SI26542A

SI26542A - Nove liposomske formulacije in postopek za njihovo pripravo

Info

Publication number: SI26542A
Application number: SI202300123A
Authority: SI
Inventors: ULRIH Nataša POKLAR; Jan Kejžar; Črnivec Ilja Gasan Osojnik
Original assignee: Univerza V Ljubljani
Priority date: 2023-09-12
Filing date: 2023-09-12
Publication date: 2025-03-31
Also published as: EP4529920A1

Abstract

Predmet izuma so nove liposomske formulacije in postopek za njihovo pripravo. Liposomske formulacije izkazujejo izredno fizikalno-kemijsko stabilnost in omogočajo pripravo liposomov različnih velikosti z metodami tankega filma, sonikacije, ekstruzije in nabrekanja na gelu. Liposomske formulacije po izumu imajo lipidni dvosloj sestavljen iz med 40 in 80 mol % fosfolipidov, med 20 in 60 mol % holesterola in med 0,5 in 50 mol % polarnega lipidnega ekstrakta arheje Aeropyrum pernix K1. Z omenjenimi postopki se pridobi liposome, ki so koloidno stabilni ter ostanejo morfološko nespremenjeni skozi daljše časovno obdobje (več kot 30 dni).

Description

Nove liposomske formulacije in postopek za njihovo pripravo

Področje izuma

Predmet izuma so nove liposomske formulacije, kjer lipidni dvosloj liposomskih formulacij, to je liposomov, poleg fosfolipidov in holesterola vključuje dodatek različnih deležev arhealnih lipidov, in postopki njihove priprave. Dodatek arhealnih lipidov k mešanici fosfolipidov in holesterola vpliva na lastnosti liposomov. Vpliv arhealnih lipidov je zelo izražen že pri minimalnem dodatku. Z dodanim deležem arhealnih lipidov v liposomske formulacije, to je v njen lipidni dvosloj, je: (i) omogočena homogena porazdelitev velikosti in olajšana tvorba liposomov; (ii) znižanje zeta potenciala in posledično izboljšana stabilnost koloidnih raztopin liposomov; (iii) povečanje fluidnosti lipidnega dvosloja; (iv) omogočena dolgotrajna stabilnost liposomov tudi pri povišanih temperaturah, potrjena preko nespremenjenih morfoloških lastnosti in študije sproščanja kalceina.

Prednostno je lipidni dvosloj liposoma na osnovi jajčnega sfingomielina in holesterola.

Po izumu so uporabljeni arhealni etrski lipidi, ekstrahirani iztermofilne arheje Aeropyrum pernix KI. V liposomske formulacije po izumu so vključeni arhealni lipidi, in sicer polarni lipidni ekstrakti, pridobljeni iz lastnega cenovno sprejemljivega postopka gojenja arhejske biomase. Slednje je tudi novost, saj so primerljive tovrstne sestavine bodisi sintetične bodisi zajemajo stroškovno kompleksne procese gojenja arhej, kar ovira ekonomičnost komercialnega procesa.

Pripravijo se lahko enoplastni liposomi različnih velikosti, pri čemer enoplastni pomeni, da imajo en lipidni dvosloj, in sicer:

- majhni enoplastni (unilamelarni) liposomi (vezikli) (premer do 100 nm; ang. Small unilamellar vesicles - SUV);

- veliki enoplastni liposomi (vezikli) (premer 100-1000 nm; ang. Large unilamellar vesicles LUV);

- orjaški enoplastni liposomi (vezikli) (premer nad 1 pm; ang. Giant unilamellar vesicles-GUV).

Majhni in veliki enoplastni liposomi se prvenstveno uporabljajo za dostavo učinkovin na tarčno mesto.

Tehnični problem

Glavna pomanjkljivost konvencionalnih liposomov oziroma liposomskih formulacij je njihova slaba stabilnost in posledično slabša sposobnost dostave učinkovin na tarčno mesto¹. Prav tako je izdelava liposomov precizen in kompleksen postopek s številnimi koraki, ki imajo ključen vpliv na končno velikost in stabilnost liposomov ter funkcionalnost končnega izdelka².

V preteklosti smo že prikazali potencial arhealnih lipidov A. pernix na primeru enokomponentnih liposomov z dobrimi morfološkimi lastnostmi in fizikalno-kemijsko stabilnostjo^{3 4}. Glavna težava tovrstnih liposomov iz 100 mol % arhealnih lipidov je bila po eni strani njihova slaba stabilnost v bioloških sistemih⁵, po drugi strani pa nezmožnost sprostitve tovorja po celičnem privzetju celotnih liposomov (pokazano na različnih celičnih linijah)⁶. Samostojna uporaba arhealnih lipidov za tvorbo liposomov prav tako ni ekonomsko opravičena.

Stanje tehnike

Navkljub obsežnem številu raziskav in njihovega prenosa v klinične aplikacije, je na trgu manj kot 20 registriranih zdravil na osnovi liposomov⁷. Patentiranih je tudi nekaj zdravil z dostavnim sistemom učinkovin na osnovi sfingomielina in holesterola. Obstoječi sistemi se navkljub svoji terapevtski učinkovitosti soočajo s pomanjkljivo fizikalnokemijsko stabilnostjo. Primer je izdelek Marqibo® v obliki kompleta s tremi vialami, ki ločeno vsebujejo (i) zdravilno učinkovino vinskristinijev sulfat, (ii) sfingomielin in holesterol kot komponenti liposomov in (iii) delovni pufer. Priprava v liposome kapsulirane učinkovine za končno terapevtsko uporabo zahteva dolgotrajno pripravo (24 korakov) v specifičnih pogojih⁸. Za zagotavljanje stabilnosti omenjene formulacije mora biti postopek priprave Marqibo® liposomske formulacije opravljen najkasneje 12 ur pred uporabo. Za razliko od predstavljenega primera naš izum z dodatkom arhealnih lipidov poenostavi postopek priprave liposomov in podaljša obstojnost dostavnega sistema.

Osnovna formulacija iz sfingomielina in holesterola se pojavlja v številnih patentih. Npr. patentni dokument EP 2266537 A2 se nanaša na zdravljenja raka z učinkovino vinkristin, kapsulirano v liposome. Patentni dokument US 2023/0028179 opisuje zdravljenje virusnih infekcij s pomočjo liposomov na osnovi sfingomielina in holesterola. Za razliko od našega izuma, ti patenti ne navajajo dodatka arhealnih lipidov v obravnavani liposomski osnovi. V bazi patentov nismo zasledili izumov, ki bi dodajali arhealne lipide v formulacijo sfingomielina in holesterola. Poleg tega so arhealni lipidi (iz A. pernix KI) omenjeni izključno v patentnem dokumentu EP 2518138 Al, ki se nanaša na drugo aplikacijo.

Izum je podrobneje opisan v nadaljevanju in predstavljen na slikah in z izvedbenimi primeri, pri čemer slike prikazujejo:

Slika 1. Orjaški liposom (GUV) z 2 % deležem arhealnih lipidov, narejen z metodo nabrekanja na gelu. Slikano na svetlobnem mikroskopu (400x povečava, Leica DM750, Leica Microsystems Ltd., Kitajska).

Slika 2: Skupek orjaških liposomov (GUV) z 2 % deležem arhealnih lipidov, narejenih z metodo nabrekanja na gelu. Slikano na svetlobnem mikroskopu (40x povečava, Leica DM750, Leica Microsystems Ltd., Kitajska).

Slika 3: Privzetje velikih liposomov (LUV) z 2 % deležem arhealnih lipidov, polnjenih z 80 mM kalceinom, v celice CHO (Chinese Hamster Ovary). Slikano na inverznem mikroskopu z modulom za fluorescenco (400x povečava, Leica DM IL LED, Leica Ltd., Kitajska).

Scientific, Waltham, MA, ZDA) opremljenim z digitalno kamero Četa 16M in programsko opremo Velox. Slika 4: Primerjava morfologije velikih liposomov (LUV, narejenih z ekstruzijo skozi 100 nm membrano) brez arhealnih lipidov (A) in s 5 % dodatkom arhealnih lipidov (B). Vzorce smo nanesli na bakrene mrežice (400 mesh, SPI, ZDA) s plastjo podporne folije Formvar, predhodno napršene z ogljikom in s povečano hidrofilnostjo površine z metodo modifikacije površine s plazmo (ang. glow discharge) (naprševalnik EM ACE200, Leica Microsystems, Avstrija). Po 30sekundni inkubaciji smo vzorec kontrastirali z 1% vodno raztopino uranil acetata. Pregled vzorcev in dokumentiranje rezultatov je potekalo na presevnem elektronskem mikroskopu Philips CM 100 (Amsterdam, Nizozemska) opremljenim z digitalno kamero Orius SC200 in programsko opremo Digital Micrograph (Gatan Inc., Washington, ZDA) oziroma na presevnem elektronskem mikroskopu TALOS L120C (ThermoFischer Scientific, Waltham, MA, ZDA) opremljenim z digitalno kamero Četa 16M in programsko opremo Velox.

V kontekstu prijave se izrazi liposomska formulacija, liposom, vezikel uporabljajo enakovredno in so medsebojno zamenljivi.

Po izumu je lipidni dvosloj liposomske formulacije sestavljen iz fosfolipidov, holesterola in arhealnih lipidov, in sicer iz polarnega lipidnega ekstrakta arheje Aeropyrum pernix KI, pri čemer je molski delež fosfolipidov med 40 in 80 mol %, molski delež holesterola med 20 in 60 mol %, in molski delež polarnega lipidnega ekstrakta arheje Aeropyrum pernix KI med 0,5 in 50 mol %.

Fosfolipid je izbran izmed fosfatidilholina, fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina ali sfingomielina, katerih stranske -R acilne verige vsebujejo 8-24 ogljikovih atomov.

Prednostno je fosfolipid sfingomielin, katerega stranske -R acilne verige vsebujejo 8-24 ogljikovih atomov, pri čemer je sfingomielin lahko naravnega izvora, to je jajčni ali možganski, ali sintetični.

Prednostno polarni lipidni ekstrakt arheje Aeropyrum pernix KI sestoji iz dveh frakcij polarnih lipidov, in sicer iz 91 mol % 2,3-di-O-sesterterpanil-sn-glicerol-l-fosfo

-l'-(2'-O-a-D-glukozil)-mio-inozitola (C₂5,25-arhetidil(glukozil)inozitol) in 9 mol % 2,3-di-Osesterterpanil-sn-glicerol-l-fosfo-mio-inozitola (C₂₅,₂5-arhetidilinozitol).

V Tabeli 1 so prikazane različne liposomske formulacije po izumu.

Tabela 1: Preračunani molski deleži sfingomielina, holesterola in arhealnih lipidov v izbranih primerih liposomske formulacije (2, 5,15, 25, 35 in 45 % mol dodatek arhealnih lipidov)

FORMULACIJA ARHEALNI JAJČNI HOLESTEROL (DELEŽ LIPIDI SFINGOMIELIN (mol %)

ARHEALNIH (mol %) (mol %)

LIPIDOV)

2 mol %	2	58,8	39,2
5 mol %	5	57	38
15 mol %	15	51	34
25 mol %	25	45	30
35 mol %	35	39	26
45 mol %	45	33	22

Dodatek arhealnih lipidov v predstavljenih liposomskih formulacijah kažejo bistvene izboljšave formulacije že pri dodanih 2 mol %. Izvedbeni primeri prikazujejo, da dodatek arhealnih lipidov k mešanici jajčnega sfingomielina in holesterola omogoča tvorbo manjših veziklov z bistveno manjšim indeksom polidisperznosti v primerjavi s formulacijo, kjer arhealni lipidi niso bili dodani (Tabela 2).

Tabela 2: Povprečni premer, indeks polidisperznosti in zeta potencial majhnih unilamelarnih veziklov (SUV) pripravljenih s sonikacijo. Parametri so bili izmerjeni z metodo dinamičnega sipanja svetlobe in analize faz na napravi ZetaSizer Nano (Malvern Panalytical, Malvern, UK).

FORMULACIJA	POVPREČNI	INDEKS	ZETA
(DELEŽ	PREMER	POLIDISPERZNOSTI	POTENCIAL
ARHEALNIH	(nm)		(mV)
LIPIDOV)
0 mol %	152	0,388	-12
2 mol %	86	0,191	-29
5 mol %	81	0,185	-37
15 mol %	84	0,194	-47
25 mol %	88	0,171	—47
35 mol %	80	0,185	-50
45 mol %	86	0,219	-48

Za doseganje željenih lastnosti aplikacij arhealnih lipidov se pogostokrat uporablja kemijsko modificirane arhealne lipide (polsintetične)⁹, medtem ko se arhealni lipidi Aeropyrun? pernix KI v formulacijah po izumu uporabljajo nespremenjeni. Termostabilnost arhealnih lipidov prav tako lahko olajša postopek sterilizacije dostavnega sistema.

Zaradi aerobnega značaja A. pernix KI je biotehnološki proces gojenja relativno nezahteven, kar nam daje tudi ekonomsko prednost. Arheje smo gojili v 1 L reagenčnih steklenicah s konstantnim mešanjem (600 obratov magneta/min) pri 92 °C z vpihovanjem zraka (pretok 11 L/h). Gojišče smo pripravili po receptu (Tabela 3) in ga umerili na pH 7,0. Arheje smo poželi po 40 urah. Iz požetih arhej smo na znane načine pripravili ustrezni polarni lipidni ekstrakt.

Tabela 3: Sestava gojišča za gojenje arheje Aeropyrum pernix KI.

SESTAVA GOJIŠČA ZA Aeropyrum pernix

REAGENT

Akvarijska sol Pepton (kazein) Kvasni ekstrakt

Natrijev tiosulfat

HEPES (4-(2-hidroksietil)-lpiperazinetansulfonska kislina)

KOLIČINA (/L)

32,64 g 6g 0,96 g 0,96 g

4,77 g

V enem izvedbenem primeru postopek priprave liposomskih formulacij, to je majhnih enoplastnih liposomov (SUV) in velikih enoplastnih liposomov (LUV), kjer lipidni dvosloj liposomskih formulacij, poleg fosfolipidov in holesterola vključuje dodatek različnih deležev arhealnih lipidov vključuje pripravo večplastnih liposomov (veziklov) (ang. Multilamellar vesicles - MLV), ki so predstopnja pri proizvodnji SUV in LUV, pri čemer se koloidna suspenzija večplastnih liposomov pripravi z metodo tankega filma.

Za pripravo koloidne suspenzije večplastnih liposomov pripravimo raztopino mešanice fosfolipida in holesterola, ki sta raztopljena v mešanici kloroforma in metanola. Mešanici dodamo preračunano količino arhealnih lipidov raztopljenih v kloroformu. Na rotavaporju iz skupne mešanice izparimo topila dokler ne pridobimo suh film. Suh film hidriramo s pufrom do želene končne koncentracije lipidov, ki je prednostno 5 mg/mL. Formacijo liposomov olajšamo z izmeničnimi cikli vorteksiranja in soniciranja v ultrazvočni kopeli, pri čemer dobimo koloidno suspenzijo večplastnih liposomov.

Iz pripravljene koloidne suspenzije večplastnih liposomov se s sonikacijo pripravi koloidno raztopino majhnih enoplastnih (unilamelarnih) liposomov (veziklov)- SUV (premera do 100 nm). Prednostno poteka sonikacija 30 minut pri frekvenci 22 kHz in amplitudi 35 % z 10 sekundnimi on-off cikli.

Iz pripravljene koloidne suspenzije večplastnih liposomov se z ekstruzijo skozi membrano pripravi koloidno raztopino velikih enoplastnih (unilamelarnih) liposomov - LUV (premera 1001000 nm). Z velikostjo por membrane skozi katero se ekstrudira koloidna suspenzija večplastnih liposomov vplivamo na želeno velikost velikih enoplastnih liposomov. Za zagotavljanje morfoloških lastnosti velikih liposomov je priporočljivo opraviti vsaj 21 pretokov (ekstruzij) skozi membrano.

V enem izvedbenem primeru postopek priprave orjaških enoplastnih liposomov (GUV), kjer lipidni dvosloj liposomskih formulacij, poleg fosfolipidov in holesterola vključuje dodatek različnih deležev arhealnih lipidov, poteka po metodi nabrekanja na gelu. Postopek vključuje pripravo posušenega filma polimera (npr. agaroza, polivinil alkohol...) in polnjenje GUV s saharozo ter pripravo suspenzije v ekvimolarni raztopini glukoze. Slednje bistveno olajša uporabo mikroskopskih tehnik za analizo GUV. V našem primeru smo za polimer izbrali polivinil alkohol z visoko molekulsko maso, ker ne kontaminira vzorca. Postopek vključuje pripravo posušenega filma polivinil alkohola s saharozo, katerega površino omejimo z 0-tesnilom. Mešanico lipidov želene formulacije, raztopljeno v kloroformu, nanesemo na posušeni film in tako ustvarimo sekundarni film. Dodatek pufra s saharozo povzroči nabrekanje lipidnega filma in formacijo GUV. Po 30 min nabrekanja se suspenzijo previdno odpipetira v pufer z ekvimolarno koncentracijo glukoze (glede na saharozo).

V drugem izvedbenem primeru postopek priprave orjaških enoplastnih liposomov (GUV) poteka po metodi elektroformacije.

V še nadaljnjih izvedbenih primerih lahko postopek priprave liposomskih formulacij, to je enoplastnih liposomov navedenih velikosti, poteka po metodi vbrizgavanja lipidne suspenzije želene sestave v vodno fazo, po emulzifikacijskih metodah ali po metodi proliposomov.

Postopki izvedbenih primerov prikazujejo, da je proces tvorbe manjših liposomov (<100 nm) bistveno olajšan napram konvencionalnim formulacijam iz sfingomielina in holesterola, saj pri dodatku arhealnih lipidov pridobimo manjše strukture, brez uporabe sotopil (ki bi jih bilo v primeru uporabe v nadaljevanju postopka potrebno tudi odstraniti, čemur se v našem primeru torej v celoti izognemo).

Iz slike 4 so vidne izboljšane morfološke lastnosti velikih enoplastnih veziklov. Pri liposomih z dodanimi arhealnimi lipidi (B) je opazna bistveno manjša stopnja medsebojnega lepljenja, ki je posledica zmanjšanega zeta potenciala liposomov. Prav tako imajo liposomi z dodanimi arhealnimi vezikli (B) bolj homogeno porazdelitev velikosti. Poleg izboljšanih morfoloških lastnosti je izboljšano tudi privzetje liposomov v celice, kot je razvidno is slike 3.

Izvedbeni primeri vključujejo pripravo liposomov različnih velikosti ter prikazujejo:

- Lipidno sestavo liposomov na osnovi jajčnega sfingomielina in holesterola (pri fiksnem molskem razmerju 6:4), kjer je kot ključna invencija dodatek različnih deležev arhealnih lipidov (na primerih 2-45 mol %).

- Pripravo majhnih enoplastnih (unilamelarnih) veziklov (premer do 100 nm; ang. Small unilamellar vesicles - SUV).

- Pripravo velikih enoplastnih veziklov (premer 100-1000 nm; ang. Large unilamellar vesicles LUV).

- Pripravo orjaških enoplastnih veziklov (premer nad 1 pm; ang. Giant unilamellar vesicles GUV)

- Izboljšan zeta potencial novih SUV in LUV liposomov (< -30 mV za doseganje koloidnih stabilnosti suspenzij).

- Povečano fluidnost membran novih SUV liposomov (znižan parameter urejenosti lipidov-S)

Izboljšano dolgotrajno stabilnost novih LUV liposomov pri shranjevanju pri 4 °C in tudi pri povišanih temperaturah (45 °C).

- Dobro stabilnostjo tudi pri višjih temperaturah (praktično brez sproščanja kalceina iz veziklov v temperaturnem območju 20-98 C; hitrost segrevanja 1 °C/min).

- Pripravo večplastnih veziklov (ang. Multilamellar vesicles - MLV), ki so predstopnja pri proizvodnji SUV in LUV.

Izvedbeni primeri

Primer 1

A) Priprava koloidne suspenzije večplastnih veziklov z metodo tankega filma

Pripravimo mešanico jajčnega sfingomielina in holesterola (molsko razmerje 6:4), raztopljenega v mešanici kloroforma in metanola (volumsko razmerje 7:3). V 10 mL bučko za rotavapor dodamo preračunano količino arhealnih lipidov raztopljenih v kloroformu in mešanico jajčnega sfingomielina ter holesterola (skupna masa lipidov naj ne presega 15 mg). Končni molski deleži lipidov v različnih formulacijah so v Tabeli 1. Izparevanje kloroforma na rotavaporju poteka pri 50 °C, 200 mbar in 90 rpm. Za popolno sušenje pa znižamo tlak na minimum (pribl. 16 mbar; sušenje traja vsaj 3 ure). Suh film hidriramo s pufrom PBS (pH 7,4) ali 20 mM HEPES (pH 7,0), do končne koncentracije lipidov 5 mg/mL. Formacijo veziklov olajšamo s tremi cikli vorteksiranja (10 sec) in soniciranja v ultrazvočni kopeli (30 sec pri maksimalni moči), pri čemer dobimo koloidno suspenzijo večplastnih veziklov.

B) Priprava manjših veziklov (premer pribl. 80 nm) s sonikacijo

Pripravljeno koloidno suspenzijo večplastnih veziklov razredčimo z izbranim pufrom na 1 mg/mL. Pripravimo ledeno kopel in napolnimo 2 mL epico z 1-1,5 mL koloidne suspenzije veziklov, ki jih nato soniciramo 30 minut pri frekvenci 22 kHz in amplitudi 35 % z 10 sekundnimi on-off cikli (naprava Vibracell Ultrasonic Disintegrator VCX 750, Sonics and Materials, Newtown,

USA). Sonicirane vezikle centrifugiramo 10 min pri 12000 RCF, da odstranimo morebitne ostanke ultrazvočne sonde.

Primer 2

A) Priprava velikih veziklov (premer pribl. 145 nm) z ekstruzijo

Velike vezikle pripravimo s sistemom za ekstruzijo od Avanti Polar Lipids (Alabaster, USA) z membrano z velikostjo por 100 nm (za povprečni premer veziklov 145 nm) ali 400 nm (povprečni premer veziklov 200 nm). Uporabimo koloidno suspenzijo večplastnih veziklov pripravljeno na enak način kot v primeru 1 — korak A. Pripravljeno koloidno suspenzijo večplastnih veziklov razredčimo z izbranim pufrom na 1 mg/mL. Stekleno brizgo (V = 1 mL) s teflonskim batom napolnimo s suspenzijo večplastnih veziklov in suspenzijo ekstrudiramo skozi membrano. Za uspešno formacijo velikih veziklov je potrebno opraviti vsaj 21 pretokov (ekstruzij) skozi membrano.

Primer 3

A) Priprava orjaških veziklov (premer pribl. 1-100 pm) s pomočjo nabrekanja na gelu

Pripravimo 5 % (w/w) raztopino polivinil alkohola - PVA (molekulska masa 145000 Da) v 280 mM raztopini saharoze (v = 95,84 g/L). Mešamo na 90 °C, da se PVA raztopi. Objektno steklce (premer približno 30 mm) premažemo s 100-300 pL raztopine PVA in ga nato sušimo 30 min na 50 °C. 10-20 pL lipidov želene sestave, raztopljenih v kloroformu (1 mg/mL) enakomerno nanesemo na posušeni film iz PVA. Lipide 30 min sušimo na vakumu. Ustvarimo komoro s premerom 1-2 cm (npr. z O-tesnilom) in dodamo 1 mL pufra (HEPES ali PBS z 280 mM saharoze). Suspenzijo nastalih orjaških liposomov po 30 minutah skrbno odpipetiramo v pufer z 280 mM glukoze.

REFERENCE (1) Filipczak, N.; Pan, J.; Yalamarty, S. S. K.; Torchilin, V. P. Recent Advancements in Liposome Technology. Advanced Drug Delivery Reviews 2020, 156, 4-22.

https://doi.Org/10.1016/j.addr.2020.06.022.

(2) Worsham, R. D.; Thomas, V.; Farid, S. S. Potential of Continuous Manufacturing for Liposomal Drug Products. Biotechnol. J. 2019, 14 (2), 1700740.

https://doi.org/10.1002/biot.201700740.

(3) Gmajner, D.; Grabnar, P. A.; Žnidarič, M. T; Štrus, J.; Šentjurc, M.; Ulrih, N. P. Structural Characterization of Liposomes Made of Diether Archaeal Lipids and Dipalmitoyl-L-aPhosphatidylcholine. Biophysical Chemistry 2011, 158 (2-3), 150-156.

https://doi.Org/10.1016/j.bpc.2011.06.014.

(4) Gmajner, D.; Ota, A.; Šentjurc, M.; Ulrih, N. P. Stability of Diether C25,25 Liposomes from the Hyperthermophilic Archaeon Aeropyrum Pernix KI. Chemistry and Physics of Lipids 2011, 164 (3), 236-245. https://doi.Org/10.1016/j.chemphyslip.2011.01.005.

(5) Markelc, B.; Napotnik, T. B.; Ota, A.; Cemazar, M.; Ulrih, N. P.; Miklavčič, D.; Sersa, G. Archaeosomes Prepared from Aeropyrum Pernix KI Lipids as an In Vivo Targeted Delivery System for Subsequent Nanosecond Electroporation. In 6th European Conference of the International Federation for Medica/ and Biological Engineering; Lackovič, L, Vasic, D., Eds.; IFMBE Proceedings; Springer International Publishing: Cham, 2015; Vol. 45, pp 561-564. https://doi.org/10.1007/978-3-319-11128-5_140.

(6) Napotnik, T. B.; Valant, J.; Gmajner, D.; Passamonti, S.; Miklavčič, D.; Ulrih, N. P. Cytotoxicity and Uptake of Archaeosomes Prepared from Aeropyrum Pernix Lipids. Hum Exp Toxicol 2013, 32 (9), 950-959. https://doi.org/10.1177/0960327113477875.

(7) Bulbake, U.; Doppalapudi, S.; Kommineni, N.; Khan, W. Liposomal Formulations in Clinical Use: An Updated Review. Pharmaceutics 2017, 9 (4), 12. https://doi.org/10.3390/pharmaceutics9020012.

(8) Silverman, J. A.; Deitcher, S. R. Marqibo® (Vincristine Sulfate Liposome Injection) Improves the Pharmacokinetics and Pharmacodynamics of Vincristine. Cancer Chemother Pharmacol 2013, 71 (3), 555-564. https://doi.org/10.1007/s00280-012-2042-4.

(9) Sprott, G. D.; Dicaire, C. J.; Fleming, L. P.; Patel, G. B. Stability of Liposomes Prepared from Archaeobacterical Lipids and Phosphatidylcholine Mixtures.

Claims

PATENTNI ZAHTEVKI

1. Liposomska formulacija, pri čemer je liposomska formulacija majhen enoplasten liposom, velik enoplasten liposom ali orjaški enoplasten liposom, označena s tem, daje lipidni dvosloj liposomske formulacije sestavljen iz fosfolipidov, holesterola in arhealnih lipidov, pri čemer je molski delež fosfolipidov med 40 in 80 mol %, molski delež holesterola med 20 in 60 mol %, in molski delež polarnega lipidnega ekstrakta arheje Aeropyrum pernix KI med 0,5 in 50 mol %.
2. Liposomska formulacija po zahtevku 1, označena s tem, da je fosfolipid izbran izmed fosfatidilholina, fosfatidilserina, fosfatidiletanolamin ali sfingomielina, katerih stranske -R acilne verige vsebujejo od 8 do 24 ogljikovih atomov.
3. Liposomska formulacija po zahtevku 1 ali 2, označena s tem, da je fosfolipid sfingomielin, katerega stranske -R acilne verige vsebujejo od 8 do 24 ogljikovih atomov, pri čemer je sfingomielin lahko naravnega izvora, to je jajčni ali možganski, ali sintetični.
4. Liposomska formulacija po zahtevkih od 1 do 3, označena s tem, da polarni lipidni ekstrakt arheje Aeropyrum pernix KI sestoji iz dveh frakcij polarnih lipidov, in sicer iz 91 mol % 2,3di-O-sesterterpanil-sn-glicerol-l-fosfo-l'-(2'-O-a-D-glukozil)-mio-inozitola - (C₂₅,25- arhetidil(glukozil) inozitol) in 9 mol % 2,3-di-O-sesterterpanil-sn-glicerol-l-fosfo-mioinozitola - (C25,25-arhetidilinozitol).
5. Postopek priprave liposomskih formulacij, pri čemer so liposomske formulacije majhni enoplastni liposomi, označen s tem, da postopek vključuje:

- pripravo koloidne suspenzije večplastnih liposomov z metodo tankega filma;

- iz pripravljene koloidne suspenzije večplastnih liposomov se nato s sonikacijo pripravi koloidno raztopino majhnih enoplastnih liposomov-SUV premera do 100 nm, pri čemer sonikacija poteka prednostno 30 minut pri frekvenci 22 kHz in amplitudi 35 % z 10 sekundnimi on-off cikli.
6. Postopek priprave liposomskih formulacij po zahtevku 5, označen s tem, da postopek poteka po metodi vbrizgavanja lipidne suspenzije želene formulacije v vodno fazo, po emulzifikacijskih metodah ali po metodi proliposomov.
7. Postopek priprave liposomskih formulacij, pri čemer so liposomske formulacije veliki enoplastni liposomi, označen s tem, da postopek vključuje:

- pripravo koloidne suspenzije večplastnih liposomov z metodo tankega filma;

- iz pripravljene koloidne suspenzije večplastnih liposomov se nato z ekstruzijo skozi membrano pripravi koloidno raztopino velikih enoplastnih liposomov - LUV premera od 100 do 1000 nm, pri čemer se opravi vsaj 21 pretokov skozi membrano.
8. Postopek priprave liposomskih formulacij po zahtevku 7, označen s tem, da postopek poteka po metodi vbrizgavanja lipidne suspenzije želene formulacije v vodno fazo, po emulzifikacijskih metodah ali po metodi proliposomov.
9. Postopek priprave liposomskih formulacij, pri čemer so liposomske formulacije orjaški enoplastni liposomi, označen s tem, da postopek vključuje:

p ripravo posušenega filma alkohola s saharozo, katerega površino omejimo z Otesnilom;

n anos mešanice lipidov želene formulacije, raztopljene v kloroformu, na posušeni film, s čimer se ustvari sekundarni film;

- dodatek pufra s saharozo, pri čemer pride do nabrekanja lipidnega filma in s tem formacija orjaških enoplastnih liposomov - GUV v suspenziji;

- odpipetiranje suspenzije GUV v pufer z ekvimolarno glukozo.
10. Postopek priprave liposomskih formulacij po zahtevku 9, označen s tem, da postopek poteka po metodi elektroformacije.
11. Postopek priprave liposomskih formulacij po zahtevku 9, označen s tem, da postopek poteka po metodi vbrizgavanja lipidne suspenzije želene formulacije v vodno fazo, po emulzifikacijskih metodah ali po metodi proliposomov.
12. Liposomske formulacije po zahtevkih od 1 do 4, pri čemer so liposomske formulacije mali ali veliki enoplastni liposomi, za dostavo učinkovin na tarčno mesto.