SI23374A - Uporaba glikozidaz in glikoziltransferaz za povečano proizvodnjo proteinov - Google Patents

Abstract

Metoda za izboljšano proizvodnjo rekombinantnih proteinov v rastlinah ali rastlinskih celicah rešuje problem proizvodnje kompleksnih proteinov s hitro zanesljivo in ekonomsko učinkovito potjo Zato so prednostne rastline N tabacum v katere sevnese najmanj en polinukleotid ki kodira želen protein za proizvodnjo in najmanj eno kodirajoče modulatorsko zaporedje ki poveča prepustnost medcelicami v tarčnih celicah prednostno iz skupine glikozidaz ali v katere se vnese najmanj en polinukleotid ki vsebuje tako zaporedje za želen protein kot tudi kodirajoče zaporedje za povečanje prepustnosti med celicami v tarčnih celicah prednostno iz skupine glikozidaz Polinukleotidna zaporedja prednostno izvirajo iz rastlinskih virusov prednostno TMV in/ali PVX

Description

NAZIV IZUMA: UPORABA GLIKOZIDAZ IN GLIKOZILTRANSFERAZ ZA POVEČANO PROIZVODNJO PROTEINOV

OPIS IZUMA

Predmet izuma je metoda za izboljšano proizvodnjo rekombinantnih proteinov v rastlinah ali rastlinskih celicah.

Izum predstavlja metodo, ki omogoča izboljšano produkcijo rekombinantnih proteinov v rastlinah ali rastlinskih celicah, in rešuje problem nizke učinkovitosti dosedanje proizvodnje proteinov z rastlinami. Produkcijski sistem predstavlja rastlina, v katero poleg zaporedja za želen protein vnesemo še zaporedje za encim iz skupine glikozidaz, ali zaporedje za inhibicijo encima iz skupine glikoziltransferaz, kar bo olajšalo in pospešilo širjenje želenega zaporedja za protein po rastlini. Rezultat uporabe te metode je, da do določene količine želenega proteina pridemo v hitrejšem času.

Proteini, na primer terapevtski proteini, kot so protitelesa, cepiva, encimi, antibiotiki, hormoni, citokini, interferoni itd., so potrebni v industrijskih količinah. Tradicionalne metode za proizvodnjo rekombinantnih proteinov so mikrobne fermentacije in živalske celične kulture. Povpraševanje po rekombinantnih proteinih se v svetu povečuje in ga ni mogoče zadovoljiti samo s tradicionalnimi metodami proizvodnje. Tako so raziskovalci iskali druge možnosti in ena med njimi je produkcija proteinov v rastlinah.

Poskusi za učinkovito proizvodnjo proteinov v rastlinah potekajo že od poznih 1970-ih naprej, vendar so bili ti poskusi ovirani zaradi dolgega časa, potrebnega za pripravo stabilno transformiranih rastlin z genskim zapisom proteina, ki se proizvaja in tudi zaradi nizkega donosa stabilno in prehodno transformiranih rastlin. Dodatne ovire so bili zadržki glede biološke varnosti ob gojenju rastlin na prostem in povečevanje obsega, da bi bile metode komercialno zanimivejše.

Medtem je prišlo do precejšnjega napredka. Uporaba prehodnega izražanja heterolognih genov, vnesenih v rastlino z bakterijo ali virusom, je postala rutina. Rastline transformirane z bakterijo Agrobacterium, izražajo protein že po kratkem času, kljub vsemu pa je izražanje običajno precej nizko. Rastline, transformirane z virusnimi vektorji, potrebujejo več časa, da po transformaciji izrazijo protein, vendar pa se lahko širijo po rastlini z uporabo virusnih sposobnosti premikanja med celicami. Deom et al (1992) so ugotovili, da širjenje virusa poteka preko plazmodezem in je posredovano z virusnimi gibalnimi proteini.

• ·

Do danes so že poznane metode za proizvodnjo proteinov v rastlinskih celicah v večjem obsegu, ampak v primerjavi s tradicionalnimi metodami za veliko proteinov niso konkurenčne.

V zadnjih desetletjih se je poskušalo povečati učinkovitost proizvodnje proteinov z rastlinami.

Leta 1999 je patent US5939541 razkril metodo za povečanje izražanja genov v rastlinah z dodatkom virusno kodirane pospeševalne sekvence. Leta 2000 je patent US6011198 razkril metodo za povečanje izražanja proteinov v plastidih fotosintetskih organizmov preko povečanja sposobnosti izrabe svetlobe. Leta 2004 je patent US2004/0214318 razkril metodo za povečanje izražanja proteinov v rastlinah preko uporabe nenativnih 5' neprevedenih povečevalnih zaporedij. Leta 2006 je patent US7087811 razkril metodo za povečanje proizvodnje proteinov z uporabo fuzijskih produktov želenega proteina in ubikvitina. Bistvo teh metod je, da poskušajo povečati izražanje proteina na nivoju posamezne celice.

Vseeno pa za učinkovitost proizvodnje ni dovolj le boljše izražanje proteina na ravni posameznih celic, ampak preko celotne rastline ali rastlinskega tkiva. To se lahko doseže, ko je polinukleotidno zaporedje, ki kodira protein, ki nas zanima, prisotno po celi rastlini ali rastlinskem tkivu.

Ena od možnosti, za porazdelitev vektorja po celotni rastlini ali rastlinskem tkivu, je vstavitev polinukleotidnega zaporedja preko celotne rastline ali rastlinskega tkiva.

Takšen pristop je bil opisan s strani Icon Genetics in z metodo imenovano »Magnifection« (W02007/137788, W02006/079546, S. Marillonnet et al., Nature Biotechnol. 2005, Gleba et al., Vaccine. 2005). Metoda zahteva simultan vnos bakterije Agrobacterium v številne liste rastline.

Če bi odpravili pomanjkljivosti proizvodnje proteinov v rastlinah, bi lahko to predstavljalo alternativo obstoječim metodam, kot so mikrobna fermentacija ali živalske celične kulture. Prav tako bi lahko bila produkcija v rastlinah cenovno bolj učinkovita, saj uporablja naravne in obnovljive vire ter ni vezana na posebne proizvodne obrate. Proizvodnja v rastlinah je lahko cenejša, saj je potrebnih manj dodatnih virov, kot so gojišča in bioreaktorji. Rastline so lahko učinkoviti proizvajalci proteinov, to pa lahko počnejo brez nevarnosti razmnoževanja humanih patogenov ali ostalih sesalčjih povzročiteljev bolezni, kar zniža stroške povezane z varnostnimi ukrepi biološke varnosti. Rastline imajo boljšo sposobnost asimilacije genetskih informacij in lahko proizvajajo kompleksnejše rekombinantne proteine v primerjavi z ostalimi obstoječimi metodami proizvodnje. Nadalje lahko rastline izvedejo glikozilacijske vzorce, ki so bolj podobni humanim proteinom. To omogoča preskok nekaterih korakov post-translacijskih modifikacij, ki so potrebni pri drugih metodah.

« ·

Trenutni pristopi še vedno niso zadovoljivi, tako da so dodatne izboljšave še vedno potrebne, posebej za industrijske aplikacije v večjem obsegu je potrebno povečati učinkovitost in dobiček.

Namen izuma je metoda, ki bo zagotovila izboljšano izražanje proteinov v rastlinskih celicah ter hitro, zanesljivo in ekonomsko učinkovito pot proizvodnje kompleksnih proteinov.

Nadalje je namen izuma učinkovito transformirati dele rastlin ali rastlinskega tkiva in priskrbeti možnosti za učinkovito širjenje po rastlini in za učinkovito izražanje želenega proteina po celotni rastlini.

Izum določa metodo proizvodnje enega ali več želenih proteinov v rastlinah ali rastlinskem tkivu, ki vodi do visokih donosov proteina in je lahko enostavno povečana do proizvodnje v velikem obsegu. Izum določa tudi metodo produkcije transgenih rastlin, ki imajo v rastlinskem genomu stabilno integrirano polinukleotidno zaporedje, ki kodira želen protein, in ki se lahko uporablja za komercialno uspešno proizvodnjo proteina. Izum določa tudi metodo produkcije transgenih rastlin, ki imajo v rastlinskem genomu stabilno integrirano polinukleotidno zaporedje, ki kodira modulacijsko zaporedje, in ki se lahko uporablja za komercialno uspešno proizvodnjo proteina, kateri je bil prehodno vstavljen v rastlino.

Izum določa metodo za proizvodnjo vsaj enega proteina v rastlinskih celicah, ki vključuje korak:

a) vnos v celico najmanj enega polinukleotida, ki ga sestavlja najmanj eno zaporedje i) ki kodira protein za proizvodnjo in najmanj en polinukleotid, ki ga sestavlja kodirajoče zaporedje ii) za še najmanj en protein ali poliribonukleotid, ki poveča prepustnost med celicami v tarčnih celicah ali

b) vnos v celico najmanj enega polinukleotida, ki ga sestavljata oba, polinukleotid i) in polinukleotid ii).

Presenetljivo je bilo ugotovljeno, da se z uporabo encimov, ki povečajo prepustnost med celicami ali z inhibicijo encimov, ki zmanjšajo prepustnost med celicami, polinukleotidna zaporedja, ki kodirajo protein(e), hitreje širijo po rastlini, kar rezultira v želenem povečanju proizvodnje in donosa proteina. Na ta način lahko z uporabo poznane metode za proizvodnjo proteina v rastlinskih celicah, ki vključuje stopnjo zahtevka 1 tega izuma, povečamo proizvodnjo proteina.

V kontekstu tega izuma, imajo naslednji izrazi naslednje definicije:

• ·

Izraza »rastlina« in »rastlinsko tkivo« sta uporabljena zamenljivo. Izraz »rastlina« obsega tudi rastlinsko tkivo ali dele rastlin.

»Heterologen« se v kontekstu tega izuma nanaša na katerikoli genetski material, ki je vstavljen v rastlinsko celico.

»Transgena rastlina« je rastlina, ki nosi vstavljen heterologen polinukleotid stabilno integriran v njen genom.

»Izvirati iz« v povezavi z izvorom RNA amplikona v kontekstu tega izuma, pomeni da so uporabljeni deli originalnega zaporedja iz virusa, kjer so ostali deli spremenjeni ali izbrisani. To vključuje vektorsko strategijo »celega virusa«, kjer je virusnemu replikonu dodano le zaporedje proteina in vektorsko strategijo »razstavljenega virusa«, kjer je vektorski genom narejen po meri, tako da vključuje dele, ki so koristni ali potrebni za uporabo. Strokovnjak tega področja lahko izbere primerno strategijo.

Polinukleotidna zaporedja ii), ki lahko povečajo prepustnost med celicami, bodo v kontekstu tega izuma imenovani tudi »modulatorji« ali »modulatorna zaporedja«.

V delu tega izuma so lahko ta modulatorna zaporedja stabilno integrirana v rastlinski genom.

Stopnja, ki je definirana v zahtevku 1 tega izuma, je lahko uporabljena v katerikoli metodi rastlinske proizvodnje proteinov.

Pomemben del tega izuma je povečanje prepustnosti med celicami, kar olajša širjenje heterolognih zaporedij znotraj rastlinskega tkiva in rezultira v boljšem izražanju in donosu želenega proteina.

Stik med celicmi je v rastlinah v plazmodezmah. Rastline iz skupine Archaeplastida, ki vključuje terestrične rastline in zelene alge, imajo plazmodezme. Plazmodezme kažejo dinamično naravo in se odpirajo ali zapirajo.

Prepustnost plazmodezem se poveča z encimsko razgradnjo polisaharidov prisotnih znotraj plazmodezem. Prepustnost plazmodezem se zmanjša s sintezo novih polisaharidov, ki se odlagajo v plazmodezmah.

Ti polisaharidi delujejo kot vratarji in količina polisaharidov prisotnih v plazmodezmi regulira omejitev izključitvene velikosti, ki je velikost največje molekule, katera se lahko premika iz celice v celico.

• *

Povečanje polisaharidnih oblog je naraven obrambni mehanizem v boju z virusno okužbo, ki omeji širjenje virusa po rastlini.

Prepustnost plazmodezme se poveča z encimsko razgradnjo polisaharidov. Drug mehanizem povečanja prepustnosti med celicami je inhibicija encimov, ki sintetizirajo polisaharide, kar rezultira v povečanem plazmodezmalnem prometu in posledično povečanem širjenju vnesenega materiala.

Polisaharidi v plazmodezmah pripadajo razredu glukanov, ponavadi so β-glukani, bolj podrobno β1,3-glukani. Levy et al (2007) so pokazali, da je količina specifičnega β-13-glukana, kaloze, v plazmodezmah povezana s prepustnostjo med celicami. Kaloza je substrat za β-13-glukanaze in kontrolira promet skozi plazmodezme. Do sedaj so Bucher et al (The Plant Journal, 2001) opisali povečane simptome virusne okužbe v tobaku, ki so jih povezali z virusno-inducirano povečano prepustnostjo med celicami, preko encimske razgradnje kaloze.

V tem izumu je zgornji mehanizem uporabljen za vpliv na prepustnost med celicami, in na ta način tudi na širjenje polinukleotida znotraj rastline preko polinukleotida, ki vključuje kodirajoče zaporedje za modulator, vnesenega v rastlino. Ker naj bodo polisaharidi razgrajeni, ali pa sinteza polisaharidov inhibirana, je lahko modulator snov, ki poveča encimsko razgradnjo ali inhibira sintezo. Nekatere snovi, ki so posebej uporabne v ta namen so encimi, aktivni v tem procesu.

Polisaharidi, na katere vplivajo encimi, so tisti, ki so običajno prisotni v plazmodezmah, t.j. glukani, posebej β-13-glukam.

Encimi, ki imajo vpliv na polisaharide in povečajo encimsko razgradnjo ali inhibirajo sintezo so poznani. Bili so že razkriti in njihove sekvence so bile objavljene. Kot primer za razgradne encime lahko omenimo β-13-glukanaze, ki pripadajo razredu EC 3.2.1.39 encimske nomenklature. Ta tip encima je bil med drugim najden v Arabidopsis thaliana. Vloga β-13-glukanaz je hidroliza β-1,3-ϋglukozidne vezi v β-1,3-0^^8ηΐΙι. Ker ti encimi razgradijo polisaharide v plazmodezmah, hkrati povečajo prepustnost med celicami.

Zato so v enem delu tega izuma uporabljeni encimi za razgradnjo polisaharidov, na primer β-1,3glukanov.

Prednostni del metode tega izuma predstavlja modulatorno polinukleotidno zaporedje ii) kodirajoče zaporedje za β-13-glukanazo.

Modulirajoče polinukleotidno zaporedje ii) je vneseno v rastlinsko celico. Transformacija je lahko prehodna, lahko pa pride do stabilne integracije. Možno je, na primer, ustvariti transgene rastline, kjer je polinukleotidno zaporedje, kodirajoč modulatorno zaporedje, stabilno vključeno v rastlinski genom. Del izuma predstavlja uporabo polinukleotidnega zaporedja, ki predstavlja kodirajoče zaporedje za P-l,3-glukanazo, kjer se le ta stabilno vključi v rastlino.

Nadalje je za povečevanje prepustnosti med celicami možno inhibirati sintezo polisaharidov, še posebej z inhibicijo encimov, ki so aktivni v sintezi teh polisaharidov. Encimi s takšno aktivnostjo so poznani. Med njimi je na primer p-l,3-D-glukan-sintaza (EC 2.4.1.34). Ti encimi so že bili razkriti in njihova zaporedja objavljena.

V enem delu tega izuma so zato encimi, ki sintetizirajo polisaharide, inhibirani, da se poveča prepustnost med celicami.

Metode in snovi za inhibicijo teh encimov so poznane. Encimi so lahko na primer inhibirani na DNA nivoju preko utišanja z mikroRNA, ali na mRNA nivoju preko siRNA oziroma shRNA, ali na proteinskem nivoju z uporabo protiteles.

Ta inhibicija je lahko narejena z inhibitornimi snovmi kot so siRNA, shRNA, dsRNA, mikroRNA, spiegelmere (ki so L-oligonukleotidi), DNA-, RNA- ali peptidni aptameri, ribocimi, abcimi (ki so katalitska protitelesa ali encimi).

Izraz »inhibicija« uporabljen v povezavi s sinteznimi encimi pomeni, da je aktivnost teh encimov znižana za vsaj 30%, še bolje vsaj za 50%. Aktivnost encima se lahko določi z metodami, ki so strokovnjakom poznane. Z izbiro odstotka inhibicije se lahko potem ustrezno vpliva na širjenje.

Dva pristopa vplivanja na prepustnost med celicami sta lahko uporabljena posebej ali v kombinaciji. Lahko je uporabljenih tudi več tipov hidroliznih encimov skupine EC 3.2.1 in/ali več kot ena inhibitorna snov za encime skupine EC 2.4.1.. Hidrolizni encimi in snovi, ki inhibirajo sintezo encimov, so lahko uporabljeni posamično, zaporedoma ali istočasno. Povedano drugače, se lahko na aktivnost enega encima vpliva istočasno kot na aktivnost drugega encima, lahko se vpliva na aktivnost enega encima in nato drugega ali pa se na aktivnost obeh tipov encimov vpliva ob različnih časih in/ali mestih.

Izraz »modulacija encimske aktivnosti« se nanaša na povečano aktivnost hidroliznih encimov ali na inhibicijo sinteznega encima. Povečanje aktivnosti hidroliznih encimov vključuje tudi možnost, daje encim vnesen v rastlino, kjer ga prej ni bilo.

Za proizvodnjo proteinov se lahko uporablja vsako rastlino, ki ima plazmodezme s polisaharidi, ki kontrolirajo prepustnost med celicami. Rastline, ki imajo plazmodezme z depoziti kaloze so na primer iz skupine Archaeplastida, ki vključuje vse terestrične rastline in zelene alge. Rastline so lahko enokaličnice ali dvokaličnice, najbolje če so iz družin Solanaceae, Poaceae, Fabaceae, Brassicaceae, Musaceae, Cucurbitaceae, Apiaceae, Rosaceae in Salicaceae.

Najbolj zaželena je uporaba rastlin iz rodov Solanum in Nicotiana, na primer N. tabacum, N. benthamiana in Solanum tuberosum, ker so med najbolje raziskanimi in najbolj uporabljanimi rastlinami za rastlinsko proizvodnjo proteinov.

Presenetljivo je bilo odkrito, da lahko z oslabitvijo naravnega obrambnega mehanizma rastlin proti virusom, preko tarčnega in kontroliranega povečevanja prepustnosti med celicami z nižanjem količine kaloze v plazmodezmah, povečamo proizvodnjo proteinov.

Jedro tega izuma predstavlja vnos polinukleotidnih zaporedij i) in ii) v rastlinske celice, da se dovoli širjenje polinukleotidnega zaporedja i). Polinukleotidni zaporedji i) in ii) sta lahko prisotni na enem nukleotidnem zaporedju ali na ločenih nukleotidnih zaporedjih. Vnos obeh zaporedij je lahko združen ali narejen ločeno. Tako je v enem delu izuma polinukleotidno zaporedje ii) najprej vneseno v rastlino, da se stabilno integrira v rastlinski genom. Za tem je vneseno polinukleotidno zaporedje i), njegovo širjenje po rastlini je omogočeno s polinukleotidnim zaporedjem ii), kjer se na koncu izrazi, da se proizvede želen protein. V drugem delu izuma sta obe zaporedji i) in ii) hkrati vneseni v rastlino.

Heterologno nukleotidno zaporedje ali zaporedja so ponavadi DNA in vključuje nukleotidno zaporedje, ki kodira RNA replikon.

Izvor omenjenega RNA replikona nima kritičnega pomena za ta izum. Lahko je katerikoli replikon, kije ustrezen za rastlinsko proizvodnjo proteinov. Strokovnjaki lahko izberejo primeren replikon. Na primer, replikon lahko izvira iz skupine virusov, ki lahko okužijo rastline in so navedeni v VIDE (Virus Identification Data Exchange), objavljenem v »Viruses of Plants« od A. A. Brunt, Horticulture Research International, VVellesbourne, UK.

Ti virusi lahko izvirajo iz katerekoli skupine virusov, dsRNA virusov, ssRNA virusov, negativnih ssRNA virusov, ssDNA in dsDNA. Primeri izvornih virusnih replikonov so virus mozaika tobaka (TMV), krompirjev virus X (PVX), virus mozaika graha (CPMV), virus šarke (PPV), virus mozaika Alstroemeria (AIMV), virus razraščanja in pritlikavosti paradižnika (TBSV), virus mozaika kumar (CMV), virus rumenega mozaika bučk (ZYMV), krompirjev virus A(PVA) in virus mozaike repe (TuMV). Standard akronimov se lahko najde v »A list of proposed standard acronyms for plant viruses and viroids«, Archives of Virology, 1991.

V metodi tega izuma je vneseno najmanj eno zaporedje i), ki kodira najmanj en želen protein. Želen protein je lahko katerikoli protein, na primer proteini za terapevtsko uporabo, na primer terapevtski proteini, kot so protitelesa, cepiva, encimi, antibiotiki, hormoni, citokini in interferoni.

Ta izum pokriva različne možnosti proizvodnje proteinov v rastlinah. Možno je vnesti zaporedje za samo en protein ali zaporedja za več kot en protein za proizvodnjo. Razen tega lahko polinukleotid vključuje več kot eno kopijo zaporedja i).

En primer želenega proteina je protitelo, kjer je zaporedje lahke in težke verige na istem polinukleotidu ali na različnih polinukleotidih.

Nadalje, kot je opisano zgoraj, je lahko uporabljen en, dva ali več modulatorjev, ki lahko imajo enako ali različne vloge. Če je uporabljenih več modulatorjev, so lahko zaporedja, ki jih kodirajo, na istem polinukleotidu ali na različnih polinukleotidih. Uporaba več kot enega modulatorja je lahko uporabna za optimalno prilagoditev prepustnosti med celicami. Ta prilagoditev se lahko doseže tudi z regulacijo ali kontrolo izražanja teh zaporedij. Metode za indukcijo ali kontrolo izražanja zaporedij so strokovnjakom poznane.

V prednostnem delu tega izuma zaporedje ii) kodira encim p-l,3-glukanazo. To zaporedje je lahko na istem heterolognem nukleotidnem zaporedju, kot je zaporedje za protein(e), ki bodo proizvedeni. Lahko je tudi na ločenem heterolognem nukleotidnem zaporedju.

Kot dodatek k kodirajočem nukleotidnem zaporedju (3-l,3-glukanaze, je lahko uporabljena ena ali več modulatornih zaporedij ali zaporedij, ki kodirajo modulatorne snovi.

Uporabljena je lahko katerakoli kombinacija polinukleotidnih zaporedij i) in ii), torej katerakoli kombinacija števila in tipov zaporedij. Posebej zaželjena je kombinacija zaporedja, ki kodira β-1,3glukanazo, z zaporedjem, ki kodira želen protein.

V prednostnem delu tega izuma polinukleotidno zaporedje i) predstavlja zaporedje enega želenega proteina.

Metoda tega izuma se lahko uporabi za vnos zaporedij, ki kodirajo en želen protein ali več, ali za vnos različnih zaporedij, ki kodirajo različne proteine.

Tako lahko polinukleotidno zaporedje i) vključuje tudi zaporedja za najmanj dva želena proteina, na primer lahko in težko verigo protitelesa.

V enem delu tega izuma sta lahko vneseni vsaj dve posamezni polinukleotidni zaporedji i), od katerih vsako zaporedje predstavlja najmanj enega, dva ali več želenih proteinov.

P-l,3-glukanaza je lahko na istem heterolognem nukleotidnem zaporedju, kot tudi najmanj eno polinukleotidno zaporedje i), ki predstavlja zaporedje(a) želenega(ih) proteina(ov).

p-l,3-glukanaza je lahko edino modulatorno zaporedje ali eno od več modulatornih zaporedij. Modulatorna zaporedja so lahko na enem heterolognem nukleotidnem zaporedju ali na vsaj dveh različnih heterolognih nukleotidnih zaporedjih.

Možna je katerakoli kombinacija polinukleotidnih zaporedij i) in ii) glede na kvantiteto in kvaliteto, vključujoč p-l,3-glukanazo.

Zaželena je uporaba kombinacije želenega proteina in zaporedja za p-l,3-glukanazo na dveh različnih heterolognih nukleotidnih zaporedjih, najbolje ne-kompetitivnih, sinergističnih vektorjih, najbolje z inducibilnimi promotorji.

Polinukleotidna zaporedja i) in/ali ii) so lahko del enega velikega heterolognega zaporedja ali iz različnih virusnih replikonov.

V enem delu tega izuma sta polinukleotidni zaporedji i) in ii) del enega velikega heterolognega zaporedja, ki izvira iz enakega virusnega replikona.

V enem delu tega izuma so polinukleotidna zaporedja i) in ii) iz dveh velikih heterolognih zaporedij, ki izvirajo iz različnih virusnih replikonov, ki so lahko sinergistični ali ne-kompetitivni, kot na primer TMV in PVX.

Katerikoli polinukleotid tega izuma vključuje tudi promotor. Uporabljen promotor ni kritičen. Lahko je katerikoli promotor primeren za izražanje v rastlinah in primeren za izražanje zaporedja, ki ga želimo izraziti. Izbira optimalnega promotorja je za strokovnjaka rutinska, prav tako so poznane metode izbire ustreznih promotorjev. Primer ustreznih promotorjev sta p35s in Act2.

Navadno je promotor prisoten navzgor od kateregakoli zaporedja. V metodi tega izuma, je lahko uporabljen enak promotor za katerokoli polinukleotidno zaporedje ali pa so uporabljeni različni promotorji za različna polinukleotidna zaporedja. Tako je možno uporabiti različna modulatorna

zaporedja z enakim promotorjem ali različne promotorje za vsako modulatorno zaporedje. To omogoča kontrolo nivoja izražanja.

Na primer, izražanje želenega proteina, ki bo proizveden, je lahko pod kontrolo močnejšega promotorja, kot izražanje modulatornega zaporedja.

Promotorje lahko konstitutiven ali inducibilen. Tip promotorja je lahko enak za vse polinukleotide, ali pa je različen. Tako je v enem delu tega izuma promotor za modulatorno zaporedje lahko inducibilen, medtem ko je promotor za želen protein konstitutiven, ali pa sta oba inducibilna. Za več stopenjsko indukcijo je koristno, če so promotorji različni.

Promotorje lahko kemično-reguliran promotor, vključujoč promotorje, katerih transkripcijska aktivnost je regulirana s prisotnostjo ali odsotnostjo alkohola, tetraciklina, steroidov, kovin in ostalih zmesi, ali fizikalno-reguliran promotor, vključujoč promotorje, katerih transkripcijska aktivnost je regulirana s prisotnostjo ali odsotnostjo svetlobe in nizkih ali visokih temperatur.

V enem delu tega izuma sta zaporedji i) in ii) na različnih vektorjih navzdol od dveh različnih inducibilnih promotorjev. Ta sestav omogoča kontrolirano izražanje zaporedij, ki v stopnji distribucije olajšajo širjenje virusa med celicami, sledi stopnja izklopa, kateri pa sledi indukcija zaporedja i) v proizvodnji stopnji.

Količina polisaharida je lahko spremenjena na različne načine, ločeno, zaporedoma ali hkrati. Ena možnost je znižanje količine že prisotne kaloze z uporabo hidroliznih encimov skupine EC 3.2.1. Druga možnost je inhibicija encimov (EC 2.4.1), ki sintetizirajo novo kalozo. Možna je tudi uporaba obeh načinov hkrati, kjer inhibiramo sintezo encimov, obenem pa uporabimo še razgrajevalne encime.

Heterologna polinukleotidna zaporedja i) in ii) v tem izumu so lahko del virusnega ekspresijskega sistema in obsegajo enega ali več vektorjev. Eno ali več polinukleotidnih zaporedij i) je lahko na istem ali na ločenih različnih vektorjih. Eno ali več polinukleotidnih zaporedij ii) je lahko na istem ali na ločenih različnih vektorjih. Eno ali več polinukleotidnih zaporedij i) in ii) je lahko na istem vektorju.

V enem delu tega izuma sta polinukleotidni zaporedji i) in ii) na različnih vektorjih, najbolje na nekompetitivnih sinergističnih vektorjih, kot sta TMV in PVX.

V enem delu tega izuma je polinukleotidno zaporedje ii) pripravljeno z uporabo pMDC32 vektorskega ogrodja. Najbolje je, če polinukleotidno zaporedje ii) obsega pMDC32 kot vektorsko ogrodje in • · • · ···*· · ···· · «· « zaporedje, ki kodira P-l,3-glukanazo. Curtis 2003 je objavil vektor pMDC32 v Plant Physiol. 2003 Oct;133(2):462-9. Ena variacija vektorja je objavljena v GenBank pod dostopno številko FJ172534.

V metodi tega izuma so polinukleotidi vneseni v rastlinske celice.

Metode vnosa velikih heterolognih nukleotidnih zaporedij v rastlinske celice so poznani. Strokovnjak s tega področja lahko izbere metodo prilagojeno na kombinacijo rastline in vektorja.

Takšne metode so lahko kemijske metode, kot na primer transfekcija s kalcijevim fosfatom, ciklodekstrinom, liposomi (lipofekcija) in transformacija plastidov s polietilenglikolom (PEG), ali neposredne ne-kemijske metode kot so na primer biolistično bombardiranje z gensko pištolo, elektroporacija, magnetofekcija in sonoporacija, ali transdukcija z virusnimi metodami.

Vse od teh metod so lahko uporabljene v različnih kombinacijah.

Ena od metod je rastlinska transformacija z bakterijo Agrobacterium. Bakterije, ki nosijo virusni ekspresijski sistem so lahko iz skupine, ki obsega Agrobacterium tumefaciens, A. rhizogenes, Sinorhizobium meliloti, Rhizobium sp. in Mesorhizobium loti, brez omejitve na to skupino.

Nadalje so lahko heterologna zaporedja vnesena v rastlinske celice z visokotlačnim škropljenjem bakterijske suspenzije na rastlinsko tkivo, kije bilo predpripravljeno za transfekcijo z mehanskim abrazivom (kot je silikonski karbid, karborund), saj ta poveča učinkovitost transfekcije preko ranitve rastlinskega tkiva.

Nadalje so lahko heterologna zaporedja vnesena v rastlinske celice z visokotlačnim škropljenjem bakterijske suspenzije skupaj z mehanskim abrazivom (kot je silikonski karbid, karborund) na rastlinsko tkivo, saj abraziv poveča učinkovitost transfekcije preko ranitve rastlinskega tkiva.

Poleg tega so lahko heterologna zaporedja vnesena v rastline z Magnifekcijo.

Čeprav se lahko vnos naredi po celi rastlini, je prednost metode tega izuma, da se lahko vnos heterolognega(ih) zaporedja(ij) zgodi na enem ali nekaj vstopnih mestih in kljub vsemu se bodo zaporedja razširila po celotni rastlini zaradi izražanja polinukleotidnega(ih) zaporedja(ij) ii).

Vnos je lahko stabilen in vodi do transgene rastline, lahko pa je prehoden.

V enem delu tega izuma je modulatorno zaporedje stabilno integrirano v rastlinski genom, zaporedje, ki kodira želen protein pa je vneseno prehodno.

Rastlinske celice so lahko del cele rastline ali del rastlinskega celičnega tkiva.

Polinukleotidno(a) zaporedje(a) ii) lahko kodira(jo) katerikoli želen protein, kot so terapevtski proteini, kot na primer protitelesa, cepiva, encimi, antibiotiki, hormoni, citokini in interferoni.

Z namenom olajšanja zaključnih postopkov proizvodnje želenega(ih) proteina(ov), so lahko proteini označeni z dodatnim zaporedjem ali lokalizacijskim signalom, na primer His-Tag ali lokalizacijskim signalom, ki omogoča izločanje proteina z gutacijo.

Polinukleotidno(a) zaporedje(a) ii) je (so) lahko katerikoli polinukleotid, ki poveča prepustnost med celicami po izražanju ali translaciji.

Modulatorno zaporedje, ki poveča prepustnost med celicami, je definirano kot zaporedje, ki po izražanju poveča širjenje virusa za najmanj 5%, še bolje med 10% do 200%, če primerjamo z virusnim širjenjem brez modulatornega zaporedja.

Metode preverjanja širjenja zaporedja po rastlini so poznane. En pristop je vnos zaporedja i), ki kodira reporterski gen (kot na primer zeleni fluorescentni protein, GFP) in modulatornega zaporedja ii) v rastlino; kot kontrola je zaporedje i) vneseno brez modulatornega zaporedja. Povečanje širjenja je lahko merjeno s primerjavo reporterskih signalov, na primer fluorescenco, če je GFP reporterska molekula. Širjenje reporterskega proteina je lahko v primeru GFP merjeno kot fluorescenca po celotni rastlini.

Druga metoda preverjanja virusnega širjenja je z inokulacijo spodnjih listov rastline z zaporedjem i), ki kodira želen protein, in z modulatornim zaporedjem ii); kot kontrola je zaporedje i) vneseno brez modulatornega zaporedja. Po določenem času se izmeri izražanje želenega proteina v neinokuliranih zgornjih listih, količine proteina pa se primerjajo. Alternativna možnost spremljanja širjenja vektorja je merjenje količine mRNA reporterskega gena s PCR v realnem času.

Nadalje ta izum nudi vektorski sistem, kije lahko uporabljen v zgoraj opisani metodi. Vektorski sistem lahko obsega vsaj en vektor, ki vključuje promotor (lahko inducibilen promotor) in vsaj en polinukleotid, ki vključuje zaporedji i) in ii), kot je definirano v zahtevku 1; ali pa lahko obsega kombinacijo dveh vektorjev, kjer en vektor vključuje promotor (lahko inducibilen promotor) in vsaj eno zaporedje i), kot je definirano v zahtevku 1, in drug vektor, ki vključuje promotor (lahko inducibilen promotor) in vsaj eno zaporedje ii) kot je definirano v zahtevku 1.

Bakterija, ki vsebuje zgoraj omenjeni vektorski sistem in rastlina, ki vsebuje omenjeno bakterijo, sta tudi del tega izuma.

Primer 1:

Gen za P-l,3-glukanazo je bil pomnožen iz cDNA krompirja Solanum tuberosum cv. Igor z uporabo PCR z začetnima nukleotidoma glucl3F (SEQ ID NO:1) in gluc!3R (SEQ ID NO:2), z rezultatom glulll (SEQ ID NO:3). glulll je bil kloniran v plazmid pENTR D-TOPO z uporabo pENTR™ Directional TOPO® Cloning Kit (Invitrogen, ZDA), s čimer smo dobili pENTRglulll plazmid (Slika 1).

Gen je bil nato kloniran v pMDC85 plazmid (Curtis and Grossniklaus, 2003, in Plant Physiol. 2003 Oct; 133(2):462-9) z uporabo Gateway® LR Clonase™ Enzyme Mix (Invitrogen, ZDA), s čimer smo dobili pMDC85_glulll plazmid (Slika 2). Ta plazmid je bil elektroporiran v Electromax™ Agrobacterium tumefaciens LBA4404 celice (Invitrogen, ZDA) z uporabo Eppendorf 2510 elektroporatorja.

Transformacija krompirja (Solanum tuberosum cv. Desiree) je bila izpeljana v skladu s protokolom od Visser et al. 1989 (Plant Molecular Biology 12, No. 3:329-337) z Agrobacterium tumefaciens LBA4404 celicami, ki nosijo pMDC85_glulll. Tri transgene linije (pozitivne na pMDC85_glulll konstrukt), Gl, A6 in A2, z različnim nivojem izražanja glulll so bile izbrane za nadaljnje poizkuse.

Transgene linije in kontrolne (divji tip) rastline so bile prenesene iz tkivnih kultur v zemljo, kjer so rasle v rastnih komorah s 16 urno fotoperiodo pri 21 ± 2 °C v svetlem in pri 18 ± 1 °C v temi, z relativno vlažnostjo 75% ± 2%, svetlobnim obsevanjem 70-90 pmol/m2/s2 (L36VV/77 lamp, Osram, Nemčija). Po štirih tednih rasti v zemlji so bili po trije spodnji listi vsake transgene in kontrolne rastline inokulirane s krompirjevim virusom Y^N™ (PVY). Spodnji inokulirani in zgornji neinokulirani listi so bili pobrani po 7 dneh. Iz vzorcev je bila izolirana celokupna RNA in pretvorjena v cDNA. Relativna količina RNA, ki kodira plaščni protein (CP) PVY, je bila v vzorcih listov določena s kvantitativnim PCR v realnem času z NTN F začetnim nukleotidom, NTN R začetnim nukleotidom in NTN sondo (Kogovšek et al. 2008, Journal of Virological Methods, 149:1-11). Za normalizacijo je bil uporabljen gen cox z začetnima nukleotidoma COX-F in COX-R ter sondo COX-P (Weller et al., 2000, Applied and Environmental Microbiology, 66(7):2853-2858). Ker količina inokuluma ob inokulaciji ne more biti popolnoma izenačena, je bila količina CP PVY v spodnjih listih normalizirana na vrednost 1000 enot pri vseh vzorcih, uporabljenih v izračunih. Povprečna količina CP v zgornjih neinokuliranih listih kontrolnih rastlin je bila 1, medtem ko je bila povprečna količina CP v zgornjih neinokuliranih listih pri transgenih linijah 130.

Primer 2:

Gen glulll (SEQ ID NO: 3) v pENTR_glullI plazmidu (Slika 1) je bil kloniran v pMDC32 plazmid (Curtis and Grossniklaus, 2003, in Plant Physiol. 2003 Oct;133(2):462-9) z uporabo Gateway® LR Clonase™ Enzyme Mix (Invitrogen, ZDA), s čimer smo dobili pMDC32_glulll plazmid (Slika 3). Ta plazmid je bil elektroporiran v Electromax™ Agrobacterium tumefaciens LBA4404 celice (Invitrogen, ZDA) z uporabo Eppendorf 2510 elektroporatorja.

Transformacija krompirja (Solanum tuberosum cv. Desiree) je bila izpeljana v skladu s protokolom od Visser et al. 1989 (Plant Molecular Biology 12, No. 3:329-337) z Agrobacterium tumefaciens LBA4404 celicami, ki nosijo pMDC32_glulll. Transgena linija (pozitivna na pMDC32_glulll konstrukt) J3 je bila izbrana za nadaljnje poizkuse.

Transgene in kontrolne (divji tip) rastline so bile prenesene iz tkivnih kultur v zemljo, kjer so rasle v rastnih komorah s 16 urno fotoperiodo pri 21 ± 2 °C v svetlem in pri 18 ±1°C v temi, z relativno vlažnostjo 75% ± 2%, svetlobnim obsevanjem 70-90 pmol/m2/s2 (L36VV/77 lamp, Osram, Nemčija). Po štirih tednih rasti v zemlji so bili po trije spodnji listi vsake transgene in kontrolne rastline inokulirane s krompirjevim virusom Y^NTN (PVY). Spodnji inokulirani in zgornji neinokulirani listi so bili pobrani po 1,4 in 7 dneh. Iz vzorcev je bila izolirana celokupna RNA in pretvorjena v cDNA. Relativna količina RNA, ki kodira plaščni protein (CP) PVY, je bila v vzorcih listov določena s kvantitativnim PCR v realnem času z NTN F začetnim nukleotidom, NTN R začetnim nukleotidom in NTN sondo (Kogovšek et al. 2008, Journal of Virological Methods, 149:1-11). Za normalizacijo je bil uporabljen gen cox z začetnima nukleotidoma COX-F in COX-R ter sondo COX-P (Weller et al., 2000, Applied and Environmental Microbiology, 66(7):2853-2858). Ker količina inokuluma ob inokulaciji ne more biti pololnoma izenačena, je bila količina CP PVY v spodnjih listih normalizirana na vrednost 1000 enot pri vseh vzorcih, uporabljenih v izračunih. Povprečna količina CP po 7 dneh v zgornjih neinokuliranih listih kontrolnih rastlin je bila 8, medtem ko je bila povprečna količina CP v zgornjih neinokuliranih listih pri transgeni liniji 28.

Seguence listing <110> National Institute ofBiology <120> Use of glycosidases and glycosyltransferases for enhanced protein production <160> 3 <170> Patentln version 3.3 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220>

<223> forvvard Primer <400> 1 caccatggct tgtaccaaac ta 22 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220>

<223> reverse Primer <400> 2 tgttgaaact gatcgcgtat tttgg 25 <210> 3 <211> 1037 <212> DNA <213> Solanum tuberosum cv. Igor <400> 3 caccatggct tgtaccaaac tacattttcc aattaccgtg acgactctgc tggtgatact 60 tatattggct accttagatc tcacaggagc acaaacagga gtttgttatg gaagaaatgg 120 • · gaatggatta ccatctccag tagatgttgt gggtctatgc aatcgaaaca atatacgaag 180 aatgagaatc tatgatcctc atcaaccaac tctccaagcc cttagaggtt cgaatattga 240 actcatacta ggcgtgccaa atcctgacct tcagaatatc gcgtctagcc aagctaacgc 300 gaatgcttgg gtccaaaaca atgttaggaa ctatggtaat gtcaagttca ggtatatagc 360 tgttggaaat gaagttagtc cattaaatgg taacgcgcag tatgtacctt tcgtgatcaa 420 tgcaatgaga aacattcaga acgcgatttc tggtgctggt cttggaaacc agatcaaagt 480 ttctactgct attgaaaccg aacttactac agatacttac cctccatcaa gaggcaaatt 540 taaagacaac gtccgaggat atgttgatcc catcatcaga ttcttagtag ctaaccgctc 600 acctttactt gtcaacatat atccttactt tgcaatagca aacaatcaag ctattcagct 660 tgactacgcg ctgtttacat cccctggagt tgttgtaaat gataatggaa gagcataccg 720 caacctgttt gatgcactct tagatgctac atactcagcc cttgaaaagg ccggtggttc 780 atctttggac atcgttgtat cagagagcgg ttggccttca gctggagcag ggcaattgac 840 gtccattgac aacgcaagga cttacaacaa caacttgatt agacatgtga aaggagggag 900 tccgaaaaga ccatcaaagc caattgaagc ttacattttc gcgctgttga atgaagatct 960 gaagagccct gaaattgaga aacattttgg actgtttaca ccaaacaggc agccaaaata 1020 cgcgatcagt ttcaaca 1037

Claims (17)

1. Sistem proizvodnje proteinov, označen s tem, da proizvede najmanj en protein v rastlinskih celicah, ki vključuje korak:

a. vnos v celico najmanj enega polinukleotida, ki vsebuje najmanj eno zaporedje i) ki kodira protein za proizvodnjo in najmanj en polinukleotid, ki vsebuje kodirajoče zaporedje ii) za še najmanj en protein ali poliribonukleotid, ki poveča prepustnost med celicami v tarčnih celicah ali

b. vnos v celico najmanj enega polinukleotida, ki vsebuje oba, polinukleotid i) in polinukleotid ii).

2. Sistem za proizvodnjo proteinov po zahtevku 1, označen s tem, da so rastlinske celice del rastlinskega tkiva ali celotne rastline, kjer je tkivo ali rastlina iz skupine enokaličnic ali dvokaličnic, prednostno iz rastlinskih družin Solanaceae, Poaceae, Fabaceae, Brassicaceae, Musaceae, Cucurbitaceae, Apiaceae, Rosaceae in Salicaceae, prednostno iz rodu Nicotiana, najbolje N. tabacum ali N. benthamiana, ali iz rodu Solanum, najbolje S. tuberosum.

3. Sistem za proizvodnjo proteinov po zahtevku 1, označen s tem, da je metoda vnosa polinukleotidov Magnifekcija in/ali visokotlačno škropljenje suspenzije, ki vključuje polinukleotide in/ali abraziv, najbolje karborund.

4. Sistem za proizvodnjo proteinov po zahtevku 3, označen s tem, da so polinukleotidi vneseni v en ali več ločenih delov rastline ali rastlinskega tkiva, ali v celotno rastlino ali tkivo in/ali kjer so polinukleotidi vneseni istočasno in/ali eden za drugim.

5. Sistem za proizvodnjo proteinov po predhodnih zahtevkih, označen s tem, da so polinukleotidna zaporedja vnesena z bakterijami iz skupine, ki vključuje Agrobacterium tumefaciens, A. rhizogenes, Sinorhizobium meliloti, Rhizobium sp. in Mesorhizobium loti.

6. Sistem za proizvodnjo proteinov po predhodnih zahtevkih, označen s tem, da polinukleotidna zaporedja izvirajo iz kateregakoli rastlinskega virusa, najbolje TMV in/ali PVX, najbolje v kombinaciji ne-kompetitivnih TMV in PVX vektorjev.

• ·

7. Sistem za proizvodnjo proteinov po predhodnih zahtevkih, označen s tem, da polinukleotidno(a) zaporedje(a) ii) kodira(jo) encime, ki so zmožni razgradnje polisaharidov.

8. Sistem za proizvodnjo proteinov po predhodnih zahtevkih, označen s tem, da polinukleotidno(a) zaporedje(a) ii) kodira(jo) snovi, ki znižajo izražanje in/ali inhibirajo encime, ki so sposobni sinteze polisaharidov, ki regulirajo prepustnost med celicami.

9. Sistem za proizvodnjo proteinov po predhodnih zahtevkih, označen s tem, da je sistem za proizvodnjo proteinov po zahtevku 7 kombiniran s sistemom za proizvodnjo proteinov po zahtevku 8.

10. Sistem za proizvodnjo proteinov po zahtevku 7 ali 9, označen s tem, da je encim iz skupine EC 3.2.1.

11. Sistem za proizvodnjo proteinov po zahtevku 8 ali 9, označen s tem, da je encim, katerega izražanje je znižano ali pa je inhibiran, iz skupine EC 2.4.1.

12. Sistem za proizvodnjo proteinov po predhodnih zahtevkih, označen s tem, da so proteini, sposobni olajšanja širjenja, izraženi v prvi stopnji z indukcijo in izklopljeni po razširitvi ter da so v nadaljnji stopnji inducirani želeni proteini.

13. Sistem za proizvodnjo proteinov po zahtevku 8 ali 9, označen s tem, da je znižanje izražanja in/ali inhibicija narejena preko inhibitornih snovi, kot so siRNA, shRNA, dsRNA, mikroRNA, spiegelmere, ki so L-oligonukleotidi, DNA-, RNA- ali peptidni aptameri, ribocimi, abcimi, ki so kataiitska protitelesa ali encimi.

14. Sistem za proizvodnjo proteinov po zahtevku 13, označen s tem, da je ustvarjena transgena rastlina s stabilnim vnosom.

15. Vektorski sistem, označen s tem, da obsega vsaj en vektor, ki vključuje promotor, opcijsko inducibilen promotor, in vsaj en polinukleotid, ki vključuje zaporedja i) in ii) definirana v zahtevku 1; ali obsega kombinacijo dveh vektorjev, kjer en vektor vključuje promotor, opcijsko inducibilen promotor, in vsaj eno zaporedje i) definirano v zahtevku 1, in kjer drugi vektor vključuje promotor, lahko inducibilen promotor, in vsaj eno zaporedje ii) definirano v zahtevku 1.

16. Bakterija, označena s tem, da vključuje vektorski sistem po zahtevku 15.

17. Rastlina, označena s tem, da vsebuje bakterijo po zahtevku 16.