SI21222A - Postopek za pripravo nanodelcev - Google Patents

Abstract

Predloženi izum se nanaša na nov postopek za pripravo nanodelcev. Še zlasti se ta izum nanaša na postopek, kjer za pripravo biološko razgradljivih nanodelcev iz kopolimerov mlečne in glikolne kisline uporabimo postopek dvojne emulzije voda-v-olju-v-vodi (V/O/V) ob pogojih nizke energije, ki vključuje hkratno mešanje in sonifikacijo, in kjer nanodelci vsebujejo eno ali več aktvnih snovi, pri čemer se ohrani biološka aktivnost vgrajene aktivne snovi.ŕ

Description

Postopek za pripravo nanodelcev

Tehnično področje izuma

Predloženi izum se nanaša na nov postopek za pripravo nanodelcev. Izum se še zlasti nanaša na postopek za pripravo biološko razgradljivih nanodelcev iz kopolimerov mlečne in glikolne kisline, ki vsebujejo eno ali več aktivnih snovi, z uporabo postopka dvojne emulzije voda-v-olju-v-vodi (V/O/V).

Ozadje izuma

V preteklosti so bila kot rezultat obširnega napredka na področju biotehnologije in genetskega inženiringa pripravljena številna nova proteinska zdravila, za katera se domneva, da imajo visok potencial v zdravljenju različnih bolezni. Na primer, za zdravljenje raka so bili kot potencialna protitumorska sredstva predlagani številni proteini, ki imajo sposobnost, da oslabijo tumorsko rast, invazijo in metastaziranje. Ti proteini vključujejo tudi proteazne inhibitorje, kot so TIMP-ji (tkivni inhibitorji metalo proteaz), inhibitorji plasminogenskega aktivatorja in cistatini.

Ena od pomanjkljivosti proteinskih zdravil je njihova nestabilnost v fiziološkem okolju, njihova nagnjenost k encimatski razgradnji in s tem krajša razpolovna doba in vivo. Nadalje so proteini v večini primerov velike molekule, ki težko prehajajo skozi biološke membrane, kar znatno zmanjša njihovo uporabnost.

Da bi presegli nekatere izmed gornjih problemov, so razvili nosilne sisteme za aktivne snovi, ki izboljšajo razpolovno dobo in biološko uporabnost takšnih snovi. Med takšnimi sistemi predstavljajo zelo obetaven pristop nanodelci, saj so njihove lastnosti zaščite aktivne snovi in nadzorovanega sproščanja zelo koristne. Še zlasti je bilo ugotovljeno, da nanodelci omogočajo transport učinkovin skozi biološke membrane in specifično ciljanje s potencialno površinsko modifikacijo (Lamprecht A., Ubrich N.,

Perez M. H., Lehr C. M., Hoffman M., Maincent P., Biodegradable monodispersed nanoparticles prepared by pressure homogenization-emulsification, Int. J. Pharm. 184 (1999) 97-105).

Glavno prednost nanodelcev predstavlja možnost njihove različne uporabe. Omogočajo parenteralne in neparenteralne načine vnosa. Injiciramo jih lahko intravensko in ker je protein vključen znotraj polimernega matriksa in s tem zaščiten pred krožečimi encimi, je plazemska razpolovna doba vključenega proteina podaljšana v primerjavi z injicirano raztopino proteina. Sproščanje proteina iz nanodelcev je tudi zadržano, kar ima za posledico podaljšano aktivnost proteina. Nadalje lahko, ob izbiri ustreznega polimera, nanodelci olajšajo absorpcijo skozi biološke membrane. Možno je tudi peroralno jemanje. Pri tem je odločilni parameter velikost delcev, ki določa absorpcijo iz gastrointestinalnega trakta. Manjši nanodelci se običajno absorbirajo v večjem obsegu.

Do sedaj je bilo razvitih več kapsulacijskih tehnik za pripravo nanodelcev, ki uporabljajo dva glavna principa, to je enojno (V/O) in dvojno (V/O/V) emulzijsko metodo.

Tako je v US 4,177,177 opisan postopek direktnega emulgiranja raztopine v vodi netopnih polimerov v primernih organskih topilih v vodno raztopino, ki vsebuje vsaj en emulgator neionskega, anionskega ali kationskega tipa. Za zmanjševanje velikosti kapljic emulzije so uporabili ultrazvok (sonifikacijo), s čimer so dosegli velikost delcev manjšo od 0,5 pm.

V EP 0 052 510 B2 je opisana tehnika ločevanja faz ob uporabi koacervacijskih sredstev ali ne-topil, kot so mineralna olja in rastlinska olja. Aktivna snov, npr. polipeptid, se najprej raztopi v vodni fazi emulzije voda-v-olju. Polimer se obori okoli vodnih kapljic z dodatkom ne-topila za polimer, kot je silikonsko olje. Nato se doda sredstvo za utrjevanje, da se ekstrahira organsko topilo iz mikro- ali nanodelcev.

Vendar pa je ena od pomanjkljivosti navedenega postopka v veliki porabi organskih topil, ki so potrebna za ekstrakcijo in spiranje.

V US 5,019,400 je opisan še en postopek, v katerem se uporablja tehnika sušenja z razprševanjem in/ali tehnika oblaganja z razprševanjem Za sušenje z razprševanjem sta polimer in aktivna snov dispergirana v topilu za polimer. Topilo se nato upari z razprševanjem raztopine, kar ima za posledico tvorbo polimernih kapljic, ki vsebujejo aktivno snov. Vendar pa lahko občutljive snovi, kot so proteini, postanejo med postopkom neaktivne zaradi uporabljenih povišanih temperatur in zaradi izpostavitve mejnim površinam organsko topilo/zrak.

V US 5,407,609 je opisan postopek, v katerem se uporablja uparevanje topila. Tehnika uparevanja topila (postopek olje-v-vodi (O/V)) vključuje raztopitev polimera in aktivne snovi v organskem topilu, nakar se raztopino doda k mešajoči se vodni zunanji fazi, ki se ne meša s polimerom. Vodna zunanja faza običajno vsebuje surfaktante, ki stabilizirajo emulzijo olje-v-vodi in preprečijo aglomeracijo. Uporabljeni emulgator je običajno polivinil alkohol. Organsko topilo se nato v času nekaj ur ali več upari, pri čemer se polimer obori, tako da se tvori polimerni matriks.

Razvita je bila tudi tako imenovana dvojna emulzij ska metoda voda-v-olju-v-vodi (V/O/V), ki je uporabna še zlasti kadar se uporabijo v vodi topni peptidi, ki se jih le težko vgradi z običajnim postopkom olje-v-vodi (O/V) (EP 0 190 833 BI). Glavna prednost tega postopka je v tem, da med postopkom tvorbe nanodelcev protein ostaja v notranji vodni fazi, s čimer se zmanjša neposredni stik med proteinom in organskim topilom. Ta postopek vključuje raztapljanje proteina v vodi, dodajanje vodne raztopine proteina ob mešanju k organski polimerni raztopini in tvorbo prve V/O emulzije. Ta V/O emulzija se nato vlije v vodno fazo, ki vsebuje emulgator, pri čemer se ob mešanju tvori dvojna V/O/V emulzija. Organsko topilo se naknadno odstrani z uparevanjem ali ekstrakcijo.

Vendar pa se lahko med pripravo takšne vrste nanodelcev pojavijo med topilom in proteinom značilne destruktivne interakcije, ki so delno posledica uporabljenih organskih topil, strižnih sil med mešanjem in sonifikacijo, kar vse zmanjša biološko aktivnost vgrajene aktivne snovi.

Odločilni korak v pripravi mikro- in nanodelcev je emulgiranje, ki se ga lahko splošno izvede s sonifikacijo, visokotlačno homogenizacijo ali s homogenizacijo z visokim strigom. Mešanje, združeno z naknadno sonifikacijo eno uro, ima običajno za rezultat nanodelce s premerom večjim od 1400 nm. (Ferdous A. J., Stembridge N. Y., Singh M. Role of monensin PLGA polymer nanoparticles and liposomes as potentiator of ricin A immunotoxins in vitro, J.Control. Rel. 50, 1998: 71-78). Za pridobitev delcev v nanometrskem območju je potrebna višja energija, kar ima pogosto za posledico izgubo biološke aktivnosti proteina. Kadar so uporabili postopek uparevanja topila olje-v-vodi (O/V) in so združili vse tri postopke, t.j. vzorec so homogenizirali (20 000 vrt./min, 20 minut), čemur je sledilo hkratno mešanje (500 vrt./min) in sonifikacija 1 uro, so dobili delce velikosti manj kot 200 nm.

Rešitev tehničnega problema z izvedbenimi primeri

Naloga predloženega izuma je torej rešiti pomanjkljivosti stanja tehnike in zagotoviti nov postopek za pripravo nanodelcev, ki nima znatnega škodljivega učinka na aktivne snovi, ki jih želimo vključiti.

Med obširnimi študijami, ki so vodile do predloženega izuma, so izumitelji ugotovili, da ima kombinacija različnih ukrepov, namreč mešanja in sonifikacije, obeh na nivoju, pri katerem vsak posamezen ukrep kot tak nima za posledico dovolj intenzivnega emulgiranja, za rezultat nanodelce majhne velikosti, v katerih vgrajena aktivna snov izraža izboljšano biološko aktivnost.

Predloženi izum se torej po enem vidiku nanaša na postopek za pripravo nanodelcev z vgrajeno eno ali več aktivnimi snovmi, kjer uporabimo emulzij sko metodo, pri kateri hkrati izvedemo mešanje in sonifikacijo, vsako pri energetskem nivoju, ki sam ni zadosten za tvorbo nanodelcev, in ki ohrani biološko aktivnost vgrajene aktivne snovi.

V smislu izuma se mešanje in sonifikacija izvedeta hkrati in pri zmernih pogojih. V prednostni izvedbi je hitrost mešanja v območju od 4000 do 15000 vrt./min, prednostno od 5000 do 10000 vrt./min in še bolj prednostno od 5000 do 7000 vrt./min

Sonifikacija se prednostno izvede pri frekvenci od 20 kHz do 70 kHz.

Postopek v smislu izuma še zlasti obsega:

I) raztapljanje biološko razgradljivega polimera v zanj primernem organskem topilu (prednostno v organskem topilu, ki se ne meša z vodo),

II) emulgiranje, pri katerem hkrati izvedemo mešanje in sonifikacijo, vsako pri energetskem nivoju, ki sam ni zadosten za tvorbo nanodelcev, ki obsega:

a) emulgiranje aktivne snovi (prednostno polipeptida ali peptida), raztopljene v vodi ali v zanjo primernem vodnem topilu (npr. v pufru), v organsko raztopino, dobljeno v stopnji I), da zagotovimo nastanek primarne emulzije z aktivno snovjo v notranji vodni fazi in

b) emulgiranje primarne emulzije, dobljene v stopnji Ha), v vodno raztopino emulgatorja kot kontinuirano fazo (prednostno z vodno raztopino polivinil alkohola), tako da dobimo nanodelce, v katerih je vgrajena aktivna snov ter

III) izolacijo in sušenje nanodelcev na znan način (prednostno sušenje izvedemo z liofilizacijo, pri čemer je aktivna snov v stopnji Ha raztopljena v zanjo primernem vodnem topilu, ki vsebuje krioprotektante).

V postopku v smislu izuma uporabimo novo ustrezno modificirano tehniko emulgiranja, pri kateri hkrati uporabimo homogenizacijo z visokim strigom ob nizkih vrtljajih/minuto in sonifikacijo. Dobljeno primarno emulzijo nato emulgiramo v raztopino emulgatorja, da dobimo dvojno emulzijo (V/O/V). Dvojno emulzijo razredčimo s prebitno vodo, da omogočimo odstranitev organskega topila, in zmes mešamo, da omogočimo uparitev topila, s Čimer se inducira obarjanje polimera in s tem tvorba trdnih nanodelcev z vgrajeno aktivno snovjo. Delce izoliramo s centrifugiranjem ali filtracijo in jih večkrat speremo z destilirano vodo ali ustreznimi vodnimi pufri, da s površin odstranimo prebiten emulgator. Nato delce posušimo s konvencionalnimi sredstvi, na primer v vakuumu, s prepihavanjem s plinastim dušikom ali s tokom zraka, z liofilizacijo ali s sušenjem z razprševanjem.

Organsko topilo, uporabljeno v stopnji raztapljanja biološko razgradljivega polimera, je lahko kakršnokoli topilo, ki je sposobno tvoriti emulzijo z določeno količino vodne raztopine emulgatorja, in katerega lahko odstranimo iz emulzijskih kapljic z dodatkom uporabljene prebitne vodne raztopine emulgatorja in ki ima nadalje sposobnost, da raztaplja biološko razgradljive polimere. Z drugimi besedami, topilo se ne sme mešati z vodo ali se z njo v bistvu ne sme mešati, je pa deloma topno v navedeni vodni raztopini emulgatorja. Primeri organskih topil, ki se lahko uporabijo za raztapljanje polimera, so kloroform, benzen, diklorometan, kloroetan, dikloroetan, trikloroetan, ogljikov tetraklorid, etileter, cikloheksan, n-heksan, toluen, bolj prednostno etil acetat, metilen klorid ali zmes metilen klorida in acetona, najbolj prednostno etil acetat. Presenetljivo smo ugotovili, da uporaba etil acetata omeji izgubo biološke aktivnosti proteinov kot je cistatin in zagotovi manjše delce v primerjavi z drugimi topili. Ne da bi želeli biti omejeni s kakršnokoli teorijo menimo, da je to lahko posledica večje topnosti etil acetata v vodi, kar vodi do hitrejše difuzije etil acetata v zunanjo vodno fazo, pri čemer za sabo pusti netopne polimerne delce z vključenim proteinom.

Ker so emulzije termodinamsko nestabilni sistemi, je nujna uporaba emulgatorja. Emulgator služi večim namenom: pripomore k pridobitvi pravilne porazdelitve velikosti kapljic emulzije, stabilizira V/O/V emulzijo, da se izognemo koalescenci kapljic in prepreči, da bi se oborjeni nanodelci lepili eden na drugega. Prednostni primeri emulgatorjev so anionski surfaktanti (npr. natrijev oleat, natrijev stearat, natrijev lavril sulfat itd.), neionski suffaktanti (npr. estri polioksietilen sorbitana in maščobnih kislin (Tween 80, Tvveen 60 itd.)), derivati polioksietilen ricinusovega olja, polivinil pirolidon, polivinil alkohol, karboksimetilceluloza, lecitin, želatina itd., bolj prednostno polivinil alkohol. Takšne emulgatorje lahko uporabimo bodisi same ali v kombinaciji.

Za vgrajevanje aktivne snovi lahko uporabimo množico različnih polimernih materialov, kot so poliestri mlečne in glikolne kisline, polimlečna kislina, poli-βhidroksimaslena kislina, polihidroksivalerinska kislina, polikaprolakton, poliesteramidi, policianoakrilati, poli(amino kisline), polikarbonati, polianhidridi, biološko razgradljivi polimeri, pri čemer je značilno prednosten poliester mlečne in glikolne kisline. Masno razmerje (poli)mlečne kisline/(poli)glikolne kisline je prednostno od okoli 99/1 do 36/65, bolj prednostno 95/5 do 50/50, pri čemer natančno sestavo polimera izbere strokovnjak na osnovi svojega splošnega znanja in v odvisnosti od želene kinetike sproščanja. Mikrosfere in nanodelci iz kopolimerov mlečne in glikolne kisline (PLGA) so biološko kompatibilni, se razgradijo ob tvorbi ne-toksičnih monomerov, polimerni matriks odlično zaščiti proteine in peptide pred destruktivnimi pogoji okolja, še zlasti kadar jih dajemo peroralno. Prav tako lahko z variiranjem molekulske mase in razmerja monomerov PLGA nadzorujemo kinetiko sproščanja vgrajenih aktivnih snovi.

Kot aktivno snov, ki jo vgradimo v smislu predloženega izuma, lahko uporabimo kakršnokoli zdravilno učinkovino, še zlasti snovi, ki imajo kratko razpolovno dobo v telesu, kot so proteini in/ali peptidi. Uporabimo lahko biološko aktivne makromolekule kot so interferoni, interlevkini, kolonije stimulirajoči faktorji, faktorji tumorske nekroze, drugi imuno modulatorji, rastni faktorji, transformirajoči rastni faktorji, eritropoetin, albumin, krvni proteini, hormoni, vakcine, virusi, toksini, protitelesa, protitelesni fragmenti, encimi, encimski inhibitorji vključno s cistatinom.

Poleg aktivne snovi lahko vključimo tudi druge snovi, kot so sredstva za nadzorovanje stabilnosti in, če je želeno, sredstva za nadzorovanje topnosti biološko aktivne snovi. Takšna sredstva so lahko sredstva za nadzorovanje pH, konzervansi ter stabilizatorji in krioprotektanti, ki lahko vključujejo glikole, albumin, želatino, aminokisline, etilendiamin tetraocetno kislino, dimetil sulfoksid, citronsko kislino, dekstrin, saharozo, fruktozo, manozo, trehalozo, ostale sladkorje in vse njihove kombinacije.

Še en vidik predloženega izuma so nanodelci, ki jih dobimo po postopku v smislu predloženega izuma, ki imajo prednostno velikost od okoli 100 do okoli 800 nm. Ti nanodelci dajejo presenetljivo povečano biološko aktivnost in stabilnost aktivnim snovem, ki so vgrajene v njih.

Predloženi izum v bistvu temelji na ugotovitvi, da lahko vrtenje homogenizatorja z visoko hitrostjo (15000 vrt./min), kije običajno potrebno za proizvodnjo nanodelcev, nadomestimo z nižjo hitrostjo, v kolikor je sistem istočasno izpostavljen delovanju ultrazvoka z majhno energijo, pri čemer se biološka aktivnost in biološka uporabnost aktivne snovi, ki je vgrajena, izboljša v primerjavi z nanodelci, proizvedenimi z običajnimi tehnikami samega mešanja ali sonifikacije ali zaporedno kombinacijo obojega.

Ugotovili smo tudi, da krajši čas homogeniziranja (2 minuti v primerjavi s 7 minutami) v večji meri ohrani aktivnost proteina. To je vsaj delno lahko posledica zmanjšanja časa, ki je na razpolago za stik proteina z organskim topilom. Kratek čas izdelave lahko vodi tudi do večje učinkovitosti vgrajenega proteina znotraj nanodelcev, ker ovira difuzijo proteina iz notranje vodne faze proti zunanji fazi velikega volumna.

Nanodelci v smislu izuma so primerni za izdelavo zdravila za parenteralno, nazalno, pulmonalno, peroralno, oralno, transdermalno ali rektalno dajanje aktivne snovi.

Na slikah je:

Sl. 1 prikazuje velikost nanodelcev, pridobljenih s postopkom v smislu predloženega izuma, v primerjavi z nanodelci iz stanja tehnike.

Sl. 2 prikazuje aktivnost cistatina pod različnimi eksperimentalnimi pogoji.

Sl. 3 prikazuje aktivnost cistatina med shranjevanjem, kadar je vgrajen v nanodelcih (3a), dobljenih po predloženem izumu, v primerjavi z raztopino cistatina (3b).

Naslednji primeri ponazarjajo izum, ne da bi bil le-ta nanje omejen.

Primer la

Naslednji postopek smo uporabili za pripravo praznih nanodelcev iz kopolimera mlečne in glikolne kisline (PLGA) (nanodelcev brez vključenega proteina). Izvedli smo študijo za ovrednotenje, kako eksperimentalne omejitve vplivajo na velikost nanodelcev.

Najprej smo pripravili polimerno raztopino tako, da smo v epruveti raztopili 50 mg PLGA (Resomer RG 503H, Boehringer Ingelheim) v 1 ml etil acetata. Nato smo k polimerni raztopini dodali 200 μΐ vode in zmes homogeno emulgirali z rotor-stator homogenizatorjem (Omni Lab tek, Omni International, ZDA) dve minuti. Na dveh različnih vzorcih smo uporabili dve različni hitrosti vrtenja, 15000 oz. 12500 vrt./min. Po eni minuti homogeniziranja smo k homogeniziram zmesi dodali 4 ml 5 % vodne raztopine PVA (polivinil alkohola), da se je tvorila stabilna dvojna emulzija (V/O/V). Ko je bilo homogeniziranje končano, smo nastalo dvojno emulzijo počasi vlili k 100 ml 0,1 % vodne raztopine PVA. Dobljeno zmes smo nato homogenizirali 5 minut pri 5000 vrt./min.

Disperzijo smo nato ultracentrifugirali pri 15000 vrt./min 15 minut z uporabo ultracentrifuge Sorvall RC 5C plus, rotor SS 34, ZDA. Po ločitvi smo nanodelce trikrat sprali z destilirano vodo (20 ml) in zbrali s centrifugiranjem pri predhodno navedenih pogojih.

Dobljeni delci so imeli velikost v območju od 600 nm do 700 nm, pri čemer so dosegli minimalno velikost v formulaciji, kije bila pripravljena z najvišjo hitrostjo vrtenja.

-1010

Primer lb

Naslednjo študijo smo izvedli za določitev izgube aktivnosti cistatina med homogeniziranjem pod različnimi pogoji in za identifikacijo največje hitrosti vrtenja, ki je še možna, da se ohrani aktivnost cistatina. Cistatin, inhibitor cisteinskih proteinaz, smo izolirali iz beljaka kokošjih jajc kot je bilo opisano (Kos, J., Dolinar, M., Turk, V.: Isolation and characterisation of chicken L- and H-kininogens and their interaction with chicken cysteine proteinases and papain, Agends and Actions 38, 331-339, 1992). Biološko aktivnost cistatina smo določili na rastlinski proteinazi papainu z uporabo BANA (a-N-benzoil-DL-arginin-3-naftilamid) kot substrata. Vpliv različnih pogojev homogeniziranja na aktivnost cistatina smo opazovali na vodni raztopini cistatina. Izvedli smo enako zaporedje posameznih stopenj postopka kot v primeru la. V primeru lb torej nismo uporabili polimera PLGA, 1 ml etil acetata, 4 ml 5 % vodne raztopine PVA in 100 ml 0,1% vodne raztopine PVA pa smo nadomestili z destilirano vodo. Namesto 200 μΐ vode smo uporabili raztopino proteina (2 mg cistatina smo raztopili v 200 μΐ 0,1 M fosfatnega pufra, pH=6,0). Uporabili smo enake pogoje kot v primeru la in učinek hitrosti vrtenja na inhibitomo aktivnost cistatina smo določili kot je opisano zgoraj.

Ugotovili smo, daje homogeniziranje pri 15000, 12500 in 10000 vrt./min povzročilo izgubo biološke aktivnosti cistatina za 82 %, 66 % oz. 30 %.

Ugotovili smo, daje potrebno hitrost vrtenja zmanjšati na 5000 vrt./min, da se ohrani aktivnost cistatina na nivoju okoli 98%. Vendar takšno zmanjšanje vnosa energije ne omogoča pridobivanja nanodelcev.

Primer 2a

Da bi omogočili pripravo nanodelcev tudi pri nižjih hitrostih vrtenja, smo izvedli enak postopek kot v primeru la, razen da smo hkrati s homogeniziranjem (10000, 7500 in 5000 vrt./min) uporabili tudi ultrazvok. Nastali nanodelci so imeli velikost 320, 350 oz. 360 nm.

-1111

To kaže, da lahko bolj učinkovito izrabimo vnos energije, če izvedemo različne tipe (postopke) emulgiranja hkrati, npr. homogeniziranje in ultra-sonifikacijo. Torej sinergijski učinek mehanske in ultrazvočne energije omogoča izdelavo nanodelcev pri nižjih vrt./min (5000 vrt./min) in blagih ultrazvočnih valovih.

Primer 2b

Naslednji test smo izvedli za določitev sinergijskega učinka emulgiranja (primer 2a) na aktivnost cistatina.

Izvedli smo enak postopek kot v primeru lb, razen da smo ultrazvok uporabili hkrati s homogeniziranjem pri 5000 vrt./min. Izguba biološke aktivnosti cistatina je bila le 20 %. To kaže, daje ta postopek dober kompromis med ohranjanjem visokega nivoja aktivnosti proteina in tvorbo nanodelcev z želeno velikostjo.

Primer 3a

Naslednjo študijo smo izvedli z namenom določitve stabilnosti proteina znotraj nanodelcev pod simuliranimi fiziološkimi pogoji.

Nanodelce smo izdelali s postopkom v smislu predloženega izuma. Izvedli smo enak postopek kot v primeru la, razen da smo namesto 200 μΐ vode uporabili 200 μΐ raztopine cistatina v vodi in da smo namesto uporabe homogenizacije z visoko hitrostjo uporabili homogenizacijo pri 5000 vrt./min s hkratno uporabo ultrazvoka.

Nastale nanodelce smo sprali, centrifugirali in zbrali kot v primeru la in jih na koncu dispergirali v 5 ml 0,12 M fosfatnega pufra (PBS) s pH 7,2-7,4 in inkubirali 19 dni pri 37 °C ob mešanju na magnetnem mešalniku (2 vrt./min).

Pri različnih časovnih intervalih (3 ure, 1, 2, 5, 7, 12, 14, 16 in 19 dni) smo odvzeli 300 μΐ vzorca, nato vzorce centrifugirali (15 minut pri 16000 vrt./min) in določili

-1212 aktivnost cistatina v supematantu z encimatskim spektrofotometričnim testom (BANA test). Preostale nanodelce smo vrnili nazaj v inkubacijsko disperzijo.

Primer 3b

Nadalje smo nanodelce z vključenim cistatinom pripravili v smislu predloženega izuma, le da smo namesto v vodi cistatin raztopili v raztopini 2% albumina, 300mM trehaloze, 300mM manoze, 300mM fruktoze in lOOmM saharoze (krioprotektant). Po pripravi nanodelcev kot v primeru la smo le te centrifugirali 15 min pri 7000 vrt./min z uporabo ultracentrifuge Sorvall RC 5C plus, rotor SS 34, ZDA. Sediment smo resuspendirali v vodi s pomočjo ultrazvoka in ga posušili z liofilizacijo. Aktivnost cistatina v disperziji nanodelcev po liofilizaciji, je predstavljala 90% tiste pred liofilizacijo. V primeru, da smo nanodelce s cistatinom pripravili kot pri lb in jih liofilizirali, je bila aktivnost cistatina le 17% tiste pred liofilizacijo.

Primer 3c

Z namenom primerjati stabilnost proteina, sproščenega iz nanodelcev, z običajno raztopino proteina, smo pripravili kontrolni vzorec in ga obdelali pod enakimi pogoji, kot disperzijo nanodelcev v primeru 3a.

Kontrolni vzorec smo pripravili z raztopitvijo ustrezne količine cistatina v 5 ml PBS (pribiližno enaka koncentracija glede na protein v sproščenem mediju predhodnega primera 3 a).

Izvedli smo enak postopek kot v primeru 3a in dobili smo stabilnost inkubiranega proteina za različne časovne intervale.

Claims (14)

1. Patentni zahtevki

   1. Postopek priprave nanodelcev z vgrajeno eno ali več aktivnimi snovmi, označen s tem, da uporabimo emulzijsko metodo, pri kateri hkrati izvedemo mešanje in sonifikacijo, vsako pri energetskem nivoju, ki sam ni zadosten za tvorbo nanodelcev, in ki ohrani biološko aktivnost vgrajene aktivne snovi.
2. 2. Postopek po zahtevku 1, označen s tem, da obsega:

   I) raztapljanje biološko razgradljivega polimera v zanj primernem organskem topilu,

   II) emulgiranje, pri katerem hkrati izvedemo mešanje in sonifikacijo, vsako pri energetskem nivoju, ki sam ni zadosten za tvorbo nanodelcev, ki obsega:

   a) emulgiranje aktivne snovi, raztopljene v vodi ali v zanjo primernem vodnem topilu, v organsko raztopino, dobljeno v stopnji I), da zagotovimo nastanek primarne emulzije z aktivno snovjo v notranji vodni fazi in

   b) emulgiranje primarne emulzije, dobljene v stopnji Ha), v vodno raztopino emulgatorja kot kontinuirano fazo, tako da dobimo nanodelce, v katerih je vgrajena aktivna snov; ter

   III) izolacijo in sušenje nanodelcev na znan način.
3. 3. Postopek po zahtevku 1 ali 2, označen s tem, daje hitrost mešanja v območju od 4000 do 15000 vrt./min.
4. 4. Postopek po kateremkoli od zahtevkov 1 do 3, označen s tem, da sonifikacijo izvedemo pri 20 kHz do 70 kHz.
5. 5. Postopek po kateremkoli od zahtevkov 2 do 4, označen s tem, da kot organsko topilo uporabimo organsko topilo, ki se ne meša z vodo, prednostno kloroform, benzen, diklorometan, kloroetan, dikloroetan, trikloroetan, ogljikov tetraklorid, etileter, cikloheksan, n-heksan, toluen, bolj prednostno etil acetat, metilen klorid ali zmes metilen klorida in acetona, najbolj prednostno etil acetat.

   -1414
6. 6. Postopek po kateremkoli od zahtevkov 2 do 5, označen s tem, da kot emulgator uporabimo anionske surfaktante, neionske sufraktante, derivate polioksietilen ricinusovega olja, polivinil pirolidon, polivinil alkohol, karboksimetilcelulozo, lecitin, želatino ali kakršnokoli njihovo kombinacijo in prednostno polivinil alkohol.
7. 7. Postopek po kateremkoli od zahtevkov 2 do 6, označen s tem, da je polimer poliester mlečne in glikolne kisline, polimlečna kislina, ροΐΐ-β-hidroksimaslena kislina, polihidroksivalerinska kislina, polikaprolakton, poliesteramid, policianoakrilat, poli(amino kislina), polikarbonat, polianhidrid, biološko razgradljiv polimer, prednostno kopolimer mlečne in glikolne kisline.
8. 8. Postopek po kateremkoli od predhodnih zahtevkov, označen s tem, da je aktivna snov protein in/ali peptid in/ali biološko aktivna makromolekula kot so interferoni, interlevkini, kolonije stimulirajoči faktorji, faktorji tumorske nekroze, drugi imuno modulatorji, rastni faktorji, transformirajoči rastni faktorji, eritropoetin, albumin, krvni proteini, hormoni, vakcine, virusi, toksini, protitelesa, protitelesih fragmenti, encimi, encimski inhibitorji vključno s cistatinom.
9. 9. Postopek po kateremkoli od predhodnih zahtevkov, označen s tem, da so v nanodelce poleg ene ali več aktivnih snovi vgrajena tudi sredstva za nadzorovanje stabilnosti in/ali sredstva za nadzorovanje topnosti aktivne snovi, prednostno sredstva za nadzorovanje pH, konzervansi, stabilizatorji in krioprotektanti.
10. 10. Postopek po kateremkoli od zahtevkov 2 do 9, označen s tem, da sušenje nanodelcev izvedemo z liofilizacijo, pri čemer je aktivna snov raztopljena v zanjo primernem vodnem topilu, ki vsebuje krioprotektante.
11. 11. Postopek po zahtevku 10, označen s tem, da so krioprotektanti lahko sladkorji, glikoli, albumin, želatina, aminokisline, dimetil sulfoksid ali njihove različne

    -1515 kombinacije, prednostno albumin, saharoza, fruktoza, manoza, trehaloza ali njihove kombinacije.
12. 12. Nanodelci, označeni s tem, da jih pridobimo s postopkom po kateremkoli od zahtevkov 1 do 11.
13. 13. Nanodelci po zahtevku 12, označeni s tem, da imajo povprečni premer od okoli 100 nm do okoli 800 nm.
14. 14. Uporaba nanodelcev, pridobljenih po postopku po kateremkoli od zahtevkov 1 do 11, za izdelavo zdravila za parenteralno, nazalno, pulmonalno, peroralno, oralno, transdermalno ali rektalno dajanje aktivne snovi.