SI21102A - Postopek za izolacijo biološko aktivnega granulocitne kolonije stimulirajočega dejavnika - Google Patents
Postopek za izolacijo biološko aktivnega granulocitne kolonije stimulirajočega dejavnika Download PDFInfo
- Publication number
- SI21102A SI21102A SI200100322A SI200100322A SI21102A SI 21102 A SI21102 A SI 21102A SI 200100322 A SI200100322 A SI 200100322A SI 200100322 A SI200100322 A SI 200100322A SI 21102 A SI21102 A SI 21102A
- Authority
- SI
- Slovenia
- Prior art keywords
- csf
- biologically active
- imac
- buffer
- elution
- Prior art date
Links
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 title claims abstract description 206
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 title claims abstract description 206
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 95
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims abstract description 55
- 238000002955 isolation Methods 0.000 title claims abstract description 51
- 102100021935 C-C motif chemokine 26 Human genes 0.000 claims abstract description 71
- 101000897493 Homo sapiens C-C motif chemokine 26 Proteins 0.000 claims abstract description 71
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 claims abstract description 24
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 claims abstract description 14
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 72
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 54
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 54
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 40
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 claims description 26
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 24
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 18
- 102100039619 Granulocyte colony-stimulating factor Human genes 0.000 claims description 16
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 14
- 101000746367 Homo sapiens Granulocyte colony-stimulating factor Proteins 0.000 claims description 12
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 12
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 10
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 claims description 10
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 10
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 239000000969 carrier Substances 0.000 claims description 9
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 9
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 8
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 7
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 claims description 6
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 6
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 claims description 5
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 5
- 206010011409 Cross infection Diseases 0.000 claims description 4
- PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N Zinc dication Chemical compound [Zn+2] PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- NBZBKCUXIYYUSX-UHFFFAOYSA-N iminodiacetic acid Chemical compound OC(=O)CNCC(O)=O NBZBKCUXIYYUSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 208000004235 neutropenia Diseases 0.000 claims description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 4
- 206010059482 Neutropenic infection Diseases 0.000 claims description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 3
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 claims description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 3
- 238000002428 photodynamic therapy Methods 0.000 claims description 3
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 3
- 208000028399 Critical Illness Diseases 0.000 claims description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 2
- 208000002633 Febrile Neutropenia Diseases 0.000 claims description 2
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 claims description 2
- 206010033661 Pancytopenia Diseases 0.000 claims description 2
- 206010040943 Skin Ulcer Diseases 0.000 claims description 2
- 206010072170 Skin wound Diseases 0.000 claims description 2
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 claims description 2
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 claims description 2
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 claims description 2
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 230000010437 erythropoiesis Effects 0.000 claims description 2
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000035876 healing Effects 0.000 claims description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 claims description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 claims description 2
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 claims description 2
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 2
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 claims description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims description 2
- 238000004904 shortening Methods 0.000 claims description 2
- 231100000019 skin ulcer Toxicity 0.000 claims description 2
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims 2
- BTLHODXEDLCLAD-VKHMYHEASA-N (2s)-2-(carboxymethylamino)butanedioic acid Chemical compound OC(=O)CN[C@H](C(O)=O)CC(O)=O BTLHODXEDLCLAD-VKHMYHEASA-N 0.000 claims 1
- 206010029803 Nosocomial infection Diseases 0.000 claims 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 claims 1
- 206010040070 Septic Shock Diseases 0.000 claims 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims 1
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 claims 1
- 208000037893 chronic inflammatory disorder Diseases 0.000 claims 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 claims 1
- 230000036303 septic shock Effects 0.000 claims 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 abstract description 6
- 239000013522 chelant Substances 0.000 abstract description 4
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 abstract description 2
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 abstract description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 abstract description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 abstract description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 53
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 16
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 14
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 13
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 12
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 10
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 7
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 6
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 6
- 239000003398 denaturant Substances 0.000 description 6
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 4
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 108010029961 Filgrastim Proteins 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 3
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 3
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 3
- IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N hydrogen chloride Substances Cl.Cl IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- MGFYIUFZLHCRTH-UHFFFAOYSA-N nitrilotriacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CC(O)=O MGFYIUFZLHCRTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000005498 polishing Methods 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 229910052720 vanadium Inorganic materials 0.000 description 3
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000007644 Colony-Stimulating Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010071942 Colony-Stimulating Factors Proteins 0.000 description 2
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 2
- 108010062867 Lenograstim Proteins 0.000 description 2
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-L Malonate Chemical compound [O-]C(=O)CC([O-])=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 2
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 2
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 229960004177 filgrastim Drugs 0.000 description 2
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 229960002618 lenograstim Drugs 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PSBDWGZCVUAZQS-UHFFFAOYSA-N (dimethylsulfonio)acetate Chemical compound C[S+](C)CC([O-])=O PSBDWGZCVUAZQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XMIIGOLPHOKFCH-UHFFFAOYSA-N 3-phenylpropionic acid Chemical compound OC(=O)CCC1=CC=CC=C1 XMIIGOLPHOKFCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102220519361 Coatomer subunit alpha_C17S_mutation Human genes 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 1
- 102000000646 Interleukin-3 Human genes 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 229940047120 colony stimulating factors Drugs 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000002883 imidazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 229940076264 interleukin-3 Drugs 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- IZXGZAJMDLJLMF-UHFFFAOYSA-N methylaminomethanol Chemical compound CNCO IZXGZAJMDLJLMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 229940029345 neupogen Drugs 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000006920 protein precipitation Effects 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 1
- 229940117986 sulfobetaine Drugs 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
- C07K14/535—Granulocyte CSF; Granulocyte-macrophage CSF
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- A61K38/193—Colony stimulating factors [CSF]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
Abstract
Izum se nanaša na postopek izolacije biološko aktivnega granulocitne kolonije stimulirajočega dejavnika (G-CSF), pri katerem je z uporabo nosilca za kovinsko kelatno afinitetno kromatografijo (IMAC) možno že pri nativnih pogojih ločiti pravilno zvite biološko aktivne monomerne molekule G-CSF od napačno zvitih, biološko neaktivnih monomernih, oligo- in polimernih ter agregiranih molekul G-CSF. Tako pridobimo biološko aktivni G-CSF z več kot 95% čistoto. Za odstranitev sledov nečistot sta zato potrebni le dve dodatni kromatografski stopnji, ki vključujeta kationsko izmenjevalno kromatografijo in gelsko filtracijo. Celoten postopek omogoča pridobivanje večjih količin G-CSF z več kot 99% čistoto in je tako primeren za industrijsko pridobivanje G-CSF.ŕ
Description
Naziv izuma
Postopek za izolacijo biološko aktivnega granulocitne kolonije stimulirajočega dejavnika.
Področje tehnike
Predloženi izum se nanaša na nov postopek izolacije biološko aktivnega granulocitne kolonije stimulirajočega dejavnika (G-CSF) z uporabo kovinsko kelatne afinitetne kromatografije (IMAC).
G-CSF uvrščamo med kolonije stimulirajoče dejavnike, ki regulirajo diferenciacijo in proliferacijo hematopoetskih celic sesalcev. Imajo odločilno vlogo pri tvorbi nevtrofilcev, zato so primerni za uporabo v medicini na področju hematologije in onkologije. Za klinično uporabo sta danes na trgu dve obliki: lenograstim, ki je glikoziliran, in ga pridobivajo z ekspresijo v sesalski celični liniji, ter filgrastim, ki je neglikoziliran, in ga pridobivajo z ekspresijo v bakteriji Escherichia coli {E. coli).
Bistvo predloženega izuma
Bistvo predloženega izuma je, da je pravilno zvite in biološko aktivne molekule G-CSF možno pri nativnih pogojih ločiti od napačno zvitih ali biološko neaktivnih molekul G-CSF z uporabo nosilca za IMAC. Postopek izolacije biološko aktivnega GCSF, ki je predmet izuma, torej vključuje ločevanje pravilno zvitih in biološko aktivnih molekul G-CSF od napačno zvitih ali biološko neaktivnih molekul G-CSF ter od večine gostiteljskih proteinov z uporabo nosilca za IMAC pri nativnih pogojih. Pri tem se pravilno zvite in biološko aktivne molekule G-CSF specifično vežejo na nosilec za IMAC, napačno zvite, biološko neaktivne oblike G-CSF in večina ostalih nečistot pa ostane v eluatu. Postopek izolacije biološko aktivnega G-CSF, ki je predmet izuma, prav tako vključuje ločevanje biološko aktivnih monomernih oblik G-CSF od biološko neaktivnih monomernih ter oligo- in polimernih oblik G-CSF. Pri tem se biološko aktivne monomerne oblike G-CSF specifično vežejo na nosilec za IMAC, biološko neaktivne monomerne ter oligo- in polimerne oblike ter agregrirane oblike G-CSF pa ostanejo v eluatu.
Postopek izolacije biološko aktivnega G-CSF, ki je predmet izuma, predstavlja učinkovito stopnjo čiščenja in koncentriranja pravilno zvitih biološko aktivnih monomernih oblik G-CSF in ga lahko uporabimo kot ključno stopnjo celotnega postopka izolacije G-CSF.
Postopek izolacije biološko aktivnega G-CSF, ki je predmet izuma, je uporaben v primerih, kjer se G-CSF po ekspresiji izloča direktno po sekretorni poti v medij ali kjer se izloča v obliki inkluzijskih teles v citoplazmo, periplazmo ali druge celične organele. Uporaben je tudi pri izolaciji biološko aktivnega G-CSF direktno iz raztopljenih inkluzijskih teles ter v vseh primerih, ko je po predhodni denaturaciji, ki ji sledi postopek renaturacije, prisoten pravilno zvit biološko aktiven monomeren GCSF. Postopek izolacije biološko aktivnega G-CSF, ki je predmet izuma, poteka pri nativnih pogojih.
Pri uporabi postopka izolacije biološko aktivnega G-CSF, ki je predmet izuma, pridobimo biološko aktiven G-CSF z več kot 95% čistoto. Za odstranitev sledov nečistot (poliranje) sta zato potrebni le dve dodatni kromatografski stopnji, ki vključujeta kationsko izmenjevalno kromatografijo in gelsko filtracijo. Po celotnem postopku izolacije, ki je tudi predmet izuma, tako dobimo biološko aktivni G-CSF z več kot 99% čistoto. Celoten postopek izolacije biološko aktivnega G-CSF omogoča pridobivanje večjih količin biološko aktivnega G-CSF in je tako primeren za industrijsko pridobivanje biološko aktivnega G-CSF.
Stanje tehnike
Med kolonije stimulirajočimi dejavniki, ki regulirajo diferenciacijo in proliferacijo hematopoetskih celic sesalcev, so neglikoziliran G-CSF (filgrastim) in postopki za njegovo pridobivanje opisani v EP 237545, medtem ko so glikoziliran G-CSF (lenograstim) in postopki za njegovo pridobivanje opisani v EP 169566.
Postopki za izolacijo G-CSF, ki so poznani iz patentne in strokovne literature, obsegajo izolacijske postopke, ki vključujejo različne kombinacije ionske kromatografije, kromatofokusiranja, hidrofobne interakcijske kromatografije, gelske filtracije in nekaterih drugih metod.
V splošnem je začetna stopnja izolacije G-CSF odvisna od organizma, v katerem je izvedena heterologna ekspresija G-CSF. V bakteriji E. coli pride po ekspresiji G-CSF do izločanja G-CSF v obliki netopnih inkluzijskih teles. Izolacija GCSF zato obsega dodatne stopnje pridobivanja pravilno zvitih biološko aktivnih GCSF iz inkluzijskih teles. Te običajno vključujejo spiranje z detergenti ali kaotropnimi snovmi, raztapljanje z močnimi denaturanti (kot npr. gvanidinijev hidroklorid (GndHCI), urea) ali visokimi koncentracijami detergentov (kot npr. sarkozil ali natrijev dodecil sulfat), delno čiščenje raztopljenega denaturiranega proteina z gelsko filtracijo, HPLC z reverzno fazo (RP-HPLC) in renaturacijo z razredčevanjem denaturanta ali z dializo. Pri ekspresiji G-CSF v kvasovkah ali sesalskih celicah pa se inkluzijska telesa ali njim podobne strukture pojavljajo redko in se postopek izolacije G-CSF začne takoj po sekreciji. Postopki izolacije G-CSF so opisani v patentnih prijavah in patentih, kot npr. v EP 169566, EP 237545, EP 215126, EP 243153, US 5055555 in WO 0104154. Prav tako so ti postopki opisani v strokovni literaturi, kot npr. v: Lu.H.S. s sodelavci v Protein Expr Purif 4, 465-472 (1993), Kang, S.H. s sodelavci v Biotechnol. Lett. 17, 687-692 (1995), VVingfield, P s sodelavci v Biochem J 256, 213-218 (1988), (Kang, S.H. s sodelavci v Biotechnol. Lett. 17, 687-692 (1995), (Yamasaki,M. s sodelavci v Biosci Biotechnol Biochem 62, 1528-1534 (1998), VVingfield, P s sodelavci v Biochem J 256, 213-218 (1988), Bae, C.S. s sodelavci v Biotechnol. Bioeng. 57, 600-609 (1998).
Razen običajnih kromatografskih tehnik so za delno čiščenje in renaturacijo nekaterih proteinov uporabili tudi IMAC. Uporabo le-te je prvi opisal Porath s sodelavci v Nature 258, 598-599 (1975) in temelji na vezavi proteinov na imobilizirane kovinske ione, ki so kelatno vezani na različne nosilce za IMAC. Za koordinativno vezavo so v proteinu odločilne elektron-donorske skupine v aminokislinski verigi in največjo vlogo pri vezavi ima imidazolni obroč v histidinskih ostankih. Uporabo IMAC pri izolaciji rekombinantnih proteinov, ki imajo na določenih mestih, navadno na N- ali C-koncu molekule, pripete podaljške s številnimi histidini, ki omogočajo visoko specifično vezavo na ustrezne nosilce IMAC so opisali Hochuli,
E. s sodelavci v Bio/Technology 1321-1325 (1988), Chaga, G. s sodelavci v
Biotechnol Appl Biochem 29 (1. del), 19-24 (1999) in Jeong, J.K. in Lee S.Y. Protein Expr. Purif, 23: 311-318 (2001). Uporabnost IMAC za preučevanje majhnih topografskih razlik med proteinskimi molekulami so opisali Sulkovvski v Trends Biotechnol 3, 1-7 (1985) in Hemdan s sodelavci v Proč Natl Acad Sci U S A 86, 1811-1815 (1989).
Postopek čiščenja nekaterih proteinov, ki vsebujejo histidinske ostanke, z uporabo IMAC je opisan v US 5932102. Postopek čiščenja proteinov, ki imajo na površini aminokisline, ki se vežejo na kovinske ione, je opisan v WO 9012803. V tej prijavi je opisan postopek za čiščenje nekaterih proteinov z uporabo IMAC. Ti proteini so bili predhodno že delno očiščeni z uporabo drugih kromatografskih metod. Navedena postopka ne opisujeta ne izolacije ne ločevanja biološko aktivnih molekul G-CSF od biološko neaktivnih molekul G-CSF v nativnih pogojih z uporabo IMAC.
V literaturi pa so bile objavljene primerjalne študije interakcij G-CSF, analoga G-CSF (Cys17Ser) in fuzijskega proteina s heksahistidinskim podaljškom z metodo afinitetnega porazdeljevanja (affinity partitioning) (Gelunaite, L. s sodelavci v J Chromatogr A 904, 131-143 (2000)). Pri poskusih renaturacije interleukina-3, G-CSF in granulocitne makrofagne kolonije stimulirajočega dejavnika (GM-CSF) na nosilcu za IMAC so proučevali vezavo z GndHCI denaturiranih proteinov na nosilcu Sepharose IDA (iminodiacetat) z imobiliziranimi Zn(ll) ali Ni(ll) ioni, čemur je sledila renaturacija med elucijo (Zaveckas, M. s sodelavci v. J Chromatogr A 904, 145-169 (2000); Rozenaite, V. s sodelavci v Poster abstract, P-104., Cordoba, Spain, 19-22. April (1998)). Pri tem so pri vezavi denaturiranih proteinov na nosilec za IMAC uporabljali denaturirajoče pogoje.
Med poskusi renaturacije proteinov po ekspresiji v E. coli in denaturacije v močnem denaturantu opisujejo renaturacijo denaturiranih proteinov z njihovo vezavo na nosilec za IMAC (Zaveckas, M. s sodelavci v. J Chromatogr A 904, 145-169 (2000); Rozenaite,V. s sodelavci v Poster abstract , P-104., Cordoba, Spain, 19-22. April (1998)). Ponovno je opisan postopek renaturacije s pomočjo vezave denaturiranih proteinov na nosilec za IMAC.
Ne v strokovni ne v patentni literaturi ne zasledimo opisa ločevanja biološko aktivnih monomernih pravilno zvitih molekul G-CSF od biološko neaktivnih monomernih ali oligo- ali polimernih oblik ali nepravilno zvitih molekul G-CSF pri nativnih pogojih z uporabo IMAC.
Prav tako ne zasledimo opisa izolacije biološko aktivnega G-CSF z vezavo pravilno zvitih biološko aktivnih monomernih molekul G-CSF, ki so že prisotne v raztopini, na kolono pri nativnih pogojih, in tudi ne opisa ločevanja molekul G-CSF glede na konformacijsko stanje molekul G-CSF z uporabo IMAC.
Vse do sedaj opisane in poznane metode izolacije G-CSF opisujejo izolacijo G-CSF vključujejo več stopenj. Ne omenjajo pa možnosti uporabe le ene kromatografske metode tako za ločevanje G-CSF glede na njihovo biološko aktivnost in pravilno zvitje, kot za njihovo ločevanje od ostalih nečistot, prisotnih v raztopini, kot tudi za učinkovito metodo za koncentriranje G-CSF in končno pridobitev več kot 95% čistote biološko aktivnega G-CSF, tako da nadaljnja izolacija biološko aktivnega GCSF zahteva le dodatno čiščenje (polishing).
Opis izuma
Ugotovili smo, da lahko IMAC uporabimo kot učinkovito kromatografsko metodo v procesu izolacije biološko aktivnega G-CSF, pri kateri se pravilno zvite biološko aktivne monomerne oblike G-CSF v nativnih pogojih selektivno vežejo na različne nosilce za IMAC, medtem ko se nepravilno zvite ali agregirane molekule GCSF ter v primeru ekspresije v E. coli tudi večina proteinov bakterije E. coli iz raztopljenih inkluzijskih teles ne vežejo na te nosilce in se eluirajo brez zadrževanja. Do tega predvidoma pride zaradi specifične razporeditve naravno prisotnih histidinov.
Z izrazom 'nativni pogoji' so mišljeni tisti pogoji, pri katerih molekula (protein) ohrani tako nativno konformacijo kot biološko aktivnost.
Z izrazom 'denaturirajoči pogoji' so mišljeni tisti pogoji, pri katerih se nativna konformacija proteinov ne ohrani, njihova biološka aktivnost se pri teh pogojih spreminja in se ne ohrani.
Z izrazom 'agregirane molekule' so mišljene tiste molekule, ki tvorijo skupke molekul, ki so med seboj povezane predvsem s hidrofobnimi, pa tudi z drugimi vezmi (kot npr. disulfidnimi). Take molekule niso biološko aktivne.
Z izrazom 'elucija' je mišljeno spiranje ali ekstrakcija adsorbiranega materiala s kromatografske kolone.
Z izrazom 'eluat' je mišljena tista raztopina, ki se spira ali izloča s kromatografske kolone.
Z izrazom 'inkluzijska telesa' so mišljeni netopni kompaktni agregati nepravilno zvitih in delno pravilnih zvitih proteinov.
Z izrazom 'raztopina inkluzijskih teles' je mišljena raztopina, ki vsebuje inkluzijska telesa.
Z izrazom 'biološko aktivni G-CSF' je mišljen G-CSF z biološko aktivnostjo, ki je enaka ali večja od 1x108 lU/mg, in se meri z uporabo metode proliferacije na celični liniji, kot je opisano v primeru 5.
Predmet priloženega izuma je postopek za izolacijo biološko aktivnega GCSF, ki vključuje naslednje stopnje:
a) nanos raztopine, ki vsebuje biološko aktivni G-CSF ali mešanico biološko aktivnega in neaktivnega G-CSF, na nosilec za IMAC pri nativnih pogojih,
b) selektivno vezavo biološko aktivnega G-CSF, ki je pravilno zvit in ima monomerno obliko, na nosilec za IMAC pri nativnih pogojih,
c) spiranje kolone za IMAC in elucija biološko aktivnega G-CSF iz kolone pri nativnih pogojih.
Postopek izolacije biološko aktivnega G-CSF, ki je predmet izuma, lahko dodatno vključuje tudi dodatno čiščenje biološko aktivnega G-CSF, ki vključuje naslednji stopnji, ki se izvedeta po izolaciji biološko aktivnega G-CSF z IMAC:
d) kationsko izmenjevalno kromatografijo in
e) gelsko filtracijo.
Na ta način pridobimo biološko aktiven G-CSF, ki je primeren za klinično uporabo v medicini.
Postopek izolacije biološko aktivnega G-CSF, ki je predmet izuma, se lahko uporablja tudi v primeru izolacije derivatiziranih oblik G-CSF, kot so: metionil G-CSF (Met-G-CSF), glikozilirani, encimsko in kemijsko modificirani (kot npr.: pegilirani) GCSF, G-CSF analogi in fuzijski proteini, ki vsebujejo G-CSF.
Bistveno za postopek izolacije biološko aktivnega G-CSF, ki je predmet izuma, je:
1. da se molekule G-CSF ločijo glede na konformacijsko stanje, v katerem se nahajajo in s katerim je povezana njihova biološka aktivnost,
2. da postopek omogoča vezavo biološko aktivnih molekul G-CSF na nosilec za IMAC pri nativnih pogojih in s tem ločevanje biološko aktivnih molekul G-CSF od biološko neaktivnih molekul G-CSF pri nativnih pogojih,
3. da postopek omogoča vezavo pravilno zvitih molekul G-CSF na nosilec za IMAC pri nativnih pogojih in s tem ločevanje pravilno zvitih molekul G-CSF od nepravilno zvitih molekul G-CSF pri nativnih pogojih,
4. da postopek omogoča vezavo biološko aktivnih monomernih oblik G-CSF na nosilec za IMAC pri nativnih pogojih in s tem ločevanje biološko aktivnih monomernih oblik G-CSF od biološko neaktivnih monomernih oblik G-CSF.
5. da postopek omogoča vezavo monomernih oblik G-CSF na nosilec za IMAC pri nativnih pogojih in s tem ločevanje monomernih oblik G-CSF od oligo- in polimernih oblik G-CSF pri nativnih pogojih,
6. da postopek omogoča ločevanje pravilno zvitih monomernih biološko aktivnih molekul G-CSF od drugih proteinov in nečistot, prisotnih v raztopini, pri nativnih pogojih.
7. da celoten postopek izolacije biološko aktivnega G-CSF, ki vsebuje še dodatno čiščenje z uporabo kationsko izmenjevalne kromatografije in gelske filtracije, omogoča pridobivanje večjih količin G-CSF z več kot 99% čistoto in je primeren za industrijsko pripravo biološko aktivnega G-CSF.
8. da celoten postopek izolacije biološko aktivnega G-CSF, ki vsebuje še dodatno čiščenje z uporabo kationsko izmenjevalne kromatografije in gelske filtracije, ne vsebuje nobenih dodatnih vmesnih stopenj čiščenja GCSF in poteka ves čas pri nativnih pogojih.
Pogoji pri celotnem postopku izolacije biološko aktivnega G-CSF, ki je predment izuma, so v vseh navedenih točkah nativni.
Pri postopku izolacije G-CSF, ki je predmet izuma, ne gre za renaturacijo nepravilno zvitih molekul G-CSF, ampak za specifično vezavo na nosilec za IMAC pravilno zvitih biološko aktivnih monomernih molekul G-CSF, ki so že prisotne v raztopini.
Pri ločevanju monomernih od oligo- in polimernih oblik G-CSF se biološko aktivne monomerne oblike vežejo na nosilec za IMAC, medtem ko oligo- in polimerne oblike, ki so lahko v obliki agregatov, ostanejo v eluatu. Za ločevanje monomernega G-CSF od njegovih oligo- in polimernih oblik bi lahko uporabljali tudi gelsko filtracijo.
Prednosti IMAC pred gelsko filtracijo so v tem, da ima nosilec za IMAC mnogo večjo kapaciteto, poleg tega pa od pravilno zvitih monomernih oblik G-CSF selektivno loči tudi monomerne, vendar napačno zvite oblike G-CSF, česar gelska filtracija ne omogoča. Te prednosti omogočajo večje izkoristke pri izolaciji biološko aktivnega G-CSF po postopku, ki je predmet izuma.
Postopek izolacije biološko aktivnega G-CSF, ki je predmet izuma, ima bistveno prednost pred drugimi postopki izolacije G-CSF, kajti omogoča izolacijo pravilno zvitih molekul G-CSF iz mešanice različnih proteinov in mešanice molekule G-CSF v različnih konformacijskih stanjih, pri tem da celoten postopek poteka v popolnoma nativnih pogojih. Omogoča tudi direktno izolacijo G-CSF iz inkluzijskih teles pri nativnih pogojih.
Dodatne prednosti izolacije biološko aktivnega G-CSF iz inkluzijskih teles z IMAC po postopku izolacije biološko aktivnega G-CSF, ki je predment izuma, pred drugimi postopki, so tudi: zmanjšana uporaba detergentov, odsotnost denaturantov, ki so bodisi toksični ali obremenjujejo okolje (kot npr. GndHCI ali urea), manjša poraba pufrskih in drugih raztopin.
Prednost izolacije biološko aktivnega G-CSF, ki je predmet izuma, pred metodami, pri katerih se uporabljajo močni denaturanti, je ta, da po postopku izolacije biološko aktivnega G-CSF, ki je predmet izuma, ni potrebno uporabljati aktivnih reducentov (kot npr. ditiotreitol ali β-merkaptoetanol). Aktivni reducenti namreč reagirajo s kovinskimi ioni, prisotnimi na nosilcu za IMAC, in posledica tega so manjši izkoristki pri izolaciji biološko aktivnega G-CSF.
V primeru sekrecije G-CSF direktno v gojišče pa postopek za izolacijo biološko aktivnega G-CSF, kije predmet izuma, omogoča učinkovito in direktno koncentriranje biološko aktivnega G-CSF iz razredčenih gojišč. Eluat iz kolone za IMAC vsebuje biološko aktivni G-CSF visoke čistote.
Tako v primeru izolacije biološko aktivnega G-CSF iz inkluzijskih teles kot pri izolaciji biološko aktivnega G-CSF direktno iz raztopine je pri uporabi izolacije biološko aktivnega G-CSF, ki je predmet izuma, zaradi učinkovite ločitve biološko aktivnih G-CSF od biološko neaktivnih G-CSF in ostalih proteinskih nečistot na koloni za IMAC ekonomičnost izolacije G-CSF bistveno izboljšana v primerjavi z drugimi metodami.
Pri postopku za izolacijo biološko aktivnega G-CSF, ki je predmet izuma, pridobimo v eni stopnji čiščenja biološko aktivni G-CSF visoke čistote, ki je več kot 95%.
Za dokončno čiščenje (polishing) po uporabi IMAC po postopku za izolacijo biološko aktivnega G-CSF sta potrebni le še dve kromatografski stopnji. Ti dve stopnji vključujeta:
1. Kationsko izmenjevalno kromatografijo, ki odstrani sledove gostiteljskih nukleinskih kislin, lipopolisaharidov in proteinov, ionske izomere G-CSF ter okvarjene oblike G-CSF z nižjimi pl vrednostmi.
2. Gelsko filtracijo, ki omogoča odstranitev sledov dimernih in agregiranih oblik GCSF.
Po dokončnem prečiščenju s kationsko izmenjevalno kromatografijo in gelsko filtracijo dobimo biološko aktivni G-CSF visoke čistote. Ta čistota je več kot 99%.
Celoten postopek izolacije biološko aktivnega G-CSF, ki vključuje dodatno čiščenje s kationsko izmenjevalno kromatografijo in gelsko filtracijo, ima pred drugimi postopki izolacije G-CSF prednosti, da poteka samo v treh stopnjah, da med posameznimi stopnjami ni vmesnih stopenj obdelave materiala (kot npr. koncentriranje, dializa, obarjanje...) in da ves čas poteka pri nativnih pogojih. Vmesno koncentriranje bi povzročilo nastanek dimerov in drugih agregatov, kar bi povzročilo manjše izkoristke. Celoten postopek je primeren za prenos v industrijsko merilo in omogoča pridobitev biološko aktivnega G-CSF z vsaj 99% čistoto.
Biološko aktivni G-CSF, ki smo ga pridobili s postopkom za izolacijo biološko aktivnega G-CSF na IMAC in z dodatnim čiščenjem s kationsko izmenjevalno kromatografijo in gelsko filtracijo, je primeren za klinično uporabo. Primeren je za pripravo farmacevtske oblike, ki vsebuje terapevtsko učinkovito količino biološko aktivnega G-CSF.
Z izrazom 'terapevtsko učinkovita količina' je mišljena tista količina biološko aktivnega G-CSF, ki omogoča terapevtski učinek biološko aktivnega G-CSF.
-1010
Biološko aktivni G-CSF, ki smo ga pridobili s postopkom za izolacijo biološko aktivnega G-CSF na IMAC in z dodatnim čiščenjem s kationsko izmenjevalno kromatografijo in gelsko filtracijo, se lahko uporablja za pripravo zdravil, ki so indicirana za indikacije, izbrane iz skupine, ki vključuje vsaj: nevtropenijo in njene klinične sekvele, zmanjšanje hospitalizacije pri febrilni nevtropeniji po kemoterapiji, mobilizacijo hematopoetskih zarodnih celic, alternativo infuziji donorskih levkocitov, kronično nevtropenijo, nevtropenične in nenevtropenične infekcije, prejemnike transplatatov, kronična vnetna obolenja, sepso in septični šok, zmanjšanje tveganja, obolevnosti, smrtnosti in števila dni hospitalizacije pri nevtropeničnih in nenevtropeničnih infekcijah, prevencijo infekcij in komplikacij infekcij pri nevtropeničnih in nenevtropeničnih bolnikih, prevencijo nozokomialne infekcije in zmanšanje mortalitete in frekvence nozokomialnih infekcij, enteralno aplikacijo novorojenčkom, okrepitev imunskega sistema novorojenčkov, izboljšanje kliničnega izida bolnikov na intenzivni negi in kritično bolnih bolnikov, celjenje in zdravljenje opeklin, kožnih ulkusov in ran, intenzifikacijo kemoterapije in/ali radioterapije, pancitopenijo, povečanje anti-inflamatornih citokinov, skrajšanje intervalov visokodozne kemoterapije s profilaktično uporabo G-CSF, potenciranje antitumorskih učinkov fotodinamske terapije, prevencijo in zdravljenje bolezni, ki jih povzročajo različne cerebralne disfunkcije, zdravljenje trombotičnih bolezni in njihovih komplikacij in postradiacijsko obnovo eritropoeze. Uporablja se lahko tudi pri vseh drugih boleznih, za katere so indicirani G-CSF.
Postopek izolacije biološko aktivnega G-CSF, ki je predmet izuma, se prične z nanosom in vezavo vzorca na nosilec za IMAC.
Uporabni nosilci za IMAC so npr.: Zn(ll)- iminodiacetat (IDA), Ni(ll)-IDA, Ni(ll)nitrilotriocetna kislina (NTA), možno pa je uporabiti tudi vse druge običajne kombinacije, kot npr.: M(II)-IDA, M(II)-NTA, M(ll)-karboksimetilaspartat itd., kjer je M lahko Zn, Cu, Co, Ni itd.
Na nosilec za IMAC lahko nanesemo raztopino inkluzijskih teles v prisotnosti nizkih koncentracijah detergentov (kot npr. 0,2% sarkozil, 0,005% natrijev dodecil sulfat in drugi) ali solubilizatorjev (kot npr. sulfobetain), ki še vedno predstavljajo nativne pogoje, bodisi brez odstranitve ali po odstranitvi glavnine detergenta na ionskih izmenjevalcih, z dializo, obarjanjem itn.
-1111
Na nosilec za IMAC lahko nanesemo tudi raztopino inkluzijskih teles v močnih denaturantih, kot so 8 M urea ali 6 M GndHCI ali denaturirajočih koncentracijah detergentov (kot npr.: 1% sarkozil, 2% sarkozil ali 1% natrijev dodecil sulfat) po predhodni renaturaciji z razredčenjem, dializo ali odstranitvijo denaturanta oziroma detergenta.
Po ekspresiji v sekretornih sistemih, kot so kvasovke, glive ali sesalske celične linije, je na nosilec za IMAC mogoče nanesti supernatant ali skoncentrirani supernatant, ki smo mu vzpostavili pH od 6,5 do 9,0.
Prav tako je možno kot nanos uporabiti eluat, ki smo ga dobili po prvi eluciji iz kolone za IMAC. Eluatu moramo uravnati pH na vrednost v območju med 6,5 in 9,0 npr. z dodatkom raztopine NaOH. Tako pripravljen eluat lahko ponovno nanesemo na kolono z istim nosilem za IMAC (kot npr.: Zn(ll)-IDA, Ni(ll)-IDA, Ni(ll)-NTA (NTA nitrilotriocetna kislina) ali pa tudi na kolono z drugačnimi nosilci za IMAC. Možna je tudi kombinacija z drugimi imobiliziranimi kovinskimi ioni (kot npr.: Zn(ll), Cu(ll), Co(ll), Ni(ll) itd...). S tem lahko dosežemo izboljšano ločbo odnosno odstranitev specifičnih proteinov gostitelja.
Ne glede na pripravo in izvor raztopine, ki jo nanašamo na kolono z nosilcem za IMAC, mora biti pH raztopine pred nanosom v območju med pH 6,5 in 9,0. Prednostni pH za nanos na kolono je med 7,0 in 8,5. Najbolj prednostni pH za nanos na kolono je pH okrog 8,0.
Pri nanosu in vezavi na nosilec za IMAC je možno uporabiti različne pufre, ki imajo pH med 6,5 in 9,0. Uporabljajo se lahko fosfatni, acetatni, hidroksimetilaminometan(Tris)/HCI, Tris/acetatni pufer in nekateri drugi pufri. Prednostna je uporaba Tris/HCI pufra.
Tris/HCI pufer lahko uporabljamo v koncentracijskem območju med 5 in 50 mM, pri tem, daje prednostna koncentracija med 10 in 40 mM.
Po nanosu na kolono se postopek nadaljuje s spiranjem kolone in elucijo proteinov iz kolone. Pri tem se lahko uporabljajo stopenjski gradient ali zvezni gradient z znižanjem pH ali kompetitivna elucija pri visokem pH (kot npr.: z imidazolom, histidinom, amonijevim kloridom in podobno).
Z izrazom 'zvezni gradient' je mišljeno spiranje kromatografske kolone na tak način, da se kromatografsko kolono spira z raztopino, ki ji spreminjamo sestavo na
-1212 tak način, da delež enega pufra (ali ene komponente pufra) zvezno narašča, delež drugega pufra (ali druge komponente pufra) pa zvezno pada.
Z izrazom 'stopenjski gradient' je mišljeno spiranje kromatografske kolone na tak način, da se kolono spira z raztopino, ki vsebuje določen delež enega pufra (ali ene komponente pufra) in določen delež drugega pufra (ali druge komponente pufra) določeno časovno obdobje. Deleži pufrov se nato skokovito spremenijo in kolono se ponovno spira določeno časovno obdobje. Postopek se večkrat ponovi. Spreminjanje deležev pufrov ne poteka zvezno.
Stopenjski gradient z uporabo nižjega pH se pri izolaciji biološko aktivnega GCSF, ki je predmet izuma, uporablja prednostno, ker bi pri višjem pH lahko prihajalo do aktivacije cisteinov in nastankov dimer. Pri nizkem pH je tudi stabilnost G-CSF visoka. Elucijski pufri, ki se uporabljajo za stopenjsko ali zvezno spiranje in elucijo, so lahko npr.; acetatni, Tris/acetatni, fosfatni, citratni pufer in nekateri drugi pufri. Območje pH za elucijo je med 3,0 in 5,0, medtem ko je prednostni pH 4,0. Stopenjski gradient omogoča hiter skok od pH 7,0 na pH 4,0 in s tem preskočitev izoelektrične točke, pri kateri ob eluciji lahko pride do obarjanja proteina. Na ta način dobimo v eluatu monomerni, biološko aktivni, pravilno zviti G-CSF s čistoto večjo od 95%.
Eluat, ki ga dobimo s kolone za IMAC, lahko brez dodatnih vmesnih stopenj nanesemo na nosilec za kationsko izmenjevalno kromatografijo. Uporabni nosilci za kationsko kromatografijo so npr.; SP Sepharose FF, SP Sepharose HP, CM Sepharose FF, TSK gel SP-5PVV. TSK gel CM-5PW, TSK gel SP-650M, TSK gei SP550C, TSK gel CM-650M, Macro-Prep High S support, Macro-Prep S support, Macro-Prep CM support itd. Prednostno uporabljamo nosilca SP Sepharose FF ali TSK gel SP-5PVV.
pH raztopine, ki jo nanašamo na nosilec za kationsko kromatografijo, mora biti v območju med 3,0 do 5,8. Prednostni pH za nanos na kolono je pH med 4,0 in 5,0. Koncentracija soli v raztopini, ki jo nanašamo na nosilec za kationsko kromatografijo mora biti dovolj nizka, da omogoča vezavo, kar je odvisno od pH, pri katerem delamo.
Pri nanosu in vezavi na nosilec za kationsko kromatografijo je možno uporabiti različne pufre, ki imajo pH med 3,0 in 5,8. Uporabljajo se lahko acetatni, citratni,
-1313 tris/HCI, tris/acetatni, fosfatni, sukcinatni, malonatni, MES in drugi pufri. Prednostna je uporaba acetatnega pufra.
Acetatni pufer lahko uporabljamo v koncentracijskem območju 10 do 60 mM, pri tem, da je prednostna koncentracija med 10 in 30 mM.
Po nanosu na kolono se postopek nadaljuje s spiranjem kolone in elucijo proteinov s kolone. Do tega pride zaradi večanja ionske jakosti ob dodatku pufra s soljo, kot npr. NaCl. Pri tem se lahko uporabljajo stopenjski gradient, linearni zvezni gradient ali ustrezna kombinacija stopenjskega in zveznega gradienta.
Elucijski pufri, ki se uporabljajo za spiranje in elucijo, so lahko acetatni, citratni, Tris/HCI, Tris/acetatni, fosfatni, sukcinatni, malonatni, 2-(N-morfolinoetansulfonatni) (MES) in drugi pufri z dodatkom soli, kot npr. NaCl ali KCI. Ionska jakost pufra oziroma koncentracija soli v pufru, pri katerih dosežemo elucijo s kolone, sta odvisni od pH uporabljenega pufra. Čim višji je pH uporabljenega pufra, pri tem nižji ionski jakosti dosežemo elucijo proteina s kolone.
Na ta način dobimo v eluatu monomerni, biološko aktivni, pravilno zviti G-CSF s čistoto večjo od 98%.
Eluat, ki ga dobimo s kolone za kationsko kromatografijo, brez dodatnih vmesnih stopenj nanesemo na nosilec za gelsko filtracijo. Uporabni nosilci za gelsko filtracijo so npr Sephacryl S-200HR, Sephacryl S-100HR, Superose 12, Superose 6, Superdex 75, TSK gel G-2500PVV, TSK gel G-3000 PW, Bio-Gel P-60, Bio-Gel P-100 itd. Prednostno uporabljamo nosilec Superdex 75.
pH raztopine, ki jo nanašamo na nosilec za gelsko filtracijo, je lahko v širokem območju pH, zato lahko uporabimo za nanos kar eluat s kationske kolone brez vsake obdelave. Za nanos, vezavo na nosilec za gelsko filtracijo in elucijo s kolone potrebujemo en sam pufer. Uporabljajo se lahko citratni, acetatni, tris, fosfatni in drugi pufri, ki imajo pH med 3,5 in 8,0. Prednostna je uporaba fosfatnih pufrov s pH med 6,0 in 7,0.
Fosfatne pufre za nanos lahko uporabljamo v koncentracijskem območju od 2 do 100 mM, pri tem, da je prednostna koncentracija med 3 in 10 mM. Koncentracija soli v pufru za gelsko filtracijo je med 30 in 100 mM. Prednostna koncentracija je okrog 50 mM.
-1414
Na ta način dobimo v eluatu monomerni, biološko aktivni, pravilno zvit G-CSF s čistoto večjo od 99% in z biološko aktivnostjo 1x108 lU/mg.
Predloženi izum prikazujejo, vendar v ničemer ne omejujejo naslednji primeri.
Opis slik
Slika 1: Kromatografska ločba proteinov iz raztopljenih inkluzijskih teles z uporabo nosilca za IMAC: Zn(ll)-lDA Chelating Sepharose fast flow (Pharmacia).
Kromatogram prikazuje spreminjanje absorbance pri 280 nm (A280) (—) in odstotek pufra P3 (-----) v odvisnosti od časa, izraženega v minutah (min).
Pik A - proteini E. coli in agregirani G-CSF; pik B - monomerni pravilno zviti biološko aktivni G-CSF in sledovi E. coli proteinov.
Slika 2: Analiza s poliakrilamidno gelsko elektroforezo v prisotnosti natrijevega dodecil sulfata (SDS-PAGE) začetnega vzorca in kromatografskih vrhov pri ločbi na Zn-IDA Chelating Sepharose fast flow (Pharmacia), ki je prikazana na Sliki 1. Legenda:
1. Standard molekulskih mas (Bio-Rad) in G-CSF standard (Neupogen) (označen s puščico).
2. Izhodni vzorec za kromatografsko ločbo.
3. Proteini v kromatografskem vrhu A na sliki 1 (agregirani G-CSF in proteini E. coli).
4. Proteini v kromatografskem vrhu B na sliki 1 (monomerni, pravilno zviti, biološko aktivni G-CSF in sledovi E. coli proteinov).
Slika 3: Kromatografska ločba na koloni ΧΚ50/20, polnjeni z IMAC nosilcem Zn-IDA Chelating Sepharose Fast Flow (Pharmacia).
Kromatogram prikazuje spreminjanje absorbance pri 280 nm (A280) (—) in odstotek pufra P6 (—) v odvisnosti od časa, izraženega v minutah (min).
Pik A - proteini E. coli in agregirani G-CSF; pik B - monomerni pravilno zviti biološko aktivni G-CSF in sledovi E. coli proteinov.
Slika 4: Kromatografska ločba na koloni ΧΚ16/20, polnjeni s kationskim nosilcem Toyopearl SP-5PVV (TosoHaas).
Kromatogram prikazuje spreminjanje absorbance pri 280 nm (A280) (—) in odstotek pufra P8 (-----) v odvisnosti od časa, izraženega v minutah (min).
-1515
Glavni pik - monomerni pravilno zviti biološko aktivni G-CSF; manjši stranski piki izoforme G-CSF in sledovi E. coli proteinov.
Slika 5: Kromatografska ločba na koloni ΧΚ26/70, polnjeni z nosilcem za gelsko filtracijo Superdex™ 75 prep grade (Pharmacia).
Kromatogram prikazuje spreminjanje absorbance pri 280 nm (A280) v odvisnosti od časa, izraženega v minutah (min).
Glavni pik - monomerni pravilno zviti biološko aktivni G-CSF.
Primeri
Primer 1: Izolacija biološko aktivnega G-CSF z IMAC: Zn-IDA (Chelating Sepharose fast flow)
Kromatografsko kolono (h=10 cm, d=10 mm) smo napolnili z nosilcem Chelating Sepharose fast flow (Pharmacia), na katerega smo vezali Zn2+ ione, in jo uravnotežili s petimi volumni kolone pufra P2 pri pretoku 2 ml/min. Inkluzijska telesa smo raztopili v pufru P1 (0,2 % sarkozil, 40 mM Tris/HCI, pH 8,0) in odstranili sarkozil na ionskem izmenjevalcu. Na kolono smo nanesli 10 ml raztopine (17 mg celokupnih proteinov), ki je vsebovala biološko aktivni G-CSF, pri pretoku 1 ml/min. Ločitev smo izvedli s stopenjskim gradientom pufra P3 pri pretoku 2 ml/min (glej Sliko 1). V prvem kromatografskem piku (pik A) se nahaja poleg proteinov E. coli predvsem napačno zvit in agregiran G-CSF. Pri 100% pufra P3 (0% pufra P2) se eluira v piku B monomerni, biološko aktivni G-CSF (7 mg) s čistoto večjo od 95 % (glej Sliko 2).
Izmerjena biološka aktivnost vzorca iz pika A je okrog 1 χ 106 lU/mg proteinov, izmerjena biološka aktivnost vzorca iz pika B pa je 8-9 χ 107 lU/mg proteinov, pri čemer je biološka aktivnost standarda 1 x 108 lU/mg proteina. Z enostopenjsko IMAC smo uspeli iz izhodne raztopine inkluzijskih teles izolirati monomerno obliko G-CSF, ki ima več kot 95 % čistoto in specifično biološko aktivnost primerljivo s standardom.
Primer 2: Izolacija biološko aktivnega G-CSF z IMAC: Zn-IDA (Fractogel EMD
Chelate)
Kromatografsko kolono (h=2 cm, d=10mm) smo napolnili z nosilcem Fractogel EMD Chelate (Merck) in nanjo vezali Zn2+ ione. Kolono smo dobro sprali z vodo in
-1616 uravnotežili s petimi volumni pufra P2 pri pretoku 1 ml/min. Inkluzijska telesa smo raztopili v pufru P1 in nato sarkozil odstranili na ionskem izmenjevalcu. Na kolono smo nanesli 3,3 ml vzorca raztopljenih inkluzijskih teles v skupni količini 4 mg. Ločitev smo izvedli s stopenjskim gradientom pufra P3 pri pretoku 1 ml/min (Gradient: 0% pufra P3 (100% pufra P2) 13 minut, 25% pufra P3 (75% pufra P2) 12 minut, 100% pufra P3 (0% pufra P2) 14 minut, 0% pufra P3 (100% pufra P2) 11 minut). Pri 100 % pufra P3 se je eluiral monomerni biološko aktivni G-CSF (0,7 mg).
Primer 3: Izolacija biološko aktivnega G-CSF z IMAC: Ni-NTA (Superflow) Kromatografsko kolono (h=10 cm, d=10 mm) smo napolnili z nosilcem Ni-NTA Superflow (Qiagen) in jo uravnotežili s petimi volumni kolone pufra P4 pri pretoku 2 ml/min. Inkluzijska telesa smo raztopili v pufru P1 in nato sarkozil odstranili na ionskem izmenjevalcu. Na kolono smo nanesli po 10 ml vzorca raztopljenih inkluzijskih teles (10 mg celokupnih proteinov) pri pretoku 1 ml/min. Ločitev smo izvedli s stopenjskim gradientom pufra P5 pri pretoku 2 ml/min (gradient je bil enak kot pri ločbi na koloni Zn-IDA Chelating Sepharose fast flow, ki jo prikazuje Slika 1). Pri 100 % pufra P5 (0% pufra P4) se je eluiral monomerni, biološko aktivni G-CSF (3,6 mg) s čistoto večjo od 95%. V prvem kromatografskem piku se nahaja poleg proteinov E. coli predvsem napačno zvit in agregiran protein. Monomerni G-CSF iz drugega pika smo združili iz več kromatografskih ločb na Ni-NTA Superflow in dokončno čistili na kolonah za kationsko izmenjevalno kromatografijo in gelsko filtracijo.
Primer 4: Celoten postopek za pridobivanje biološko aktivnega G-CSF
Pri celotnem postopku za pridobivanje biološko aktivnega G-CSF smo izhajali iz raztopine inkluzijskih teles, ki smo jih dobili po ekspresiji G-CSF v E. coli. 4,5 g spranih inkluzijskih teles smo resuspendirali v 225 ml pufra P1 in pustili raztapljati pri temperaturi 20°C 18 ur med rahlim stresanjem na recipročnem stresalniku. Po 15minutnem centrifugiranju smo odstranili sarkozil s pomočjo vezave na ionski izmenjevalec. Vzorec smo razredčili z vodo do dvakratnega volumna in dobili ~ 430 ml raztopine inkluzijskih teles s proteinsko koncentracijo ~ 1,4 mg/ml (po Bradfordu
-1717 glede na G-CSF kot standard). Proteinsko raztopino smo v dveh enakih alikvotih nanesli na kromatografsko kolono ΧΚ50/20 (Pharmacia), napolnjeno z nosilcem Chelating Sepharose fast flow (45-165 pm, Pharmacia) do višine 10 cm (h=10 cm, d=5 cm, V=200 ml), na katerega smo vezali Zn2+ ione. Nanos vzorca in elucija iz kolone sta potekali pri pretoku 7 ml/min. Po končanem nanosu smo kolono spirali s stopenjskim gradientom (Glej Sliko 3): 15 minut s pufrom P2, nato 45 minut z mešanico pufrov P2 in P6 v volumskem razmerju 75:25 in 86 minut s pufrom P6. Monomerni biološko aktivni G-CSF se je eluiral pri 100% pufra P6. Po združenju vseh frakcij (iz dveh ločb), ki so vsebovale monomerni biološko aktivni G-CSF, smo dobili 271 ml raztopine s koncentracijo proteinov ~ 0,7 mg/ml, ki smo ji dodali EDTA do končne koncentracije 2 mM. To raztopino smo po trikratnem razredčenju z 20 mM CH3COOH, pH 4,0 uporabili za naslednjo ločbo na koloni za kationsko kromatografijo.
Raztopino, ki smo jo dobili po IMAC smo v dveh alikvotih nanesli na kromatografsko kolono ΧΚ16/20 (Pharmacia), napolnjeno s kromatografskim nosilcem SP-5PVV (30 μιτι; TosoHaas) do višine 16 cm (h=16 cm, d=1,6 cm, V=32 ml). Nanos vzorca in elucija s kolone sta potekali pri pretoku 5 ml/min. Po končanem nanosu vzorca smo kolono spirali 11 minut s pufrom P7, sledila je elucija z linearnim zveznim gradientom pufra P8 in sicer v 30 minutah od 0% do 25 % pufra P8 (od 100% do 75% pufra P7). Kolono smo spirali še 16 minut z mešanico pufrov P7 in P8 v volumskem razmerju 75:25 in nato 22 minut s pufrom P8 (Glej Sliko 4). Frakcije glavnega kromatografskega pika, ki se eluira v linearnem delu zveznega gradienta pri ~ 18% pufra P8 in pripada pravilni obliki G-CSF (z več kot 98% čistoto), smo združili in direktno uporabili za nanos na naslednjo kromatografsko kolono za gelsko filtracijo.
Raztopino, ki smo jo dobili po kationski kromatografiji (V= 46 ml, koncentracija proteinov ~ 2,4 mg/ml), smo v 5 alikvotih nanesli na kromatografsko kolono ΧΚ26/70 (Pharmacia), napolnjeno s kromatografskim nosilcem Superdex 75 (prep grade, 34 pm) (Pharmacia) do višine 57 cm (h=57 cm, d=2.6 cm, V=300 ml). Ločba je potekala v pufru P9 pri pretoku 2,5 ml/min. Pik, ki vsebuje dimerni protein, je dobro ločen od glavnega kromatografskega pika za monomerni protein (Glej Sliko 5). Po združitvi
-1818 frakcij glavnega kromatografskega pika in zamenjavi pufra smo dobili 100 mg čistega monomernega G-CSF z več kot 99% čistoto in biološko aktivnostjo 1 χ 108 lU/mg, kar je ekvivalentno specifični aktivnosti standarda.
Primer 5: Testiranje biološke aktivnosti G-CSF in vitro
Biološko aktivnost G-CSF smo določali z metodo proliferacije na celični liniji
NFS-60 po znani metodi (Hammerlingn, U. s sodelavci v J Pharm Biomed Anal 13, 920 (1995)) in uporabi mednarodnega standarda Human recombinant G-CSF (88/502, yeast celi derived; NIBSC Potters Bar, Hertfordshire, UK); (Mire-Sluis,A.R. s sodelavci v J Immunol Methods 179, 117-126 (1995)).
Sestave pufrov:
P1: 0,2% sarkozil, 40 mM TrisHCI, pH 8,0
P2: 20 mM TrisHCI, 150 mM NaCI pH 8,0
P3: 20 mM ocetna kislina, 150 mM NaCI, pH uravnan na 4,5 z dodajanjem 1 M NaOH
P4: 10 mM TrisHCI, 200 mM NaCI, pH 8,0
P5: 20 mM ocetna kislina, 200 mM NaCI, pH uravnan na 4,0 z dodajanjem 1 M NaOH
P6: 20 mM CH3COOH, 150 mM NaCI, pH 4,0
P7; 20 mM CH3COOH, pH 5,5
P8: 20 mM CH3COOH, 500 mM NaCI, pH 5,5
P9: 5 mM Na fosfat, 50 mM NaCI, pH 7,0
LEK, tovarna farmacevtskih in kemičnih izdelkov, d.d.
Claims (29)
- Patentni zahtevki1. Postopek za izolacijo biološko aktivnega G-CSF, ki vključuje uporabo kromatografije na IMAC nosilcu.
- 2. Postopek po zahtevku 1, ki vključuje naslednje stopnje:• nanos raztopine, ki vsebuje biološko aktivni G-CSF, na nosilec za IMAC, • selektivno vezavo biološko aktivnega G-CSF na nosilec za IMAC in • spiranje in elucijo biološko aktivnega G-CSF iz kolone za IMAC.
- 3. Postopek po zahtevkih od 1 do 2, označen s tem, da omogoča ločevanje biološko aktivnih, monomernih in pravilno zvitih oblik G-CSF od biološko neaktivnih nepravilno zvitih monomernih, oligomernih ali polimernih oblik G-CSF, in tudi od večine gostiteljskih proteinov.
- 4. Postopek po zahtevkih od 1 do 3, označen s tem, da je biološko aktivni G-CSF neglikoziliran.
- 5. Postopek po zahtevkih od 1 do 3, označen s tem, da je biološko aktivni G-CSF glikoziliran.
- 6. Postopek po zahtevkih od 1 do 3, označen s tem, da je biološko aktivni G-CSF izbran iz skupine, ki obsega metionil G-CSF, G-CSF analoge, encimatsko in kemijsko modificirane oblike G-CSF in fuzijske proteine, ki vsebujejo G-CSF.
- 7. Postopek po zahtevkih od 1 do 3, označen s tem, da je izvor raztopine, ki vsebuje biološko aktivni G-CSF, izbran iz skupine, ki obsega raztopino G-CSF po denaturaciji, ki ji sledi renaturacija, raztopino inkluzijskih teles pri nativnih pogojih, supernatant po ekspresiji v sekretornih sistemih, in eluat, ki smo ga dobili po predhodni eluciji iz kolone za IMAC.
- 8. Postopek po zahtevku 7, označen s tem, da je izvor biološko aktivnega G-CSF raztopina inkluzijskih teles pri nativnih pogojih.
- 9. Postopek po zahtevkih od 1 do 3, označen s tem, da so nosilci za IMAC izbrani iz skupine, ki obsega M(ll)-iminodiacetat, M(ll)-nitriloocetno kislino in M(ll)karboksimetilaspartat, kjer je M izbran iz skupine, ki obsega Zn, Cu, Co in Ni.
- 10. Postopek po zahtevku 9, označen s tem, da so nosilci za IMAC izbrani iz skupine, ki obsega Zn(ll)-iminodiacetat, Ni(ll)-iminodiacetat in Ni(ll)-nitrilotriocetno kislino.-2020
- 11. Postopek po zahtevku 10, označen s tem, da je nosilec za IMAC Zn(ll)iminodiacetat.
- 12. Postopek po zahtevkih od 1 do 3, označen s tem, da je raztopina za nanos, ki vsebuje biološko aktivni G-CSF, pufrska raztopina, s pH v območju med 6,5 in 9,0.
- 13. Postopek po zahtevku 12, označen s tem, da ima raztopina za nanos pH od 7,8 do 8,2.
- 14. Postopek po zahtevku 12, označen s tem, da so pufri za pripravo raztopine za nanos, ki vsebuje biološko aktivni G-CSF, izbrani iz skupine, ki obsega acetatni, fosfatni, Tris/HCI in Tris/acetatni pufer.
- 15. Postopek po zahtevku 14, označen s tem, da je pufer za pripravo raztopine za nanos, ki vsebuje biološko aktivni G-CSF, Tris/HCI pufer.
- 16. Postopek po zahtevku 15, označen s tem, da je koncentracija Tris/HCI v območju med 10 in 50 mM.
- 17. Postopek po zahtevkih od 1 do 3, označen s tem, da potekata spiranje in elucija biološko aktivnega G-CSF iz kolone za IMAC z uporabo postopka za elucijo, ki obsega stopenjski gradient, zvezni gradient z nizkim pH in kompetitivno elucijo pri visokem pH.
- 18. Postopek po zahtevku 17, označen s tem, da potekata spiranje in elucija biološko aktivnega G-CSF iz kolone za IMAC z uporabo stopenjskega gradienta.
- 19. Postopek po zahtevkih od 1 do 3, označen s tem, da je raztopina za elucijo pufrska raztopina s pH v območju med 3,0 in 5,0.
- 20. Postopek po zahtevku 19, označen s tem, da ima raztopina za elucijo pH 4,0.
- 21. Postopek po zahtevkih od 1 do 3, označen s tem, da so pufri za pripravo raztopine za elucijo, izbrani iz skupine, ki obsega acetatni, Tris/acetatni, fosfatni in citratni pufer.
- 22. Postopek po zahtevku 21, označen s tem, da je pufer za elucijo acetatni pufer.
- 23. Postopek po zahtevkih od 1 do 22, označen s tem, da ima biološko aktivni G-CSF po eluciji iz kolone za IMAC več kot 95% čistoto.
- 24. Postopek po zahtevkih od 1 do 3, označen s tem, da postopek za izolacijo biološko aktivnega G-CSF na IMAC nosilcu lahko opcijsko nadalje vključuje naslednje stopnje:-2121-kationsko izmenjevalno kromatografijo in/ali -gelsko filtracijo.
- 25. Postopek po zahtevku 24, označen s tem, da ima biološko aktivni G-CSF po eluciji iz kolone za gelsko filtracijo več kot 99% čistoto.
- 26. Biološko aktivni G-CSF z več kot 99% čistoto.
- 27. Farmacevtska oblika, ki obsega terapevtsko učinkovito količino biološko aktivnega G-CSF z več kot 99% čistoto in farmacevtsko sprejemljivimi pomožnimi snovmi.
- 28. Farmacevtska oblika po zahtevku 27, označena s tem, da je biološko aktivni GCSF pridobljen po postopku, opisanem v zahtevkih od 1 do 24.
- 29. Uporaba biološko aktivnega G-CSF, pridobljenega po postopku, opisanem v zahtevkih od 1 do 28 za pripravo zdravil, ki so indicirana za indikacije, izbrane iz skupine, ki vključuje vsaj: nevtropenijo in njene klinične sekvele, zmanjšanje hospitalizacije pri febrilni nevtropeniji po kemoterapiji, mobilizacijo hematopoetskih zarodnih celic, alternativo infuziji donorskih levkocitov, kronično nevtropenijo, nevtropenične in nenevtropenične infekcije, prejemnike transplatatov, kronična vnetna obolenja, sepso in septični šok, zmanjšanje tveganja, obolevnosti, smrtnosti in števila dni hospitalizacije pri nevtropeničnih in nenevtropeničnih infekcijah, prevencijo infekcij in komplikacij infekcij pri nevtropeničnih in nenevtropeničnih bolnikih, prevencijo nozokomialne infekcije in zmanšanje mortalitete in frekvence nozokomialnih infekcij, enteralno aplikacijo novorojenčkom, okrepitev imunskega sistema novorojenčkov, izboljšanje kliničnega izida bolnikov na intenzivni negi in kritično bolnih bolnikov, celjenje in zdravljenje opeklin, kožnih ulkusov in ran, intenzifikacijo kemoterapije in/ali radioterapije, pancitopenijo, povečanje anti-inflamatornih citokinov, skrajšanje intervalov visokodozne kemoterapije s profilaktično uporabo G-CSF, potenciranje anti-tumorskih učinkov fotodinamske terapije, prevencijo in zdravljenje bolezni, ki jih povzročajo različne cerebralne disfunkcije, zdravljenje trombotičnih bolezni in njihovih komplikacij in postradiacijsko obnovo eritropoeze.
Priority Applications (25)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SI200100322A SI21102A (sl) | 2001-12-19 | 2001-12-19 | Postopek za izolacijo biološko aktivnega granulocitne kolonije stimulirajočega dejavnika |
| HU0402547A HUP0402547A3 (en) | 2001-12-19 | 2002-12-05 | Process for the purification and/or isolation of biologically active granulocyte colony stimulating factor |
| NZ533305A NZ533305A (en) | 2001-12-19 | 2002-12-05 | Process for the purification and/or isolation of biologically active granulocyte colony stimulating factor |
| SI200230822T SI1458757T1 (sl) | 2001-12-19 | 2002-12-05 | Postopek za äśiĺ äśenje in/ali izolacijo bioloĺ ko aktivnega rastnega dejavnika za granulocite (g-csf) |
| EP09152902A EP2053061A1 (en) | 2001-12-19 | 2002-12-05 | Process for the purification and/or isolation of biologically active granulocyte colony stimulating factor |
| PL369669A PL207775B1 (pl) | 2001-12-19 | 2002-12-05 | Sposób izolowania biologicznie czynnego poprawnie zwiniętego czynnika stymulującego kolonie granulocytów (G-CSF) |
| HR20040572A HRP20040572A2 (en) | 2001-12-19 | 2002-12-05 | Process for the purification and/or isolation of biologically active granulocyte colony stimulating factor |
| JP2003552802A JP4454311B2 (ja) | 2001-12-19 | 2002-12-05 | 生物学的に活性な顆粒球コロニー刺激因子の精製および／または単離方法 |
| IL16244802A IL162448A0 (en) | 2001-12-19 | 2002-12-05 | Process for the purification and/orisolation of biologically active granulocyte colony stimulating factor |
| HK04107314.0A HK1064681B (en) | 2001-12-19 | 2002-12-05 | Process for the purification and/or isolation of biologically active granulocyte colony stimulating factor |
| DE60231243T DE60231243D1 (de) | 2001-12-19 | 2002-12-05 | Prozess für die aufreinigung und isolierung von biologisch-aktivem granulozyten-koloniestimulierungsfaktor |
| KR10-2004-7009409A KR20040071212A (ko) | 2001-12-19 | 2002-12-05 | 생물학적 활성 과립구 콜로니 자극 인자의 정제 및(또는)단리 방법 |
| RU2004121982/13A RU2358980C2 (ru) | 2001-12-19 | 2002-12-05 | Способ очистки и/или выделения биологически активного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора |
| CA2469984A CA2469984C (en) | 2001-12-19 | 2002-12-05 | Process for the purification and/or isolation of biologically active granulocyte colony stimulating factor |
| AU2002366275A AU2002366275B2 (en) | 2001-12-19 | 2002-12-05 | Process for the purification and/or isolation of biologically active granulocyte colony stimulating factor |
| US10/499,315 US20050159589A1 (en) | 2001-12-19 | 2002-12-05 | Process for the purification and/or isolation of biologically active granulocyte colony stimulating factor |
| BR0215191-0A BR0215191A (pt) | 2001-12-19 | 2002-12-05 | Processo para a purificação e/ou isolamento de fator de estimulação de colÈnia de granulócito biologicamente ativo |
| MXPA04006076A MXPA04006076A (es) | 2001-12-19 | 2002-12-05 | Proceso para la purificacion y/o aislamiento del factor estimulante de colonias de granulocitos biologicamente activos. |
| AT02804876T ATE423136T1 (de) | 2001-12-19 | 2002-12-05 | Prozess für die aufreinigung und isolierung von biologisch-aktivem granulozyten- koloniestimulierungsfaktor |
| PCT/EP2002/013810 WO2003051922A1 (en) | 2001-12-19 | 2002-12-05 | Process for the purification and/or isolation of biologically active granulocyte colony stimulating factor |
| EP02804876A EP1458757B1 (en) | 2001-12-19 | 2002-12-05 | Process for the purification and/or isolation of biologically active granulocyte colony stimulating factor |
| CNA028254651A CN1606568A (zh) | 2001-12-19 | 2002-12-05 | 生物活性粒细胞集落刺激因子的纯化和/或分离方法 |
| ZA200404291A ZA200404291B (en) | 2001-12-19 | 2004-06-01 | Process for the purification and/or isolation of biologically active granulocyte colony stimulating factor. |
| IL162448A IL162448A (en) | 2001-12-19 | 2004-06-10 | Process for the purification and isolation of biologically active granulocyte colony stimulating factor |
| NO20042967A NO20042967L (no) | 2001-12-19 | 2004-07-14 | Fremgangsmate for rensing og/eller isolasjon av biologisk aktiv granulocyt-koloni-stimulerende-faktor |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SI200100322A SI21102A (sl) | 2001-12-19 | 2001-12-19 | Postopek za izolacijo biološko aktivnega granulocitne kolonije stimulirajočega dejavnika |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SI21102A true SI21102A (sl) | 2003-06-30 |
Family
ID=20433022
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SI200100322A SI21102A (sl) | 2001-12-19 | 2001-12-19 | Postopek za izolacijo biološko aktivnega granulocitne kolonije stimulirajočega dejavnika |
| SI200230822T SI1458757T1 (sl) | 2001-12-19 | 2002-12-05 | Postopek za äśiĺ äśenje in/ali izolacijo bioloĺ ko aktivnega rastnega dejavnika za granulocite (g-csf) |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SI200230822T SI1458757T1 (sl) | 2001-12-19 | 2002-12-05 | Postopek za äśiĺ äśenje in/ali izolacijo bioloĺ ko aktivnega rastnega dejavnika za granulocite (g-csf) |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20050159589A1 (sl) |
| EP (2) | EP1458757B1 (sl) |
| JP (1) | JP4454311B2 (sl) |
| KR (1) | KR20040071212A (sl) |
| CN (1) | CN1606568A (sl) |
| AT (1) | ATE423136T1 (sl) |
| AU (1) | AU2002366275B2 (sl) |
| BR (1) | BR0215191A (sl) |
| CA (1) | CA2469984C (sl) |
| DE (1) | DE60231243D1 (sl) |
| HR (1) | HRP20040572A2 (sl) |
| HU (1) | HUP0402547A3 (sl) |
| IL (2) | IL162448A0 (sl) |
| MX (1) | MXPA04006076A (sl) |
| NO (1) | NO20042967L (sl) |
| NZ (1) | NZ533305A (sl) |
| PL (1) | PL207775B1 (sl) |
| RU (1) | RU2358980C2 (sl) |
| SI (2) | SI21102A (sl) |
| WO (1) | WO2003051922A1 (sl) |
| ZA (1) | ZA200404291B (sl) |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SI21273A (sl) * | 2002-07-31 | 2004-02-29 | LEK farmacevtska dru�ba d.d. | Priprava inkluzijskih teles z visokim deležem pravilno zvitega prekurzorja heterolognega proteina |
| SI1439191T1 (sl) * | 2004-01-19 | 2006-06-30 | Ares Trading Sa | Postopek ciscenja proteinov izrazenih v bakteriji |
| EP1803464A4 (en) * | 2004-09-17 | 2009-09-09 | Cellgentech Inc | TOPICAL PREPARATION FOR THE TREATMENT OF SKIN DISEASES |
| AU2005327507A1 (en) * | 2005-02-15 | 2006-08-24 | Apollo Life Sciences Limited | A molecule and chimeric molecules thereof |
| US20080171857A1 (en) * | 2005-03-17 | 2008-07-17 | Uma Devi Komath | Process for the Purification of Recombinant Granulocyte-Colony Stimulating Factor |
| DE102005033250A1 (de) * | 2005-07-15 | 2007-01-18 | Bioceuticals Arzneimittel Ag | Verfahren zur Reinigung von G-CSF |
| DE202006020194U1 (de) | 2006-03-01 | 2007-12-06 | Bioceuticals Arzneimittel Ag | G-CSF-Flüssigformulierung |
| EP1878739A1 (en) | 2006-07-14 | 2008-01-16 | LEK Pharmaceuticals D.D. | One step IMAC (MCAC) purification of proteins |
| WO2008096370A2 (en) * | 2007-02-05 | 2008-08-14 | Natco Pharma Limited | An efficient and novel purification method of recombinant hg-csf |
| SI2197919T1 (sl) | 2007-08-27 | 2014-09-30 | Ratiopharm Gmbh | Tekoäśa formulacija g-csf konjugata |
| JP2009073819A (ja) * | 2007-08-29 | 2009-04-09 | Fujifilm Corp | 生理活性物質の精製方法 |
| JP2012530131A (ja) * | 2009-06-16 | 2012-11-29 | ルピン・リミテッド | 組み換えヒト顆粒球コロニー刺激因子の精製のための方法 |
| JP5808323B2 (ja) | 2009-06-22 | 2015-11-10 | アムジエン・インコーポレーテツド | 化学的に制御されたレドックス状態を用いたタンパク質のリフォールディング |
| EP3660032B1 (en) | 2009-06-25 | 2025-10-22 | Amgen Inc. | Capture purification processes for proteins expressed in a non-mammalian system |
| CN102858797B (zh) * | 2010-03-30 | 2016-05-11 | 奥克塔法马股份有限公司 | 纯化生长因子蛋白的方法 |
| CN107915769A (zh) | 2011-03-29 | 2018-04-17 | 葛兰素史密斯克莱有限责任公司 | 用于蛋白纯化的缓冲液体系 |
| CN103215340A (zh) * | 2012-01-19 | 2013-07-24 | 江苏粒福特生物科技有限公司 | 一种新颖的粒细胞制备及其抗癌活性检测方法 |
| HUP1200172A2 (en) * | 2012-03-19 | 2013-10-28 | Richter Gedeon Nyrt | Methods for refolding g-csf from inclusion bodies |
| HUP1200171A1 (hu) | 2012-03-19 | 2013-09-30 | Richter Gedeon Nyrt | Módszerek polipeptidek elõállítására |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61227526A (ja) | 1984-07-25 | 1986-10-09 | Chugai Pharmaceut Co Ltd | 新規なコロニー刺激因子 |
| EP0215126B1 (en) | 1985-02-08 | 1991-07-31 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Human granulocyte colony stimulating factor |
| US4810643A (en) | 1985-08-23 | 1989-03-07 | Kirin- Amgen Inc. | Production of pluripotent granulocyte colony-stimulating factor |
| DK203187A (da) | 1986-04-22 | 1987-10-23 | Immunex Corp | Human g-csf proteinekspression |
| EP0719860B1 (en) * | 1988-05-13 | 2009-12-16 | Amgen Inc. | Process for isolating and purifying G-CSF |
| US5055555A (en) | 1989-01-05 | 1991-10-08 | Helmut Sassenfeld | Purification of G-CSF |
| US5169936A (en) | 1989-04-14 | 1992-12-08 | Biogen, Inc. | Protein purification on immobilized metal affinity resins effected by elution using a weak ligand |
| US5932102A (en) | 1998-01-12 | 1999-08-03 | Schering Corporation | Immobilized metal, affinity chromatography |
| FR2796071B1 (fr) * | 1999-07-08 | 2001-09-07 | Hoechst Marion Roussel Inc | Procede de purification de facteur de stimulation de colonies de granulocytes |
-
2001
- 2001-12-19 SI SI200100322A patent/SI21102A/sl not_active IP Right Cessation
-
2002
- 2002-12-05 HU HU0402547A patent/HUP0402547A3/hu unknown
- 2002-12-05 JP JP2003552802A patent/JP4454311B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2002-12-05 AT AT02804876T patent/ATE423136T1/de active
- 2002-12-05 PL PL369669A patent/PL207775B1/pl unknown
- 2002-12-05 EP EP02804876A patent/EP1458757B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-12-05 HR HR20040572A patent/HRP20040572A2/xx not_active Application Discontinuation
- 2002-12-05 KR KR10-2004-7009409A patent/KR20040071212A/ko not_active Ceased
- 2002-12-05 RU RU2004121982/13A patent/RU2358980C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2002-12-05 DE DE60231243T patent/DE60231243D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-12-05 BR BR0215191-0A patent/BR0215191A/pt not_active Application Discontinuation
- 2002-12-05 SI SI200230822T patent/SI1458757T1/sl unknown
- 2002-12-05 CA CA2469984A patent/CA2469984C/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-12-05 EP EP09152902A patent/EP2053061A1/en not_active Withdrawn
- 2002-12-05 WO PCT/EP2002/013810 patent/WO2003051922A1/en not_active Ceased
- 2002-12-05 CN CNA028254651A patent/CN1606568A/zh active Pending
- 2002-12-05 IL IL16244802A patent/IL162448A0/xx unknown
- 2002-12-05 AU AU2002366275A patent/AU2002366275B2/en not_active Ceased
- 2002-12-05 US US10/499,315 patent/US20050159589A1/en not_active Abandoned
- 2002-12-05 NZ NZ533305A patent/NZ533305A/en unknown
- 2002-12-05 MX MXPA04006076A patent/MXPA04006076A/es active IP Right Grant
-
2004
- 2004-06-01 ZA ZA200404291A patent/ZA200404291B/en unknown
- 2004-06-10 IL IL162448A patent/IL162448A/en not_active IP Right Cessation
- 2004-07-14 NO NO20042967A patent/NO20042967L/no not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| BR0215191A (pt) | 2004-11-16 |
| ZA200404291B (en) | 2005-08-05 |
| MXPA04006076A (es) | 2005-02-24 |
| EP1458757A1 (en) | 2004-09-22 |
| HUP0402547A2 (hu) | 2005-03-29 |
| AU2002366275B2 (en) | 2009-04-02 |
| EP1458757B1 (en) | 2009-02-18 |
| HK1064681A1 (en) | 2005-02-04 |
| PL207775B1 (pl) | 2011-01-31 |
| PL369669A1 (en) | 2005-05-02 |
| RU2004121982A (ru) | 2005-04-20 |
| CA2469984A1 (en) | 2003-06-26 |
| SI1458757T1 (sl) | 2009-10-31 |
| CA2469984C (en) | 2014-05-20 |
| NZ533305A (en) | 2005-11-25 |
| EP2053061A1 (en) | 2009-04-29 |
| JP2005525304A (ja) | 2005-08-25 |
| DE60231243D1 (de) | 2009-04-02 |
| NO20042967L (no) | 2004-09-07 |
| RU2358980C2 (ru) | 2009-06-20 |
| AU2002366275A1 (en) | 2003-06-30 |
| HRP20040572A2 (en) | 2005-06-30 |
| WO2003051922A1 (en) | 2003-06-26 |
| IL162448A0 (en) | 2005-11-20 |
| CN1606568A (zh) | 2005-04-13 |
| IL162448A (en) | 2010-12-30 |
| JP4454311B2 (ja) | 2010-04-21 |
| KR20040071212A (ko) | 2004-08-11 |
| ATE423136T1 (de) | 2009-03-15 |
| HUP0402547A3 (en) | 2010-01-28 |
| US20050159589A1 (en) | 2005-07-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| SI21102A (sl) | Postopek za izolacijo biološko aktivnega granulocitne kolonije stimulirajočega dejavnika | |
| ES3002087T3 (en) | A novel process for purification of rhu-gcsf | |
| WO2008006899A1 (en) | One step imac (mcac) purification of proteins | |
| JPH03193736A (ja) | ヒトインターロイキン２の活性を有するポリペプチドからなることを特徴とする白血病を治療するための医薬組成物 | |
| ES2322819T5 (es) | Procedimiento de purificación de G-CSF | |
| EP2341061B1 (en) | A novel process for preparing G-CSF (granulocyte colony stimulating factor) | |
| RU2278870C2 (ru) | Способ получения, выделения, очистки и стабилизации рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека, пригодного для медицинского применения, и иммунобиологическое средство на его основе | |
| IE61444B1 (en) | Process for preparing and purifying interferon | |
| IL90975A (en) | Non-glycosylated, recombinant human il2 in reduced form, the process for obtaining it and its use as a medicament | |
| MXPA06006356A (es) | Proceso para purificar interferon beta. | |
| KR100531670B1 (ko) | 인체 인터페론 알파의 제조방법 | |
| JPWO1992014832A1 (ja) | ヒトｂｃｄｆの精製法 | |
| WO1992014832A1 (fr) | Procedes pour la purification de fdlb humains | |
| HK1064681B (en) | Process for the purification and/or isolation of biologically active granulocyte colony stimulating factor | |
| WO2016146629A1 (en) | A process for preparing g-csf (granulocyte colony stimulating factor) | |
| EP0446850B1 (en) | Process for purifying recombinant human beta-interferon | |
| US20220195002A1 (en) | Process for preparing granulocyte-colony stimulating factor |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| IF | Valid on the event date | ||
| KO00 | Lapse of patent |
Effective date: 20120106 |