[go: up one dir, main page]

SI20120A - Nova karbonil reduktaza, gen, ki omenjeno kodira in postopek za uporabo take reduktaze in gena - Google Patents

Nova karbonil reduktaza, gen, ki omenjeno kodira in postopek za uporabo take reduktaze in gena Download PDF

Info

Publication number
SI20120A
SI20120A SI9720093A SI9720093A SI20120A SI 20120 A SI20120 A SI 20120A SI 9720093 A SI9720093 A SI 9720093A SI 9720093 A SI9720093 A SI 9720093A SI 20120 A SI20120 A SI 20120A
Authority
SI
Slovenia
Prior art keywords
enzyme
ethyl
plasmid
hydrogen
optically active
Prior art date
Application number
SI9720093A
Other languages
English (en)
Inventor
Yasohara Yoshihiko
Kizaki Noriyuki
Hasegawa Junzo
Wada Masaru
Shimizu Sakayu
Kataoka Michihiko
Yamamoto Kazuhiko
Kawabata Hiroshi
Kita Keiko
Original Assignee
Kaneka Corporation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kaneka Corporation filed Critical Kaneka Corporation
Publication of SI20120A publication Critical patent/SI20120A/sl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
    • C12P41/002—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by oxidation/reduction reactions

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

Zagotovili smo encim z aktivnostjo karbonilne redukcije z reduciranjem karbonilne spojine asimetrično, da se izdela optično aktiven alkohol, neko DNA, ki kodira encim, nek plazmid z DNA, neko transformanto, ki je celica, transformirana s plazmidom in postopek izdelave optično aktivnega alkohola z uporabo encima in/ali transformirane celice.ŕ

Description

NOVA KARBONIL REDUKTAZA, GEN, KI OMENJENO KODIRA IN POSTOPEK ZA UPORABO TAKE REDUKTAZE IN GENA
PODROČJE TEHNIKE
Predloženi izum se nanaša na encim z aktivnostjo karbonilne redukcije z reduciranjem karbonilne spojine asimetrično, da se izdela optično aktiven alkohol (odslej se ta encim navaja kot CRD encim) , na DNA, ki kodira tak encim, na plazmid, ki ima tako DNA, na neko transformanto, ki je celica, transformirana s takim plazmidom in na postopek izdelave optično aktivnega alkohola z uporabo encima in/ali transformirane celice. Nastali optično aktiven alkohol, na primer ester (S)-4-halo-3-hidroksi maslene kisline, je uporabna spojina kot surovina za sintezo zdravil, agrikulturnih kemikalij in podobnega.
OZADJE IZUMA
Poznanih je več CRD encimov (glej Yuki Gosei Kagaku, 49, 52 (1991) in Eur. J. Biochem., 184, 1 (1981)). Tista med takimi CRD encimi, ki delujeta na 4-halo acetocetni ester, da se proizvede ester (S) -4-halo-3-hidroksi maslene kisline, ki sta dobljena iz mikrobov in ki imata opisane karakteristike, sta samo iz Geotriohum candidum dobljeni encim (Enzyme Microb. Technol. (1992), Vol. 14, 731) in iz Candida parapsilosis dobljen encim (Enzyme Microb. Technol. (1993), Vol. 15, 950). Vendar ni bilo nobene informacije predstavljene o genih, ki kodirajo ta dva tipa encimov. Redukcija 4-halo acetocetnega estra z uporabo takih encimov se vrši samo pri nizki koncentraciji substrata. Zato je nepraktično sintetizirati ester (S)-4-halo-3-hidroksi maslene kisline z uporabo takih encimov kot katalizatorjev.
-2Poleg zgornje reakcije z uporabo dveh tipov encimov, je poznanih več reakcij, pri katerih se uporabljajo mikrobna telesa in proizvodov takih reakcij, ki izvedejo asimetrično redukcijo 4halo acetocetnega estra (Japonski Patent št. 1723728, Japonska javna objava št. 6-209782 in 6-38776, itd.). Vendar se take reakcije ne izvajajo pri visoki koncentraciji substrata in zato ni mogoče zagovarjati, da je bil vpeljan praktičen postopek proizvodnje. Glej, na primer, postopek reakcije z uporabo dvofaznega sistema z organskim topilom (Japonski patent št. 2566962). Opisan je bil tudi postopek (Japonska javna objava št. 1-211551), ki kot katalizator uporablja rutenijev optično aktiven fosfin kompleks. Pri tem postopku pa je mnogo problemov, ki jih je treba rešiti, kot na primer zahteva po visokotlačni reakcijski posodi in potreba za dragim katalizatorjem.
V zgornjih okoliščinah je bil zaželen razvoj praktičnega encima za uporabo pri asimetrični redukciji karbonilne spojine, kot na primer 4-halo acetocetnega estra, da bi se izdelal nek optično aktiven alkohol, kot na primer ester (S)-4-halo-3-hidroksi maslene kisline.
Za reakcijo zahteva CRD encim nek koencim redukcijskega tipa. Običajno se, kadar je treba reducirati neko karbonilno spojino z uporabo mikrobnega telesa in podobnega, ki ima CRD encim, v reakcijski sistem dodaja nek saharid, kot na primer glukoza, da se aktivira skupina encimov regeneracijskega sistema za spremembo oksidiranega koencima v reducirani tip, s tem regenerirajoč koencim tako, da se uporabi za redukcijo. Verjetno je, da tako skupino encimov regeneracijskega sistema blokirajo ali poškodujejo substrati in reducirani produkti. To se je smatralo za enega od glavnih razlogov, zakaj redukcija napreduje samo, če je koncentracija substratov ali produktov nizka. Poznano je, da se količina dragega koencima, uporabljanega med
-3redukcijo, lahko bistveno zmanjša s kombiniranjem nekega encima s sposobnostjo regeneriranja koencima, od katerega je CRD encim odvisen, s CRD encimom med reakcijo (Japonski patent št. 2566960 in Enzyme Microb. Technol. (1993), Vol. 15, 950, na primer). V tem primeru pa je potrebno, da se vir encima za regeneriranje koencima pripravi ločeno od priprave CRD encima, preden se regenerirajoči encim doda v reakcijski sistem.
Izumitelji predložene prijave so odkrili nek nov CRD encim, dobljen iz rodu Candida in ugotovili, da se z uporabo tega CRD encima lahko optično aktiven alkohol učinkovito izdela iz karbonilne spojine.
Ugotovljeno je bilo tudi, da se lahko optično aktiven alkohol učinkovito izdela z uporabo neke transformirane celice, ki istočasno vsebuje gen encima s sposobnostjo regeneriranja koencima (na primer gen glukoza dehidrogenaze).
Potemtakem lahko predloženi izum, ki ga opisujemo v opisu patenta, ugodno zagotovi nek nov CRD encim, neko DNA, ki kodira ta encim, nek plazmid, ki ima to DNA, neko transformanto, ki je celica, transformirana s tem plazmidom in postopek izdelave optično aktivnega alkohola z uporabo zgornjega encima in/ali transformirane celice.
OPIS IZUMA
Karbonil reduktaza v smislu predloženega izuma ima fizikalne in kemične lastnosti (1) do (4):
(1) učinkovanj e:
delovanje na etil 4-kloroacetoacetat z uporabo NADPH kot koencima, da se izdela etil (S)-4-kloro-3-hidroksibutirat;
(2) specifičnost substrata:
-4izkazovanje močne aktivnosti na etil 4-kloroacetoacetat, medtem ko v bistvu ni izkazovanja aktivnosti na etil acetoacetat;
(3) optimalen pH: 5,5 do 6,5; in (4) optimalna temperatura učinkovanja 50 °C do 55 °C.
Pri eni izvedbi ima karbonil reduktaza dodatne fizikalne in kemične lastnosti (5) do (7):
(5) toplotna stabilnost: stabilna je do okoli 40 °C, če se obdeluje pri pH 7,0 v teku 30 minut;
(6) inhibitor: inhibirana je z živo srebrovimi ioni in kvercetinom; in (7) molekulska masa: okoli 76.000 pri analizi z gelsko filtracijo in okoli 32.000 pri analizi z elektroforezo z SDSpoliakrilamidom.
Karbonil reduktaza v smislu predloženega izuma ima aminokislinsko zaporedje SEQ ID NO:1 iz Seznama zaporedij, ali neko aminokislinsko zaporedje, pri katerem je ena ali več amino kislin odstranjenih, substituiranih ali dodanih v aminokislinsko zaporedje SEQ ID N0:l iz Seznama zaporedij, ali del aminokislinskih zaporedij SEQ ID NO:1 iz Seznama zaporedij in ki ima aktivnost reduciranja etil 4-kloroacetoacetata asimetrično, da se izdela etil (S)-4-kloro-3-hidroksibutirat.
Pri eni izvedbi se encim dobi iz mikroba, ki spada v genus Candida. V prednostni izvedbi je encim dobljen iz Candida magnoliae. V bolj prednostni izvedbi je encim dobljen iz Candida magnoliae IFO 0705.
DNA v smislu predloženega izuma kodira za zgornji encim. V eni izvedbi ima DNA nukleotidno zaporedje SEQ ID NO:2 iz Seznama zaporedij.
-5Plazmid v smislu predloženega izuma ima zgornje zaporedje DNA. V eni izvedbi je plazmid pNTSl.
Transformirana celica v smislu predloženega izuma je neka transformanta, ki je celica, transformirana z zgornjim plazmidom. Pri eni izvedbi je transformirana celica E. coli. V prednostni izvedbi je transformirana celica E. coli HB101(pNTSl).
Plazmid v smislu predloženega izuma ima DNA, kodirajočo za encim z aktivnostjo asimetričnega reduciranja etil 4kloroacetoacetata, da se izdela etil (S)-4-kloro-3hidroksibutirat in DNA, kodirajočo za encim s sposobnostjo regeneriranja koencima, od katerega zavisi encim (npr. glukoza dehidrogenazo).
Pri eni izvedbi je glukoza dehidrogenaza dobljena iz Bacillus megaterium. V prednostni izvedbi je plazmid pNTSIG.
Transformirana celica v smislu predloženega izuma je neka transformanta, ki je celica, transformirana z zgornjim plazmidom.
Pri eni izvedbi je transformirana celica E. coli. V prednostni izvedbi je transformirana celica E. coli HB101(pNTSl).
Transformirana celica v smislu predloženega izuma je neka transformanta, ki je celica, transformirana s prvimi plazmidom, ki ima DNA, kodirajočo za encim z aktivnostjo asimetričnega reduciranja etil 4-kloroacetoacetata, da se izdela etil (S)-4kloro-3-hidroksibutirat in z drugim plazmidom, ki ima DNA, kodirajočo nek encim s sposobnostjo regeneriranja koencima, od katerega je odvisen encim (npr. glukoza dehidrogenazo).
-6Pri eni izvedbi je transformirana celica neka transformanta, ki je celica, transformirana s plazmidom pNTSl in s plazmidom, ki ima DNA, kodirajočo za glukoza dehidrogenazo, dobljeno iz Bacillus megaterium. Pri prednostni izvedbi je transformirana celica E. coli.
Izdelavni postopek za izdelavo optično aktivnega estra 3hidroksi maslene kisline v smislu predloženega izuma vključuje stopnje: reagiranje, z estrom 3-okso maslene kisline, nekega encima z aktivnostjo asimetričnega reduciranja estra 3-oksomaslene kisline, da se izdela nek optično aktiven ester 3hidroksi-maslene kisline, ali kulture mikroba s sposobnostjo izdelave encima, ali obdelanega proizvoda kulture; in pospravljanje pridelka izdelanega optično aktivnega estra 3hidroksi-maslene kisline.
Izdelavni postopek za izdelavo optično aktivnega estra 3hidroksi maslene kisline v smislu predloženega izuma vključuje stopnje: reagiranje transformante, ki je celica, transformirana s plazmidom, ki ima DNA, kodirajočo za encim z aktivnostjo asimetričnega reduciranja estra 3-okso-maslene kisline, da se izdela nek optično aktiven ester 3-hidroksi-maslene kisline, z estrom 3-okso-maslene kisline; in pospravljanje pridelka izdelanega optično aktivnega estra 3-hidroksi-maslene kisline.
Izdelavni postopek za izdelavo optično aktivnega alkohola v smislu predloženega izuma vključuje stopnje: reagiranje, s karbonilno spojino, neke transformante, ki je celica, transformirana s plazmidom, ki ima DNA, kodirajočo za encim z aktivnostjo asimetričnega reduciranja karbonilne spojine, da se izdela nek optično aktivena alkohol in DNA, kodirajočo encim s sposobnostjo regeneriranja koencima, od katerega je encim odvisen; in pospravljanje pridelka izdelanega optično aktivnega
-7alkohola.
Izdelavni postopek optično aktivnega alkohola v smislu predloženega izuma vključuje stopnje: reagiranje, s karbonilno spojino, neke transformante, ki je celica, transformirana s prvim plazmidom, ki ima DNA, kodirajočo za encim z aktivnostjo asimetričnega reduciranja karbonilne spojine, da se izdela optično aktiven alkohol in z drugim plazmidom, ki ima DNA, kodirajočo za encim s sposobnostjo regeneriranja koencima, od katerega je odvisen encim; in pospravljanje pridelka izdelanega optično aktivnega alkohola.
Pri eni izvedbi je karbonilna spojina ester 3-okso-maslene kisline, predstavljen s splošno formulo:
R,
COOR,
R, nastali optično aktiven alkohol pa je optično aktiven ester 3hidroksi-maslene kisline, predstavljen s splošno formulo:
OH
R,. X .COOR,
R,
Pri prednostni izvedbi sta v zgornjih splošnih formulah R1 in R2 neodvisno halogen, azid, benzil amino ali vodik, pri čemer je eden od Rj^ in R2 vodik, R3 pa je neka substituirana ali nesubstituirana alkilna skupina ali arilna skupina.
V bolj prednostni izvedbi je v zgornjih splošnih formulah R^ klor, R2 je vodik, R3 pa je etil.
V prednostni izvedbi sta v zgornjih splošnih formulah R1 in R2
-8neodvisno alkilna skupina, hidroksilna skupina ali vodik, pri čemer je eden od R-^ in 1½ vodik, R3 pa je substituirana ali nesubstituirana alkilna skupina ali arilna skupina.
V bolj prednostni izvedbi je v zgornjih splošnih formulah Rhidroksilna skupina, R2 je vodik, R3 pa je etil.
KRATEK OPIS RISB
Slika 1 je pregled, ki kaže zaporedje baz in določeno aminokislinsko zaporedje.
Slika 2 je pregled, ki ilustrira postopek za konstrukcijo rekombinantnega plazmida pNTSIG.
NAJBOLJŠI NAČIN ZA IZVAJANJE IZUMA
Predloženi izum bo v dodatnih podrobnostih opisan spodaj.
(Prečiščenje CRD encima)
Organizem, uporabljen kot vir CRD encima v smislu predloženega izuma, ni specifično omejen, vendar je lahko, na primer, kvasovka iz rodu Candida. Posebno prednosten primer je Candida oagnoliae IFO 0705, ki je mikrob, prvotno deponiran pri Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS; Oosterstraat 1, Postbus 273, NL-3740 AG Baarn, Netherlands) pod številko CBS166 in katerega izolacija in karakteristike so opisane v The Yeasts, a Taxonomic Study, 3. izdaja (1984), stran 731. Mikrob, sposoben izdelave encima v smislu predloženega izuma, je lahko iz nekega divjega seva ali nekega mutiranega seva. Alternativno se tudi lahko uporablja nek mikrob, dobljen z genetsko tehniko, kot na primer s celično združitvijo ali genetsko manipulacijo.
-9Na primer, mikrob, dobljen z genetsko manipulacijo, ki producira encim v smislu predloženega izuma, se lahko dobi s postopkom, ki vključuje stopnje: izoliranje in/ali prečiščenje takega encima, da se določi del ali celota aminokislinskega zaporedja encima; dobivanje zaporedja DNA od DNA, kodirajoče za encim na osnovi dobljenega aminokislinskega zaporedja; uvajanje DNA v drug mikrob, da se dobi rekombinantni mikrob; in gojenje rekombinantnega mikroba, da se dobi encim v smislu predloženega izuma.
Medij za gojenje mikroba za dobivanje encima v smislu predloženega izuma (ali mikroba, uporabljenega pri izdelavnem postopku estra (S)-4-halo-3-hidroksi maslene kisline v smislu predloženega izuma) ni posebej omejen, dokler lahko omogoča rast mikroba. Lahko se uporablja, na primer, normalen tekoč hranilen medij, ki vsebuje nek vir ogljika, nek vir dušika, neko anorgansko sol, neko organsko hranilo in podobno.
Mikrobna kultura, kot se uporablja tu notri, pomeni neko mikrobno telo ali tekočo kulturo, ki vsebuje telo mikroba, njegov obdelani proizvod pa pomeni proizvod, dobljen z ekstrakcijo in prečiščenjem, na primer, kot je opisano spodaj.
Za ekstrakcijo in prečiščenje encima od nastale kulture se lahko uporabljata postopka encimske ekstrakcije in prečiščenja, ki ju normalno uporabljajo strokovnjaki. Na primer, kultura se centrifugira, da se izločijo mikrobna telesa, nastala mikrobna telesa pa se suspendirajo v primernem puferju. Mikrobna telesa v suspenziji se razbijejo ali raztopijo z uporabo neke fizikalne tehnike, kot na primer z uporabo steklenih kroglic ali neke biokemijske tehnike, kot na primer z uporabo nekega encima. Trdne snovi v raztopini se potem odstranijo s centrifugiranjem, da se dobi surova encimska raztopina. Alternativno se taka
-10surova encimska raztopina lahko dobi iz kulture s postopkom prečiščenja, podobnim onemu, ki je opisan zgoraj.
Zgornja surova encimska raztopina se lahko nadalje prečisti z uporabo postopka, ki ga normalno uporabljajo strokovnjaki, kot na primer obarjanje z amonijevim sulfatom, dializa in kromatografija, samega ali v kombinaciji. Kar se tiče kromatografije, se lahko sami ali v kombinaciji uporabljajo različni tipi kromatografije, kot na primer hidrofobna kromatografija, ionsko izmenjalna kromatografija (npr. DEAE Sepharose) in gelska filtracija, da se dobi encim v smislu predloženega izuma.
CDR encim se, na primer, lahko izolira iz Candida magnoliae IFO 0705 na naslednji način.
Zgornja kvasovka se najprej goji v nekem primernem mediju, mikrobna telesa pa se zberejo iz nastale kulture s centrifugiranjem. Mikrobna telesa se razbijejo z Dyno mill-om (ki ga izdeluje Dyno-Mill) , na primer, in centrifugirajo, da se odstranijo ostanki celic in se tako dobi ekstrakt brez celic. Ekstrakt brez celic se potem podvrže nekemu obdelovanju, kot na primer izsoljevanju (npr. obarjanju z amonijevim sulfatom in obarjanju z natrijevim fosfatom), obarjanju s topilom (obarjalni postopek s frakcioniranjem proteinov z uporabo acetona, etanola ali podobnega), dializi, gelski filtraciji, ionski izmenjavi, kolonski kromatografiji, kot na primer reverzno fazni kromatografiji in ultrafiltraciji, samemu ali v kombinaciji, da se encim prečisti. Aktivnost CRD encima se lahko določi z merjenjem zmanjšanja v absorpciji pri 340 nm pri 30 °C za 100 mM fosfatni pufer (pH 6,5) z 1 mM etil 4-kloroacetoacetatom kot substratom, 0,1 mM NADPH kot koencimom in k temu dodanim encimom ali za 200 mM fosfatni pufer (pH 7,0) z 0,2 mM etil 4-liki or oacetoacetatom kot substratom in 0,32 mM NADPH kot k temu dodanim koencimom. Pod temi rakcijskimi pogoji je oksidacija 1 pmola NADPH v NAD P v eni minuti definirana kot ena enota encimatske aktivnosti.
Izraz, da je nek encim stabilen, kot se uporablja tu notri, pomeni, da encim, potem ko je bil obdelan pri pH 7,0 pri 40 °C v teku 30 minut, obdrži 90 % aktivnosti ali več od one pred obdelovanjem.
Molekulska masa encima se meri z gelsko filtracijo z uporabo kolone TSK-G3000SW (Φ 0,75 x 60 cm; ki jo izdeluje Tosoh Corporation). Kot eluent se uporablja 0,1 M fosfatni pufer (pH 7,0), ki vsebuje 0,1 M Na2SO4 in 0,05 % NaN3. Molekulska masa podenote se določa z izvajanjem elektroforeze z 10 % SDSpoliakrilamidnim gelom pod reduktivnimi pogoji (reducent: 2 V/V % 2-merkaptoetanol) in z izračunanjem iz relativne mobilnosti standardnega proteina.
Na primer, CRD encim, ki ima aminokislinsko zaporedje SEQ ID N0:l v smislu predloženega izuma, ima fizikalne in kemične lastnosti (1) do (4):
(1) učinkovanje:
delovanje na etil 4-kloroacetoacetat z uporabo NADPH kot koencima, da se izdela etil (S)-4-kloro-3-hidroksibutirat;
(2) specifičnost substrata:
izkazovanje močne aktivnosti na etil 4-kloroacetoacetat, medtem ko v bistvu ni izkazovanja aktivnosti na etil acetoacetat;
(3) optimalen pH: 5,5 do 6,5; in (4) optimalna temperatura učinkovanja: 50 °C do 55 °C.
-12Pri eni izvedbi ima karbonil reduktaza, ki ima aminokislinsko zaporedje SEQ ID ΝΟ.Ί v smislu predloženega izuma, dodatne fizikalne in kemične lastnosti (5) do (7):
(5) toplotna stabilnost: stabilna je do okoli 40 °C, če se obdeluje pri pH 7,0 v teku 30 minut;
(6) inhibitor: inhibirana je z živosrebrovimi ioni in kvercetinom; in (7) molekulska masa: okoli 76.000 pri analizi z gelsko filtracijo in okoli 32.000 pri analizi z elektroforezo z SDSpoliakrilamidom.
Encim, ki ima v bistvu identične lastnosti kot encim v smislu predloženega izuma, je lahko nek naraven encim ali rekombinanten encim. Rekombinanten encim se lahko dobi, na primer na naslednji način: Ena amino kislina ali več amino kislin v aminokislinskem zaporedju nekega encima, dobljenega iz Candida magnoliae IFO 0705, je substituiranih, odstranjenih, vstavljenih ali dodanih, da se izdela rekombinatni encim in se izmeri njegova encimska aktivnost.
(Priprava sintetične oligonukleotidne sonde)
Prečiščeni CRD encim, dobljen na zgornji način, se denaturira (npr. z 8M sečnino) in potem razgradi (v angl. orig.: is digested) z endopeptidazo (npr. lizil endopeptidaza). Aminokislinsko zaporedje nastalega peptidnega fragmenta se določi z Edmanovim postopkom. DNA-sonda se sintetizira na osnovi določenega aminokislinskega zaporedja. Taka sonda se lahko, na primer, označi z 32P.
(Ustvarjanje genske knjižnice)
Kromosomska DNA nekega mikroba, ki producira CRD encim v smislu
-13predloženega izuma ali cDNA od tega, se delno razgradi s primernim restrikcijskim encimom, npr., Sau3AI. Fragment DNA, s primerno velikostjo (npr. 23 kb do 20 kb) razgrajenega proizvoda se vstavi v kompatibilno restrikcijsko encimsko mesto fagnega vektorja. Nastali rekombinanti fagni vektor se pakira in vitro in potem omogoča, da se E. coli s tem inficira, da se ustvari genska knjižnica.
(Kloniranje gena CRD encima iz genske knjižnice)
Tako ustvarjena genska knjižnica se lahko preišče za nek gen CRD encima s postopkom hibridizacije plakov z uporabo z 32p označene sintetične DNA sonde (Science, 196, 180 (1977)). Analiza zaporedja baz nastale DNA se lahko določi z metodo dideoksi sekvenciranja, z metodo terminacije dideoksi verige ali podobnim. Taka določitev zaporedja se lahko izvaja z uporabo kompleta ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (ki ga izdeluje Perkin Elmer) in ABI 373A DNA Seguencer (ki ga izdeluje Applied Biosystems).
Nastali fragment DNA se lahko pomnoži s postopkom PCR ali podobnim in klonira.
(Konstrukcija rekombinantnega plazmida, ki vsebuje gen CRD encima)
Gen CRD encima se uvede v gostiteljski mikrob in izrazi v njem z uporabo vektorske DNA. Kot taka vektorska DNA se lahko uporabi katerakoli vektorska DNA, dokler lahko izraža gen CRD encima v primernem gostiteljskem mikrobu. Primeri takih vektorskih DNA vključujejo nek plazmidni vektor, fagni vektor in kozmidni vektor. Lahko se uporablja shuttle vektor, ki omogoča izmenjavo genov med različnimi gostiteljskimi sevi. Taka
-14vektorska DNA ima lahko kontrolni element, kot na primer nek promotor (npr. lacUV5 promotor, trp promotor, tre pr orno tor, tac promotor, lpp promotor, tufB promotor, recA promotor in pL promotor) in nek k temu operativno vezan element ojačanja.
Prednostno se lahko uporablja, na primer pUCNT (W094/03613) in podobno. Plazmid pUCNT je prednosten, ker ima mesta za vstavljanje, kot na primer Ndel in EcoRI za (v angl. orig.: dotmstream) lac promotorjem.
(Konstrukcija rekombinantnega plazmida, ki vsebuje tako gen CRD encima in gen encima, ki ima sposobnost regeneriranja koencima, od katerega je CRD encim odvisen)
Kot encim, ki ima sposobnost regeneriranja koencima, se lahko uporablja hidrogenaza, format dehidrogenaza, alkohol dehidrogenaza, aldehid hidrogenaza, glukoza-6-fosfat dehidrogenaza, glukoza dehidrogenaza in podobno. Prednostno se uporablja glukoza dehidrogenaza. Bolj specifično se uporablja neka iz Bacillus megateriuza dobljena glukoza dehidrogenaza (za tem okrajšano kot GDH).
Plazmid pGDA2 (J. Biol. Chem. (1989), 264, 6381) vsebuje iz Bacillus zoegaterium dobljen gen GDH. Fragment gena GDH se izreže iz tega plazmida in vstavi v plazmid, ki vsebuje gen CRD encima pred (v angl. orig.: upstream) ali za genom CRD encima, da se izdela rekombinantni plazmid, ki ima tako gen CRD encima kot gen GDH.
(Transformacija)
Nastali rekombinantni plazmid, ki ima gen CRD encima ali nek rekombinantni plazmid, ki ima tako gen CRD encima kot gen GDH,
-15se lahko uvede v gostiteljsko celico z običajnim postopkom. Alternativno se lahko rekombinantni plazmid, ki ima gen CRD encima in rekombinatni plazmid, ki ima gen GDH, uvedeta v gostiteljsko celico simultano ali ob različnih časih, da se dobi sev trasformante, transformiran s tema dvema plazmidoma.
Kot taka gostiteljska celica se lahko uporablja neka bakterija, kvasovka, nitasta gliva, rastlinska celica, živalska celica in podobno. Posebno prednostno se uporablja E. coli.
Plazmid, se lahko uvede v gostitelja s postopkom, znanim v stroki, kot na primer s postopkom, ki vključuje stopnjo mešanja gostiteljske celice v kompetentnem stanju in rekombinantnega plazmida in s postopkom, ki vključuje stopnjo transfekcije plazmida z uporabo plazmida pomagalca s konjugacijsko transmisijo.
Plazmid, uveden v gostitelja, se lahko avtomatsko replicira kot nek episom. Alternativno se lahko vgradi ves ali del plazmida v nek kromosom in replicira skupaj s kromosomom.
Aktivnost GDH transformirane celice se lahko določi z merjenjem povečanja v absorpciji pri 340 nm pri 25 °C za 1 M pufer trisklorovodikove kisline (pH 8,0) z 0,1 M glukozo kot substratom, 2 mM NADP kot koencimom in k temu dodanim encimom.
(Pridobivanje optično aktivnega alkohola)
Optično aktiven ester 4-halo-3-hidroksi maslene kisline, ki je en tip optično aktivnega alkohola, se pridobi, na primer na naslednji način.
Kot substrat se lahko uporablja 4-halo acetocetni ester,
-16predstavljen s splošno formulo:
O
R
COOR '3
R, (v čemer je Rj nek halogen, R2 je vodik, R3 pa je neka substituirana ali nesubstituirana alkilna skupina ali arilna skupina). Če je R3 neka alkilna skupina, je, na primer metilna skupina, etilna skupina, propilna skupina, butilna skupina, izopropilna skupina ali podobno. Če je R3 neka arilna skupina, je, na primer fenilna skupina, tolilna skupina ali podobno. Če je R3 neka substituirana arilna skupina, je, na primer neka fluorofenilna skupina, klorofenilna skupina ali podobno.
Prednostno je Rj klor ali brom, R3 pa je neka alkilna skupina, ki ima 1 do 4 ogljike. Bolj prednostno je substrat metil 4kloroacetoacetat, etil 4-kloroacetoacetat, metil 4bromoacetoacetat ali etil-4-bromoacetoacetat. Alternativno se kot substrat lahko uporabljajo etil 4-jodoacetoacetat, etil 4hidroksiacetoacetat, etil 2-kloro-3-oksobutirat, etil 2-metil-3oksobutirat, etil 4-azidacetoacetat in podobno.
Zgornji 4-halo acetocetni ester se lahko pripravi s postopkom, opisanim, na primer, v Japonski javni objavi št. 61-146191. Na primer, 4-halo acetocetni ester se lahko pripravi s postopkom, kjer se uporablja kot izhodni material diketen in reagira z nekim halogenom, da se dobi 4-halo acetoacetat halid, ki potem reagira z alkoholom. Alternativno se lahko 4-halo acetocetni ester pripravi s postopkom, kjer se kot izhodni material uporablja acetocetni ester in se kvaternarna pozicija od tega halogenira direktno.
4-halo acetocetni ester kot substrat se doda v primerno topilo
-17skupaj z NADPH kot koencimom in neko kulturo mikroba transformante ali njegovega obdelanega proizvoda in podobnega in se meša, medtem ko se uravnava pH. Ta reakcija se izvaja pri pH 4 do 10, pri temperaturi od 10 °C do 70 °C. Čeprav pripravljena koncentracija substrata variira med 0,1 % in 90 % (m/v), se substrat lahko dodaja kontinuirano. Reakcija se izvaja na šaržni način ali kontinuiran način.
Obdelani produkt mikroba in podobno, omenjeno zgoraj, se nanaša na surov ekstrakt, gojena mikrobna telesa, liofiliziran organizem, z acetonom sušen organizem, na homogenate takih mikrobnih teles in podobno. Taki obdelani proizvodi in podobno se lahko uporabljajo v stanju, ko so imobilizirani tako, kot so, to je, kot encimi ali mikrobna telesa, po znanem načinu. Imobilizacija se lahko izvaja s postopkom, znanim strokovnjakom (npr. postopek navzkrižnega vezanja, postopek fizikalne absorpcije in postopek ujetja v past).
Pri reakciji se količina dragega koencima, uporabljenega pri reakciji, lahko precej zmanjša z uporabo splošnega sistema za regeneracijo NADPH v kombinaciji. Lahko se uporablja, na primer nek postopek, ki uporablja GDH in glukozo, ki sta tipična sistema za regeneracijo NADPH. Reakcijski pogoji so, kot sledi, čeprav so odvisni od encima, mikroba ali njegovega obdelanega proizvoda, koncentracije substrata in podobnega, ki naj bi se uporabljali: koncentracija substrata variira med okoli 0,1 in 90 mas. %, reakcijska temperatura je 10 °C do 50 °C, pH je 5 do 8 in reakcijski čas je 1 do 36 ur.
Zgornja reakcija se lahko izvaja z uporabo kulture transformiranega mikroba ali njegovega obdelanega proizvoda, dobljenega z vstavljanjem tako gena CRD encima kot gena encima (npr. GDH), ki ima sposobnost regeneriranja koencima, od
-18katerega je CRD encim odvisen, v gostiteljski mikrob. V tem primeru ni potrebna dodatna priprava vira encima, zahtevanega za regeneracijo koencima in se ester (S)-4-halo-3-hidroksi maslene kisline lahko proizvede pri nižji ceni.
Z reakcijo proizveden ester 4-halo-3-hidroksi maslene kisline se lahko prečisti z nekim običajnim postopkom. Ester 4-halo-3hidroksi maslene kisline se, na primer, podvrže centrifugiranju, filtriranju in drugim obdelovanjem, kot je zahtevano v primeru, kjer se mikrob uporablja, da se odstranijo suspendirajoče substance, kot na primer mikrobna telesa. Nastali proizvod se podvrže ekstrakciji z organskim topilom, kot na primer etil acetatom in toluenom in dehidrira z dehidrantom, kot na primer z natrijevim sulfatom. Organsko topilo se odstrani ob znižanju tlaka. Nastali proizvod se potem podvrže izparevanju z znižanjem tlaka, kromatografiji (npr. kolonski kromatografiji s silikagelom) in podobnemu, da se prečisti.
Kvantifikacija estra 4-halo-3-hidroksi maslene kisline se lahko izvede s plinsko kromatografijo. Kvantifikacija etil 4-kloro-3hidroksibutirata se, na primer, lahko izvaja s kromatografijo z uporabo steklene kolone (ID 3 mm ac 1 m) , napolnjene s PEG-20M Chromosorb WAWDMCS 10 % 80/100 mesh (izdelano pri GL Science CO., Ltd) pri 150 °C in z detekcijo s FID.
Optična čistost etil (S) -4-halo-3-hidroksibutirata se lahko meri s HPLC z uporabo optične izolacijske kolone CHIRALCEL OB (ki jo izdeluje Daicel Chemical Industries, Co., Ltd.).
Potemtakem, kot je opisano zgoraj, omogoča predloženi izum masovno proizvodnjo CRD encima. Nadalje je z uporabo tega encima zagotovljen učinkovit postopek za proizvodnjo optično aktivnega alkohola, kot na primer estra (S)-4-halo-3-hidroksi maslene
-19kisline.
Spodaj bo predloženi izum podrobno opisan s pomočjo ilustrativnih, vendar ne restriktivnih primerov.
Detajli postopka manipulacije, ki se nanašajo na tehniko rekombinacijske DNA, uporabljene v primerih, so opisani v naslednjih tekstih.
(I) Molecular Cloning, 2. izdaja (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) (II) Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing Associates and Wiley Interscience) (Primer 1: Prečiščenje CRD encima)
CRD encim s sposobnostjo reduciranja 4-halo acetocetnega estra asimetrično iz Candida magnoliae IFO 0705, da se izdela ester (S)-4-halo-3-hidroksi maslene kisline, smo prečistili na naslednji način, tako da se je elektroforetsko premikal kot enojen trak.
Pripravili smo tekoč medij, 8000 ml, z naslednjo sestavo in 400 ml porcijo dispenzirali v 2000 ml Sakaguchi stekleničke ter sterilizirali s paro pri 120 °C v teku 20 minut.
Sestava medija:
Glukoza 5 % polipepton 0,5 %
KH2PO4 0,2%
K2HPO4 0,1%
-20MgSO4 · 7H2O vodovodna voda pH 6,5
0,02 %
Zgornji medij smo inokulirali s kulturo Candida magnoliae IFO 0705, ki je bila predhodno gojena v mediju, s 5 ml/stekleničko in gojili v teku treh dni pri 30 °C z agitacijo. Mikrobna telesa smo zbrali iz nastale kulture s centrifugiranjem in potem dvakrat prečistili s solno raztopino, da smo s tem dobili 230 g mokrih mikrobnih teles. Izmed mokrih mikrobnih teles smo suspendirali 180 g v 360 ml 50 mM fosfatnega puferja (pH 7,0) in potem mikrobna telesa razbili z Dyno mill-om (ki ga proizvaja Dyno-Mill) . Razbita mikrobna telesa smo centrifugirali, da smo odstranili ostanke celic in tako dobili 760 ml ekstrakta brez celic. Dodali smo amonijev sulfat in raztopili v ekstraktu brez celic, tako da smo dobili 40 % nasičenje. Nastale precipitate smo odstranili s centrifugiranjem in supernatant dializirali z 10 mM fosfatnim pufer jem (pH 7,0) , ki je vseboval 0,1 mM DTT. Nastali proizvod smo dali v kolono (500 ml) z DEAE Sephacel (izdelano pri Pharmacia Biotech), ki smo jo ekvilibrirali z istim puferjem in kolono izprali z istim puferjem. Aktivne frakcije smo zbrali iz eluirane raztopine, ki je šla skozi kolono in k zbranim aktivnim frakcijam dodali NaCl, tako da smo dobili končno koncentracijo 4 M. Aktivne frakcije smo dali v kolono (200 ml) s Phenyl Sepharose CL-4B (izdelano pri Pharmacia Biotech) , ki smo jo ekvilibrirali z 10 mM fosfatnim puferjem (pH 7,0) , vsebujočim 4 M NaCl in 0,1 mM DTT, tako da se je adsorbiral encim. Potem ko smo kolono izprali z istim puferjem, smo aktivne frakcije eluirali z uporabo 10 mM fosfatnega puferja (pH 7,0) z linearnim gradientom NaCl (od 4 M do 0 M) in etilen glikola (od 0 % do 50 % (m/v)). Tiste od aktivnih frakcij, ki so bile eluirane v začetku, smo zbrali in dializirali preko noči z 10 mM fosfatnim puferjem (pH 7,0).
-21Nastali dializat smo dali v kolono (1 ml) iz Mono Q HR 5/5 (FPLC sistem, izdelan pri Pharmacia Biotech) , ki smo jo ekvilibrirali z 10 mM fosfatnim puferjem (pH 7,0), vsebujočim 0,1 mM DTT in izprali z istim puferjem. Aktivne frakcije v izpiralni tekočini smo zbrali in koncentrirali na 200 μΐ z ultrafiltracijo. Koncentrat smo dali v kolono (24 ml) iz Superdex 200 HR 10/30 (izdelano pri Pharmacia Biotech), ki smo jo ekvilibrirali z 10 mM fosfatnim pufer jem (pH 7,0) , vsebujočim 0,2 M natrijev klorid in 0,1 mM DTT in eluirali z istim pufer jem. Aktivne frakcije smo zbrali, da smo dobili prečiščen encimski vzorec.
(Primer 2: Meritve lastnosti encima)
Preiskali smo encimatske lastnosti encima, dobljenega v primeru
1.
Aktivnost encima smo določali, v bistvu, z omogočanjem, da so reagirali 3 ml reakcijske raztopine, vsebujoče 0,2 mM etil 4kloroacetoacetat kot substrat, 0,32 mM NADPH kot koencim in 0,1 ml raztopine encima v 200 mM fosfatnem puferju (pH 7,0), pri 30 °C v teku ene minute in z merjenjem zmanjšanja v absorpciji pri 340 nm.
(1) Učinkovanje: Encim je deloval na etil 4-kloroacetoacetat z NADPH kot koencimom, da smo izdelali etil (S)-4hidroksibutirat, ki ima optično čistost 99 % e.e. (e.e. = enantiomeric excess = prebitek enantiomera - op. prev.) ali več.
(2) Specifičnost substrata: Encim v smislu predloženega izuma je reagiral z uporabo različnih karbonilnih spojin, prikazanih v Tabeli 1 spodaj, kot substratom pod istimi pogoji, kot so oni, ki so bili uporabljeni za etil 4-kloroacetoacetat. Kot izsledek je encim pokazal specifičnost substrata, kot je prikazano v
-22Tabeli 1.
Tabela 1
Substrat 0,2 mM Relativna aktivnost (%)
etil 4-kloroacetoacetat 100
etil acetoacetat 0
p-nitrobenzaldehid 0
o-nitrobenzaldehid 0
m-nitrobenzaldehid 0
p-klorobenzaldehid 0
o-klorobenzaldehid 0
m-klorobenzaldehid 0
nikotinaldehid 0
izonikotinaldehid 0
benzaldehid 0
glioksal 0
metil glioksal 0
diacetil 19
kloroacetoaldehid 0
kafra kinon 0
etil 2-kloroacetoacetat 95
metil 4-kloroacetoacetat 11
metil 2-kloroacetoacetat 11
oktil 4-kloroacetoacetat 36
(3) Optimalen pH: aktivnost encima smo merili v območju od pH 5,0 do 8,5 z uporabo fosfatnega puferja ali puferja trisklorovodikova kislina. Kot izsledek je bil optimalen pH za učinkovanje encima na etil (S) -4-kloro-3-hidroksibutirat 5,5 do 6,5.
(4) Optimalna temperatura učinkovanja: Aktivnost encima v smislu predloženega izuma smo merili z uporabo etil 4-23kloroacetocetata kot substrata v teku ene minute v temperaturnem območju od 20 °C do 60 °C, da smo dobili optimalno temperaturo. Kot izsledek je optimalna temperatura bila 50 °C do 55 °C.
(5) Toplotna stabilnost: Potem ko smo encim v smislu predloženega izuma obdelovali pri pH 7,0 pri 40 °C v teku 30 minut, smo izmerili aktivnost encima z uporabo etil 4kloroacetocetata kot substrata. Kot izsledek je aktivnost ostala 90 % od one pred obdelovanjem.
(6) Inhibitor: V zgornjo reakcijsko raztopino smo dodali različne kovinske ione in inhibitorje s poedinimi koncentracijami, prikazanimi v Tabeli 2 spodaj, da smo izmerili aktivnost etil (S) -4-kloro-3-hidroksibutirata z uporabo etil 4kloroacetocetata kot substrata. Kot izsledek je bil encim v smislu predloženega izuma inhibiran s kvercetinom in živosrebrovimi ioni, kot je prikazano v Tabeli 2.
Tabela 2
Spojina Koncentracija dodatka (mM) Relativna aktivnost (%)
nedodano 100
kvercetin 0,01 84
0,1 0
difenil hidantoin 1 84
dikumarol 0,1 97
2,4-dinitrofenol 0,1 86
DTNB 0,05 100
jodocetna kislina 1 100
NEM 1 105
PMSF 1 93
p-CMB 1 88
EDTA 1 95
fenilhidrazin 1 97
SnCl2 1 77
PbCl2 1 86
CdCl2 1 91
CuSO4 1 85
C0CJL2 1 89
MgCl2 1 83
ZnSO4 1 97
HgCl2 0,1 49
(7) Molekulska masa
Molekulsko maso encima smo merili z uporabo kolone TSK-G3000SW in 0,1 M fosfatnega pufer ja (pH 7,0), ki je vseboval 0,1 M Na2SO4 in 0,05 % NaN3, kot eluenta in ugotovili, da je okoli 76.000. Molekulsko maso podenote encima smo določili s tem, da smo ga podvrgli elektroforezi z 10 % SDS-poliakrilamidnim gelom ob prisotnosti 2 v/v % 2-merkaptoetanola in jo izračunali iz relativne mobilnosti standardnega proteina. Kot izsledek smo določili, da je molekulska masa podenote encima okoli 32.000.
(8) Odpornost na organska topila: Ekvivalentno količino etil acetata ali butil acetata smo dodali v fosfatni pufer (pH 7,0) , ki je vseboval notri raztopljen encim v smislu predloženega izuma, stresali pri 28 °C v teku 30 minut in potem centrifugirali. Rezidualno aktivnost encima v vodni fazi smo merili z uporabo etil 4-kloroacetocetata kot substrata. Kot izsledek je ostala aktivnost 72 % v primeru dodatka etil acetata in aktivnost 85 % v primeru dodatka butil acetata.
-25(Primer 3: Izdelava etil (S)-4-kloro-3-hidroksibutirata z uporabo encima v smislu predloženega izuma)
100 mM fosfatni pufer (pH 6,5) , 25 ml, ki je vseboval 50 enot prečiščenega encima v smislu predloženega izuma, 250 mg etil 4-kloroacetoacetata, 1,56 mg NADP, 280 mg glukoze in 60 enot glukoza dehidrogenaze (ki jo izdeluje Amano Pharmaceutical Co., Ltd.) smo mešali pri 30 °C v teku 24 ur. Po reakciji smo reakcijsko raztopino podvrgli ekstrakciji z etil acetatom in ekstrakt po odstranitvi topila analizirali. Kot izsledek smo ugotovili, da je bil etil (S)-4-kloro-3-hidroksibutirat z optično čistostjo 99 % e.e. ali več izdelan pri izkoristku 98 %.
Optično čistost etil (S)-4-kloro-3-hidroksibutirata smo izmerili s HPLC z uporabo optične izolacijske kolone, CHIRALCEL OB (ki jo izdeluje Daicel Chemical Industries, Co., Ltd.). To kromatografijo smo izvajali z uporabo mešanega topila iz heksana/izopropanola 9/1 kot mobilne faze pri hitrosti pretoka mobilne faze 0,8 ml/min. Detekcijo smo izvajali z merjenjem absorpcije na 215 nm.
Kvantifikacijo etil (S)-4-kloro-3-hidroksibutirata smo izvajali s plinsko kromatogafijo pri 150 °C z uporabo steklene kolone (ID 3 mm x 1 m) , napolnjene s PEG-20M Chromosorb WAW DMCS 10 % 80/100 mesh (izdelane pri GL Science Co., Ltd.) in detektirali s FID.
(Primer 4: Izdelava etil (S)-4-bromo-3-hidroksibutirata z uporabo encima v smislu predloženega izuma)
100 mM fosfatni pufer (pH 6,5) , 2,5 ml, vsebujoč 5 enot prečiščenega encima v smislu predloženega izuma, 25 mg etil
-264-bromoacetoacetatata, 0,16 mg NADP, 28 mg glukoze in 6 enot glukoza dehidrogenaze (ki jo izdeluje Amano Pharmaceutical Co., Ltd.) smo mešali pri 30 °C v teku 24 ur. Po reakciji smo reakcijsko raztopino podvrgli ekstrakciji z etil acetatom in ekstrakt po odstranitvi topila analizirali. Kot izsledek smo ugotovili, da je bil etil (S)-4-bromo-3-hidroksibutirat izdelan pri izkoristku 43 %. Kvantifikacijo etil 4-bromo-3-hidroksibutirata smo izvedli na v bistvu enak način, kot ono za etil 4-kloro-3-hidroksibutirat v Primeru 2.
(Primer 5: Izdelava metil (S)-4-kloro-3-hidroksibutirata z uporabo encima v smislu predloženega izuma)
Butil acetat, 2,5 ml, smo dodali v 2,5 ml 100 mM fosfatnega puferja (pH 6,5), vsebujočega 5 enot prečiščenega encima v smislu predloženega izuma, 25 mg metil 4-kloroacetoacetata, 0,16 mg NADP, 28 mg glukoze in 6 enot glukoza dehidrogenaze (ki jo izdeluje Amano Pharmaceutical Co., Ltd.) in mešali pri 30 °C v teku 24 ur. Po reakciji smo reakcijsko raztopino podvrgli ekstrakciji z etil acetatom in ekstrakt analizirali po odstranitvi topila. Kot izsledek smo ugotovili, da je bil metil (S)-4-kloro-3-hidroksibutirat izdelan pri izkoristku 58 %. Kvantifikacijo 4-kloro-3-hidroksi metil butirata smo izvajali v bistvu na isti način, kot ono za etil 4-kloro-3-hidroksibutirat v Primeru 2.
(Primer 6: Izdelava etil (S)-4-kloro-3-hidroksibutirata z uporabo encima v smislu predloženega izuma: Kontinuirano dodajanje substrata)
Etil 4-kloroacetoacetat, 3,8 g, smo kontinuirano dodajali v 50 ml 100 mM fosfatnega pufer ja (pH 6,5) , vsebujočega 100 enot prečiščenega encima v smislu predloženega izuma, 1,56 mg NADP,
-π4,5 g glukoze, 250 enot glukoza dehidrogenaze (ki jo izdeluje Amano Pharmaceutical Co., Ltd.) in 0,24 g NaCl, pri hitrosti 0,23 g na uro in mešali pri 30 °C v teku 20 ur, medtem ko smo uravnavali pH z uporabo natrijevega hidroksida. Po reakciji smo reakcijsko raztopino podvrgli ekstrakciji z etil acetatom in ekstrakt po odstranitvi topila analizirali. Kot izsledek smo ugotovili, da je etil (S)-4-kloro-3-hidroksibutirat z optično čistostjo 100 % e.e. bil izdelan z izkoristkom 91 %.
Kvantifikacijo in merjenje optične čistosti etil 4-kloro-3-hidroksibutirata smo izvajali v bistvu na isti način, kot ono v Primeru 2.
(Primer 7: Kloniranje gena CRD encima) (Ustvarjanje knjižnice kromosomske DNA)
Kromosomsko DNA smo ekstrahirali iz kultiviranega mikrobnega telesa Candida magnoliae IFO 0705 v skladu s postopkom, ki ga je opisal Hereford (Celi, 18, 1261 (1979)). Nastalo kromosomsko DNA smo deloma razgradili s Sau3AI in fragment DNA z velikostjo 23 kb do 20 kb nastalega produkta razgradnje vstavili v mesto BamHI iz fagnega vektorja EMBL3, (ki ga izdeluje Stratagene). Nastali rekombinantni fagni vektor smo in vitro pakirali z uporabo Gigapack II Gold (ki ga izdeluje Stratagene) in potem pustili, da se je E. coli NM415 s tem inficirala, da smo ustvarili knjižnico kromosomske DNA, sestavljeno iz okoli 20.000 DNA.
(Priprava sintetične oligonukleotidne sonde)
Prečiščeni CRD encim, dobljen, kot je opisano v Primeru 1, smo denaturirali ob prisotnosti 8 M sečnine in potem razgradili z lizil endopeptidazo, dobljeno z Achramobacter-jem (izdelano pri Wako Pure Chemical Industries, Ltd). Aminokislinsko zaporedje
-28nastalega peptičnega fragmenta smo določili z Edmanovim postopkom.
Na osnovi nastalega aminokislinskega zaporedja smo sintetizirali DNA-sonde z naslednjim zaporedjem.
Sonda 1: 5'-GCNCAYACNAARAAYGA-3' (SEQ ID NO:3)
Sonda 2: 5'-AAYGTNGARTAYCCNGC-3' (SEQ ID NO:4)
Sonda 3: 5'-CTRGTYCTRCTRCTRTT-3' (SEQ ID NO:5)
Sonde 1, 2, in 3 smo označili z 32P z uporabo Megalabel (izdelano pri Takara Shuzo Co., Ltd.) in označene sonde uporabili v naslednjih eksperimentih.
(Kloniranje gena CRD encima iz knjižnice kromosomske DNA)
Knjižnico kromosomske DNA, kreirano, kot je opisano zgoraj, smo preiskali za plake fagov, ki vključujejo gen CRD encima, s postopkom hibridizacije plakov (Science, 196, 180 (1977)), z uporabo z 32P označenih sintetičnih DNA-sond. Kot izsledek smo dobili en pozitiven plak. Potem smo rekombinantno fagno DNA, dobljeno iz pozitivnega plaka, dvakratno razgradili z EcoRI in Hindlll in nastalo DNA analizirali z metodo Southern blotting (J. Mol. Biol., 98, 53 (1975)). Kot izsledek smo ugotovili, da je razgrajeni fragment z okoli 1,3 kb, proizveden z dvakratno razgradnjo z EcoRI in Hindlll, bil hibridiziran z zgornjimi sintetičnimi DNA-sondami. Na osnovi tega dejstva smo fragment DNA z okoli 1,3 kb vstavili v mesto EcoRI-Hindlll plazmida pUC19 (ki ga izdeluje Takara Shuzo Co., Ltd.), da smo sestavili rekombinantni plazmid pUC-HE in izbrali kot klon kromosomske DNA, ki vključuje gen CRD encima. Ta plazmid smo imenovali pUC-HE.
-29(Določitev zaporedja baz)
Z zgornjim rekombinantnim plazmidom pUC-HE je reagirala množica restrikcijskih encimov in med reakcijo izdelane razgrajene fragmente smo analizirali, da bi izdelali mapo cepitve restrikcijskega encima. Potem smo različne fragmente DNA, dobljene med analizo, vstavili v mesta za multi-kloniranje plazmida pUC19, da smo dobili rekombinantne plazmide. Z uporabo teh rekombinantnih plazmidov smo analizirali zaporedja baz poedinih vstavljenih fragmentov z uporabo kompleta ABI PRISM Dye Terminator Cycle Seguencing Ready Reaction Kit (izdelanega pri Perkin Elmer) in ABI 373A DNA Seguencer (izdelanega pri Applied Biosystems). Kot izsledek smo določili celotno zaporedje baz fragmenta DNA z okoli 1,3 kb, za katerega smo pričakovali, da vključuje gen CRD encima. Slika 1 prikazuje na ta način določeno zaporedje baz. Aminokislinsko zaporedje, določeno iz zaporedja baz za del strukturnega gena zaporedja baz, je tudi prikazano pod ustreznim zaporedjem baz na Sliki 1. Aminokislinsko zaporedje smo primerjali z delnim aminokislinskim zaporedjem z lizil endopeptidazo razgrajenega peptidnega fragmenta prečiščenega CRD encima. Kot izsledek smo ugotovili, da delno aminokislinsko zaporedje prečiščenega CRD encima obstaja v aminokislinskem zaporedju, določenem iz zaporedja baz in se popolnoma ujema s tem (pokazano kot podčrtani del v zaporedju amino kislin na Sliki 1) , razen da nima metionina na N terminalu. Smatramo, da se metionin na N terminalu odstrani z modifikacijo po sintezi proteina.
(Primer 8: Konstrukcija rekombinantnega plazmida, ki vsebuje gen CRD encima)
Da bi CRD encim izrazili v E. coli, smo konstruirali rekombinantni plazmid, uporabljen za transformacijo. Najprej smo
-30dobili dvo jno-verižno DNA z mestom Ndel, dodanim v del iniciacijskega kodona strukturnega gena CRD encima, in z mestom EcoRI, dodanim takoj za terminacijskim kodonom od tega, na naslednji način. Sintetizirali smo N-terminalni DNA primer z mestom Ndel, dodanim v del iniciacijskega kodona strukturnega gena CRD encima in C-terminalni DNA primer z mestom EcoRI, dodanim takoj za terminacijskim kodonom strukturnega gena CRD encima. Zaporedji baz teh dveh primerjev sta, kot sledi:
N-terminalni DNA primer
5'-TAGTCGTTAACCATATGGCTAAGAACTTCTCCAAC-3' (SEQ ID NO: 6)
C-terminalni DNA primer ’ -TCTGAGTTAACGAATTCTTAGGGAAGCGTGTAGCCACCGT-3' (SEQ ID NO: 7)
Z uporabo zgornjih dveh sintetičnih DNA primerjev smo sintetizirali dvojno-verižno DNA z uporabo plazmida pUC-HE, dobljenega v Primeru 7, kot matrice. Nastali fragment DNA smo razgradili z Ndel in EcoRI in vstavili v mesta Ndel in EcoRI za lac pr omot or jem plazmida pUCNT (WO94/03613) , da smo dobili rekombinantni plazmid pNTSl.
(Primer 9: Izdelava rekombinantnega plazmida, ki vsebuje tako gen CRD encima kakor gen GDH)
Plazmid pGDA2 (J. Biol. Chem. (1989), 264, 6381) smo dvakratno razgradili z EcoRI in Pstl, da smo izolirali nek fragment DNA z okoli 0,9 kb, ki vključuje iz Bacillus megaterium dobljen gen GDH. Ta fragment DNA smo vstavili v mesto EcoRI-Pstl plazmida pSL301 (ki ga izdeluje Invitrogen), da smo konstruirali rekombinantni plazmid pSLG. Rekombinantni plazmid pSLG smo potem
-31dvakratno razgradili z EcoRI in Xhol, da smo izolirali fragment DNA z okoli 0,9 kb, ki vključuje gen GDH, dobljen iz Sacillus megaterium. Ta fragment DNA smo vstavili v mesto EcoRI-Sall (locirano za CRD genom) od PNTSl, konstruiranega v Primeru 8, da smo dobili rekombinantni plazmid pNTSIG. Postopek konstrukcije in struktura PNTSIG sta predstavljena na Sliki 2.
(Primer 10: Konstrukcija rekombinantne E. coli)
E. coli HB101 (ki jo izdeluje Takara Shuzo Co., Ltd.) smo transformirali z uporabo rekombinantnega plazmida pNTSl, dobljenega v Primeru 8 in rekombinantnega plazmida pNTSIG, dobljenega v Primeru 9, da smo dobili rekombinantno E. coli HB101(pNTSl) in HB101(pNTSIG), poedino. Tako dobljeni transf ormanti, JE. coli HB101 (pNTSl) in HB101(pNTSIG) smo deponirali pri Ministry of International Trade and Industry, Agency of Industrial Science and Technology, National Institute of Bioscience and Human Technology, pod poedinima številkama depozita FERM BP-5834 oziroma FERM BP-5835, 24. februarja 1997.
Dalje smo, kot v Primeru 9, plazmid pGDA2 (J. Biol. Chem.
(1989), 264, 6381) dvakratno razgradili z EcoRI in Pstl, da smo izolirali fragment DNA z okoli 0,9 kb, ki vključuje iz Bacillus megaterium dobljen gen GDH. Ta fragment DNA smo vstavili v mesto EcoRI-Pstl plazmida pSTV28 (ki ga izdeluje Takara Shuzo Co., Ltd.), da smo konstruirali rekombinantni plazmid pSTVG. E. coli HB101(pNTSl), ki smo jo naredili kompetentno vnaprej s postopkom s kalcijevim kloridom, smo transformirali s pSTVG, da smo dobili E. coli HB101(pNTSl, pSTVG).
(Primer 11: Ekspresija CRD encima v rekombinantni E. Coli) (Določitev aktivnosti CRD encima v rekombinantni E. Coli)
-32Rekombinantno E. coli HB101 (pNTSl) , dobljeno v Primeru 10, smo kultivirali v 2 χ YT mediju, ki je vseboval 50 pg/ml ampicilina, zbrali, suspendirali v 100 mM fosfatnem puferju (pH 6,5) in podvrgli ultrazvočnemu obdelovanju, da smo dobili ekstrakt brez celic. Aktivnost CRD encima ekstrakta brez celic smo izmerili na naslednji način. To je, za reakcijo smo 1 mM etil 4-kloroacetoacetat kot substrat, 0,1 mM NADPH kot koencim in encim dodali v 100 mM fosfatni pufer (pH 6,5), zmanjšanje absorpcije pri 340 nm pa smo izmerili pri 30 °C. Pri teh reakcijskih pogojih smo oksidacijo 1 pmola NADPH v NADP v eni minuti definirali kot eno enoto encimske aktivnosti. Tako izmerjeno aktivnost CRD encima v ekstraktu brez celic smo predstavili kot specifično aktivnost in primerjali z ono neke transformante z uporabo samo vektorskega plazmida. Poleg tega smo za primerjavo dobili aktivnost CRD encima v ekstraktu brez celic s Candida magnoliae IFO 0705, pripravljenem v bistvu na isti način, kot je oni, ki je opisan v Primeru 1. Izsledki so prikazani v Tabeli 3 spodaj. E. coli HB101(pNTSl) je pokazala neko izrazito povečanje v aktivnosti CRD encima v primerjavi z E. coli HB101(pUCNT), ki smo jo transformirali z uporabo samo vektorskega plazmida in je pokazala okoli 8,5 krat tako veliko aktivnost, kot je ona od Candida magnoliae IFO 0705.
Tabela 3
Ime seva specifična aktivnost CRD (U/mg)
HB101 (pUCNT) <0,01
HB101 (pNTSl) 16,0
Candida magnoliae IFO 0705 1,89
(Primerjava N-terminalnega zaporedja)
Aminokislinsko zaporedje na N terminalu vsakega od CRD encimov,
-33prečiščenih iz ekstrakta brez celic, dobljenega na v bistvu isti način, kot oni v zgoraj opisanem eksperimentu ekspresije in iz ekstrakta brez celic od Candida magnoliae IFO 0705, smo določili pri 30 ostankih s postopkom po Edmanu. Nastala N-terminalna aminokislinska zaporedja smo primerjali in ugotovili, da se v tem območju popolnoma ujemajo med seboj.
(Primer 12: Simultana ekspresija CRD encima in GDH v rekombinantni E. coli)
Aktivnost GDH ekstrakta brez celic, dobljenega z obdelovanjem rekombinantne E. coli HB101 (pNTSIG) in E. coli HB101(pNTSl, pSTVG) , dobljene v Primeru 10 na način, kot je opisan v Primeru 11, smo izmerili, kot sledi. To je, za reakcijo smo 0,1 M glukozo kot substrat, 2 mM NADP kot koencim in encim dodali v 1 M pufer tris klorovodikove kisline (pH 8,0) in izmerili povečanje absorpcije pri 340 nm pri 25 °C. Pri teh reakcijskih pogojih je bila redukcija 1 pmola NADP v NADPH v eni minuti definirana kot ena enota encimske aktivnosti. Aktivnost CRD encima smo tudi izmerili kot v Primeru 10. Tako izmerjeno aktivnost CRD encima in aktivnost encima GDH v ekstraktu brez celic smo prikazali kot specifične aktivnosti in primerjali s tistimi od E. coli HB101(pNTSl), HB101(pNTSl, pSTVG) in transformante HB101(pUCNT) z uporabo samo vektorja. Izsledki so prikazani v Tabeli 4 spodaj. E. coli HB101(pNTSIG) in HB101(pNTSl, PSTVG) sta pokazali izrazito povečanje v aktivnosti CRD encima in aktivnosti GDH v primerjavi z E. coli HB101(pUCNT), ki je bila transformirana z uporabo samo vektorskega plazmida.
-34Tabela 4
Ime seva Specifična aktivnost Specifična aktivnost
CRD (U/mg) GDH (U/mg)
HB101(pUCNT) <0,01 <0,01
HB101(pNTSl) 16,0 <0,01
HB101(pNTSIG) 8,03 62,6
HB101(pNTSl,pSTVG) 13,5 1,6
(Primer 13: Sinteza estra (S)-4-halo-3-hidroksi maslene kisline iz 4-halo acetocetnega estra z uporabo rekombinantne E. coli z genom CRD encima, uvedenim v to)
Rekombinantno E. coli HB101(pNTSl), dobljeno v Primeru 10, smo inokulirali v 100 ml 2 ac YT medija, steriliziranega v 500 ml Sakaguchi steklenički in gojili z agitacijo pri 37 °C v teku 13 ur. V 50 ml nastale kulture smo dodali GDH (ki jo izdeluje Amano Pharmaceutical Co., Ltd.), 1250 U, 5,5 g glukoze in 1,6 mg NADP. Kulturo smo mešali pri 30 °C, medtem ko je bila uravnana na pH
6,5 z 5 M raztopino natrijevega hidroksida. Medtem ko smo mešali, smo v kulturo dodajali etil 4-kloroacetocetat v 250 mg porcijah vsakih 15 minut. Na ta način smo dodali skupaj 5 g etil 4-kloroacetoacetata in reakcijo izvajali v teku pet ur. Po reakciji smo reakcijsko raztopino podvrgli ekstrakciji z uporabo etil acetata in analizirali ekstrakt po odstranitvi topila. Kot izsledek smo ugotovili, da smo etil (S)-4-kloro-3-hidroksibutirat z optično čistostjo 100 % e.e. izdelali pri izkoristku 90 %.
Kvantifikacijo etil 4-kloro-3-hidroksibutirata smo izvajali s plinsko kromatografijo z uporabo steklene kolone (ID 3 mm x 1 m), napolnjene z PEG-20M Chromosorb WAW DMCS 10 % 80/100 mesh (izdelano pri GL Science Co., Ltd.) pri 150 °C in detektirali
-35s FID.
Optično čistost etil (S)-4-kloro-3-hidroksibutirata smo izmerili s HPLC z uporabo optične izolacijske kolone CHIRALCEL OB (ki jo izdeluje Daicel Chemical Industries, Co., Ltd.). To kromatografijo smo izvajali z uporabo mešanega topila iz heksana/izopropanola 9/1 kot mobilne faze pri hitrosti pretoka mobilne faze 0,8 ml/min. Detekcijo smo izvajali z merjenjem absorpcije na 215 nm.
(Primer 14: Sinteza estra (S)-4-halo-3-hidroksi maslene kisline iz 4-halo acetocetnega estra z uporabo rekombinantne E. coli s CRD encimom in GDH, izraženima istočasno)
Rekombinantno E. coli HB101 (pNTSIG) , dobljeno v Primeru 10, smo inokulirali v 100 ml 2 χ YT medija, steriliziranega v 500 ml Sakaguchi steklenički in gojili z agitacijo pri 37 °C v teku 13 ur. V 50 ml nastale kulture smo dodali glukozo, 5,5 g in 3,2 mg NADP. Kulturo smo mešali pri 30 °C, medtem ko je bila uravnana na pH 6,5 s 5 M raztopino natrijevega hidroksida. Medtem ko smo mešali, smo kulturi dodali etil 4-kloroacetoacetat v 250 mg porcijah vsakih 15 minut. Na ta način smo dodali skupaj 5 g etil 4-kloroacetoacetata in reakcijo izvajali v teku pet ur. Po reakciji smo reakcijsko raztopino podvrgli ekstrakciji z uporabo etil acetata in ekstrakt po odstranitvi topila analizirali. Kot izsledek smo ugotovili, da je bil etil (S)-4-kloro-3-hidroksibutirat z optično čistostjo 100 % e.e. izdelan pri izkoristku 92 %.
Kvantifikacijo in meritev optične čistosti etil 4-kloro-3-hidroksibutirata smo izvajali na v bistvu enak način, kot je oni v Primeru 13.
-36(Primer 15: Sinteza etil (S)-4-kloro-3-hidroksibutirata iz etil 4-kloroacetoacetata z uporabo rekombinantne E. coli s CRD encimom in GDH, izraženima istočasno)
Rekombinantno E. coli HB101 (pNTSIG) , dobljeno v Primeru 10, smo inokulirali v 100 ml 2 χ YT medija, steriliziranega v 500 ml Sakaguchi steklenički in gojili z agitacijo pri 37 °C v teku 13 ur. V 40 ml nastale kulture smo dodali glukozo, 19,2 g in 2,5 mg NADP. Kulturo smo mešali pri 30 °C, medtem ko je bila uravnana na pH 6,5 s 5 M raztopino natrijevega hidroksida. Medtem ko smo mešali, smo v kulturo, pri hitrosti okoli 2 g na uro, kontinuirano dodali skupaj 16,1 g etil 4-kloroacetoacetata. Reakcijo smo izvajali v teku 24 ur. Po reakciji smo reakcijsko raztopino podvrgli ekstrakciji z uporabo etil acetata, topilo smo odstranili ob znižanju tlaka in koncentrat prečistili s kolonsko kromatografijo s silikagelom, da smo dobili 15,6 g etil (S)-kloro-3-hidroksibutirata. Optično čistost etil (S)-4-kloro-3-hidroksibutirata smo analizirali s postopkom s HPLC in ugotovili, da je 100 % e.e. 1H-NMR(CDC13) δ (ppm) :
1,33(3H, t) , 2,65(2H, d), 3,31(1H, d), 3,60(2H, d), 4,2 (3H, m); Kolona: Chiralcel OB (0,46 x 25 cm), izdelana pri Daicel Chemical industries, Co., Ltd.; Temperatura kolone: 0 °C;
Eluent: n-heksan/2-propanol 9/1; Hitrost pretoka: 0,8 ml/min.; Detekcija: 215 nm; Čas eluiranja: 19,2 minut za (S), 17,0 minut za (R).
(Primer 16: Sinteza etil (S) -4-kloro-3-hidroksibutirata iz etil 4-kloroacetoacetata z uporabo rekombinantne E. coli s CRD encimom in GDH, izraženima istočasno)
Rekombinantno E. coli HB101 (pNTSIG) , dobljeno v Primeru 10, smo inokulirali v 100 ml 2 χ YT medija, steriliziranega v 500 ml Sakaguchi steklenički in gojili z agitacijo pri 37 °C v teku 13
-37ur. V 40 ml nastale kulture smo dodali glukozo, 9,6 g. Kulturo smo mešali pri 30 °C, medtem ko je bila uravnana na pH 6,5 s 5 M raztopino natrijevega hidroksida. Medtem ko smo mešali, smo v kulturo kontinuirano dodali skupaj 8,1 g etil 4-kloroacetoacetata pri hitrosti okoli 2 g na uro. Reakcijo smo izvajali v teku skupaj 24 ur. Po reakciji smo reakcijsko raztopino podvrgli ekstrakciji z uporabo etil acetata in po odstranitvi topila analizirali koncentrat. Kot izsledek smo ugotovili, da smo etil (S)-4-kloro-3-hidroksibutirat z optično čistostjo 100 % e.e. izdelali pri izkoristku 96 %.
(Primer 17: Sinteza etil (S) -4-bromo-3-hidroksibutirata iz etil 4-bromoacetoacetata z uporabo rekombinantne E. coli s CRD encimom in GDH, izraženima istočasno)
Rekombinantno E. coli HB101 (pNTSIG) , dobljeno v Primeru 10, smo inokulirali v 100 ml 2 χ YT medija, steriliziranega v 500 ml Sakaguchi steklenički in gojili z agitacijo pri 37 °C v teku 13 ur. V 50 ml nastale kulture smo dodali glukozo, 1,3 g, 3,2 mg NADP in potem 1 g etil 4-bromoacetoacetata. Kulturo smo mešali pri 30°C, medtem ko je bila uravnana na pH 6,5 s 5 M raztopino natrijevega hidroksida, da smo jo pustili reagirati v teku 18 ur. Po reakciji smo reakcijsko raztopino podvrgli ekstrakciji z uporabo etil acetata, topilo smo odstranili ob znižanju tlaka in koncentrat prečistili s kromatografijo s silikagelom, da smo dobili 900 mg etil (S)-4-bromo-3-hidroksibutirata. Optično čistost etil (S) -4-bramo-3-hidroksibutirata smo analizirali, kot sledi in ugotovili, da je 100 % e.e. To je, vzorec smo pretvorili v nek karbamat z uporabo fenil izocianata ob prisotnosti piridina in optično čistost karbamata izmerili s postopkom HPLC. 1H-NMR (CDC13) δ (ppm) : 1,38(3H, t) , 2,75(2H, m), 3,28(IH, br), 3,51 (2H, m), 4,18(3H, q), 4,25(IH, m); Kolona: Chiralcel OJ (0,46 x 25 cm), izdelana pri Daicel Chemical
-38Industries, Co. , Ltd.; Temperatura kolone: 25 °C; Eluent: n-heksan/2-propanol 9/1; Hitrost pretoka: 0,8 ml/min.; Detekcija 254 nm; Čas eluiranja: 24,2 minut za (S), 27,8 minut za (R) .
(Primer 18: Sinteza etil (S)-4-jodo-3-hidroksibutirata iz etil 4-jodoacetoacetata z uporabo rekombinantne E. coli s CRD encimom in GDH, izraženima istočasno)
Rekombinantno E. coli HB101 (pNTSlG) , dobljeno v Primeru 10, smo inokulirali v 100 ml 2 χ YT medija, steriliziranega v 500 ml Sakaguchi steklenički in gojili z agitacijo pri 37 °C v teku 13 ur. V 50 ml nastale kulture smo dodali glukozo, 0,5 g, 3,2 mg NADP in potem 0,5 g etil 4-jodoacetoacetata. Kulturo smo mešali pri 30 °C, medtem ko je bila uravnana na pH 6,5 s 5 M raztopino natrijevega hidroksida, da smo jo pustili reagirati v teku 72 ur. Po reakciji smo reakcijsko raztopino podvrgli ekstrakciji z uporabo etil acetata, topilo smo odstranili ob znižanju tlaka in koncentrat prečistili s kolonsko kromatografijo s silikagelom, da smo dobili 900 mg etil (S)-4-jodo-3-hidroksibutirata. Optično čistost etil (S)-4-jodo-3-hidroksibutirata smo analizirali, kot sledi in ugotovili, da je 91,6 % e.e. To je, vzorec smo segrevali skupaj z natrijevim cianidom v dimetil sulfoksidu, da smo dobili etil 4-ciano-3-hidroksibutirat, ki smo ga potem spremenili v ester benzojske kisline z uporabo benzoil klorida ob prisotnosti piridina. Optično čistost estra benzojske kisline smo izmerili s postopkom HPLC. NMR(CDC13)δ(ppm): 1,28(3H, t), 2,65(2H, d), 3,31(3H, m), 4,00(IH, m), 4,20(2H, q) ; Kolona: Chiralpak AS (0,46 x 25 cm), izdelana pri Daicel Chemical Industries, Co., Ltd.; Temperatura kolone: 25 °C; Eluent: n-heksan/etanol 95/5; Hitrost pretoka: 1 ml/min.; Detekcija: 254 nm; Čas eluiranja: 19,6 minut za (S), 21,3 minut za (R).
-39(Primer 19: Sinteza metil (S)-4-kloro-3-hidroksibutirata iz metil 4-kloroacetoacetata z uporabo rekombinantne E. coli s CRD encimom in GDH, izraženima istočasno)
Rekombinantno E. coli HB101(pNTSIG), dobljeno v Primeru 10, smo inokulirali v 100 ml 2 χ YT medija, steriliziranega v 500 ml Sakaguchi steklenički in gojili z agitacijo pri 37 °C v teku 13 ur. V 50 ml nastale kulture smo dodali glukozo, 7,2 g, 3,2 mg NADP in potem 4 g metil 4-kloroacetoacetata. Kulturo smo mešali pri 30 °C, medtem ko je bila uravnana na pH 6,5 s 5 M raztopino natrijevega hidroksida, da smo jo pustili reagirati v teku 24 ur. Po reakciji smo reakcijsko raztopino podvrgli ekstrakciji z uporabo etil acetata, topilo smo odstranili ob znižanju tlaka in koncentrat prečistili s kolonsko kromatografijo s silikagelom, da smo dobili 3,85 g metil (S)-4-kloro-3-hidroksibutirata. Optično čistost metil (S)-4-kloro-3-hidroksibutirata smo analizirali, kot sledi in ugotovili, da je 100 % e.e. To je, vzorec smo pretvorili v karbamat z uporabo fenil izocianata ob prisotnosti piridina in z merjenjem optične čistosti karbamata s HPLC postopkom. 1H-NMR(CDC13)δ (ppm) : 2,65(2H, m), 3,2O(1H, br) , 3,63(2H, m), 3,73(3H, s), 4,28(IH, m); Kolona: Chiralcel OJ (0,46 x 25 cm), izdelana pri Daicel Chemical Industries, Co., Ltd.; Temperatura kolone: 25 °C; Eluent: n-heksan/2-propanol 8/2; Hitrost pretoka: 1 ml/min.; Detekcija: 254 nm; Čas eluiranja: 19,2 minut za (S), 22,6 minut za (R) .
(Primer 20: Sinteza etil (S)-4-azid-3-hidroksibutirata iz etil 4-azidacetoacetata z uporabo rekombinantne E. coli s CRD encimom in GDH, izraženima istočasno)
Rekombinantno E. coli HB101 (pNTSIG) , dobljeno v Primeru 10, smo inokulirali v 100 ml 2 χ YT medija, steriliziranega v 500 ml
-40Sakaguchi steklenički in gojili z agitacijo pri 37 °C v teku 13 ur. V 50 ml nastale kulture smo dodali glukozo, 3,1 g, 3,2 mg NADP in potem 2 g etil 4-azidacetoacetata. Kulturo smo mešali pri 30 °C, medtem ko je bila uravnana na pH 6,5 s 5 M raztopino natrijevega hidroksida, da smo jo pustili reagirati v teku 72 ur. Po reakciji smo reakcijsko raztopino podvrgli ekstrakciji z uporabo etil acetata, topilo smo odstranili ob znižanju tlaka in koncentrat prečistili s kolonsko kromatografijo s silikagelom, da smo dobili 1,6 g etil (S)-4-azid-3-hidroksibutirata. Optično čistost etil (S)-4-azid-3-hidroksibutirata smo analizirali s postopkom HPLC in ugotovili, da je 90 % e.e. 1H-NMR (CDC13)δ(ppm): 1,25(3H, t) , 2,55(2H, d), 3,30-3,35 (3H, m), 4,20(3H, m); Kolona: Chiralcel OB (0,46 ac 25 cm) , izdelana pri Daicel Chemical Industries, Co., Ltd.; Temperatura kolone: 25 °C; Eluent: n-heksan/2-propanol 9/1; Hitrost pretoka: 1 ml/min.; Detekcija: 254 nm; Čas eluiranja: 16,2 minut za (S), 19,6 minut za (R).
(Primer 21: Sinteza etil (S)-3,4-dihidroksibutirata iz etil 4-hidroksiacetoacetata z uporabo rekombinantne E. coli s CRD encimom in GDH, izraženima istočasno)
Rekombinantno E. coli HB101 (pNTSIG) , dobljeno v Primeru 10, smo inokulirali v 100 ml 2 χ YT medija, steriliziranega v 500 ml Sakaguchi steklenički in gojili z agitacijo pri 37 °C v teku 13 ur. V 50 ml nastale kulture smo dodali glukozo, 7,4 g, 3,2 mg NADP in potem 4 g etil 4-hidroksiacetoacetata. Kulturo smo mešali pri 30 °C, medtem ko je bila uravnana na pH 6,5 s 5 M raztopino natrijevega hidroksida, da smo jo pustili reagirati v teku 18 ur. Po reakciji smo reakcijsko raztopino podvrgli ekstrakciji z uporabo etil acetata, topilo smo odstranili ob znižanju tlaka in koncentrat prečistili s kolonsko kromatografijo s silikagelom, da smo dobili 3,2 g etil
-41(S)-3,4-dihidroksibutirata. Optično čistost etil (S)-3,4-dihidroksibutirata smo analizirali, kot sledi in ugotovili, da je 100 % e.e. Analizo smo izvedli na naslednji način. Vzorec je reagiral z natrijevim cianidom v etanolu pri sobni temperaturi, da smo dobili 4-ciano-3-hidroksi etil butirat, ki smo ga potem spremenili v ester benzojske kisline z uporabo benzoil klorida ob prisotnosti piridina. Optično čistost estra benzojske kisline smo merili s postopkom HPLC. 1H-NMR (CDC13)δ(ppm): 1,30(3H, t), 2,55(2H, m), 3,18(IH, br), 3,55(1H, d), 3,68(1H, d), 4,15(1H, s), 4,20(2H, q) ; Kolona: Chiralpak AS (0,46 x 25 cm), izdelana pri Daicel Chemical Industries, Co., Ltd.; Temperatura kolone: 25 °C; Eluent: n-heksan/etanol 95/5; Hitrost pretoka: 1 ml/min.; Detekcija: 254 nm; Čas eluiranja: 19,6 minut za (S), 21,3 minut za (R).
(Primer 22: Sinteza etil 3-hidroksi-2-metilbutirata z redukcijo etil 2-metil-3-oksoacetata z uporabo rekombinantne E. coli s CRD encimom in GDH, izraženima istočasno)
Rekombinantno E. coli HB101 (pNTSIG) , dobljeno v Primeru 10, smo inokulirali v 100 ml 2 χ YT medija, steriliziranega v 500 ml Sakaguchi steklenički in gojili z agitacijo pri 37 °C v teku 13 ur. V 50 ml nastale kulture smo dodali glukozo, 7,5 g, 3,2 mg NADP in potem 4 g etil 2-metil-3-oksocetata. Kulturo smo mešali pri 30 °C, medtem ko je bila uravnana na pH 6,5 s 5 M raztopino natrijevega hidroksida, da smo jo pustili reagirati v teku 18 ur. Po reakciji smo reakcijsko raztopino podvrgli ekstrakciji z uporabo etil acetata, topilo smo odstranili ob znižanju tlaka in koncentrat prečistili s kolonsko kromatografijo s silikagelom, da smo dobili 3,5 g etil 3-hidroksi-2metilbutirata. Optično čistost etil 3-hidroksi-2-metilbutirata smo analizirali, kot sledi in ugotovili, da je 91,6 % e.e. Analizo smo izvedli na naslednji način. Vzorec je reagiral z
-42natrijevim cianidom v demetil sulfoksidu pri sobni temperaturi, da smo dobili etil 4-ciano-3-hidroksibutirat, ki smo ga potem spremenili v ester benzojske kisline z uporabo benzoil klorida ob prisotnosti piridina. Optično čistost estra benzojske kisline smo izmerili s postopkom HPLC. IH-NMR (CDC13)δ(ppm) : 1,17(3H, t) , 1,22(2H, t) , 1,28(3H, t) , 2,46(1H, m), 2,82(1H, br) , 3,9O(1H, m) , 4,18(2H, q) .
(Primer 23: Sinteza etil 2-kloro-3-hidroksibutirata z redukcijo etil 2-kloro-3-oksoacetata z uporabo rekombinantne E. coli s CRD encimom in GDH, izraženima istočasno)
Rekambinantno E. coli HB101 (pNTSIG) , dobljeno v Primeru 10, smo inokulirali v 100 ml 2 χ YT medija, steriliziranega v 500 ml Sakaguchi steklenički in gojili z agitacijo pri 37 °C v teku 13 ur. V 50 ml nastale kulture smo dodali glukozo, 6,5 g, 3,2 mg NADP in potem 4 g etil 2-kloro-3-oksocetata. Kulturo smo mešali pri 30 °C, medtem ko je bila uravnana na pH 6,5 s 5 M raztopino natrijevega hidroksida, da smo jo pustili reagirati v teku 18 ur. Po reakciji smo reakcijsko raztopino podvrgli ekstrakciji z uporabo etil acetata, topilo smo odstranili ob znižanju tlaka in koncentrat prečistili s kolonsko kromatografijo s silikagelom, da smo dobili 3,8 g etil 2-kloro-3hidroksibutirata. 1H-NMR(CDC13) δ (ppm) : 1,35(6H, m), 2,55(1H, br) , 4,15(1H, d), 4,25(1H, m), 4,30(2H, q) .
INDUSTRIJSKA UPORABNOST
Z uporabo novega CRD encima lahko učinkovito proizvajamo optično aktivne alkohole, kot na primer ester (S)-4-halo-3-hidroksi maslene kisline, uporabne kot sintezni intermediati za zdravila in podobno.
-43S kloniranjem gena CRD encima in analiziranjem zaporedja baz od tega lahko dobimo transformanto z visoko sposobnostjo produciranja CRD encima. Dobljena je bila tudi transformanta z visoko sposobnostjo produciranja CRD encima in GDH istočasno.
Z uporabo zgornjih transformant je mogoče bolj učinkovito izvesti sintezo optično aktivnih alkoholov, kot na primer estra (S)-4-halo-3-hidroksi maslene kisline, iz karbonilnih spojin, kot na primer 4-halo acetocetnega estra.
-44SEZNAM ZAPOREDIJ
INFORMACIJA ZA SEQ ID NO:1
DOLŽINA ZAPOREDJA: 283
TIP ZAPOREDJA: amino kisline
MOLEKULSKI TIP: peptid
TOPOLOGIJA: 1inearna
OPIS ZAPOREDJA:
Met Ala Lys Asn 1 Phe 5 Ser Asn Val Glu Tyr Pro Ala Pro Pro Pro Ala
10 15
His Thr Lys Asn Glu Ser Leu Gin Val Leu Asp Leu Phe Lys Leu Asn
20 25 30
GIy Lys Val Ala Ser lle Thr Gly Ser Ser Ser G l y lle G l y Tyr Ala
35 40 45
Leu Ala Glu Ala Phe Ala Gin Val Gly Ala Asp Val Ala Ile Trp Tyr
50 55 60
Asn Ser His Asp Ala Thr Gly Lys Ala Glu Ala Leu Ala Lys Lys Tyr
65 70 75 80
GIy Val Lys Val Lys Ala Tyr Lys Ala Asn Val Ser Ser Ser Asp Ala
85 90 95
Val Lys Gin Thr Ile Glu Gin Gin Ile Lys Asp Phe Gly His Leu Asp
100 105 110
Ile Val Val Ala Asn Ala Gly lle Pro Trp Thr Lys Gly Ala Tyr Ile
115 120 125
Asp Gin Asp Asp Asp Lys His Phe Asp Gin Val Val Asp Val Asp Leu
130 135 140
Lys Gly Val Gly Tyr Val Ala Lys His Ala Gly Arg His Phe Arg Glu
145 150 155 160
Arg Phe Glu Lys Glu G1 y Lys Ly s Gly Ala Leu Val Phe Thr Ala Ser
165 170 175
Met Ser G1 y His lle Val Asn Val Pro Gin Phe Gin Ala Thr Tyr Asn
180 185 190
Ala Ala Lys Ala Gly Val Arg His Phe Ala Lys Ser Leu Ala Val Glu
195 200 205
Phe Ala Pro Phe Ala Arg Val Asn Ser Val Ser Pro G1 y Tyr I le Asn
210 215 220
Thr Glu I le Ser Asp Phe Val Pro Gin Glu Thr Gin Asn Lys Trp Trp
225 230 235 240
Ser Leu Val Pro Leu Gl y Arg Gly Gly Glu Thr Ala Glu Leu Val GI y
245 250 255
Ala Tyr Leu Phe Leu Ala Ser Asp Ala Gly Ser Tyr Ala Thr Gl y Thr
260 265 270
Asp Ile Ile Val Asp Gly Gly Tyr Thr Leu Pro 275 280
INFORMACIJA ZA SEQ ID NO:2
DOLŽINA ZAPOREDJA: 852
TIP ZAPOREDJA: nukleinska kislina
VERIŽNOST: dvojna
TOPOLOGIJA: linearna
TIP ZAPOREDJA: genomska DNA
OPIS ZAPOREDJA:
ATGGCTAAGA ACTTCTCCAA CGTCGAGTAC CCCGCCCCGC CTCCGGCCCA CACCAAGAAC 60 GAGTCGCTGC AGGTCCTTGA CCTGTTCAAG CTGAATGGCA AGGTTGCCAG CATCACTGGC 120 TCGTCCAGCG GTATTGGCTA CGCTCTGGCT GAGGCCTTCG CGCAGGTCGG CGCTGACGTC 180 GCCATCTGGT ACAACAGCCA CGACGCTACT GGCAAGGCTG AGGCCCTCGC CAAGAAGTAC 240 GGCGTCAAGG TCAAGGCCTA CAAGGCGAAC GTGAGCAGCT CTGACGCCGT GAAGCAGACG 300 ATCGAGCAGC AGATCAAGGA CTTCGGCCAC CTCGACATTG TCGTGGCGAA CGCCGGCATT 360 CCCTGGACGA AGGGTGCCTA CATCGACCAG GACGACGACA AGCACTTCGA CCAGGTCGTT 420 GACGTCGATC TGAAGGGTGT TGGATACGTC GCGAAGCACG CTGGCCGTCA CTTCCGCGAG 480 CGCTTCGAGA AGGAGGGCAA GAAGGGCGCC CTTGTGTTCA CGGCCTCCAT GTCTGGCCAC 540 ATTGTGAACG TGCCCCAGTT CCAGGCCACG TACAACGCGG CCAAGGCTGG CGTGCGCCAC 600 TTCGCGAAGT CGCTGGCCGT CGAGTTCGCG CCGTTCGCGC GCGTGAACTC TGTGTCGCCG 660 GGCTACATCA ACACGGAGAT CTCGGACTTC GTGCCCCAGG AGACGCAGAA CAAGTGGTGG 720 TCGCTCGTGC CCCTTGGCCG CCGCGGAGAG ACGGCCCAGC TCGTTGGCGC CTACCTGTTC 780 CTTGCATCTG ACGCCGGCTC GTACGCCACT GGTACGGACA TCATTGTTGA CGGTGGCTAC 840
-46INFORMACIJA ZA SEQ ID NO:3
DOLŽINA ZAPOREDJA: 17
TIP ZAPOREDJA: nukleotidi
VERIŽNOST: enojna
TOPOLOGIJA: linearna
TIP ZAPOREDJA: sintetična DNA
OPIS ZAPOREDJA:
GCNCAYACNA ARAAYGA
INFORMACIJA ZA SEQ ID NO:4
DOLŽINA ZAPOREDJA: 17
TIP ZAPOREDJA: nukleinska kislina
VERIŽNOST: enoj na
TOPOLOGIJA: linearna
TIP ZAPOREDJA: sintetična DNA
OPIS ZAPOREDJA:
AAYGTNGART AYCCNGC
INFORMACIJA ZA SEQ ID NO:5 DOLŽINA ZAPOREDJA: 17 TIP ZAPOREDJA: nukleinska kislina VERIŽNOST: enojna TOPOLOGIJA: 1inearna
TIP ZAPOREDJA: sintetična DNA
OPIS ZAPOREDJA:
CTRGTYCTRC TRCTRTT
INFORMACIJA ZA SEQ ID NO:6 DOLŽINA ZAPOREDJA: 35 TIP ZAPOREDJA: nukleinska kislina VERIŽNOST: enojna TOPOLOGIJA: linearna
TIP ZAPOREDJA: sintetična DNA
-47OPIS ZAPOREDJA:
TAGTCGTTAA CCATATGGCT AAGAACTTCT CCAAC
INFORMACIJA ZA SEQ ID NO:7
DOLŽINA ZAPOREDJA: 40
TIP ZAPOREDJA: nukleinska kislina
VERIŽNOST: enojna
TOPOLOGIJA: linearna
TIP ZAPOREDJA: sintetična DNA
OPIS ZAPOREDJA:
TCTGAGTTAA CGAATTCTTA GGGAAGCGTG TAGCCACCGT
Za KANEKA CORPORATION

Claims (6)

  1. PATENTNI ZAHTEVKI
    1. Karbonil reduktaza, ki ima fizikalne in kemične lastnosti (D do (4) :
    (1) učinkovanje:
    delovanje na etil 4-kloroacetoacetat z uporabo NADPH kot koencima, da se izdela etil (S)-4-kloro-3-hidroksibutirat;
  2. (2) specifičnost substrata:
    izkazovanje močne aktivnosti na etil 4-kloroacetoacetat, medtem ko v bistvu ni izkazovanja aktivnosti na etil acetoacetat;
  3. (3) optimalen pH: 5,5 do 6,5; in
  4. (4) optimalna temperatura učinkovanja: 50 °C do 55 °C.
    2. Karbonil reduktaza po zahtevku 1, ki ima nadalje fizikalne in kemične lastnosti (5) do (7):
  5. (5) toplotna stabilnost: stabilna je do okoli 40 °C, če se obdeluje pri pH 7,0 v teku 30 minut;
  6. (6) inhibitor: inhibirana je z živosrebrovimi ioni in kvercetinom: in (7) molekulska masa: okoli 76.000 pri analizi z gelsko filtracijo in okoli 32.000 pri analizi z elektroforezo z SDSpoliakrilamidom.
    3. Karbonil reduktaza, ki ima aminokislinsko zaporedje SEQ ID NO:1 iz Seznama zaporedij, ali neko aminokislinsko zaporedje, pri katerem je ena ali več amino kislin odstranjenih, substituiranih ali dodanih v aminokislinsko zaporedje SEQ ID NO:1 iz Seznama zaporedij, ali del aminokislinskih zaporedij in ki ima aktivnost reduciranja etil 4-kloroacetoacetata asimetrično, da se izdela etil (S)-4-kloro-3-hidroksibutirat.
    4.
    Karbonil reduktaza po kateremkoli od zahtevkov 1 do 3, kjer
    -49je encim dobljen iz mikroba, ki spada v rod Candida.
    5. Karbonil reduktaza po kateremkoli od zahtevkov 1 do 3, označena s tem, da je encim dobljen iz Candida magnoliae.
    6. Karbonil reduktaza po kateremkoli od zahtevkov 1 do 3, označena s tem, da je encim dobljen iz Candida magnoliae IFO 0705.
    7. DNA, ki kodira encim po kateremkoli od zahtevkov 1 do 6.
    8. DNA po zahtevku 7, označena s tem, da ima DNA nukleotidno zaporedje SEQ ID NO:2 iz Seznama zaporedij.
    9. Plazmid, ki ima DNA po zahtevku 7 ali 8.
    10. Plazmid po zahtevku 9, označen s tem, da je plazmid pNTSl.
    11. Transformanta, ki je celica, transformirana s plazmidom po zahtevku 9 ali 10.
    12. Transformirana celica po zahtevku 11, označena s tem, da je transformirana celica E. coli.
    13. Transformirana celica po zahtevku 11, označena s tem, da je transformirana celica E. coli HB101(pNTSl).
    14. Postopek izdelave estra (S)-4-halo-3-hidroksi maslene kisline, predstavljenega s splošno formulo:
    OH
    R
    COOR.
    R.
    -50(v čemer Rx označuje nek halogenov atom, R2 označuje vodik, R3 pa označuje substituirano ali nesubstituiran© alkilno skupino ali arilno skupino), pri čemer postopek obsega stopnjo: reagiranje 4-halo acetocetnega estra, predstavljenega s splošno formulo:
    in nekega encima po kateremkoli od zahtevkov 1 do 3 ali kulture mikroba, ki ima sposobnost produciranja encima ali obdelanega produkta kulture.
    15. Postopek po zahtevku 14, označen s tem, da je halogenov atom klor ali brom, R3 pa je alkilna skupina, ki ima 1 do 4 ogljike.
    16. Postopek po zahtevku 15, označen s tem, da je substrat metil 4-kloroacetoacetat, etil 4-kloroacetoacetat, metil 4-bromoacetoacetat ali etil 4-bromoacetoacetat.
    17. Postopek po kateremkoli od zahtevkov 14 do 16, označen s tem, da je mikrob nek mikrob, ki spada v rod Candida.
    18. Postopek po zahtevku 17, označen s tem, da je mikrob Candida magnoliae.
    19. Postopek po zahtevku 18, označen s tem, da je mikrob Candida magnoliae IFO 0705.
    20. Postopek po kateremkoli od zahtevkov 14 do 16, označen s tem, da je mikrob neka transformirana celica po kateremkoli od zahtevkov 11 do 13.
    -5121. Postopek izdelave optično aktivnega estra 3-hidroksi maslene kisline, predstavljenega s splošno formulo:
    coor3 pri čemer postopek obsega stopnje: reagiranje transformante, ki je celica, transformirana s plazmidom, ki ima DNA, kodirajočo encim z aktivnostjo asimetričnega reduciranja estra 3-okso-maslene kisline, predstavljenega s splošno formulo:
    COOR3 da se izdela nek optično aktiven ester 3-hidroksi-maslene kisline, predstavljen s splošno formulo:
    coor3 z estrom fomulo:
    3-okso-maslene kisline, predstavljenim s splošno coor3 in pospravljanje pridelka izdelanega optično aktivnega estra 3-hidroksi maslene kisline, predstavljenega s splošno formulo:
    22. Postopek po zahtevku 21, označen s tem, da sta v splošnih
    -52formulah R-j^ in R2 neodvisno halogen, azid, benzil amino ali vodik, pri čemer je eden od R! in R2 vodik, R3 pa je substituirana ali nesubstituirana alkilna skupina ali arilna skupina, ali sta v splošnih formulah R! in R2 neodvisno alkilna skupina, hidroksidna skupina, ali vodik, pri čemer je eden od R-L in R2 vodik, R3 pa je substituirana ali nesubstituirana alkilna skupina ali arilna skupina.
    23. Postopek po zahtevku 22, označen s tem, formulah R^ hidroksilna skupina, R2 je vodik,
    24. Postopek po zahtevku 22, označen s tem, formulah R! klor, R2 je vodik, R3 pa je etil.
    da je v splošnih R3 pa je etil.
    da je v splošnih
    25. Postopek po kateremkoli od zahtevkov 21 do 24, tem, da je transformirana celica neka transformirana kateremkoli od zahtevkov 11 do 13.
    označen s celica po
    26. Plazmid, ki ima DNA po zahtevku 7 ali 8 in DNA, ki kodira glukoza dehidrogenazo.
    27. Plazmid po zahtevku 26, označen s tem, da je glukoza dehidrogenaza dobljena iz Bacillus mega te ritim.
    28. Plazmid po zahtevku 27, označen s tem, da je plazmid pNTSIG.
    29. Transformanta, ki je celica, transformirana s plazmidom po kateremkoli od zahtevkov 26 do 28.
    30. Transformirana celica po zahtevku 29, označena s tem, da je transformirana celica E. coli.
    -5331. Transformirana celica po zahtevku 30, označena s tem, da je transformirana celica E. coli HB101(pNTSIG).
    32. Postopek izdelave nekega optično aktivnega alkohola, ki obsega stopnje: reagiranje transformante, ki je celica, transformirana s plazmidom, ki ima DNA, kodirajočo encim z aktivnostjo asimetričnega reduciranja karbonilne spojine, da se izdela optično aktiven alkohol in DNA, kodirajočo encim s sposobnostjo regeneriranja koencima, od katerega je odvisen encim, z neko karbonilno spojino; in pospravljanje pridelka izdelanega optično aktivnega alkohola.
    33. Postopek po zahtevku 32, označen s tem, da je encim, ki ima sposobnost regeneriranja koencima, glukoza dehidrogenaza.
    34. Postopek po zahtevku 32, označen s tem, da je transformirana celica neka transformirana celica po kateremkoli od zahtevkov 29 do 31.
    35. Postopek po kateremkoli od zahtevkov 32 do 34, označen s tem, da je karbonilna spojina nek ester 3-okso-maslene kisline, predstavljen s splošno formulo:
    coor3 in nastali optično aktiven alkohol je nek optično aktiven ester 3-hidroksi-maslene kisline, predstavljen s splošno formulo:
    OH
    H2
    36. Postopek po zahtevku 35, označen s tem, da sta v splošnih
    -54formulah R^ in 1½ neodvisno halogen, azid, benzil amino ali vodik, pri čemer je eden od Rx in R2 vodik, R3 pa je neka substituirana ali nesubstituirana alkilna skupina ali arilna skupina, ali sta v splošnih formulah R^ in R2 neodvisno alkilna skupina, hidroksilna skupina, ali vodik, pri čemer je eden od Ri in R2 vodik, R3 pa je substituirana ali nesubstituirana alkilna skupina ali arilna skupina.
    37. Postopek po zahtevku 36, označen s tem, da je R! klor, R2 je vodik, R3 pa je etil.
    38. Transformanta, ki je celica, transformirana s prvim plazmidom, ki ima DNA po zahtevku 7 ali 8 in z drugim plazmidom, ki ima DNA, ki kodira glukoza dehidrogenazo.
    39. Transformirana celica po zahtevku 38, označena s tem, da je prvi plazmid pNTSl, glukoza dehidrogenaza pa je dobljena iz Bacillum megaterium.
    40. Transformirana celica po zahtevku 38 ali 39, označena s tem, da je transformirana celica E. coli.
    41. Postopek izdelave optično aktivnega alkohola, ki obsega stopnje: reagiranje transformante, ki je celica, transformirana s prvim plazmidom, ki ima DNA, kodirajočo encim z aktivnostjo asimetričnega reduciranja karbonilne spojine, da se izdela nek optično aktiven alkohol in z drugim plazmidom, ki ima DNA, kodirajočo encim s sposobnostjo regeneriranja koencima, od katerega je encim odvisen, z neko karbonilno spojino; in pospravljanje pridelka izdelanega optično aktivnega alkohola.
    42. Postopek po zahtevku 41, označen s tem, da je encim, ki ima sposobnost regeneriranja koencima, glukoza dehidrogenaza.
    -5543. Postopek po zahtevku 41, označen s tem, da je transformirana celica neka transformirana celica po kateremkoli od zahtevkov 38 do 40.
    44. Postopek po kateremkoli od zahtevkov 41 do 43, označen s tem, da je karbonilna spojina ester 3-okso-maslene kisline, predstavljen s splošno formulo:
    COOR3 in nastali optično aktiven alkohol je nek optično aktiven ester 3-hidroksi-maslene kisline, predstavljen s splošno formulo:
    COORg
    45. Postopek po zahtevku 44, označen s tem, da sta v splošnih formulah in 1½ neodvisno halogen, azid, benzil amino ali vodik, pri čemer je eden od Rj. in R2 vodik, R3 pa je substituirana ali nesubstituirana alkilna skupina ali arilna skupina, ali sta v splošnih formulah Rj in R2 neodvisno alkilna skupina, hidroksilna skupina ali vodik, pri čemer je eden od R^ in R2 vodik, R3 pa je neka substituirana ali nesubstituirana alkilna skupina ali arilna skupina.
    46. Postopek po zahtevku 45, označen s tem, da je v splošnih formulah Rj klor, R2 je vodik, R3 pa je etil.
SI9720093A 1997-02-07 1997-09-01 Nova karbonil reduktaza, gen, ki omenjeno kodira in postopek za uporabo take reduktaze in gena SI20120A (sl)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2566797 1997-02-07
JP11305297 1997-04-30
PCT/JP1997/003051 WO1998035025A1 (en) 1997-02-07 1997-09-01 Novel carbonyl reductase, gene that encodes the same, and method of utilizing these

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SI20120A true SI20120A (sl) 2000-06-30

Family

ID=26363321

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SI9720093A SI20120A (sl) 1997-02-07 1997-09-01 Nova karbonil reduktaza, gen, ki omenjeno kodira in postopek za uporabo take reduktaze in gena

Country Status (14)

Country Link
US (2) US6218156B1 (sl)
EP (1) EP0967271B1 (sl)
JP (1) JP4012257B2 (sl)
KR (1) KR100506134B1 (sl)
AT (1) ATE280218T1 (sl)
AU (1) AU4032997A (sl)
CA (1) CA2280502A1 (sl)
CZ (1) CZ298236B6 (sl)
DE (1) DE69731317T2 (sl)
ES (1) ES2235246T3 (sl)
IL (2) IL131241A0 (sl)
SI (1) SI20120A (sl)
SK (1) SK105699A3 (sl)
WO (1) WO1998035025A1 (sl)

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6242253B1 (en) * 1997-10-09 2001-06-05 Regents Of The University Of California IkB kinase, subunits thereof, and methods of using same
JP2000189170A (ja) 1998-05-08 2000-07-11 Daicel Chem Ind Ltd 光学活性４―ハロ―３―ヒドロキシ酪酸エステルの製造方法
JP2000175693A (ja) * 1998-12-18 2000-06-27 Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd （ｒ）−２−ヒドロキシ−１−フェノキシプロパン誘導体の製造方法
JP2000236883A (ja) 1998-12-21 2000-09-05 Daicel Chem Ind Ltd 新規なカルボニル還元酵素、該酵素の製造方法、該酵素をコードするｄｎａおよびこれを利用したアルコールの製造方法
JP2002538782A (ja) * 1999-02-19 2002-11-19 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフトング グルコースデヒドロゲナーゼ融合蛋白質及び発現システムにおけるそれらの使用
TWI275645B (en) 2000-02-16 2007-03-11 Daicel Chemical Industries Ltd. (R)-2-octanol dehydrogenases, methods for producing the enzymes, DNA encoding the enzymes, and methods for producing alcohols using the enzymes
WO2002000585A1 (en) * 2000-06-27 2002-01-03 Kaneka Corporation Chlorohydroxyacetone derivative and process for producing optically active chloropropanediol derivative from the same
US6884607B2 (en) * 2000-12-07 2005-04-26 Sumitomo Chemical Company, Limited Process for producing optically active 4-halo-3-hydroxybutanoate
US20040248250A1 (en) * 2001-07-02 2004-12-09 Takahisa Nakai Method for modifying enzyme and oxidoreductive variant
JPWO2003040382A1 (ja) * 2001-11-09 2005-03-03 株式会社カネカ 光学活性クロマン誘導体の製造法および中間体
KR100522133B1 (ko) * 2002-01-26 2005-10-18 한국과학기술연구원 클루이베로마이세스 마르시아누스로부터 분리 및 정제된 카르보닐 환원효소 및 그 제조 방법
AU2003221082B2 (en) * 2002-03-19 2007-06-07 Mitsubishi Chemical Corporation Novel carbonyl reductase, gene encoding it and process for producing optically active alcohols using the same
JP4228605B2 (ja) * 2002-07-02 2009-02-25 住友化学株式会社 改変型還元酵素、その遺伝子及びそれらの利用
JP4228606B2 (ja) * 2002-07-03 2009-02-25 住友化学株式会社 改変型還元酵素、その遺伝子及びそれらの利用
EP1382683B1 (en) * 2002-07-15 2006-02-22 Sumitomo Chemical Company, Limited Process for producing 3-hydroxycyclohexanone
AU2003258187A1 (en) 2002-08-09 2004-02-25 Codexis, Inc. Enzymatic processes for the production of 4-substituted 3-hydroxybutyric acid derivatives
EP1660669A4 (en) 2003-08-11 2008-10-01 Codexis Inc ENZYMATIC PROCEDURES FOR THE PREPARATION OF 4-SUBSTITUTED 3-HYDROXYBUTYLIC ACID DERIVATIVES AND OF VICINAL CYANO, HYDROXY-SUBSTITUTED CARBOXYLIC ACID ESTERS
JP2007502124A (ja) * 2003-08-11 2007-02-08 コデクシス， インコーポレイテッド 改良ケトレダクターゼポリペプチドおよび関連ポリヌクレオチド
JP4757804B2 (ja) 2004-10-27 2011-08-24 株式会社カネカ 新規カルボニル還元酵素、その遺伝子、およびその利用法
JPWO2006129628A1 (ja) 2005-05-31 2009-01-08 株式会社カネカ 光学活性２−置換プロパナール誘導体の製造法
JP2009114065A (ja) * 2006-02-21 2009-05-28 Kaneka Corp （２ｒ，３ｒ）および（２ｓ，３ｓ）−３−フェニルイソセリン誘導体の製造法
US7834190B2 (en) 2006-05-26 2010-11-16 Kaneka Corporation Process for production of optically active-3-amino-2-hydroxypropionic cyclopropylamide derivatives and salts thereof
CN101528917B (zh) 2006-10-02 2015-07-29 科德克希思公司 用于制备立体异构纯的他汀类及其合成中间体的组合物和方法
US8338142B2 (en) 2007-02-19 2012-12-25 Kaneka Corporation Method for producing optically active 3-aminopiperidine or salt thereof
DK2202303T3 (en) 2007-09-26 2017-02-06 Kaneka Corp NEW GLUCOSEDE HYDROGENASE
MY155662A (en) * 2009-06-22 2015-11-13 Sk Biopharmaceuticals Co Ltd Method for preparation of carbamic acid (r)-1-aryl-2-tetrazolyl-ethyl ester
US8404461B2 (en) * 2009-10-15 2013-03-26 SK Biopharmaceutical Co. Ltd. Method for preparation of carbamic acid (R)-1-aryl-2-tetrazolyl-ethyl ester
CN102686558A (zh) 2009-12-25 2012-09-19 株式会社钟化 光学活性3-取代戊二酸单酰胺的制造方法
CN111172124B (zh) * 2020-02-26 2022-07-22 复旦大学 一种羰基还原酶突变体及其在制备(r)-4-氯-3-羟基-丁酸酯中的应用
CN115433721B (zh) * 2022-06-24 2024-01-23 山东理工大学 一种羰基还原酶突变体及其应用

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS61146191A (ja) * 1984-12-20 1986-07-03 Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd （Ｓ）−γ−ハロ−β−ヒドロキシ酪酸エステルの製造法
JP2566960B2 (ja) * 1987-06-08 1996-12-25 電気化学工業株式会社 （Ｒ）−ｒ−置換−β−ハイドロキシ酪酸エステルの製造法
JP3163338B2 (ja) * 1992-05-28 2001-05-08 味の素株式会社 （Ｓ）−γ−ハロゲン化−β−ハイドロキシ酪酸エステルの製造方法
JP3155107B2 (ja) * 1993-01-12 2001-04-09 ダイセル化学工業株式会社 光学活性４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルの製造方法
JPH08336393A (ja) * 1995-04-13 1996-12-24 Mitsubishi Chem Corp 光学活性なγ−置換−β−ヒドロキシ酪酸エステルの製造法

Also Published As

Publication number Publication date
US6218156B1 (en) 2001-04-17
WO1998035025A1 (en) 1998-08-13
ES2235246T3 (es) 2005-07-01
ATE280218T1 (de) 2004-11-15
US6448052B2 (en) 2002-09-10
CA2280502A1 (en) 1998-08-13
IL131241A (en) 2006-12-31
SK105699A3 (en) 2000-06-12
EP0967271A1 (en) 1999-12-29
KR20000070896A (ko) 2000-11-25
KR100506134B1 (ko) 2005-08-08
DE69731317D1 (de) 2004-11-25
IL131241A0 (en) 2001-01-28
AU4032997A (en) 1998-08-26
EP0967271B1 (en) 2004-10-20
CZ276199A3 (cs) 2000-03-15
CZ298236B6 (cs) 2007-08-01
JP4012257B2 (ja) 2007-11-21
DE69731317T2 (de) 2006-02-23
US20020006651A1 (en) 2002-01-17
EP0967271A4 (en) 2002-09-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SI20120A (sl) Nova karbonil reduktaza, gen, ki omenjeno kodira in postopek za uporabo take reduktaze in gena
JPWO1998035025A1 (ja) 新規カルボニル還元酵素、およびこれをコードする遺伝子、ならびにこれらの利用方法
Goetz et al. Continuous production of (R)‐phenylacetylcarbinol in an enzyme‐membrane reactor using a potent mutant of pyruvate decarboxylase from Zymomonas mobilis
US7202069B2 (en) (R)-2-octanol dehydrogenases, methods for producing the enzymes, DNA encoding the enzymes, and methods for producing alcohols using the enzymes
JPWO2001061014A1 (ja) （ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素、該酵素の製造方法、該酵素をコードするｄｎａおよびこれを利用したアルコールの製造方法
CA2479705C (en) Novel carbonyl reductase, gene encoding the same, and process for producing optically active alcohols using the same
Czempinski et al. 4-Dihydromethyltrisporate dehydrogenase from Mucor mucedo, an enzyme of the sexual hormone pathway: purification, and cloning of the corresponding gene
US7582454B2 (en) 5-substituted hydantoin racemase, DNA coding for the racemase, and processes for producing optically active amino acids
JP4205496B2 (ja) 新規カルボニル還元酵素及びこれをコードするｄｎａ、ならびにこれらを利用した光学活性アルコールの製造方法
JP4603171B2 (ja) （ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルの製造に有用な酵素をコードする遺伝子、その取得方法、およびこれを利用した光学活性アルコールの製造方法
MXPA99007259A (en) Novel carbonyl reductase, gene that encodes the same, and method of utilizing these
JPWO2010098505A1 (ja) 新規な光学活性マンデル酸及びその誘導体の製造方法
EP1408107B1 (en) Chlorohydrin and hydroxycarboxylic ester asymmetric hydrolase gene
JP3496640B2 (ja) 酸化還元酵素、同酵素をコードする遺伝子、同酵素遺伝子含有形質転換体および同酵素の製造方法
JP4601049B2 (ja) バチルス・サチルス由来のエポキシドハイドロラーゼを発現する微生物およびそれを用いたエポキシドハイドロラーゼの製造方法
JP3518501B2 (ja) 酸化還元酵素遺伝子、同遺伝子のクローニングおよび同酵素の製造方法
AU2018340299A1 (en) Method for the preparation of chiral alpha haloalkanoic acids

Legal Events

Date Code Title Description
IF Valid on the event date
KO00 Lapse of patent

Effective date: 20060419