SE528775C2 - Behandling och diagnos av insulinresistenta tillstånd - Google Patents

Description

70 15 20 25 30 .. h) f. m., 'I ”d ...gg 4' d? Flera studier på glukostransportsystem som potentiella stäl- len för en sådan postreceptordefekt har visat att både mäng- den och funktionen av den insulinkänsliga glukostransportören (Glut4) är bristfälliga i insulinresistenta tillstànd hos gnagare och människor (Garvey et al., Science 245:6O (1989): Sivitz et al., Nature 340:72 (1989): Berger et al., Nature 340:70 (l989); Kahn et al., J. Clin. Invest. 84:404 (l989); Charron et al., J. Biol. Chem. 265:7994 (l990); Dohm et al., Am. J. Physiol. 260:E459 (l99l); Sinha et al., Diabetes 40: 472 (l99l); Friedman et al., J. Clin. Invest. 89:70l (1992)).

En brist av en normal uppsättning av insulinkänsliga glukos- transportörer skulle teoretiskt kunna göra en individ insu- linresistent (Olefsky et al. i Diabetes Mellitus, ovan).

Emellertid är det så att vissa studier har misslyckats med att visa nedreglering av Glut4 i human NIDDM, särskilt i muskler, (Bell, 865 den huvudsakliga platsen för glukosbortskaffande (l990); Handberg et al., Diabetes 4l:465 Diabetes 40:4l3 (1990): Diabetes 39: (l990); Pederson et al., Diabetologia 33:625 Garvey et al., (1992)).

Bevis från studier in vivo i djurmodeller och kliniska studi- er indikerar att insulinresistens i typ II diabetes kan vara resultat av förändringar i uttryckning och aktivitet av mel- lanprodukter i insulinsignalöverföringsvägen, förändringar i hastigheten för eller insulinstimulerad glukostransport, förändringar i translokationen av GLUT4 till plasmamembranet (Zierath et al., Diabetologia 43:82l-835 (2000)). djurstudier föreslår att insulinsignaleringsdefekter i musk- J. Clin.

Bevis från ler förändrar helkroppsglukoshomeostas 90:1839-1849 (l992); 92:l787-1794 (l993); 1358-1366 (1993): (l993); Heydrich et al.

(Saad et al., Invest. Folli et al., J.

Clin. Invest.

Heydrick et al., J.

J. Clin.

, Am. J.

Invest. 91: 92:2065-2072 268:E604-612 Clin.

Saad et al., Invest.

Physiol. 70 75 20 25 30 92% 77 UW (1995)); insulinsignale- ringskaskaden, inkluderande IR, IRS-1 och PI 3-kinas kan leda och defekter i mellanprodukter i till reducerad glukostransport och reducerad insulinstimule- rad GLUT4-translokation i skelettmuskel från insulinresisten- ta och typ II diabetes-individer. I vissa exempel har man observerat förändrad uttryckning av IRS-1 (Saad et al., 1992, 1993, Clin. (1995)), ovan; Saad et al., 95:2195-2204 47:13-23 (1998)), eller GSK-3 49:263-271 (2000)), fant et al., Endocrinology 141:2773-2778 (Dadke et al., (2000)). ovan; Goodyear et al., J.

Invest. PI 3-kinas (Anai et al., Diabe- tes (Nikoulina et al., Diabe- PKCG (Chal- eller PTPIB 274:583-589 eller sänkta nivåer av (2000)), Commun. tes, Biochem. Biophys. Res.

(Arner et al., Diabetolo- Diabetes 44:815-819 1993, Sankt fosforylering av IR 30:437-440 (1987): Maegawa et al., (1991): 1992, gia, Saad et al., Saad et al., 1992, ovan) och Akt OVER; Saad OVän; Goodyear et al-, :Rs-1 (saad et al., 1993, Diabetes 4721281-1286 ovan), ovan; et al-, ovan; Goodyear et al., (Krook et (1998)) skelettmuskel hos vissa typ II diabetesindivider. Vidare har 1992, 81-, har också observerats i minskad aktivitet av PI 3-kinas 1995, (Saad et al., 1993, OVân; Heydrich et al., ovan; Saad et al., ovan; Goodye- ar et al-, Ovan; Heydrich et al., 1993, ovan; Folli et al., Acta Diabetol. 33:l85-192 (1996): Bjornholm et al., Diabetes 46= 524-527 (1997): Andreeiii er al., øiabetologia 42 358-364 (199): Kim et al., J. Clin. Invest. 104:733-741 (1999); And- reelli F., et al., Diabetologia 43:356-363 (2000): Krook et al., Diabetes 49:284-292 (2000)) och ökad aktivitet av GSK-3 (Eldar-Finkelman et al., Diabetes 48:1662-1666 (1999)), PKC (Avignon et al., Diabetes 45:1396-1404 (1996)) och PTPIB (Dadke et al., ovan) också visat sig vara associerade med typ II diabetes. Vidare är distributionen av PKC-isoformer för- ändrad i skelettmuskler från diabetiska djur (Schmitz-Peiffer et al., Diabetes 46:169-178 (1997)) och innehållet av PKCQ, 70 75 20 25 30 PKCB, PKCa och PKC8 är ökat i membranfraktioner och minskat i cytosolfraktioner av soleusmuskel i den icke feta Goto- Kakizaki-(GK)-diabetiska råttan (Avignon et al-, 0V&n)- Abnormal subcellulär lokalisering av GLUT4 har observerats i skelettmuskel från insulinresistenta individer med eller utan typ II diabetes (Vogt et al., Diabetologia 352456-463 (l992); 1011377-2386 (1988)), vilket föreslår att defekter i GLUT4-trafiken och translokationen Garvey et al., J. Clin. Invest. kan orsaka insulinresistens i skelettmuskel. Studier in vivo och in vitro har visat en reducerad hastighet för insulinsti- mulerad glukostransport i skelettmuskel i vissa typ II diabe- tesindivider (Andreasson et al., Acta Physiol. Scand. 142: 255-260 (l99l); Zierath et al., Diabetologia 37:270-277 (l994); Bonadonna et al., Diabetes 45:9l5-925 (1996)). Även fast diagnosticeringen av symptomatisk diabetes mellitus inte är svår, kan detektionen av asymptomatisk sjukdom orsaka ett antal problem. Diagnos kan vanligen bekräftas genom de- monstrationen av fastande hyperglykemi. I gränsfall tillämpas det välkända glukostoleranstestet vanligen. Vissa bevis anty- der, emellertid, att det orala glukostoleranstestet överdia- gnosticerar diabetes i en avsevärd grad, sannolikt på grund av att stress från ett flertal källor (förmedlad via frisätt- ningen av hormonet epinefrin) kan orsaka en abnorm respons.

För att klarlägga dessa svårigheter har National Diabetes Data Group i National Institutes of Health rekommenderat kriterier för diagnosen av diabetes efter en utmaning med oralt glukos (National Diabetes Data Group: Classification and diagnosis of diabetes mellitus and other categories of glucose intolerance, Diabetes 28:l039 (1979)). 70 75 20 25 30 f 'fl :sa RQÛ s; w en Frekvensen för diabetes mellitus i den allmänna populationen är svår att fastställa med säkerhet, men störningen tros påverka mer än 10 miljoner amerikaner. Diabetes mellitus kan i allmänhet inte botas utan bara kontrolleras. På senare år har det blivit tydligt att det finns en serie olika syndrom inkluderade under paraplytermen "diabetes mellitus". Dessa syndrom skiljer sig både vad gäller kliniska manifestationer och deras ärftlighetsmönster. Termen diabetes mellitus anses kunna tillämpas på en serie av hyperglykemitillstånd som uppvisar de särdrag som noterats ovan och nedan.

Diabetes mellitus har klassificerats i två grundläggande kategorier, primär och sekundär och inkluderar försämrad glukostolerans, som kan definieras som ett tillstànd associe- rat med abnormt förhöjda blodglukosnivàer efter ett oralt glukosintag, där graden av förhöjning inte räcker för att möjliggöra. att diagnosen diabetes ställs. Personer i denna grupp har ökad risk att utveckla fastande hyperglykemi eller symptomatisk diabetes i förhållande till personer med normal glukostolerans, även fast ett sådant framskridande inte kan förutsägas i enskilda patienter. I själva verket antyder flera stora studier att de flesta patienter som har försämrad glukostolerans (ungefär 75 %) aldrig utvecklar diabetes rett et al., Diabetologia 16:25-30 (1979)).

(Jar- De för aterosklerossjukdomar oberoende riskfaktorerna fetma och högt blodtryck är också associerade med insulinresistens.

Med användning av en kombination. av insulin/glukosklämmor, spårämnesglukosinfusion och indirekt kalorimetri, har det visat sig att insulinresistensen från essentiellt högt blod- tryck är belägen i perifera vävnader (i huvudsak muskler) och korrelerar direkt med strängheten hos det höga blodtrycket (DeFronzo och Ferrannini, Diabetes Care l4:173 (1991). Vid 10 75 20 25 30 si; f» n insulinresistens högt blodtryck hos överviktiga genererar hyperinsulinemi, som är en mekanism för att begränsa ytterli- gare viktuppgång via termogenes, men insulin ökar också nju- sympatiska rarnas natriumåterabsorption och stimulerar det nervsystemet i njurar, Vilket Skapar högt blodtryck. hjärta och kärl, Man har nu insett att insulinresistens vanligen är ett resul- tat av en defekt i insulinreceptorsignaleringssystemet, vid ett ställe efter bindning av insulin till receptorn. Ackumu- lerade vetenskapliga bevis smn visar insulinresistens i de le- huvudsakliga vävnaderna som svarar på insulin (muskler, ver, adipos) antyder starkt att en defekt i insulinsignal- överföring finns i ett tidigt steg i denna kaskad, specifikt vid insulinreceptorkinasaktiviteten, Diabetologia 34:848 (1991)). som tycks vara utplànad (Haring, Det är värt att notera att, oaktat andra typer av behandling- ar, insulinterapi förblir den behandling som väljs för många patienter med typ II diabetes, särskilt de som har genomgått primär dietsvikt och som inte är överviktiga, eller de som har genomgått både primär dietsvikt och sekundär oral hypog- lykemisvikt. Men det är lika klart att insulinterapi måste kombineras med en fortsatt ansträngning avseende dietkontroll och livsstilsmodifiering och kan på intet sätt tros vara en ersättning för dessa. För att uppnå optimala resultat, bör insulinterapi följas av eget blodglukosövervakande och lämp- liga uppskattningar av glykosylerade blodproteiner: insulin kan administreras i olika regimer, enstaka, två eller flera injektioner med kortverkande, mellanverkande eller långtids- verkande insulin, eller blandningar av mer än en typ. Den bästa regimen för en patient måste bestämmas genom en process 70 75 20 25 30 ífïfl u x.. i) 775 som skräddarsyr insulinterapin för den enskilda patientens övervakade respons.

Trenden att använda. insulinterapi vid typ II diabetes har ökat med den moderna insikten av vikten av strikt glykemikon- troll för undvikande av diabeteskomplikationer på lång sikt.

I icke överviktiga personer med typ II diabetes med sekundär oral hypoglykemisvikt, garanteras emellertid inte på något sätt god respons, även fast insulinterapi kan vara framgångs- (Rendell et al., Ann. Int. rik med att ge adekvat kontroll Med. 90:l95-197 (1979)). 58 icke överviktiga patienter, O I en studie uppnådde endast 31 6 av som kontrollerades dåligt på maximala doser av orala hypoglykemimedel, objektivt verifier- bar förbättring i kontroll på en enkel insulinregim (Peacock et al., Br. Med. J. 288:l958-1959 (1984)). diabetespatienter med sekundär svikt, är bilden ännu mindre I överviktiga klar på grund av att i denna situation ökar insulin ofta kroppsvikten, ofta med en medföljande försämring av kontrol- len.

Det kommer därför att vara tydligt att det för närvarande rådande kunskapsläget och praktiken med avseende på terapi av typ II diabetes inte på något sätt är tillfredsställande.

Majoriteten av patienterna dietsvikt med genomgår primär tiden och majoriteten av överviktiga typ II diabetesfall misslyckas med att uppnå ideal kroppsvikt. Även fast orala hypoglykemimedel ofta är framgångsrika i att minska graden av glykemi i fallet med primär dietsvikt, betvivlar många aukto- riteter att den grad av glykemikontroll som uppnås är till- räcklig för att undvika förekomsten av komplikationer på lång sikt av aterosklerossjukdom, neuropati, nefropati, retinopati och perifer kärlsjukdom associerad med långt gången typ II diabetes. Skälet för detta kan inses i ljuset av nuvarande 70 75 20 25 30 insikt att till och med minimal glukosintolerans, ungefär likvärdig med en fastande plasmaglukos av 5,5 ïill 6,0 ökad Lancet 1:l373-1378 hjärt- (1980)). associerad med en riSk för (Fuller et al., mmol/l, är kärlrelaterad död Det är inte heller klart att insulinterapi ger någon förbätt- ring på lång sikt jämfört med behandling med orala hypoglyke- mimedel. Således kan det inses att en bättre behandlingsmetod skulle vara av stor användning.

Dickkopf-(dkk)-gruppen av proteiner är en grupp av utsöndrade Gene 238:301-313 (1999): 87:45-56 (1999)). Dkk-i (wo 00/12708 Dkk-1 benämns PRO13l6 och det Wnt-hämmare (Krupnik et al., MOÛHQ' Mech. Dev. publicerad 2000-03-09, han et al., vari kodande DNA är DNA60608) identifierades som en inducerare för huvudbildning i Xenopus genom hämning av Wnt-signalering Nature 39l:357-362 (1998)) senare vara involverad i utvecklingen av lemmarna et al., Mech. 89:151-153 (1999)) inducerad morfologisk transformation Chem. 274:19465-19472 (1999)).

Dkk-2 uppvisar ömsesidig antagonism i och med att Dkk-2 aktie (Glinka et al., och visade sig (Grotewold och hämmande för Wnt- (Fedi et al., J. Biol.

Man har funnit att Dkk-1 och Dev. verar snarare än hämmar Wnt/B-cateninsignaleringsvägen i Xenopus-embryon (Wu et al., Curr. Biol. 10:1611-1614 (2000)).

Det har också rapporterats att medan Dkk-1 hämmar Wnt- signalering, aktiverar en klyvningsprodukt av Dkk-1 densamma (Brott och Sokol, Mol. Cell Biol. 22:6l00-6110 (2000)).

Nyligen gjorda studier indikerar att Dkk *verkar genom att binda till det lipoproteinrelaterade proteinet LRP6 med låg densitet, som verkar som en samreceptor för Wnt-signalering Nature 407:535-538 (2000): (2000): Nature 407:527-530 Dkk-1 motarbetar Wnt-signalering genom bindning till (Pinson et al., Nature 407:530-535 (2000)).

Tamai et al., Wehrli et al., 10 75 20 25 30 f; Cfl sa »a LW LRP6 vid domäner som är distinkta från de som är involverade "frizzled", varigenom LRP6- vid dess samverkan med Wnt och förmedlad Wnt/ß-cateninsignalering således hämmas (Bafico et al., Nat. Cell. Biol. 3:683-686 (200l); Mao et al., Nature 4ll:32l-325 (200l); Semenov et al., Curr. Biol. ll:95l-961 (2001)).

Wnt-signaleringsvägen spelar en nyckelroll vid embryoutveck- ling, differentiering av olika celltyper och onkogenes (Pei- 287:l606-1609 (2000)). signaleringsvägen aktiveras genom samverkan mellan utsöndrade fer och Wnt- Polakis, Science Wnt och deras receptorer, de krusade proteinerna (Hlsken och 11323545-3546 (2000)). Det leder till aktiveringen av Disheveled Behrens, J. Cell Sci.

(Dvll)-protein, som aktiverar Akt, som därefter rekryteras till Axin-B-catenin-GSK3ß-APC (Fuku- moto et al., J. Biol. Chem. 276:l7479-17483 (2001)). Detta följs av fosforyleringen och inaktiveringen av GSK3ß, som resulterar i hämning av fosforyleringen och nedbrytningen av B-catenin. Ackumulerat ß-catenin translokeras till kärnan där det samverkar med transkriptionsfaktorer av den lymfoidförs~ tärkande faktor T-cellfaktor-(LEF/TCF)-familjen och inducerar transkription av màlgener.

Två av de nedströms för Wnt- liggande effektorerna signalering, Akt och GSK3ß, är nyckelmellanprodukter i insu- linsignaleringsvagen/glukosmetabolismen. Wnt-signalering är inblandad i regleringen av muskeldifferentiering (Borello et al., Development l26:4247-4255 (1999): l5=4526-4536 (1996): cossu øch Boreilo, EMBo J. isweev-esvz (1999): Ridgeway et al., J. Biol. Chem. 275:32398~32405 (2000); Development l26:337l-3380 (l999); J. Cell Biol. l50:225-241 (2000)) Cook et al., EMBO J.

Tian et al., Toyo- fuku et al-, och adipogenes 70 15 20 25 30 I _" *slå (_31 10 Science 2892950-953 (2000)). Hämning av Wnt- signalering kan simulera transdifferentieringen av myocyter (Ross et al., till adipocyter (Ross et al., ovan). Dessutom är LRP5 i all- Genen ligger inom den IDDM4 på (1998)) mänhet associerad med typ I diabetes. mellitus-(IDDM)-platsen Gene 2162103-111 insulinberoende diabetes kromosom llql3 (Hey et al., OCh uttrycks i de langerhanska cellöarna, makrofagerna och vita- min A-systemcellerna, vilka är celltyper som är involverade i framskridandet av typ I diabetes Histo- 48:l357-1368 (2000)). vern och ackumulerade i kolesterolladdade skumceller i ate- (Figueroa et al., J. chem. Cytochem. LRP5 mRNA ökade i le- med 124: rosklerosskador i LDLR-bristfälliga Watanabe-kaniner ärftlig hyperlipidemi Biochem. (Tokyo) 1072-1076 (l998)).

(Kim et al., J.

En Dkk-5-molekyl beskrivs i WO 01/40465 (PCT/USOO/30873), vari Dkk-5 benämns PROl0268 och det kodande DNA:t benämns DNA 145583-2820, med ATCC-deponeringsnumret PTA-1179, deponerat 2000-ll-Ol. En annan Dkk-5-molekyl med en aminosyraförändring i den mogna regionen jämfört med molekylen i WO 01/40465 identifieras j. EP 1067182-A2 publicerad 2001-Ol-10 (benämnd PSECO258). Den senare ansökan avser flera nukleinsyrasekven- ser som kodar för humana sekretoriska eller membranproteiner och antikroppar därtill. Fokus för deras användbarhet finns i två exempel. Det första är att behandla NT-celler med reuma- toid artrit (RA) och RA-hämmare och iakttagande av upp/ned- reglering av en undergrupp av de upptäckta generna allt medan de genomgår neuronal differentiering. Det andra exemplet involverar behandling av primära celler från synovialvävnad med TNF-a för RA och iakttagande av' upp/nedregleringen av Undergrupp av deras gener. Inte i något fall är Dkk-5- molekylen frán EP 1067182-A2 en positiv träff. 70 75 20 25 30 ra» P; cc \¿ *J n ll Det finns ett behov av effektiva terapeutiska medel som kan användas i diagnos och terapi av individer som lider av en insulinresistensstörning, inklusive NIDDM.

Sammanfattning av uppfinningen Proteinet Dkk-5 identifierades som en modulator för glukosme- tabolism i odlade skelettmuskelceller och adipocyter. Behand- ling av muskelceller med Dkk-5 resulterade i en ökning i det grundläggande och insulinstimulerande glukosupptaget. Denna effekt observerades efter làngtidsbehandling, vilket antyder att Dkk-5 påverkar både muskeldifferentiering och uttryck- ningsnivàerna av proteiner i insulinsignaleringsvägen_ Värden visar att Dkk-5 stimulerar både grundläggande och insulinsti- mulerd glukosmetabolism in vitro. Därav följer att Dkk-5 är användbart vid behandlingen av en insulinresistensstörning, inklusive en som är övervikt, associerad med, exempelvis, glukosintolerans, diabetes mellitus, högt blodtryck och ischemistörningar i de stora och små blodkärlen.

Uppfinningen häri består i metoder, kit och kompositioner enligt patentkraven. Specifikt tillhandahåller uppfinningen i en utföringsform en metod för behandling av en insulinresi- stensstörning i däggdjur innefattande administrering till ett däggdjur som är i behov därav, av en effektiv mängd av Dkk-5.

Företrädesvis är däggdjuret en människa och har NIDDM eller är överviktig. Föredraget är också systemisk administrering.

I ytterligare en föredragen utföringsform, administreras ett annat insulinresistensbehandlande medel utöver Dkk-5 för att behandla störningen av insulinresistens.

I ytterligare en annan föredragen utföringsform, har den Dkk- 5-polypeptid som används för behandling åtminstone omkring 85 %, mer företrädesvis åtminstone omkring 90 %, mer företrädes- 10 15 20 25 30 , ... bf wa n-fl m 12 vis åtminstone omkring 95 %, mer företrädesvis atminstone omkring 99 % och mest företrädesvis 100 % aminosyrasekvens- identitet med sno in No; 5 i Pig. 2, med eller Utan dess associerade signalpeptid. I en annan föredragen utförings- form, är Dkk-5 ett internt klyvningsproteinfragment från SEQ ID NO: 5 som har N-terminalsekvensen MALFDWTDYEDLK (SEQ ID NO: 8) och en nwlekylvikt av omkring 16 kDaf eller är en blandning av Dkk-5 med SEO ID NO: 5 och ett internt klyv- ningsproteinfragment av SEQ ID NO: 5 med N-terminalsekvens MALFDWTDYEDLK (SEQ ID NO: 8) och en molekylvikt av omkring 16 kDa, eller är en blandning av ett Dkk-5 som har SEQ ID NO: 5 i avsaknad av dess associerade signalpeptid och ett internt sEQ ID No: 5 (SEQ ID NO: 8) vikt av omkring 16 kDa. Mer företrädesvis är Dkk-5 ett Dkk-5 klyvningsproteinfragment av SOM haf N' terminalsekvens MALFDWTDYEDLK och en molekyl' som innefattar SEO ID NO: 5, eller ett Dkk-5 som innefattar sekvensen mellan rest 20 upp till rest 30 och rest 347 av SEQ ID NO: 5, (än- den) företrädesvis ett Dkk-5 innefattande sekvensen mellan resterna 25 och 347 av SEQ ID NO: 5, eller ett internt klyvningsproteinfragment av SEQ ID NO: 5 SOm har (SEQ ID NO: 8) N-terminalsekvens MALFDWTDYEDLK och en mole- kylvikt av omkring 16 kDa, eller en kombination av nämnda klyvningsprodukt och en eller båda av de Dkk-5 som innefattar SEQ ID NO: 5 eller innefattar sekvensen mellan rest 2D upp till rest 30 och rest 347 av SEQ ID NO: 5.

I ytterligare en utföringsform tillhandahåller uppfinningen ett kit för behandling av en insulinresistensstörning i ett däggdjur, vilket kit innefattar: (a) en behållare innefattande Dkk-5; (b) instruktioner för användning av Dkk-5 för att behandla störningen; och 10 75 20 25 30 (31 RQ QS \J \3 LH 13 (c) en behållare innefattande ett insulinresistensbehandlande medel.

I en föredragen utföringsform är störningen NIDDM, behållaren är en ampull och instruktionerna specificerar placering av ampullens innehåll i en nål för omedelbar injektion.

I en annan utföringsform tillhandahåller uppfinningen ett isolerat internt klyvningsproteinfragment av SEQ ID NO: 5 SOm (SEQ ID NO: 8) har N-terminalsekvens MALFDWTDYEDLK och en molekylvikt av omkring 16 kDa.

I ytterligare en aspekt erbjuder uppfinningen en komposition innefattande och en bärare och mer detta proteinfragment företrädesvis innefattar denna komposition vidare ett Dkk-5 som innefattar SEQ ID NO: 5 med eller i avsaknad av dess associerade signalpeptid. Om det Dkk-5 som innefattar SEQ ID NO: 5 är i avsaknad av sin associerade signalpeptid, innefat- tar det i allmänhet sekvensen mellan omkring rest 20 upp till omkring rest 30 till slutet av SEQ ID NO: 5, mer företrädes- vis resterna 25 till 347 i SEQ ID NO: 5.

Uppfinningen tillhandahåller vidare ett hybridom som produce- rar en Dkk-5-antikropp vald från PTA-3090, PTA-3091, PTA- 3092, PTA-3093, PTA-3094, PTA-3095 och PTA-3096. Tillhanda- hållet är också en antikropp som produceras av något av dessa hybridom.

Uppfinningen tillhandahåller vidare en metod för utvärdering av effekten av ett farmaceutiskt kandidatläkemedel på en insulinresistensstörning i ett däggdjur innefattande admini- strering av läkemedlet till en transgen icke human djurmodell som överuttrycker dkk-5-cDNA:t och bestämning av effekten av 10 15 20 25 30 14 läkemedlet på glukosclearance från modellens blod. Företrä- desvis är djurmodellen en gnagare, mer företIäd6SViS en mus eller råtta och mest företrädesvis en musmodell.

I en annan föredragen utföringsfornl är det dkk-5-cDNA som överuttrycks av modellen under kontroll av en muskelspecifik promotor och cDNA:t överuttrycks i muskelvävnad.

Kort beskrivninggav figurerna Fig. l uppenbarar den schematiska strukturen av den humana Dkk-gruppen av proteiner (hDkk-1, hDkk-2, hDkk-4, hDkk-3 och hDkk-5).

Fig. 2 anger sekvensplaceringen i den humana Dkk-gruppen av proteiner, Dkk-l (SEQ ID NO: l), Dkk-2 (SEQ ID NO: 2), Dkk-3 (SEQ ID NO: 3), Dkk~4 (SEQ ID NO: 4) Och Dkk-5 (SEQ ID NO: 5). De inramade regionerna anger cysteinrika domäner och de uppochnedvända trianglarna anger placeringen för det interna klyvningsstället för proteiner i denna grupp.

Fig. 3 visar de relativa uttryckningsnivåerna av Dkk-5 i olika vuxna humana vävnader.

Fig. 4 visar de relativa nivåerna av Dkk-5-uttryckning i musembryo.

Fig. 5A~5E visar hybridiseringsanalyser in situ av helmusem- bryon vid olika dagars utveckling, p.c., 5A är dag 8,5-9 (i närbild) (huvud) där Fig. 5C är dag 10 p.c., Fig. 5D är dag ll p.c. och Fig. 5E är dag 12,5 p.c.

Fig.

Fig. 5B är dag lO p.c., Fig. 6 visar den relativa uttryckningsnivån av Dkk-5 under L6-celldifferentiering från dag l till dag 8.

Fig. 7 visar ett SDS-PAGE Coomassie blue-färgat gel av hDkk-5 uttryckt i bakulovirus och dess klippning, där fält 1 är icke reducerande betingelser och fält 2 är reducerande betingelser. 70 75 20 25 30 (_31 i _? C \J “N21 ”I 15 Fig. 8A-8B visar effekten av Dkk-5 på grundläggande och ïnsu' linstimulerat glukosupptag i L6-muskelceller vid 48 timmars behandling (Fig. 8A) och 96 timmars behandling (Fig. 8B). De lägre staplarna representerar ingen insulinanvändning och de högre staplarna representerar användning av 30 nM insulin.

Fig. 9A-9B visar effekten av Dkk-5 på grundläggande och insu- linstimulerad inkorporering av glukos till glykogen i L6- muskelceller vid 48 timmars behandling (Fig. 9A) och 96 tim- mars behandling (Fig. 9B). De lägre staplarna representerar ingen insulinanvändning och de högre staplarna representerar användning av 30 nM insulin.

Fig. lOA-lOG anger effekten av Dkk-5 pà uttryckningsnivàerna av olika gener som är inblandade i myogenes i L6-muskel- celler. Fig. lOA visar effekten på uttryckning av myosin med lätt kedja (MLC-2); Fig. lOB visar effekten på Myf5- uttryckning; Pig. lOC visar effekten på myogeninuttryckning; Fig. l0D visar effekten på Pax3-uttryckning; Fig. lOE visar effekten på MLC l/3-uttryckning; Fig. lOF visar effekten på MyoD-uttryckning och Pig. lOG visar effekten på uttryckning av myosin med tung kedja (HC). Diamanterna representerar obehandlade celler och trianglarna representerar celler be- handlade med Dkk-5.

Fig. ll visar effekten av Dkk-5 på uttryckning av gener in- blandade i insulinsignaleringsvägen (inblandade i glukosmeta- bolism). Stapeln till vänster i varje par är Dkk-5 på dag 5 och stapeln till höger i varje par är Dkk-5 på dag 7.

Fig. 12 visar en FACS-analys av bindning till L6-celler av Dkk-5 och vad som kan upphäva bindningen.

Fig. l3A-l3B visar effekterna av Dkk-5 på grundläggande och insulinstimulerat glukosupptag i adipocyter vid 48 timmars behandling l3A) l3B).

De lägre staplarna representerar ingen insulinanvändning och (Fig. och 96 timmars behandling (Fig. de högre staplarna representerar användning av 30 nM insulin. 10 75 20 25 30 16 rig. 14A-14B viser effekten av mkr-s på grundläggande Och insulinstimulerad glukosinkorporering in i lipider i adipocy- 14A) och 96 timmars be- ter vid 48 timmars behandling l4B).

(Fig. handling (Fig. De lägre staplarna representerar ingen insulinanvändning och de högre staplarna representerar an- vändning av 3O nM insulin.

Detaljerad beskrivning_av de föredragna utföringsformerna Definitioner Enligt användningen häri hänvisar "Dkk-5" eller "Dickkopf-5" eller "Dkk-5-polypeptid" till en polypeptid som har åtminsto- ne omkring 80 % aminosyrasekvensidentitet med fullängdsamino- syrasekvensen av den Dkk-5-polypeptid som visas i Fig. 2 (SEQ ID NO: 5), O e aminosyrasekvensidentitet med den aminosyrasekvens i Dkk-5- (SEQ ID NO: 5) eller en polypeptid som har åtminstone omkring 80 polypeptiden som visas i Fig. 2 som är i av- saknad av sin associerade signalpeptid, eller en polypeptid som har åtminstone 80 % aminosyrasekvensidentitet med en aminosyrasekvens som kodas för av kodningssekvensen av full längd av det DNA som är deponerat under ATTC-accessionsnummer PTA-1179, eller något annat fragment av fullängdspolypeptid SEQ ID NO: 5 såsom det är uppenbarat häri, förutsatt att Dkk~ 5-polypeptiden såsom den definieras häri har aktiviteten att behandla en insulinresistensstörning.

Det Dkk-5 källor, som. definieras häri kan isoleras fràn. en mängd såsom från humana vävnadstyper eller från en annan nativ källa, eller beredas genom rekombinanta eller syntetis- ka metoder. Termen "Dkk-5" omfattar specifikt naturligt fore- kommande stympade eller utsöndrade former av den specifika polypeptiden (t.ex. en extracellulär domänsekvens), naturligt förekommande variantformer (t.ex. alternativt splitsade for- 70 75 20 25 30 (TI x; UI* -41 »<1 "I 17 mer) och naturligt förekommande allelvarianter av polypepti- den. I olika utföringsformer av uppfinningen är Dkk-5- polypeptiden en mogen eller fullängdsnativ sekvenspolypeptid innefattande den fullständiga längden av aminosyrasekvensen av SEQ ID NO: 5 som visas i Fig. 2. Fastän den Dkk-5- polypeptid som uppenbaras i bifogade Fig. 2 som SEQ ID NO: 5 visas börja med en metioninrest, är det emellertid tänkbart och möjligt att andra metioninrester belägna antingen upp- ströms eller nedströms från startaminosyrapositionen av SEQ ID NO: 5 i. Fig. 2 kan användas som startaminosyrarest för Dkk-5-polypeptiden.

Dkk-5-polypeptiden inkluderar, exempelvis, polypeptider vari en eller flera aminosyrarester är tillsatta, eller uteslutna, vid N- eller C-änden av den nativa aminosyrasekvensen av full längd av SEQ ID NO: 5. En Dkk-5-polypeptid kommer att ha åtminstone omkring 80 % alterna- al- aminosyrasekvensidentitet, tivt åtminstone omkring 81. % aminosyrasekvensidentitet, ternativt åtminstone omkring 82 % aminosyrasekvensidentitet, alternativt åtminstone omkring 83 % aminosyrasekvensidenti- tet, alternativt åtminstone omkring 84 % aminosyrasekvens- identitet, alternativt åtminstone omkring 85 % aminosyrase- kvensidentitet, alternativt åtminstone omkring 86 % aminosy- O rasekvensidentitet, alternativt åtminstone omkring 87 6 ami- nosyrasekvensidentitet, alternativt åtminstone omkring 88 % aminosyrasekvensidentitet, alternativt åtminstone omkring 89 O 6 aminosyrasekvensidentitet, 90 % alternativt åtminstone omkring aminosyrasekvensidentitet, alternativt åtminstone om- kring 91 % aminosyrasekvensidentitet, alternativt åtminstone omkring 92 % aminosyrasekvensidentitet, alternativt åtminsto- ne omkring 93 % aminosyrasekvensidentitet, alternativt åtmin- stone omkring 94 % aminosyrasekvensidentitet, alternativt åtminstone omkring 95 % aminosyrasekvensidentitet, alterna- 70 75 20 25 30 18 tivt åtminstone omkring 96 % aminosyrasekvensidentitet, al- ternativt åtminstone omkring 97 % aminosyrasekvensidentiteïI alternativt åtminstone omkring 98 % aminosyrasekvensidenti- tet, alternativt åtminstone omkring 99 % aminosyrasekvens- identitet och alternativt 100 % SEQ ID NO: 5 såsom det uppenbaras häri, eller SEQ ID NO: 5 i aminosyrasekvensidentitet med avsaknad av signalpeptiden såsom den uppenbaras hari, förut- satt att det har aktiviteten att behandla en insulinresi- stensstörning.

Vanligen har av åtminstone Dkk-5-polypeptiderna en längd omkring 10 aminosyror, alternativt en längd av åtminstone 20 aminosyror, alternativt en längd av åtminstone 30 aminosyror, alternativt en längd av åtminstone 40 aminosyror, alternativt en längd av åtminstone 50 aminosyror, alternativt en längd av åtminstone 60 aminosyror, alternativt en längd av åtminstone 70 aminosyror, alternativt en längd av åtminstone 80 aminosy- ror, alternativt en längd av åtminstone 90 aminosyror, alter- nativt en längd av åtminstone 100 aminosyror, alternativt en längd av åtminstone 150 aminosyror, alternativt en längd av åtminstone 200 aminosyror, alternativt en längd av åtminstone 300 aminosyror, eller mer, förutsatt att den har aktiviteten att behandla en insulinresistensstörning.

Den isolerade interna klyvningsprodukten (som startar med MA) som bildas vid klyvning vid det interna ställe som markerats med en uppochnedvänd pil i SEQ ID NO: 5 i Fig. 2 som har en molekylvikt av omkring 16 kDa är aktiv vid förstärkning av grundläggande och insulinstimulerat glukosupptag i muskelcel- ler, precis som den rekombinanta beredningen är som innehål- ler till största del det mogna proteinet och/eller det sig- nalsekvensinnehållande proteinet. 10 75 20 25 30 19 Föredragna är de med åtminstone omkring 85 %, mer företrädes- vis åtminstone omkring 90 %, mer företrädesvis åtminstone O omkring 95 %, mer företrädesvis åtminstone omkring 99 6 ami- nosyrasekvensidentitet med SEQ ID NO: 5. Mer föredraget är polypeptiden av SEQ ID NO: 5 från Fig. 2 häri, den polypeptid som benämnts PRO10268 i WO 01/40465 (PCT/USO0/30873) polypeptid som benämnts PSEC0258 i EP 1067182-A2 publicerad och den 2001-01-10. Ännu mer föredragen är den polypeptid som har SEQ ID NO: 5 från Fig. 2 häri och PRO10268 från WO 01/40465 och de mogna polypeptiderna därifrån, samt det interna klyvnings- proteinfragmentet från SEQ ID NO: 5 som har N-terminalsekvens MALFDWTDYEDLK (SEQ ID NO: 8) kDa och blandningar därav med en Dkk-5 som har SEQ ID NO: 5 och en molekylvikt av omkring 16 med eller i avsaknad av dess associerade signalpeptid. Mest föredragen är den polypeptid som innefattar SEQ ID NO: 5 från Fig. 2 häri, med, eller utan dess associerade signalpeptid och/eller det interna klyvningsproteinfragmentet från SEO ID NO: 5 som har N-terminalsekvens MALFDWTDYEDLK (SEQ ID NO: 8) och en molekylvikt av omkring 16 kDa.

Den ungefärliga placeringen för "signalpeptiden" i polypepti- den som uppenbaras häri är från metioninet vid position 1 till alaninet i position 24 i SEQ ID NO: 5 i. Pig. 2, där klyvningsstället är mellan alaninet vid position 24 och gly- cinet vid position 25 i SEQ ID NO: 5 i Fig. 2. emellertid, Det noteras, att den C-terminala gränsen. av' en signalpeptid kan variera, men mest sannolikt med inte mer än omkring 5 aminosyror pà endera C-terminala den C- sidan om signalpeptidens gräns såsom den initialt identifieras häri, vari terminala gränsen i signalpeptiden kan identifieras enligt kriterier som rutinmässigt används inom området för att iden- tifiera den typen av' aminosyrasekvensdel al., Prot. lO:1-6 (1997) (t.ex. Nielsen et Eng- och von Heinje et al. Nucl. 70 15 20 25 30 çgzflxïg 20 Acids Res. l4:4683-4690 (1986)). Vidare inses det också att, i vissa fall, är klyvning av en signalsekvens från en utsönd- rad polypeptid inte fullständigt enhetlig, vilket resulterar i mer än ett utsöndrat ämne. Dessa mogna polypeptider, där signalpeptiden klyvs inom högst omkring 5 aminosyror på ende- ra sidan om den C-terminala gränsen av signalpeptiden enligt definition häri och de polynukleotider som kodar för dem, övervägs av föreliggande uppfinning. med avseende på de "Procent (%) aminosyrasekvensidentitet" Dkk-5-polypeptidsekvenser som identifieras häri, definieras som procent aminosyrarester i en kandidatsekvens som är iden- tiska med aminosyraresterna i den specifika polypeptidsekven- sen, efter uppradning av sekvenserna och introducering av mellanrum, för att erhålla en maximal om så är nödvändigt, procent av sekvensidentitet, varvid man inte överväger några konservativa substitutioner som del av sekvensidentiteten.

Uppradning med syfte att bestämma procent aminosyrasekvens- identitet kan uppnås pà olika sätt som ligger inom områdets kunskap, exempelvis, med användning av offentligt tillgänglig datormjukvara, BLAST-2, ALIGN eller såsom mjukvarorna BLAST, Megalign (DNASTAR). Fackmän inom området kan bestämma lämpli- ga parametrar för mätning av uppradning, inklusive eventuella algoritmer som behövs för att uppnå maximal uppradning över den fulla längden av sekvenser som jämförs. För syften häri, genereras emellertid värden för procent aminosyrasekvensiden- titet med ALIGN-2, användning av sekvensjämförelsedataprogrammet fullständiga källkoden ALIGN-2- programmet tillhandahålles i Tabell 1 i WO 01/16319 publice- rad 200l-O3-08 och WO 00/73452 publicerad 2000-12-07. ALIGN- 2-dataprogrammet för sekvensjämförelse författades av Genen- tech, vari den för Inc. och källkoden har inlämnats med användardokumenta- tion i U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, där den 70 15 20 25 30 328 775 21 är registrerad under U.S. Copyright Registration No.

TxU510087. ALIGN-2-programmet är offentligt tillgängligt från South San Francisco, CA. ALIGN-2-programmet Genentech, Inc., bör kompileras för användning på ett UNIX-operativsystem, företrädesvis digital UNIX V4.0D. Alla sekvensjämförelsepara- metrar anges av ALIGN-2-programmet och varierar inte.

I situationer där ALIGN-2 används för aminosyrasekvensjämfö- relse, är det så att procent aminosyrasekvensidentitet för en given amino- given aminosyrasekvens A till, med eller mot en syrasekvens B (som kan vara alternativt benämnd som en given aminosyrasekvens A som har eller innefattar en viss procent aminosyrasekvensidentitet till, med eller mot en given amino- syrasekvens B) beräknas enligt följande: l00 gånger kvoten X/Y där X är antalet aminosyrarester som protokollförts som iden- tiska matchningar av sekvensuppradningsprogrammet ALIGN-2 i det programmets uppradning av A och B och där Y är det totala antalet aminosyrarester i_ B. Det kommer att inses att där längden av aminosyrasekvens A inte är lika med längden av aminosyrasekvens B kommer procent aminosyrasekvensidentitet mellan A och B inte att vara lika med procent aminosyrase- kvensidentitet mellan B och A. Exempel på beräkningar av aminosyrasekvensidentiteter med användning av ALIGN-2 till- handahålles i tabellerna, 2 och 3 i. WO 01/16319 publicerad 2001-03-08 och WO 00/73452 publicerad 2000-12-07.

Om inte något annat anges på annan plats, har alla procent- värden för aminosyrasekvensidentitet som används häri erhål- lits genom beskrivning i. det omedelbart föregående stycket med användning Emellertid kan av ALIGN-2-dataprogrammet. procentvärden för aminosyrasekvensidentitet också erhållas enligt beskrivningen nedan genom användning av WU-BLAST-2- 70 75 20 25 30 22 dataprogrammet (Altschul et al., Meth. Enzymol. 266:460-480 (1996)). De flesta av WU-BLAST-2-sökparametrarna ställs in på normalvärden. d-V-5- De som inte ställs in på normalvärdenf de justerbara parametrarna, ställs in med följande värden: överlappsspännvidd = l, överlappskvot = 0,125, ordtröskel (T) = ll och protokollföringsmatris = BLOSUM62. Då WU-BLAST-2 används, bestäms ett procentvärde för aminosyrasekvensidenti- tet genom att dela (a) antalet matchande identiska aminosyra- rester mellan aminosyrasekvensen i Dkk-5-polypeptiden av intresse som har en sekvens härledd från den nativa Dkk-5- polypep-tiden och den jämförande aminosyrasekvensen av in- tresse (d.v.s. sekvensen mot vilken Dkk-5-polypeptiden av intresse jämförs) enligt bestämning med WU-BLAST-2 med (b) det totala antalet aminosyrarester i den intressanta Dkk-5- polypeptiden. Exempelvis gäller att i uttalandet "en polypep- tid innefattande aminosyrasekvensen A som har åtminstone 80 % aminosyrasekvensidentitet med aminosyrasekvensen B", är ami- nosyrasekvensen A intresse jämförelseaminosyrasekvensen av och aminosyrasekvensen B är aminosyrasekvensen för Dkk-5- polypeptiden av intresse.

Procent aminosyrasekvensidentitet kan också bestämmas med användning av sekvensjämförelseprogrammet NCBI-BLAST2 (Alt- schul et al., Nucl. Acids Res. 25:3389-3402 (1997)). NCBI- BLAST2-sekvensjämförelseprogrammet kan laddas ned från http://www. ncbi.nlm.nih.gov eller annars erhållas från Na- tional Institute of Health, Bethesda, MD. NCBI-BLAST2 använ- der flera sökparametrar, vari alla de parametrarna ställs in pà normalvärden inkluderande, exempelvis, "unmask" = ja, sträng = alla, förväntad förekomst = 10, minimal låg komplex- itetslängd = 15/5, multi-pass e-värde = 0,01, konstant för multi-pass H 25, nedgång för slutlig mellanrumsförsedd upp- radning = 25 och protokollföringsmatris = BLOSUM 62. 10 15 20 25 30 '" n (j E) ii íš *J *J CH 23 I situationer där NCBI-BLAST2 används för aminosyrasekvens- jämförelser, beräknas procenten aminosyrasekvensidentitet hos en given aminosyrasekvens A till, med eller mot en given SOITl en aminosyrasekvens B (som alternativt kan formuleras given aminosyrasekvens A som. har eller innefattar en viss procent aminosyrasekvensidentitet till, med eller mot en given aminosyrasekvens B) enligt följande: lO0 gånger kvoten X/Y där X är antalet aminosyrarester som protokollförts som iden- tiska matchningar genom sekvensuppradningsprogrammet NCBI- BLAST2 i det programmets uppradning av A och B och där Y är totala antalet aminosyrarester i B. Det kommer att inses att då längden av aminosyrasekvensen A inte är likadan som läng- den av aminosyrasekvens B, kommer procentandelen aminosyrase- kvensidentitet av A i förhållande till B inte att vara lika med procentandelen aminosyrasekvensidentitet av B i. förhål- lande till A.

Enligt användningen häri beskriver "behandling" övervakningen och vården av en patient med syfte att bekämpa en insulinre- sistensstörning och inkluderar administreringen för att före- bygga påbörjan av symptomen eller komplikationerna, lindra symptomen eller komplikationerna, eller eliminera insulinre- sistenssjukdomen, -tillståndet eller -störningen. För denna uppfinnings syften inkluderar gynnsamma eller önskade kronis- ka resultat, men är inte begränsade till, lindring av symptom som är associerade med insulinresistens, försvagning av om- fattningen av symptomen av insulinresistens, stabilisering (d.v.S. inte försämring) av symptomen av insulinresistens (t.ex. reduktion av insulinbehov), ökning i insulinkänslighet och/eller insulinutsöndring för att förebygga svikt i de langerhanska cellöarna och försening eller retardering av 70 15 20 25 30 W 5 CJ se \__'] CH 24 insulinresistensframskridandet, t.ex. diabetesframskridande.

Såsom kommer att inses av fackmannen på Området, kOmm@f de specifika symptom som överlämnas för behandling i enlighet med uppfinningen att bero på typen av insulinresistensstör- inklu- ning som behandlas. De som är "i behov av behandling" derar däggdjur som redan har störningen, samt de som har en benägenhet att få störningen, inklusive de i vilka störningen skall förebyggas.

Termen "däggdjur" hänvisar för behandlings- och diagnossyften till vilket djur som helst som är ett däggdjur, inklusive men inte begränsat, till människor, sportdjur, djur på zoo, säll- katter, skapsdjur och hus- eller lantbruksdjur, såsom hundar, nötboskap, får, grisar, hästar och primater, såsom apor.

Företrädesvis är däggdjuret en människa.

En "insulinresistensstörning“ är en sjukdom, ett tillstånd eller störning som resulterar från en svikt i den normala metaboliska responsen i perifera vävnader (insensibilitet) på verkan av exogent insulin, d.v.s. det är ett tillstånd där närvaron av insulin producerar en subnormal biologisk re- spons. I kliniska termer är insulinresistens då normala eller förhöjda blodglukosnivåer kvarstår inför normala eller för- höjda nivàer av insulin.

Den representerar, i huvudsak, en glykogensynteshämning, genom. vilken antingen grundläggande eller insulinstimulerad glykogensyntes, eller båda, är redu- cerade under normala nivåer. Insulinresistens spelar en hu- vudsaklig roll i typ II diabetes såsom visas av det faktum att den hyperglykemi som finns närvarande i typ II diabetes ibland kan motverkas genom dieten eller viktförlust tillräck- ligt mycket, uppenbarligen, för att återupprätta sensitivitet inkluderar hos de perifera vävnaderna för insulin. Termen abnorm glukostolerans, samt de många störningarna i vilka 70 75 20 25 30 (_57 ikß Cß \J “NJ "l 25 insulinresistens spelar en nyckelroll, såsom övervikt, diabe- tes mellitus, ägqstockshyperandrogeni och högt blodtryck.

"Diabetes mellitus" hänvisar till ett tillstànd av kronisk hyperglykemi, d.v.s. överskott av socker i blodet, SOm en följd av en relativ eller absolut avsaknad av insulinverkâfl- Det finns tre grundläggande typer av diabetes mellitus, typ I (IDDM), (NIDDM) eller insulinberoende diabetes mellitus typ ïï eller icke-insulinberoende diabetes mellitus och typ A' insulinresistens, även fast typ A är relativt sällsynt. Pati- enter med antingen typ I eller typ II diabetes kan bli okäns- liga för effekterna av exogent insulin genom en mängd meka- nismer. Insulinresistens av typ A är resultat av antingen mutationer i insulinreceptorgenen eller defekter i postrecep- torställen för verkan som är kritisk för glukosmetabolism.

Diabetesindivider kan enkelt kännas igen av en läkare och karakteriseras genom hyperglykemi, försämrad glukostolerans, glykosylerat hemoglobin och, i vissa fall, ketoacidos associ- erad med trauma eller sjukdom.

"Icke insulinberoende diabetes mellitus" eller "NIDDM" hänvi- sar till typ II diabetes. NIDDM-patienter har en abnormt hög blodglukoskoncentration vid fastande och försenat cellulärt upptag av glukos efter måltider eller efter ett diagnostiskt test känt som glukostoleranstestet. NIDDM diagnosticeras på basis av erkända kriterier (American Diabetes Association, Physician's Guide to Insulin-Dependent (Type I) Diabetes, 1988; American Diabetes Association, Physician's Guide to Non-Insulin-Dependent (Type II) Diabetes, 1988).

Symptom och komplikationer med diabetes som ska behandlas som en störning enligt definition häri inkluderar hyperglykemi, otillfredsställande glykemisk kontroll, ketoacidos, insulin- 10 75 20 25 30 26 resistens, förhöjda tillväxthormonnivàer, förhöjda nivåer av glykosylerat hemoglobin. och framskridna glykosyleringsslut- produkter ("advanced glycosylation end-products") (ÅGE)f frambrytningsfenomen, otillfredsställande lipidprofil, vasku- lär sjukdom (t.ex. ateroskleros), mikrovaskulär sjukdom, njurstörningar (t.ex. proliferativ diabetisk retinopati), njurstörningar, neuropati, komplikationer med graviditet (t.ex. för tidig förlossning och födelsedefekter) och liknan- de. Inkluderade i definitionen för behandling är sådana slut- punkter som, exempelvis, ökning i insulinkänslighet, reduk- tion av insulindosering under upprätthållande av glykemisk kontroll, sänkning av HbAlc, förbättrad glykemisk kontroll, minskad vaskulär, renal, neural, retinal och andra diabetiska komplikationer, förebyggande eller reduktion av "frambryt- ningsfenomen", förbättrad lipidprofil, reducerade komplika- tioner vid graviditet och reducerad ketoacidos.

En "terapeutisk komposition" eller "komposition", definieras enligt användningen häri som innefattande Dkk-5 och en farma- ceutiskt acceptabel bärare såsom vatten, mineraler, proteiner och andra konstituentia som är kända för fackmannen på områ- det.

Termen "antikropp" används häri i dess vidaste bemärkelse och täcker specifikt intakta monoklonala antikroppar, polyklonala antikroppar, multispecifika antikroppar (t.ex. bispecifika antikroppar) som bildats från åtminstone två intakta an- tikroppar och antikroppsfragment, under förutsättning att de uppvisar den önskade biologiska aktiviteten som angetts häri, exempelvis, bindning till Dkk-5 i en diagnostisk analys.

Termen "monoklonal antikropp" hänvisar såsom den används häri till en antikropp som erhålles från en population av så gott 70 75 20 25 30 77." 27 som homogena antikroppar, d.v.s. att de enskilda antikroppar- na i populationen är identiska med undantag av möjliga natur- ligt förekommande mutationer som kan finnas närvarande i mindre mängd. Monoklonala antikroppar är starkt specifika, varigenom de är riktade mot ett enda antigenställe. Vidare gäller, i motsats till polyklonala antikroppspreparat som inkluderar olika antikroppar riktade mot olika determinanter (epitoper), att varje monoklonal antikropp är riktad mot en enstaka determinant på antigenet.

Utöver deras specificitet, är de monoklonala antikropparna fördelaktiga i och med att de kan framställas utan att bli kontaminerade av andra antikroppar. Modifieraren "monoklonal" indikerar karaktären av antikroppen såsom erhållen från en huvudsakligen homogen population av antikroppar och skall inte anses kräva produktion av antikroppen genom någon sär- skild metod. De monoklonala antikropparna som skall användas i enlighet med föreliggande uppfinning kan exempelvis fram- ställas genom den hybridommetod som först beskrevs av Kohler och Milstein, Nature 256:495 (1975), eller kan framställas genom rekombinanta DNA-metoder (t.ex. US-A-4816567). De "mo- noklonala antikropparna" kan också isoleras från fagantik- roppsbibliotek med användning av de tekniker som beskrivs i Nature 352:624-628 (1991) 222:58l-597 Clackson et al., och Marks et al., J. Mol. Biol. (1991), exempelvis.

De monoklonala antikroppar som specificeras häri inkluderar "chimera" antikroppar i vilka en del av den tunga och/eller lätta kedjan är identisk med eller homolog till motsvarande sekvenser i antikroppar härledda från en specifik art eller som hör till en specifik antikroppsgrupp eller undergrupp, allt medan återstoden av kedjan (kedjorna) är identisk med eller homolog till motsvarande sekvenser i antikroppar här- 70 15 20 25 30 775 28 ledda från en annan art eller som hör till en annan anti- kroppsgrupp eller -undergrupp, likaväl som fragment av sådana antikroppar, under förutsättning att de uppvisar den önskade biologiska aktiviteten enligt notering häri (US-A-4816567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8l:685l-6855 (1984)). Chimera antikroppar av intresse häri inkluderar "primatiserade" antikroppar innefattande varierbara domänan- tigenbindande sekvenser härledda från en icke human primat (t.ex. Old World Monkey, apa, o.s.v.) och humana konstanta regionsekvenser.

"Antikroppsfragment" innefattar en del av en intakt anti- kropp, företrädesvis innefattande den antigenbindande eller variabla regionen därav. Exempel på antikroppsfragment inklu- derar Fab, Fabfl F(abW2 och Fv-fragment; diakroppar; linjära antikroppar; enkelkedjiga antikroppsmolekyler; och multispe- cifika antikroppar formade från antikroppsfragment.

En "intakt" antikropp är en som innefattar en antigenbindande (Cfl De konstanta variabel region samt en lättkedjig konstant domän och tungkedjiga konstanta domäner (CH1, CH2 och CH3). domänerna kan vara nativsekvenskonstanta domäner (t.ex. huma- na nativsekvenskonstanta domäner) eller en aminosyrasekvens- variant därav.

Termen "prov", hänvisar såsom den används häri, till ett biologiskt prov innehållande eller som ndsstänks innehålla Dkk-5. Detta prov kan komma från vilken källa som helst, företrädesvis ett däggdjur och mer företrädesvis en människa.

Sådana prover inkluderar vattenhaltiga vätskor, plasma, såsom serum, lymfvätska, helblod, ledvätska, follikulär vätska, sädesväts- ka, mjölk, urin, cerebrospinalvätska, saliv, slem, 70 75 20 25 30 r v: ? Y., *Q *J QW 29 tårar, svett, mukus, vävnadskulturmedium, vävnadsextrakt och cellulära extrakt.

Ett "insulinresistensbehandlande medel" eller "hypoglykemime- del" är ett medel som skiljer (som används utbytbart häri) sig fràn Dkk-5 som används för att behandla en insulinresi- stensstörning, såsom, t.ex., insulin (en eller flera olika insulinsorter), insulinhärmande medel, såsom insulin av liten molekyl, t.ex. L-783,28l, insulinanaloger (t.ex. Lyspro“” (Eli Lilly Co.), Lysßæinsulin, Proæ9insulin eller Aspæsinsulin eller de som. beskrivs i, exempelvis, US-A-5149777 och - 5514646) eller fysiologiskt aktiva fragment därav, insulinbe- släktade peptider (C-peptid, GLP-l, IGF-I eller IGF-I/IGFBP- 3-komplex) eller analoger eller fragment därav, ergoset, pramlintid, leptin, BAY-27-9955, T-1095, antagonister till insulinreceptortyrosinkinashämmare, antagonister till TNF-d- funktion, ett tillväxthormonfrisättande medel, amylin eller antikroppar till amylin, en insulinsensibiliserare såsom föreningar ur glitazongruppen, inkluderande de som beskrivs i US-A-5753681, såsom troglitazon, pioglitazon, englitazon och besläktade föreningar, (US-A-6187333) Linalol““ ensamt eller med vitamin E och insulinutsöndringsförstärkare, sàsonl na- teglinid (AY-4166), kalcium-(23)-2-bensyl-3-(cis-hexahydro-2- isoindolinyl-karbonyl)propionatdihydrat KAD~ 1229), acetohexamid, (mitiglinid repaglinid och sulfonylurealäkemedel, exempelvis, klorpropamid, tolazamid, tolbutamid, glyklopy- ramid och dess ammoniumsalt, glibenklamid, glibornurid, glik- lazid, l-butyl-3-metanilylurea, karbutamid, glipizid, gliki- don, glisoxepid, glybutiazol, glibuzol, glyhexamid, glymidin, glypinamid, fenbutamid, tolcyklamid, glimepirid, o.s.v., samt biguanider (såsom fenformin, metformin, buformin o.s.v.) och a-glukosidashämmare, såsom askarbos, voglibos, miglitol, 10 75 20 25 30 30 emiglitat, o.s.v.) och sådana icke typiska behandlingar som bukspottkörteltransplantation eller autoimmuna reagenser. till vilken som Enligt användningen häri hänvisar "insulin" helst eller alla insulinverkan och substanser som har en exemplifieras med, exempelvis, djurinsulin extraherat från bovin bukspottkörtel eller grisbukspottkörtel, semisyntetise- rat humant insulin som syntetiserats enzymatiskt från insulin extraherat från grisbukspottkörtel och humant insulin synte- tiserat genom genetiska tekniker typiskt med användning av E. coli eller jästsocker, o.s.v. Vidare kan insulin inkludera insulin-zinkkomplex innehållande omkring 0,45 till 0,9 vikt- procent zink, protamin-insulin-zink producerat ur zinkklorid, Insulin kan vara i formen INS-1. såsom L8328l och protaminsulfat och insulin o.s.v. av dess Insulin kan fragment eller derivat, t.ex., också inkludera insulinliknande substanser, insulinagonister. Medan insulin finns tillgängligt i en mängd typer, kande, såsom supersnabbverkande, snabbverkande, bimodalver- mellanproduktsverkande, làngtidsverkande, o.s.v., kan dessa typer lämpligen väljas i enlighet med patientens till- stånd.

Enligt användningen häri hänvisar termen "transgen" till en nukleinsyrasekvens som är delvis eller fullständigt hetero- log, d.v.s., främmande, för det transgena djur in i vilket det införs, eller är homolog till en endogen gen i det trans- gena djuret in i vilket den införs, men som är utformad för att infogas, eller infogas, in i djurets genom på ett sådant sätt att den förändrar genomet i cellen in i vilken den info- gas (t.ex. infogas den vid en belägenhet som skiljer sig från densamma för den naturliga genen). En transgen kan bli opera- belt kopplad till en eller flera transkriptionsreglerande sekvenser och någon eventuell annan nukleinsyra, såsom in- 10 15 20 25 30 rgï ,,3 Cï: \Q *Q U? 31 tron, som kan vara nödvändiga för optimal uttrYCknín9 ÛV en utvald nukleinsyra. Transgenen häri benämns Dkk-5.

De "transgena icke-humana djuren" häri inkluderar alla i ett flertal av som sina celler den Dkk-5-kodande transgenenf förändrar fenotypen för värdcellen med avseende på glukoscle- arance i blodet.

"Isolerad" betyder, vid användning för att beskriva de olika polypeptiderna och proteinfragmenten häri, en polypeptid eller ett protein som har identifierats och separerats och/- eller utvunnits från en komponent ur dess naturliga miljö.

Kontaminerande komponenter ur dess naturliga miljö är materi- al som typiskt skulle störa diagnostiska eller terapeutiska användningar av polypeptiden eller proteinet och kan inklude- ra enzymer, hormoner och andra proteinartade eller icke pro- kommer teinartade lösta ämnen. I föredragna utföringsformer, polypeptiden att renas (1) i en grad som är tillräcklig för att erhålla åtminstone 15 rester av N-terminal eller intern aminosyrasekvens genom användning av en sekvensator med ro- terande kopp, eller (2) till ett homogent tillstånd genom SDS-PAGE vid icke-reducerande eller reducerande betingelser med användning av Coomassie blue eller, företrädesvis silver- färgning. Isolerad polypeptid inkluderar polypeptid in situ inuti rekombinanta celler, eftersom åtminstone en komponent av Dkk-lzs naturliga miljö inte kommer att vara närvarande.

Vanligen kommer, emellertid, isolerad polypeptid att beredas genom åtminstone ett reningssteg.

Sätt för att utföra uppfinningen Pà basis av upptäckten häri angáende verkningarna av Dkk-5 på L6-muskelceller och andra värden, uppenbaras nya metoder för att diagnosticera och behandla en insulinresistensstörning 70 75 20 25 30 fr) t: s: NMJ _. l 32 med användning av Dkk-5. Därför tillhandahåller föreliggande uppfinning metoder som är användbara i ett antal diagnostiska och terapeutiska situationer in vitro och in vivo.

Terapeutisk användning Dkk-5 administreras till däggdjur genom någon användbar väg, men (IM), inkluderande en parenteral väg för administering såsom, (IV), intramuskulära (IP) inte begränsat till, intravenösa subkutana (SC) och intraperitoneala likaväl som trans- dermala, bukala, sublinguala, intrarektala, intranasala och IV-, IM-, SC- vara genom piller eller infusion och i fallet med SC också inhalerande vägar. och IP-administrering kan genom implanterbara anordningar med långsam frisättning, inkluderande, men inte begränsat till pumpar, formuleringar med långsam frisättning och mekaniska anordningar. Företrä- desvis är administeringen systemisk och en sänkning i insu- linresistens manifesteras som en1 nedgång i. de cirkulerande nivåerna av glukos och/eller insulin i patienten.

En särskilt föredragen metod för administrering av Dkk-5 är genom subkutan infusion, särskilt med användning av en grade- rad infusionsanordning, såsom en pump. En sådan pump kan vara återanvändningsbar eller av engångstyp och vara implanterbar eller möjlig att anordna externt. Medicineringsinfusionspum- par som på användbart sätt utnyttjas för detta syfte inklude- rar, exempelvis, i US-A-5637095; -5569186 de pumpar -5527307. som. uppenbaras och Kompositionerna kan administreras kontinuerligt från sådana anordningar, eller med avbrott.

Terapeutiska formuleringar av Dkk-5 som lämpar sig för lag- ring inkluderar blandningar av proteinet som har den önskade graden av renhet med farmaceutiskt acceptabla bärare, konsti- tuentia eller stabiliseringsmedel (Remington's Pharmaceutical 10 75 20 25 30 775 33 Osol, A., (1980)) i form av frys- torkade formuleringar eller vattenhaltiga lösningar.

Sciences, l6:e uppl., red.

Accep- tabla bärare, konstituentia eller stabiliseringsmedel är icke toxiska för mottagarna i de doser och koncentrationer som används och inkluderar* buffertar, såsom fosfat, citrat och andra organiska syror; antioxidanter inkluderande askorbinsy- (såsom oktadecyldimetyl- ra och metionin; konserveringsmedel hexametoniumklorid; bensalkoniumklorid, alkyl- bensylammoniumklorid; bensetoniumklorid; fenol, butyl- eller bensylalkohol; parabener, såsom metyl- eller propylparaben; katechol; resor- cinol; cyklohexanol; 3-pentanol; och m-kresol); polypeptider med låg molekylvikt (mindre än omkring 10 rester); proteiner, såsom serumalbumin, gelatin eller immunglobuliner; hydrofila polymerer, såsom polyvinylpyrrolidon; aminosyror, såsom gly- cin, glutamin, asparagin, histidin, arginin eller lysin; monosackarider, disackarider och andra kolhydrater inklude- rande glukos, mannos eller dextriner; SåSOm EDTA; kelateringsmedel, sockerarter, såsom sackaros, mannitol, trehalos eller sorbitol; saltbildande motjoner, såsom natrium; metallkOmpleX (t.ex. Zn-proteinkomplex); och/eller nonjoniska ytaktiva ämnen, såsom Tweennh Pluronicsnd eller polyetylenglykol (PEG). Föredragna lyofiliserade Dkk-5-formuleringar beskrivs i WO 97/04801. Dessa kompositioner innefattar Dkk-5 inne- hållande från omkring 0,1 till 90 viktprocent av det aktiva Dkk-5, företrädesvis i en löslig form och mer allmänt från omkring 10 till 30 viktprocent.

De aktiva beståndsdelarna kan också vara infångade i mikro- kapslar som beretts, exempelvis, genom koacervationstekniker eller genom gränsytepolymerisation, exempelvis, hydroximetyl- cellulosa- eller gelatinmikrokapslar respektive poly-(metyl- metakrylat)mikrokapslar, i kolloidala läkemedelsavgivningssy- stem (exempelvis, liposomer, albuminmikrosfärer, mikroemul- 10 75 2D 25 30 TÛQ info 34 eller i makroemulsio- sioner, nanopartiklar och nanokapslar) ner. Sådana tekniker uppenbaras i Remington's PharmaCeutiC&l Sciences, ovan.

Det Dkk-5 som uppenbaras häri kan också formuleras som immu- noliposomer. Liposomer innehållande Dkk-5 bereds genom meto- der som är kända inom området, såsom beskrivs i Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985): Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:403O (l980); US-A-4485045 och -4544545; och, WO 97/38731 publicerad 1997-10-23. Liposomer med förlängd cirkulationstid uppenbaras i US-A-5013556.

Särskilt användbara liposomer kan genereras genom indunst- ningsmetoden med omvänd fas med en lipidkomposition innefat- tande fosfatidylkolin, kolesterol och PEG-derivatiserad fos- fatidyletanolamin (PEG-PE). Liposomer strängsprutas genom filter med definierad porstorlek till att ge liposomer med den önskade diametern.

Preparat med utdragen frisättning kan beredas. Lämpliga exem- pel på preparat med utdragen frisättning inkluderar semiper- meabla matriser av fasta hydrofoba polymerer innehållande Dkk-5, vilka matriser är i formen av formade artiklar, t.ex., filmer eller mikrokapslar. Exempel på matriser med utdragen frisättning inkluderar polyestrar, hydrogeler (exempelvis, poly(2-hydroxietylmetakrylat), (US-A-3773919), eller poly(vinylalkohol)), P0lylaktider sampolymerer av L-glutaminsyra och y-etyl-L-glutamat, icke nedbrytningsbart etylen- vinylacetat, nedbrytningsbara mjölksyra- glykolsyrasampolymerer, såsom Lupron Depofm (injicerbara mikrosfärer sammansatta av mjölksyra-glykolsyrasampolymerer och leuprolidacetat) och poly-D- (-)-3-hydroxismörsyra. 70 75 20 25 30 (fl m; *CO 35 Dkk-5 kan sammanfogas med ett bärarprotein för att öka dess halveringstid i serum. De formuleringar som skall användas för administrering in vivo måste vara sterila. Detta åstad- kommes enkelt genom filtrering genom sterilfiltreringsmem- bran.

Formuleringen häri kan också innehålla mer än en aktiv före- ning enligt vad som krävs för den specifika indikation som behandlas, företrädesvis sådana med komplementära aktiviteter som inte negativt påverkar varandra. En sådan aktiv förening kan också administreras separat till det däggdjur som behand- las.

Sådana andra läkemedel kan administreras, genom en väg och i, en mängd som vanligen används därför, samtidigt med eller sekventiellt med Dkk-5. Då Dkk-5 används samtidigt med ett eller flera andra läkemedel, föredras en farmaceutisk enhetsdosform innehållande sådana andra läkemedel utöver Dkk- 5. De farmaceutiska kompositionerna enligt föreliggande upp- finning inkluderar följaktligen sådana som också innehåller Dkk-5. en eller flera andra aktiva beståndsdelar, utöver Exempel på insulinresistensbehandlande medel eller hypoglyke- mimedel som kan kombineras med Dkk-5, antingen administrerade separat eller i samma farmaceutiska kompositioner, inklude- rar, men är inte begränsade till: (a) insulinsensibiliseringsmedel inkluderande (i) PPAR-y- agonister, såsom glitazonerna (t.ex. inkluderande de som beskrivs i US-A-5753681, såsom troglitazon (Noscal eller Resiline), pioglitazon HCL, englitazon, MCC-555, BRL-49653, ALRT 268, LGD 1069, krompikolinat DIAB Il““ (V-411) eller Glucanin“4 och liknande) 97/27857, WO 97/28115, biguanider, och föreningar som uppenbaras i WO WO 97/28137 och WO 97/27847 och såsom metformin och fenformin; (ii) (b) insulin (ett eller flera olika insuliner), insulinhärman- de medel, såsom ett insulin med liten molekyl, t.ex., L- 70 15 20 25 30 (Ü y w LJ *J “J w] 36 783,281, insulinanaloger (t.ex. Lyspronl (Eli Lilly CO-)f Lysmsinsulin, Prowginsulin eller Aspßæinsulin eller de Som us-A-5149777 och -551464m eller insulinbesläktade pepti- beskrivs i, exempelvis, fysiologiskt aktiva fragment därav, der (C-peptid, GLP-l, IGF-I eller IGF-I/IGFBP-3-komplex) eller analoger eller fragment därav; (c) sulfonylureor, såsom acetohexamid, klorpropanid, tolaza- mid, tolbutamid, glibenklamid, glibornurid, gliklazid, glipi- zid, glikidon och glymidin; (d) d-glykosidashämmare (såsom akarbos); (e) kolesterolsänkande medel såsom (i) HMG-CoA-reduktas- hämmare (lovastatin, simvastatin och pravastatin, fluvasta- tin, atorvastatin och andra statiner), (ii) komplexbildare (kolestyramin, kolestipol och ett dialkylaminoalkylderivat av tvärbundet dextran), (iii) nikotinylalkoholnikotinsyra eller ett salt därav, (iv) proliferator~aktivatorreceptor-d- agonister, såsom fenofibrinsyraderivat (gemfibrozil, klofib- rat, fenofibrat och bensafibrat), (v) hämmare av kolesterol- absorption, exempelvis, ß-sitosterol och (acyl- CoA:kolesterolacyltransferas) hämmare, exempelvis, melinamid, (vi) probukol, (vii) vitamin E och (viii) tyrohärmande medel; (f) PPAR-ö-agonister såsom de som uppenbaras i WO 97/28149; (9) föreningar mot övervikt, såsom fenfluramin, dexfenflura- min, fentermin, sibutramin, orlistat och andra Bg-adrenerga receptoragonister; (h) medel som nwdifierar ätbeteendet, såsom neuropeptid Y- antagonister (t.ex. neuropeptid Y5), exempelvis, de som up- penbaras i WO 97/19682, WO 97/20820, WO 97/20821, WO 97/20822 och WO 97/20823; (i) PPAR-a-agonister, såsom de som beskrivs i WO 97/36579; (j) PPAR-y-antagonister, såsom de som beskrivs i WO 97/10813; 70 15 20 25 30 tfš š\§ ÛÛ \n »z CW 37 (k) serotoninåterupptagningshämmare såsom fluoxetin och ser- tralin; (l) ett eller flera insulinsensibliseringsmedel tillsammans med ett eller flera av ett oralt intaget insulin, ett injice- rat insulin, ett sulfonylurea, en biguanid eller en a- glukosidashämmare såsom beskrivits i US-A-6291495; (m) autoimmunreagenser; (n) antagonister mot insulinreceptortyrosinkinashämmare (US- A-5939269 och -5939269); (O) IGF-I/IGFBP-3-komplex (US-A-604029217 (US-A-60l5558); (US-A-5939387)7 (r) antikroppar till amylin (US-A-5942227). (p) antagonister till TNF-a-funktion (q) tillväxthormonfrisättande medel OCh Andra medel specificeras i definitionen ovan och är kända för fackmannen på området.

Sådana ytterligare molekyler är lämpligen närvarande eller administreras i kombination i mängder som är effektiva för det avsedda syftet, typiskt mindre än vad som används om de administreras ensamma utan Dkk-5. Om de formuleras tillsam- mans, kan de vara formulerade i mängder bestämda enligt, exempelvis, individen, åldern och kroppsvikten hos individen, rådande klinisk status, administreringstid, dosform, admini- streringsmetod o.s.v. Exempelvis används ett medföljande läkemedel företrädesvis i en andel av' omkring 0,000l till 10 000 viktdelar i förhållande till 1 viktdel av närvarande Dkk-5.

Hypoglykemimedlet administreras till däggdjuret genom någon lämplig teknik inkluderande den parenterala, intranasala, orala vägen eller genom någon annan effektiv väg. Mest före- trädesvis sker administreringen genom injektion (vad gäller 70 75 20 25 30 775 38 insulin) eller genom den orala vägen. Exempelvis är Microna- sem-tabletter (glyburid), som marknadsförs av Upjohn i ta- blettkoncentrationer om 1,25, 2,5 och 5 mg, lämpliga för Oral administrering. Den vanliga uppehâllsdosen för typ II diabe- tespatienter, som får denna terapi, är i allmänhet inom områ- det av från omkring 1,25 till 20 mg per dag, som kan ges som en enstaka dos eller delas upp över dagen allt efter vad Som bedöms vara lämpligt 2553'2565 (1995)). Andra (Physician's Desk Reference, exempel på glyburidbaserade tabletter som finns tillgängliga för förskrivning inkluderar GlynaseTM- märkesläkemedlet (Upjohn) och Diabetanhflärkesläkemedlet (Ho- echst-Roussel). Glucotrolnfl är handelsnamnet för en (Pratt) glipizid (1-cyklohexyl-3-[p-[2-(5-metylpyraZinkarbOXamid)t ety1]feny1]su1fony1urea) tablett i styrkor av både 5 och 10 mg och förskrivs också till typ II diabetespatienter som kräver hypoglykemiterapi efter dietkontroll eller för patien- ter som har upphört att svara på andra sulfonylureor (Physi- cian's Desk Reference, 1902-1903 (1995)).

Användning av Dkk-5 i kombination med insulin möjliggör re- duktion av dosen av insulin jämfört med dosen vid tiden för administrering av insulin ensamt. Därför är risken för blod- kärlskomplikation och hypoglykemiinduktion, vilka båda kan vara problem som àtföljer stora mängder av administrerat insulin, låg. För administrering av insulin till en vuxen diabetespatient (kroppsvikt omkring 50 kg), är, 10 till 100 U exempelvis, dosen per dag vanligen omkring ("UnitS"), (enheter) företrädesvis omkring 10 till 80 U, men kan vara lägre enligt bestämning av läkaren. För administrering av insulinutsöndringsförstärkningsmedel till samma typ av pati- ent är dosen per dag, tili 1000 mg, exempelvis, företrädesvis omkring 0,1 mer företrädesvis omkring 1 till 100 mg. För 70 75 20 25 30 å: i? 8 775 39 administrering av biguanider till samma typ av patient, är dosen per dag, exempelvis, omkring 10 till 2500 mg, mer före- trädesvis omkring 100 till 1000 mg. För administrering av a- glukosidashämmare till samma typ av patient är dosen per dag, exempelvis, företrädesvis omkring 0,1 till 400 mg, mer före- trädesvis omkring 0,6 till 300 mg. Administrering av ergoset, BAY-27-9955 T-1095 till patienter kan utföras vid en dos av företrädesvis omkring 0,1 till 2500 mg, eller sådana pramlintid, leptin, mer företrädesvis omkring 0,5 till 1000 mg.

Alla ovanstående doser kan administreras en gång till flera gånger per dag.

Dkk-5 kan också administreras tillsammans med en lämplig behandling utan läkemedel för en insulinresistensstörning, såsom en bukspottkörteltransplantation.

De doser av Dkk-5 som administreras till ett insulinresistent däggdjur kommer att bestämmas av läkaren i ljuset av relevan- ta omständigheter, inkluderande tillstàndet för däggdjuret och den valda administreringsvägen. De dosområden som presen- teras häri är inte avsedda att begränsa uppfinningens omfatt- ning på något sätt. En "terapeutiskt effektiv" mängd för syften häri bestäms av de ovanstående faktorerna, men är i allmänhet omkring 0,01 till 100 mg/kg kroppsvikt/dag. Den föredragna dosen är omkring 0,1-50 mg/kg/dag, mer företrädes- vis omkring 0,1 till 25 ng/kg/dag. Ännu mer företrädesvis gäller, då Dkk-5 administreras dagligen, att den intravenösa eller intramuskulära dosen för en människa är omkring 0,3 till 10 mg/kg kroppsvikt per dag, mer företrädesvis, omkring 0,5 till 5 mg/kg. För subkutan administrering är dosen före- trädesvis större än den terapeutiskt ekvivalenta dos som ges intravenöst eller intramuskulärt. Företrädesvis är den dagli- 10 75 20 25 30 40 ga subkutana dosen för en människa omkring 0,3 till 20 mg/kg, mer företrädesvis omkring 0,5 till 5 mg/kg.

UPP" vilka Uppfinningen överväger en mängd olika doseringsscheman. finningen omfattar kontinuerliga doseringsscheman, i Dkk-5 administreras regelbundet (dagligen, varje vecka eller mànatligen, beroende på dosen och dosformen) utan anmärk- ningsvärda avbrott. Föredragna kontinuerliga doseringsscheman inkluderar daglig kontinuerlig infusion, där Dkk-5 infunderas varje dag och kontinuerliga bolusadministreringsscheman, där Dkk-5 administreras åtminstone en gång per dag genom bolusin- jektion eller eller intranasala vägar. genom inhalerande Uppfinningen omfattar också diskontinuerlig (t.ex. intermit- tenta och uppehàllande) doseringsscheman. De exakta paramet- rarna för sådana diskontinuerliga administreringsscheman kommer att variera allt efter formulering, avgivningsmetod och kliniska behov för det däggdjur som behandlas. Exempelvis gäller att om Dkk-5 administreras genom infusion, kan admini- streringsscheman innefatta en första period av administrering följt av en andra period i vilken Dkk-5 inte administreras, som är längre än, likvärdig med eller kortare än den första perioden.

Då administreringen sker genom bolusinjektion, särskilt bo- lusinjektion med en formulering med långsam frisättning, kan doseringsscheman också vara kontinuerliga på så sätt att Dkk- 5 administreras varje dag, eller vara diskontinuerliga, med första och andra perioder o.s.v. enligt beskrivning ovan.

Kontinuerliga och diskontinuerliga administreringsscheman genom vilken metod som helst inkluderar också doseringssche~ man i vilka dosen modifieras under den första perioden, så att, exempelvis, i början av den första perioden är dosen låg W 15 20 25 30 (J: I* u: CÛ s-:e »a UW 41 och ökas fram till slutet av den första perioden, dosen är initialt hög och minskas under den första perioden, dosen är initialt låg, ökas till en toppnivå, varefter den minskas mot slutet av den första perioden och vilken kombination som helst därav.

Effekterna av administrering av Dkk-5 kan mätas genom. en mängd analyser som är kända inom området. Vanligast är att lindring av effekterna av diabetes kommer att resultera i förbättrad glykemikontroll (enligt mätning med tester i serie av blodglukos), hålla reduktion i kravet på insulin för att uppe- god glykemikontroll, reduktion i seruminsulinivåer, reduktion i. blodnivàer (ÅGE), reduktion i. glykosylerat hemoglobin, av' avancerade glykosyleringsslutprodukter reducerade reducerad ketoacidos och förbättrad "frambrytningsfenomen", lipidprofil. Alternativt kan administrering av Dkk-5 resulte- ra i en stabilisering av symptomen av diabetes, som indikeras genom reduktion av blodglukosnivåer, reducerat insulinbehov, reducerade seruminsulinnivâer, reducerat glykosylerat hemo- globin och blod-AGE, reducerade vaskulära, renala, neurala och retinala komplikationer, reducerade komplikationer vid graviditet och förbättrad lipidprofil.

Den blodsockersänkande effekten av Dkk-5 kan utvärderas genom bestämning av koncentrationen av glukos eller Hb (hemoglobin) AR i venöst blodplasma hos individen innan och efter admini- strering och efterföljande jämförelse av den erhållna kon- centrationen innan administrering och efter administrering.

HbAm betyder glykosylerat hemoglobin, och produceras löpande som svar på blodglukoskoncentration. Därför tros-HbAM viktigt som ett index för blodsockerkontroll som inte så lätt Vêfê påverkas av snabba blodsockerförändringar i. diabetespatien- ter. 10 15 20 25 30 42 Uppfinningen tillhandahåller också kit för behandlingen av en insulinresistensstörning. Uppfinningens kit innefattar en eller flera behållare för Dkk-5 i en förbestämd mängd i kom- bination med en uppsättning av instruktioner, i allmänhet skrivna instruktioner, avseende användningen och doseringen av Dkk-5 för behandlingen av en insulinresistensstörning företrädesvis diabetes. De instruktioner som inkluderas med detta kit inkluderar i allmänhet information vad gäller dose- ring, doseringsschema och administreringsväg för behandlingen av insulinresistensstörningen. Behållarna för Dkk-5 kan vara enhetsdoser, bulkförpackningar (t.ex. multidosförpackningar) eller subenhetsdoser.

Dkk-5 kan vara förpackat i någon lämplig, passande förpack- ning. Exempelvis gäller att om Dkk-5 är en frystorkad formu- lering, används normalt en ampull eller vial med en elastisk propp som behållare, varigenom läkemedlet enkelt kan rekons- titueras genom injicering av vätska genom den elastiska prop- pen. Ampuller med icke elastiska, avtagningsbara förslutning- ar (t.ex. förslutet glas) eller elastiska proppar används mest lämpligen för injicerbara former av Dkk-5. I detta fall specificerar instruktionerna företrädesvis placering av inne- hållet i vialen i en nål för omedelbar injektion. Förpack- ningar för användning i kombination med en specifik anordning övervägs också, såsom en inhalator, en anordning för nasal administrering (t.ex. eller en infusionsan- en nebulisator), ordning, såsom en minipump.

Kitet kan också innefatta en behållare innefattande ett insu- linresistensbehandlande medel i en förbestämd mängd. 70 75 20 25 30 43 Diagnostisk användning att ett Många olika analyser och analysformat kan användas för detektera mängden av Dkk-5 i ett prov i förhållandet till kontrollprov. Dessa format är, i sin tur, användbara Vid diagnosanalyser av föreliggande uppfinning, som används för att detektera närvaron eller påbörjan av en insulinresistens- störning i ett däggdjur.

Vilken procedur som helst som är känd inom omrâdet för märk- ningen av lösliga analyter kan användas vid utövandet av föreliggande uppfinning. Sådana procedurer inkluderar, men är inte begränsade till, konkurrerande och icke konkurrerande analyssystem som utnyttjar tekniker såsom radioimmunanalys, enzymimmunanalys (EIA), företrädesvis ELISA, "sandwich"- immunanalyser, utfällningsreaktioner, geldiffusionsreaktio- ner, immundiffusionsanalyser, agglutinationsanalyser, komple- fluore- ment-fixeringsanalyser, immunoradiometriska analyser, scerande immunanalyser, protein A-immunanalyser och immun- elektroforetiska analyser. För exempel pà föredragna immuna- nalysemetoder se US-A-4845026 och -5006459.

I en utföringsform används en eller flera anti-Dkk-5-anti- kroppar för att mäta mängden av Dkk-5 i provet. För diagnos- tiska tillämpningar, om en anti-Dkk-5-antikropp används för detektion, kommer antikroppen typiskt att vara märkt med en detekterbar del. Företrädesvis används en sådan antikropp i en immunanalys. är en eller flera I en aspekt av märkning, anti-Dkk-5-antikroppar som används märkta; i en annan aspekt är en första antikropp omärkt och en märkt, andra antikropp används för att detektera det Dkk-5 som finns bundet till den första antikroppen eller används för att detektera den första antikroppen. 70 15 20 25 30 775 44 Flera märken finns tillgängliga, vilka i allmänhet kan grup- peras i följande grupper: (a) Radioisotoper, såsom %S, MC, lßï 3H och lfll finns till- I med Eller kan märkas radioisotopen gängliga. Antikroppen radionukleiden med användning av de tekniker som beskrivs i 1 och 2, 1991) tivitet kan mätas med användning av scintillationsräkning.

Curr. Prot. Immunol., vol. Coligen et al-, fed- (Wiley-Interscience: New York, exempelvis och radioak- (b) Fluorescerande märken, såsom kelat av sällsynta jordarts- metaller (europiumkelat) eller fluorescein och dess derivat derivat, fluo- rodamin och dess o-ftaldehyd, (såsom fluoresceinisotiocyanat), fykoerytrin, fykocyanin, allofykocyanin, reskamin, dansyl, lissamin och Texas Red finns tillgängliga.

De fluorescerande märkena kan exempelvis konjugeras till antikroppar med användning av tekniker som uppenbaras i Curr.

Prot. Immunol., an- ovan. Fluorescens kan kvantifieras med vändning av en fluorimeter. Den detekterande antikroppen kan också märkas på detekterbart sätt med användning av fluore- scensutsöndrande metaller såsom l”Eu eller andra ur lantanid- serien. Dessa metaller kan fästas till antikroppen med an- vändning av sådana metallkelaterande grupper som dietylentri- aminpentaättiksyra (DTPA) (EDTA). eller etylendiamintetraättiksyra (c) Olika enzymsubstratmärken finns tillgängliga för en EIA och US-A-4275149 tillhandahåller en översikt för några av dessa. Enzymet katalyserar i allmänhet en kemisk förändring i det kromogena substratet som kan mätas med användning av olika tekniker. Exempelvis kan enzymet katalysera en färgförändring i ett substrat, som kan mätas spektrofotometriskt. Alterna- tivt kan enzymet förändra fluorescensen, kemiluminescensen eller bioluminescensen hos substratet. Tekniker för kvantifi- ering av en förändring i fluroscens beskrivs ovan. Det kemi- luminescerande substratet blir elektroniskt exciterat genom 10 15 20 25 30 52323 775 45 en kemisk reaktion och kan sedan utsöndra ljus som kan mätas (exempelvis med användning av en kemiluminometer) eller done- ra energi till en fluorescerande acceptor. Exempel på enzyma- inkluderar luciferas (t.ex. eldflugeluciferas US-A-4737456), 2,3-dihydroftalazindioner, malatdehydrogenas, (HRPO), alkaliskt fosfa- tiska märken och bakteriellt luciferas; luciferiflf äkveo' fin, ureas, ett peroxidas såsom pepparrotsperoxidas tas, ß-galaktosidas, lysozym, saCkaridOXidâS@I jästalkoholdehydrogenas, glukoamylas, (t.ex. glukosoxidas, galaktosoxidas, a-glycerofosfatdehydrogenas och glukos-6-fosfatdehydrogenas), staffylokocknukleas, 5-V-steroidisomeras, triosfosfatisome- ras, asparaginas, ribonukleas, ureas, katalas, acetylkolines- teras, heterocykliska oxidaser (såsom urikas och xantinox- idas), laktoperoxidas, mikroperoxidas och liknande. Tekniker för att konjugera enzymer till antikroppar beskrivs i O'Sul- livan et al., Meth.

Langone och Van Vunakis (1981). red. 73:l47-166 Enzymol., (Academic Press, New York) Exempel på enzymsubstratkombinationer inkluderar: (i) pepparrotsperoxidas (HRPO) med väteperoxidas som ett substrat, vari vateperoxidaset oxiderar en färgämnesprekursor (t.ex. ortofenylendiamin (OPD) eller 3,?,5,5¥tetrametyl- bensidinhydroklorid (TMB)); (ii) alkaliskt fosfatas (AP) med. para-nitrofenylfosfat som kromogent substrat; och (iii) ß-D-galaktosidas (B-D-Gal) med ett kromogent substrat (t.ex. p-nitrofenyl-B-D-galaktosidas) eller fluorogent sub- strat 4-metylumbelliferyl-ß-D-galaktosidas.

Flera andra enzymsubstratskombinationer finns tillgängliga för fackmannen på omrâdet. För en allmän översikt av dessa, se US-A-4275149 och -4318980. 10 75 20 25 30 77.5 46 Ibland är märket indirekt konjugerat med antikroppen. Den skicklige fackmannen kommer att vara medveten om olika tekni- ker för att uppnå detta. Exempelvis kan antikroppen konjuge- ras med biotin och någon av den stora mängden av märken som nämnts ovan kan konjugeras med avidin eller vice versa. Bio- tin binder selektivt till avidin och således kan märket kon- jugeras med antikroppen på detta indirekta sätt.

För att uppnå indirekt konjugation av märket med antikroppen, konjugeras, alternativt, antikroppen med en liten hapten (t.ex. digoxin) och en av de olika typer av märken som nämnts ovan konjugeras med en anti-haptenantikropp (t.ex. anti- digoxinantikrøpp). Således kan indirekt konjugation av märket med antikroppen åstadkommas.

I en annan utföringsform av uppfinningen, behöver anti-Dkk-5- antikroppen inte märkas och närvaron därav kan detekteras med användning av en märkt antikropp som binder till Dkk-5-anti- kroppen.

Antikropparna enligt föreliggande uppfinning kan användas i vilken känd analysmetod som helst, såsom konkurrerande bind- ningsanalyser, direkta och indirekta sandwichanalyser och immunutfällningsanalyser. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, sid. 147-158 (CRC Press, Inc., 1987).

I föreliggande uppfinnings analyser är antigenet Dkk-5 eller antikroppar därtill företrädesvis bundna till ett underlag eller en bärare av fast fas. Med fast fas" "underlag eller bärare av avses vilket underlag som helst som har förmågan att binda ett antigen eller antikroppar. eller Välkända underlag bärare, inkluderar glas, polystyren, polypropylen, 10 75 20 25 30 år fe) Cr -4 *J LH 47 polyetylen, dextran, nylon, amyloser, naturliga och modifie- rade cellulosor, polyakrylamider, agaros och. magnetit. Be- skaffenheten på bäraren kan antingen vara löslig i viss ut- sträckning eller olöslig för föreliggande uppfinnings syften.

Underlagsmaterialet kan ha så gott som vilken möjlig struktu- rell konfiguration som helst under förutsättning att den kopplade molekylen har förmågan att binda till ett antigen eller en antikropp. Underlagskonfigurationen kan således vara sfärisk, som på insidesytan som i en pärla, eller cylindrisk, av ett provrör, eller den externa ytan av en stav. Alterna- tivt kan ytan vara plan, sàsom ett ark, testband o.s.v. Före- dragna underlag inkluderar polystyrenpärlor. Fackmännen på området kommer att känna till många andra lämpliga bärare för bindning av antikropp eller antigen, eller kommer kunna sä- kerställa desamma genom användning av rutinmässigt experi- mentarbete.

I en föredragen utföringsform, utförs en antikropp-antigen- antikroppssandwichimmunanalys, d.v.s. antigen detekteras eller mäts genom en metod som innefattar att binda en första antikropp till antigenet och att binda en andra antikropp till antigenet och att detektera eller mäta antigen som immu- nospecifikt bundits av både den första och andra antikroppen.

I en specifik utföringsform är de första och andra antikrop- parna monoklonala antikroppar. I denna utföringsform gäller att om antigenet inte som innehåller repetitiva epitoper känns igen av den monoklonala antikroppen, måste den andra monoklonala antikroppen binda till ett ställe som skiljer sig från detsamma för den första antikroppen (såsom t.ex. reflek- teras genom avsaknaden av konkurrerande hämning mellan de två antikropparna för bindning till antigenet). I en annan speci- fik utföringsfonn är den första eller andra antikroppen en polyklonal antikropp. I ytterligare en annan specifik utfö- 70 75 20 25 30 frn s: ca ~J »i Un 48 ringsform, är både de första och andra antikropparna polyklo- nala antikroppar.

I en föredragen utföringsform, används en "framàtriktad" sandwichimmunenzymanalys, enligt schematisk beskrivning ovan.

Abl) riktad mot Dkk-5 företrädesvis en mikroplat- En antikropp (infàngningsantikropp, fästs till en matris av fast fas, ta. Provet bringas i kontakt med den Abl-belagda matrisen så att eventuellt Dkk-5 i provet till vilket Abl är specifikt binder till den fasta fasen av Abl. Obundna provkomponenter avlägsnas genom tvättning. En enzymkonjugerad andra antikropp Ab2) antigenet binder till det antigen som infångats av Abl och (detektionsantikropp, riktad mot en andra epitop av gör "sandwichen" fullständig. Efter borttagande av obunden Ab2 genom. tvättning, tillsätts ett kromogent substrat för enzymet och en färgad produkt bildas i proportion till mäng- den av enzym närvarande i sandwichen, vilket reflekterar mängden av antigen i provet. Reaktionen avbryts genom till- sats av stopplösning. Färgen mäts som absorbans vid en lämp- lig våglängd med användning av en spektrofotometer. En stan- dardkurva bereds från kända koncentrationer av antigenet, från vilken okända provvärden kan bestämmas.

Andra typer av sandwichanalyser är de så kallade "simultana" och "omvända" analyserna. En simultan analys involverar ett enda inkubationssteg eftersom den antikropp som binds till det fasta underlaget och den märkta antikroppen båda till- sätts till provet som testas samtidigt. nen är fullständig tvättas det fasta underlaget för att av- lägsna resten av provvätska och icke komplexbunden märkt antikropp. Närvaron av märkt antikropp associerad med det fasta underlaget bestäms sedan såsom man skulle göra i en konventionell "framàtriktad" sandwichanalys.

Efter att inkubatio-I 70 75 20 25 30 fi; fi: »a d... 49 I den "omvända" analysen, utnyttjas en stegvis tillsats först av en lösning av märkt antikropp till vätskeprovet följt av tillsatsen av en omärkt antikropp bunden till ett fast under- lag efter en lämplig inkubationsperiod. Efter en andra inku- bation, tvättas den fasta fasen på konventionellt sätt för att befria den från resten av det prov som testats och lös- ningen av oreagerad märkt antikropp. Mängden av märkt anti- kropp som är associerad. med det fasta underlaget bestäms sedan såsom i de "simultana" och "framåtriktade" analyserna.

Kit innefattande en eller flera behållare eller vialer inne- hållande komponenter för att utföra analyserna enligt före- liggande uppfinning ligger också inom omfattningen för upp- finningen. Ett sådant kit är en förpackad kombination av reagenser i bestämda mängder med instruktioner för att utföra den diagnostiska kan ett sådant kit analysen. Exempelvis innefatta en antikropp eller antikroppar, företrädesvis ett par av antikroppar till Dkk-5-antigenet som företrädesvis inte konkurrerar om samma bindningsställe på antigenet. I en specifik utföringsform kan Dkk-5 vara föradsorberat på matri- sen av fast fas. Kitet innehåller företrädesvis de andra nödvändiga tvättningsreagenserna som är kända inom området.

För EIA innehåller kitet det kromogena substratet samt ett reagens för att avbryta den enzymatiska reaktionen då färgut- veckling har skett. Det substrat som inkluderas i kitet är ett som lämpar sig för det enzym som konjugeras till ett av antikroppspreparaten. Dessa är välkända inom området och vissa exemplifieras nedan. Kitet kan eventuellt också inne- fatta en Dkk-5-standard; d.v.s. en mängd av renat Dkk-5 som motsvarar en normal mängd av Dkk-5 i ett standardprov. 70 75 20 25 30 'P75 50 Då antikroppen är märkt med ett enzym, kommer detta kit att inkludera substrat och kofaktorer som krävs av enzymet (t.ex. en substratprekursor som tillhandahåller den detekterbara kromoforen eller fluoroforen). Dessutom kan andra tillsatser buffertar (t.ex. en inkluderas, blockbuffert såsom stabiliseringsmedel, och liknande. De relativa stort för till- eller lysbuffert) mängderna av de olika reagenserna kan variera handahållande av koncentrationer i lösning av reagenserna som huvudsakligen optimerar analysens känslighet. Specifikt kan reagenserna tillhandahållas som torra pulver, vanligen lyofi- liserade, inkluderande konstituentia som vid upplösning kommer att ge en reagenslösning som har den lämpliga koncentrationen.

Screening med användning av transgena djur Transgena icke humana djur som överuttrycker Dkk-5-cDNA i muskelceller kan användas för att genomföra screening på kandidatläkemedel (proteiner, peptider, polypeptider, små molekyler o.s.v.) med avseende på effektiviteten i ökande glukosclearance från blodet, indikerande en behandling för en insulinresistensstörning.

I en utföringsform produceras de transgena djuren genom att införa dkk-5-transgenen in i könslinjen hos det icke humana djuret. Embryonala màlceller vid olika utvecklingsstadier kan användas for att introducera transgenerna. Olika metoder används beroende på utvecklingsstadiet hos den embryonala målcellen. Den specifika linjen (de specifika linjerna) av det djur som används för att utöva uppfinningen väljs med avseende på allmän god hälsa, goda embryoutbyten, god pronuk- leär synlighet i embryot och god reproduktiv form. Dessutom är haplotypen en signifikant faktor. Exempelvis gäller, då transgena möss skall produceras, att stammar såsom C57BL/6- eller FVB-linjer ofta används. Linjen (linjerna) som används 10 75 20 25 30 51 för att utöva denna uppfinning kan i sig själv vara transëena och/eller vara utsatta för knockout (d.v.s. erhållna från djur som har en eller flera gener som delvis eller fullstän- digt är kuvad).

Transgenkonstruktionen kan införas in i ett embryo i enkelt stadium. Zygoten är det bästa målet för mikroinjektion. An- vändningen av zygoter som ett mål för genöverföring har en stor fördel i att i de flesta fallen kommer det injicerade DNA:t att inkorporeras i värdgenen innan den första klyvning- Sci. USA 82:4438-4442 en (Brinster et al., Acad. (1985)).

Proc. Natl.

Följaktligen kommer alla cellerna i. det transgena djuret att ha den inkorporerade transgenen. Detta kommer i allmänhet också att reflekteras i den effektiva överföringen av transgenen till avkomman, eftersom 50 % av könscellerna kommer att härbärgera transgenen.

Normalt gäller att befruktade embryon inkuberas i lämpliga media tills prokärnorna framträder. Vid omkring denna tid, införs den nukleotidsekvens som innefattar transgenen in i hon- eller hanprokärnan. föredras I vissa arter, såsom möss, hanprokärnan. Det exogena genetiska materialet kan tillsättas till han-DNA-komplementet hos zygoten innan den behandlas av äggkärnan eller zygothonprokärnan.

Således kan det exogena genetiska materialet tillsättas till hankomplementet av DNA eller något annat komplement av DNA innan det påverkas av honprokärnan, vilket sker då han- och honprokärnorna är väl separerade och båda är belägna nära cellmembranet. Alternativt skulle det exogena genetiska mate- rialet kunna tillsättas till spermiekärnan efter att den har inducerats till att genomgå dekondensation. Spermier inne- hållande det exogena genetiska materialet kan sedan tillsät- 70 75 20 25 30 if? i Q (LI-Û 52 tas till ägget eller så skulle den dekondenserade spermien kunna tillsättas till ägget med transgenkonstruktionerna som tillsätts så snart som möjligt därefter.

Vilken teknik som helst som möjliggör för tillsatsen av det exogena genetiska materialet in i kärngenetiskt material kan användas under förutsättning att det inte är destruktivt för cellen, det nukleära membranet eller andra existerande cellu- lära eller genetiska strukturer. Introduktion av transgennuk- leotidsekvensen in i embryot kan åstadkommas genom vilket sätt som helst som är känt inom området, såsom, exempelvis, mikroinjektion, elektroporering eller lipofektion. Det exoge- na genetiska materialet infogas företrädesvis in i det kärn- genetiska materialet genom mikroinjektion. Mikroinjektion av celler och cellulära strukturer är känd och används inom området. I musen, när hanprokärnan storleken av ungefär 20 mikrometer i diameter, vilket möjliggör för reproducerbar injektion av 1-2 pl av DNA-lösning. Efter introduktion av den transgena nukleotidsekvensen in i embryot, kan embryot inku- beras in vitro under varierande tidslängder, eller àterim- planteras i surrogatvärden eller bàdadera. Inkubation in vitro till mognad ligger inom denna uppfinnings omfattning.

En vanlig metod är att inkubera embryona in vitro under om- kring 1-7 dagar beroende på arten, och sedan àterimplantera dem in i surrogatvärden.

Antalet kopior av transgenkonstruktionen som tillsätts till zygoten beror på den totala mängden av exogent genetiskt material som tillsätts och kommer att vara den mängd som möjliggör för genetisk transformation att ske. Teoretiskt krävs endast en kopia; emellertid används många kopior, exem- pelvis, lOOO-2O OOO kopior av transgenkonstruktionen, för att garantera att åtminstone en kopia är funktionell. Vad gäller 10 75 20 25 30 53 föreliggande uppfinning, kan det vara en fördel att ha mer än en fungerande kopia av den infogade exogena DNA-sekvensen för att förstärka den fenotypiska uttryckningen därav.

Transgen avkomma från surrogatvärden kan genomgå screening med avseende på närvaron och/eller uttryckning av transgenen genom någon lämplig metod. Screening åstadkommas ofta genom Southern-blott eller Northern-blottanalys, med användning av ett sökfragment som är komplementärt till åtminstone en del av transgenen. Western~blottanalys med användning av en anti- kropp mot det Dkk-5 som kodas av transgenen kan användas som ett alternativ eller en ytterligare metod för screening med avseende på närvaron av transgenprodukten. Typiskt bereds DNA från svansvävnad och analyseras genom Southern-analys eller PCR med avseende på transgenen. Alternativt gäller att de vävnader eller celler som tros uttrycka transgenen vid de högsta nivåerna, testas med avseende på närvaron och uttryck- ningen av transgenen med användning av Southern-analys eller PCR, även fast vilka vävnader eller celltyper som helst kan användas för denna analys.

Alternativa eller ytterligare metoder för utvärdering av närvaron av transgenen inkluderar, utan begränsning, lämpliga biokemiska analyser, såsom enzym~ och/eller immunologiska analyser, histologiska färgningar för specifika markör- eller enzymaktiviteter, flödescytometriska analyser och liknande.

Analys av blodet kan också vara användbar för att detektera närvaron av transgenprodukten i blodet samt för att utvärdera effekten av transgenen på nivåerna av blodbeståndsdelar, såsom glukos.

Avkomma från de transgena djuren kan erhållas genom parning av det transgena djuret med en lämplig partner, eller genom 70 75 20 25 30 54 befruktning in vitro av ägg och/eller sperma erhållet från det transgena djuret. Då parning med en partner skall utfö- ras, kan partnern vara transgen eller inte och/eller en knockout; då den är transgen kan den innehålla samma eller en Alternativt kan partnern vara kan det annan transgen eller bådadera. en föräldralinje. Då befruktning in vitro &nVändS, befruktade embryot implanteras in i. en surrogatvärd eller inkuberas in vitro eller bâdadera. Med användning av endera metoden, kan avkomman utvärderas med avseende på närvaro av transgenen med användning av metoder som. beskrivits ovan, eller andra lämpliga metoder.

De transgena djur som produceras i enlighet med denna uppfin- ning kommer att inkludera exogent genetiskt material, d.v.s., en DNA-sekvens som resulterar i produktionen av Dkk-5. Se- kvensen kommer att vara operabelt fäst till ett transkrip- tionskontrollelement, t.ex., promotor, som företrädesvis möjliggör uttryckningen av transgenproduktionen i en specifik typ av cell. Det mest föredragna sådana kontrollelement häri är en muskelspecifik promotor som möjliggör överuttryckning av Dkk-5-CDNA i muskelvävnad. Ett exempel på en sådan promo- tor är myosinpromotorn med lätt kedja (Shani, Nature 3l4:283- 286 (1985)) "smoothelin" A- eller B- eller den som driver uttryckning, eller liknande sådana promotorer, som exempelvis beskrivs i WO Ol/18048 publicerad 2001-03-15.

Retroviral infektion kan också användas för att införa trans- genen in i ett icke humant djur. Det utvecklande icke humana embryot kan odlas Under in vitro till blastocyststadiet. denna tid kan blastomererna vara mål för retroviral infektion (Jaenich, Natl. Acad. USA 73:l260-1264 (1976)).

Effektiv infektion av blastomererna erhålles genom enzymatisk Proc. Sci, behandling för att avlägsna zona pellucida (Manipulating the 10 75 20 25 30 i . rs co sa sa om 55 (Cold Spring Harbor Laboratory NY 1986)).

Mouse Embryo, Hogan, red.

Press, Cold Spring Harbor, Det virala vektorsystem som används för att införa transgenen är typiskt ett replika- tionsbristfälligt retrovirus som bär på transgenen (Jahner et USA 82:6972-6931 (l985); USA 82:6l48-6152 Nati. sei. Van der Putten et al., (1985)). al., Proc. Acad.

Proc. Natl. Acad. Sci.

Transfektion erhålls enkelt och effektivt genom odling av blastomererna på ett monoskikt av virusproducerande celler (Van der Putten et al., Stewart et al., EMBO J. 6:383-388 (1987)). ovan; Alternativt kan infektion utföras i ett senare skede. Virus eller virusproducerande celler kan inji- ceras in i. blastocoele Nature 298:623-628, 1982)). transgenen, (Jahner et al., De flesta av grundarna kommer att vara mosaiska för eftersom inkorporering sker endast i. en under- grupp av cellerna som bildade det transgena icke humana dju- ret. Vidare kan grundaren innehàlla olika retrovirala infog- ningar av transgenen vid olika positioner i genomet som i allmänhet segregerar in i avkomman. Dessutom) är det också möjligt att införa transgener in i könslinjen genom intraute- rin retroviral infektion av embryot i mitten av havandeskaps- perioden 1982, (Jahner et al., ovan).

En tredje typ av målcell för transgenintroduktion är den embryonala stamcellen (ES). ES-celler erhålls från förimplan- tationsembryon odlade in vitro och sammansmälta med embryon Nature 2922154-156 (1981): Nature 309:255-258 (l984); USA 83:9065-9069 445-448 (1986)).

(Evans et al., Bradley et al., Gossler et al., Proc. Natl. Acad.

Sci. (l986); Robertson et al., Nature 322: Transgener kan effektivt införas in j. ES- celler genom DNA-transfektion eller genom retrovirusförmedlad transöverföring. Sådana transformerade ES-celler kan därefter kombineras med blastocyster från ett icke humant djur. ES- cellerna koloniserar därefter embryot och bidrar till köns- 70 75 20 25 30 Cfäfl \1¿-U 775 56 linjen hos det resulterande chimera djuret. För en ÖVerSikt se Jaenisch, Science 240:l468-1474 (1988).

Kandidatläkemedel genomgår screening med avseende på deras förmåga att behandla en insulinresistensstörning genom att tillhandahålla det till sådana djur (exempelvis genom inhala- tion, ingestion, injektion, implantation o.s.v) i- en mängd som är lämplig för att glukosclearance eller -upptagspotenti- 'upptag skulle indikera läkemedlets förmåga att behandla diabetes och alen skall kunna mätas. Ökad glukosclearance eller andra insulinresistensstörningar_ Genterapi med Dkk-5 Dkk-5 Olika kan användas i genterapi för att behandla diabetes. tillvägagångssätt kan följas, såsom kutan genterapi eller retroviral vektorgenterapi för att korrigera leptinb- rist, som producerar en fenotyp med reducerad adipös vävnad samt medfödd övervikt och diabetes i FASEB J., l5:l529-l538 (2001)). En annan metod för att återupprätta insulinsensitivitet genom och insulinresistens människor (Larcher et al., genterapi är att använda adenovirusförmedlad genterapi enligt beskrivning i Ueki et al., J. Clin. lO5:l437-1445 Invest. (2000). Ytterligare en metod är att använda genterapi för att motverka diabetisk hyperglykemi genom bearbetning av skelett- muskel till att uttrycka Dkk-5-kodande DNA, enligt beskriv- ning av Otaegui et al. Hum. Gene Ther. ll:l543-1552 (2000).

Följande exempel anges för att assistera vid förståelsen av uppfinningen och bör inte, naturligtvis, betraktas såsom specifikt begränsande av uppfinningen som beskrivs och kraven häri. Sådana variationer av uppfinningen som ligger inom räckvidden för fackmannen på området, inkluderande substitu- tion av alla nu kända eller senare utvecklade ekvivalenter, 70 75 20 25 30 (WW oo se w m 57 anses ligga inom uppfinningens omfattning enligt eftêrföljan" de patentkrav. Uppenbarandena och alla citeringar häri är härmed införda genom hänvisning.

Exempel 1: Effekter av Dkk-5 Material och metoder L6-cellodling L6-myoblaster tillväxte i tillväxtmedium, sammansatt av MEM-a (Gibco-BRL) med 10 % fetalt kalvserum. Innan sammanflytning uppnàddes dispergerades cellerna med trypsin och återsåddes i färskt tillväxtmedium. Myoblastfusion inducerades genom för- ändring av mediet till differentieringsmedium vid sammanfly- tande (MEM-a med 2 % fetalt kalvserum). Celler odlades i detta medium under 3-9 dagar och under behandlingar som var Dkk-5 till detta medium. längre än 28 timmar, tillsattes Behandlingar kortare än 28 timmar utfördes i MEM-a med 0,5 % fetalt bovinserum (FBS).

Uttryckning av rekombinant Dkk-5 Den humana homologen av Dkk-5 5 i 2 häri) (hDkk-5) (Se SEQ ID NO: Fig. ler som en C-terminal 8X His-tag-fusion och renades genom 01/40465 och WO Identiteten hos renat protein bekräftades genom N- nickelaffinitetskolonnkromatografi 01/16319).

(WO terminal sekvensanalys. Det renade proteinet hade endotoxin- nivåer av mindre än 0,3 EU/ml.

DOG-upptag Kontrollceller och celler behandlade med Dkk-5 inkuberades i Krebs-Ringers fosfat-HEPES-buffert KCl, 1,3 mM CaClb (KRHB) (130 mM NaCl, 5 mM 1,3 mM MgSO4, 10 mM Na2HPO4 och 25 mM HE- uttrycktes i bakulovirusinfekterade insektscel-» 70 75 20 25 30 (N P3 C13 -J *Q G1 58 PES, pH 7,4) innehållande 0,5 pCi av 2-deoxi[14C]9lUkO5 i närvaro eller frånvaro av 0,5 pM insulin under 20 min vid 37°C. Cellerna tvättades två gånger med KRHB och lyseradeS i 100 mM NaOH och mängden av intracellulär 2-deoxi[MC]glukOS i cellysaten mättes genom flytande scintillation (LSC).

Glykogensyntes som [MC]glukosinkorporering in i glykOqen- Kontroll-L6-celler och celler behandlade med Dkk-5 inkubera- Glykogensyntes des under 2 timmar i serumfritt MEM-d innehållande [Ü'MC]' glukos (5 mM glukos; 1,25 pCi/ml) med eller utan 0,5 uM insu- lin. Experimentet avbröts genom avlägsnande av mediet och snabb tvättning av cellerna tre gånger med iskall PBS och lysering av dem med 20 % (vikt/volym) KOH, som neutralisera- des efter l timme genom tillsats av l M HCl. Lysaten kokades under 5 min och klargjordes genom centrifugering och det cellulära glykogenet i supernatanten utfälldes med isopropa- nol vid 0°C under 2 timmar med användning l mg/ml kallt gly- kogen som en bärare. Det utfällda glykogenet separerades genom centrifugering, tvättades med 70 % etanol och återupp- löstes i vatten och inkorporeringen av [”C]glukos in i glyko- genet bestämdes genom LSC.

Glukosinkorporering in i lipider Kontroll- och behandlade 3T3 L1-adipocyter inkuberades med D- iU-MC]glukos (0,2 pCi/ml) i serumfritt MEM-u, under 2 timmar vid 37°C i närvaro eller frånvaro av 0,5 pM insulin. Cellerna tvättades två gånger med iskall PBS och lyserades i 100 mM NaOH. Lysaten neutraliserades med 100 mM saltsyra. De cellu- lära lipiderna i lysaten extraherades i n-heptan och inkorpo- reringen av ÜÅC]glukos in i. den extraherade lipiden mättes genom flytande scintillationsräkning (LSC). 10 75 20 25 30 L 3"" . : c: »i s: m 59 Kvantitativ realtids-PCR Kvantitativ realtids-PCR (RTQ-PCR) utfördes med användning av ett ABI Prism7700““ sekvensdetekteringssysteminstrument och mjukvara (PE Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) en" ligt beskrivning av Gibson et al., Gen. Res. 6:995-1001 (1996) och Heid et al., Gen. Res. 6:986-994 (1996).

Analys Om inget annat anges presenteras alla värden som medelvärden plus och minus standardavvikelserna. Jämförelser mellan kon- trollceller och behandlade celler och mellan transgena möss och möss av vildtyp gjordes med användning av ett oparat studenternas t-test.

Odling av 3T3/Ll-adipocyter 3T3/Ll-fibroblaster odlades till sammanflytning och differen- till Chem. 253:7570-7578 tierade adipocyter BiOl- (1978)).

(Rubin et al., J.

Differentierade celler behandlades med Dkk-5 72 timmar efter induktionen eller differentieringen.

Djur Alla protokoll skulle godkännas av en "Institutional Use and Care Committee". Om inget annat anges hålls möss på laborato- riekost av standardtyp i, en temperatur- och fuktighetskon- trollerad miljö. (O6.00/18.00) En 12 timmars ljuscykel an- vänds.

Transgena möss Det humana Dkk-5-cDNA:t ligerades 3' till pRK-splitsdonator/- acceptorstället som föregås av myosinpromotorn med lätt kedja (Shani, Nature 3l4:283-286 (1985)). Dkk-5-cDNA:t följdes av splitsdonator/acceptorställena som finns närvarande mellan de 70 75 20 25 30 I”'Ü Ülf &š?Ö 7! Ö 60 fjärde och femte exonerna j. den humana tillväxthormongenen (1992)). Det full- till (Stewart et al., Endocrinology l30:405-414 ständiga uttryckningsfragmentet renades frihet fran kontaminerande vektorsekvenser och injicerades in i encelliga musägg härledda från FVB X FVB-parningar. Transgena möss identifierades genom PCR-analys av DNA extraherat från svans- biopsier.

Resultat Dkk-5 är ett utsöndrat protein som är starkt besläktat med Dickkopf-familjen av proteiner. Se Fig. 1 och 2. Med använd- ning av strålningshybridkartläggning, lokaliserades genen för okk-5 till kromosan 1 mellan DIS434 (32,2 cm) och DIS2843 (48,8 cm) av föreliggande uppfinnare. Denna placering bekräf- tas av värden från andra sekvenseringsansträngningar bestämda genom BLAST-analys av de offentliga sekvensdatabaserna (se nedan).

HS3300l2 Homo sapiens kromosom l klon RP3-330012 karta p36.ll-36.23, , sekvensering i utveckling, i beställda bitar, 119969 bp DNA, HTG den 28 juni 2001 Accession: AL03l73l Version: AL03l73l.36 GI:l4575526 Källa: human Organism: Homo sapiens Referens: l (baser l till ll9969) Författare: Martin, S.

Titel: Direct Submission Handling; framlagd (26 juni 2001), Sanger Centre, Hinxton, Cambridgeshire, CBl0lSA, Storbritannien.

Kommentar: den 28 juni 2001 ersatte denna sekvens gi:l442220l. 70 75 20 25 30 528 775 61 Dkk-5 befanns vara vida uttryckt i vuxna humana vävnader, såsom visas i Fig. 3. Detta bestämdes genom kvantitativ re- altids-PCR enligt beskrivning ovan.

Dkk-5 uttrycktes differentiellt under musembryoutveckling.

Kvantitativ avslöjade realtids-RT-PCR-analys av musembryon att Dkk-5-uttryckning börjar på dag 10 p.c. och fortsätter till dag l6 p.c. med en topp vid dag 12 p.c. Se Fig. 4. Ana- lys av hybridisering in situ av hela embryon uppvisade att denna uttryckning är vid mitthjärne-bakhjärneförbindelsen och längs gomplattan, en region som är viktig vid specificeringen av mesodermutveckling. Se Fig. 5.

Resultaten visar att Dkk-5-uttryckning reglerades under dif- ferentiering av L6-muskelceller. Nivàerna för transkriptet, mätt genom kvantitativ realtids-RT~PCR, började öka på dag 3 av differentiering och började sjunka pà dag 7 av differenti- ering. Se Fig. 6, som visar den relativa uttryckningsnivàn av Dkk-5 under L6-celldifferentiering från dag l till dag 8.

Detta uttryckningsmönster motsvarar den tidsperiod under vilken L6-celler är mottagliga för Dkk-5 och också den period under vilken tid Dkk-5-bindning till L6-celler är detekter- bar.

Vid uttryckning i bakulovirusinfekterade insektsceller, klipptes Dkk-5-proteinet av full längd internt till att ge tre klippningsprodukter som sträckte sig från 16 kDa till 20 kDa i storlek. "bn I det gel som visas i Pig. 7 motsvarar band proteinet av full längd. Den N-terminala sekvensen av proteinet av full längd inkluderande signalsekvensen är MAG- PAIHTAPML (SEQ ID NO: 6).

GALAPGTP (SEQ ID NO: 7) Det mogna proteinet börjar vid så att signalpeptidklyvningsstället är mellan alaninet vid position 24 och glycinet vid position 10 75 20 25 30 a: f: ß »J .Å- 775 62 "a" motsvarar 25 i SEQ ID NO: 5. Banden som är grupperade som de internt klippta proteinerna, alla med den N-terminala sekvensen MALFDWTDYEDLK (SEQ ID NO: 8). (band c, fält l i Fig. 7) Proteinet bildar dimerer som blir konverterade till den monomera formen under reducerande betingelser. Det 16 kDa (till klippta proteinet, efter att det till stor del renats en renhetsgrad av omkring 90 %) från beredningen av rekombi- nant producerade Dkk-5 av full längd genom anjonutbyteskroma- tografi med användning av en Mono-Qnflnärkeskolonn, förstärk- te grundläggande och insulinstimulerat glukosupptag i muskel- celler. Det Dkk-5 som hänvisas till i experimenten nedan var en beredning kännetecknad som en blandning av protein av full O längd och internt klippt sådant, innehållande ungefär 5 6 klippt protein.

Det klippta proteinfragmentet kan renas från rekombinant protein av full längd och eventuella andra oönskade proteiner medelst någon klassisk proteinkemiteknik, ej begränsat till jonutbyteskromatografi. Dessutom kan stora mängder av Dkk-5- proteinet av full längd uttryckas med begränsad proteolys för att erhålla mest klippt material; Arg-Arg-stället i molekylen kan också klippas och den resulterande önskade klyvningspro- dukten renas genom storleksuteslutning eller andra konventio- nella proteinreningstekniker som är välkända för fackmannen på området.

Behandling av L6-muskelceller med Dkk-5 resulterade i ett ökat glukos-(2-DOG)~upptag. Se Fig. 8. Effekten av Dkk-5 kan ses inom 48 timmar (Fig. 8A) tillståndet i. cellerna. och beror på differentierings- Effekterna av Dkk-5-behandlingen på ökningen av insulinberoende glukosupptag är mer signifikanta vid 96 timmar (p = 0,001) (Fig. 8B), även vid 48 timmar (p = Q,05)_ även fast effekten ses 70 15 20 25 30 ÃIFWÜ »i 4.3 775 63 Behandling av L6~muskelceller med Dkk-5 resulterade i en ökad Se Fig. 9. Såsom visas inkorporering av glukos in i glykogen. i Pig. 9A, kan effekterna av Dkk-5 ses på 48 timmar (P = 0,003) och, utan att begränsas till någon teori, kan denna verkan förmedlas genom reglering av aktiviteten av Akt och/eller GSK-3ß, av vilka båda är intermediärer i Wnt- och insulinsignaleringsvägen.

Dkk-5 påverkade myogenes i L6-celler. Eftersom effekterna av Dkk-5 observerades efter lângtidsbehandling är det möjligt, utan att bli begränsad till någon teori, att proteinet verkar genom att påverka differentieringen av L6-celler. RT-PCR- analys med användning av Taqmanm-PCR utfördes för att be- stämma uttryckningsnivåerna av gener involverade i myogenes, (MHC), myosin lätt kedja (MLC)f Pax3, Myf5 och MyoD i L6-celler behandlade med Dkk-5. såsom myosin tung kedja myo' genin, Fig. 10A-G visar att Dkk-5-behandling resulterade i förändrad uttryckning av myogenin och MyoD mellan dagarna 4 och 6 av differentiering och av MLC2, Myf5 och Pax3 mellan dagarna 2 och 4 av differentiering.

Dkk-5 reglerade uttryckningen av gener i insulinsignalerings- vägen i. muskelceller. RT-PCR-analys (Taqmannfi utfördes för att bestämma huruvida Dkk-5 påverkade uttryckningsnivåerna av gener involverade i glukosmetabolism. Såsom visas i Fig. ll, ökade Dkk-5-behandling uttryckningen av Akt (tvåfaldigt) (tvàfaldigt), glykogensyntas (fyrfaldigt) och IRS-1 efter 96 timmar och minskade uttryckningen av IRS-2 (0,2-faldigt efter 48 timmars behandling) och Glut-1 och PDK-1 (efter 96 timmar).

Med användning av FACS-analys med polyklonala antikroppar mot Dkk-5 och monoklonala antikroppar mot His-8-epitopmärkningen, 70 75 20 25 30 E? fi» fi: f ;_) MJ a..- 775 64 visades att Dkk-5 binder L6-celler från dag 2 till dag 5 av differentiering, men denna bindning har gått ned/förlorats vid dag 6. Dkk-5-bindning till L6 kan upphävas genom denatu- rering av proteinet, kan konkurreras ut genom användning av överskott av Fc-märkt Dkk-5 och pâverkas inte genom överskott av obesläktat His-märkt protein, vilket antyder att det är en specifik samverkan. Se Fig. 12. Härav följer att Dkk-5 har en specifik receptor på ytan av muskelceller. Det besläktade proteinet Dkk-l binder LRP6 och, utan att bli begränsad till någon teori, är det sannolikt att Dkk-5 också verkar genom denna receptor. Dessa receptorer befanns av föreliggande uppfinnare vara uttryckta på ytan av L6-celler och befanns av andra vara uttryckta i normal muskel i möss och nànniskor Gene 2l6:l03-lll (l998); 248:879-888 (1998)).

(Hey et al., Biochem.

Brown et al., Biophys. Res. Commun.

Dkk-5-behandling minskade grundläggande och insulinstimulerat glukosupptag i adipocyter. Specifikt visade Dkk-5-behandlade 3T3 Ll-celler en ökning i nivåerna av grundläggande och insu- 13A och l3B) linstimulerat glukosupptag samt en ökad (Pig. inkorporering av glukos in i lipider efter insulinstimulering (Fig. 14A och l4B). Ökningen i insulinberoende glukosupptag som ses efter 48 timmars behandling var mer uttalad efter 96 timmars behandling och en liknande observation sågs med insu- linberoende inkorporering av glukos in i lipid.

Effekterna av Dkk-5 in vivo bestämdes genom analys av glukos- metabolism i. transgena möss som uttryckte Dkk-5-CDNA under kontrollen av en muskelspecifik promotor (Shani, ovan). Pre- liminara resultat visade att dessa specifika transgena djur inte hade någon förändrad glukosmetabolism. Utan att bli begränsad till någon teori, skulle detta resultat kunna bero på låg uttryckning, inkorrekt eller avsaknad av klyvning av 70 75 20 25 30 :Mn ni QS *Q *J GW 65 proteinet i dessa djur eller avsaknad av utsöndring av prote- inet fràn muskelceller in i närliggande celler, varigenom det åstadkommes en frånvaro av alla synliga effekter på glukosme- tabolisnn Användning av en annan promotor eller ett annat uttryckningssystem såsom ett annorlunda splitsdonator/accep- torställe på endera ände av dkk-5-DNA, förväntas leda till en högre uttryckning. Dessutom skulle uttryckning av cDNA som kodar för endast en aktiv klyvningsprodukt av Dkk-5, såsom den l6 kDa stora interna klyvningsprodukten, med användning av riktiga startkodon och andra element i uttryckningskon- struktionen vilka skulle framgå för fackmän, möjliggöra be- stämning av dess effekter pà glukosmetabolism i dessa trans- gena djur.

Sammanfattning och diskussion Dkk-5 hade distinkta effekter på glukosupptag i muskelceller och adipocyter. Dkk-5-behandlade muskelceller var mer känsli- ga för insulinbehandling. I muskelceller, stimulerade Dkk-5- behandling en lätt ökning i inkorporeringen av glukos till glykogen och, utan att begränsas till någon teori, kan detta bero på dess effekter på uttryckningsnivån av glykogensyntas.

Dkk-5 kan också utöva sina effekter på glukosmetabolisni i muskel genom att påverka uttryckningsnivåerna av proteiner i insulinsignaleringsvägen_ Dessutom är det sannolikt att Dkk-5 också påverkar aktiviteten av proteiner i insulinsignaleringsvä- gen och/eller reglerar translokationen av den insulininducer- bara glukostransportören (GLUT-4) i L6-celler.

I adipocyter ökade Dkk-5-behandling både grundläggande och insulinstimulerat glukosupptag och inkorporeringen av glukos in i lípider efter 96 timmars behandling. Glukosupptag och lipidackumulation i adipocyter beror på differentieringstill- ståndet hos cellerna och adipocytdifferentiering regleras 10 15 20 25 30 66 genom Wnt-signalering. Det förväntas att aktiva Dkk-5-överut- tryckande möss har förstärkt glukostolerans.

Slutsats Dkk-5 påverkade glukosmetabolimn i L6-muskelceller och för- väntas göra detsamma i transgena möss som överuttrycker pro- teinet i muskel med användning av ett uttryckningssystem liknande det ovan. Användning av injicerad rekombinant Dkk-5- proteinberedning såsom anges i gelet i Fig. 7 innehållande både den fulla längden därav och delen om l6 kDa därav eller den injicerade delen av 16 kDa ensam förväntas också arbeta för att behandla insulinresistens i däggdjur. Behandling av muskelceller med Dkk-5 (både av full längd och internt klyvd produkt om 16 kDa) resulterade i en ökning i det grundläggan- de och insulinstimulerade glukosupptaget. Denna effekt obser- verades efter långtidsbehandling, vilket antyder, utan att begränsas av någon teori, att Dkk-5 kan påverka muskeldiffe- rentiering och både aktiviteten samt uttryckningsnivàerna av proteiner i insulinsignaleringsvägen. Ovanstående observatio- ner visar att Dkk-5 inducerar insulinsensitivitet. Insulinre- sistens är ett nyckelsärdrag i de flesta formerna av NIDDM.

Följaktligen skulle Dkk-5 vara användbart vid behandling av insulinresistensstörningar och Dkk-5 är användbart som. en diagnostisk markör i analyser för sådana tillstànd. Dkk-5 förväntas också hämma framskridandet av diabetesfenotypen i transgena djurmodeller, såsom uppenbaras, exempelvis i US-A- 6187991 och vara användbart både vid identifiering av» nya läkemedel för att behandla insulinresistensstörningar och i genterapi med användning av tekniker som anges i Larcher et al-, Ovan, Ueki et al., ovan och Otaegui et al., ovan. 70 15 20 25 30 67 Exempel 2: Utvecklin¶_§v anti-Dkk-5-monoklonala antikroppar Fem Balb/c-möss av honkön (Charles River Laboratories, Wil- mington, DE) hyperimmuniserades med renat rekombinant poly- humant Dkk-5 uttryckt i bakulovirusin- histidinmärkt (HIS8) fekterade insektsceller (beredda enligt angivelser i exempel 1) och spaddes i RibiTM-adjuvans (Ribi Immunochem Research, Inc., Hamilton, MO). Djuren immuniserades två gånger per vecka, med 50 ul använt för varje djur, administrerat via trampdynan. Efter fem injektioner, genomgick B-Cêllër från lymfknolarna från de fem mössen, som visade höga anti-Dkk-5- antikroppstitrar, fusion med musmyelomceller (X63.Ag8.653; American Type Culture Collection, Manassas, VA) med använd- ning av de protokoll som beskrivs i Kohler och Milstein, ovan och Hongo et al., Hybridoma l4:253-260 (1995). Efter 10-14 dagar skördades supernatanterna och genomgick screening med avseende på antikroppsproduktion genom direkt ELISA. Sju positiva kloner, som visade den högsta immunbindningen efter den andra omgången av subkloning genom begränsande spädning, injicerades in i Pristanem-primade möss l29:2826-2830 (1982)) de monoklonala antikropparna.

(Freund och Blair, J. Immunol. för produktion in vivo av Askitesvätskorna slogs samman och renades genom protein A-affinitetskromatografi (Pharma- cia“^ "fast-protein liquid chromatography" [FPLC]; PhäImäCia, Uppsala, Sverige) enligt beskrivning Hongo et al., ovan. De renade antikroppspreparaten sterilfiltrerades (0,2 um por- storlek; Nalgene, Rochester, NY) (PBS). och lagrades vid 4°C i fos- fatbuffrad koksaltlosning Dessa antikroppar, beredda från de deponerade hybridomen som anges nedan, kan användas i de diagnostiska metoder som anges häri med användning av ovan beskrivna tekniker. 10 75 20 25 ll' f?- G . I 1.1 f..- 775 68 Deponering av material Följande material har deponerats i American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, USA (ATCC): Benämning ATTC deponeringsnr, Deponeringsdatum DKK5.MAB3o60.7A9.1A1.2G5 PTA-3090 2001-02-21 0KK5.MAB3o58.13r10.1G4.238 PTA-3091 2001-02-21 DKK5.MAB3o59.3A4.1B10.1Gs PTA-3092 2001-02-21 nKK5.uAB3o57.6c5.2c2.2n3 fPTA-3093 2001-02-21 nKK5.MAB3063.11As.2F1.2B0 PTA-3094 2001-02-21 DKK5.MAB3061.11H3.2F6.1E3 ETA-3095 2001-02-21 DKK5.MAB3056.7H4.1H6.2B3 PTA-3096 2001-02-21 Denna deponering gjordes enligt bestämmelserna i Budapest- överenskommelsen om Internationellt Erkännande av Deponering- en av (Budapest- Mikroorganismer i Patentprocedursyfte överenskommelsen). Denna garanterar uppehållande av en livs- duglig kultur av deponering under 30 år från deponeringsdatu- met. Deponeringen kommer att hållas tillgänglig av ATCC en- ligt villkoren i Budapest-överenskommelsen och vara föremål för en överenskommelse mellan Genentech, Inc. och ATCC, som garanterar permanent och obegränsad tillgänglighet till av- komman från kulturen av deponeringen för allmänheten efter utfärdande av det relevanta US-patentet eller efter utlägg- ning till allmänheten av någon eventuell amerikansk eller utländsk patentansökan, vilken som än kommer först och garan- terar tillgänglighet till avkomman för någon bestämd av U.S.

Commissioner of Patents and Trademarks till att vara berätti- gad därtill enligt 35 USC avsnitt 122 och ombudets regler i enlighet därmed (inklusive 37 CFR avsnitt 1.14 med särskild hänvisning till 886 OG 638). 10 75 20 25 30 (_72 n: u: -~i »a (Fl 69 Föreliggande ansökans innehavare har gått med på att om en kultur av materialet efter deponering skulle dö eller förlo- ras eller förstöras vid odling under lämpliga betingelser, kommer materialet snabbt att ersättas efter underrättelse med ett annat av samma typ. Tillgängligheten för de deponerade materialen skall inte betraktas som en licens att utöva upp- finningen i motsättning mot de rättigheter som ges av en regerings myndighet i enlighet med dess patentlagar.

Föregående skrivna beskrivning anses vara tillräcklig för att möjliggöra för en fackman inom området att utöva uppfinning- en. Föreliggande uppfinning skall inte begränsas i sin om- fattning av de konstruktioner som har deponerats, eftersom den deponerade utföringsformen endast är avsedd som en il- lustration av vissa aspekter av uppfinningen och andra kon- struktioner som är funktionellt ekvivalenta ligger inom denna uppfinnings omfattning. Deponeringen av material häri utgör inte något medgivande till att den häri ingående skrivna beskrivningen skulle vara otillräcklig för att möjliggöra utövandet av vilken aspekt som helst av uppfinningen, inklu- derande den bästa utföringsformen därav, inte heller ska det anses som begränsande av omfattningen av kraven till de spe- cifika illustrationer som den representerar. I själva verket kommer olika modifieringar av uppfinningen utöver de som visats och beskrivits häri att bli tydliga för fackmannen på området utifrån föregående beskrivning och ligger inom om- fattningen för de bifogade kraven.

Principerna, de föredragna utföringsformerna och sätten för utövande av föreliggande uppfinning har beskrivits i föregå- skyddas ska emellertid inte betraktas son1 begränsad till de ende beskrivning. Uppfinningen som är avsedd att häri, specifika former som har uppenbarats, utan de skall betraktas (51 kJ GG NJ *<3 'i i) 70 som. illustrerande snarare än begränsande. Variationer och förändringar kan göras av fackmannen pà området utan att de fràngâr uppfinningens anda.

Claims (28)

10 75 20 25 30 35 f; år» 775 m* fff- v.) 71 PÄTENTKRÄV

1. l. Användning av en effektiv mängd av Dickkopf-5 (Dkk“5) Vid framställning av ett läkemedel för behandling av en insulin- resistensstörning i däggdjur.

2. Användning enligt krav l, vari störningen är icke insulin- beroende diabetes mellitus (NIDDM) eller övervikt.

3. Användning enligt krav l eller 2, vari Dkk-5 har åtminsto- ne omkring 85 % aminosyrasekvensidentitet med SEQ ID NO:5 i O Fig. 2 eller så har Dkk-5 åtminstone omkring 85 6 aminosyra- sekvensidentitet med sekvensen mellan rest 20 upp till reSï 30 och rest 347 i SEQ ID NO:5.

4. Användning enligt något av kraven l-3, vari Dkk-5 innefat- tar SEQ ID NO:5 eller innefattar sekvensen mellan rest 20 upp till rest 30 och rest 347 i SEQ ID NO:5.

5. Användning enligt något av de föregående kraven, vari Dkk- 5 innefattar sekvensen mellan resterna 25 och 347 i SEQ ID NO:5. vari Dkk-5 är ett in- ternt klyvningsproteinfragment från SEQ ID NO:5 som har den sekvensen MALFDWTDYEDLK (SEQ ID NO:8) molekylvikt av omkring 16 kDa, eller är en blandning av Dkk-5 innefattande SEQ ID NO:5 och det interna klyvningsprotein- fragmentet,

6. Användning enligt krav l eller 2, N-terminala OCH en eller är en blandning av ett Dkk-5 innefattande sekvensen mellan rest 20 upp till rest 30 och rest 347 av SEQ ID NO:5 och det interna klyvningsproteinfragmentet.

7. Användning enligt något av kraven l-6, varvid läkemedlet vidare innefattar en effektiv mängd av ett insulinresistens- behandlande medel. 70 75 20 25 30 35 i: V L”. 'J 77å3 72

8. Användning enligt krav 7, vari medlet är insulin, IGF-1 eller en sulfonylurea.

9. Kit för behandling av en insulinresistensstörning, vilket kit innefattar: (a) en behållare innefattande Dkk-5; (b) instruktioner för användning av Dkk-5 för att behandla störningen; och (c) en behållare innefattande ett insulinresistensbehandlande medel.

10. Kit enligt krav 9, vari störningen är icke insulinberoen- de diabetes mellitus (NIDDM) eller övervikt.

11. Kit enligt krav 9 eller 10, vari behållaren är en vial och instruktionerna specificerar placering av innehållet i vialen i en nål för omedelbar injektion.

12. Kit enligt något av kraven 9-11, vari Dkk-5 är ett Dkk-5 innefattande SEQ ID NO:5, eller ett Dkk-5 innefattande se- kvensen mellan rest 20 upp till rest 30 och rest 347 av SEQ ID NO:5, eller ett internt klyvningsproteinfragment av SEQ ID NO:5 som har den N-terminala sekvensen MALFDWTDYEDLK (SEQ ID NO:8) och en molekylvikt av omkring 16 kDa, eller en kombina- tion av klyvningsprodukten och en eller båda av de Dkk-5 som innefattar SEQ ID NO:5 eller som innefattar sekvensen mellan rest 20 upp till rest 30 och rest 347 av SEQ ID NO:5,

13. Isolerat internt klyvningsproteinfragment från SEQ ID NO:5 som har den N-terminala sekvensen MALFDWTDYEDLK (SEQ ID NO:8) och en molekylvikt av omkring 16 kDa.

14. Komposition innefattande proteinfragmentet enligt krav 13 och en bärare.

15. Komposition enligt krav 14, Dickkopf-5 (Dkk-5) som vidare innefattar ett innefattande SEQ ID NO:5 eller ett Dkk-5 70 15 20 25 30 35 fi. n 0 'f f' t; i 7 73 innefattande sekvensen mellan rest 20 upp till IeSï 30 Och rest 347 av SEQ ID NO:5. innefattar en

16. Komposition enligt krav 15, vari Dkk-5 sekvens mellan resterna 25 och 347 i SEQ ID NO:5.

17. Hybridom som producerar en Dkk-5-antikropp vald från gruppen bestående av PTA-3090, PTA“309l, PTÄ“3Û92f PTA'3Ü93f PTA-3094, PTA-3095 och PTA-3096.

18. Antikropp producerad av någon av hybridomen enligt krav 17.

19. Användning av Dkk-5 vid framställningen av ett läkemedel för ett förfarande for att i kroppen öka cellupptagning av glukos.

20. Användning enligt krav 19, vari Dkk-5 innefattar en poly- peptid med aminosyrasekvensen i SEQ ID NO:8.

21. Användning enligt krav 19, peptid med åtminstone 85% identitet med aminosyrasekvensen för resterna 30 till 347 i SEQ ID NO:5. vari Dkk-5 innefattar en poly-

22. Användning enligt krav 19, vari Dkk-5 innefattar en poly- peptid. med åtminstone 85% identitet med aminosyrasekvensen för resterna 25 och 347 i SEQ ID NO:5.

23. Användning enligt krav 19, vari Dkk-5 innefattar en poly- peptid med. åtminstone 85% identitet med aminosyrasekvensen för resterna 20 och 347 i SEQ ID NO:5.

24. Användning enligt krav 19, vari Dkk-5 innefattar en poly- peptid med aminosyrasekvensen i SEQ ID NO:5. 70 15 20 Éfëfi r3¿ 74

25. Användning enligt krav 19, vidare innefattande admini- strering av ett medel för insulinresistansbehandling till cellerna. IGF-1

26. Användning enligt krav 25, vari medlet är insulin, eller en sulfonylurea.

27. Användning av Dkk-5 vid framställningen av ett läkemedel för att öka cellinkorporering* av' glukos in i. glykogen. vid behandlingen av förhöjda blodsockernivàer.

28. Användning enligt krav 27, vari Dkk-5 innefattar: a) aminosyrasekvensen i SEQ ID NO:8, b) en aminosyrasekvens med åtminstone 85% identitet med aminosyrasekvensen i resterna 30 till 347 i SEQ ID NO:5, c) en aminosyrasekvens med åtminstone 85% identitet med aminosyrasekvensen i resterna 25 till 347 i SEQ ID NO:5, 85% aminosyrasekvensen i resterna 20 till 347 i SEQ ID NO:5, dl en aminosyrasekvens med åtminstone identitet med eller e) aminosyrasekvensen i SEQ ID NO:5.