SE526842C2

SE526842C2 - Xylanaser med förhöjd termofilicitet och alkalofilicitet

Info

Publication number: SE526842C2
Application number: SE0302103A
Authority: SE
Inventors: Wing L Sung
Original assignee: Ca Nat Research Council
Priority date: 2001-11-21
Filing date: 2003-07-18
Publication date: 2005-11-08
Also published as: CN1697877B; CN1697877A; AU2002342464A1; SE0302103L; SE0302103D0; CA2435527C; WO2003046169A2; FI122936B; US20090075330A1; CA2435527A1; US7510860B1; FI20031094L; WO2003046169A3

Description

o n u o a: n o 526 842 o uno wo 2 ka xylanaset som används. Dessutom måste varm massa kylas ned till en temperatur nära den optimala temperaturen för enzymatisk aktivitet av det utvalda xylanaset.

Minskning av massaternperaturer för xylanasbehandling minskade effektiviteten av den efterföljande kemiska blekningen. Surgöming av massa kräver användningen av stora kvantiteter av syror. Dessutom leder tillsatsen av syror till korrosion, vilket minskar livstiden av processutrustningen. Således skulle xylanaser som är optimalt aktiva vid temperaturer och pH-betingelser som närmar sig betingelserna för massan vara användbara och fördelaktiga vid massatillverkning.

Xylanaser som uppvisar större aktivitet vid högre temperaturer skulle kunna använ- das för att behandla massa omedelbart efter massakokningsprocessen, utan behovet av att kyla massan. På liknande sätt skulle xylanaser som uppvisar en större aktivitet med högre pH-betingelser kräva mindre eller ingen syra för att neutralisera massan.

Isoleringen av, eller den genetiska mauipuleringen av, xylanaser med sådana egen- skaper skulle tillhandahålla ﬂera fördelar och väsentligen ekonomiska fördelar inom ett antal industriella processer.

Flera angreppssätt som är riktade mot förbättrade xylanaser för användning i mas- sablekning inom teknikens ståndpunkt inkluderar isoleringen av termostabila xyla- naser från extrema termoﬁler som växer vid 80-l00°C, såsom Caldocellum saccha- rolyticum, T hermatoga maritima och T hermatoga sp._stam F J SS-B.l (Lüthi et al. 1990; Winterhalter et al. 1995; Simpson et al. 1991). Emellertid är dessa tennosta- bila enzymer stora, med molekylmassor som sträcker sig från 35-120 kDa (320-1100 rester), och uppvisar en reducerad förmåga att penetrera massan jårnfórt med andra mindre xylanaser som uppvisar bättre tillgänglighet till massaﬁbrerna. Dessutom uppvisar vissa av de extremt termoﬁla xylanaserna, såsom Caldocellum saccharoLv- licum xylanas A, både xylanas- och cellulasaktivitet (Lüthi et al. 1990). Denna ytter- ligare cellulytiska aktivitet är oönskad för massablekning, på grund av dess nedbryt- ande effekt på cellulosa, bulkmaterialet i papper. Vidare har hypertermostabila xyla- nasenzymer som fungerar normalt vid extremt höga temperaturer låga specifika aktiviteter vid temperaturer i intervallet för optimal massablekning (Simpson et al. 1991). 0 10000 I 20 30 526 842 o . ; p . 0 c n a a 4 n Q ø c nu 3 Ett antal xylanaser har modiﬁerats genom proteinmodiﬁering för att förbättra deras egenskaper för industriella applikationer. Till exempel beskriver US-A-5 759 840 (Sung et al.), och US-A-5 866 408 (Sung et al) mutationen i den N-tenninala regio- nen (restema 1-29) av T ríchoderma reesei xylanas H (TrX). Tre mutationer, vid resterna 10, 27 och 29 av TrX, fann förstärkande den enzymatiska aktiviteten av xylanasenzymet vid förhöjda temperaturer och alkali-pH-betingelser.

US-A-4 505 769 (Campbell et al.), beskriver modiﬁeringen av Bacíllus circulans xylanas (BcX) genom att använda platsrilctad mutagenes för att förbättra tennostabi- liteten av enzymet. De platsspeciﬁka mutationema inkluderar ersättandet av två aminosyror med Cys-rester för att skapa intramolekylära disulﬁdbindningar. Dess- utom muterades speciﬁka rester i N-terminalen av enzymet vilka också fann ytterli- gare förstärkning av termostabiliteten i enzymet. I in vitro-analyser uppvisade disul- ﬁdmutanterna termostabilitetet vid 62°C, en förbättring av 7°C över det nativa BcX- xylanasenzymet. Emellertid uppvisade dessa terniostabila disulﬁdmutanter ingen förbättring i termoﬁlicitet i laboratorieanalyser i efterföljande studier (Wakarchuck et al., 1994). Mutationema T3G (dvs treonin i position 3 ersatt med Gly; BcX- xylanasaminosyranumreiing). D4Y(F) och N8Y(F) nära N-terminalen av BcX- xylanasenzymet tillhandahöll termostabílitet till 57°C, en förhöjning av 2°C jämfört med nativt BcX (U S-A-5 405 769). Emellertid kräver användningen av dessa enzy- mer inom industriella applikationer fortfarande nedkylning och surgörning av massan eﬁer förbehandling, innan enzymtillsats. Därför är ytterligare förbättringar i termostabilitet, termoﬁlicitet och pH-optimum fortfarande nödvändigt.

Turunen et al (2001) beskriver mutationer (N 1 1D, N3 8E, Ql62H) av TrX II i posi- tionema ll, 38 och 162, som kompletterar liknande disulﬁdbindningar (S l 10C/N154C) för att förbättra tennostabiliteten av xylanaset. Emellertid har dessa mutationer inklusive NI 1D också en bieffekt på både termoﬁliciteten och alkaloﬁli- citeten av xylanaset, vilket resulterar i en minskning av enzymatisk aktivitet vid högre temperaturer och det neutrala-alkalina pH, jämfört med nativt TrX II. 15 20 25 30 526 842 Det finns ett behov inom teknikens ståndpunkt att erhålla nya xylanaser vilka uppvi- sar förstärkt enzymatisk aktivitet vid förhöjda temperaturer och pH-betingelser, som också är lämpliga för industriell användning. Det är ett ändamål med föreliggande uppﬁnning att överkomma nackdelarna inom teknikens ståndpunkt.

Ovanstående ändamål uppnås genom en kombination av egenskaperna av huvudkra- vet, och underkraven beskriver ytterligare fördelaktiga utföringsformer av uppﬁn- ningen.

SAMMANFATTNING AV UPPFINNINGEN Föreliggande uppﬁnning avser xylanaser. Mer speciﬁkt avser uppfinningen xylana- ser och modifierade xylanaser med förbättrat uppträdande vid betingelser av hög temperatur och pH.

Denna uppfinning avser ett modiﬁerat xylanas som innefattar en substituerad amino- syrarest vid positionen 144, varvid den substituerade aminosyran är en basisk ami- nosyra. Den nämnda positionen bestäms från sekvensorienteringen av det modiﬂe- rade xylanaset med T ríchoderma reeseí xylanas II-aminosyrasekvens som deﬁnieras i SEKV ID NR 16. Det modifierade xylanaset uppvisar förbättrad termofilicitet, al- kaloﬁlicitet, expressionseffektivitet, eller en kombination därav, i jämförelse med motsvarande nativa xylanas.

Föreliggande uppﬁnning tillhandahåller också xylanasen som definieras ovan vari xylanasen är en modifierad xylanas och åtminstone en substituerad aminosyrarest är vid position 116. Företrädesvis är den substituerade aminosyran Gly.

Föreliggande uppﬁnning innefattar också xylanasen, som modifieras i position 116 som deﬁnierat ovan och som ytterligare innefattar en His vid positionerna 10 och 105, en Met vid position 27, en Leu vid position 29, en Ala vid positionema 75 och 125, en Glu vid position 129 och en Arg vid position 144. 20 25 30 (TI '26 842 o ~ o e o o o n . o o o .en a. 5 Denna uppﬁnning inkluderar xylanasen som modifieras i position 116 som deﬁnie- rats ovan och som vidare innefattar en His vid positionerna 10 och 105, en Met vid position 27, en Leu vid position 29, en Ala vid positionema 75 och 125, en Glu vid position 129 och en Arg vid position 144.

Denna uppﬁnning beskriver xylanasen som modiﬁeras vid position 116 som deﬁnie- rats ovan och som ytterligare innehåller en His vid positionerna 10 och 105, en Asp vid position 11, en Met vid position 27, en Leu vid position 29, en Ala vid positio- nerna 75 och 125, en Glu vid position 129 och en Arg vid positionerna 144 och 161.

Föreliggande uppﬁnning tillhandahåller också den modiﬁerade xylanasen som deﬁ- nierats ovan vari åtminstone en substituerad aminosyrarest är vid position 144.

Företrädesvis år den substituerade aminosyran Arg.

Föreliggande uppﬁnning innefattar xylanasen som modiﬁeras vid position 144 som deﬁnierats ovan och som ytterligare innefattar en His vid positionerna 10 och 105, en Met vid position 27, en Leu vid position 29, en Ala vid positionerna 75 och 125 och en Glu vid position 129.

Föreliggande uppﬁnning tillhandahåller också den modiﬁerade xylanasen som deﬁ- nierats ovan vari åtminstone en substituerad aminosyrarest är i position 161. Före- trädesvis är den substituerade aminosyran Arg.

Denna uppﬁnning innefattar xylanasen som modiﬁerats vid position 161 som deﬁni- erats ovan och som ytterligare innefattar en His vid positionerna 10 och 105, en Met vid position 27, en Leu vid position 29, en Ala vid positionema 75 och 125 och en Glu vid position 129 och en Arg vid position 144.

Föreliggande uppﬁnning tillhandahåller också den modiﬁerade xylanasen som deﬁ- nierats ovan vari åtminstone en substituerad aminosyrarest är i position ll. Företrä- desvis är den substituerade aminosyran Asp. clan gu I 20 25 30 596 842 | o o c nu n n ~ o c n n o u u u A o :nu ao 6 Denna uppﬁnning innefattar xylanasen som modiﬁerats vid position 11 som deﬁnie- rats ovan och som ytterligare innefattar en His vid positionerna 10 och 105, en Met vid position 27, en Leu vid position 29, en Ala vid positionema 75 och 125, en Glu vid position 129, och en Arg vid positionerna 144 och 161.

Föreliggande uppﬁnning tillhandahåller också den modiﬁerade xylanasen som deﬁ- nierats ovan vari åtminstone en substituerad aminosyrarest är i position 118. Före- trädesvis är den substituerade arninosyran Cys.

Föreliggande uppﬁnning innefattar också xylanaser som modiﬁerats vid position 118 som deﬁnierats ovan och som ytterligare innefattar en His vid positionerna 10 och 105, en Met vid position 27, en Leu vid position 29, en Ala vid positionerna 75 och 125, en Glu vid position 129 och en Arg vid position 144.

Denna uppﬁnning inkluderar xylanasen som modiﬁerats vid position 118 som deﬁ- nierats ovan och som ytterligare innefattar en His vid positionerna 10 och 105, en Met vid position 27, en Leu vid position 29, en Ala vid positionema 75 och 125, en Glu vid position 129 och en Arg vid position 144.

Denna uppﬁnning beskriver xylanasen som rnodiﬁerats vid position 118 som deﬁni- erats ovan och som ytterligare innefattar en His vid positionerna 10 och 105, en Asp vid position ll, en Met vid posiﬁon 27, en Leu vid position 29, en Ala vid positio- nema 75 och 125, en Glu vid position 129, och en Arg vid positionerna 144 och 161.

Föreliggande uppfmning riktar sig också mot de modiﬁerade xylanasema, som deﬁ- nierat ovan, vari de modiﬁerade xylanasema är ﬁamtagna från en familj II-xylanas, företrädesvis en T richoderma reesei xylanas.

Föreliggande uppﬁnning riktar sig mot en modiﬁera xylanas som innefattar åtmins- tone en substituerad aminosyra, vari den modiﬁerade xylanasen kännetecknas av att den har en maximal effektiv temperatur (MET) mellan omkring 69 till omkring 10 20 QQÖ 842 o - u q o o n u u c o u o man oo 7 84°C, vari den modiﬁerade xylanasen är en familj II-xylanas som erhålls från en Trichoderma sp. Företrädesvis är MET mellan omkring 70 till omkring 80°C.

Denna uppﬁnning inkluderar också en modiﬁerad xylanas som innefattar åtminstone en substituerad aminosyrarest, vari den modiﬁerade xylanasen kännetecknas som att den har ett effektivt maximalt pH (MEP) mellan omkring pH 5,8 till omkring pH 8,4, och vari den modifierade xylanasen är en familj II-xylanas som erhålls ﬁån en Trichoderma sp. Företrädesvis är MEP mellan omkring pH 6,0 till omkring pH 8,0.

Föreliggande uppﬁnning riktar sig mot en modiﬁerad xylanas som innefattar åt- minstone en substituerad aminosyrarest, vari den modiﬁerade xylanasen känneteck- nas av att den har en maximal effektiv temperatur (MET) mellan omkring 69 till omkring 84°C, och ett maximalt eﬁektivt pH (MEP) mellan omkring pH 5,8 till omkring pH 8,4. Företrädesvis är MET mellan omkring 70° till omkring 80°C och MEP är mellan omkring pH 6,0 till omkring pH 8,0.

Föreliggande uppﬁnning hänför sig också till en modiﬁerad xylanas som väljs från gruppen som består av: TrX-H1VlL-75Al05H-125A129E- l44R; TrX-I-IML-75Al05H-l25Al29E- 144R16lR; TrX-l 16G; TrX-l l8C; TrX-HML-75Al05H-l16G-l25A129E-l44R; TrX-I-lML-75A l05H-l l8C-l25Al29E-144R; TrX-H-l lD-Nﬂf75Al05H-125Al29E- l44Rl6 IR; TrX-H-1 lD-ML-75A105H-116G-l25Al29E-144R161R; TrX-H-llD-ML-75A105H-118C-l25Al29E-144R16lR; och TrX-H-l lD-ML-75A105H-1 16Gl l8C- l25A129E-144Rl6lR Enligt föreliggande uppﬁnning tillhandahålls också en modifierad xylanas med hjälp av åtminstone en substituerad aminosyrarest, och som kännetecknas av att den har I 00000 I 20 25 30 526 842 n u u v u 0 u o u a - e noe nu s en maximal effektiv temperatur (MET) mellan omkring 69 till omkring 84°C, vari den modiﬁerade xylanasen är en familj II-xylanas som erhålls från en Trichoderma sp. Dessutom hänför sig föreliggande uppﬁnning till en modifierad familj lI-xylanas som erhålls ﬁån en Trichoderma sp. som kännetecknas av att den har en MET mellan omkring 70 till omkring 80°C. Föreliggande uppﬁnning inkluderar också den modiﬁerade familj H-xylanasen som erhålls från en T richoderma sp. som känne- tecknas av den har ett MET mellan omkring 69 till omkring 84°C och ett maximalt eﬁektivt pH (MEP) mellan omkring 5,8 till omkring 8,4. Denna uppﬁnning hänför sig också till den modifierade xylanasen som precis deﬁnierats, vari MEP är mellan omkring 6,0 till omkring 8,0.

Föreliggande uppﬁnning riktar sig mot användningen av den modifierade xylanasen som deﬁnierats ovani ett industriellt förfarande. Även inkluderat är ett industriellt förfarande, vari det industriella förfarandet innefattar blekning av massa, process- ning av precisionsanordningar, en förbättring av nedbrytbarheten av fågel- och grismat.

Denna sammanfattning av uppﬁnningen beskriver inte nödvändigtvis alla nödvändi- ga egenskaper av uppﬁnningen men att uppﬁnningen även kan bestå i en underkom- bination av de beskrivna egenskapema.

KORT BESKRIVNING AV F IGURERNA Dessa och andra egenskaper av uppﬁnningen kommer att bli tydliga från följande beskrivning i vilken referens görs till de bifogade figurerna vari: FIGUR 1 visar en aminosyrasekvensorientering bland familj lI-xylanaser. Arnino- syranumreringen jämförs med T richoderma reesei xylanas II (Tr2) som indikeras vid toppen av sekvensema. Resten av positionerna 75 och 105 (relativt till Tr2) är i kursiverad stil och indikeras med en asterisk. Arninosyroma som är gemensamma till åtminstone 75 % av de listade familj lI-xylanaserna indikeras i fet stil. Restema 0000 n 20 526 842 e o o u u a n u a I u n o c n 1 n oss av 9 som är gemensamma for alla familj II-xylanaser är understrukna. För xylanaser med en cellulosasbindande domän, presenteras endast de katalyﬁska kämsekvensema.

FIGUR 2 visar nukleotidsekvensen av TrX-xylanas (SEKV ID NR 39), och de syntetiska oligonukleotiderna som används för att konstruera sekvenser som kodar för Trichoderma reesei xylanas II enzym (TrX) i plasmiden pTrX.

FIGUR 3 visar effekten av temperatur på den enzymatiska aktiviteten av modiﬁerad xylanas TrX-I-UvIL-75A105H-125A129E- 144R, jämfört med TrX-HML-7 5A105H- 125A129E vid pH 5,5, under 30 minuters inkuberingar. Data nonnaliseras mot akti- viteten som observeras vid 40°C.

FIGUR 4 visar effekten av temperatur på den enzymatíska aktiviteten av modiﬁera- de xylanaser TrX~1l6G och TrX-118C, jämfört med nativ TrX, vid pH 5,0 under 30 minuters inkuberingar. Data normaliseras till aktiviteten som observeras vid 40°C.

FIGUR 5 visar effekten av temperatur på den enzymatiska aktiviteten av modifierad xylanaser TrX-PIIVILJSAIOSH-l l6G-l25A129E-l44R och TrX-H-l lD-ML- 75A105H-l l6G-l25A129E-l44R16lR, järnfcirt med nativ TrX, TrX-HML, TrX- HIVlL-75A105H-l25A129E och TrX-I-INIL-75A105H-125Al29E-l44R vid pH 5,5 under 30 minuters inkuberingar. Data normaliseras till aktiviteten som observeras vid 40°C.

FIGUR 6 visar eiïekten av temperatur på den enzymatiska aktiviteten av modifiera- de xylanaser TrX-H-11D-ML75A105H-1l6G118C-125A129E-144R161R, TrX- H1vﬂ.-75A105H-116G-l25Al29E-144R, TrX-H-llD-ML-75A105H-1l6G- l25A129E-l44R16lR, TrX-HML-75AlO5H-l l8C-l25A l29E-144R, och TrX-H~ 11D-ML-75Al05H-l l8C-125Al29E-144R161R, järnfort med TrX-HML- 75A105H-125A129E-l44R vid pH 6,0 under 30 minuters inkuberingar. Data nor- maliseras till aktiviteten som observeras vid 40°C. 526 842 u v .oo n n o o n o o u o o oo 10 FIGUR 7 visar effekten av temperatur på den enzymatiska aktiviteten av modiﬁera- de xylanasef Trx-iuilfvsßiiosn-i16G-12sA129E-144R, och Tfx-H-i iD-ML- 75A105H-1l6G-l25A129E-144Rl6lR, TrX-IDvIL-75Al05H-1l8C-125A129E- 144R och TrX-H-l lD-ML-75AlO5H-1 l8C-l25Al29E- 144R16 IR, jämfört med TrX-I-IML-75Al05H-125Al29E-144R vid pH 6,0 under 30 minuters inkuberingar.

Data normaliseras till maximal aktivitet för varje enzyrn.

FIGUR 8 visar effekten av temperatur på den enzymatiska aktiviteten av modifiera- de xylanaser TrX-H-1lD-ML-75A105H-l25Al29E-144R161R, jämfört med TrX- HMÉL-75AlO5I-I-125A129E-l44Rl6lR vid pH 6,0 under 30 minuters inkuberingar.

Data normaliseras till aktiviteten som observeras vid 40°C.

FIGUR 9 visar pH/elïektivitetsproﬁlen av modiﬁerade xylanasenzymer TrX-H- llD-ML-75AlO5H- 1 l6Gl l8C-125Al29E-l44R16lR, TrX-H-l1D-ML-75A105H- 116G-l25A129E-144R16lR, TrX-HlViL-75A105H-l16G-l25Al29E-144R och TrX-HML-75Al05H-1 l8C- 125 A129E-l44R, jämfört med TrX-I-Ih/IL-75A105H- l25Al29E- 144Rl6lR och TrX-HML-75A105H-125Al29E över pH 5,0-8,0 vid 65°C under 30 minuters inkuberingar. Data normaliseras till pH som uppvisar opti- mal aktivitet för varje enzym. i FIGUR 10 visar pI-I/eﬁektivitetsproﬁlerna för modifierade xylanaser TrX-116G och TrX-118C, jämfört med nativ TrX, över pH 4,5-7,0 vid 50°C under 30 minuters inkubering. Data normaliseras till det pH som uppvisar optimal aktivitet för varje enzym.

FIGUR ll visar den maximala eﬁektiva temperaturen (MET) och maximala effek- tiva pH:t (MEN-värdena för ﬂera av de modiﬁerade enzymerna av föreliggande uppﬁnning. MET och MEP är de högsta temperaturerna respektive pH vid vilka ett xylanas uppvisar åtminstone 80 % av dess optimala aktivitet (genom att använda löslig björkträxylan som ett substrat; se förfarandet för fullständiga detaljer av ana- lysen). Dessa datapunkter erhölls från data som presenteras i ﬁg 3 till 10. 20 25 30 526 842 1 1 BESKRIVNING Av FÖREDRAGNA UTFöRINGsFomrER u: o o c n en a o ø I > nu Föreliggande uppﬁnning avser xylanaser. Mer speciﬁkt avser uppﬁnningen xylana- ser och modiﬁerade xylanaser med förbättrat uppträdande vid betingelser av hög temperatur och pH.

Följande beskrivning är av en töredragen utlöringsform genom endast exempel och utan begränsning till kombinationen av egenskaper som är nödvändiga för att utföra uppﬁnningen till dess eﬁekt.

Mekanismen genom vilken xylanaser möjliggör blekning av massa är inte fullstän- digt klarlagd. Det har postulerats att det färgade ligninet binds till kristallin cellulosa genom xylan och xylanasenzymer som möjliggör blekning av massa genom att hyd- rolysera xylan, och ﬁisätta färgat lignin i massan. Xylanaser och modiﬁerade xyla- naser, som beskrivet häri, kan användas för ändamål av att bleka massa eller andra applikationer som kräver aktivitet vid temperaturer och pH över det för vildtypsen- zymet. För bioblekning av massa, är den föredragna xylanasen framtagen från en xylanas som klassiﬁcerats i familj H (se tabell 1), emellertid behöll modiﬁeringania som beskrivs häri inte begränsas till endast familj II-xylanaser och kan inkludera andra xylanasenzymer. Dessutom kan modiﬁeiingar som beskrivs häri hittas i nativa xylanasproteiner, och dessa nativa xylanasenzymer kan uppvisa de önskade egen- skapema som beskrivs häri, och inkluderas genom föreliggande uppfinning.

Familj II-xylanasenzymer är en grupp av små enzymer av relativt låg molekylär massa (ungefär 20 kDa, och omkring 200 arninosyrarester). Den lilla storleken som associeras med familj II-xylanaser möjliggör enkel penetrering av massan. Dess- utom är familj II-xylanaser ﬁia ﬁån cellulosaaktivitet.

En aspekt av föreliggande uppﬁnning riktas mot en modiﬁerad familj II-xylanas som erhålls från T richoderma sp. som innefattar åtminstone en substituerad amino- syrarest, och som kännetecknas av att den har en maximal effektiv temperatur (MET; se deﬁnition nedan) mellan omlaing 69 till omkring 84°C. Företrädesvis OQO o 20 5 'DO 6 842 l2 kännetecknas det modiﬁerade xylanaset som att det har ett MET mellan omkring 70 och omkring 80°C. Denna uppﬁnning inkluderar också en modiﬁerad xylanas med åtminstone en substituerad aminosyrarest, och som kännetecknas av att den har ett i maximalt eﬁektivt pH (MEP; se definition nedan) mellan omkring 5,8 till omkring 8,4. Företrädesvis är MEP mellan omkring 6,0 och omkring 8,0.

Denna uppfinning riktas också till en modifierad xylanas som erhålls från T richodernza, och som innefattar åtminstone en substituerad aminosyra, och som kännetecknas som att den har maximal effektiv temperatur (MET mellan omkring 69 till omkring 84°C, och ett maximalt effektivt pH (MEP) mellan omkring 5,8 till omkring 8,4. Företrädesvis är MET mellan omkring 70 till omkring 80°C, och MEP är mellan omkring 6,0 till omkring 8,0.

Denna uppﬁnning riktar sig också mot en nativ familj II-xylanas som kännetecknas som att den har maximal effektiv temperatur (MET) mellan omkring 69°C till omkring 84°C, och ett maximalt effektivt pH (MEP) mellan omkring 5,8 till omkring 8,4. Företrädesvis är lvíET mellan omkring 70 till omkring 80°C och MEP är mellan omkring 6,0 till omkring 8,0.

Med "maximal effektiv temperatur" eller "MET" avser den högsta temperaturen vid vilken en xylanas uppvisar åtminstone 80 % av dess optimala aktivitet. Detta försök genomförs vanligtvis genom att använda löslíg björkvedsxylan som ett substrat vid pH 5,5 eller 6,0, och under en 30-minutersperiod. Resultat från analyser som an- vänds för att känneteckna modiﬁerade xylanaser presenteras i ﬁg 3 till 8 och invol- verar en 30-minutersinkubering vid pH 5,5 eller 6,0. En sammanfattning av MET för ﬂera enzymer av föreliggande uppﬁnning, som bestäms ﬁån ﬁg 3 till 8 presenteras i ﬁg ll. Experiment visar att MET av en xylanas skiljer sig från mellan olika substrat.

Därför skall det förstås att med olika substrat, kommer olika MET-värden att erhål- las (data ej presenterat). För ändamålet av att utvärdera xylanaser enligt föreliggande uppﬁnning, används lösligt björksvedsxylansubstrat (se exempel 3). ff! 26 842 n n o o v o n | ø o o o no. oo 13 Med "maximalt eiïektivt pH" eller "MEP" avses det högsta pH vid vilken en xylanas uppvisar åtminstone 80 % av dess optimala aktivitet. Dessa försök genomförs genom att använda löslig björkvedsxylan som ett substrat, vid 65°C, och i en 30-minuterspe1iod. Resultat från analysen som används för att känneteckna modiﬁe- rade xylanaser presenteras i ﬁg 9 och 10 och involverar en 30-minuters inkubering vid 65°C. En sammanfattning av MEP av ﬂera enzymer av föreliggande uppﬁnning presenteras i ﬁg ll. Experiment visar att MEP av en xylanas skiljer sig mellan olika substrat. Till exempel, för lcraﬁmassa som framställs från mjukt trä eller hårdträ, har ett MEP av 9,2 observerats (data ej presenterat). Därför skall det förstås att med olika substrat kommer olika MEP-värden erhållas. För ändarnålen av att utvärdera xylanas av föreliggande uppﬁnning används lösligt björkvedsxylansubstrat (se exempel 4). 526 842 14 TABELL 1. Familj II-xylanasenzymer Mikrob Xylanas SEKV ID NR Aspergillus niger Xyn A SEKV 1D NR 1 Aspergillus awamori var. kawachi Xyn B SEKV ID NR 19 Aspergillus kawachii Xyn C SEKV 1D NR 54 Aspergillus tubigensis Xyn A SEKV ID NR 2 Bacillus circulans Xyn A SEKV 1D NR 3 Bacillus pumílus Xyn A SEKV ID NR 4 Bacillus subtilis Xyn A SEKV ID NR 5 Cellulomonas ﬁmi - Xyn D -- Chainia spp. Xyn I -- Clostridium acetobulylicum Xyn B SEKV II) NR 6 Clostridium stercorarium Xyn A SEKV 1D NR 7 Fibrobacter succinognees Xyn II SEKV ID NR 18 Neocallimasterzlv patriciarum Xyn A -- Nocardiopsis dassonvillei Xyn II -- Ruminococcusﬂavejàciens Xyn A SEKV ID NR 8 Schízophyllum cimmune Xyn SEKV ID NR 9 Streptomyces lividans Xyn B SEKV 1D NR 10 Streptomyces Iívidans Xyn C SEKV 1D NR 11 Streptomyces sp. nr 36a Xyn SEKV 1D NR 12 Streptomyces thermoviolaceus Xyn II -- T hermomonospora fizsca Xyn A SEKV 1D NR 13 T hermomonospora lanuginosus Xyn SEKV ID NR 20 . T richodemza harzianum Xyn SEKV H) NR 14 Trichoderma reesei Xyn I SEKV ID NR 15 T richoderma reesei Xyn II SEKV ID NR 16 T richoderma viride Xyn SEKV 1D NR 17 20 5 ° 6 8 4 2 o nu o e c n I Q o c I I 0 Q I I U Û Ål 15 Familj II-xylanaser delar en omfattande aminosyrasekvenslikhet (ﬁg 1). Strukturella studier av ﬂera familj lI-xylanaser indikerar att familj II-Xylanaser från bakteriellt ursprung och fungalt ursprung delar samma generella molekylära struktur (U S-A- 5 405 769; Arase et al 1993). Dessutom uppvisar de ﬂesta familj lI-xylanaser som identifierats hittills tre slag av sekundär struktur, inklusive beta-flak, höjningar och en enkel alfa-helix. Helixen av Trichoderrna reesei xylanas II enzym innefattar regionen från aminosyra 151 till aminosyra 162 (Torronen et al. 1995).

En xylanas klassificeras som en familj II-xylanas om den innefattar aminosyror som är gemensamma för andra familj lI-xylanaser, inklusive två glutaminsyra (E)-rester vilka kan fungera som katalytiska rester. Glutaminsyrarestema hittas vid positioner- na 86 och 177 (se ﬁg 1; baserat på Tr2 (T richoderma reesei xylanas II enzym)- aminosyranumrering).

De flesta av familj lI-xylanasema som identiﬁerats hittills är mesoﬁla och har låg molekylmassa (20 kDa). Emellertid inkluderar denna familj också åtminstone två termostabila xylanaser av högre molekylmassa, T hermomonospora fusca xylanas A (TfX-A) av 296 aminosyror och en molekylmassa av ungefär 32 kDa (Irwin et al., 1994); Wilson et al. 1994, WO 95/12668 och C lostrídium stercararium xylanas A av 511 aminosyror och en molekylmassa av ungefär 56 kDa. Clostridium stercora- rium xylanas A enzym uppvisar maximal aktivitet vid en temperatur av 70°C (Sakka et al., 1993).

De stora termostabila familj II-xylanaserna skiljer sig från de små mesoﬁla enzy- merna genom att de har en hydrofobisk cellulosabindande domän (CBD) i den för- längda C-terminalen av enzymen. TiX-A-enzymet består av en katalytisk käm- sekvens av 189 rester som är gemensamma för alla familj II-xylanaser, och en cellulosabindande domän av 107 rester. Den större C. stercorarium xylanas A har 2 kopior av den cellulosabindande domänen.

Platsriktad mutagenes har använts i föreliggande uppfinning för att framställa muta- tioner i xylanaser vilket gör enzymet mer termoﬁlt och alkaloﬁlt jämfört med det :":"É'° : ::": o n o o u u 1 u n: n. 16 nativa enzymet. Företrädesvis är det mutanta xylanaset ett som är framtaget ﬁån ett farnilje II-xylanas. Mera föredraget innefattar det mutanta xylanaset av föreliggande uppﬁnning ett mutant T richoderma reesei xylanas II enzym. s Således är det ansett inom uppﬁnningens skyddsomfång att xylanaser, inklusive familj II-xylanaser till exempel, men inte begränsat till Trichoderma reesei xylanas II, Trichoderma reesei xylanas I, T richodemza viride xylanas, Streptomyces lividans xylanas B och Streptomyces lividans xylanas C, kan modifieras genom att följa de allmänna angreppssâtten hos förfarandet som beskrivs häri. Det anses också inom 10 uppﬁnningens skyddsomfäng att icke-familj II-xylanaser också kan modiﬁeras genom att använda de allmänna principer som beskrivs häri för att erhålla ett xylanasenzym som uppvisar termoﬁlicitet och alkaloﬁlicitet.

Med begreppet "termoﬁlicitet" avses om ett enzym är aktivt, eller mer aktivt, vid en rs högre temperatur jämfört med aktiviteten av ett annat enzym när alla andra betingel- ser förblir konstanta. Till exempel uppvisar xylanas I förhöjd termoﬁlicitet jämfört med xylanas II och xylanas I är kapabel till, eller är mer aktiv, hydrolyseringen av xylan vid en högre temperatur än xylanas 2, under identiska betingelser genom att använda samma substrat Eftersom de ﬂesta xylanaser är effektiva vid en högre tem- 20 peratur när man hydrolyserar ren xylan snarare än massa, bör jämförande analys göras genom att använda samma substrat. Kvantitativa mätningar av termoﬁlicitet som refereras till häri använder rena xylansubstrat om inget annat sägs.

Med "termostabilitet" menas förmågan för ett enzym att lagras eller inkuberas vid 25 högtemperaturbeﬁngelser, vanligtvis i frånvaro av substrat, och sedan uppvisar akti- vitet när det återvänder till standardmässiga analysbetingelser. Till exempel sägs co I o: ,- xylanas 1 uppvisa förhöjd termostabilitet jämfört med xylanas 2 och xylanas l bibe- håller en större mängd av aktivitet än xylanas 2 efter att hållits kvar vid en viss tem- peratur (vanligtvis en högre temperatur), tex men inte begränsad till 70°C i 24 30 timmar, följt av analys vid en lägre temperatur. I motsats till tennoﬁlicitet hänför sig termostabilitet till den återstående enzymaktiviteten efter inkubering i frånvaro av substrat. 526 842 o un: n Q - n Q n q a an: oo 17 Användningen av dessa två begrepp (termoﬁlicitet och tennostabilitet) har missför- ståtts inom teknikens ståndpunkt eftersom de har använts utbytbart. Emellertid är användningen av begreppet såsom deﬁnieras här konsekvent med användningen av begreppen inom omrâdet (Mathrani och Ahring, 1992).

Med "alkaloﬁlicitet" avses att ett enzym är aktivt eller mer aktivt, vid ett högre pH jämiört med aktiviteten av ett annat enzym när alla andra betingelser förblir kon- stanta. Till exempel uppvisar xylanas 1 förstärkt alkaloﬁlicitet jämfört med xylanas 2 och xylanas 1 är kapabelt att hydrolysera xylan vid ett högre pH än xylanas 2. 10 Vanligtvis hänför sig alkaloﬁlicitet till enzymaktivitet i närvaro av xylansubstrat.

Med "ett bredare intervall av effektivt pH" avses att ett enzym är aktivt, eller mer aktivt, vid ett högre pH, ett lägre pH, eller både ett högre och ett lägre pH, jämfört med aktiviteten av ett annat enzym när alla andra betingelser förblir konstanta. Till 15 exempel, vilket dock inte skall anses begränsande, uppvisar xylanas 1 ett bredare intervall av effektivt pH jämfört med xylanas 2, om xylanas 1 är kapabelt att hyd- rolysera xylan över ett pH av 5,5 - 8,0 vid nära optimal (80 %) aktivitet, emedan xylanas 2 endast kan bibehålla 80 % optimal aktivitet vid ett smalare intervall av pH 5,5 - 7,5. 20 Med "TrX-numrering" avses att numreringen associeras med positionen av aminosy- ror som baseras på aminosyrasekvensen av TrX (Xyn II - tabell 1: Tr2 - ﬁg 1; SEKV 1D NR 16). Som beskrivet nedan och som är uppenbart vid analys av ﬁg 1, uppvisar familj Il-xylanaser en väsentlig grad av sekvenslikhet. Således, genom att orientera 25 aminosyrorna för att optimera sekvenslikheten mellan xylanasenzym och genom att använda aminosyranumreringen av TrX som bas tör numrering, kan posítionema för aminosyrorna inom andra xylanasenzymer bestämmas relativt TrX.

I Med "expressionsetïektivitet" avses att lämpligheten eller enkelheten av ett aktivt 30 enzym eller enzymatisk aktivitet att produceras genom produktionsvärden, och beräknas vanligtvis om kvantiteten av aktivt enzym eller enzymatisk aktivitet som genereras per enhetsvolym av fermentationsodling när alla fermenteringsbetingelser 1000 oo 0 20 25 30 526 842 u» u n n o oo o is förblir konstanta. Till exempel, vilket inte skall anses begränsande, har xylanas 1 förbättrad expressionseiïektivitet jämfört med xylanas 2 om xylanas 1 produceras i 3-faldig mängd jämfört med xylanas 2 i en enhetsvolym av odling av samma värd.

Ett icke-begränsande exempel av sådan värd är E. coli.

Med modiﬁerad xylanas, avses förändringen av xylanasmolekylen genom att använ- da tekniker som är kända för fackmannen på området. Dessa tekniker inkluderar, men begränsas inte till, platsriktad mutagenes, kassettmutagenes, slumpmässig mutagenes, syntetisk oligonukleotidkonstruktion, kloning och andra gentekniska tekniker.

Som beskrivet i större detalj häri, har ﬂera mutanta xylanaser framställts som uppvi- sar förhöjd termoﬁlicitet, alkaloﬁlicitet och termostabilitet jämfört med nativt xyla- nas. En lista av ﬂera mutanter, vilket inte skall anses begränsande på något sätt, pre- senteras i tabell 2.

Vidare riktar sig föreliggande uppﬁnning mot ett modifierat familj Il-xylanas, t ex men inte begränsat till ett xylanas som erhålls från en T richoderma sp., som inne- fattar åtminstone en substituerad aminosyrarest, som kännetecknas av att den har en maximal eﬁektiv temperatur (MET) mellan omkring 69 till omkring 84°C. Företrä- desvis kännetecknas det modiﬁerade xylanaset som att det var ett MET mellan om- kring 70 till omkring 80°C. Denna uppﬁnning riktar sig också mot en modiﬁerad xylanas, t ex men inte begränsat till, xylanas som är erhållen 'från T richoderma, och som innefattar åtminstone en substituerad aminosyra, och som kännetecknas av att det har ett maximalt eﬁektivt pH (MEP) mellan omkring 5,8 till omkring 8,4. Före- trädesvis är lvlEP mellan omkring 6,0 till omkring 8,0. Denna uppfmning riktar sig också till en modiﬁerad xylanas, t ex men inte begränsat till en xylanas som erhålls från Trichoderma, och som innefattar åtminstone en substituerad aminosyra, och som kännetecknas av att den har en maximal effektiv temperatur (MET) mellan omkring 69 till omkring 84°C, och ett maximalt effektivt pH (MEP) mellan omkring 5,8 till omkring 8,4. Företrädesvis är MET mellan omkring 70 till omkring 84°C, och MEP är mellan omkring 6,0 till omkring 8,0. 526 842 1 u nu u A v v a 0 0 a a o ø en 19 Dessutom riktar sig föreliggande uppﬁnning till en nativ-familje Il-xylanas som kännetecknas av att den har en maximal effektiv temperatur (MET) mellan omkring 69°C till omkring 84°C och ett maximalt effektivt pH (MEP) mellan omkring 5,8 till omkring 8,4. Företrädesvis är MET mellan omkring 70 till omkring 80°C, och MEP s är mellan omlcring 6,0 till omkring 8,0.

Bestämning av MET och MEP av en xylanas kan genomföras enligt följande: (i) uppmätning av temperaturproﬁlen av en xylanas som beskrivet i exempel 3.

Temperaturerna fór vilka åtminstone 80 % av den optimala (maximala) aktivi- 1o teten bestäms, och den högsta temperaturen är MET; (ii) nppmätning av pH-proﬁlen av en xylanas som beskrivet i exempel 4. pH:t för vilken åtminstone 80 % av den optimala (maximala) aktiviteten bestämt, och det högsta pH:t är MEP. 15 Dessa värden kan sedan plottas som visas i ﬁg 11.

I 00-0! 526 842 o n n c o. o o 20 Tabell 2: Modiﬁerade xylanaser n .oo oo Xylanas Beskrivning TrX-I-IMI. TrX med NIOH, Y27M, och N29L (se US-A-5 579 804) TrX-Hhﬂ-IOSR TrX NIOH, Y27M, N29L och Ll05R TrX-HML-'JSA- 1 OSR TrX NIOH, Y27M, N29L, S75A och LIOSR TrX-HML-75 G- l OSR TrX NIOH, Y27M, N29L, S75G och LIOSR Trx-mn-GRAB Tfx 111011, 1121111, N29L, s15G,1.10s11, Q125A ooh 112911 rfx-mnﬂuhxs rrx 111011, 11211111, N29L, sm., 110511, Q125A ooh 11295 rfx-mnfAnAs-R "rfx 111011, Y27M,N291., S154, 140511, Q125A, 11291: ooh 14411 Tfx-mn-AHAE-RR Tfx 111011, Y21M, N29L, svsA, L10511, Q125A, 112911, 14411 ooh Q16111 1111-1160 rfx D116G Tfx-usc Tfx Ynsc Tfx-I-nn-AHGAE-R Tfx 111011, 112m, N29L, sm., L1o511, D116G, Q125A, 11291: ooh 1114411 Tfx-mn-AHcAE-R Tfx 111011, Y21M, N29L, s15A, L10511, Y11sc, Q125A, 1129116611 1114411 1111-111 1D-ML- Tfx 111011, N11D, Y21M,N291., svsA, 110511, Q125A, 112911, 1114411 AHAE-RR ooh 1116111 Tfx-H-1 iD-m- 'rrx N1o11, 111 1D, 112m, N29L, svsA, L10511, D116G, Q125A, 1129E, AHGAE-RR 1114411ooh Q16111 Tfx-H-1 1D-ML- 'rfx 111011, N1 1D, Y27M, N29L, s75A, L10511, Y1 1sc, Q125A, 112911, AHcAE-RR 1114411 ooh Q16111 Tfx-H-1 1D-ML- Trx 111011, N11D, Y21M, N29L, S754, 1.10511, D116G,Y11sc, Q12sA, AHcAE-RR 112911, 1114411 ooh 016111 Substimering vid position 11, 116, 118, 144 eller 161 förändrar inte signiﬁkant den speciﬁka aktiviteten av xylanasenzymet jämfört med den för det naﬁva xylanaset (se tabell 4, exempel 2-3). 526 842 o o a u oc 21 Förbíittringgv exnressionseﬁektivitete De mutanta xylanasema TrX-H-l 1D-ML-75A105H-l25Al29E-144Rl6 IR, (TrX-H-l lD-ML-AHAE-RR); s TrX-H-11D-ML-75A105H-1 16G-125A129E-144R16lR, (TrX-H11D-ML- AHGAE-RR); och TrX-H-11D-ML-75A105H-118C-125A129E-l44Rl6lR, (TrX-Hl lD-ML-AHCAE- RR), som alla bär mutationerna Nl 1D, har konsekventa utuyck som produceras från 10 omkring 2,5 till 4,3 gånger så mycket protein som deras prekursorer utan denna mutation (se tabell 5, exempel 2-4). Dessa resultat antyder att denna mutation tör- bättrar utbytet av produktionen av xylanaser, en viktig faktor vid all produktion i industriell skala. Denna förbättring i expressionseñektiviteten av xylanas erhålls utan någon minskning av termoﬁlicitet och alkaloﬁlicitet av xylanaset.

Förhöjning av termoﬁliciteten av gylanas Mutationen av position 144 till Arg har förbättrat den enzymatiska aktiviteten av mutant xylanas TrX-I-IlvlL-75A105H-l25Al29E-INR, (TrX-PIlvíL-AHAE-R) i 20 hydrolysen av xylan vid högre temperaturer (ﬁg 3), jämfört med prekursorxylanas TrX-HML-7 5A105H- l25Al29E som saknar denna mutation. Därför tillhandahåller ﬁâreliggande uppﬁnning ett nativt eller ett modiﬁerat xylanas som innefattar en basisk aminosyra, t ex men inte begränsat till Arg, vid position 144. Företrädesvis uppvisar det nativa eller modifierade xylanaset med den basiska aminosyran vid ' 25 position 144 en MET mellan omkring 69 till omkring 84°C.

Två mutationer vid positionema 116 och l 18 till Gly respektive Cys, demonstrerar __ också förbättrad aktivitet och xylanas vid höga temperaturer. Jämfört med nativt TrX, uppvisar enkelpunktsrnutantema TrX-1l6G och TrX-118C en större aktivitet 30 med högre temperaturer (ﬁg 4), med ett temperaturoptimum vid 55°C, jämfört med 50°C uppvisat av nativ TrX. 0 OI O 0 0000 CIO cc 20 526 842 22 Samma förstärkning i termoﬁliciteten av dessa två mutatíoner (116 och 1 18 till Gly respektive Cys) observeras också i: TrX-HM -75A105H-116G-125A129E-144R, (TrX-I-IhfíL-AHGAE-Ry och TrX-HML-75A105l-l-118C-l25Al29E-l44R, (TrX-I-[hﬂ-AHCAE-R), när de jäinfórs med prekursorxylanaset, TrX-HML-75Al05H-125A129E-144R, (TrX-llls/E-AHAE-R) vid pH 5,5 (se ﬁg 5, ll6G-mutant) och pH 6,0 (ﬁg 6 och 7).

Förbättring i termoﬁlicitet genom mutationema vid position 116 till en liten icke- polär rest är oväntad eftersom en majoritet av de naturliga xylanaserna inklusive termoﬁla xylanaser (t ex Tf; TL Cs, ﬁg 1) innehar negativt laddade aminosyror, asparginsyra (D, 66 %, ﬁg 1) ochglutaminsyra (E, 10 %, ﬁg 1), eller en polär, olad- dad aminosyraglutamin (Q, 15 %, ﬁg 1) vid denna position. Inga kända xylanaser innehar en Gly vid position 116. Därför riktar sig föreliggande uppﬁnning också till en nativ eller en modiﬁerad xylanas som innefattar en icke-polär aminosyra, tex men inte begränsat till Gly, vid position 116. Företrädesvis uppvisar den nativa eller modifierade xylanasen med en icke-polär aminosyra vid position 116 ett MET mellan omkring 69 till omkring 84°C.

Förbättringen av termoﬁliciteten som baseras på mutationen vid position 118 till cystein är också oväntad, eftersom de flesta xylanaser inklusive termoﬁla xylanaser (Tf, Tl, Cs, ﬁg 1) innehar en tyrosin (Y, 60 %, ﬁg 1) och tryptofan (W, 10 %, ﬁg 1).

De enda xylanasema som innehar cystein vid position 118 är bland de mesoﬁla Aspergillus niger, Aspergillus kawakii och Aspergillus tubigensis (ﬁg 1), med tem- peraturoptimum av dessa xylanaser runt 45-55°C (Sunna och Antranikian, 1997).

Därﬁir riktar sig föreliggande uppfinning också till en modiﬁerad xylanas som inne- fattande en icke-aromatisk hydrofobisk aminosyra, t ex men inte begränsat till Cys vid position 118, och till ett nativt xylanas som innefattar en icke-aromatisk hydro- fob aminosyra vid position 118, under förutsättningen att det nativa xylanaset uppvi- sar en MET mellan omkring 69 till omkring 84°C.

En annan mutation vid position ll till Asp förstärker också tennoﬁliciteten av xyla- nas. Mutant TrX-H-l 1D-ML-75A l 05H-l25A129E-l44R16 lR, (TrX-Hl lD-ML- l IC IOIO ll 0 O I 0 n II nu n. 0 0 u 0 I u I I nO en coca Q 0 Q 1 u l 8 I 0 I 0 On In 0000 001 20 25 526 842 23 AHAE-RR) uppvisar större aktivitet vid högre temperaturer,- jämiört med prekursom TrX-llML-75Al05H-l25Al29E-144 (TrX-HML-AHAE; ﬁg 8). Detta resultat är också oväntat eftersom (Turenen et al (2001)) rapporterade att samma N1lD- mutation sänkte temperaturoptimumet och intervallet i en TrX-mutant innehållande en intramolekylär disulﬁdbindning. Dessutom beskriver US-A-5 759 840 att llD- mutationen inte har någon etïekt mot termoﬁliciteten av TrX-H-1 ID-ML (mutant benämnd NI-TX 12). Därför riktar sig föreliggande uppﬁnning också till en nativ eller modiﬁerad xylanas som innefattar en sur aminosyra, t ex men inte begränsat till Asp, vid position _11 8¿_under ñrutsätmingen att det nativa eller modiﬁerade xylana- set uppvisar en MET mellan omkring 69 till omkring 84°C.

Vidare kan mutationerna som identiﬁeras ovan kombineras för att skapa mutanta xylanaset med större termoﬁlicitet, även vid högre pH-iritervall. Kombinations- mutantxylanaserna baserade på trippelmutationerna NI 1D/Dl 16G/ l44R eller N11D/Y118C/144R, nämligen: TrX-H-11D-ML-75Al05H-1l6G~l25A129E-l44Rl61R (TrX-H1 lD-ML-AHGAE- RR); och TrX-H-llD-lsﬂl-75Al05H-l 18C-125A129E-144R161R (TrX-Hl lD-ML-AHCAE- RR). uppvisade vid en maximal enzymatisk aktivitet vid högre temperaturer av 70-75°C och visade ytterligare signiﬁkant enzymatisk aktivitet vid 80°C vid pH 5,5 (ﬁg 5, endast ll6G-mutant) och pH 6,0 (ﬁg 6 och 7). Dessa resultat antyder effekten av mutationerna Dl16G eller Yl18C med NI 1D och Hl44R på termoﬁliciteten av det mutanta xylanaset att det är komplementärt. Därför hänför sig föreliggande uppﬁn- ning till en nativ eller modiﬁerad xylanas som innefattar en sur amino syra vid posi- tion 11, en icke-polär aminosyra vid position 116, och en basisk aminosyra vid position 144, t ex men inte begränsad till N1lD/D1l6G/l44R eller en sur aminosyra vid position ll, en icke-aromatísk hydrofob aminosyra vid position 118 och en basisk aminosyra vid position 114, tex men inte begränsad till Nl1D/Yl18C/144R.

Företrädesvis uppvisar den nativa eller modiﬁerade xylanasen som innefattar en sur aminosyra vid position 11, en icke-polär aminosyra vid position 116, och en basisk aminosyra vid position 144, eller xylanaset som innefattar en sur aminosyra vid 20 526 842 24 one o o 0 o n u position 11, en icke-aromatisk hydrofob aminosyra vid position 118, och en basisk aminosyra vid position 114, ett MET mellan omkring 69 till omkring 84°C.

Utöver uppnâendet av optimal aktivitet vid högre temperaturer, uppvisar de mutanta xylanaserna som baseras på föreliggande uppfinning, t ex: TrX-H-11D-ML-75A105H-1l6G-125A129E-144R161R (TrX-H1 lD-ML-AHGAE- RR); och TrX-H-11D-ML-75A105H-118C-125A129E-144R161R(TrX-HllD-MLAHCAE- RR), (ﬁg 5 och 6), även högre enzymatisk aktivitet (baserat på större xylosfrisättning) vid deras temperaturoptimum. Både TrX-HI lD-ML-AHGAE-RR och TrX-HI lD-ML- AHCAE-RR uppvisar omkring 600 % aktivitet vid deras temperaturoptimum, än aktiviteten som observeras vid 40°C. Detta kan järnﬁiras med prekursom, modiﬁe- rad xylanas TrX-Hhﬂ-75A105H-125A129E, vilken uppvisar omkring 400 % akti- vitet vid en temperaturoptimum, mot dess aktivitet vid 40°C, och naturlig TrX (150 % av dess aktivitet vid dess optimala temperatur, mot värdet vid 40°C).

Denna uppfinning inkluderar således en modifierad xylanas som innefattar en His vid positionerna 10 och 105, en Met vid position 27, en Leu vid position 29, en Ala vid positionerna 75 och 125, en Glu vid position 129, och åtminstone en av: 0 en sura aminosyra vid position 11; 0 en liten icke-polär aminosyra vid position 116; 0 en mediumstor icke-aromatisk hydrofob aminosyra vid position 118; och 0 en basisk aminosyra vid position 144 F öreträdesvis är aminosyran vid position 11 Asp (D), aminosyran vid position 116 är Gly (G), arninosyran vid position 118 är Cys (C), och aminosyran vid position 144 väljs ﬁån gruppen som består av Lys (L) och Arg (R). 20 25 n n o Q nu e ø ø u u.

Förhöjning av alkaloﬁliciteten av gylanas Effekten av pH-betingelser på den enzymatiska aktiviteten genom mutation Q16 IR i det mutanta xylanaset TrX-I-IhlIL-75A105H-125Al29E-144R161R (TrX-HM - AHAE-RR), visas i ﬁg 9. Jämfört med dess prekursorer TrX-I-llvíL-75A105H- 125A129E och TrX-HML-75Al05H-l25A129E-144R (ej visat). Dessa senare enzymer har identiska pI-I/aktivitetsproﬁler, emellertid uppvisar det mutanta xylana- setTrX-PINILJSAIOSH-125A129E-144Rl61R (1 rX-HML-AHAE-RR) en större aktivitet vid högre pH-intervall av omkring 6,5 till omkring 8,0. TrX-HML-AHAE- RR uppvisar även lägre aktivitet) vid lägre pH av omkring 5,0 till omkring 6,0, när den jämförs med prekursorer utan denna mutation. Således hänför sig föreliggande uppfinning till en nativ eller en modifierad xylanas som innefattar en basisk amino- syra, t ex men inte begränsat till Arg, vid position 161. Företrädesvis uppvisar den nativa eller modiﬁerade xylanasen med den basiska aminosyran vid position 161 en MEP mellan omkring 5,8 till omkring 8,4.

Mutationerna vid positionema 116 och 118 till Gly respektive Cys, förbättrar även enzymatisk aktivitet vid högre pH-intervall. Jämfört med nativt TrX, har de enskilda mutanterna TrX-116G och TrX-118C större aktivitet vid högre pH som visat i ﬁg 10.

Förbättrandet genom mutationen vid positionerna 116 till en lite icke-polär rest för att förbättra alkaloﬁliciteten är oväntad eftersom ingen naturlig förening innehar en Gly vid position 116. Därför tillhandahåller föreliggande uppﬁnning ett nativt eller ett modifierat xylanas som innefattar en icke polär aminosyra, t ex men inte begrän- sat til] Gly, vid position 116. F öreträdesvis uppvisar den nativa eller modiﬁerade xylanasen med den icke-polära amínosyran vid position 116 en MEP mellan om- kring 5,8 till omkring 8,4.

Förbättrandet av termoﬁlicíteten baserat på mutationen vid position 118 till cystein är också oväntad, eftersom de ﬂesta xylanaser, inklusive alkaloﬁla xylanaser (t, ex, Tf, Bp, se ﬁg 1) innehåller en tyrosin (Y, 60 %, ﬁg 1) och tryptofan (W, 10 %, ﬁg Ilocø 20 26 1). De enda xylanaserna som innehar cystein vid position 118 är bland de acidoﬁla Aspergillus niger, Aspergillus kawakii och Aspergillus tubigensis (ﬁg 1), med pH- optimum av dessa xylanaser runt 2-4 (Sunna och Antranikian, 1997; Kinoshita et al 1995). Därför innefattar föreliggande uppﬁnning en nativ eller modiﬁerad xylanaS som innefattar en icke-aromatisk hydrofob aminosyra, t ex men inte begränsat till Cys, vid position 118. Företrädesvis uppvisar den nativa eller modiﬁerade xylanasen med den icke-aromatiska hydrofoba aminosyran vid position 118 ett MEP mellan omkring 5,8 till omkring 8,4.

En fórstärkande effekt i alkaloﬁliciteten av xylanas, genom mutationerna D116G och Y118C, observeras också i mutantema: TrX-I-Ihﬂ-75A105H-116G-l25A129E-144R (T rX-PINíL-AHGAE-m; och TrX-HNIL-75Al05H-118C-l25A129E-144R (TrX-I-IlvlL-AHCAE-R), (ﬁg 9), när den jämförs med prektirsorxylanasema TrX-I-lh/[L-75A105H-125A129E- 144R och TrX-I-Ihﬂf75A105H-125A129E. Emedan båda mutantema uppvisade höga aktiviteter vid pH ﬁán omkring 6,5 till omkring 8,0, behåller endast mutanten rfx-mn-vsA1osH-116G-12sA129B- 1441: (Tfx-rﬂwL-AHGAE-R) väsentligen optimal aktivitet vid det lägre pHzt av omkring 5,0 till omkring 6,0. Detta bibehåll- ande av hög aktivitet vid pH av omkring 5,0 till omkring 8,0 representerar en bredd- ning av det optimala pH-intervallet genom denna mutation vid position 116.

Mutationema som identiﬁerats ovan har kombinerats för att skapa mutanta xylanaser med större alkaloﬁlicitet och termoﬁlicitet. Kombinationsmutantxylariaserna som baseras på kvadtipla rnntationer N1 ID/D116G/144R/Q161R eller N1 1D/Y1 18C/l44R/Q 16 IR, nämligen: TrX-H-1 1D-ML-75A 105 H-1 16G-125A129E-144R161R (TrX-H1 lD-ML-AHGAE- RR; ﬁg 9); och TrX-H-11D-ML-75A105H-118C-l25A129E-144Rl61R (TrX-Hl lD-ML-AHCAE- RR; ej visad), uppvisar nära maximal enzymatisk aktivitet vid pH ﬁân omkring 5,0 till omkring 7,0, jämfört med deras prekiirsorer. Dessutom hjälper närvaron av mutationen D116G bibehållandet av väsentligen maximal aktivitet vid lägre pH-intervall av uno no 20 526 842 27 omkring 5,0 till omkring 6,0, vilket därigenom undviker den signiﬁkanta förlusten av aktivitet vid lågt pH som observerats i prekursorn TrX-PML-75A105H- 125Al29E-144Rl61R (ﬁg 9). Dessa resultat bekräﬂar vidare breddningen av det optimala pH-intervallet genom denna mutation vid position 116. Därför hänför sig denna uppﬁnníng till en nativ eller modiﬁerad xylanas som innefattar en sur amino- syra vid position 11, en icke-polär aminosyra vid position 116, och en basisk amino- syra vid position 114, t ex men icke begränsat till Nl1D/Dl16G/l44R, eller en sur aminosyra vid position 11, en icke-aromatisk hydrofob aminosyra vid position 118, och en basisk aminosyra vid position 114, t ex men inte begränsat till N11D/Yl18C/144R. Företrädesvis innefattar den nativa eller modiﬁerade xylanasen en sur aminosyra vid position 11, en icke-polär aminosyra vid position 116, och en basisk aminosyra vid position 114, eller xylanaser som innefattar en sur aminosyra vid position 11, en icke-aromatisk hydrofob aminosyra vid position 118, och en basisk aminosyra vid position 114 med ett MEP mellan omkring 5,8 till omkring 8,4.

Denna uppfinning tillhandahåller också en modiﬁerad xylanas som innefattar en His vid positionema 10 och 105, en Met vid position 27, en Leu vid position 29, en Ala vid positionema 75 och 125, och Glu vid position 129, och åtminstone en av: 0 en sura aminosyra vid position 11; en liten icke-polär aminosyra vid position 116; v en mediumstor icke-aromatisk hydrofob aminosyra vid position 118; en basisk aminosyra vid position 161.

Företrädesvis är aminosyran vid position 11 Asp, aminosyran vid position 116 är Gly, aminosyran vid position 118 är Cys, aminosyran vid position 161 väljs ﬁån gruppen som består av Lys, och Arg.

För att sammanfatta kan förbättrade alkaloﬁla mutant-TrX-xylanaser konstrueras genom: n oro ut 5.96 842 28 i) mutation av Asp 116 till en liten icke-polär rest, t ex men inte begränsad till Gly; ii) mutation av Tyr 118 till en mediumstor, icke-aromatisk hydrofob rest såsom men inte begränsad till Cys; 5 iii) mutation av Glen 161 till en basisk aminosyra Arg eller Lys; iv) kombination av mutationema som beskrivs i i) med de som beskrivs i ii) till iii) för fórbättrandet av termoﬁlicitet och alkaloﬁlicitet; eller v) kombination av mutationema som beskrivs i i) till iv) ovan, med HlvIL-seriema av mutationer som beskrivs ovan (se US-A-5 759 840 vilken inkorporeras hån' 10 genom referens ﬁór HML-mutationer).

Ovanstående beskrivning är inte avsedd att begränsa den skyddade uppfinningen på något sätt, och dessutom måste inte de diskuterade kombinationerna av egenskaper- na vara absolut nödvändiga för uppﬁnningslösningen.

Exempel Föreliggande uppﬁnning kommer nu att ytterligare illustreras i följande exempel.

Emellertid skall det förstås att dessa exempel är endast för illustrativa ändamål och 20 bör inte användas för att begränsa uppﬁnningens skyddsomfâng på något sätt.

EXEMPEL 1: Konstruktion av Trichoderma reesei-mutanta xylanaser Grundläggande rekombinanta DNA-förfaranden som plasmidberedning, restrik- zs tionsenzymnedbrytning, polymeraskedjereaktion, och oligonukleotidfosforylering, ligering, transformering och DNA-hybridisering genomfördes enligt väl etablerade protokoll som är kända för fackmannen på området (t ex Sung et al., 1986) eller som 7": rekommenderas av tillverkaren av enzymema eller kiten. Buiïertania för många enzymer har tillhandahållits som delar av ett kit eller har tillverkats enligt tillverka- 30 rens instruktioner. Resniktionsenzymer, T4-polynukleotidkinas och T4 DNA-ligas inhandlades från New England BioLabs Ltd, Mississauga, Ont. GeneAmp PCR- reagenskit inhandlades ﬁån Perkin-Elmer. En prekursorplasmid pXYbc, vilket är en 20 526 29 pUC-typs plasmid med en Bacillus circulans xylanasgen insatt, har tidigare fram- ställts oﬂiciellt (Sung et al, 1993; Campbell et al., US-A-5 405 769). En vanligt använd E. coli-stam, HB 101 (Clonetech Lab, Palo Alto, CA) användes som en transformerings- och expressionsvärd för alla genkonstrukt. Birchwood xylan och Remazol Brilliant Blue R-D-Xylan inhandlades från Sigma (St. Louis, Mo).

Hydroxibensoesyrahydrazid (I-IBAH) inhandlades från Aldrich. Oligonukleotider framställdes med en APPLID BIOSYSTEM DNA synthesizer (modell 380B). Alla xylanasenzymatiska analyser genomfördes i ett täckt cirkulerande vattenbad (Haake typ F 4391) och bibehölls inom ett temperaturintervall av i O,l°C. 1-1: Konstruktion av prekursogglasxnid pTrX som innehar ggtetisk TrX (SEKV ID NR 39 Prekursorplasmiden pTrX för mutationema som diskuteras nedan har tidigare publi- cerats (Sung et al, 1995). Denna plasmid är framtagen från en pUC119-plasmid med en syntetisk nukleotidsekvens kodande för en Trichoderma reesei xylanas (TrX; ﬁg 2). Expression av denna xylanas och andra mutanta xylanaser som beskrivs därefter är under kontrollen av lac Z-promotorn av pUC-plasmiden. Den totala ihopsätming- en av T richoderma xylanas-genen laävde två steg, initialt för (92- 190; Tr2-numre- ring) -regionen, sedan följt av (1-92; Tr2-nurnrcring) -regionen Protokollet för kon- struktionen av denna gen är rutinmässig och identisk med det standardmässiga pub- licerade förfarandet för många andra gener. Protokollet kräver enzymatisk fosforyle- ring av överlappande syntetiska oligonukleotider vilka kodar för en xylanas. Denna är följd av deras ligering i en lämpligt skuren plasmid.

För konstruktionen av TrX (92-190), utformades tio överlappande oli gonukleotider (se ﬁg 2): XyTv-101 SEKV ID NR 29; XyTv-l02 SEKV ID NR 30; TrX-103 SEKV ID NR 31; XyTv-104 SEKV ID NR 32; 59.6 842 - . n u » o u »nu oo 30 XyTv- 105 SEKV 1D NR 33; XyTv-106 SEKV 1D NR 38; XyTv-lO7 SEKV 1D NR 37; TrX-l08 SEKV ID NR 36; 5 XyTv-109 SEKV 1D NR 35; och XyTv-110 SEKV ID NR 34 med kodonanvändningsfrekvenser som imiterar dem för E. coli. De sammanhängan- de Sall- och BglII-ändama av de två terminala oligonukleotidema möjliggjorde den 10 enzymatiska ligeringen av tio fragment till den linjeariserade plasmiden pXYbc. De tio oligonukleotiderna (50 pmol, 1 ul för vardera) som kodar för en TrX (92-190)- regionen av Trichoderma xylanas fosforylerades i en blandning som innehåller 10x standardkinasbutïert (0,4 ul), lmM ATP (4 ul), T4 DNA-kinas (5 enheter), och vatten (3 ul). Fosforyleringsreaktionen genomfördes i l timme vid 37°C. Lösningar- 15 na kombinerades sedan och värmdes upp till 70°C i 10 minuter. Efter att ha kylts ned långsamt till rumstemperatur sattes de kombinerade lösningarna till en bland- ning av 4 mM ATP (3,5 ul), EcoRl-I-IindIH-linjeariserad plasmid pUC119 (0,1 pmol), och T4 DNA-ligas (3,5 ul) och inkuberades vid l2°C i 20 timmar. Alikvoter av ligeringsblandningen användes för att transfonnera E. coli HB 101 på YT-plattor 20 (8 g jästextralct, 5 g baktotrypton, 5 g NaCl, 15 g agari 1 1 vatten) innehållande ampicillin (100 mg/l).

För framställningen av en hybridiseringsprob, fosforylerades en av oligonukleoti- 5 dema, t ex XyTv-110 (10 pmol, 1 ul) med ”P-ATP ( 10 pmol, 3 ul) för att använda 25 T4 DNA-kinas (1 ul), l0x kinasbuiïert (1 ul), och vatten (4 ul) vid 37°C i 1 timme.

Transformantema valdes slumpmässigt ut fór hybridiseringsanalys. Kolonier läts växa på YT-plattor med ampicillin över natt, och överfördes till nylonﬁlter. De _ denaturerades sedan med 0,5N NaOH - 1,5 M NaCl (10 minuter) och neutralisera- 30 des med 0,5N Tris-HCl (pH 7,0) - 1,5 M NaCl (10 minuter). Eﬁer ultraviolett i bestrålning vid 254 nm i 8 minuter, tvättades ﬁltema med 6X SSC - 0,05 % Triton X-100 i 30 minuter. Celldebris skrapades bort fullständigt. Efter ytterligare 30 20 25 3 O 526 842 31 minuter i färsk lösning överfördes de dubbla ﬁltren individuellt i separatorbland- ningen av 6X SSC - 1 % dextran-sulfat - 0,05 % TritonX-IOO - IX Denhardts- hybridiseringsvätska. Den ”P-märkta proben sattes till ﬁltret. Efter 16 timmar vid 45 °C tvättades ﬁltret två gånger med 6X SSC - 0,05 % TritonX-IOO vid rumstem- peratur i 5 minuter och sedan vid 65°C i 30 minuter. Positivt hybridiserade kloner med mellanproduktplasmiden pBcX-TrX identiﬁerades genom autoradíograﬁsk analys.

Ovanstående protokoll, vilket involverar enzymatisk fosforylering av syntetiskt överlappande oligonukleotider och lígering i en linjeariserad plasmid, användes ihopsâttningen av TrX (1-92) -regionen och i kassettmutagenesen for de efterföljan- de bilderna av andra mutantxylanaser som beskrivs i denna uppﬁnning.

För ihopsätmingen av TrX (1-92; Tr2-numrering) -regionen for att fullgöra full- längds T richodemza reesei xylanas II-genen (TrX), linjeariserades mellanprodukt- plasmiden pBcX-TrX med NheI- och Kpnl-endonukleaser for att frisätta DNA- insättningen för BcX (1-83). Med de sammanhängande Nhel- och KpnI-ändama, ligerades åtta överlappande oligonukleotider: TrX-l SEKV 1D NR 21; XyTv-2 SEKV ID NR 22; TrX-3 SEKV ID NR 23; XyTv-4 SEKV ID NR 24; XyTv-5 SEKV ID NR 28; TrX-6 SEKV ID NR 27; XyTv-7 SEKV ID NR 26; och TrX-8 SEKV 1D NR 25, som kodar för TrX (1-91) -sekvensen in i den linjeariserade plasmiden pBcX-TrX (ﬁg 2), via protokollet som beskrivs ovan. Den nya plasmiden pTrX innehar således en syntetisk TrX-gen (SEKV ID NR 39). noe co 0 00 5000 00 Q 0 O I Inca I 0 0 I 0 ool 00 0000 0 0 g I U O I n OO 526 842 32 n 1 u ro - » 0 u o o Alla mutanta xylanas gener som beskrivs nedan har konstruerats via förfarandet av kassettmutagenes. Protokollet för kassettmutagenes var identiskt med det som beskrevs for geninsättningen som beskrivs ovan. I allmänhet involverade kassett- mutagenes (i) enzymatisk fosforylering av överlappande syntetiska oligonukleotider, (ii) ligering av syntetiska oligonukleotider med en linjeariserad plasmid, (iii) trans- fonnering av plasmiden in i E. coli-HB 101-kompetenta celler, (iv) identifiering av mutanta transfonnanter via hybridisering med den märkta oligonukleotiden, och (v) konﬁrmering av mutationen genom dideoxinukleotidsekvensning. 1-2: Konstruktion av prekursorplasmiden nTrX-lllvlL Konstruktionen av denna prekiirsorplasmid pTrX-HML har beskrivits i detalj i US-A-5 759 840 (se exempel IN, här inkorporerat genom referens; plasmiden benämns pNI-TX13). TrX-l-IML innefattar den nativa TrX-xylanasen, tillsammans med tre mutationer vid NlOH (Asn vid position 10 ersätts med His), Y27M och N29L. De första 30 aminosyroma av sekvensen som innefattar NlOH, Y27M och N29L visas nedan. rrx 1 2 3 4 s s 7 e ﬂminesrra Q 'rgr Q P c r t; s'-cr AGc rAA GGA se çrc; cAG Arc cAA AcA ArA cAA ccA GGA Acc Ger 3'-c-: Arr ccr cc GAc crc rAc crr rer rAr arr Ger ccr res ccA NheI 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 Y B N G Y F Y S Y W N D G H G G TAC CAC AAC GGT TAC TTT TAC AGC TAT TGG AAC GAT GGC CAT GGA GGC ATG GTG TTG CCA ATG AAA ATG TCG ATA ACC TTG CTA CCG GTA CCT CQG 25 26 27 28 29 30 V T M T L G GTC ACA ATG ACT CTG GGG CAG TGTTTAC TGA GAC CCC PinAI _ 20 25 526 842 33 cv un; n o n ø nu 1-3: Konstruktion av deletionsnlasmiden nTrX-lilvlL-t l-1 lïﬁ Plasmiden pTrX-HML-( l-1 13) innefattar aminosyrasekvensen 1-113 av TrX (SEKV ID NR 39) och kan inte uttrycka ett aktivt xylanas. Sådana transformanter konﬁrme- ras genom frånvaron av en avskiljningszon eller halo nmt transformantkoloniema på blå xylanplattor.

Den nya plasmiden konstruerades vid (i) borttagandet av TrX (114-190) som kodar för sekvensen av pTrX-I-IlvIL genom klyvning med restriktionsenzymerna BamHI och BglII, (ii) ligering av de identiska sammanhängande ändarna av den linjeaiise- rade plasmiden, (iii) transformering in i E. coli HBIOI-kompetenta celler följt av plätexing på YT-platta (irmehållande 5 g jästextrakt, 3 g baktotrypton, 5 g NaCl. 15 g agar i 1 1 vatten, 1 g Remazol Brilliant Blue R-D-xylan) och ampicillin (100 mg/l), (iv) identifiering av de mutanta transformantema genom förlusten av xylanasaktivi- tet (frånvaro av en avskiljningszon eller halo runt koloniema på blå xylanplattor över natt vid 40°C), och (v) konfumering av mutationen genom dideoxinukleotid- sekvensning. Protokollet fór var och en av dessa steg var liknande med det för gen- ihopsättningen som beskrivs ovan. 1-4: Konstruktion av plasmiden pTrX-I-IML- 105R Mutant xylanas pTrX-HML-IOSR är liknande TrX-HML med undantaget att Leu vid position 105 ersätts med Arg (Ll05R).

PCR användes för att generera ett DNA-fragment som kodar for (100-190)-region med LIOSR-mutation. PCR-primers med mutation (i fet stil) i konstruktionen av pTrX-HML-105R visas nedan. rx-105R-1 (SEQ ID No:44) 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 T G A T K R G s v 'T s D G S 5'-ACC GGC GCC ACA AAA AGA GGC GAA GTC ACT AGT GAT GGA TCC Kasï 526 842 =::= oense , . ' , . o n Q n. 34 Omvänd PCR-primer TX-Cl innefattade: rx-c1 (sso ID No:42) 183 184 185 186 187 188 189 190 ter G s A s I T v s ccA Ace cGA rcA TAA TGT cAc Tce ATT Tcr AGA Aer Tee AAC cc-5' BglI HindIII Det lämpliga PCR-templatet och primerarna och restriktionsenzymema for att klyva ändama av PCR-produktema listas nedan (tabell 3-1). 10 Tabell 3-1 PCR-produkt PCR upp- PCR omvänd PCR-templat Restiiktionsenzym strömsprimer primer for PCR-produkt (a) TX-105R-1 TX-Cl pTrX KasI/HindIH Den kluvna PCR-produktion (a) (tabell 3-1) ligerades in i KasI/HindIII-linjeariserad plasmid pTrX-HML (1-113) för att generera plasmid pTrX-HML-l05R. 15 1-5: Konstruktion nlasmidema pTrX-HML-75Al05R och nTrX-IfIlvIL-75Gl05R Xylanasmutantema pTrX-HML-75 A-IOSR och pTrX-l-IML-75G-lO5R är liknande pTrX-HML-IOSR, med undantaget av en ytterligare enkel mutation S75A respektive S75G. 20 PCR-primers med mutationema S75A (TX-75A-1; SEKV ID NR 40) och S75G (TX75-G-l; SEKV ID NR 46) visas nedan. “7 Txqsä-l (SEO ID Nowio) än* 69 10 11 72 73 74 vs 76 77 78 79 8 0 81 - - N G _ ~ - ._ z N s Y L A V Y G W S R 5'-T GGG AAT TCA TAC TTA GCC GTC TAT GGC TGG T " CT AG 2 : EcoRI z 526 842 ss -rx-7sc-1 (ssqro Nowae) 69 70 71 72 13 74 'Is vs 'n 78 79 so 81 .RGNSYLG-vxcwss 5'-'r GGG AAT 'rcA TAC TTA GGC Gfrc 'rAT GGC 'rGG 'rcT AG EcoRI Det lämpliga PCR-templatet och primerarna, och restriktionsenzymerna fór att klyva ändama av PCR-produkterna listas nedan (tabell 3-2).

Tabell 3-2 PCR-produkt PCR upp- PCR omvänd PCR-templat Resniktionsenzym strömsprimer primer for PCR-produkt (b) TX-75A-1 TX-Cl pTrX-HML- EcoRI/HindIII l05R (c) TX-75G-1 TX-Cl pTrX-HML- EcoRI/HindIII l05R De EcoRI/HindIII-klyvna PCR-produkterna (b) och (c) (se tabell 3-2) framställdes och ligerades in i EcoRI/HindIII-linjeariserade pTrX-HML (1-113) för att generera plasmidema pTrX-HML-75A- l05R respektive pTrX-HML-75G- l05R 1-6: Konstruktion av plasmiden nTrX-l-llvíL-75GlO5R-l25Alëﬁ Mutanta TrX-INL-75G-105R-125Al29E var identisk med TrX-HML-75G- l05R, med undantaget av de ytterligare mutationema Q 125A och Il29E. 20 Den intakta mutanta xylanasgenen sattes ihop via legeringen av två DNA-sekvenser som kodar fór 1-121- och 122-l90-regionema. DNA-sekvenser som kodar for I-IZI-regionen isolerades genom deletionen av plasmiden pTrX-HML-75G-lO5R med restriktionsendonukleasema som listas nedan (tabell 3-3). 526 842 36 Tabell 3-3 Deletionssekvens Prekursorplasmid Restriktionsenzymer (A) pTrX-IIML-7SG-IOSR NheI/Mlul DNA-sekvensen som kodar för 122-190-regionen var en PCR-produkt (d) genom en s primer som kodar för mutationema som beskrivs nedan. 'rxnzsmzsz-s. (sno m' icons) 120 121 122 '123 124 125 126 121 12a 129- _13o 131 132 133 QRVN_APSIEGTAT s'-c CALQQLQQT. AAT scc; ccA Tcs Arc sas GGA Acc scc Acc MluI I De lämpliga PCR-templaten och primerarna, och restrikﬁonsenzymema för att klyva änden av PCR-produkten listas nedan (tabell 3-4.

Tabell 3-4 1s PCR-produkt PCR upp- PCR omvänd PCR-templat Resniktionsenzym stömspximer primer för PCR-produkt (d) TX- 125A129E-1 TX-Cl pTrX lvﬂul/I-Iindlll Den klyvda PCR-produkten (d) och deleﬁonssekvensen (A) ligerades till den _ NheIIPIindIII-linjeariserade plasmiden pTrX- (1-113) för att generera plasmíden TrX-I-IIVH..-75G-l05R-l25Al29E. zo I = 1-7: Konstruktion av glasmiden gTfx-Hm-7sA1osH-12sA129E I: Den intakta mutanta genen sattes ihop via lígeringen av två DNA-sekvenser som koda: för 1-101- och loz-wo-fegionema. _ 'If zs För ﬁamställningen av DNA-sekvensen som kodar för l-lOl-regionen, listas restriktionsnukleaser för deletionen av den lämpliga plasmiden nedan (tabell 3-5). 526 842 37 Tabell 3-5 Deletionssekvens Prekursorplasmid Restriktionsenzymer (B) pTrX-IIMLJSA-IOSR Nhel/KasI För framställningen av DNA-sekvensen som koda: för 102-l90-regionen, användes polymeraskedjereakﬁon med primer TX-l05H-1. fx-1osn-1 (sno ID No 41) __ 1oo 101 102 103 104 1os 106 101 ios ioa 110 111 112 113» 1 G A T K. a G E v 1 s D G s 5'-ACC GGC GCC ACA AAA CAC GGC GAA GTC ACT AGT GAT GGA TCC 20 25 Kasï De lämpliga PCR-primers med mutationema vid position 105 och restriktionsenzy- mema för att klyva ändarna av PCR-produkten listas nedan (tabell 3-6).

Tabell 3-6: Plasmid pTrX-I-HvIL-75G-l05R-l25Al29E som PCR-templat.

PCR-produkt PCR upp- PCR omvänd Restriktionsenzym för 'strömsprimer primer PCR-produkt (e) TX-IOSH-l TX-Cl KasI/HindIH Den klyvda PCR-produkten (e) och deletionssekvensen (B) ligerades till den NheI/HindIII-linjeariserade plasmiden TrX-(1-113) för att generera plasmiden pTrX-IIIVIIJSA-IOSH- 125 A 129E 1-8: Konstruktion av deletionsglasmiden pTrX-del(43 -53) En plasmid pTrX-del(43-53) som kodar för en inaktiv xylanas med (43 -53)-regionen borttagen, konstruerades via restriktionsklyvning av plasmiden pTrX vid BspEI- stället vid resten 43 och XmaI-stället vid rest-53 och självlegexing av de identiska ändama. Efter transformering identiﬁerades de korrekta klonerna genom icke- nu 0400 nu g. 0 0 c o o o u n. Ü o O I I I Q I I o o a o a Il nu ca coq; 526 842 38 uttryclming av xylanas eller ﬁånvaro av halo eller avskiljningszon i blå xylanasirmehållande YT-plattor. 1-9: 75A105H-del( 123- 14ﬁ Konstruktion av deletions lasmidema TrX-del 123-144) och nTrX-HML- Två plasmider som innehöll partiellt deleterade xylanasgen konstruerades i en PCR- reaktion med en ny primer som koda: för deletionen av (l23-l44)-regionen. 10 PCR-oligonukleotid-prirners: _ 5'-C GGA GCT CCG AC GCG TTG GGT ACG GTA GAT ATC ATA_ 5 25 148 147 146 145 G S S SacI 'SLELE 'TAA GGA se cro cAG ATG cAA A NheI Tx-aen (12s-144)-1r ( sEKv ro NR 43) R R Q T R Y MluI 122 121 120 119 118 117 116 115 1 D Y TX-Nl (SEKV ID NR 45) 12 QTI PstI 3 4 5 6 7 Q P G T CA ATA CAA CCA GG A Tabell 3-7: PCR-templat med TX-de|(123-144)-lr och TX-Nl som primer PCR-produkt PCR-templat Restriktionsenzymer for PCR-produkt (t) pTrX PstI/SacI (g) pTrX-IfIML-75A105H-l25Al29E PstI/SacI Ligering av det klyvda PCR-fragmentet (f) och (g) till den PstI/SacI-linjeariserade plasmiden pTrX och transformation fór att ge de korrekta klonema som innehar u o o ø nu I deletíonsplasmidema pTrX-del(l23-144) respektive pTrX-HML-75A105H-del(123- 144), som identiﬁerades genom uttryck av xylanas och frånvaro av avskíljningszoni de blå xylaninnehållande YT-plattoma. s 1-10: Konstruktion av glasmidçnpTrX-HML-BAIOSH-l25Al29E-l44R I I! IOII nl o o c I O I I nina 0 0 n o c OOO OO OO lv note ao o: O I 0 o 0 n g 0 o n u c o g ln o! oo o Den nya mutanten pTrX-I-IlvíL-75A105H-l25Al29E-l44R skiljer sig från prekur- sorn pTrX-I-IlvíL-75Al05H-l25A129E genom en ytterligare mutation H144R En ny PCR-omvänd primer användes for att skapa denna mutation.

Tx-144R-1r (sEKv 1D NR 47) 15.9 1sa 157 156 1ss'1s4 153 152 151 1so 149 148 141 146 145 144 143 142 wnurauaruvscssaaun _5'-CCA TGC ATT AAA GTG ATT CGC AGT ATT AAC CGA ACC GGA GCT CCG ACS Ã1&=ACG NsiI 141 140 139 138 R V S W TCT ÄÄC ACT CCA Det lämpliga PCR-templatet och primers, och restriktionsenzymema för att klyva 20 ändarna av PCR-produkten, vilken är l-l46-sekvensen, listas nedan (tabell 3-8).

Tabell 3-8 PCR- Uppströms- Nedströms- Templat Restziktions- produkt primer primer klyvning (h) TX-Nl TX-l44R-lr pTrX-HML-75A105H- PstI/NsiI l25Al29E 25 Det Pstl/NsiI-klyvda PCR-fragmentet (h) ligerades till den Pstl/Nsíl-linjeaxíserade plasmiden pTrX-del(43-53) for att återställa den ﬁmktionella xylanasgenen i den nya plasmiden pTrX-flML-75 A- 1 05 H- 1 25 A- 129E- l44R 842 40 1-11: Konstruktion av piasmiden nTfx-imL-'lsmosH-12sA129E-144R161R Den nya mutanten pTrX-lllvlL-75Al05H-125A129E-l44R16l skiljer sig från prekursom pTrX-l-IML-75AlO5H-l25A129E- l44R genom ytterligare mutation 5 Q16lR. En ny PCR-omvänd primer användes För att skapa denna mutation.

TX-16 lR-lr (SEKV ID NR 48) 168 167 166 165 164 163 162 161 160 159 158 157 156 155 154 T G L T L G _Q R A W A N F' H N I 5'-GT ACC TAG GGT TAA CCC TTG CCG TGC CCA TGC ATT AAA GTG ATT l'- AvrII En PCR-produkt innehållande TrX(l65)-regionen framställd som beskrivet i tabell 3-9.

Tabell 3-9: Plasmid pTrX-HML-75A-l05H-l25Al29E-l44R som PCR-templat.

PCR- PCR-upp- PCR omvänd Restriktionsenzymer produkt strömsprimer primer for PCR-produkt (i) TX-Nl TX-l6lR- lr PstI/AvrII Det Pstl/AvrH-klyvda PCR-fragmentet (i) ligerades till PstI/AvrlI-linjeariserade 20 plasmiden pTrX-del(43-53) för att återställa den ﬁmktionella xylanasgenen i den nya plasmiden pTrX-I-INIL-75A-105H- l25A- l29E- l44Rl6 IR. 1-12: Konstruktion av plasmidema nTrX-l l6G och nTrX-l 18C 25 De två nya mutantema är identiska med TrX, med den huvudsakliga skillnaden av ytterligare en mutation, dvs Asp-116 till Gly (D1l6G) eller Tyr-118 till Cys (Yl 18C).

Två PCR-primers framställdes med mutation (i fet stil). 526 RIG OO .w .o OO 41 TX-llóG-l (SEKV lD NR 50) 111 112 113 114 115 116 117 llß 119 D G S V Y G I Y R 5'-GAC GGA TCC GTA TAT GGT ATC TAC CG 5 BamHI TX-118C-1 (SEKV ID NR 51) 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 D G S V Y D I C R T Q R 5'-GAC GGA TCC GTA TAT GAT ATC TGC CGT ACC CAA CGC \'\ 10 20 BamHI Följande plasmidtemplat och primers krävdes för de två PCR: Tabell 3-10: PCR med plasmid pTrX som templat PCR-produkt PCR-upp- PCR omvänd Restiiktionsklyvningar strömsprimer primer (j) ' TX-1 16G-l TX-Cl BamHI/HindHI (k) TX-1 18C-1 TX-Cl BamHI/HindIII Ligering av de klyvda PCR-produktema (i) och (k) till BamHI/I-IindIII-linjeariserade plasmiden pTrX-de1(123-144) återställde en funktionell xylanasgen i transforman- tema som innehar de respektive plasmidema pTrTX-l16G och pTrX-1l8C. 1-13: Konsiruktion av plasmidema pTrX-llML-75A105H-1 16G-125Al29E-144R och DTrX-I~I1\/ll..-75AlO5H-l ISC- 1Ü25Al29E-144R De två nya mutantema var identiska med prekursom TrX-HlvIL-75A105H- 125A129E-l44R, varvid den huvudsakliga skillnaden var en ytterligare mutation, dvs Asp-116 till Gly (D1l6G) eller Tyr-l18 till Cys (Yl18C).

Följande plasmidtemplat och primers krävdes för de två PCR: 842 526 842 av u u a u nu Tabell 3-11: PCR med plasmid pTrX-HML-75A105H-125A129E-144R som templat PCR-produkt PCR-upp- PCR omvänd Resuiktionsklyvningar strömsprimer primer (1) TX-1 l6G- l TX-Cl BamI-Il/Hilidlll (m) TX-118C-l TX-Cl BamHI/Hindlll 5 Ligering av de klyvda PCR-produktema (l) och (m) till den BamHI/Hindlll- ljnjeariserade plasmiden pTrX-HML-75A105H-del(l23-144) âterställde en flmktio- nell xylanasgen i transformanterna som innehar de respektive plasmidema pTrX- I-IIvIL-75A105H-116G-125Al29E-144R och pTrX-HML-75A105H-118C- 125A129E-144R 1-1 4: Konstruktion av plasmidemapTrX-H-l 1D-ML-75A105H- 125A129E- l44Rl6lR. nTrX-H-Dl1-ML-75Al05H-116G-l25A129E-144Rl61R och DTrX-H-Dl 1-ML-75Al05H-1 l8C-125Al29E-144Rl6lR 15 De nya mutantema TrX-H-l lD-ML-75A105H- 125A129E-144R16 IR, TrX-H-11D- ML-75A105H-1 16G-l25A129E-144Rl61R och TrX-H-l 1D-ML-75A105H-118C- l25A129E-144R161R var identiska med respektive prekursor TrX-I-[h/Ib75A105H- 125A129E-144R, TrX-HML-75A105H- 1 16G-125Al29E-144R och TrX-HML- 75A105H-l18C-l25Al29E-144R, varvid den huvudsakliga skillnaden var ytterliga- š -- 20 re mutationer, dvs Asp-11 till Asp (N 1 ID) och Gln-161 till Arg (Q161R). En ny z PCR-primer framställdes med mutationen N1 1D (i det sﬁ1): TX-10HllD-1 (SEKV ID NR 52) o 0000: o 6 7 8 9 10 11_ 12 13 14 15 16 17' 18 ,-¶_ 5'-GGA Acc GGT TAC cmc sAc Ger TAC Trr TAC AGC : .- ' rm res .nun 42 2 22%' .. .. u n' J. n' PCR-produkt PCR-templat Restriktionsenzymer för . __ PCR-produkt (q) pTrX-H-11D-ML-75Al05H-1 16G- PstI/Sacl 12sA129E-144R161R 526 842 Q - c n no a I n ø on 43 s"==.= .. .. .. .:='.s.::= Tabell 3-13 PCR-pro Uppströms- Nedströms- Templat Restriktions- dukt primer primer _ klyvning (n) TX-10H11D-1 TX-lólR-lr pTrX-HML-75Al05H- AgeI/Avrll 125A129E-144R (o) TX-10H11D-1 TX-l6lR-lr pTrX-HNIL-75A105H- AgeI/AvrII 1 l6G-125Al29E-l44R (p) TX-10Hl1D-1 TX-l6lR-lr pTrX-HlvIL-75Al05H- Agel/AvrII 1l8C-l25Al29E-144R Ligering av de klyvda PCR-produktema (n), (o) och (p) till AgeI/AvrII-kluven 5 plasmid pTrX-del(43-53) âterställde en funktionell xylanas gen i transformanten som innehade de nya plasmidema pTrX-H-l lD-NH..-75A105H-l25A129E-144R16lR, pTrX-H-l lD-ML-75A105H-1 16G-125Al29E-l44Rl61R respektive pTrX-H-l 1D- lvfL-75Al05H-ll8C-l25A129E-144Rl61R 10 1-15: Konstruktion av deletionsplasmiden gTrX-H-1lD-ML-75A105H-116G- delg 123-144) En plasmid innehållande partiellt deleterad xylanasgen, konstruerades via en PCR- realction med en ny primer som kodar för deletionen av (123-144)-regionen, via ett 15 protokoll som är identiskt med EXEMPEL 1-9.

Tabell 3-14: PCR-templat med TX-del(123-144)-1r och TX-NI som primer | o 0 o co n o Ligering av det klyvda PCR-fragmentet (q) till den Pstl/Sacl-linjeariserade plasmi- den pTrX och transformation för att ge de korrekta klonema som innehar deletions- plasmiden pTrX-H-l 1D-ML-75A105H-1 16G-del( 123- 144), som identiﬁerades genom icke-uttryck av xylanas och frånvaro av halo eller avskiljningszon i de blå s xylaninnehâllande YT-plattoma. 1-16: Konstruktion av plasmiden nTrX-H-l 1D-ML-75A105H-1 16Gl18C- l25A129E-144R161R 10 Den nya mutanten TrX-H-l 1D-ML-75A105H-1 16Gl l8C-125A129E-l44Rl6lR var identisk med dess prekursorer TrX-H-1 1D-ML-75A105H-1 16G-125Al29E- 144R16 IR och TrX-H-1 1D-ML-75A105H-1 18C-l25A129E-144R16 IR varvid med undantaget i innehavandet av kombinationsmutationen T yr-1 18 till Cys (Yl18C) och Asp-116 till Gly (Dl16G). Nya PCR-primers framställdes med kombina- 15 tionsmutationen D116G/Y118C (i fet stil).

TX-116G118C-l (SEKV ID NR 53) 111 112 113 114 115 116 111 na 119 120 121 122 DGSvYGICaTQR sf-cAc ccA 'rcc GTA frAfr Ger Arc rcc cer Acc cAA cec 'BamHI Tabell 3-15 PCR för att bilda (112-167)-fragment innehållande kombina- tionsmutationen PCR- Uppströms- Nedströms- Templat Restriktions- produkt primer primer klyvning (r) TX- TX-161R- lr pTrX-IML-75A105H- BamI-II/AvrH ll6G118C-1 125A129E-144R Ligering av de klyvda PCR-produktema (r) till BamHI/AvrII-kluven plasmid pTrX- H-1 1D-ML-75A105H-1 16G-del(123-l44) återställde en funktionell xylanasgen i 20 ø n Q o ua o. po o n » o a nu 45 transformanten som innehåller den nya plasmiden pTrX-H-1 1D-ML-75A105H- 116G1 l8C-l25Al29E-144R161R. i Exempel 2: Karakterisering av mutanta xylanaser 2-1: Produktion av gylanaser Odlingsbetingelsema som innefattar en 5 ml odling av övematt-ymprring i 2YT- medium (16 g baktotrypton, 10 g jästextrakt, 5 g NaCl, 1 l vatten) innehållande ampicillin (100 mg/l) sattes till 2 YT-medium (1 1) med ampicillin. Odlingarna läts växa med skakning (200 vpm) vid 37°C. Efter 16 timmar skördades cellerna. 2-2: Rening av mutanta ylanaser Proteinprover framställdes ﬁån celler genom att först tillverka ett extrakt av cellerna genom att mala 10 g av cellpasta med 25 g aluminapulver. Efter malning till mjuk blandning, sattes små mängder (5 ml) av iskall buffert A (10 mM natriumacetat, pH 5,5 för BcX-mutanter) eller buﬁert B (10 mM natriumacetat, pH 4,6 för TX-mutan- ter) till och blandningen maldes kraftigt mellan tillsatserna. Aluminan och cell- debrisen togs bort genom centrifugering av blandningen vid 8000 x g i 30 minuter.

Före kolonnlcromatograﬁ justerades supernatanten till pH 4,6 genom ättiksyra och cennifugerades för att ta bort all utfállning. Det efterföljande förfarandet för kolonn- kromatograﬁ var identisk för alla mutanta xylanaser.

Eﬁer surgöming och centrifugering, pumpades xylanasprovet till en 50 mm bädd- volym, CM-sefarossnabbﬂöde, katjonbyteskolonn (Pharmacia Biotech, Uppsala), jämvikten i 10 mM natriumacetat (pH 4,6). Xylanasen eluerades med en 250 ml linjär gradient (0 till 0,6 M NaCl i 10 mM natriumacetat, pH 4,6) vid en ﬂödeshas- tighet av 1 ml/min. Xylanaserna eluerade vid 150 till 200 ml av gradienten. Alikvo- ten för den uppsamlade fralctionen granskas genom SDS-PAGE, och de fraktioner o .nu oo 20 25 30 5°6 842 46 som hade det mesta av xylanas närvarande blandades. Den renade xylanasen kvanti- ﬁerades genom spektrofotometri vid 280 nm genom att använda en extinktions- koefﬁcient mellan 54 600 - 53 400 M1, för de ﬂesta mutanta TrX-xylanaser. En vanlig rening ﬁ~ån 10 g av celler gav 25 mg xylanas. 2-3: Standardanalys för uppmämingen av eíatisk aktivitet Den kvantitativa analysen bestämde antalet reducerande sockerândar som generera- des från löslig xylan. Substratet för denna analys var fraktioner: av bj örkträicylan vilken löstes upp i vatten ﬁån en 5 % suspension av björkträxylan (Sigma Chemical Co.) Efter borttagande av den olösliga fraktionen ﬁystorkades supema- tanten och lagrades i en tork. Uppmätníngen av speciﬁk aktivitet genomfördes enligt följande: Reaktionsblandningar innehållande 100 pl av 30 mg/ml xylan som tidigare ställts uti analysbuffert (50 mM natriurncitrat, pH 5,5 eller pH-optimum av den tes- tade xylanasen), 150 pl analysbuiïert, och 50 pl enzym utspädd i analysbuiffert inkuberades vid 40°C. Vid olika tidsintervall togs 50 pl delar bort och reaktionen stoppades genom att späda uti l ml av 5 mM NaOH. Mängden reducerande socker bestämdes med hydroxibensoesyrahydrazidreagens (I-IBAH) (Lever, 1972, Analytical Biochem 47:273-279). En enhet av enzymaktivitet fimgerade som den mängd som genererade 1 pmol reducerande socker i 1 minut vid 40°C.

För jämförelse av de speciﬁka aktiviteterna mellan mutanta och nativa xylanaser ombildades de speciﬁka aktivitetema av en mutant xylanas till en relativ aktivitet.

Den relativa aktiviteten beräknas som procentsats, genom att dela den speciﬁka aktiviteten av det mutanta enzymet med den speciﬁka aktiviteten av det nativa xyla- naset. 20 E76 842 o a ø c n n o 47 Tabell 4: Relativ aktivitet av mutanta och nativa xylanaser vid 40°C och pH 5,5.

Xyhnag Relativ aktivitet Nativ TrX 100' TrX-PHVíL-75A105H-1 16G-125Al29E-l44R 84 TrX-H-11D-ML-75A105H-116G-l2SAl29E-144R16IR 80 TrX-lML-75Al05H-l18C-l25A129E-144R 113 TrX-H- l lD-ML-75A105H-118C- 125Al29E- 144Rl6 IR 121 ' Speciﬁk aktivitet av nativ TrX-xylanas bestämt att vara 770 enheter/mg.

Resultaten som beskrivs i tabell 4 indikerar att de speciﬁka enzymatiska aktiviteter- na och de mutanta xylanasema vid 40°C inte hade förändrats signiﬁkant jämfört med nativ xylanas. Snarare, med IISC-mutantxylanaserna (TrX-HïvíL-AHCAE-R och TrX-H1 lD-ML-AHCAE-R) observerades mer aktivitet, jämfört med den nativa xylanasen (en ökning i 13-21 % i speciﬁk aktivitet). 2-4: Bestämning av exgressionseﬁektivitet av mutanta gylanaser genom E. coli Via standardanalysen som beskrivs i 2-3, har den relativa expressionseffektiviteten for varje mutant xylanas bestämts, via en uppskattning av xylosﬁisätmingen av xylanaset som produceras i enhetsvolym av bakterieodling. De tre mutanta xylana- serna som kodar för mutationen N1 ID, nämligen: TrX-H-l1D-MI.,-75A105H-125A129E-l44R161R (TrX-Hl lD-ML-AI-IAE-RR); TrX-H-11D-ML-75Al05H-1 16G-l25A129E-144R16lR (TrX-Hl lD-ML-AHGAE- RR); och TrX-H-l1D-ML-75Al05H-118C-125A129E-144R16lR (TrX-H11D-ML- AHCAERR); är 2,4 - 4,3 gånger mer effektivt uttryckt av E. coli, jämfört med deras respektive prekursorer TrX-I-lML-75AlO5I-I-l25A129E-144Rl6lR, TrX-I-IL/íL-75A105H- 1l6G-125A129E-144R och TrX-HM -75A105H-l18C-l25A129E-144R utan denna mutation. o con aa 20 25 526 842 48 Tabell 5: Expressionseffektivítet av mutanta xylanaser xylanas Relativ expressions- effektivitet* TrX-H-lID-ML-75A105H-125Al29E-144R161R 2,4-faldig TrX-H-1lD-N1L-75A105H-l l6G-125A129E-144Rl61R 3,1 -faldig TrX-H-1 lD-NE-75Al05H-l l8C- l25Al29E-l44R16 IR 4,3-faldig ' Relativt till de respektive prekursorerna som uttryckte texten ovan.

Detta indikerar att en av fördelarna med mutationen N11D är íörstärkníngen av expression i rnikrober, ett viktigt kännetecken för den industriella ﬁ-arnställningen av enzymet.

Exempel 3: Termoﬁlicitet av mutanta xylanaser Termoﬁlicitet granskade; för att undersöka effekten av olika temperaturer på enzymatisk hydrolys av löslig xylan genom olika mutanta xylanaser.

Analystörfarandet för liknande standardanalyser med förändringar i inkuberíngs- temperatur och tid. Xylanasema (15 tig/ml) och löslig björkträxylansubstrat, i 50 uM natriumcitratbuffert av pH 5,5, blandades och inlcuberades i ett cirkulerande vattenbad vid olika temperaturer. Eﬁer 30 minuters ínkubering, bestämdes mängden av reducerande socker som ﬁisatts ﬁ-ån xylan genom I-[BAH-analys och beräknades som en relativ aktivitet, varvid värdet vid 40°C representerade 100 %.

Effekten av temperatur på hydrolysen av xylan genom TrX-PI1VIL-7 SAIOSH- 125Al29E-l44R (TrX-lllvlL-AHAE-R) visas i ﬁg 3. Jämfört med prekiirsorn utan Hl44R-mutationen (TrX-PIIVIL-AHAE), uppvisade denna mutanta xylanas en mått- ligt förbättrad enzymatisk aktivitet vid högre temperatur. Dessa resultat antyder att Hl44R-mutationen förbättrar termoﬁliciteten av xylanaser. 526 842 49 En annan mutaﬁon TrX-HMLf75A105H-125A129E-144R161R (TrX-HML-AHAE- RR) förstärkte inte signifikant den enzymatiska aktiviteten vid högre temperatur (ej visad), jämfört med TrX-l-llvlL-75Al05H-125A129E-144R (T rX-EML-AHAE-R).

Dessa resultat antyder att QlólR-mutationen inte förstärker termoﬁliciteten av xylanaser.

Två serier av mutanter baserade på mutationer av D116G och Y118C har testats.

Jämfört med nativ 'IirX uppvisade de enskilda mutanterna TrX-116G och TrX-118C större aktivitet vid högre temperaturer (ﬁg 4).

Samma förstärkande eiïekt i termoﬁlicitet observerades också i nästa par av mutan- ter: TrX-H1víL-75A 1 OSH-l 16G- 125A129E-144R (TrX-IiML-AI-IGAE-ID; och TrX-HNlL-7 5A105H-11 8C-125A129E-144R (TrX-ILIIVILAHCAE-R), jämfört med prekursorn TrX-HLfIL-75A105H-l25A129E-l44R (T rX-HML-AHAE- R) vid pH 5,5 (ﬁg 5, endast 116G-mutant visas) och pH 6,0 (ﬁg 6 och 7; dessa ﬁgu- rer innefattar samma data men har olika representation av den relativa aktiviteten).

En annan serie av mutanta xylanaser baserade på NI lD-mutationen främjar också termoﬁliciteten. Mutanten TrX-H-11D-ML-75Al05H-l25A129E-144Rl6 IR (TrX- Hl lD-bfIbAHAE-RR) uppvisade större aktivitet vid högre temperaturer, jämfört med prekursom TrX-I-IML-75A105H~125A129E-144R (TrX-HML-AHAE-R; ﬁg 8). Dessa resultat är överraskande eftersom den kända tekniken indikerat samma Nl1D-mutation antingen sänkte temperaturoptimum och temperaturintervall i TrX- mutanterna som innehåller en intramolekylär disulﬁdbindning (Turenen et al., 2001), eller så observerades ingen effekt på termoﬁliciteten av TrX-H-1 lD-ML (U S-A-5 759 840; mutanten benämnd NI-TXIZ). Dessa data av föreliggande upp- ﬁnning indikerar att 1lD-mutationen främjar lämpligt modiﬁerade xylanaser.

Mutationema som identiﬁerats ovan kan kombineras för att skapa mutanta xylanaser med större termoﬁlicitet, även vid högre pH-intervall. Kombinationsmutantxylana- QOOQ o 20 526 842 so serna, innefattande nippelmutationer Nl lD/Dl 16G/ l44R eller Nl ID/Y1 l8C/ l44R, nämligen: TrX-H-1 1D-ML-7 5A105 H-1 1 6G- 125 A 1 29E-l44R 16 IR (TrX-Hl 1D-ML-AHGAE- RR); och TrX-H-11D-ML-75A105H-l 18C- 125A129E-l44R161R (TrX-Hl lD-ML-AHCAE- RR), uppvisar maximal enzymatisk aktivitet vid en högre temperatur av omkring 70 till omkring 75°C, och uppvisar signiﬁkant enzymatisk aktivitet vid 80°C vid pH 5,5 (ﬁg 5, endast 116G-mutant visad), och pH 6,0 (ﬁg 6 och 7). Dessa resultat antyder eiïekteina av mutaﬁonema, Dl 16G eller Yl18C, komplementära mutationema, N11D och H144R, med avseende på termoﬁlicitet av xylanas.

Exempel 4: Alkaloﬁlicítet av mutanta xylanaser Alkaloﬁliciteten av genetiskt modiﬁerade xylanaser granskades för att undersöka effekten av som olika pH-betingelser hade på den enzymatiska hydrolysen av löslig björkträxylan genom mutanta xylanaser. Analysﬁårfarandet var liknande med stan- dardíörfaranden med förändringar i inkuberingstemperatur och tid. Alikvoter av genetiskt modiﬁerade xylanaser (15 tig/ml) och lösligt xylansubstrat i 50 mM naniumcitratbuiïert vilken varierade mellan pH 4-7 inkuberades tillsammans vid 65 °C. Efter 30 minuters inkuberingar bestämdes mängden reducerande socker som ﬁisatts från xylansubstratet genom HBAH-analys och den enzymatiska aktiviteten som en funktion av pH beräknades för ett antal mutanta xylanaser med den maxi- mala aktiviteten tagen som 100 %.

Mutationen Hl44R påverkade inte aktiviteten vid högre pH. Mutanten TrX-HML- 75Al05H-l25A129E-l44R och dess prekursor TrX-llML-75A105H-l25Al29E hade samma pH/aktivitetsproﬁl (ej visad). Emellertid, som noterats i exempel 3, är denna mutation (H144R) lördelaktig fór tennoﬁliciteten av xylanas.

Effekten av pH på enzymatisk aktivitet genom mutationen Ql6 IR i den mutanta xylanasen TrX-I-llVlL-75Al05H-l25A129E- l44R1 6IR (TrX-HML-AHAE-RR) (fl 26 842 a »nu na 51 visas i ﬁg 9. Jämfört med dess prekursorer TrX-HML-75A105H-l25A129E och TrX-HML-75A105H-125A129E-l44R (ej visad), av vilka båda hade identiska pH/aktivitetsproﬁler, uppvisade den mutanta xylanasen TrX-HIVIL-7SAIOSH- 125Al29E-144R16lR (TrX-HML-AHAE-RR) större aktivitet vid ett högre pH- 5 intervall av 6,5, 7,0, 7,5 och 8,0. TrX-HNlL-AHAE-RR uppvisade också lägre akti- vitet vid lägre pH av 5,0, 5,5 och 6,0, jämfört med prekursorer utan denna mutation.

Den direkta effekten mutaﬁonema Dl l6G och Y1 18C på xylanasalctivitet har under- sökts. Jämfört med nativ TrX har de enskilda mutantema TrX-l16G och TrX-118C 10 uppvisat större aktivitet vid högre pH (ﬁg 10).

Samma iörstärkande effekt i alkaloﬁlicitet genom mutationerna D1l6G och Y118C observerades också i mutantema: i TrX-HML-75A105H-116G-l25A129E-l44R (T rX-HML-AHGAE-R); och 15 TrX-I-ML-75A105H-118C-125A129E-l44R (TrX-I-IIVIL-AHCAE-R; ﬁg 9), när de jämförs med prekursorema TrX-HML-75A105H-l25Al29E-144R och TrX- I-Ihﬂ-75A105H-l25Al29E. Emedan båda av dessa mutanter uppvisade högre akti- vitet vid pH 6,5, 7,0, 7,5 och 8,0, bibehåller mutanten TrX-Hhﬂ-75A105H-116G- 125Al29E-144R optimal aktivitet vid lägre pH av 5,0, 5,5 och 6,0. Detta bibehåll- 20 ande av hög aktivitet vid pH 5,0-8,0 med båda av dessa mutanter representerar en breddning av det optimala pH-intervallet.

N 1 lD-mutatíonen tycks inte bidraga till alkaloﬁliciteten av TrX. Mutanten TrX-H- 11D-ML-75Al05H-125A129E-l44R161R (T rX-H1 1D-ML-AHAE-RR) har iden- ' 25 tiskt pH/aktivitetsproﬁl som dess prekursor TrX-HML-75A105H-125A129E- 144Rl6 IR (ej visad). Resultatet, där llD inte har någon eiïekt på pH/akﬁvitetspro- ﬁl, motsäger Turenen et al (2001) som noterat N1 lD-mutationen sänkte pH- : optimum och pH-intervall i en TrX-mutant som innehåller en intramolekylär disul- ﬁdbindning. Emellertid överensstämmer resultaten som beskrivs ovan med de i 30 US-A-5 759 840, där ingen negativ effekt på alkalofiliciteten av TrX-H-1 1D-ML (mutant benämnd NI-TXIZ) observerades. 526 842 nu g n u Q o c c . . I . I .' 52 Mutationerna som identifierats ovan har kombinerats för satt skapa mutanta xylana- ser med större alkaloﬁlicitet och termoﬁlicitet. Kombinationsmutantxylanaserna baserade på kvadrupla mutationer Nl 1D/Dl 16G/H l44R/Q l 6 lR eller NI 1D/Y 1 l8C/ l44R/Q 161R, nämligen: s TrX-H-11D-MI.,-75Al05H-l16G-l25Al29E-l44R161R (TrX-H1 1D-ML-AHGAE- R; ﬁg 9); och TrX-H-l1D-ML-75AlO5H-ll8C-l25Al29E-144R161R (TrX-Hl 1D-ML-AHCAE- RR; ej visad), uppvisade en maximal enzymatisk aktivitet från omkring pH 5,5 till omkring pH 7, 10 jämfört med prekursorxylanaser. Dessutom hjälper närvaron av mutationen D116G bibehållandet av väsentligen maximal aktivitet vid lägre pH~intervall av 5,0, 5,5 och 6,0, och därigenom undvika de signiﬁkanta alctivitetsförluster vid lågt pH som observerats i prekursorn TrX-Hlvﬂ.,-75Al05H-l25Al29E-l44R161R (ﬁg 9). Detta resultat bekräftar ytterligare breddningen av det optimala pH-intervallet.

För att sammanfatta kan alkaloﬁlt xylanas konstrueras genom kombination av muta- tioner, Dl 16G eller Yl l8C med Q16lR. Addition av andra nya mutationer Nl lD och H144R kan ytterligare förstärka termoﬁliciteten av mutanten TrX. Nl1D-muta- tionen kan främja expressionen av mutantema.

Emedan föreliggande uppfinning har beskrivit mutanta xylanaser vilka uppvisar fór- bättrad termoﬁlicitet och alkaloﬁlicitet och fördelarna som associeras med dessa enzymer vid framställningen av pappersmas sa, kan dessa mutanta xylanaser också vara av användning i andra industriella förfaranden, t ex men inte begränsat till 25 tvättningen av precisionsanordningar och halvledare. Dessutom, på grund av deras förstärka termoﬁlicitet, och termostabilitet kan de mutanta xylanasema användas i kemiska förfaranden som använder små kvantiteter av denaturanter eller detergenter eller i närvaro av lösningsmedel, t ex men inte begränsat till små mängder av apolära I lösningsmedel såsom men inte begränsat till hexan, dioxaner, koltetraklorid, bensen, f: 30 etrar, kloroform, ättiksyra och metylenklorid och polära lösningsmedel såsom, men inte begränsat till, aceton, alkoholer, dimetylfonnarnid, acetonitril, sulfolan, dime- tylsulfoxid och vatten. . . o o oo 5 2 5 g 4 2 ._12 - ' 53 Föreliggande uppfinning har beskrivits med hänseende till de foredragria utföfiﬂgs' . - ° 'd t att formerna. Emellertid kommer det att vara uppenbart fOI fﬂßklﬂaﬂﬂeﬁ Pa Omni e ett antal variationer och modifieringar kan göras man att avvika från “ppﬁnmngens skyddsomiång såsom det beskrivs - - ~ " ' ns.

Alla referenser och citermgar mkorporeras 11211 50111 fefefe Referenser iArase, A., Yomo, T., Urabe, I., Hata, Y., Katsube, Y. and Okada, H. (1993) FEBS Lett. 316:123- 127. ' Casirnir-Schenkel, J., Davis, S_., Fiechter, a., Gysin, B., Murray, E., Perrolaz, J.-J. :md Zimmermann, W. European Patent application no. 91810652.7, published on 04.03.92.

Publication no. 0 473 545 A2.

Campbell, L., Rose, D. R., Sung, W. L., Yaguchi, M. and Wakarchuk, W. US patent no. 5,405,769 issued on Apr. 11, 1995.

Campbell, R. LL, Rose, D. R., Sung, W. L., Yaguchi, M. and Wakarchuk, W. PCT publication no. WO 94/24270, published on 27.10.1994.

ChandrajRaj, K. and Chandra, T. S. (1995) Biotechnol. Lett. 17: 309-314. - - Fisk, R. S. and Simpson, C. (1993) in Stability and Stabiliration of Enzyrnes, edited by W. J. J. van den Tweel, A. Harder and R. M. Buitelaar; published by Elsevier Science Publishers B. V. pp323-328.

Gniber, K., Klintschar, G., Hayn, M, Schlaeher, A., Steiner, W. and Kratky, C. (1998) Biochemisüy 37:l3475-l3485. -g--E Irwin, D., Jung, E. D. and Wilson, D. B. (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60:763-770. 526 842 'u c . n a u en nu 54 Kinoshna, K., Tekno, M., Køsèki, T., 1:0, K. and twm, K. (1995) J. Pememanon ana Bioengineering 79:422-428.

Krengel, U. and Dijkstra (1996) J. Mol. Biol. 263:70-78. " Lee, S. L., Forsberg, C. W., and Rattray, J. B. (1987) Appl. Enš/iron. Microbíol. 53:644-650.

Lütlii, E., Jasmat, N. B., and Bergquistß. L. (1990) Appl. Environ. Microbiol. 5612677-26821.

Mathrani, I. M. and Alu-ing, B. K. (1992) Appl. Microbiol. Biotechnol. 38123-27.

Misset, 0. (1993) in Stability and Stabilization of Enzymes, edited by W. J. J. van den Tweel, A.

Hardef and R. M. Buitelaar; published by Elsevier Science Publishers B. V. ppll 1-131.

Nissen A. M., Anker, L., Munk, N., and Lange, N. K. in Xylans and Xylanases, edited by J.

Visser, G. Beldman, M. A. Kusters-van Someren and A. G. J. Voragen, published by Elsevier, Amsterdam, 1992. p325-337. l Saltka, K., Kojima Y., Kondo, T., Karita, S., Ohmiya, K. and Shimada, K. (1993) Bíoscí.

Biotech. Biochern. 571273-277.

Simpson, H. D., Hauﬂer, U. R., and Daniel, R. M. (1991) Biochem. J. (1991) 277z4l3-4l7.

Sung. W. L. .i Yao. F.-L., Zahab, D. M. and Narang, S. JA. (1986) Proc. Natl. Acad_. Sci., USA 83:S61-S65.

Sung, W. L., Luk, C. K, Zahab, D. M. and Wakarchuk, W. (1993) Protein Expression Purif. 4200-206.

Sung, W. Luk, C. K., Chan, B., Wakarchuk, W., Yaguchi, M., Campbell, R, Willick, CJ., Isliikawa, K. and Zabab, D. M. (1995) Biochem. Cell. Biol. 73:253-259.

Sung, W. L., Yaguchi, M and Ishíkawa, K. US patent #5,759,840, issued on Jun. 2, 1998.

Sung, W. L., Yaguchi, M and Ishikawa, K. US patent #5,866,408, issued on Feb. 2, 1999 Sunna, A. and Antranildan, G. (1997) Crit. Rev. Biotech. 17139-67.

I inc (11 FO O\ L O lä YO . b I I ' ' ' ' , , a U n no 55 man, J. s. and Vega canms, R. (1992) Plup & n-pef canaàa 93.1 16-1 19).

Turenen, O., Etuaho, K., Fenel, F., Vehmaanpera, J., Wu, X. Rouvinen, J. and Leísola, M. (2001) J. Biotech. 88:37-46.

Wakarchuck W. W., Sung, W. L., Campbell, R. L., Cunningham, A., Watson, D. C. and Yaguchi, M. (1994) Protein Engineering 7zl379-l 386.

Wilson, D. B., Jung, E. D., Changas, G. S., Irvin, D. C. PCT international publication on ll may 1995. Publication No. WO 95/ l 2668.

Wínterhalter Cfand Liebl, W. (1995) Appl. Environ. Bicrobiol. 6l:l 810-1815. hZappe, H., Jones, W. A., and Woods, D. R. (1987) AppLMícrobíol. Biotechnol. 27:57:63.

Zappe, H., Jones, W. A., and Woods, D. R. (1990) Nucleic Acids Res. 182179.

Claims

10 15 20 25 30 526 842 'S6 PATENTKRAV

1. En modiﬁerad xylanas som innefattar en substituerad aminosyrarest vid positio- nen 144, varvid nämnda substituerade aminosyra är en basiska aminosyra, varvid nämnda position bestäms från sekvensorienteringen av nämnda modiﬁerade xylanas med Trichoderma reesei xylanas II-aminosyrasekvens som definieras i SEKV ID NR 16, vari det modiﬁerade xylanaset uppvisar förbättrad termoﬁlicitet, alkaloﬁlici- tet, expressionseffektivitet, eller en kombination därav, i jämförelse med motsva- rande nativa xylanas.

2. Modifierat xylanas enligt krav 1, vari nämnda substituerad aminosyra väljs från gruppen som består av Arg och Lys.

3. Modifierat xylanas enligt något av kraven 1-2, vari näirmda modifierade xylanas är framtagen från en familj ll-xylanas.

4. Modifierat xylanas enligt krav 3, vari nämnda familj ll-xylanas är en T richoderma reesei xylanas.

5. Modifierat xylanas enligt något av kraven 1-4, vilket vidare innefattar en His vid position 10, His eller Arg vid position 105, Met vid position 27, Leu vid position 29, Ala eller Gly vid position 75, Ala vid position 125 och Glu vid position 129.

6. Modiﬁerat xylanas enligt något av kraven l-S, som vidare innefattar en substi- tuerad aminosyra vid position 161 väljs från gruppen som består av basiska amino- syror.

7. Modifierat xylanas enligt krav 6, vari nämnda substituerade aminosyra vid posi- tion 161 väljs från en grupp som består av Arg, Lys och His och vari nämnda substi- tuerade arninosyra vid position 144 väljs från en grupp som består av Arg och Lys. 10 15 20 25

8. Modifierat xylanas enligt krav 6, som vidare innefattar en substituerad aminosy- ra vid position 11 väljs från en grupp som består av en sur aminosyra.

9. Modiﬁerat xylanas enligt krav 8, vari nämnda substituerade aminosyra är Asp vid position 1 1.

10. Modiﬁerat xylanas enligt krav 9, vari nämnda substituerade aminosyra vid posi- tion 144 väljs från en grupp som består av Arg och Lys, och nämnda substituerade aminosyra vid position 161 väljs från en grupp som består av Arg, Lys och His.

11. Modiﬁerat xylanas enligt krav 8, som vidare innefattar substituerad aminosyra vid position 116 väljs från en grupp som består av små hydrofoba aminosyror.

12. Modifierat xylanas enligt krav 1 1, vari nämnda substituerade aminosyra vid po- sition 116 är Gly.

13. Modiﬁerat xylanas enligt krav 12, vari nämnda substituerade aminosyra vid po- sition 11 är Asp, nämnda substituerade aminosyra vid position 144 väljs från en grupp som består av Arg och Lys, och nämnda substituerade aminosyra vid position 161 väljs från en grupp som består av Arg, Lys, och His.

14. Modiﬁerat xylanas enligt krav 1, vilket vidare innefattar en substituerad amino- syra vid position 116 väljs från en grupp som består av små hydrofoba aminosyror.

15. Modiﬁerat xylanas enligt krav 14, vari nämnda substituerade aminosyra vid po- sition 1 16 är Gly och nämnda substituerade aminosyra vid position 144 väljs från en grupp som består av Arg och Lys. 10 15 20 25 526 842 S8

16. Modiﬁerat xylanas enligt krav 8, vilket vidare innefattar en substituerad arnino- syra vid position 118 väljs från gruppen som består av mediumstora icke-aromatiska hydrofoba aminosyror.

17. Modifierat xylanas enligt krav 16, vari nämnda substituerade aminosyra vid po- sition 118 är Cys.

18. Modiﬁerat xylanas enligt krav 17, vari nämnda substituerade aminosyra vid po- sition 11 är Asp, och nämnda substituerade aminosyra vid position 161 väljs från en grupp som består av Arg, Lys och His.

19. Modiﬁerat xylanas enligt krav 1, vilket vidare innefattar en substituerad amino- syra vid position 118 väljs från en grupp som består av medelstora icke-aromatiska hydrotubarninosyror.

20. Modiﬁerat xylanas enligt krav 19, vari nämnda substituerade arninosyra vid po- sition 118 är Cys och närrmda substituerade aminosyra vid position 144 väljs från en grupp som består av Arg och Lys.

21. Modiﬁerat xylanas enligt krav 16, vilket vidare innefattar en substituerad arnino- syra vid position 116 väljs från en grupp som består av små hydrofoba aminosyror.

22. Modiﬁerat xylanas enligt krav 17, vari nämnda substituerade aminosyra vid po- sition 11 är Asp, nämnda substituerade aminosyra vid position 116 är Gly, och nämnda substituerade aminosyra vid position 161 väljs från en grupp som består av Arg, Lys och His.

23. Användning av den modifierade xylanasen i krav 1 i ett industriellt förfarande. 20 526 842 S9

24. Användning enligt krav 23, vari nänmda industriella förfarande är en massatill- verkning.

25. Modiﬁerat xylanas som väljs från gruppen (som beskrivs i tabell 2) som består av: TrX-I~IML-75A105H-125Al29E-l44R TrX-HML-75A105H-125Al29E-l44R16lR TrX-I-IML-75A105H-1 16G- l25A129E- 144R TrX-I-I1VlL-75A1 05H-1 18C-125A129E-144R TrX-H-1 1D-lVlL-75Al05H-125A129E-144Rl6 IR TrX-H-l1D-Iv1L-75A105H-l16G-125A129E-144Rl61R TrX-H-l1D-ML-75A105H-l18C-125A129E-l44Rl61R TrX-H-l1D-NIL-75Al05H-116G118C-125A129E-l44R16lR

26. Xylanas som innefattar en basisk aminosyrarest vid position 144, varvid nämnda position bestäms från sekvensorientering av nämnda modifierade xylanas med Tri- choderma reesei xylanas II-aminosyrasekvens som defmieras i SEKV ID NR 16, varvid nämnda arninosyra inte hittas vid nämnda position vid nämnda T richoderma reesei xylanas Il-amino-syrasekvens som definieras i SEKV ID NR 16, vari nämnda modifierade xylanas uppvisar förbättrad termobilitet, alkaloﬁlicitet, expressionsef- fektivitet, eller en kombination därav, i jämförelse med motsvarande nativa xylanas.

27. Xylanas enligt krav 26, vari nämnda basiska aminosyra är Arg.

28. Xylanas enligt krav 26, vilket vidare innefattar en icke-polär aminosyra vid po- sition 1 16.

29. Xylanas enligt krav 28, vari nämnda icke-polära aminosyra är Gly. 10 15 20 25 30 526 842 60

30. Xylanas enligt krav 26, vilket vidare innefattar en icke-aromatisk hydrofob ami- nosyra vid position 118.

31. Xylanas enligt krav 30, vari nämnda icke-aromatiska hydrofoba aminosyra är Cys.

32. Xylanas enligt krav 26, vilket vidare innefattar en sur aminosyra vid position 11 och en icke-polär aminosyra vid position 116.

33. Xylanas enligt krav 32, vari nämnda sura aminosyra vid position ll är Asp, och nämnda icke-polära arninosyra vid position 116 är Gly, och nämnda basiska amino- syra vid position 144 är Arg.

34. Xylanas enligt krav 26, vilket vidare innefattar en sur aminosyra vid position 11 och en icke-aromatisk hydrofob arninosyra vid position 118.

35. Xylanas enligt krav 34, vari nänmda sura aminosyra vid position ll är Asp, nämnda icke-aromatiska hydrofoba aminosyra vid position 118 är Cys, och nämnda basiska aminosyra vid position 144 är Arg.

36. Modifierat xylanas enligt krav 1, vari nämnda modiﬁerade xylanas känneteck- nas av att den har en maximal effektiv temperatur (MET) mellan omkring 69°C till omkring 84°C, och vari nämnda modiﬁerade xylanas är en familj 11-xylanas erhål- len från Trichoderma sp.

37. Modifierat xylanas enligt krav 36, vari nämnda MET är mellan omkring 70"C till omkring 84°C.

38. Modifierat xylanas enligt krav 1, vari nämnda modiﬁerade xylanas känneteck- nas av att den ett maximalt effektivt pH (MEP) mellan omkring pH 5,8 till omkring 5 2 6 8 4 2 'bl pH 8,4, vari nänmda modifierade xylanas är en familj l l-xylanas erhållen från en T richoderma sp.

39. Modifierat xylanas enligt krav 38, vari näirmda MEP är mellan omkring pH 6,0 till omkring pH 8,0.

40. Modifierat xylanas enligt krav 36, vari nämnda modiﬁerade xylanas ytterligare kännetecknas som att den har en maximal effektiv pH (MEP) mellan omkring pH 5,8 till omkring pH 7,6.

41. Modifierat xylanas enligt krav 37, vari nämnda modiﬁerade xylanas ytterligare kännetecknas som att den har ett maximalt effektivt pH (MEP) mellan omkring pH 6,5 till omkring pH 7,4. II I oo una: 10 o o I O I Q j... n o g Oona uno on I sExvENsLIsTA <110> National Research Council of Canada Sung, Hing <120> Xylanaser med förhöjd terﬁofílicítet och alkalofílicítet <130> 08-893220WO 54 <170> Patentln version 3.0 <210> 1 <2ll> 184 <212> PRT <213> Aspergillus niger <400> 1 Ser Ala Gly Ile Asn Tyr Val Gln Asn Tyr Asn Gly Asn Leu Gly Asp 1 5 10 15 Phe Thr;¥yr Asp Glu Ser Ala Gly Thr Phe Ser Met Tyr Trp Glu Asp 20 25 30 Gly val Ser Ser Asp Phe Val Val Gly Lau Gly Trp Thr Thr Gly ser 35 40 45 Ser Asn Ala Ile Th: Tyr Ser Ala Glu Tyr Ser Ala Ser Gly Ser Ser 50 55 60 Ser Tyr Leu Ala Val Tyr Gly Trp Val Asn Tyr Pro Gly Ala Glu Ty: 65 Tyr Ile Val Glu Ser Leu Gly Thr 100 Asp Thr Arg Ile 115 Gln Tyr Phe Ser 130. Val Ala Asn His 145 Asp Phe Asn Tyr Val 180 Ser Ala Ser b <210> 2 <2ll> 185 <2l2> PRT -r <213> <400> 2 Ser Ala Gly Ile Asn Tyr Val Gln Asn 1 I Phe Thr Tyr Asp Glu 20 Gly Val Ser Ser Asp 35 Ser Ser Asn Ala Ile 50 _ Ala Ser Tyr Leu Ala 65 Tyr Ty: Ile Val Glu I Asp 85 Val Ash Val Phe Gln f16S Thr 5 TYI Glu Arg Asn 150 Val Ile Ser Ala Gly Thr Phe Val Val Gly Thr Tyr Ser Ala Val Tyr Gly Trp 70 Asp Tyr Gly Asp Tyr Asn Pro Cys 526 842 z Glv ASP 'fyr Mn 90 Asp Gly Ser 105 Ser Ser Ile Thr 120 Pro Glu 135 Ser Thr Arg Phe Trp Ala Gln Glu 170 Met Ala Val Ser Ser Aspergillus tubígensis TYI 10 Phe 25 40 55 Leu Gly Gly Trp Glu Tyr Ser Ala Val Asn Tyr Pro 75 Pro Cys Ser Ser Thr Tyr Gln Val 110 Thr serï-rnr 125 Gly Thr Ser Gly Thr 140 His 155 Gly Phe Gly Ala Trp Ser Gly Asn Gln Asn Leu Ser Met Tyr Trp 30 Thr 45 Ser 60 Gln 75 SBI Cys Thr Phe Thr Val Thr Ser 160 Asn Ala 175 Gly Gly Asp 15 Glu Asp Thr Gly Gly Ser Ala Glu 80 Ser Ala 3-- OO 00 0 0 0 00 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 00 00 00 0000 Thr Ser Leu Thr Asp Thr 115 Thr Gln Tyr 130 Thr val Ala 145 Ser Asp Phe Gly Ser Ala <210> 3 <211> 185 <212> PRT <213> <400> 3 Ala Ser Thr 1 Asn Ala Val Thr Gly Asn 35 Arg Thr'Ile S0 Tyr Leu Thr 65 Val Val Asp Thr Val Lys Gly 100 ÅI9 Phe ÅSD Asn Ala -1eo Bacillus Asp ÅSII 20 Phe Ašn Leu SGI' S81' 526 842 85 Thr Val Tyr Ile Asn Glu Ser Val Arg 135 Phe Asn 150 His Tyr Gln Val 165 Val Thr Ile circulans Tyr Trp Gln S Gly Ser Gly Val Val Gly Tyr Asn Ala 55 'fyr Gly 'frp vo Trp Gly Thr 85 Asp Gly Gly 3 Ser Pro 120 Glu Phe Val Ser Asn Gly Lys 40 Gly Thr Thr Asp 105 Ser Ser Tr? Ala SGI 185 Trp Asn 25 Gly val Arg A19 TYI 90 Gly Ile Thr Val 170 Thr 10 TID TYP Ser PID 90 Asp Ser Thr Ärg His 155 Gln ASP Ser Thr Pro- 75 Th! Ile Thr Tyr Gln 110 Gly Thr Ser 125 Thr Ser Gly 140 His Gly Phe Ala Trp Ser Gly Öly Gly Val Asn Trp 30 Th: Gly Ser 45 PIO 60 Asn Gly Leu Ile Glu Gly Th: Tyr Tyr Thr Thr Val Cys Thr Phe Thr val ÅSD 160 His Gly Ala 175 Ile 15 Val Ser Asn Pro Phe Asn Gly Tyr Tyr ao Lys Gly 95 Thr Arg p... Tyr Asn Ala 115 Trp Ser Val 130 100 PID Årš Thr Phe Thr Asn 145 Gly Ser Asn Ser Sly Ser x2l0> 4 <211> 201 ~<2l2> PRT <2l3> <400> 4 ,, .- Arg Thr Ile 1 Glu Leu Trp Gly Ala Phe 35 I Lys Gly Lys 50 Ile Ser Ile 65 Leu Cys Val val Asp Ser Phegïyr Ala 9 TYP Ser 180 Bacillus Thr Lys 20 Ser Lys ÅSII Ty! Tf? 100 ASP Ser Ile Gln Ser Val 150 His Ala 165 Tyr Asn Val pumilus Asn Asn Asp Tyr Ala Gly Phe Asp Tyr Asn 70 Gly Trp BS Gly Thr Gly'Gly 526 842 Asp Lys 135 ÅSU Gln Thr Glu 'Gly Trp Ser 55 Ala Thr Tyr Thr 105 Gly Asp Arg 120 ÄI9 Ala Val Val Met ASH Asn 40 Thr Ser Gln A19 PrO Trp Met TIP 185 Gly Thr 25 Asn ÅI9 Phe Ser Pro 105 Asp Thr Lys Ala 170 Asn 10 Ser Ile Thr ASU Pro 90 Thr Ile ry: Glu L: Th* Gly Ser 155 Th: His Met Gly His Pro 75 LEU Gly Thr Phe Thr 125 Ser Asn Ala 140 " His Gly Met Glu Gly Tyr Ser Gly Tyr Thr. Asn 30 Leu Ala 45 Asn Leu His Gln Leu 60 Ser Gly Asn Ala Glu Ala Lys 110 Thr Thr Gln Thr Ile Leu 160 Asn Gln 175 SEZ' ASP TYY Asn Gly Phe Arg G1y'Asn Ser Tyr 80 Ty: Ile 95 Gly ser Arg Val Ä;- v' 526 842 5 115 "ízo 125 Asn Gln Pro Ser Ile Ile Gly Ile Ala Thr Phe Lys Gln Tyr Trp Ser 130 135 140 Val Arg Gln Thr Lys Arg Thr Ser Gly Thr Val Ser Val Ser Ala His 145 150 155 160 Phe Arg Lys Trp Gln Ser Leu Gly Met Pro Met Gly Lys Met Tyr Glu 165 170 175 Thr Ala Phe Thr Val Gln Gly Tyr Gln Ser Ser Gly Ser Ala Asn Val 180 185 190 Met Thr Asn Gln Leu Phe Ile Gly Asn 195 200 <210> 5 <211> 185 <212> PRT <213> Bacillus subtilus <400> S Ala Ser Thr Asp Tyr Trp Gln Asn Trp Thr Asp Gly Gly Gly Ile Val 1 S 10 15 Asn Ala Val Asn Gly Ser Gly Gly Asn Tyr Ser Val Asn Trp ser Asn -20 25 _ 30 Thr Gly Asn Phe Val Val Gly Lys Gly Trp Thr Thr Gly Ser Pro Phe 35 40 45 Arg Thr Ile Asn Tyr Asn Ala Gly Val Trp Ala Pro Asn Gly Asn Gly 50 55 60 Tyr Leu'Thr Leu Tyr Gly Trp Thr Arg Ser Pro Leu Ile Glu Tyr Tyr 65 70 75 80 Val Val Asp Ser Trp Gly Thr Tyr Arg Pro Thr Gly Thr Tyr Lys Gly 85 90 95 Thr val Lys Ser Asp Gly Gly Thr Tyr Asp Ile Tyr Thr Thr Thr Arg 100 105 110 Tyr Asn Ala Pro Ser Ile Asp Gly Asp Arg Thr Thr Phe Thr Gln Tyr I. 526 842 115 120 Trp Ser Val Arg Gln Ser Lys Arg Pro 130 135 Thr Phe Ser Asn His Val Asn Ala Trp 145 150 Gly Ser Asn Trp Ala Tyr Gln Val Met 165 Ser Gly Ser Ser Asn Val Thr Val Trp 180 185 <210> 6 <21l> 211 -<2l2> PRT <213> Clostridium acetobutylicum <400> 6 Ser Ala Phe Asn Thr Gln Ala Ala Pro 1 5 Ile Gly val Asn Gly äly Tyr Asp Tyr 20 25 Asn Thr Ser Met Thr Leu Lys Asn Gly 35 ' 40 Ser Asn Ile Gly Asn Ala Leu Phe Arg 50 S5 1 _ Thr Gln Thr Tyr Lys Gln Leu Gly Asn 65 70 Asn Tyr Gln Pro Tyr Gly Asn Ser Tyr 85 Ser Ser Pro Leu Val Glu Tyr Tyr Ile 100 105 Arg Pro Pro Gly Gly Thr Ser Lys Gly Thr 115 120 Ile Tyr Asp Ile Tyr Glu Thr Thr Arg r 155 Thr Leu Ala Gly Ser 75 CYS Asp Ile Asn Thr Lys _Ser 45 Lys ASH Trp Val 125 PIO 175 Ser Asn 15 ASP TYI ao Cys Gln Phe Asn Ty! Asn Sly Trp äs Gly Ser 110 Asp Gly Ser Ile Gly Ser Asn Ala Thr Ile Ser His Gly Met Asn Leu 160 Thr G10 Gly Ty: Gln Ser Glu Gly Trp Asp 80 Thr TYP Gly Gln i -rﬁ l30 Gly Asn Thr Thr Phe Lys Gln Tyr TYP Ser Va 145 Th: Ser Gly Lys Gly Met 180 Gly Tyr Gln 195 Ile Gly Lys 210 <210> <21l> 205 <212> PRT <2l3> 7 <400> Gly Arg Ile Ile l Glu Leu Trp -20 TYY Gly Gly Thr Phe 35 Arg Lys Gly 50 Arg Asp Val 65 Ile'Val Leu Cys val Ile val Glu Ser 100 Thr Ile Gly Th: 165 Lys Ser Lys Glu Tyr BS TIP Gln 150 ÅSP ASP Gly Gly Trp 526 842 135 Gln Asn SS Gly Trp Ser Met 200 Glu Gly Trp 40 Ser Cys Thr TYP Ala 185 Clostrídium stercoeraríum Thr Asn 25 Ser ÅSP Asp Arg Arg 105 Gly ï 170 Giy 10 Thr Asn LYS Ty: Asn 90 PID Th: 155 Thr Ile Ile Thr Asn 75 Phe Pro 140 1 Arg Thr Ile Ser Val Ser Lys His Phe Ala Pro Leu Gly Lys Met His Glu Thr Ala Ser Ser Gly Lys Ala Asp Val Asn Ser His Me: Gly 60 PID Leu Gly Glu nosen: o 0 u 0 nu oo a'.... ø..'. .ago o o 0 u coon u a ; o a nu nu Arg Thr Lys Arg 160 Ala Trp Glu Ser 175 Phe Asn Ile Glu 190 Met 205 Ser Ile Asn Gliy Tyr ASP 1s Gly Glu Leu Asn Asp 30 Asn Ala Leu 45 Phe Glu Glu Leu Gly Asn Ser 80 Gly Asn Val Glu Tyr 95 TYT Ala Thr Pro 110 Lys Ile Tyr Glu Thr nu n n a 0 I 0 000: 00 oo oo o o o o o o oo o I o q o o o o g O' II oooo 115 Thr Arg 130 Tyr Trp 145 Thr Glu His Met Tyr Ala Asn 195 .<2l0> 8 <211> 211 ~<212> PRT <213> <400> B Ser Ala Ala 1 Glu Met Trp Ala Gly Ser 35 Arg Meﬁ Gly S0 Gly Asn Ile 65 Ser Tyr Met ryr Ile val Glu Val Lys H 115 » Val Asn Ser Val Phe Glu Val 180 Val Tyr Asp Asn 20 Phe Lys Val CYS Glu 100 120 Gln Ser Ile 135 Pro Thr 150 Arg Ser Lys Lys Gln 165 Trp Glu Ala Leu Thr Val Asn Glu Ile 200 Lys Ruminoccus flavefaciens Gln Gln Thr Arg 5 Gln Asn Gly Gln Thr Cys Ser Trp 40 Asn Tyr Asp Ser S5 Leu Thr Tyr'Asp 70 Val Tyr Gly Trp 85 Gly Trp Gly Asp Gly Thr Val Ser Ala 120 ASP A19 Arg Glu 105 A19 Gly Gly 25 Ser Gln Val Thr Tf? 1os Asn Gly Thr Met 170 Gly Ile Asn 10 Gln Asn Lys Glu ÅI9 90 ÅI9 Gly 526 842 '8 Thr Ser 155 Gly Gly Val Ala Ile Lys TYT 75 Asn Pro Asn Ala 140 Gly Met Gln Ala Gly Ser Glu Asn 60 Thr Pro Pro Thr 125 Thr Thr Aro Ser Asn 205 Gly Met ASU 45 Ty! PIO Leu Gly 125 Ile Met Ser 190 Pro Tyr Asn 30 Phe Lys Arg Met Asn 110 ASP Ser Val 160 Gly Lys 175 Gly Tyr ASP TYI 15 Pro Gly Leu Ala Ala Phe Gly Asn 80 Glu Tyr 95 Asp Gly Ile Arg u: oo o o o o o o oo o o o o o o o 0 o o ooo o I o o o o I o oo oo ooo '1-.1 å* _' OO 0 0 0000 0 0 O O O 0 0 0 I 0 0 0 0 0 00 00 0000 000 00 0 0 QIO 0 0 Lys Thr Met 130 Pro Gln 145 Thr Asn Tyr Trp Ser Ala Leu Asn Ile 195 Val Ser Val 210 <2l0> 9 <21l> 197 <2l2> PRT <213> <400> 9 Ser Gly Thr 1 Trp Trp Thr Gly Ser Tyr 35 Gly Lys S0 Gly Gly Thr Tyf 65 Thr Arg Ser Tyr Asp Pre Arg Ty: Asn Glnd Met Ala 180 Glu PID .Asp 20 Thr Trp Gln Ser Ser 100 Tyr Trp Ser Val Arg Lys 165 Gly Gly Ser Gly Leu 'Asn Pro Leu BS Ser 526 842 9 Pro Ser Leu Asp Gly Th: 135 140 Gln Thr Ser Gly Ser Ala 150 155 Ile Asp Val Ser Lys His 170 Gly Thr Met Ser Gly Thr Leu Tyr 185 Leu Asp Ser 200 Asn Gly Ser Ala Asn 205 TYIÅIS Schizophyllum cimmdne Ser Thr Gly Asp Gly 10 Gly Tvr Ala Glﬂ Asn 25 Ala Gly Asp Thr Tyr Thr Trp Ser Asn Asn 40 Gly Gly Asn 45 Ala Ser Ile 60 Pro Gly Ala äs Ser Arg Asn Gly Asn 70 Ser Tyr Leu Ser Val 75 Ile Val 90 Ile Glu Tyr Glu Ser His Ser Val 105 Ala Ala Ser Lys Gly Ala rn: phe Asn Asn Gln 160 Phe Asp Ala 175 Glu Val 190 Ser Val Lys Ser Ser TYï TYI 15 Asn 30 Gly Gly Leu Val Gly Ser Ser Tyr Gly Trp 80 Gly 95 SBI Thr 110 Asn II Jolo o o o 0 I o oooo O o .I Il o oo I O I . . O I I oo oo oooo oo. ';0' ', OI O- oo oo o o o Il IQ U o O O Gly Ala Thr Tyr 115 Ile Asp Gly Thr .l30 Lys Lys Ala Pro 145 His Phe Asp Ala Gln Ile 180 Asn Tyr Thr Ile Th: Val 195 <2l0> 10 <2ll> 191 <2l2> PRT <2l3> <4ooš 10 Asp Thr Val Val 1 Tr? 20 Tyr Ser Phe Ser Gly Gly Gln 1 as Ala Gly Lys Gly S0 Gly Ser Phe Asn 65 Thr Ser Asn Pro Thr 100 Tyr Arg Pro Streptomyces Asp Ile Gln Thr Gly Gly 150 Trp Lys 165 Val Ala Thr Thr Thr Thr Asp SGI' Trp Ala Ser 70 Pro Leu Val 85 Gly Glu Leu Phe 135 Ser Gly Th! Asn Gln Ser Gln Thr Ser Asn Gly 526m842 Ser 120 Glu Ile Leu Glu 40 55 ' G1y_Asn Glu Tyr TYY LYS Thr Trp Arg Gln Phe Trp Ser Gly Thr l5S Gly Met Asn 170 Gly Tyr Gln 185 lividans Xyl B Glu 10 Gly 25 TYP Gly Ala 75 Tyr 90 Gly 105 Gly Thr Asn Arg Asn Thr Arg Arg Thr Tyr Leu Ala Ile Val Asp Thr Val Th: Ser Val Arg Asn 140 Val Asp Val Gln Leu Gly Ser Glu Ser Ser Gly Thr 190 Asn Gly Thr Val Ser Met Asn 30 Gly Asn 45 Val Gln 60 Leu Tyr Asn Trp 110 Pro ' Cys 160 His 175 TYI Tyr 15 Met Gly Phe Val Tyr Ser ¿;, Gly Trp 80 Gly Thr 95 Ser Asp Gly Gly Thr Tyr Asp Gly 115 Thr Arg 130 Thr Gly Gly 145 Ala Glu <2l0> _<211> <212> ”<213> .-_~!\ <400> Ala 1 Ser Gly Gly Phe 65 Asn Pro Gly Met Gly Tyr 11 191 PRT 11 Thr Thr Phe Trp Gly Ser 35 Lys Gly 50 Asn Pro 1--,_ PID LSU Th: Gly Ile Tyr 115 'TYI Thr Phe Thr Ile PID LSU 165 Gln Ser 180 Streptomyces Ile Thr Thr 20 ASP Ser Trp Ser Val Gly Val Gln BS Thr 100 Gln Thr Lys Asp 135 Thr 150 526”842 120 Gln Tyr Trp Th: Gly Asn Gly Asn Phe Ser Ser Gly Thr Ser 185 lividans Xyl C Thr Asn Gly Gly Thr Gln Thr Gly ÅSH 70 Gly TYI Tyr Lys Gly Thr Arg Gln Gly TYP 40 Asp TYr Ile Thr 120 Thr Set 25 Thr Gly Gly Val Val 105 Asn Th: šhr Arg val Ser Ris 170 Ser Gly 10 Val Asn Asn Cys Asp 90 Ser Ala Åsn Val Phe 155 Ile Thr Ser Cys Val Leu 75 Asn Ser Pro Lys ÄI9 Pro _ 125 Gln 140 V Asp- Met Asn Asp Met G1; Arg 60 Tyr TIP Asp SBI Ala Ile Val Gly Thr Asn 45 Gly Gly Gly Val 125 Ser TYP Asn Gly 190 Met Leu 30 Phe Asn TIP Ser Gly 110 Glu Ala Ala 175 Gly Tyr 15 A50 Val Gly' Thr Tyr 95 Thr Gly Arg 160 Thr Gly Ala Ser 80 ÅI9 Thr Gly 145 Ala Glu <2l0> <2l1> <2l2> <2l3> <400> Ala 1 Phe Gly Lys Phe 65 ÅSU Pro ÅSQ_ Ala Ala Ser Gly Thr Ile Thr 150 Gly Met Asn Met Gly 165 Gln Ser Ser 180 Gly Tyr 12 189 PRT Streptomyces sp . 12 Thr Thr Ile Thr Asn 5 Typ Th; Asp Gly Gly 20 Ser Tyr Ser Thr Arg 35 Cly Trp Ala Asn Gly 50 Asq7Pro Ser Gly Asn 70 Leu Val Glu Ty: 85 Pro Th: Gly Glu Th: Arg 100 Ile Tyr Lys Th: Thr 115 Phe Asp Gln Tyr 130 s2ßQs42 135 Thr Gly Gln Phe Gly Ser No. 36a Glu Thr Gly Ser Trp Thr 40 Gly Arg S5 Sly Tyr Tyr_Ile Gly.Thr Arg Ty: 120 Trp Ser 135 _ Gln Gln Tyr Trp Ser Val Arg Asn His A19 TYY 170 Ser Asn 185 Gly Tyr 10 Val Ser 25 Asn Cys Arg Thr Gly Cys Val Asp 90 Val His 105 Asn Ala Val Arg Gln Phe iss TYZ Ile Asp Met Gly Val Leu 75 Ser Pro Gln Ser 140 Asp Met Thr Gly Thr Asn Arä 60 Asp Ser Ser 140 Lys Ala Ile Val Met Leu Phe 45 Gly Gly Gly Val 125 Lys Val Tr? Asn Ser 190 Asn 30 Val Th! Ser Gly 110 Glu Val Ala Thr 175 Gly Ty: ser 15 Gly Gly Ala Gly Gly Trp Thf Ser _ao 'rvr Ars *+4- 95 Thr Tyr Ala Pro Th: Ser ~526 842 /3 Gly Thr Ile Thr Thr Gly Asn His Phe Asp 145 Met Asn Met Gly Asn Phe Arg Tyr Tyr Met 150 165 170 Tyr Gln Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ile Thr <210> <211> <2l2> <213> <400> "Ala Val Th! I? 1 Phe Gly Lys Phe 65 ÅSn Pro Asp Arg Gly 145 180 185 13 189 PRT Thermomonospora fusca 13 His 10 Ser Asn Glu Thr Gly Thr Val 25 Thr Asp Ala Pro Gly Ser 20 TIP Asn Ser Thr Ser Asn Thr 'IYI 35 Ars 40 TIP Thr Gly Gly Thr 55 Gly Trp Arg Arg S0 Asn Thr 70 Asn Pro Ser Gly Ala Leu Tyr Val Glu 90 Val Glu Ile 85 Pro Leu Tyr Val 105 Thr Thr Thr 100 Thr Gly Tyr Met Gly .--¿ Ile Thr Thr Asn Ala 'ryr 115 Lys Arg 120 Gln Val Thr Phe 130 Asp Trp Ser 135 Thr Ile Thr Ala Gly His Phe 150 Asn Asp Ala Trp Ala Arg Ala Gly 155 160 Ile Asn Ala Thr Glu Gly Val Ser Asp Gly Met Glu Asn Gly Thr 60 Val Leu Tyr 75 Ser Trp Thr Asp Pro Ser Gln Ser 140 Ala 155 TYP Gly TYI: Phe 45 m' Gly Gly Gly Ile 125 Lys Ala 175 Phe Tyr 15 Gly Pro 30 Val Ala Ser'Ala Trp Thr Thr Tyr 95 Gly Thr 110 Glu Gly Arg Thr Arg His Ser Gly Gly Ser A29 ao .Arg Thr Ser Gly 160 526/9842 Me: His Leu Gly Thr His Asp Tyr Me: Ile Me: Ala Th: Glu ély Ty; 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Ser Ser Asn Val Thr Leu Gly Thr Ser 180 185 <210>> 14 <21l> 190 <2l2> PRT <213> Tríchoderma harzanium <400> 14 Sln Ihr Ile Gly Pro Gly Thr Gly Tyr Ser Asn Gly Tyr Tyr Tyr Ser 1 5 10 , ~Tyr Trp Asn Asp Gly His Ala Gly Val Thr Tyr Thr Asn Gly Gly Gly 20 25 I 30 Gly Ser Phe Thr Val Asn Trp Ser Asn Ser Gly Asn Phe Val Gly Gly 35 40 45 Lys Gly Trp Gln Pro Gly Thr Lys Asn Lys Val Ile Asn Phe Ser Gly S0 ° SS 60 Ser Tyr Asn Pro Asn Gly Asn Ser Tyr Leu Ser Ile Tyr Gly Trp Ser SS ' 70 75 80 Arg Asn Pro Leu Ile Glu Tyr Tyr Ile Val Glu Asn Phe Gly Thr Tyr 85 90 95 Asn Pro Ser Thr Gly Ala Thr Lys Leu Gly Glu Val Thr Ser Asp Gly 7 100 105 110 Ser Val Tyr Asp Ile Tyr Arg Thr Gln Arg Val Asn Gln Pro Ser Ile 115 '120 125 Ile Gly Thr Ala Thr Phe Tyr Gln Tyr Trp Ser Val Arg Arg Asn His 130 135 140 Arg Ser Ser Gly Ser Val Asn Thr Ala Asn His Phe Asn Ala Trp Ala 145' 150 155 160 Ser His Gly Leu Thr Leu Gly Thr Met Asp Tyr Gln Ile Val Ala Val 165 170 175 --=~_.-» 526 84,25 Glu Gly Tyr Phe Ser Ser Gly Ser Ala Ser Ile Thr Val Ser <210> 15 <21l> 178 <212> PRT <213> <400> Ala Ser Tyr Ser Asp Phe Phe S0 Asn Val 65 Asp Asn Ser Asp Ser Pro ÅS!! Ser 15 Ile PIO Val 35 Gly Gly His Gly' Ile 115 PIO 1so_ Trp Ala 145 Val Ala Ser Asn Ser Val 180 Asn 'Ser 20 Val Gly TYP Asn Ala 100 Gln Arg Leu Glu ÄSD Gly Ser Ser Tyr 85 Thr Gly Thr Gly Gly 165 ÅSP Thr Val Phe Thr 70 Pro Thr SGI' Leu 150 Trichoderma ressei Xyl I Gln Asn Gly Phe Gly Trp 40 Ser Val 55 Asn Pro Ala Gln Thr Ile Ala Thr 120 Gly Thr 135 Hiš Leu 185 Ser 25 Thr Asn Leu Gly TIP 105 Phe Val Gly Trp Gly Gly Ser Gln Thr 10 val Asn Gly Ser Gly Val Glu 75 Thr Val 90 Glu Asn Asn Gln Thr Val Gln Met 155 Gly Ser 170 Gly Gly Trp Asn Ser Ser 45 Th: Gly 60 TYT TYI Lys Gly Thr Arg Tyr Ile 125 Gln Asn 140 Met Asn Ala Ser 190 Gln Thr 30 Ala Leu Ile Thr Val 110 SBI His Tyr Gln coon-o u :ocean o o Val 15 Gln Pro Leu Met Val 95 ASU Val Phe Gln Ser 175 Ser ASP Ile Ser Glu 80 Thr Glu Åfš Asn Val 160 Val I 00 o 0 I u I; 0 u n o C000 to 0000 n i I O O O o o u g UI OO <210> <2l1> <2l2> <213> <400> 16 190 PRT Tríchoderma ressei Xyl II 16 Gln Thr Ile 1 myr 'rrp Asn -sly sin *Lys S0 Ser 65 Arg ÅSD Ser Ile Gly TYI Ash PIO Val Phe 35 TYP Pro Ser Ty! 115 Gly Thr 137 Arg 145 Gln SBI SBI Gln Gly Gln Gly Ty! \ <210> <2l§> 7 17 190 Gln Asp 20 Ser Gln Pro Leu Thr 100 Asp Ala Gly Leu Phe 180 Pro Gly Val Pro ASn Ile 85 Gly Ile Thr Ser Thr 165 Ser Gly His Gly Gly 70 Gln Ala Ty: Phe Val 150 Leu Ser Thr Gly TTP Th: 55 Asn Thr A19 TYI 135 F26 842 /6 Gly T§r Asn Gly Ser 40 Lys Ser Lys Thr 120 Gln Asn Thr Gly Th: Gly Ser val 25 Asn ÅSH Ile Leu 105 Gln Ala Met Ala 185 10 Thr Ser Lys Leu Val 90 Gly Är? TYP ßsn ÅSP 170 Ser Asn Gly Val Ser 75 Glu Glu Val Ser His 155 Ile Gly Thr Asn Ile 60 Val ÅSH val Ash Val 140 Phe Gln Th: TYT Asn Phe 45 ÄSQ Phe Thr Gln 125 A19 Aso Ile Val Phe Gly 30 Val Phe Gly Gly Ser 110 PID Arg Ala Val Ser 190 Tyr 15 Pro Gly SGI TIP. Thr 95 ASP Ser ASn TYP Ala 175 Ser Gly Gly Gly Ser BO Tyr Gly Ile His Ala 160 Val OO 0000 0000 0 0 0 g 0 0 0 0000 0 0 0 0 0 0 0 000 00 00 g 526 842 I? <212> PRT <213 > Trichoderma viride <400> 17 Gln Thr Ile Gln Pro Gly 'rhr Gly Phe Asn Asn Gly Tyr Phe Tyr Ser 1 S 10 Å 15 Tyr Trp Asn Asp Gly His Gly Gly Val 'rhr Nr Thr Asn Gly Pro Gly 20 25 30 Gly Gln Phe Ser Val Asn Trp Ser Asn Ser Gly Asn Phe Val Gly Gly 35 40 45 Lys Gly Trp Gln Pro Gly Thr Lys Asn Lys Val Ile Asn Phe Ser Gly 50 _ 55 60 ser 'IW/r Asn Pro Asn Gly Asn Ser 'ryr Leu Ser Val 'Dyr Gly Trp Ser 65 70 75 '_ 80 Arg Asn Pro Leu Ile Glu Tyr Tyr Ile Val Glu Asn Phe Gly 'fbr 'ryr 85 90 95 Asn Pro Ser Thr Gly Ala Thr Lys Leu Gly Gln Val Thr Ser Asp Gly 100 105 110 Ser Val 'Fyr Asp Ile Tyr Arg Thr Gln Arg val Asn Gln Pro Ser Ile 115 120 125 Ile Gly ThrAla 'rhr Phe 'Iyr Gln 'ryr Trp Ser Val Arg Arg 'rhr His 130 135 140 “ Arg Ser Ser Gly Ser Val Asn Thr Ala Asn His Phe Aen Ala Trp Ala 145 150 155 .160 Gln Gln Gly Leu Thr Leu Gly Thr Met Asp Tyr Gln Ile Val Ala Val 165 170 175 Gln Glyxl-'yr Phe Ser Ser Gly Ser Ala Ser Ile Thr Val Ser 180 185 190 <210> 18 <211> 202 <212> PRT <213> Fibrobacter succinognees <400> Asn Ser 1 Ile Trp Thr Ty: Phe 50 Gly Asp 55 Tyr Ile Ile Val Arg Lys Asn 130 Gln 145 Ile Lys Ser Phe <210> <211> <212> <213> Tyr Thr 18 Ser Tyr Lys 35 Lys Tyr Gly ÄSP Gly 115 Thr Aïg Phe Ala MeE'Tyr ASP 195 19 189 PRT Asparigillus awamori var. Val Gln 20 Ala Ile ÅSP 100 Glu Val Ser His Glu 180 Val Thr Gly SBI Asp Lys BS TYP Phe Gln Val MSC 165 Thr Gly Gly Tf? Glu Trp 70 Gly Phe Th: Gln ÅIQ 150 Lys Lys Tyr 526 842 /8 Asn Val Asn Asn Asn Gly 40 Lys His SS Ser Lys Trp Thr Asn Lys Val Asp 120 Pro 135 Ser Lys Ser Lys Trp Val Leu Phe'Lys 200 Gly SBI 25 Thr Thr Gln Val P20 105 Gly Ile Ala Glu Val 185 Met Ser 10 Met Asn Tyr Gly Asp 90 Gly Asp Lys AI9 Glu 170 Glu Thr Se! Thr Asp Gln Se! 75 Pro Ala Thr Gly Ser 155 Leu Gly Ala Gly kawachi Phe Glu 60 Ala Leu Asn TYY Thr 140 Cys fyr: Leu 45 Leu Gly Val Leu Glu 125 Gln Gly Met Gly His Asp 30 Ala Gly Gly Glu LSU 110 Ile Thr His Lys Gly 190 ÄSII Arg PIO Tyr 95 Gly TIP Phe Ile Met 175 Ser Val Ile Asn 80 Gln Gln Pro Asp 160 Gly Gly . 00 a' en 00 I 0 00 I 0 I n U O I teen Ian I! <400> 19 Arg Ser Th: 1 Phe Trp Th: Gly Ser Tyr 35 Lys Gly S0 Trp Phe Thr Pro SS Asp Pro Leu Pro Gly Ser Val Tyr Asp 115 Gly Thr Gln 130 Val Gly 145 Gly Leu Gly Met^ Gly Tyr Gln <2l0> 20 <211> 123 <212> PRT <2l3> <400> 20 Pro Asp 20 Ser Asn Ser -Ile Gly 100 Ile Thr Thr Asn Ser 180 Ser Ser 5 Gly Gly Val Gln Pro Gly Gly Asn 70 Glu Tyr 85 Gly Thr Ty: Thr Phe Ser Val Thr 150 Leu Gly 165 Ser Gly 526 84,2 Thr Gly Gly Asp Trp ser 40 Ser Ala 55 Gly 'fyr Ile Thr Arg Ala Thr 120 Gln 135 Thr Ser Thr His Ser Ser Thermomyces lanuginosus 19 Glu Val 25 ÄSD Lys 'Leu Val Gly 105 ÄIQ TYP ÅSII Asn Ser 185 ÅSII 10 Thr Val ÅSP Ser Glu 90 Asn Thr Ser His 170 'Ile Gly lle Val 75 Ser Val Asn Val Phe 155 Gln Thr Glywrwr ïhr Asn Gly - 30 Asn Phe 45 Val Thr Tyr Ser 60 'fyr Gly Trp 'Ivr Gly ASP Ser Ser Asp 110 Ala Pro 125 Ser Arg Gln Asn 140 Asn Ala Trp ne Lau Ala Ile Gln ÄSH Gly Gly Thr Gly Ile Lys Ala Thr 175 Ser Gly ÅS!! Thr 80 Ash Ser Asp Arg Lys 160 Gln U I on case .c ou g g . . : ' I I chou cc o.. . ° . ° I Oc. co g. oss: of g o o o e I I I» o o II Gln Thr Trp Trp Gly Thr Gly 50 Lys Val GS Arg Asn Asp Pro Ser Ile Gly 130 Asp Arg Thr 145 Arg Ala Thr Glu Th! PID ASU ser Asp 20 Gly Glu Ile Tyr 35 Pro Trp Asn Gln Pro Val 85 PIO LSU Ser 100 Ser Gly Leu Tyr 115 Arg Thr Gln Thr Ser Gly Thr LSU ÅS!! 165 Gly Gly Tyr Phe 180 Val Gly <2l0> <21l> <2l2> <2l3> <400> ctagptaagg aggctgcaga tgcaaacaa 7 21 76 DNA Trx-1 21 Ser Trp 526 84-2 zo Ser Glu Gly Trp His ASP G1Y TYI Ala 25 Gly Ala Gln Gly 40 ASP Gly Leu Ala 55 Asn Gly Asn Ser 70 Glu Tyr Ile Leu 105 Ala Thr Asp Thr Thr 120 Gly Lys Phe Asp Gln 135 Val Gln 150 Thr Gly Val Asn Gly Asp Ser Ser Gly Tyr 'IBS 10 Th! TY1 Gly Gly Arg Ala Leu Ala 75 Val Glu 90 Gly Thr Arg Val Trp Ser Cys His 155 His Tyr 170 Ala Arg Thr Asn ASU. LSU. 45. Ile His 60 Val Tyr Asn Phe Val Glu Asn Ala 125 Val Arg 140 Phe Asp Tyr Gln I1e'Thr TV! Leu 30 Val Phe Gly Gly CYS 110 PIO Gln Ala Ile Val 190 Gly Glu TYP Thr 95 Asp Ser Asp TYP Val lvs Ala t acaaccagga accggttaca acaacggtba Gly Thr 80 Gly Ile 'l, Lys Ala 160 Ala ASP 60 cttttacagc tattgg <210> 22 <211> 78 <212> DNA <213> XyTv-2 <400> 22 aacgatggcc atggtggtgt tacctataca aacgggcccg gaggccaatt tagcgtcaat tggtctaact ccggaaac <210> 23 __<211> 'ra *;”<212> DNA <213> Trxv3 <400> 23 ttcgtaggtg gaaaaggttg gcaacccggg accaaaaata aggtgatcaa cttctctgga tcttataatc cgaatggg <210> 24 <21l> 74 <212> DNA <213> Xy?V-4 <400> 24 aaﬁtCataCt tﬁagßgtcta tggccggcct agaaacccac tgattgaata ttacactgtc ~ gaaaatttcg gtac 60 78 60 'ia 60 74 l. <2l0> <2ll> <212> <213> <400> '25 S1 DNA Trx-8 25 526 842 zz gattcctccg acgtctacgt ttgttatgtc~ggtccttggc caatgttgtt g <210> <21l> '<212s <213> <400> ccaatgaaaa tgtcgataac cttgctaccg gtaccaccac aatggatatg cctccggtta aatcgcagtt aacc f <2l0> <211> <212> <2l3> <400> agattgaggc ctttgaagc tagttgaaga gacctaga <2L0> <2ll> <2l2> 26 84 DNA xyrv-1 26 27 78 DNA TIX-6 27 28 85 DNA tttgcccggg a tccacctttt ccaaccgttg ggccctggtt tttattccac 5 51 60 84 0 78 526 842 gå 25 " <213> XyTv-5 <400> 28 atattaggct tacccttaag catgaattcg cagataccga Ccagátcttt gggtgactaa 60 cctataatgt aacagctttt aaagc É5 <210> 29 <211>' sa <212> DNA <2l3> xyrv-101 <400> 29 tcgacaattt cggtacctac aatccgagta ccggcgccac aaaatnaggc gaagtcac 58 <2l0> 30 <21l> 53 <212> DNA <2l§> XyTv-102 <400> 30 tagtgatgga tccgtatatg atatctaccg tacccaacgc gttaatcagc cat S3 <210> 31 <2l1> äa <212> DNA Trx-103 <213> <400> 31 cgatcattgg aaccgccacc ttttatcagt actggagtgt tagacgcaat catcggagc S9 '<210> 32 526 842 ;gg ILH <211> ss <212> nNA <213> xyrv-104 <400> 32 ' . pccggttcgg ttaatactgc gaatcacttt.aatgcatggg cacagcaagg gctaacccta 60 ggtacaatg <2l0> 33 '<211$ sv <212> DNA <213> xyrv-105 <400> 33 gattatcaaa tcgtagcggt ggaaggctac ttctcgagtg gttccgctag tattacagtg 60 .r agctaaa 67 <210> 34 <211> 73 DNA I xyrv-11o <212> <2l3> <400> 34 gttaaagcca tggatgttag gctcaﬁggcc gcggtgtttt aatccgcttc agtgatcact 60 acccaggcac aca 734 <2l0> 35 <2l3> 54 f .ga <212> DNA <213> XyTv-109 <400> 35 ctatagatgg catgggttgc gcaattagtc ggtagctagt aaccttggcg gtgg 54 <210> 36 <2l1> 60 <212> DNA I. <213> xyrv-1oa <400> 36 aaaatagtca tgacctcaca atctgcatta gtagcctcga ggccaagcca attatgacgc 60 <210> 37 <211> 66 <212> DNA <213> XyTV-107 <400> 37 ttagtgaaat tacgtacccg tgtcgttccc aattgggatc catgtcacct aatagtttag 60 CBCCQC 66 38 a' va. <210> <21l> 53 <212> DNA <213> XyTV-106 <400> 38 caccttccga <2l0$ 39 <2l1> 596 <212> DNA <213> TIX <400> 39 ctagctàagg cttttacagc 'ccaatttagc cgggaccaaa ~c;taagcgtc cggtacctac cgtatatgat cttttatcag gaatcacncc C9ta9C99C9 <210> 40 <211> ¿36 <2l2> DNA <213> TX-75A-1 <400> 40 aggctgcaga tgcaaacaat tattggaacg atggccatgg gtcaattggt ctaactccgg aataaggtga tcaacttctc tatggctggt ctagaaaccc aatccgagta ccggéåccac atctaccgta cccaacgcgt tactggagtg ttagacgtaa aatgcatggg cacagcaagg gaaggctact tctcgagtgg 526 842 tgaagagctc accaaggcga tcataatgtc actcgatttc tå acaaccagga tggtgttacc aaacttcgta tggatcttat accgattgaa aaaattaggc taatcagcca tcatcggagc gttaacccta ccccgcnagn tgggaattca tacttagccg tctatggctg gtctag <210> 41 Zk> accggttaca tatacaaacg ggtggaaaag. aatccgaatg :annacåccg gaagtcacta tcgatcattg tccggttcgg ggtacaatgg ancacagcga acaacggtta 9900999399 gttggcaacc ggaattcata tcgaaaattt gtgatggatc gaaccgccac ttaatactgc attatcaaat gﬂtaaa 60 120 180 240 300 360 420 480 540 S96 36 526 842 2? <211> 42 <212> DNA <2l3> TX-IOSH-1 <400> 41 agcggcgcca caaaacacgg cgaagtcact agtgatggat cc <210> <2l1> <212> <213> ~<4D0> ~f?-ccaàggcåat cataatgtca ctcgatttct agaacttcga <2l0> <21l> <212> <213> <400> > 42 44 DNA TX-C1_ 42 43 36 DNA TX-del(l23-144)-lr ' 43 cggagctccg acgcgttggg tacggtagat atcata <210> <211> <212> <2l3> <400> 44 -' -z 42 DNA TX-IOSR-1 44 ECCC 42 44 36 <210> <21l> <2l2> <213> <400> ctagctaagg aggctgcaga tgcaaacaat acaaccagga a _<210p <211> -<2l2> <2l3> <400> tgggaattca tacttaggcg tctatggctg gtctag <2l0> <2l1> <2l2> <213> /TX-144R-lr <400> ccatgcatta aagtgattcg cagtattaac cgaaccggag ctccgacgat °° <2l0> f' <211> .Obi <2l2> 000 - w- looø: , 0 0 45 41 DNA Tx-Nl 45 46 36 DNA TX-75-G1 46 47 S4 DNA 47 48 44 DNA 526 842 23 accggcgcca caaaaagagg cgaagtcact agtgatggat cc tacg n: n-'ø o..n kz, '.. .:- ..._ 41 _ 36 al? 54 526 842 29 <213> TX-ISIR-lr <400> 48 , gtacctaggg ttaacccttg ccgtgcccat gcattaaagt gatt <210> 49 <21l> 40 <212> DNA <213> TX-125A 129E-1 <å00> 49 CCBBCQCQÉC 8atgCgCCat CQQÉCQBQQQ aaCCQCC3CC <210> 50 <211> 26 <212> DNÄ <213> TX-116G-1 <400> 50 gäCQQ3tCCQ tåﬁaﬁggtat CCECCQ <2l0> 51 <211> 36 <2l2> DNA _'-L <213> Txlí1ac-1 <400> 51 gacggatccg tatatgatat ctgccgtacc caacgc <2l0> 52 000000 n 000000 0 0 0 0 00 un 0'..-. 'Oon- 0000 o 0 n n 000: u 0 0 0 nu 0; :con 0 0 0 0 0000 00 0 0 0 0 0 0 0000 0 0 000000 0 00 0 1 0 0 0 0 0000 L 526 842 so <211> 39 - -1 ? <212> DNA <21:> rx-1oH11o-1 <400> 52 ggaaccggrc accacgacgg ttactcctac agctattgg ¿21o> ss <21l> 36 <2l2> DNA kalas wx-11sG11ac-1 <400> S3 gacggatccg tatatggtat ctgccgtacc caacgc <210> 54 <2l1> 184 <2l2> PRT <213> Aspergíllus kawachii <400> S4 I Ser Ala Gly Ile Asn 'ryr Val Gln Asn Tyr Asn Gly Asn Leu Ala .Asp 1 S 10 15 Phe Thr Tyr Asp Glu Ser Ala -Gly Thr Phe Ser Met Tyr Trp Glu Asp 20 25 30 Gly Val Ser Ser Asp Phe Val Val Gly Leu Gly Trp Thr Thr Gly Ser 35 40 45 Ser Asn Ala Ile Ser Tyr Ser Ala Glu Tyr Ser Ala Ser Gly Ser Ser 50 55 60 Ser__Tyr Leu Ala Val Tyr Gly Trp Val Asn 'ryr Pro Gln Ala Glu Tyr i. 3 9 36 <.-:=__- annons 0 I anloøo I 0 526 842 3! 55 70 75 80 Ty;- Ile Val Glu Asp Tyr Gly Asp 'ryr Asn Pro Cys Ser Ser Ala Thr Ö Id O 0 I 0 OO III 0 I 0 u Û U O I I I I Il OI JO III! 85 90 95 ge;- Leu Gly Thr Val Tyr Ser Asp Gly Ser Thr Tyr 'Gln Val Cys Thr 100 105 110 Asp Thr Arg Thr Asn Glu Pro Ser Ile Thr Gly Thr Ser Thr Phe Thr 115 - 120 125 Gm ry; Pne ser val Arg alu ser än: Arg 'rnr sar Gly 'rhr val 'rhr « 130 ns 140 Val Ala Asn His Phe Asn Phe Trp Ala Gln His Gly Phe Gly Asn Ser 145 150 155 150 Asp Phe Asn 'ryr Gln Val Met Ala Val Glu Ala Trp Ser Gly Ala Gly ' 165 170 175 Ser Ala Ser Val Thr Ile Ser Ser 180 .--1. L