SE519172C2 - Fastfas syntes av cyaninfärgämnen - Google Patents

Description

20 25 30 35 519 172 2 Ett ytterligare ändamål är att erhålla fluorescensfärgämnen som skiljer mellan DNA och PNA när de fästes till en sond.

Utvecklingen av genetiskt modifierade produkter och karaktäriseringen av gener i human och andra däggdjurssjukdomar kräver tillförlitlig detektering av små mängder DNA. Genom att ha en sond bestående av PNA och ett cyaninfärgämne är det möjligt att detektera närvaron av och/eller kvantifiera en specifik DNA sekvens genom att mäta fluorescensökningen från färgämnet. För att erhålla mera känsliga sonder måste bindningsaffiniteten hos färgämnena till PNA, vilket resulterari bakgrundsfluorescens minskas.

Inom sjukhusvården samt inom livsmedelsindustrien utvecklas system för automatisk analys för kontroll av bakterie och viruskoncentrationer. Med användning av ny teknologi föreligger förhoppningen att det är möjligt att åstadkomma analyssvar samma dag som test genomföres , dvs. mer eller mindre i realtid.

Sonder för hybridisering till nukleinsyror (NA), med vilka det hänföres både till deoxiribonukleinsyror (DNA) och ribonukleinsyror (RNA), användes för att visa närvaro av en specifik målsekvens (TS) i komplexa blandningar. Traditionella hybridiseringsmetoder, som först beskrevs av Gillespie and Spiegelman (J. Mol. Biol. 12, 829, 1956), använder en sond baserad på oligodeoxiribonukleotid försedd med en reportergrupp (RG) som vanligen är en radioisotop, och omfattar vanligen följande steg: nukleinsyran som skall testas immobiliseras på ett papper, glaspärla eller plastyta, ett överskott av sond som är komplementär till målsekvensen tillsättes, sonden tillåts hybrldisera, icke-hybridiserad sond avlägsnas, återstående sond bunden till den immobiliserade målsekvensen detekteras. Ändamålet med föreliggande uppfinning är att syntetisera cyaninfärgämnen, företrädesvis asymmetriska cyaninfärgämnen, med användning av fastfaskemi. Detta tillvägagångssätt skall göra framställning av rena cyaninfärgämnen lättare, och en kombinatorisk metod skall förstärka effektiviteten vid färgutvecklingen. Vidare, underlättas syntes av ljussonder genom att utlämna behovet av försyntes och rening av de länk-modifierade färgämnena.

Beskrivning av föreliggande uppfinning Det har nu visat sig möjligt att kunna syntetisera asymmetriska cyaninfärgämnen med användning av fastfassyntes i enlighet med föreliggande uppfinning som omfattar en 30 35 519 172 3 metod för framställning av asymmetriska cyaninfärgämnen med den allmänna formeln (Ia, Ib, Ic, Id).

Re vari X is S, O, Se, N-Ry, eller C(CH3)2, samtliga R3, R4, R5, RÖ, R7-grupper är företrädesvis alkyl med 1 till 7 kolatomer, RI and R; är alkyl grupper med 1-11 kolatomer och omfattande en karbonylgrupp med förmåga att fästa till ett fastfasharts, och varvid R; kan vara en väteatom, och varvid R; och R4 kan beteckna substituenter med förmåga att skapa en ytterligare aromatisk ring, n är 0 - 7, företrädesvis 0,1, 2, or 3, kännetecknad av att en förening med den allmänna formeln (IIa, IIb) 519 172 4 Rs R \ 4 eller I / l* 'i Rz "a m» 10 respektive den allmänna formeln (IIIa, IIIb) RS RS Ac x / X ' / A N R/ R/ ' eller ma "lb vari Rl, Rz, R3, R4, RS, Ra, X, och n har den betydelse som givits ovan, ar fästade till fastfasmolekylen och föreningar med den allmänna formeln (III) och (II), respektive tillåts kondensera till den till fasta fasen fästade föreningen (II) respektive (III), för att bilda en förening med den allmänna formeln (I). 25 Genom att använda fastfassyntesreaktioner kan reaktionen avslutas till mycket höga utbyten, upp till 100% utbyte, och undviker användning av höga temperaturer, olika lösningsmedel, som kan vara mer eller mindre giftiga, och påverkar miljön.

Föreliggande fastfasreaktion genomföres vid omgivningstemperatur och 30 trifluorättikssyran som användes för att frisätta den slutliga föreningen från den fasta fasen, om så behövs, återvínnes enkelt.

Föreliggande uppfinning underlättar vidare lagring av utgångsmaterialen i stället för instabila, ljuskänsliga produkter med hänsyn till sondsyntes. Dessa sonder kan 35 framställas på fastfas genom att tillsätta DNA eller PNA till den fasta fasen och sedan reagera fluorescensfärgämnet direkt därpå medelst föreliggande uppfinning. 10 15 20 25 30 35 519 172 5 Föreliggande uppfinning underlättar vidare framställning av färgämnesbibliotek för att konstruera arrays, färgfläckar på papper eller guldytor. Flera färgämnen kan framställas samtidigt och deras egenskaper kan lättas fastställas. Egenskaper såsom tillsats av NAA (nukleinsyraanalog)/NA (nukleinsyra) till array, som leder till bestämning av vilken fläck som har största fluorescens, varvid ett färgämne kan särskilja mellan t.ex. DNA och PNA; giftighetsundersökning; läkemedelsutveckling; och sekvensspecifik färgämnesbindning eller kan endast innehålla NA-sekvenser som ger upphov till fluorescensförstä rkning.

Fyra olika färgade cyaninfärgämnen syntetiserades för att illustrera de kombinatoriska möjligheterna hos fastfas färgämnessyntesen. Utgångsmaterialen kombinerades enligt FIG. 1. Föreningarna 1 och 2 fästes till fastfashartset och föreningarna A och B kondenserades därefter med picolin respektive lepidingrupper. Det synliga resultatet av reaktionerna var fyra olika färgade produkter, BO (gul), TO (orange), BO-3 (mörklila) och TO-3 (blå). Masspektrometrianalys visade de förväntade produktmassorna, men också en fraktion av utgångsmaterialen fästade till hartset, dvs., mängder av picolin och lepidingrupper. Kondensationsreaktionerna fortskred till 48%, 70%, 78% respektive 50% för de fyra BO, TO, BO-3, respektive TO-3. De relativt stora mängderna av utgångsmaterial som kvarstår beror väsentligen på en alltför kort kondensationsreaktionstid.

De spektroskopiska egenskaperna hos de fyra färgerna undersöktes. Absorptionsspektra hos de rena färgämnena visas i Figur 2. Figur 3 illustrerar fluorescensspektra för färgämnena i närvaro av kalvtymus-DNA och jämföres med fluorescensen hos rena färgämnena som sådana. Samtliga fyra syntetiserade färgämnen uppvisar liknande egenskaper när de samverkar med DNA: stark fluorescensförstärkning förbunden med begränsad rotation vid intercalation (Lee et al, Cytometry, 7, 508, 1986).

Fastfassyntes av TO-N=-10, den färgförening som vanligen användes i ljussonder (Isacsson et al, Nuce. Accis Res. Metod, submitted) genomfördes för att undersöka effektiviteten i kondensationsreaktionssteget. Den aktiverande basen DIEA i 50% DMF/pyridin jämfördes med Et3N i DCM. Efter 20 hrs, hade den senare reaktionen fortskridit till 100%, medan den tidigare innehöll rester av oreagerad benzotiazol- förening (MS). Reaktionstiden för kondensationen med användning av Et_-,N i DCM undersöktes därefter. Provmängder av hartset avlägsnades vid vissa tidpunkter under reaktionen och utsattes för klyvning och MS analys. Reaktionens fortskridande kan enkelt visas med en avsättning av produktbildning respektive försvinnandet av 10 15 20 25 30 35 519 172 6 benzotialzolreagenset mot reaktionstiden för försöket. DIEA och Et3N har givits som exempel på lämpliga aminer. Andra aminer som kan användas är alkylaminer.

Sammanfattningsvis har det visats att syntesen av olika asymmetriska cyaninfärgämnen med användning av fastfaskemi är möjlig. Kombinationssättet gör det enklare att utveckla nya färgämenen och den lilla syntesskalan är passande för screeningsändamål.

Kedjelängden hos mellanlänken och substitutionerna kan lätt ändras, och ytterligare försök gör det likaså möjligt att variera länkens längd. Dessutom underlättar denna syntesmetod syntes av ljussonder eftersom framställning av rena färgämnen före sondsyntes är onödig. Utgångsmaterialet kan lagras på ett enklare sätt, det är inte känsligt för ljus eller utsatt för ringslutning vilket har varit ett problem med försyntetiserade färgämnen (Hung et al, Anal. Biochem, 243, 15, 1986).

Den fasta fasen kan bestå av hartser, i synnerhet funktionaliserade fasta hartser såsom funktionaliserade polystyrener, guldytor i vilket fall hydroxigruppen i karbonylgruppen ersättes med en tiol-grupp, pappersmaterial eller kiselytor. En funktionaliserad grupp betyder en grupp som kan binda till en amingrupp, och företrädesvis kan bindningen frigöras med trifluorättikssyra. Karbonylgruppen kan alternativt ha sin OH-grupp ersatt med en amingrupp. Den fasta fasen kan vidare vara en fast fas enligt ovan på vilken en nukleinsyra-analog/nukleinsyra/peptidsekvens är fästad och på vilken cyaninfärgämnet är syntetiserat. NAA/NA/peptidsekvensen bildar därmed den fasta fasbasen.

Förkortningar som användes häri: DCM: diklormetan; DIEA: diisopropyletylamin; DMF: N,N-dimetylformamid; Et3N: trietylamin; Fmoc: fluorenylmetoxykarbonyl; HBTU: (2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1, 1, 3, 3-tetrametyluroniumfluorfosfat; MBHA: p-metylbenzhydrylamine; MS: masspektrometri; PNA: peptidnukleinsyra; TFA: trifluorättikssyra.

Exempel Eliminering av skyddsgrupp på Fmoc rink-amid MBHA harts genomfördes med 25% piperidin i DMF under 30 min. Syra-länk derivaten (1 och 2) kopplades i 4-faldigt överskott till substitutionsnivå i hartset med användning av konventionella reagensen HBTU och DIEA i 50% DMF/pyrídin. Reaktionerna fick fortskrida under 2 hrs. Efter tvättningar med DMF, kondenserades benzotiazolföreningarna (A och B) med 1 eller 2 vid omgivningstemperatur i närvaro a EtgN (5-faldigt överskott) i DCM. Produkterna klövs medelst behandling med 95% TFA/vatten under 90 min och índunstades därefter. 519 172 7 Motsatt ordning på ingående reaktanter har också testats varvid förening A och B i Fig. 1 med en RI grupp omfattande en karbonylgrupp fästad till N-atomen fästes till den fasta fasen och föreningarna 1 och 2 då omfattande en metylgrupp (Rz) fästade till N-atomen reagerades därtill. De erhållna utbytena uppgick till 100% efter en reaktionstid av mindre än 12 hrs i varje individuell reaktion.

Claims (7)

35 519 172 PATENTKRAV

1. Förfarande för framställning av cyaninfärgämnen med den allmänna formlerna (Ia, Ib, Ic, Id) Re lb vari X is S, 0, Se, N-Ry, eller C(CH3)2, samtliga R3, R4, RS, Rs, Ry-grupper är företrädesvis alkyl med 1 till 7 kolatomer, RI and R; är alkyl grupper med 1-11 kolatomer och omfattande en karbonylgrupp med förmåga att fästa till ett fastfasharts, och varvid R; kan vara en väteatom, och varvid R3 och R., kan beteckna substituenter med förmåga att skapa en ytterligare aromatisk ring, n är O - 7, företrädesvis 0,1, 2, or 3, kännetecknad av att en förening med den allmänna formeln (IIa, IIb) 519 172 Ra Rz R* \N/ I eller / / R5 lla llb respektive den allmänna formeln (IIIa, IIIb) Re X TG QN\Äi(\/7\ñ/"P“ /NÄSCHS Ri Ra eller Illa lllb 25 vari RI, Rz, R3, R4, Rs, Re, X, och n har den betydelse som givits ovan, är fästade till fastfasmolekylen och föreningar med den allmänna formeln (III) och (II), respektive tillåts kondensera till den till fasta fasen fästade föreningen (II) respektive (III), för att bilda en förening med den allmänna formeln (I). 30

2. Förfarande enligt krav 1, vari den fasta fasen består av ett harts valt ur gruppen bestående av funktionaliserade hartser.

3. Förfarande enligt krav 1, vari den fasta fasen består av en guldyta. 35

4. Förfarande enligt krav 1, vari den fasta fasen består av papper. 519 172 10

5. Förfarande enligt krav 1, vari den fasta fasen består a en kiselyta.

6. Förfarande enligt ett eller flera av kraven 1-5, vari kondensationsreaktionen genomföras vid omgivningstemperatur.

7. Förfarande enligt ett flera av kraven 1-6, vari den fastfas-molekylen omfattar till en fast fasbas en nukelinsyra analog/nukleinsyra/peptidsekvens på vilken cyaninfärgämnen syntetiseras.