SE517610C2 - Mikropartikelberedning - Google Patents

Description

»- v v~ o-u- u- » . 10 15 20 25 30 517 61 o ' 2 ofarliga naturen hos PLGA kan dessutom exemplifieras av att åtskilliga parenterala beredningar för fördröjd fri- sättning baserade på dessa polymerer har godkänts av myn- digheter, däribland US Food and Drug Administration.

Parenteralt administrerbara produkter för fördröjd frisättning på marknaden idag baserade på PLGA innefattar Decapeptylm (Ibsen Biotech), Prostap SRW (Lederle), De- capeptyl® Depot (Ferring) och Zoladex® (Zeneca). Läke- medlen i dessa beredningar är alla peptider. Med andra ord består de av aminosyror kondenserade till en polymer med relativt låg polymerisationsgrad och de uppvisar ej någon väldefinierad tredimensionell struktur. Detta möj- liggör i sin tur vanligtvis användning av förhållandevis stränga betingelser under framställningen av dessa pro- dukter. Exempelvis kan strängsprutning och efterföljande storleksreducering utnyttjas, vilka tekniker inte torde vara tillåtna i samband med proteiner, eftersom dessa allmänt sett inte klarar så stränga betingelser.

Följaktligen föreligger det också behov av bered- ningar med reglerad frisättning för proteiner. Proteiner liknar peptider därigenom att de också består av aminosy- ror, men molekylerna är större och flertalet proteiner är beroende av en väldefinierad tredimensionell struktur vad beträffar många av sina egenskaper, däribland biologisk aktivitet och immunogenicitet. Deras tredimensionella struktur kan förstöras relativt lätt, t.ex. av höga tem- peraturer, ytinducerad denaturering samt i många fall ex- ponering för organiska lösningsmedel. En mycket allvarlig nackdel i samband med användning av PLGA, som är ett ut- märkt material i sig, för fördröjd frisättning av protei- ner är därför behovet av användning av organiska lös- ningsmedel för upplösning av nämnda PLGA, med åtföljande risk för att proteinets stabilitet påverkas negativt och att konformationsförändringar hos proteinet leder till en immunologisk reaktion hos patienten, vilket kan ge både en förlust av den terapeutiska effekten genom bildning av hämmande antikroppar och toxiska biverkningar. Då det är 10 15 20 25 30 35 517 610 3 synnerligen svårt att med säkerhet avgöra om ett komplext protein i alla delar har bibehàllit sin tredimensionella struktur, är det av stor vikt att undvika att utsätta proteinet för betingelser som kan tänkas inducera konfor- mationsförändringar.

Trots stora ansträngningar i syfte att modifiera PLGA-teknologin för undvikande av detta inneboende pro- blem med proteininstabilitet under framställningsförfa- randet har utvecklingen inom detta omrâde gàtt mycket långsamt, och huvudanledningen till detta är sannolikt att de tredimensionella strukturerna för flertalet prote- iner är alltför känsliga för att motstå de använda till- verkningsbetingelserna och den kemiskt sura miljö som bildas vid nedbrytningen av PLGA-matriser. Den vetenskap- liga litteraturen innehåller ett flertal beskrivningar av stabilitetsproblem vid tillverkningen av mikrosfärer av PLGA pà grund av exponeringen för organiska lösningsme- del. Som ett exempel pà den sura miljö som bildas vid nedbrytningen av PLGA-matriser har det nyligen visats att pH-värdet i en PLGA-mikrosfär med en diameter pà cirka 40 pm visats sjunka till 1,5, vilket är fullt tillräckligt för att denaturera, eller på annat sätt skada, många te- rapeutiskt användbara proteiner (Fu et al, Visual Eviden- ce of Acidic Environment Within Degrading Poly(lactic-co- glycolic acid) (PLGA) Microspheres. Pharmaceutical Rese- arch, Vol. 17, No 1, 2000, 100-106). I det fall mikrosfä- rerna har en större diameter kan pH-värdet förväntas sjunka ytterligare pà grund av att de sura nedbrytnings- produkterna dä får svàrare att diffundera bort och att den autokatalytiska reaktionen intensifieras.

Den för närvarande vanligast använda tekniken för inneslutning av vattelösliga substanser, sàsom proteiner och peptider, är användning av multipelemulsionssystem.

Läkemedelssubstansen löses i en vatten- eller buffertlös- ning och blandas därefter med ett med vatten oblandbart organiskt lösningsmedel innehållande den upplöste polyme- ren. En emulsion bildas vilken har vattenfasen som inre :nyn- 10 15 20 25 30 35 , . ,. »o ' " .u n. .H- '__ ,, . n. - : ..- . -- " ,. .- I °' I.. ~ ' , .I f' .- ,, na " _ .o I ... »vu I , ,, n 4 ' , . .-- __ _, ...v- a v ' ' 4 fas. Olika typer av emulgeringsmedel och kraftig ombland- ning utnyttjas ofta för skapande av denna första emul- sion. Denna emulsion överföres sedan, under omrörning, till en annan vätska, vanligtvis vatten, innehållande en annan polymer, t.ex. polyvinylalkohol, vilket ger en vat- ten/olja/vatten-trippelemulsion. Mikrosfärerna bringas därefter att härdna eller härda på något sätt. Det vanli- gaste sättet är att utnyttja ett organiskt lösningsmedel med låg kokpunkt, typiskt diklormetan, och att avdriva lösningsmedlet. Om det organiska lösningsmedlet inte är helt oblandbart med vatten, kan en kontinuerlig extrak- tionsprocedur utnyttjas genom tillsats av mera vatten till trippelemulsionen. Ett antal variationer av denna allmänna procedur beskrivs också i litteraturen. I vissa fall blandas den primära emulsionen med en icke-vatten- baserad fas, t.ex. silikonolja. Fasta läkemedelsmaterial i stället för upplösta sådana kan också användas.

PLGA-mikrosfärer innehållande proteiner beskrivs i WO-A1-9013780, där huvudsärdraget är användning av mycket låga temperaturer under framställningen av mikrosfärerna i syfte att bevara hög biologisk aktivitet hos proteiner- na. Aktiviteten för inkapslat superoxiddismutas uppmättes men enbart på den del som frisattes från partiklarna.

Denna metod har använts för framställning av PLGA- mikrosfärer innehållande humant tillväxthormon i WO-A1- 9412158, varvid man dispergerar humant tillväxthormon i metylenklorid innehållande PLGA, sprayar den erhållna dispersionen i en behållare med frusen etanol med ett skikt av flytande kväve däröver i syfte att frysa de fina dropparna samt låter dessa sedimentera i kvävet på etano- len. Etanolen upptinas därefter och mikrosfärerna börjar sjunka i etanolen, där metylenkloriden extraheras i eta- nolen och mikrosfärerna bringas att hårdna. Med hjälp av denna metodik kan man bibehålla proteinstabiliteten bätt- re än vid flertalet andra processer för inneslutning av proteiner i PLGA-mikrosfärer, och nyligen har också en produkt blivit godkänd av registreringsmyndigheterna i vinna lO 15 20 25 30 35 517 610 5 USA. Det återstår emellertid fortfarande att entydigt på- visa detta också för andra proteiner och problemet med exponering av det inneslutna biologiskt aktiva ämnet för ett mycket lågt pH under nedbrytningen av PLGA-matrisen kvarstår.

Vid de tidigare nämnda metoderna baserade på inkaps- ling med PLGA utsättes dock de aktiva substanserna för ett organiskt lösningsmedel, och detta är allmänt sett skadligt för stabiliteten hos ett protein. Dessutom är de omtalade emulsionsprocesserna komplicerade och sannolikt problematiska vid ett försök till uppskalning till in- dustriell skala. Vidare är många av de organiska lös- ningsmedel som utnyttjas vid många av dessa processer förknippade med miljömässiga problem, och deras höga af- finitet för PLGA-polymeren gör ett avlägsnande svårt.

Ett antal försök att lösa ovan beskrivna problem or- sakade av exponering av det biologiskt aktiva ämnet för en kemiskt sur miljö under bionedbrytningen av mikrosfär- matrisen och organiska lösningsmedel vid tillverknings- processen har beskrivit. För att undvika sur miljö under nedbrytningen har man försökt att byta ut PLGA som matris för mikrosfärerna mot en polymer som ger kemiskt neutrala nedbrytningsprodukter och för att undvika att utsätta det biologiskt aktiva ämnet för organiska lösningsmedel har man försökt att antingen tillverka mikrosfärerna i förväg och först efter upparbetning och torkning försökt ladda dem med det biologiskt aktiva ämnet, eller försökt ute- sluta det organiska lösningsmedlet helt under tillverk- ning av mikrosfärerna.

Exempelvis har höggrenad stärkelse med relativt låg molvikt (maltodextin, medelmolekylvikt ca 5000 Da) modi- fierats kovalent med akrylgrupper för överföring av denna stärkelse i en form som kan solidifieras till mikrosfärer och den erhållna polyakrylstärkelsen har överförts till partikulär form genom radikalpolymerisation i en emulsion med toluen/kloroform (4:l) som ytterfas (Characterization of Polyacryl Starch Microparticles as Carries for Prote- =»»~ø 10 15 20 25 30 35 517 e 1 o šïï* 2fï= 6 ins and Drugs. Artursson et al, J Pharm Sci, 73, 1507- 1513). Proteiner kunde infàngas i dessa mikrosfärer, men tillverkningsbetingelserna utsätter det biologiskt aktiva ämnet för både organiska lösningsmedel och höga skjuvk- rafter vid tillverkningen av emulsionen. De erhållna mik- rosfärerna löses upp enzymatiskt och pH kan förväntas bi- behållas neutralt. De erhållna mikrosfärerna är inte lämpliga för parenteral administration, speciellt uppre- pad sådan, av flera skäl. Allra väsentligast är den ofullständiga och mycket långsamma bionedbrytbarheten av både stärkelsematrisen (Biodegrable Microspheres IV. Fac- tors Affecting the Distribution and Degradation of Poly- acryl Starch Microparticles. Laakso et al, J Pharms Sci, 75, 962-967, 1986) och den syntetiska polymerkedja som tvärbinder stärkelsemolekylerna. Dessutom är dessa mik- rosfärer alltför små, med en diameter <2 pm, för att vara lämpliga för injektion i vävnaderna för förlängd frisätt- ning, då vävnadsmakrofager med lätthet kan fagocytera dem. Försök att höja nedbrytningshastigheten och graden av nedbrytning genom att införa en potentiellt bionedbrytbar estergrupp för att binda akrylgrupperna till den höggrenade stärkelsen ledde inte till avsett re- sultat och även dessa polyakrylstärkelsemikrosfärer bio- nedbröts alltför långsamt och ofullständigt under rimliga tidsperioder (BIODEGRADABLE MICROSPHERES: Some Properties of Polyacryl Starch Microparticles Prepared from Acrylic acid Esterified Starch. Laakso and Sjöholm. 1987 (76) pp 935-939. J Pharm Sci.).

Mikrosfärer av polyakryldextran har tillverkats i tvåfas-vattensystem (Stenekes et al, The Preparation of Dextran Microspheres in an All-Aqueous System: Effect of the Formulation Parameters on Particle Characteristics.

Pharmaceutical Reserach, Vol 15, No 4, 1998, 557-561 and Franssen och Hennink, A novel preperation method for po- lymeric microparticles without using organic solvents, Int J Pharm 168, 1-7, 1998). Med detta tillvägagångssätt undviker man att utsätta det biologiskt aktiva ämnet för 10 15 20 25 30 35 o »nu 00 517 610 7 organiska lösningsmedel men i övrigt får mikrosfärerna egenskaper motsvarande de egenskaper som har beskrivits för polyakrylstärkelsemikrosfärer ovan, vilket gör dem olämpliga för upprepad parenteral administration. Med tanke på att människan inte har specifika dextrannedbry- tande enzymer bör nedbrytningshastigheten vara ännu lägre än för polyakrylstärkelsemikrosfärer. Användning av dex- tran är också förknippad med en viss risk för allvarliga allergiska reaktioner.

Tillverkning av stärkelsemikrosfärer med användning av icke kemiskt modifierad stärkelse med utnyttjande av en olja som ytterfas har beskrivits (US 4,7l3,249; Schrö- der, U., Crystallized carbohydrate spheres for slow rele- ase and targeting. Methods Enzymol. 1985 (112) 116-128; Schröder, U., Crystallized carbohydrate spheres as a slow release matrix for biologically actived substances. Bio- materials 5:100-104, 1984). Mikrosfärerna solidifieras i dessa fall genom utfällning i aceton, vilket leder både till att det biologiskt aktiva ämnet utsätts för ett or- ganiskt lösningsmedel och till att stärkelsens naturliga tendens att solidifieras genom fysikalisk tvärbindning inte utnyttjas under tillverkningsprocessen. Detta leder i sin tur till mikrosfärer med en inneboende instabilitet då stärkelsen efter resuspendering i vatten och vid expo- nering för kroppsvätskorna kommer att sträva efter att bilda sådana tvärbindingar. För att en vatten-i-olja emulsion skall erhållas krävs höga skjuvkrafter och de mikrosfärer som bildas är alltför små för att vara lämp- liga för parenteral förlängd frisättning.

I EP 213303 A2 beskrivs framställning av mikrosfärer av bland annat kemiskt omodifierad stärkelse i tvåfas- vattensystem, med utnyttjande av stärkelsens naturliga förmåga att solidifieras genom bildning av fysikaliska tvärbindningar, och immobilisering av en substans i dessa mikrosfärer i syfte att undvika att exponera den biolo- giskt aktiva ämnet för organiska lösningsmedel. Den be- skrivna metodiken, i kombination med den stärkelsekvalité nun- 0 »vpøu lO 15 20 25 30 35 u uno I' 517 610 8 som definieras, ger inte upphov till fullständigt bioned- brytbara partiklar. De erhållna partiklarna är inte hel- ler lämpliga för injektion, framför allt för upprepade injektioner under längre tid, då den beskrivna stärkelse- kvalitén innehåller alltför höga mängder av främmande växtprotein. I motsats till vad som lärs ut av detta pa- tent har det nu också överraskande upptäckts att betyd- ligt bättre utbyte och högre laddning av den biologiskt aktiva molekylen kan erhållas om man använder betydligt högre koncentrationer av polymererna än vad som krävs för att bilda tvåfas-vattensystemet och detta leder också till fördelar vad gäller betingelserna för att erhålla stabila, icke aggregerade, mikrosfärer och deras stor- leksfördelning. De temperaturbehandlingar som beskrivs är inte användbara för känsliga makromolekyler och detsamma gäller upparbetningen som innefattar torkning med anting- en etanol eller aceton.

Alternativa metoder för att i tvåfas-vattensystem tillverka mikrosfärer har beskrivits. I US 5 981 719 tillverkas mikropartiklar genom blandning av den biolo- giskt aktiva makromolekylen med en polymer vid ett pH nära den isoelektriska punkten för makromolekylen och stabilisering av mikrosfärerna genom tillförsel av ener- gi, företrädelsevis värme. Den lägsta andelen av makromo- lekyl, d.v.s. det biologiskt aktiva ämnet, i beredningen är 40% och detta är för de flesta applikationer för högt och leder till stor osäkerhet i den injicerade mängden aktiv substans då dosen av mikropartiklarna blir alltför låg. Även om tillverkningsmetoden beskrivs som mild och kapabel att bibehålla den biologiska aktiviteten av det infångade biologiskt aktiva ämnet, stabiliseras mikropar- tiklarna genom värmning och i de angivna exemplen sker uppvärmning till minst 58°C i 30 min och i många fall till 70-90°C under motsvarande tid, vilket känsliga pro- teiner, vars biologiska aktivitet är beroende av en tre- dimensionell struktur, inte kan förväntas tåla, och även i de fall proteinet skenbart har tålt tillverkningspro- »lasa v. 10 15 20 25 30 35 5 17 6 10 9 cessen föreligger en risk för små, men ändock icke för- sumbara, förändringar i proteinets konformation. Som yt- terfas används alltid en kombination av två polymerer, oftast polyvinylpyrrolidon och PEG, vilket komplicerar tillverkningsförfarandet genom att båda dessa substanser ska tvättas bort från mikrosfärerna på ett reproducerbart och säkert sätt. De bildade mikropartiklarna är för små (i exemplen anges värden under 0,1 um i diameter) för att vara lämpliga för parenteral förlängd frisättning efter t.ex. subkutan injektion, då makrofager, som är celler specialiserade på att fagocytera partiklar och som finns i vävnaderna, med lätthet förmår att fagocytera mikrosfä- rer upp till 5-10, möjligen 20 um, och de fagocyterade partiklarna lokaliseras intracellulärt i lysosomerna, där både partiklarna och den biologiskt aktiva substansen bryts ned, varvid den terapeutiska effekten går förlorad.

Den mycket ringa partikelstorleken gör också upparbet- ningen av mikrosfärerna mer komplicerad, då önskvärda me- toder, såsom filtrering, inte kan användas. Motsvarande gäller för US 5 849 884.

I US 5 578 509 och EP 0 688 429 Bl beskrivs använd- ning av tvåfas-vattensystem för tillverkning av makromo- lekylära mikropartikellösningar och kemisk eller termisk tvärbindning av de dehydrerade makromolekylerna till bildning av mikropartiklar. Det är i högsta grad icke önskvärt att kemiskt tvärbinda den biologiskt aktiva mak- romolekylen, vare sig med sig själv eller med mikroparti- kelmatrisen, eftersom sådana kemiska modifieringar har flera allvarliga nackdelar, såsom reduktion av bioaktivi- teten av ett känsligt protein och risk för inducering av ett immunsvar mot de nya antigena determinanterna på pro- teinet, vilket leder till ett behov av omfattande toxiko- logiska studier för att undersöka produktens säkerhet.

Mikropartiklar som tillverkats genom kemisk tvärbindning med glutaraldehyd är kända sedan tidigare och anses all- mänt olämpliga för upprepad administration parenteralt på människa. De mikropartiklar som beskrivs i US 5 578 509 ,.|:» 10 15 20 25 30 35 517 610 10 lider generellt av samma nackdelar som beskrivits för US 5 981 719, med olämpliga tillverkningsbetingelser för känsliga proteiner, antingen genom att dessa utsätts för kemisk modifiering eller för skadliga temperaturer, och en mikropartikelstorleksfördelning som är för snäv för parenteral, förlängd frisättning och som komplicerar upp- arbetning av mikrosfärerna efter tillverkning.

I WO 97/14408 beskrivs användning av luftsuspen- sionsteknik för framställning av mikropartiklar för för- längd frisättning efter parenteral administration utan att det biologiskt aktiva ämnet exponeras för organiska lösningsmedel. Skriften ger emellertid ingen vägledning mot förfarandet enligt uppfinningen eller mot de nya mik- ropartiklar som kan erhållas därigenom.

I US 5 470 582 framställs en mikrosfär bestående av PLGA och innehållande en makromolekyl genom ett tvåstegs- förfarande, där själva mikrosfären tillverkas först med utnyttjande av organiska lösningsmedel och laddas med makromolekylen i ett senare steg, där det organiska lös- ningsmedlet redan har avlägsnats. Detta förfaringssätt leder till alltför làgt innehåll av det biologiskt aktiva ämnet, oftast 1-2%, och till att en mycket stor andel frisätts omedelbart efter injektion, vilket oftast är synnerligen olämpligt. Denna alltför snabba initiala fri- sättning är mycket hög redan vid en laddning av 1% och blir än mer uttalad vid högre innehåll av den aktiva sub- stansen i mikrosfärerna. Vid nedbrytningen av PLGA-matri- sen sjunker pH till nivåer som oftast inte är acceptabla för känsliga makromolekyler.

Att stärkelse teoretiskt är ett mycket lämpligt, kanske till och med idealiskt, matrismaterial för mikro- partiklar har varit känt under lång tid eftersom stärkel- se inte behöver lösas i organiska lösningsmedel och har en naturlig tendens att solidifiera och eftersom det finns kroppsegna enzymer som kan bryta ned stärkelse till kroppsegna och neutrala ämnen, i slutänden glukos, samt att stärkelse, förmodligen på grund av likheten med uu:- _ n v u wow. av, u... I :~||| 10 15 20 25 30 35 517 610 ll kroppseget glykogen, har visats vara icke immunogent.

Trots stora ansträngningar har emellertid stärkelse med egenskaper som möjliggör tillverkning av mikropartiklar lämpliga för parenteral användning och betingelser som möjliggör tillverkning av fullständigt bionedbrytbara mikropartiklar under milda betingelser som tillåter in- fångning av känsliga biologiskt aktiva substanser, såsom proteiner, ej beskrivits tidigare.

Stärkelsegranuler innehåller naturligt föroreningar, såsom stärkelseproteiner, vilket gör dem olämpliga för injektion parenteralt. Vid oavsiktlig deponering av icke tillräckligt renad stärkelse, såsom kan ske vid operatio- ner då många typer av operationshandskar är pudrade med stabiliserade stärkelsegranuler, kan mycket allvarliga biverkningar uppkomma. Stärkelsegranuler i sig är inte heller lämpliga för upprepad parenteral administration av det skälet att de inte är fullständigt bionedbrytbara inom acceptabla tidsrymder.

Stärkelsemikrosfärer tillverkade av syrahydrolyserad och upprenad stärkelse har använts för parenteral admi- nistration på människa. Mikrosfärerna tillverkades genom kemisk tvärbindning med epiklorhydrin under starkt alka- liska betingelser. Den kemiska modifiering som då erhölls av stärkelsen leder till en sänkning av bionedbrytbarhe- ten så att mikrosfärerna kan lösas upp fullständigt av kroppsegna enzymer, såsom a-amylas, men inte omvandlas fullständigt till glukos som slutprodukt. Varken till- verkningsmetoden eller de erhållna mikrosfärerna är lämp- liga för immobilisering av känsliga proteiner och såsom framgår av kontrollförsöken är inte heller syrahydrolyse- rad stärkelse lämplig för framställning av vare sig full- ständigt biodegraderbara stärkelsemikrosfärer eller stär- kelsemikrosfärer innehållande en hög laddning av ett bio- logiskt aktivt ämne, såsom ett protein.

Hydroxietylstärkelse (HES) administreras parenteralt i höga doser till människa som en plasmaersättare. HES framställs genom att stärkelsegranuler från stärkelse be- 10 15 20 25 30 35 517 610 12 stående i stort uteslutande av höggrenat amylopektin, s.k. rolyseras för en minskning av molviktsfördelningen, och ”waxy maize”, eller vaxartad majsstärkelse, syrahyd- därefter hydroxietyleras under alkaliska betingelser samt syrahydrolyseras ytterligare en gång för att en medelmol- vikt kring 200 000 Da skall uppnås. Därefter utföres fil- trering, extraktion med aceton och spraytorkning. Hydrox- ietyleringens syfte är att förlänga effektens varaktig- het, då icke modifierat amylopektin bryts ned mycket snabbt av a-amylas och dess uppehàllstid i cirkulation är ca 10 minuter. HES är inte lämplig för framställning av fullständigt biodnedbrytbara mikrosfärer innehållande ett biologiskt aktivt ämne, eftersom den kemiska modifiering- en leder till en avsevärd sänkning i hastigheten för och fullständigheten i bionedbrytningen och till att stärkel- sens naturliga tendens att solidifieras genom bildande av icke kovalenta tvärbindningar eliminerats. Dessutom blir högkoncentrerade lösningar av HES alltför viskösa för att vara användbara för framställning av mikropartiklar. An- vändningen av HES i dessa höga doser visar att parente- ralt användbar stärkelse kan tillverkas, även om HES inte är användbar för tillverkning av mikrosfärer utan kemisk tvärbindning eller utfällning med organiska lösningsme- del.

I WO 99/00425 beskrivs användning av värmetàliga proteolytiska enzymer med brett pH-optimum för att rena stärkelsegranuler från ytassocierade proteiner. De er- hållna granulerna är inte lämpliga för parenteral admi- nistration då de fortfarande innehåller de stärkelsepro- teiner som finns inuti granulerna och det finns risk för att rester av de tillsatta proteolytiska enzymerna finns kvar i granulerna. Granulerna är inte heller lämpliga för tillverkning av parenteralt administrerbara stärkelsemik- rosfärer i tvàfas-vattensystem, då de har fel molvikts- fördelning för att kunna användas i tillräckligt hög kon- centration, även efter upplösning, och i de fall mikro- 10 15 20 25 30 35 517 610 13 sfärer kan erhållas är de troligtvis inte fullständigt biodnedbrytbara.

Användning av skjuvning för att modifiera molvikts- i syfte att få fram bättre stärkelse för framställning av tabletter, beskrivs i US fördelningen av stärkelse, 5,455,342. Den stärkelse som erhålls är inte lämplig för parenteral administration på grund av det höga innehållet av stärkelseproteiner, som eventuellt kan föreligga i de- naturerad form efter skjuvningen, och den erhållna stär- kelsen är inte heller lämplig för framställning av bio- nedbrytbara stärkelsemikrosfärer för parenteral administ- ration eller för användning i tvåfas-vattensystem för framställning av dylika stärkelsemikrosfärer.

Ett förfarande för framställning av parenteralt ad- ministrerbara stärkelseberedningar med följande egenska- per skulle sålunda vara synnerligen önskvärt: 0 ett förfarande som gör det möjligt att infånga känsli- ga biologiskt aktiva ämnen i mikropartiklar med bibe- hållande av deras biologiska aktivitet; 0 ett förfarande medelst vilket man kan infånga biolo- giskt aktiva substanser under betingelser som inte ut- sätter dessa för organiska lösningsmedel, höga tempe- raturer eller höga skjuvkrafter och som medger att dessa bibehåller sin biologiska aktivitet; 0 ett förfarande som möjliggör hög laddning av en paren- teralt administrerbar beredning med även känsliga bio- logiskt aktiva substanser; 0 ett förfarande medelst vilket man kan framställa en i huvudsak fullständigt bionedbrytbar och biokompatibel beredning som är lämplig att injicera parenteralt och vid vars nedbrytning kemiskt neutrala kroppsegna ämnen bildas; 0 ett förfarande medelst vilket man kan framställa en parenteralt injicerbar beredning med en storlek över- stigande 2O pm och ännu hellre överstigande 30 um i syfte att undvika fagocytos av vävnadsmakrofager och 10 15 20 25 30 35 14 förenkla upparbetningen av densamma under tillverk- ningen; I ett förfarande för framställning av mikropartiklar in- nehållande en biologiskt aktiv substans, vilka kan an- vändas som mellanprodukt vid framställning av en be- redning för reglerad, förlängd eller fördröjd frisätt- ning och möjliggör rigorös kvalitetskontroll av det infångade biologiska ämnets kemiska stabilitet och bi- ologiska aktivitet; 0 ett förfarande som utnyttjas en parenteralt acceptabel stärkelse som är lämplig för framställning av i huvud- sak fullständigt bionedbrytbarbara stärkelsemikropar- tiklar; 0 en i huvudsak fullständigt bionedbrytbar och biokompa- tibel mikropartikulär beredning som är lämplig att in- jicera parenteralt och vid vars nedbrytning kemiskt neutrala kroppsegna ämnen bildas; 0 en mikropartikulär beredning innehållande en biolo- giskt aktiv substans och med en partikelstorleksför- delning som är lämplig för att drageras med hjälp av luftsuspensionsteknik och tillräcklig mekanisk håll- fasthet för detta ändamål; 0 en dragerad mikropartikulär beredning innehållande en biologiskt aktiv substans, vilken beredning ger en kontrollerad frisättning efter parenteral administra- tion; Sådana och andra syften uppnås medelst den nedan defi- nierade uppfinningen.

BESKRIVNING AV UPPFINNINGEN Föreliggande uppfinning hänför sig till en ny mikro- partikelberedning. Närmare bestämt är det fråga om en mikropartikelberedning, som är bionedbrytbar, som inne- håller en biologiskt aktiv substans och som är avsedd för parenteral administration av denna substans till ett däggdjur, speciellt människa. I första hand avser nämnda lO 15 20 25 30 35 517 6 1 0 ¿::= 15 parenterala administration att mikropartiklarna är avsed- da för injektion.

Eftersom mikropartiklarna i första hand är avsedda för injektion, är det företrädesvis fråga om framställ- ning av partiklar med en medeldiameter inom intervallet 10-200 pm, vanligtvis 20-100 pm och speciellt 20-80 pm.

Uttrycket "mikropartiklar" används i samband med uppfin- ningen som generell benämning för partiklar av viss stor- lek i enlighet med i och för sig känd teknik. En typ av mikropartiklar är sålunda mikrosfärer, vilka har i huvud- sak sfärisk form, under det att begreppet mikropartikel generellt kan innefatta avvikelse från sådan ideal sfä- risk form. Även det i och för sig kända begreppet mikro- kapsel faller inom uttrycket mikropartikel i enlighet med känd teknik.

Enligt en aspekt av föreliggande uppfinning tillhan- dahåller denna en parenteralt administrerbar, bionedbryt- bar mikropartikelberedning innehållande en biologiskt ak- tiv substans, vilken under de första 24 timmarna efter injektion uppvisar en frisättning av den aktiva subsansen som är mindre än 30% av den totala frisättningen, bestämt ur en koncentration-tid-kurva i form av förhållandet mel- lan area under kurvan under nämnda första 24 timmar och total area under ifrågavarande kurva.

Företrädesvis gäller att frisättningen under de för- sta 24 timmarna efter injektionen är mindre än 20%, före- trädesvis mindre än 15%, ännu hellre mindre än 10% och allra helst mindre än 5%, av den totala frisättningen.

Enligt en annan aspekt av föreliggande uppfinning tillhandahåller denna en mikropartikelberedning av ovan nämnda typ, vilken under de första 48 timmarna efter in- jektion uppvisar en frisättning av den aktiva subsansen där den maximala koncentrationen i plasma eller serum är mindre än 300% av den maximala koncentrationen av den bi- ologiskt aktiva substansen under någon tidpunkt översti- gande 48 timmar efter injektion.

Anno» 10 15 20 25 30 35 5 17 6 1 0 gi: 16 Nämnda maximala koncentration är företrädesvis mind- re än 200% och ännu hellre mindre än 100% av ifrågavaran- de maximala koncentration.

Ytterligare en aspekt av uppfinningen representeras av en mikropartikelberedning av ovan nämnt slag, vilken uppvisar en frisättning av den biologiskt aktiva substan- sen där biotillgängligheten av nämnda substans är minst 35% av den biotillgänglighet som erhålles när ifrågava- rande substans injiceras intravenöst i löslig form.

Nämnda biotillgänglighet är företrädesvis minst 45%, ännu hellre minst 50%, av den biotillgänglighet som er- hàlles när den biologiskt aktiva substansen injiceras intravenöst.

En annan aspekt av föreliggande uppfinning represen- teras av en mikropartikelberedning av nämnt slag, vilken uppvisar en frisättning av den aktiva substansen karakte- riserad av att i den frisättning som sker under vilken som helst sammanhängande sjudagarsperiod är kvoten mellan den högsta koncentrationen av den biologiskt aktiva sub- stansen i serum eller plasma dividerat med medelkoncent- rationen under nämnda sjudagarsperiod mindre än 5, förut- satt att den valda sjudagarsperioden inte inkluderar de första 24 timmarna efter injektion.

Nämnda frisättning är företrädesvis mindre än 4 gånger, ännu hellre mindre än 3 gånger och allra helst mindre än 2 gånger.

Uppfinningen tillhandahåller enligt ännu en aspekt en mikropartikelberedning av angivet slag, vilken uppvi- sar en frisättning av den biologiskt aktiva substansen där medeluppehàllstiden för ifrågavarande substans är minst 4 dagar.

Företrädesvis är nämnda medeluppehàllstid minst 7 dagar, ännu hellre minst 9 dagar, t.ex. minst 11 dagar eller speciellt minst 13 dagar.

De särdrag som har angivits för de ovan presenterade aspekterna av uppfinningen kan kombineras i vilka som helst lämpliga kombinationer. 1:--- 10 15 20 25 30 35 17 För vilken eller vilka som helst av dessa aspekter av uppfinningen gäller företrädesvis att den biologiskt aktiva substansen är ett protein, en peptid eller en po- lynukleotid. Allra helst är det fråga om ett protein, t.ex. ett rekombinant framställt protein.

Intressanta grupper av ifrågavarande substanser är hormon, speciellt humant tillväxthormon, eller en till- växtfaktor.

Mera specifikt gäller att enligt en föredragen utfö- ringsform av uppfinningen beredningen innehåller en sub- stans vald bland tillväxthormon, insulin, erytropoietin, interferon a, interferon ß, interferon y, Faktor VII, Faktor VIII, glukagonliknande peptid l eller 2 och C- peptid.

För de olika karakteristika som har angivits för mikropartikelberedningen enligt uppfinningen gäller mera specifikt att det primärt rör sig om begreppen MRT, burst och biotillgänglighet.

Dessa kan definieras enligt följande MRT Ett màl med beredningar för kontrollerad frisättning är att få en förlängd frisättning av det aktiva materia- let. Ett mått man kan använda för att kvantifiera fri- sättningstiden är medeluppehàllstid eller ”mean resi- dence time” (MRT) som är det vedertagna begreppet inom farmakokinetik.

MRT är genomsnittstiden som molekylerna som intro- ducerats i kroppen uppehåller sig i kroppen. (Clinical Pharmacokinetics. Concepts and Applications. Malcolm Rowland and Thomas N. Tozer. 2“d ed. Lea&Febiger, Phila- delphia London) MRT-värdet kan beräknas från plasmakoncentrationsdata genom följande formel. .frun 10 15 20 25 30 517 610 -a saw 18 00 J :Cdr MRT = ° OO j Cd: o där C är plasmakoncentrationen och t är tiden Bëšâš Ett vanligt problem med beredningar för kontrollerad frisättning för parenteralt bruk är att det omedelbart efter administrering i kroppen frisätts en stor del av läkemedlet under tidig fas. Detta kallas inom facklitte- raturen för ”burst-effect” Detta beror oftast pà att lä- kemedlet befinner sig på ytan av formuleringen eller att formuleringen(som kan bestå av mikropartiklar) spricker upp. En låg bursteffekt är mycket önskvärd eftersom en hög koncentration av läkemedlet kan vara toxisk och dess- utom utnyttjas den del som försvinner snabbt första ti- den dåligt, vilket innebär att mer läkemedel krävs för att upprätthålla en terapeutiskt nivå av läkemedlet under den avsedda behandlingstiden.

Burst definieras som den andel av läkemedlet som ab- sorberas under de första 24 timmarna av den totala ande- len som absorberas.

Matematiskt kan man definiera det med hjälp av ”area under kurva”-beräkningar från plasmakoncentrationskurvor. 24h j Cd: Burst = 0 0 100% w I Cd: o Biotillgänglighet Biotillgänglighet är ett mått på hur stor del av det tillförda läkemedlet som absorberas från administrations- stället till blodet i aktiv form. Biotillgänglighet jäm- förs ofta med data från intravenös tillförsel av läkemed- vann; lO 15 20 25 30 35 517 610 19 let, där man således inte har några absorptionsbarriärer, och kallas då för absolut biotillgänglighet, Absolut biotillgänglighet definieras enligt följande formel: __A(Å:x-[hv _kDx-AÉKQV där AUC xär area-under-kurvan värdet för den undersökta formuleringen, AUCiv är area-under-kurvan värdet för en intravenös tillförsel av läkemedlet, DX är dosen av läke- medlet i formuleringen och Dh är den intravenösa dosen.

Bestämningen av frisättningsprofilen och de farmako- kinetiska parametrarna görs företrädesvis genom djurför- sök. Den mest relevanta arten, pà grund av sin likhet med människa, är gris. I de fall den biologiskt aktiva sub- stansen kan inducera ett immunsvar under testet som ris- kerar att påverka bestämningen av de farmakokinetiska pa- rametrarna för den biologiskt aktiva substansen bör häm- ning av immunsvaret användas, t.ex. genom läkemedelsbe- handling, vilket är känt inom teknikomrádet, och detaljer kan hämtas ur den vetenskapliga litteraturen, till exem- pel Agersö et al, (J.Pharmacol Toxicol 41 (1999) 1-8) Mikropartikelberedningen enligt uppfinningen kan framställas medelst ett förfarande, som innefattar att man a) bereder en vattenbaserad stärkelselösning innefat- tande stärkelse, som har ett innehåll av amylopektin överstigande 85 vikt-%, där molekylvikten för nämnda amy- lopektin är reducerad, företrädesvis genom skjuvning, så att minst 80 vikt-% av materialet ligger inom intervallet 10-10000 kDa, och som har ett aminosyrakväveinnehàll un- derstigande 50 pg per g torrvikt stärkelse, varvid lös- ningens stärkelsekoncentration är minst 20 vikt-%, b) förenar den bilogiskt aktiva substansen med stärkel- selösningen under sådana betingelser att det bildas en komposition i form av en lösning, emulsion eller suspen- sion av nämnda substans i stärkelselösningen, ~w|zn 10 15 20 25 30 35 5 17 6 1 0 gi: 20 c) blandar den i steg b) erhållna kompositionen med en vattenbaserad lösning av en polymer med förmåga att bilda ett tvàfas-vattensystem, så att det bildas en emulsion av stärkelsedroppar, vilka innehåller den biologiskt aktiva substansen, som inre fas i en yttre fas av nämnda poly- merlösning, där stärkelsedropparna lämpligen har den för mikropartiklarna önskade storleken d) bringar de i steg c) erhållna stärkelsedropparna att gela till stärkelsepartiklar via stärkelsens naturliga förmåga att solidifieras, e) torkar stärkelsepartiklarna, och f) eventuellt applicerar ett frisättningsreglerande hölje av en biokompatibel och bionedbrytbar polymer, fö- reträdesvis genom luftsuspensionsteknik, på de torkade stärkelsepartiklarna.

En viktig aspekt i samband med detta förfarande är med andra ord att man som mikropartikelmatris utnyttjar stärkelse av ett visst slag. En stärkelse som är speci- ellt lämplig, liksom ett förfarande för framställning av denna, finns noggrant beskriven i den svenska patentan- sökning som har samma inlämningsdag som föreliggande pa- tentansökan och som har titeln Farmaceutisk acceptabel stärkelse. Detaljer avseende denna kan med andra ord häm- tas från nämnda svenska patentansökan, vars innehåll i detta avseende sàlund härmed upptas i föreliggande text via referens.

De viktigaste särdragen för sådan stärkelse kommer emellertid att beskrivas nedan. För att fullständigt bionedbrytbara mikropartiklar med högt utbyte av den ak- tiva substansen skall bildas i ett tvàfas-vattensystem och för att de erhållna stärkelsemikropartiklarna skall uppvisa de egenskaper som kommer att beskrivas nedan mås- te stärkelsen generellt till övervägande del bestå av höggrenad stärkelse, som i det naturliga tillståndet i stärkelsegranulen benämns amylopektin. Den skall dessutom ha en molekylviktsfördelning som gör det möjligt att upp- nå önskade koncentrationer och gelningshastigheter. annan 10 15 20 25 30 35 21 I detta sammanhang kan det tilläggas att begreppet bionedbrytbar innebär att mikropartiklarna efter parente- ral administration löses upp i kroppen till kroppsegna substanser, i slutänden glukos. Bionedbrytbarheten kan bestämmas eller undersökas genom inkubation med lämpligt enzym, t.ex. alfa-amylas, in vitro. Det är härvid lämp- ligt att tillsätta enzymet ett flertal gånger under inku- bationsperioden, så att man därigenom försäkrar sig om att det finns aktivt enzym närvarande i inkubationsbland- ningen hela tiden. Bionedbrytbarheten kan även undersökas genom parenteral injicering av mikropartiklarna, t.ex. subkutant eller intramuskulärt, och histologisk undersök- ning av vävnaden som en funktion av tiden. Bionedbrytbara stärkelsemikropartiklar försvinner normalt från vävnaden inom några veckor och oftast inom en vecka. I de fall då stärkelsemikropartiklarna är överdragna med ett frisätt- ningsreglerande hölje, t.ex. dragerade, är det oftast detta hölje som avgör hastigheten för bionedbrytbarheten, vilken i sin tur avgör när alfa-amylas blir tillgängligt för stärkelsematrisen.

Biokompatibiliteten kan också undersökas genom pa- renteral administration av mikropartiklarna, t.ex. subku- tant eller intramuskulärt, och histologisk utvärdering av vävnaden, varvid det är viktigt att beakta att den biolo- giskt aktiva substansen, som ofta är ett protein, i sig uppvisar förmåga att inducera t.ex. ett immunförsvar i det fall den administreras i en annan art. Exempelvis kan sålunda många rekombinant framställda mänskliga proteiner ge upphov till immunsvar i försöksdjur.

Stärkelsen måste vidare ha en renhet som är accepta- bel för tillverkning av en parenteralt administrerbar be- redning. Den måste även kunna bilda tillräckligt stabila lösningar vid tillräckligt hög koncentration för att möj- liggöra inblandning av den biologiskt aktiva substansen under betingelser som medger att substansens bioaktivitet bibehålls, samtidigt som den spontant måste kunna solidi- fiera på ett kontrollerat sätt för att stabila, men sam- s. v ~ u.. 10 15 20 25 30 35 517 610 22 tidigt bionedbrytbara, mikropartiklar skall erhållas. Hög koncentration är också viktig för att förhindra att den biologiskt aktiva substansen fördelas ut i oacceptabel utsträckning till den yttre fasen eller till gränsytan mellan den inre och den yttre fasen.

Ett antal olika utföringsformer med avseende på stärkelsens karaktär är följande.

Stärkelsen har företrädesvis en renhet av högst 20 pg, ännu hellre högst 10 pg och allra helst högst 5 pg, aminosyrakväve per g torrvikt stärkelse.

Molekylvikten för ovannämnda amylopektin år företrä- desvis reducerad så att minst 80 vikt-% av materialet ligger inom intervallet 100-4000 kDa, ännu hellre 200- 1000 kDa och allra helst 300-600 kDa.

Stärkelsen har vidare företrädesvis ett innehåll av amylopektin med ifrågavarande reducerade molekylvikt överstigande 95 vikt-%, ännu hellre överstigande 98 vikt- %. Den kan dessutom naturligtvis till 100 vikt-% bestå av sådan amylopektin.

Enligt en annan variant är stärkelsen av sådan art att den kan lösas i vatten i en koncentration överstigan- de 25 vikt-%. Detta innebär generellt förmåga att lösa sig i vatten i enlighet med i och för sig känd teknik, dvs vanligtvis upplösning vid förhöjd temperatur, exem- pelvis upp till approximativt 80°C.

Enligt ytterligare en variant gäller att stärkelsen saknar kovalent bundna extra kemiska grupper av det slag som förekommer i hydroxietylstärkelse. Med detta menas generellt att stärkelsen enbart innehåller sådana grupper som finns i naturlig stärkelse och inte har modifierats pà annat sätt, såsom i exempelvis hydroxietylstärkelse.

En annan variant innebär att stärkelsen har ett en- dotoxininnehåll understigande 25 EU/g.

Ytterligare en variant innebär att stärkelsen inne- håller mindre än 100 mikroorganismer per gram, ofta t o m mindre än 10 mikroorganismer per gram. ||»»u 10 15 20 25 30 35 517 e, 1 n 23 Stärkelsen kan vidare definieras som att den är re- nad fràn ytlokaliserade proteiner, lipider och endotoxi- ner medelst tvättning med vattenbaserad alkalilösning, molekylviktsreducerad medelst skjuvning samt renad från invändiga proteiner medelst jonbyteskromatografi, före- trädesvis anjonbyteskromatografi.

Att amylopektin utgör huvudbestàndsdelen i den an- vända stärkelsen innebär generellt att dess andel är 60- 100 vikt-%, räknat på torrvikt stärkelse.

I vissa fall kan det härvid vara gynnsamt att använ- da en mindre andel, t.ex. 2-15 vikt-%, kortkedjig amylos för modifiering av gelningshastigheten i steg d). Medel- molekylvikten för nämnda amylos ligger företrädesvis inom intervallet 2,5-70 kDa, speciellt 5-45 kDa. Övriga detal- jer beträffande kortkedjig amylos kan hämtas från US pa- tentskrift 3,881,99l.

Vid bildandet av stärkelselösningen i steg a) an- vänds generellt uppvärmning enligt i och för sig känd teknik för upplösning av stärkelsen. En speciellt före- dragen variant innebär härvid samtidigt att man löser upp stärkelsen under autoklavering, varvid den också företrä- desvis steriliseras. Denna autoklavering genomförs i vat- tenhaltiga lösningar, t.ex. vatten för injektion eller lämplig buffert.

Om den biologiskt aktiva substansen är ett känsligt protein eller annan temperaturkänslig substans, får stär- kelselösningen svalna till lämplig temperatur innan den förenas med substansen ifråga. Vilken temperatur som är lämplig avgörs i första hand av värmestabiliteten för den biologiskt aktiva substansen, men rent generellt gäller att en temperatur understigande ca 60°C, ännu hellre un- derstigande 55°C, är lämplig.

Enligt ett alternativ förenar man därför den aktiva substansen med stärkelselösningen vid en temperatur av högst 60°C, ännu hellre högst 55°C, och företrädesvis inom intervallet 20-45°C, speciellt 30-37°C. ;|.-u 10 15 20 25 30 35 517 610 24 För blandningsoperationen i steg b) gäller vidare att man lämpligen använder sig av ett viktförhàllande stärkelsezbiologiskt aktiv substans inom området fràn 3:1 till lOO:1.

För blandningsoperationen gäller dessutom att den aktiva substansen blandas med stärkelselösningen innan man i steg c) bildar ett tvàfas-vattensystem. Den aktiva substansen kan dà befinna sig i löst form, t.ex. i en buffertlösning, eller i fast, amorf eller kristallin, form och vid lämplig temperatur, som oftast ligger mellan rumstemperatur (20°C) och 45°C, företrädesvis högst 37°C.

Det är möjligt att sätta stärkelselösningen till den bio- logiskt aktiva substansen eller vice versa. Dà de biolo- giskt aktiva substanser som är lämpliga att använda i detta system, t.ex. proteiner, vanligtvis är makromoleky- ler, kan det vid blandning av även en lösning av en upp- löst makromolekyl med stärkelse exempelvis bildas en emulsion, där makromolekylen oftast representerar den inre fasen, eller en fällning. Detta är fullt accepta- belt, förutsatt att den biologiskt aktiva substansen bi- behåller eller inte nämnvärt förlorar sin bioaktivitet.

Därefter skapas en homogen lösning, emulsion eller sus- pension, genom omrörning, som kan ske medelst lämplig teknik. Sådan teknik är välkänd inom omrädet, varvid som exempel kan nämnas magnetomrörning, propelleromrörning eller användning av en eller flera statiska mixrar. En speciellt föredragen utföringsform av uppfinningen repre- senteras i detta fall av användning av minst en statisk mixer.

Vid framställningen av stärkelsemikropartiklarna skall koncentrationen av stärkelse i den lösning som skall överföras till fast form, och i vilken den biolo- giskt aktiva substansen skall införlivas, sålunda vara minst 20 vikt-% för att stärkelsemikropartiklar med rätt egenskaper skall bildas. Exakt vilken stärkelsekoncentra- tion som fungerar bäst i varje enskilt fall kan pä ett enkelt sätt titreras ut för varje enskild biologiskt ak- 10 15 20 25 30 35 517 610 25 tiv substans vid den laddning i mikropariklarna som öns- kas i det enskilda fallet. Det bör i detta sammanhang ob- serveras, att den biologiskt aktiva substans som skall införlivas i mikropartiklarna kan påverka tvàfas-systemet och stärkelsens gelningsegenskaper, vilket likaså innebär att sedvanliga för-försök utförs i syfte att bestämma de optimala betingelserna i det enskilda fallet. Oftast vi- sar försök att stärkelsekoncentrationen med fördel bör vara minst 30 vikt-% och i vissa speciella fall minst 40 vikt-%. speciellt högst 45 vikt-%.

Som högsta gräns gäller vanligtvis 50 vikt-%, Det är normalt inte möjligt att erhålla dessa höga stärkelsekoncentrationer utan an- vändning av molekylviktsreducerad, höggrenad stärkelse.

Beträffande den polymer som använts i steg c) i syf- te att bilda ett tvåfas-vattensystem gäller att det inom just detta teknikområde finns publicerad information om ett stort antal polymerer med förmåga att bilda tvåfas- system med stärkelse som inre fas. Alla sådana polymerer får anses användbara i föreliggande sammanhang. En speci- ellt lämplig polymer är dock polyetylenglykol. Företrä- desvis uppvisar denna polyetylenglykol en medelmolekyl- vikt av 5-35 kDa, ännu hellre 15-25 kDa och speciellt ca 20 kDa.

Polymeren löses upp i lämplig koncentration i vat- ten- eller vattenbaserad lösning, vilket uttryck även in- nefattar buffertlösning, och tempereras till lämplig tem- peratur. Denna temperatur ligger företrädesvis inom in- tervallet 4-50°C, ännu hellre 10-40°C och oftast 10-37°C.

Koncentrationen av polymeren i den vattenbaserade lös- ningen är lämpligen minst 20 vikt-% och företrädesvis minst 30 vikt-%, och lämpligen högst 45 vikt-%. Ett spe- ciellt föredraget intervall är 30-40 vikt-%.

Blandningsoperationen i steg c) kan utföras på många olika sätt, t.ex. genom användning av propelleromrörning eller minst en statisk mixer. Blandningen utföres normalt inom temperaturområdet 4-50°C, företrädesvis 20-40°C, ofta ca 37°C. Vid ett satsvis förfarande kan stärkelselösning- 10 15 20 25 30 35 517 610 26 en sättas till polymerlösningen eller vice versa. I det fall statiska mixrar eller blandare utnyttjas, utföres operationen lämpligen därigenom att de bäda lösningarna pumpas i tvà separata rörledningar in i en gemensam rör- ledning som innehåller blandarna.

Emulsionen kan bildas under användning av làga skjuvkrafter, då det inte föreligger någon hög ytspänning till skillnad fràn olja/vatten- eller vatten/olja-emulsioner, och dä mellan faserna i vatten/vatten-emulsioner, det primärt är stärkelselösningens viskositet som skall övervinnas för att dropparna skall uppnå viss storleks- I de flesta fall är det tillräckligt med mag- t.ex. då den mängd mikropartiklar som skall framställas överstiger fördelning. net- eller propelleromrörning. I större skala, 50 g, är det lämpligt att använda s.k. bafflar för erhål- lande av en ännu effektivare omrörning i den använda be- hàllaren. Ett alternativt sätt för att bilda vat- ten/vatten-emulsionen är användning av minst en statisk mixer, varvid stärkelselösningen lämpligen pumpas med re- glerad hastighet i ett rör, vari de statiska mixrarna har placerats. Pumpningen kan ske med vilken lämplig pump som helst, förutsatt att den ger jämn flödeshastighet under dessa betingelser, inte utsätter blandningen för onödigt höga skjuvkrafter och är acceptabel för tillverkning av parenterala beredningar vad avser renhet och frånvaro av läckage av oönskade substanser. Även i de fall dä statis- ka mixrar används för skapande av emulsionen är det of- tast fördelaktigt att låta solidifieringen till mikropar- tiklar ske i ett kärl med lämplig omrörning.

En föredragen utföringsform av förfarandet enligt uppfinningen innebär att man i steg c) sätter polymerlös- ningen till kompositionen i minst två steg, där en till- sats sker efter det att emulsionen har skapats eller bör- jat skapas.

Det ligger naturligtvis också inom ramen för före- liggande uppfinning att tillsätta polymerlösningarna i flera steg och att därvid exempelvis ändra medelmolekyl- nu 10 15 20 25 30 35 1 n o o ~ 1 c nun n coon Q couuu .no n o un.- 517 610 f 27 vikten och/eller koncentrationen av den använda polyme- ren, t.ex. för att öka koncentrationen av stärkelse i den inre fasen, i de fall detta är önskvärt.

Viktigt för framställning av mikropartiklarna enligt föreliggande uppfinning är att solidifieringen sker via stärkelsen naturliga tendens eller förmåga att gela, och inte genom exempelvis utfällning med organiska lösnings- medel, såsom aceton. Den sistnämnda proceduren kan sålun- da leda till att den biologiskt aktiva substansen utsätts för organiskt lösningsmedel, vilket i många fall är oac- ceptabelt, och till att den naturliga bildning av de fy- sikaliska tvärbindningar som krävs för att man på ett re- glerat sätt skall erhålla stabila mikropartiklar uteblir.

Viktigt i samband med solidiferingen av mikropartik- larna är också att denna sker under betingelser som är milda för den ingående biologiskt aktiva substansen, el- ler substanserna. Primärt är det med andra ord fråga om att använda sig av en temperatur som inte är skadlig för den närvarande substansen. Det har härvid överraskande visat sig, att kriterierna för detta och för att det skall bildas stabila mikropartiklar med lämplig storleks- fördelning lättare kan uppfyllas om man under solidifie- ringen använder sig av mera än en temperaturnivå. Speci- ellt fördelaktigt är det om man inleder solidifieringsp- rocessen i tvàfas-systemet vid lägre temperatur än den temperatur som används i slutfasen av solidifieringen. En föredragen utföringsform innebär att man inleder solidi- fieringen inom intervallet 1-20°C, företrädesvis 1-lO°C, speciellt runt 4°C, och avslutar densamma inom interval- let 20-55°C, företrädesvis 25-40°C, En bekräftelse på att de valda betingelserna är kor- i synnerhet runt 37°C. rekta eller lämpliga kan man få genom att konstatera att stärkelsemikropartiklarna har önskad storleksfördelning, är stabila under de efterföljande tvättnings- och tork- ningsoperationerna och löses upp i huvudsak fullständigt enzymatiskt in vitro och/eller att den införlivade sub- stansen har kapslats in på ett effektivt sätt och har bi- .unc . n q n nn.. _ ...v uu. lO 15 20 25 30 35 517 610 28 behàllen bioaktivitet. Det sistnämnda undersöks vanligt- vis med hjälp av kromatografiska metoder eller med hjälp av andra inom tekniken etablerade metoder, in vitro eller in vivo, efter upplösning av mikropartiklarna enzymatiskt under milda betingelser, och är en viktig del i att för- säkra sig om ett robust och säkert tillverkningsförfaran- de för känsliga biologiskt aktiva substanser. Det är en stor fördel att mikropartiklarna kan lösas upp fullstän- digt under utnyttjande av milda betingelser, då man där- igenom minimerar riskerna för preparationsinducerade ar- tefakter, som är vanligt förekommande då exempelvis orga- niska lösningsmedel behövs för upplösning av mikropartik- larna, vilket exempelvis är fallet då dessa består av en PLGA-matris.

De bildade mikropartiklarna tvättas företrädesvis på lämpligt sätt, för avlägsnande av yttre fas och av över- skott av aktiv substans. Sådan tvättning sker lämpligen genom filtrering, vilken möjliggörs av mikropartiklarnas goda mekaniska stabilitet och lämpliga storleksfördel- ning. Ofta kan det också vara lämpligt med tvättning me- delst centrifugering, avlägsnande av supernatanten och resuspendering i tvättningsmediet. Vid varje tvättnings- förfarande används ett eller flera lämpliga tvättningsme- dier, vilka oftast är bufferthaltiga vattenlösningar. I samband härmed kan också siktning vid behov användas för justering av mikropartiklarnas storleksfördelning, exem- pelvis för eliminering av innehållet av alltför små mik- ropartiklar och för säkerställande av att inga mikropar- tiklar över en viss storlek finns närvarande i den färdi- ga produkten.

Torkningen av mikropartiklarna kan ske på något lämpligt sätt, t.ex. genom spraytorkning, frystorkning eller vacuumtorkning. Vilken torkningsmetod som väljs i det enskilda fallet beror ofta på vad som är lämpligast för bibehållande av den biologiska aktiviteten för den inneslutna biologiskt aktiva substansen. Även processö- verväganden kommer in i bilden, såsom kapacitet och ren- .. - vv.. w.- ~ -.... 10 15 20 25 30 35 517 610 non nu 29 hetsaspekter. Frystorkning är ofta den föredragna tork- ningsmetoden, dä den rätt utformad är synnerligen mild med avseende pà den inneslutna biologiskt aktiva substan- sen. Att den införlivade biologiskt aktiva substansen har bibehàllit sin bioaktivitet kan fastställas medelst för substansen lämplig analys efter enzymatisk upplösning av substansen under milda betingelser. Lämpliga enzymer för användning i samband med stärkelse är alfa-amylas och amyloglukosidas, var för sig eller i kombination, varvid de i förekommande fall bör ha konstaterats vara fria fràn eventuella proteaser, som kan bryta ned proteiner. Närva- ro av proteaser kan detekteras med inom omrâdet kända me- toder och t ex genom att man i kontrollförsök blandar den biologiskt aktiva substansen och bestämmer dess integri- tet pà sedvanligt sätt efter inkubation med den avsedda enzymblandningen under de betingelser som sedan ska an- vändas för upplösning av mikropartiklarna. I de fall pre- parationen konstateras innehålla kontamination av protea- ser, kan den bytas mot en preparation med högre renhet eller renas fràn proteaser. Detta kan göras med inom om- rådet kända tekniker, t ex genom kromatografi med az- makroglobulin bundet till lämpligt kromatografimaterial.

De använda enzymerna kan behöva renas fràn t.ex. kontaminerande proteaser för undvikande av artefaktuell nedbrytning av i mikropartiklarna införlivade känsliga substanser, t.ex. rekombinanta proteiner. Detta kan åstadkommas genom inom området kända tekniker, t.ex. ge- nom kromatografi med fibronektin bundet till ett lämpligt kromatografimaterial.

För modifiering av frisättningsegenskaperna för mik- ropartiklarna kan man dessutom eventuellt också applicera ett frisättningsreglerande hölje av en biokompatibel och bionedbrytbar polymer. Exempel pà lämpliga polymerer i detta sammanhang finns i den kända tekniken, och speci- ellt kan polymerer av mjölksyra och glykolsyra (PLGA) nämnas. Appliceringen av ifrågavarande hölje sker före- trädesvis med hjälp av luftsuspensionsteknik. En speci- 10 15 20 25 30 35 5 17 6 1 0 " 30 ellt lämplig sådan teknik finns beskriven i WO97/14408, och detaljer i detta avseende kan sålunda hämtas från denna skrift, vars innehåll härmed upptas i texten via referens. De stärkelsemikropartiklar som erhålles medelst förfarandet enligt föreliggande uppfinning är ytterst väl lämpade för dragering eller beläggning med hjälp av nämn- da luftsuspensionsteknik, och de erhållna belagda mikro- partiklarna är synnerligen väl lämpade för parenteral ad- ministration.

Vid användning av de framställda mikropartiklarna, vare sig de är belagda med ett frisättningsreglerande yttre hölje eller ej, och speciellt för möjliggörande av injektion, suspenderas de torra mikropartiklarna i ett lämpligt medium. Sådana medier samt förfaranden i dessa avseenden är väl kända inom området och torde inte behöva beskrivas närmare här. Själva injektionen kan göras genom en lämplig kanyl eller med en kanylfri injektor. Det är också möjligt att injicera mikropartiklarna med hjälp av en torrpulverinjektor, utan att de dessförinnan resuspen- deras i ett injektionsmedium.

Förutom de fördelar som har omtalats ovan gäller att ovannämnda förfarande uppvisar den fördelen att utbytet av den biologiskt aktiva substansen generellt är högt, att det är möjligt att erhålla ett mycket högt innehåll av den aktiva substansen i mikropartiklarna under bibe- hållande av substansens bioaktivitet, att de erhållna mikropartiklarna har rätt storleksfördelning för använd- ning för parenteral, reglerad (t.ex. fördröjd eller för- längd) frisättning, då de är för stora för att fagocyte- ras av makrofager och tillräckligt små för att kunna in- jiceras genom små kanyler, t.ex. 23G-25G, och att det vid nedbrytningen av mikropartiklarna bildas kroppsegna och neutrala nedbrytningsprodukter, varigenom man exempelvis kan undvika att den aktiva substansen utsättes för ett alltför lågt pH-värde. Dessutom är själva förfarandet synnerligen väl lämpat för rigorös kvalitetskontroll. u. a... u 10 15 20 25 30 35 31 Beredningen enligt uppfinningen är speciellt intres- sant i samband med proteiner, peptider, polypeptider, po- lynukleotider och polysackarider eller generellt andra läkemedel eller biologiskt aktiva substanser som är käns- liga för eller instabila i exempelvis organiska lösnings- medel. Rekombinant framställda proteiner är en mycket in- tressant grupp av biologiskt aktiva substanser. Allmänt sett gäller dock att uppfinningen inte är begränsad till närvaro av sådana substanser, eftersom uppfinningsidén är tillämpbar på vilken som helst biologiskt aktiv substans, som kan användas för parenteral administration. Förutom i samband med känslighets- eller instabilitetsproblem kan uppfinningen sålunda också vara av speciellt intresse i sådana fall där det annars skulle vara svårt att avlägsna lösningsmedel eller där toxikologiska eller andra miljö- mässiga problem skulle kunna uppträda.

Exempel på biologiskt aktiva substanser av ovan an- givet slag är tillväxthormon, erytropoietin, interferon (a,ß,y-typ), vaccin, epidermalt tillväxthormon, Faktor IV, V, VI, VII, VIII och IX, LHRH-analog, insulin, makro- fagkolonistimulerande faktor, granulocytkolonistimuleran- de faktor och interleukin.

Användbara biologiskt aktiva substanser av typ icke- proteinläkemedel kan väljas ur följande grupper: Antitumörmedel, antibiotika, antiinflammatoriska me- del, antihistaminer, sedativa medel, muskelavslappnande medel, antiepileptiska medel, antidepressionsmedel, anti- allergiska medel, bronkodilatatorer, kardiotoniska medel, antiarrytmimedel, vasodilatatorer, antidiabetiska medel, antikoagulerande medel, hemostatiska medel, narkotiska medel och steroider.

Den nya mikropartikelberedningen enligt uppfinningen är emellertid inte begränsad till sådana som kan fram- ställas medelst ovannämnda förfarande utan omfattar alla mikropartikelberedningar av ifrågavarande slag oberoende av framställningsmetodiken. avv- u »nunn 10 15 20 25 30 35 517 610 22"; 32 Dessutom kan mikropartiklar väsentligen bestå av stärkelse, som har ett innehåll överstigande 85 vikt-% av amylopektin, för vilket minst 80 vikt-% har en medelmole- kylvikt inom intervallet 10-1 000 kDa, vilka har ett ami- nosyrainnehåll understigande 50 pg per torrvikt stärkelse och vilka saknar kovalent kemisk tvärbindning mellan stärkelsemolekylerna.

Den stärkelse på vilken ifrågavarande mikropartiklar är baserade är företrädesvis någon av de stärkelsesorter som har definierats ovan i samband med förfarandet.

Enligt en variant av mikropartiklarna gäller att dessa är sådana, vari den biologiska substansens bioakti- vitet är minst 80 %, företrädesvis minst 90 %, av den bioaktivitet som substansen uppvisade innan den införli- vades i stärkelsen. Allra helst är nämnda bioaktivitet i huvudsak bibehållen eller bevarad i mikropartiklarna. Ännu en variant representeras av mikropartiklar, vilka är bionedbrytbara in vitro i närvaro av alfa-amylas och/eller amyloglukosidas.

En annan variant representeras av sådana, vilka är bionedbrytbara och elimineras från vävnad efter subkutan eller intramuskulär administration.

En speciellt föredragen variant av mikropartiklarna representeras av partiklar som har ett frisättningsregle- rande hölje av minst en filmbildande, biokompatibel och bionedbrytbar polymer.

Denna polymer är företrädesvis en homo- eller sampo- lymer framställd av alfa-hydroxysyror och/eller cykliska dimerer av alfa-hydroxysysror, varvid nämnda alfa- hydroxysyra företrädesvis är vald ur gruppen bestående av mjölksyra och glukolsyra, och varvid den cykliska dimeren företrädesvis är vald ur gruppen bestående av glykolider och laktider.

Sådana polymerer eller dimerer (exempelvis av typ PLGA) finns noggrant beskrivna i sig i den kända tekni- ken, varför ytterligare detaljer beträffande sådana kan hämtas från denna. »unna 10 15 20 25 30 35 33 Ytterligare en föredragen variant av mikropartiklar- na representeras givetvis av sådana mikropartiklar som är framställningsbara, eller framställda, medelst ett förfa- rande sàsom detta har definierats ovan, antingen gene- rellt eller i form av vilken som helst föredragen utfö- ringsform av nämnda förfarande.

Vad beträffar bestämningen av den biologiska aktivi- teten för mikropartiklarna innehållande aktiv substans gäller att denna får ske pà ett för varje enskild biolo- gisk substans lämpligt sätt. I de fall bestämningen sker i form av djurförsök, injiceras en viss mängd av den bio- logiskt aktiva substansen införlivad i stärkelsemikropar- tiklarna, eventuellt efter upplösning av dessa mikropar- tiklar enzymatiskt under milda betingelser i förväg och det biologiska svaret jämförs med det svar som erhålles efter injektion av motsvarande mängd av samma biologiskt aktiva substans i en lämplig lösning. I de fall utvärde- ringen sker in vitro, t ex i provrör eller i cellkultur, görs den biologiskt aktiva substansen helst helt till- gänglig före utvärderingen genom upplösning av stärkelse- mikropartiklarna enzymatiskt under milda betingelser, varefter aktiviteten bestäms och jämförs med aktiviteten för en kontrollösning med samma koncentration av ifråga- varande biologiskt aktiva substans. I alla händelser gäller att utvärderingen skall innefatta eventuella ospe- cifika effekter av stärkelsemikropartiklarnas nedbryt- ningsprodukter.

Uppfinningen kommer nu att belysas ytterligare genom följande, icke begränsande exempel. För dessa, liksom för texten i övrigt, gäller att angivna procenthalter avser vikt-%, om inget annat anges. Exempel 1-7 avser jämföran- de försök, medan Exempel 8-15 representerar uppfinningen.

EXEMPEL Exempel la - le-b Kontrollförsök: procedur för framställning av stär- kelsemikrosfärer enligt EP 213303 A2. Syftet med dessa 10 15 20 25 30 35 517 610 34 Kontrollförsök var att visa teknikens nuvarande ständ- punkt. Stärkelsekoncentrationen var generellt 5%, och (medelmolekylvikt 6 kDa). hälldes i PEG-lösningen (5g, PEG-koncentrationen var 6% (log) tempererad till 70°C) Stärkelselösningen och stabiliserades under omrörning i rumstemperatur över natten. Därefter resuspenderades materialen ned i 95% etanol, då de inte gick att filtre- ra. Under de olika stegen observerades förekomsten av diskreta mikrosfärer och där det var möjligt undersöktes bionedbrytbarheten in vitro med a-amylas efter upparbet- ning. Inledningsvis provades att upparbeta mikrosfàrerna genom filtrering, men då detta inte var möjligt, användes centrifugering (Sorfvall, SS34, 5 min, lO 000 rpm 20°C), avsugning av supernatanten och tillsats av 10 ml 95% eta- nol.

Exempel la Tillverkning av stärkelsemikrosfärer av potatisstärkelse.

Potatisstärkelsen (Acros organics, Lot AOl364230l) bildade en mycket högviskös klar lösning redan vid 5%.

Efter stabilisering över natten hade det inte bildats diskreta mikrosfärer utan någon slags utfällning. Efter tvätt med 95% etanol återfanns inga diskreta stärkelse- mikrosfärer, utan en ganska hård och seg klump.

Exempel la-b Tillverknng av stärkelsemikrosfärer innehållande BSA.

Stärkelsemikrosfärer tillverkades enligt exempel la, med den skillnaden att ett protein (bovint serumalbumin (BSA), 20%, skapandet av tvàfas-systemet. Efter stabilisering över 0,1 ml) blandades med stärkelselösningen före natten hade det inte bildats diskreta mikrosfärer utan någon slags utfällning och efter tvätt med 95% etanol er- hölls en seg klump och inga diskreta mikrosfärer.

Exempel lb Tillverkning av stärkelsemikrosfärer av löslig stärkelse. .av lO 15 20 25 30 35 517 610 z Ia. 35 Den lösliga stärkelsen (Baker BV - Deventer Holland, Lot No M27602) gav en något opalescent lösning vid värm- ning till 95°C. Det hade inte bildats några diskreta mik- rosfärer efter omrörning över natten utan någon slags ut- fällning. Efter tvätt med 95% etanol kunde inte diskreta mikrosfärer observeras utan stärkelsen hade fallit ut i form av små grusliknande partiklar. Efter torkning er- hölls ca 4 mg partiklar av totalt satsat 500 mg stärkel- se. Vid inkubation med a-amylas in vitro var cirka 65% av stärkelsematrisen resistent och löstes inte upp.

Exempel lb-b Införlivande av BSA i stärkelsemikrosfärer framställda av löslig stärkelse.

Förfarandet enligt Exempel lb upprepades med undan- tag av att BSA (20%, 0,1 ml) blandades med stärkelselös- ningen före skapandet av tvåfas-systemet. Efter stabili- sering över natten hade diskreta partiklar bildats, vilka upparbetades, varefter biodegraderbarheten undersöktes in vitro genom inkubation med a-amylas, med resultatet att ungefär 57% av matrisen var upplösbar. Utbytet av protei- net var lågt och kunde ej kvantifieras då den erhållna koncentrationen efter den partiella upplösningen av mik- rosfärerna var lägre än den lägsta standarden i standard- kurvan för HPLC-metoden.

Exempel lc Tillverkning av stärkelsemikrosfärer av oxiderad löslig stärkelse.

Stärkelsen (Perfectamyl A3lO8, Stadex) bildade en klar lösning efter att ha värmts till 95°C. Inga diskreta mikrosfärer hade bildats efter stabilisering över natten och det kunde inte återfinnas något fast material överhu- vudtaget i provet.

Exempel lc-b :|»ø| 10 l5 20 25 30 35 517 610 36 Införlivande av BSA i stärkelsemikrosfärer framställda av löslig stärkelse.

Förfarandet enligt Exempel lc upprepades, med undan- tag av att BSA (20%, 0,1 ml) blandades med stärkelselös- ningen före skapandet av tvàfas-systemet. Efter stabili- sering observerades en utfällning, som ej liknade stär- kelse och efter tvätt och torkning erhölls ca 2 mg fast material.

Exempel ld Tillverkning av stärkelsemikrosfärer av nativ höggrenad stärkelse (amylopektin).

Den nativa amylopektinstärkelsen (Cerestar SF 04201) gav en klar och viskös lösning vid värmning till 95°C.

Efter omrörning över natten kunde inga diskreta mikrosfä- rer observeras utan provet utgjordes av någon sorts ut- fällning. Efter tvätt med 95% etanol hade provet blivit en slemmig massa och innehöll inga diskreta stärkelsemik- rosfärer.

Exempel ld-b Införlivande av BSA i stärkelsemikrosfärer framställda av nativ höggrenad stärkelse (amylopektin).

Förfarandet enligt Exempel ld upprepades, med undan- tag av att BSA (20%, 0,1 ml) blandades med stärkelselös- ningen före skapandet av tvàfas-systemet. Efter stabili- sering observerades en utfällning som ej liknade stärkel- se och efter tvätt och torkning erhölls en seg klump.

Exempel le Tillverkning av stärkelsemikrosfärer av syrahydrolyserad och skjuvad amylopektin.

Stärkelsen bestod ursprungligen av syrahydrolyserad waxy maize (Cerestar 06090) och skjuvades även mekaniskt för att ge en molviktsfördelning som är bättre lämpad för tillverkning av stärkelsemikrosfärer i tvàfas- lO 15 20 25 30 35 5 1 7 5 1 0 37 vattensystem. Efter värmning till cirka 95°C erhölls en klar lösning. Efter omrörning över natten kunde inga diskreta mikrosfärer observeras utan provet utgjordes av någon slags fällning. Efter tvätt med 95% etanol kunde inga diskreta mikrosfärer observeras utan stärkelsen hade bildat små partiklar.

Exempel le-b Införlivande av BSA i stärkelsemikrosfärer framställda av syrahydrolyserad och skjuvad stärkelse (amylopektin) Förfarandet enligt Exempel le upprepades, med undan- tag av att BSA (20%, 0,1 ml) blandades med stärkelselös- ningen före skapandet av tvàfas-systemet. Efter stabili- sering över natten kunde inga diskreta mikrosfärer obser- veras. Däremot kunde en ytterst liten utfällning observe- ras. Efter upparbetningen var den erhållna mängden så li- ten att nàgon exakt bestämning ej kunde göras.

Exempel 2 Framställning av stärkelsemikrosfärer av amylos.

Stärkelsemikrosfärer tillverkades av amylos (fràn Serva) i syfte att undersöka deras biodegraderbarhet in vitro och in vivo. Dà amylos gelar för snabbt för att ma- nuell tillverkning ska vara möjlig användes en maskin som möjliggör kontinuerlig tillverkning. Den centrala enheten i maskinen är en mikrovàgsenhet som möjliggör snabb upp- värmning av stärkelsen till cirka l50°C, följt av kylning till ca 45°C före blandning med protein- eller buffert- lösning. Stärkelselösningen bereddes i destillerat vatten då den annars brunfärgas vid upphettningen i mikrovàgsen- heten. Stärkelsen bestod av pregelatiniserad amylos från ärta (4%) och trots upprepad homogenisering kvarstod ett flertal klumpar. Flödena ställdes in enligt: stärkelse (5 ml/min), Tris-buffert, pH 7,8 (1,2 ml/min) och PEG lös- ningen (2.4 viktprocent PEG med en medelmolvikt pà 300000 Da) som också innehöll 6,9% natriumklorid och 14,3% man- 10 15 20 25 30 35 517 610 38 nitol. Mikropartiklarna tilläts stabiliseras i rumstempe- ratur några timmar och därefter i kylskåp över natten. De upparbetades genom följande tvättningar i centrifug: tre gånger med 70% etanol, tre gånger med 5 mm fosfatbuffrad koksaltlösning innehållande 1 mM kalciumklorid och 0,02% natriumazid, pH 7,4), och slutligen 99,5% etanol tre gånger. Mikropartiklarna torkades i vakuum. Eftersom det fanns en del mycket små partiklar i preparationen försök- te dessa avlägsnas genom sedimentation i 99,5% etanol tre gånger, vilket inte ledde till fullständigt borttagande av dessa. Totalt erhölls 9,5 g mikropartiklar och efter sedimentationen återstod 8,5 g.

Partikelstorleksfördelningen bestämdes med en Mal- vern Mastersizer och befanns vara bred, med de minsta mikrosfärerna kring 5 um och de största över 160 pm. Me- deldiametern beräknad från volymen var 25 pm. Ca. 30-40% av stärkelsematrisen löstes upp när mikrosfärerna inkube- rades med a-amylas vid 37°C in vitro i två veckor.

Detta jämförande exempel visar på svårigheterna att tillverka mikrosfärer från amylos till följd av att denna är svår att bereda homogena lösningar av, kräver mycket höga temperaturer för att lösas och är känslig för ned- brytning under utsättandet för dessa höga temperaturer, samt gelar mycket fort. Exemplet visar också att de re- sulterande mikrosfärerna har en alltför bred storleksför- delning, både direkt efter tillverkning och efter försök att snäva in storleksfördelningen, och ett alltför högt innehåll av mikrosfärer med en storlek understigande 10 pm för att vara väl lämpade för förlängd frisättning ef- ter injektion subkutant eller intramuskulärt. Exemplet visar också att bionedbrytbarheten, undersökt in vitro, inte är fullständig under den undersökta tidsperioden.

Exempel 3 Framställning av stärkelsemikrosfärer innehållande B- laktoglobulin. 10 15 20 25 30 35 , . n.. nu 517 610 39 Stärkelsemikrosfärer tillverkades av amylos (Serva) för att undersöka effektiviteten av immobilisering av ett modellprotein, ß-laktoglobulin. Då denna amylos gelar för snabbt för att helt manuell tillverkning ska vara möjlig användes en maskin med en mikrovàgsenhet som möjliggör snabb uppvärmning av stärkelsen till cirka 150 °C, följt av kylning till kring 45°C före blandning med protein- eller buffertlösning. Stärkelselösningen (10%) bereddes i destillerat vatten och flödet ställdes in på 5 g/minut.

Stärkelselösningen (2,5 ml) samlades upp i en bägare av plast och då temperaturen gått ned till 50-70°C sattes (0,6 ml, 8,3% i buffert) till denna un- I stort sett omedelbart därefter (10%, medelmolvikt 20 000 3,0 ml) till stärkelselösningen under omrörning och proteinlösningen der magnetomrörning. sattes den första PEG-lösningen Da, efter en minuts omrörning sattes den andra PEG-lösningen (40%, medelmolekylvikt 20 000 Da, som lämnades att stabilisera i rumstemperatur till nästa 10 ml) till emulsionen dag. De bildade mikrosfärerna upparbetades på två olika sätt för att visa deras förmåga att bibehålla en adekvat proteinladdning. Den första tvättmetodiken utgjordes av centrifugeringstvättar med buffertlösningar och resulte- rade i att i stort sett allt protein läckte ut ur stär- kelsemikrosfärerna. I den andra upparbetningsmetoden an- vändes också isopropanol för att öka laddningen av lakto- globulin i mikrosfärerna. I denna tvättades först tre gånger med 70% isopropanol, därefter en gång med 5 mM fosfatbuffrad koksaltlösning innehållande 1 mm kalcium- klorid och 0,02% natriumazid, därefter ytterligare en gång med samma buffert varvid de lämnades att stå i buf- ferten under en timme med vaggning, därefter 5 gånger med buffert och slutligen 3 gånger med 100% isopropanol. Mik- rosfärerna torkades sedan i vakuum. Laddningen av protein med användande av isopropanoltvätten var 3,6%, vilket motsvarar ett teoretiskt utbyte på 18%.

Exemplet visar bl.a. på betydande praktiska svårig- heter att tillverka mikrosfärer innehållande protein från vara; 10 15 20 25 30 35 51 7 61 0 40 amylos då stärkelselösningen måste utsättas för mycket höga temperaturer för att lösas upp fullständigt, då stärkelsen lätt förändras kemiskt vid dessa höga tempera- turer och gelar mycket snabbt efter nedkylning till tem- peraturer som är rimligt låga för att stärkelselösningen ska kunna blandas med ett känsligt protein. Tillverkning- en kompliceras ytterligare av behovet att använda två olika lösningar av PEG för att möjliggöra bildning av mikrosfärer och infàngande av proteinet i dessa. En yt- terligare allvarlig nackdel är behovet av att använda isopropanol vid upparbetningen av mikrosfärerna för att erhålla en acceptabel proteinladding då de flesta känsli- ga proteiner inte tål att utsättas för detta eller likan- de organiska lösningsmedel. Stärkelsemikrosfärer tillver- kade av denna amylos bionedbryts inte fullständigt av æ- amylas in vitro och ej heller in vivo .

Exempel 4 Framställning av amylos från ärta.

Amylos framställdes genom lakning från stärkelsegra- nuler. NUTRIO-P-star 33 (300g, Nordfalk) suspenderades i vatten (7200 g) och suspensionen värmdes till 75°C i en timme. De uppsvällda granulerna avlägsnades genom centri- fugering och den erhållna lösningen filtrerades genom först ett kolfilter, sedan ett förfilter (Filtron, 1,5 pm) och slutligen ett sterilfilter (Millipore, 0,2 pm).

Den filtrerade lösningen ställdes i kylskåp över natten varvid amylosen föll ut och återvanns genom centrifuge- ring. Den erhàllna utfällningen tvättades två gånger med etanol (95%, 700 ml) och torkades sedan under vakuum. Un- gefär 30 g amylos erhölls.

Exempel 5 Stärkelsemikrosfärer tillverkades av amylos fram- ställd enligt Exempel 4 i syfte att undersöka deras biodegraderbarhet in vitro och in vivo. Då amylos gelar för fort för att manuell tillverkning ska vara möjlig an- 10 15 20 25 30 35 51 v 610 21% 41 vändes en maskin som möjliggör kontinuerlig tillverkning.

Den centrala enheten i maskinen är en mikrovàgsenhet som möjliggör snabb uppvärmning av stärkelsen till cirka 150 °C, följt av kylning till kring 45°C före blandning med protein- eller buffertlösning. Stärkelselösningen bered- des i destillerat vatten då den annars brunfärgas vid upphettningen i mikrovågsenheten. Stärkelsen bestod av pregelatiniserad amylos från ärta (4%) och trots upprepad homogenisering kvarstod ett flertal klumpar. Flödena ställdes in enligt: stärkelse (5 ml/min), Tris-buffert, pH 7,8 (1,2 ml/min) och PEG lösningen (2,4 viktprocent PEG med en medelmolvikt på 300 000 Da) som också innehöll 6,9% natriumklorid och 14,3% mannitol. Mikropartiklarna tilläts stabiliseras i rumstemperatur några timmar och därefter i kylskåp över natten. De upparbetades genom följande tvättningar i centrifug: tre gånger med 70% eta- nol, tre gånger med 5 mm fosfatbuffrad koksaltlösning in- nehållande 1 mm kalciumklorid och 0,02% natriumazid, pH 7,4, och slutligen 99,5% etanol tre gånger. Mikropartik- larna torkades i vakuum. Eftersom det fanns en del mycket små partiklar i preparationen försökte dessa avlägsnas genom sedimentation i 99,5% etanol tre gånger, vilket inte ledde till fullständigt borttagande av dessa. Utby- tet var 8,5 g partiklar efter sedimentationen, under vil- ken 1 g mikrosfärer renades bort.

Partikelstorleksfördelningen bestämdes med en Mal- vern Mastersizer och befanns vara bred, med de minsta mikrosfärerna kring 5 um och de största över 160 pm. Me- deldiametern beräknad från volymen var 25 pm.

Bionedbrytbarheten av stärkelsemikrosfärerna under- söktes genom inkubation med u-amylas in vitro. Inled- ningsvis var nedbrytningen snabb och efter en dag hade cirka 35-45% överförts i löslig form. Därefter sjönk ned- brytningshastigheten och efter 6 dagar hade ungefär 50% lösts upp. Därefter var bionedbrytbarheten försumbar och efter 25 dagar återstod fortfarande ungefär 50% av stär- kelsemikrosfärerna i icke upplöst form. 42 Detta jämförande exempel visar på svårigheterna att tillverka mikrosfärer från amylos till följd av att denna är svår att bereda homogena lösningar av, kräver mycket höga temperaturer för att lösas och är känslig för ned- 5 brytning under utsättandet för dessa höga temperaturer, samt gelar mycket fort. Exemplet visar också att de re- sulterande mikrosfärerna har en alltför bred storleksför- delning, både direkt efter tillverkning och efter försök att snäva in storleksfördelningen, och ett alltför högt 10 innehåll av mikrosfärer med en storlek understigande 10 um för att vara väl lämpade för förlängd frisättning ef- ter injektion subkutant eller intramuskulärt. Exemplet visar också att bionedbrytbarheten, undersökt in vitro, inte är fullständig. 15 Exempel 6 Undersökning av bionedbrytbarheten av stärkelsemikrosfä- rer tillverkade av amylos in vivo Stärkelsemikrosfärer (3,0lmg) tillverkade av amylo- 2O sen i Exempel 4 injicerades subkutant i nacken i en volym av l0Oul på åtta hypofysektomerade råttor av stammen Spraque-Dawley. Små knölar kunde kännas under huden hos alla råttor på injektionsställena 8-9 dagar efter injek- tion. Vid dissekering 9 dagar efter injektion gjordes en 5,3 25 makroskopisk inspektion och då återfanns små vita cystor på injektionsstället hos alla råttor. De makroskopiska förändringarna fixerades i 4% fosfat-buffrad formaldehyd, bäddades in i paraffin, snittades med en nominell tjock- HH. lek av 5 pm, färgades med hematoxylin och eosin, samt un- :ff 30 dersöktes i ljusmikroskop. I de paraffinsnitt där stär- kelsemikrosfärerna kunde återfinnas sågs de som eosinofi- la små kulor omgivna av en zon av granulerande vävnad in- nehållande jâtteceller och vävnadsreaktionen karakterise- rades som en kronisk ”granulomatoös” inflammation i den 35 subkutana vävnaden. Stärkelsemikrosfärer kunde också ob- serveras inuti makrofager. 43 Försöket visar att stärkelsemikrosfärer tillverkade av amylos återfinns i den subkutana vävnaden 9 dagar ef- ter injektion och således inte har bionedbrutits till- räckligt för att ha lösts upp under den tiden, samt att i 5 alla fall en andel av mikrosfärerna var tillräckligt små för att kunna fagocyteras av makrofager.

Exempel 7 Undersökning av bionedbrytbarheten av stärkelsemikrosfä- 10 rer tillverkade av amylos in vivo.

Stärkelsemikrosfärer tillverkade av amylos enligt Exempel 4 och uppsuspenderade i 10 ml fosfatbuffrad (5 mM) fysiologisk koksaltlösning (O,15 M), pH 7,2. injice- rades intramuskulärt i låret på gris. Två grisar dosera- 15 des med 120 mg mikrosfärer och två grisar med 600 mg mik- rosfärer. Djuren avlivades dag 14 och vävnaden undersök- tes med avseende på makroskopiska förändringar och, efter sedvanligt inbäddnings- och färgningsförfarande, på mik- roskopiska förändringar. På dag 14 återfanns mikrosfärer 20 i vävnaden på ett dosberoende sätt. En del mikropartiklar hade fagocyterats av makrofager och jätteceller, och kun- de återfinnas intracellulärt, vilket indikerar mycket långsam nedbrytning av mikrosfärerna.

Försöket visar att stärkelsemikrosfärer tillverkade :.3 25 av amylos återfinns i den intramuskulära vävnaden två veckor efter injektion, viket indikerar att bionedbryt- barheten av dessa är mycket långsam. :»:ou Exempel 7b 30 Stärkelsemikrosfärer tillverkades av syrahydrolyse- Éf: rad amylos från potatis (Reppal PSM60U), som ultrafiltre- rats för att ta bort lågmolekylära komponenter, i syfte att undersöka deras biodegraderbarhet och förmåga att in- förliva protein utan att utsätta detta för ett organiskt 35 lösningsmedel. Som modellprotein användes B- laktoglobulin. Stärkelsekoncentrationen var 24% och 4 ml av denna blandades med 1,6 ml av proteinlösningen som vara; 10 15 20 25 30 35 517 610 :f- 44 hade en koncentration av 50 mg/ml vid 37°C. Mikrosfärerna solidifierades under omrörning i rumstemperatur över nat- ten.

Allt protein läckte ut ur mikrosfärerna under cent- rifugeringstvättarna i buffert (5 mM natriumfosfat, pH 7,8). Om enbart isopropanol eller en serie bestående av först 15% PEG med en molvikt pà 100 000, följt av 40% PEG med en molvikt på 10 000 Da och slutligen isopropanol an- vändes kunde protein motsvarande mellan 1,5 och 3% åter- finnas i mikrosfärerna. Bionedbrytbarheten av mikrosfä- rerna undersöktes in vitro. Denna var inledningsvis snabb och efter ett dygn hade cirka 60% av matrisen omvandlats till löslig form. Därefter avstannade nedbrytningen och efter 7 dagar hade cirka 70% av matrisen bionedbrutits under dessa betingelser.

För att erhålla någon laddning av proteinet i dessa mikrosfär var det nödvändigt att fälla ut proteinet med ett organiskt lösningsmedel, vilket inte är ett accept- abelt förfarande för känsliga proteiner. De erhållna mik- rosfärerna var ej heller fullständigt biodegraderbara in vitro.

Exempel 7c Stärkelsemikrosfärer tillverkades av extensivt syra- hydrolyserad amylos fràn potatis (Reppal PSM25, Reppe Glykos, Växjö) i syfte att undersöka deras bionedbrytbar- het och förmàga att införliva protein utan att utsätta detta för ett organiskt lösningsmedel. Som modellprotein användes ß-laktoglobulin. Stärkelsekoncentrationen var 20% och 4 ml av denna blandades med 1,6 ml av proteinlös- ningen som hade en koncentration av 50 mg/ml vid 37°C.

Mikrosfärerna solidifierades under omrörning i rumstempe- ratur över natten.

Allt protein läckte ut ur mikrosfärerna under cent- rifugeringstvättarna i buffert (5 mM natriumfosfat, pH 7,8). Om enbart isopropanol eller en serie bestående av först 15% PEG med en molvikt på 100 000, följt av 40% PEG nun»- 10 l5 20 25 30 35 5 17 6 10 =¿::= 45 med en molvikt pà 10 000 Da och slutligen isopropanol an- vändes, kunde protein motsvarande ungefär mellan 1,5 och 2,5% àterfinnas i mikrosfärerna. Bionedbrytbarheten av mikrosfärerna undersöktes in vitro. Denna var inlednings- vis snabb och efter ett dygn hade cirka 55% av matrisen omvandlats till löslig form. Därefter avstannade nedbryt- ningen och efter 7 dagar hade cirka 70% av stärkelsema- trisen bionedbrutits under dessa betingelser.

För att erhålla någon laddning av proteinet i dessa mikrosfär var det nödvändigt att fälla ut proteinet med ett organiskt lösningsmedel, vilket inte är ett accept- abelt förfarande för känsliga proteiner. De erhållna mik- rosfärerna var ej heller fullständigt bionedbrytbara in vitro.

Exempel 8 Immobilisering av BSA med hög laddning i stärkelsemikro- sfärer tillverkade av höggrenad skjuvad stärkelse.

En stärkelselösning (40%) av skjuvad höggrenad stär- kelse med medelmolekylvikten 1600 kDa, en lösning (38%) av PEG 20 000 Da i medelmolvikt och en lösning av BSA (14%) breddes i 50 mM natriumfosfat, pH 8,3. Stärkelse- lösningen tempererades till 50-55°C, PEG och BSA- lösningen till ca 33°C. Stärkelselösningen (2g) blandades med BSA-lösningen (0,7 ml). Den erhållna lösningen sögs upp i en spruta som monterades i en sprutpump. En lösning av PEG (29g) monterades i en annan spruta i en annan sprutpump. Stärkelsemikrosfärerna tillverkades genom att blandningarna av stärkelse/BSA och PEG med hjälp av sprutpumpen pumpades genom statiska mixrar ner i en bära- re där emulsionen rörs om med en propeller (100 rpm).

Denna del av processen tog 2 min från start tills allt blandats. Omrörningen i bägaren tilläts fortsätta i 10 min och därefter flyttades provet till 4°C, där den fick stà under omrörning i ca 4 timmar. Därefter justerades pH i lösningen ner i ca 5,5 och preparationen sattes i 37°C över natten utan omrörning. Stärkelsemikrosfärerna tvät- lO 15, 20 25 30 35 517 610 46 tades genom filtrering i en Amicon (Amicon ultrafiltre- ringscell) 5 mM natriumfosfat, pG 4,5 och frystorkades.

De torkade mikrosfärerna löstes upp enzymatiskt med d-amylas och amyloglukosidas för bestämning av protein- och stärkelseutbyte, samt proteinladdning. Utbytet av protein var 94%, av stärkelsen 89% och den erhållna ladd- ningen l0%. Medelpartikelstorleken bestämd med en Malvern Mastersizer var 90 pm och med mindre än 10% av fördel- ningen under 35 pm. Vid inkubation med a-amylas eller a- amylas samt amyloglukosidas löstes mikrosfärerna upp fullständingt inom två dygn.

Exemplet visar att ett protein, BSA, kan immobilise- ras med högt utbyte och att de erhållna mikrosfärerna har en hög laddning av proteinet. Mikrosfärerna är bionedb- rytbara då de löses upp fullständigt av a-amylas in vitro och detta kan göras under milda betingelser vilket möj- liggör noggrann kemisk analys av det immobiliserade pro- teinet utan introduktion av artefakter på grund av själva extraktionsprocessen. Exemplet visar också att allt in- fångat protein kan återfinnas efter upplösning av mikro- sfärerna.

Exempel 9 Immobilisering av BSA med hög laddning i stärkelsemikro- sfärer tillverkade av höggrenad skjuvad stärkelse.

Stärkelsemikrosfärer innehållande BSA tillverkades med användande av en stärkelselösning (40%) av höggrenad, skjuvad stärkelse med medelmolekylvikten 1600 kDa, en (38%, medelmolekylvikt 20 000 Da) (16%) tillverkades i 50 mM fosfat, pH 8,3.

Stärkelselösningen tempererades till 50-55°C och PEG- och PEG-lösning och en lös- ning av BSA BSA-lösningen till ca 30%. Stärkelsemikrosfärerna fram- (IKA labreaktor LR250). Stär- kelselösningen (20g) pumpades ner i reaktorkärlet under ställdes i en IKA-reaktor omrörning (100 rpm) under ca 6 min och omrörningen fort- satte i ca 15 min. Preparationen överfördes till 4°C och .oo- n.. 10 15 20 25 30 35 517 610 47 tilläts stå under omrörning över natten. pH i lösningen justerades ner till ca 5,5 och denna överfördes till 37°C där den tilläts stå i ca 7 timmar utan omrörning. Stär- kelsemikrosfärerna innehållande BSA tvättades med 5 mM natriumfosfat, pH 4,5 och frystorkades.

De torkade mikrosfärerna löstes upp enzymatiskt med a-amylas och amyloglukosidas för bestämning av protein- och stärkelseutbyte, samt proteinladdning. Utbytet av protein var 99%, av stärkelsen 91% och den erhållna ladd- ningen l1,5%. Medelpartikelstorleken bestämd med en Mal- vern Mastersizer var 48 pm och med mindre än 10% av för- delningen under 17 pm. Vid inkubation med d-amylas eller a-amylas samt amyloglukosidas löstes mikrosfärerna upp fullständigt inom 2 dygn.

Exempel 10 Immobilisering av BSA med hög laddning i stärkelsemikro- sfärer tillverkade av höggrenad skjuvad stärkelse.

En stärkelselösning (20%) av höggrenad skjuvad stär- kelse med medelmolekylvikten 1930 kDa, en PEG-lösning (38%, medelmolekylvikt 20 000 Da) (20%) bereddes i 50 mM natriumkarbonat, pH 9,8. Stärkel- och en BSA-lösning selösningen tempererades till 50-55°C och de övriga till ca 37°C. Stärkelselösningen (3 g) blandades med BSA- lösningen (0,7 ml). Blandningen sögs upp i en spruta och sattes till PEG-lösningen (28 g) i en bägare under omrör- ning. Preparation överfördes till 4°C där de fick stå i 4 timmar och därefter till 37°C där de fick stå över nat- ten. Stärkelsemikrosfärerna innehållande BSA tvättades med 5 mM natriumfosfat, pH 4,5,och frystorkades.

De torkade mikrosfärerna löstes upp enzymatiskt med d-amylas och amyloglukosidas för bestämning av protein- och stärkelseutbyte, av stärkelsen 90% och den erhållna ladd- ningen 10,6%. Medelpartikelstorleken bestämd med en Mal- samt proteinladdning. Utbytet av protein var 91%, vern Mastersizer var 44 pm och med mindre än 10% av för- delningen under 21 pm. Vid inkubation med a-amylas eller 10 15 20 25 30 35 517 610 48 d-amylas samt amyloglukosidas löstes mikrosfärerna upp fullständigt inom 2 dygn.

Exempel 11 Immobilisering av kristallint hGH i stärkelsemikrosfärer tillverkade av höggrenad skjuvad stärkelse med hög stär- kelse- och PEG-koncentration och med temperaturcykling.

Kristaller av zink-hGH framställdes enligt EP 0 540 582 Bl. En suspension av dessa kristaller bereddes i 10 mM Na-acetat, pH 6,4, innehållande 2 mM zinkacetat.

En stärkelselösning (40%) skjuvad stärkelse med medelmolekylvikten 378 kDa i 10 mM natriumfosfat, pH 6,4, tillverkades av höggrenad och en lösning av PEG med en me- delmolvikt på 20 000 i en koncentration av 30%. Denna ju- sterades till pH 6,4 med 1 M HCl. Lösningarna temperades enligt följande: stärkelselösningen till 50-55°C, PEG- lösningen till 37°C och suspensionen av Zn-hGH kristaller till 37°C. Till 7 ml av suspension av Zn-hGH kristaller tillsattes 4,9 g av stärkelselösningen, under omrörning.

Efter ca 20 sek tillsattes 28 g av PEG-lösningen med hjälp av en sprutpump under ca 6 min och fortfarande med omrörning vid 400 varv per minut (Eurostar digital). Mik- rosfärerna började bildas direkt och flyttades efter ca 15 min från 37°C till 4°C, och hölls där i ca 4 timmar un- der omrörning. Efter stabilisering i 4timmar var mikro- sfärerna så stabila att de kunde överföras till 37°C och hållas där utan omrörning över natten. De erhållna mikro- sfärerna tvättades tre gånger med 10 mM natriumacetat, pH 6,4, innehållande 2 mM zinkacetat, efter att ha stabili- serats i 37°C i ca 17-20 timmar genom filtrering i en Amicon, och frystorkades.

De torkade mikrosfärerna löstes upp enzymatiskt med a-amylas och amyloglukosidas för bestämning av protein- och stärkelseutbyte, samt proteinladdning och proteinkva- litet. Utbytet av protein var 95,2%, utbytet av stärkelse var 68% och laddningen av protein i mikrosfärerna 27,8%.

Medelpartikelstorleken bestämd med en Malvern Mastersizer :sann 10 15 20 25 30 35 51 7 61 o 49 var 59 pm och med mindre än 10% av fördelningen under 29 pm. Vid inkubation med a-amylas eller a-amylas samt amy- loglukosidas löstes mikrosfärerna upp fullständigt inom 2 dygn. Proteinets halt av dimerer var 0,75% och av polymer Försöket visar att även proteiner som har överförts i solid form kan immobiliseras med högt utbyte och resul- terande i stärkelsemikrosfärer med hög laddning av prote- inet enligt föreliggande uppfinning. Försöket visar också att de erhållna stärkelsemikrosfärerna kan lösas upp un- der milda betingelser, vilket möjliggör rigorös kvali- tetskontroll av det immobiliserade proteinets egenskaper utan introduktion av provberedningsinducerade artefakter, och att proteinet inte brutits ner under processen. Den erhållna proteinkvalitén är acceptabel för parenteral ad- ministration pà människa.

Exempel 12 Immobilisering av BSA i stärkelsemikrosfärer av höggrenad skjuvad stärkelse och undersökning av bionedbrytbarheten in vivo.

Stärkelsemikrosfärer innehållande BSA tillverkades av höggrenad skjuvad stärkelse med medelmolekylvikten 1930 kDa under följande betingelser: stärkelsen (30%, 100 ml) blandades med PEG (38%, 1466 ml, medelmolekylvikt 20 kDa) och rördes om först i 6 timmar vid 20°C och sedan över natt i 37°C. Dessa administrerades subkutant och intramuskulärt i råtta i en dos av 30 mg i en injektions- vehikel bestående av 0,6% natriumhyaluronsyra (MW 2000 kDa, Kraeber GMBH, Hamburg) och injektionssället prepare- rades för histologisk utvärdering efter 3 och 7 dagar. På dag 3 observerades cellulär infiltration vid injektions- sitet och redan vid dag 7 hade dessa förändringar för- svunnit.

Detta försök visar att stärkelsemikrosfärer tillver- kade av höggrenad skjuvad stärkelse bionedbröts snabbt, aauvo 10 15 20 25 30 35 51 7 6 1 0 50 inom en vecka, in vivo och att vävnaden snabbt normalise- IaS .

Exempel 13 Bestämning av bionedbrytbarheten av stärkelsemikrosfärer 1 gris.

Stärkelsemikrosfärer tillverkades fràn skjuvad stär- kelse med en medelmolekylvikt pà 529 kDa. Stärkelsen väg- des in i 10 mM natriumfosfat, pH 6,4, så att koncentra- tionen efter upplösning blev 30% och PEG 20 med en medel- molekylvikt i samma buffert så att slutkoncentrationen efter upplösning blev 27%. Lösningarna bereddes sedan ge- nom autoklavering. Tillverkningen genomfördes i en IKA- reaktor med Eurostar digital omrörningskontroll (Laba- sco). Vid tillverkningen satsades 14,35 g av stärkelse- lösningen, som varmhàllits vid 50°C efter upplösningen, varefter 200 g av PEG-lösningen tillfördes reaktorn.

Emulsionen bildades genom omrörning vid 160 varv per mi- nut med propeller och efter 8 min justerades omrörnings- hastigheten till 140 varv per minut och efter 5 timmar till 110 varv per minut, och temperaturen ställdes in pà 20°C i 7 timmar och därefter 38°C i 17 timmar. Därefter tvättades de erhållna stärkelsemikrosfärerna (Amicon ult- rafiltreringsenhet 8400) fyra gånger med 300 ml vatten och frystorkades. De torra stärkelsemikrosfärerna sikta- des (siktmaskin Retsch) med 38 och 100 um siktar. Den to- tala mängden stärkelsemikrosfärer som erhölls före sikt- ningen var 3,61 g, vilket mosvarar ett utbyte av ungefär 86% och efter siktningen 2,54 g, vilket motsvarar ett ut- byte av ungefär 59%.

Stärkelsemikrosfärerna resuspenderades i 1 ml 0,11% natriumhyaluronsyra, 4% mannitol, i vatten för injektion och 100 mg mikrosfärer injicerades subkutant i gris. In- jektionssitet preparerades för histologisk utvärdering.

Inga stärkelsemikrosfärer kunde observeras 7 dagar efter injektion. anna: 5 10 15 20 25 30 35 51 7 e 1 o 51 Detta försök visar att stärkelsemikrosfärerna bio- nedbröts snabbt och har försvunnit från injektionssitet inom en vecka.

Exempel 14 Framställning av dragerade stärkelsemikrosfärer inne- hållande hGH i stärkelsemikrosfärer tillverkade av hög- grenad skjuvad stärkelse med temperaturcykling, dragering av dessa och undersökning av deras förmåga att kontrolle- rat frisätta det infångade proteinet efter parenteral ad- ministration på gris.

Stärkelsemikrosfärer innehållande kristallint hGH tillverkades enligt Exempel ll.

De erhållna stärkelsemikrosfärerna belades med ett frisättningsreglerande hölje av PLGA medelst luftsuspen- sionsteknik i enlighet med WO97/14408 med användande av olika sammansättningar av höljet för att erhålla olika frisättningshastigheter. Följande blandningar av PLGA an- vändas; Batch 1 (+) 75% RG5o2H och 25% RG756, Batch 2 ('u_) 60% RG502H och 40% RG756, Batch 3 (_°_) 75% RG504H och 25% Rcvss och Batch 4 ("°') 1oo% RG5o4H.

Farmakokinetiken av hGH undersöktes i grisar vars immunsystems reaktivitet dämpats genom oral tillförsel av cyklosporin A (20 mg/kg), azatioprin (2 mg/kg) och pred- nisolon (2 mg/kg) för att undvika bildning av antikroppar mot det humana tillväxthormonet som skulle kunna påverka farmakokinetiken. De dragerade mikrosfärerna administre- rades subkutant i nacken med en 19G kanyl i en dos av 1,25 mg hGH/kg. För varje formulering studerades fem gri- sar. Blodprover togs ut före injektionen och efter 0,02, 0,04, 0,08, 0,17, 0,25, 0,33 dagar och därefter dagligen tills studien avslutades 29 dagar efter doseringen. Se- rumkoncentrationen av hGH bestämdes. I figur 1 nedan vi- sas medelvärdet för serumkoncentrationen av hGH som er- hölls för de olika formuleringarna. »vasa 10 15 20 51 7 e 1 o 52 FIG. l 25 Ni O I 15- Plasmakoncentration hGH (ng/ml) 'fid(dagafi Försöket visar att stärkelsemikrosfärer dragerade med PLGA efter parenteral administration i gris ger upp- hov till en kontrollerad förlängd frisättning av hGH. De erhållna koncentrationerna av hGH ligger generellt över den nivå, 0,2 ng/ml, som inducerar förhöjda nivåer av in- sulinliknande tillväxtfaktor (IGF-1), som är en indikator pà biologisk effekt, i människa. (Putney, Current Opinion in Chemical Biology 1998, 2:548-552). Exemplet visar ock- så att farmakokinetiken av hGH kan varieras betydligt ge- nom att man varierar sammansättningen av drageringshöl- jet. Exemplet visar dessutom att, jämfört med tidigare tillgängliga parenterala beredningar för förlängd fri- sättning, utomordentligt låg initial frisättning, så kal- lad burst, kan erhållas. Försöket visar också att höga biotillgängligheter kan erhållas generellt, i området 19- 52%, och med en exceptionellt hög andel, 72-96%, i den fas av förlängd frisättning som sker efter den inledande frisättningen, den så kallade ”bursten”. 10 15 20 25 30 35 517 610 53 Analysen av hGH i plasma utfördes enligt Agersö et al. (J. Pharmacol Toxicol 41 (1999) 1-8).

Exempel 15 Följande exempel visar hur man kan optimera en for- mulering för kontrollerad frisättning genom att blanda två olika formuleringar med olika egenskaper.

Stärkelsemikrosfärer innehållande humant tillväxt- hormon tillverkades först enligt Exempel 14, med undanta- gen att den erhållna loadingen för Batch l och Batch 2 var 7,7 respektive 7,6% och Batch 1 dragerades med en enda polymer, RG502H (Boehringer Ingelheim), och fasta partiklar av zinkkarbonat blandades i den coatingemulsion som användes för att skapa den innersta tredjedelen av drageringen, medan Batch 2 dragerades med en polymer- blandning bestående av 75% RG502H och 25% RG756 (Boeh- ringer Ingelheim).

Frisättningen av det i mikrosfärerna inkorporerade proteinet studerades i hypofysektomerade råttor (MOL:Wist). nehållande 0,15% hyaluronsyra, 30 mM natriumfosfatbuffert Mikrosfärerna suspenderades i en lösning in- pH 7,4 innehållande 80 mM NaCl. Djuren injicerades en vo- lym av 200 pl subkutant i nacken med en 18G nål. Fem djur per batch injicerades. Dosen var 750 pg hGH/djur. Blod- prov (250 ul) togs från orbital plexus under koldioxidbe- dövning. Serum togs fram och förvarades under -18°C. Se- rumproverna analyserades på tillväxthormon med hjälp av en specifik tillväxthormon-antikroppsbaserad RIA-metod (Tandhem-R hGH, Hybritech).

Efter det att Batch 1 och 2 hade testats och analy- serats i djurmodellen och en plasmakoncentrationskurva tagits fram, beräknades hur en plasma-koncentrationskurva skulle se ut om man blandade lika delar av Batch 1 och 2.

Värdet plasmakoncentration av de båda batcherna vid varje tid- räknades enkelt ut genom att ta medelvärdet av punkt. Det ovan beskrivna försöket upprepades sedan med en blandning av de båda. Den erhållna plasmakoncentra- 5 1 7 61 o 54 tionskurvan togs fram, vilken har plottats i Figur 2A och 2B. Detta visar att man genom att blanda tvà batcher med olika frisättningskarakteristika pà ett kontrollerat sätt kan erhålla en önskad frisàttningsprofil och koncentra- tion av det biologiskt aktiva ämnet i serum eller plasma.

Claims (24)

10 l5 20 25 30 35 n nan-o 517 610 ss' PATENTKRAV

1. l. Parenteralt administrerbar, bionedbrytbar mikro- partikelberedning innehållande en biologiskt aktiv sub- stans, som är känslig för eller instabil i organiska lös- ningsmedel, varvid beredningen under de första 24 timmar- na efter injektion uppvisar en frisättning av den aktiva substansen som är mindre än 20% av den totala frisätt- ningen, bestämt ur en koncentration-tid-kurva i form av förhållandet mellan area under kurvan under nämnda första 24 timmar och total area under ifrågavarande kurva.

2. Beredning enligt krav 1, vari frisättningen under de första 24 timmarna efter injektionen är mindre än 15%, företrädesvis mindre än 10%, och allra helst mindre än 5% av den totala frisättningen.

3. Parenteralt administrerbar, bionedbrytbar mikro- partikelberedning innehållande en biologiskt aktiv sub- stans, som är känslig för eller instabil i organiska lös- ningsmedel, varvid beredningen under de första 48 timmar- na efter injektion uppvisar en frisättning av den aktiva substansen där den maximala koncentrationen i plasma el- ler serum är mindre än 300% av den maximala koncentratio- nen av den biologiskt aktiva substansen under någon tid- punkt överstigande 48 timmar efter injektion.

4. Beredning enligt krav 3, vari nämnda maximala koncentration är mindre än 200%, företrädesvis mindre än 100%, av nämnda maximala koncentration.

5. Beredning enligt krav 3 eller 4, vilken uppvisar den frisättning som definieras i något av kraven l och 2.

6. Parenteralt administrerbar, bionedbrytbar mikro- partikelberedning innehållande en biologiskt aktiv sub- stans, som är känslig för eller instabil i organiska lös- ningsmedel, vari mikropartiklarna väsentligen består av stärkelse, som har ett innehåll överstigande 85 vikt-% av amylopektin, för vilket minst 80 vikt-% har en medelmole- kylvikt inom intervallet 10-10 000 kDa, vilka har ett aminosyrakväveinnehåll understigande 50pg per g/torrvikt stärkelse och vilka saknar kovalent kemisk tvärbindning 10 15 20 25 30 35 517 610 Sb mellan stärkelsemolekylerna, varvid beredningen uppvisar en frisättning av den biologiskt aktiva substansen där biotillgängligheten av nämnda substans är minst 35% av den biotillgänglighet som erhålles när ifrågavarande sub- stans injiceras intravenöst i löslig form.

7. Beredning enligt krav 6, vari nämnda biotillgäng- lighet är minst 45%, företrädesvis minst 50%, av den biotillgänglighet som erhålles när den biologiskt aktiva substansen injiceras intravenöst.

8. Parenteralt administrerbar, bionedbrytbar mikro- partikelberedning innehållande en biologiskt aktiv sub- stans, som är känslig för eller instabil i organiska lös- ningsmedel, vari mikropartiklarna väsentligen består av stärkelse, som har ett innehåll överstigande 85 vikt-% av amylopektin, för vilket minst 80 vikt-% har en medelmole- kylvikt inom intervallet 10-10 000 kDa, vilka har ett aminosyrakväveinnehåll understigande 50pg per g/torrvikt stärkelse och vilka saknar kovalent kemisk tvärbindning mellan stärkelsemolekylerna, varvid beredningen uppvisar en frisättning av den aktiva substansen karaktäriserad av att i den frisättning som sker under vilken som helst sammanhängande sjudagarsperiod är kvoten mellan den högs- ta koncentrationen av den biologiskt aktiva substansen i serum eller plasma dividerat med medelkoncentrationen un- der nämnda sjudagarsperiod mindre än 5, förutsatt att den valda sjudagarsperioden inte inkluderar de första 24 tim- marna efter injektion.

9. Beredning enligt krav 8, vari nämnda frisättning är mindre än fyra gånger, företrädesvis mindre än tre gånger, allra helst mindre än två gånger.

10. Parenteralt administrerbar, bionedbrytbar mikro- partikelberedning innehållande en biologiskt aktiv sub- stans, som är känslig för eller instabil i organiska lös- ningsmedel, vari mikropartiklarna väsentligen består av stärkelse, som har ett innehåll överstigande 85 vikt-% av amylopektin, för vilket minst 80 vikt-% har en medelmole- kylvikt inom intervallet 10-10 000 kDa, vilka har ett 10 15 20 25 30 35 517 610 5? .nu nu aminosyrakväveinnehàll understigande 50pg per g torrvikt stärkelse och vilka saknar kovalent kemisk tvärbindning mellan stärkelsemolekylerna, varvid beredningen uppvisar en frisättning av den biologiskt aktiva substansen där medeluppehållstiden för nämnda biologiskt aktiva substans är minst fyra dagar.

11. Beredning enligt krav 10, vari nämnda medeluppe- hållstid är minst sju dagar, företrädesvis minst nio da- gar, ännu hellre elva dagar, allra helst minst tretton dagar.

12. Beredning enligt något av de föregående kraven, vari den biologiskt aktiva substansen är ett protein, en peptid eller en polynukleotid, företrädesvis ett protein.

13. Beredning enligt krav 12, vari proteinet är ett rekombinant framställt protein.

14. Beredning enligt något av kraven 12 och 13, vari nämnda substans är ett hormon, företrädesvis humant till- växthormon.

15. Beredning enligt något av kraven 12 och 13, vari nämnda substans är vald bland tillväxtfaktorer, insulin, erytropoietin, interferon d, interferon ß, interferon 7, Faktor VII, Faktor VIII, glukagonliknande peptid 1 eller 2 och C-peptid.

16. Beredning enligt något av kraven 1-5, vari mik- ropartiklarna väsentligen består av stärkelse, som har ett innehåll överstigande 85 vikt-% av amylopektin, för vilket minst 80 vikt-% har en medelmolekylvikt inom in- tervallet 10-10 000 kDa, vilka har ett aminosyrakvävein- nehåll understigande 50 pg per g torrvikt stärkelse och vilka saknar kovalent kemisk tvärbindning mellan stärkel- semolekylerna.

17. Beredning enligt något av kraven 6-16, vari nämnda medelmolekylvikt ligger inom intervallet 100-4000 kDa, företrädesvis 100-1000 kDa.

18. Beredning enligt krav 17, vari medelmolekylvik- ten ligger inom intervallet 200-1000 kDa, företrädesvis 300-600 kDa. 10 15 20 517 610 oc. no 58

19. Beredning enligt något av de föregående kraven, vari den biologiska substansens bioaktivitet är minst 80%, företrädesvis minst 90% och allra helst väsentligen bibehållen, jämfört med den bioaktivitet som substansen uppvisade innan den införlivades i mikropartiklarna.

20. Beredning enligt något av de föregående kraven, vilken är bionedbrytbar in vitro i närvarande av alfa- amylas och/eller amyloglukosidas.

21. Beredning enligt något av de föregående kraven, vilken är bionedbrytbar och elimineras fån vävnad efter subkutan eller intramuskulär administration.

22. Beredning enligt något av de föregående kraven, vilken har ett frisättningsreglerande hölje av minst en filmbildande biokompatibel och bionedbrytbar polymer.

23. Beredning enligt krav 22, vari polymeren är en homo- eller sampolymer innehållande alfa- hydroxisyraenheter.

24. Beredning enligt krav 23, vari alfahydroxisyran är mjölksyra och/eller glykolsyra.