SE501678C2 - Peptid med oxytocinantagonistaktivitet samt farmaceutisk komposition innehållande nämnda peptid - Google Patents

Description

501 678 2 verkningsduration och biotillgänglighet är sådana att även icke parenteral administrering kan tillämpas, såsom vid oral och/eller intranasal tillförsel. Detta ställer speciella krav på molekylernas enzymatiska stabilitet och förmåga att penetrera orologiska membraner, såsom näs- och tarmslemhinna.

En faktor av betydelse för penetrationsförmâgan.är molekylstor- leken. Det är sålunda väl känt att upptaget genom tarmucosa ökar med minskad storlek av molekylen. I WO 92/00996 visas att derivat av baklobshormoner uppbyggda av 8 aminosyror är mer biotillgängliga.efter oral tillförsel änxmotsvarande derivat.med 9 aminosyror. Ett derivat uppbyggt av 7 aminosyror gav emeller- tid beträffande potens och verkningsduration resultat som var jämförbara med den 9 aminosyror långa referenssubstansen, men ca tre gånger sämre resultat än det motsvarande 8 aminosyror långa derivatet.

Peptiden enligt föreliggande uppfinning är uppbyggd av endast 7 aminosyrarester. Den uppvisar god potens samtidigt som den helt oväntat uppvisar en avsevärt längre verkningsduration än någon av de i WO 92/00996 testade molekylerna.

Härvid är förutsättningarna goda för ett högt upptag till blodet efter intranasal eller oral tillförsel. s 'vn' av u i nin en Föreliggande uppfinning omfattar en ny peptid med formeln: Mpa-D-Trp-Ile-alloIle-Asn-a-Abu-(N-Me)Orn-NH2 I ll där Mpa är 3-merkaptopropionsyrarest (-S-CHï43§-CO-) D-Trp är D-tryptofan Ile är isoleucin alloIle är alloisoleucin Asn är asparagin 3' 501 678 är a-aminosmörsyrarest (-NH-$H-CO-) CH2 :m2 a-Abu och (N-Me)Orn är N-metyl-ornitin.

En aspekt av uppfinningen är inriktad pà peptiden enligt uppfinningen till användning som aktiv ingrediens i ett läkemedel.

En annan aspekt av' uppfinningen är inriktad. på farmaceutiska kompositioner, vilka innefattar peptiden enligt uppfinningen som aktiv ingrediens i kombination med farmaceutiskt acceptabla till- satser och/eller spädmedel, jämte eventuellt effektförstärkare (enhancers). Som. farmaceutiskt acceptabelt spädmedel kan före- det gäller övriga farmaceutiskt acceptabla tillsatser så kan sådana hämtas trädesvis isotonisk koksaltlösning användas. När från litteraturen, t ex US Farmakopén, och dessa tillsatser skall väljas i enlighet med den form som kompositionen skall ha för ett specifikt administreringssätt. En komposition enligt uppfinningen kan vara i en administreringsform som är lämplig för intravenös, intranasal eller intraintestinal administrering. En form lämplig för intraintestinal administrering kan vara en tablett som intas oralt och företrädesvis är belaggd med ett skikt som upplöses att den aktiva huvudsakligen i tarmen så ingrediensen kan resorberas genom tarmslemhinnan.

En utföringsform av denna aspekt av uppfinningen är inriktad på en farmaceutisk komposition enligt uppfinningen till användning för terapeutisk behandling av excessiva uteruskontraktioner.

En ytterligare aspekt av uppfinningen är inriktad på sätt att motverka excessiva uteruskontraktioner, tisk vid vilket en farmaceu- komposition enligt uppfinningen administreras i en terapeutiskt effektiv mängd åt en kvinna som är i behov av en sådan behandling. 501 678 4 Peptiden enligt föreliggande uppfinning har en specifik effekt på livmodermuskulaturen och saknar totalt agonisteffekt liksom antidiuretisk effekt och blodtryckseffekt, vilket medför att eventuella kliniska biverkningar minimeras.

Framställning av peptiden enligt uppfinningen 'Peptiden enligt uppfinningen kan framställas genom förfaranden som är analoga med sådana som är kända på peptidområdet.

Exempelvis kan föreningarna enligt uppfinningen framställas på konventionellt sätt genom stegvis koppling av aminosyror till varandra i vätskefas, t ex såsom beskrivits av Law, H.B. & Du Vigneaud, V. i Journal of the American Chemical Society gg, (1960) 4579-4581, Zhuze, A.L., Jost, K., Kasafirek, E. & Rudinger, J. i Collection of Czechoslovak Chemical Communica- tions 22, (1964), 2648-2662, och modifierat av Larsson, L.-E., B Lindeberg, G., Melin, P. / Pliska, V. i Journal of Medicinal Chemistry gl, (1978), 352-356. Kopplingen av aminosyrorna till varandra, varvid s k peptidbindningar bildas, kan också utföras med en fast fas ( i allmänhet harts) som utgångsmaterial till vilket den första aminosyrans C-terminal kopplas, varpå nästa aminosyras C-terminal kopplas till den första aminosyrans N- terminal osv. Ringslutning utförs som sista syntessteg.

Slutligen frisätts den färdiga peptiden från den fasta fasen.

I de nedan angivna exemplen har denna s k fastfasteknik utnyttjats i enlighet med beskrivningen enligt Merrifield, R.B. , J. Am. Chem. Soc. (1963), 25, 2149, Merrifield, R.B. Biochemi- stry (1964), 1, 1385 och König, W., Geiger, R., Chem. Ber. (1970), 121, 788. 1 m tes sk ivnin Den peptid som finns beskriven i exemplen nedan syntetiserades med fastfasteknik (J. M. Stewart, J.D. Young. Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Company). 501 678 Peptiderna renades med vätskekromatografering (reversed.phase).

Den stationära fasen bestod av Kromasilfi, 13 p, 100 Å, Cm (EKA Nobel, Sverige) och den mobila fasen av acetonitril/vatten med 0,1 % trifluoroättiksyra. De fraktioner'som innehöll ren produkt (HPLC analys) slogs samnan, indunstades och produkten frystorka- des ur vatten.

Peptidernas renhet och struktur bestämdes med HPLC, aminosyra- analys och FAB-MS.

Följande förkortningar har använts: TBTU 2-(1-H-bensotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetrametyl-uronium- tetrafluorborat MBHA = 4-metyl-benshydrylamin Boc = t-butyloxikarbonyl Fmoc = 9-fluorenylmetoxikarbonyl NM = N-metylpyrrolidon TFA = Trifluorättiksyra Exempel 1 -m2 cizx-Izcnzco-n-Trp-Ile-allo:le-Asn-NH-cšn-co-n-cn-co-Nnz s auf-ca, cn3 Peptiden syntetiserades enligt en blandad Boo/Fmoc metodik på fast fas. Aktivering av aminosyrorna gjordes med TBTU/HOBt.

Hartset var av MBHA-typ med laddningen 0,65 mmol/g, 0,33 g användes vid varje syntes. Första aminosyran var skyddad med en Boc-grupp, som efter det att aminosyran kopplats till hartset avlägsnades med 50% trifluorättiksyra i diklormetan. Återstoden av syntesen följde Fmoc-strategin, dvs Na-Fmoc skyddade amino- syror bands till den fria aminogruppen på den tidigar inbundna aminosyran. Na-Pmoc-gruppen avlägsnades med 20% piperidin i NMP.

Efter att alla aminosyrorna kopplats till hartset behandlades 501 678 6 detta med 20% piperidin i NMP samt därefter med 50% TFA i diklormetan. Peptidkedjan cykliserades därefter, fortfarande sittande bunden till hartset, från D-Trpz till homoCys(CH¿H§- CO0H)5 genom aktivering med TBTU/HOBt. Peptiden klövs från hartset med flytande fluorväte-tiokresol-kresol-dimetylsulfid i förhållandet 8-0,25-0,75-1 vid 0°C. Efter indunstningen av fluorvätet suspenderades hartset i dietyleter, filtrerades och tvättades med ytterligare dietyleter. För att utvinna peptiden ifrån hartset lakades detta med ättiksyra. Ãttiksyran indunsta- des och återstoden frystorkades ur vatten. Den frystorkade produkten löstes i etanol varefter hydrazinhydrat tillsattes i molärt överskott. Lösningen omrördes över natt vid rumstempera- tur varefter den surgjordes med H§Y och indunstades och frys- torkades från vatten. Produkten renades enligt ovan. Utbyte: 4 mg. Renhet (HPLC) = 95%.

FARMAKQLO§I§KA FQR§QK In vivo försök, råtta Sprague Dawley råttor (250 g) i naturlig östrus nedsövdes med Inaktin (0,5 mg/100 g kroppsvikt i.p.). Myometriets aktivitet mättes med hjälp av en kateter som fixerats i uteruskaviteten och som var fylld med modifierad Locke's-lösning. Katetern anslöts till en Statham P23d tryckgivare och kontraktionerna registrerades på en Grass-polygraf (modell 7D). a onis ° ö h'b'to Dose I.D. . [I.D. = den anta- gonistdos, som hämar en agonistdos (2 x) till en. effekt motsvarande effekten för halva agonistdosen (x)].

Härvid utföres först en dos-effektkurva för oxytocin (2-104 - ~10¿ pmol/kg). En oxytocindos (2 x) utväljes som ger en effekt motsvarande ett intraluminärt kontraktionstryck av 10-30 mm Hg och som ligger på den linjära delen av doseffektkurvan.

Effekterna mätes som nettovärdet av den integrerade kurvan mätt under 15 min efter injektionen. 501 678 7 Man beräknar därefter effekten (eff x) av agonisten för dess halva dos (x). Därefter injiceras minst två doser antagonist (Peptid 1-4) i kombination med agonistdosen 2 x. Genom inter- polering av doseffektkurvan för hämningen erhålles den anta- gonistdos som motsvarar effekten (eff x) av agonistdosen (x), dvs I.D. dosen. Resultaten visas i Tabell I.

Agonistförsök, effektduration. (Duration, min 6.75) En dos av agonisten utväljes (5-104 - 5~l0¿ pmol/kg) som ger en effekt (effekten mätes under en 15 min period efter agonist- resp anta- gonisttillförsel varvid kontraktionskurvan integreras) motsva- rande ca 50% av maximal effekt (Ebw). r Därefter ges en dos av antagonisten (Peptid 1-3) 0,8 - 4-10* mol/kg, som i kombination med agonistdosen ger en minst 50% hämning av effekten av enbart agonistdosen. Därefter injiceras med.20 min intervall enbart agonistdosen varvid hämningseffekten successivt avtar.

Genom interpolering erhålles tiden från administreringen av hämmare till dess hämningen avtagit till 75% av agonisteffekten.

Resultaten visas i Tabell I. 501 678 TABELL I Farmakologiska data för oxytocinantagonister In vivo råtta Testsubstans ID nmol/kg Duration, min 0,75 Peptid 1 (ref.) , 1 0,8 29 1 5 Peptid 2 (ref.) , 1 , 140 1 19 Peptid 3 (enl.uppf.) 3,6 1 0,6 - 248 1 29 Peptid 1 (ref.) = Peptid enligt EP 0 112 809 med formeln Mpa-D-Tyr(Et)-Ile-Thr-Asn-Cys-Pro-Orn-Gly-NH2 L. J Peptid 2 (ref.) = Den av de testade peptiderna som enligt WO 92/00996 har den längsta durationen, med formeln Mpa-D-Phe(p-Et)-Ile-Thr-Asn-a-Abu-Pro-Orn-NH2 L J Peptid 3 (enl. uppf.) = Peptiden enligt uppfinningen.med formeln Mpa-D-Trp-Ile-alloI1e-Asn-a-Abu-(N-Me)0rn-NH2 L J Ur Tabell I framgår att Peptid 3 enligt uppfinningen har en avsevärt förlängd verkningsduration med bibehållen potens, jämfört med referenssubstanserna Peptid 1 resp. Peptid 2.

Claims (7)

501 678 EAIENIEBAX

1. Peptid, k ä n n e t e c k n a d därav, att den har formeln Mpa-D-Trp-Ile-alloIle-Asn-a-Abu-(N-Me)Orn-NH2 där Mpa är 3-merkaptopropionsyrarest (-S-CH2-CH2-CO-) D-Trp är D-tryptofan Ile är isoleucin allolle är alloisoleucin Asn är asparagin a-Abu är d-aminosmörsyrarest (-NH-CH-CO-) CH, (EH, och I (N-Me)Orn är N-metyl-ornitin.

2. Peptid enligt kravet 1, k ä n n e t e c k n a d därav, att den är till användning som aktiv ingrediens i ett läkemedel

3. Farmaceutisk komposition, k ä n n e t e c k n a d därav, att den innefattar peptiden enligt kravet l som aktiv in- grediens, tillsammans med farmaceutiskt acceptabla tillsatser och/eller spädmedel, och eventuellt effektförstärkare. 501 678 m

4. Farmaceutisk komposition enligt kravet 3, k ä n n e t e c k n a d därav, att den är i en admini- streringsform som är lämplig för intranasal administrering.

5. Farmaceutisk komposition enligt kravet 3, k ä n n e t e c k n a d därav, att den är i en admini- streringsform som är lämplig för intravenös administrering.

6. Farmaceutisk komposition enligt kravet 3, k ä n n e t e c k n a d därav, att den är i en admini- streringsform som är lämplig för intraintestinal administrering.

7. Farmaceutisk komposition enligt något av kraven 3 - 6, k ä n n e t e c k n a d därav, att den är till användning för terapeutisk behandling av excessiva uteruskontraktioner.