SE465907B

SE465907B - Diagnosticeringsmedel innehaallande en paramagnetisk metall

Info

Publication number: SE465907B
Application number: SE8405499A
Authority: SE
Inventors: T Jacobsen
Original assignee: Nyegaard & Co As
Priority date: 1984-11-01
Filing date: 1984-11-01
Publication date: 1991-11-18
Also published as: NO168928C; JPS61155337A; NO854348L; JPH0667854B2; ATE54416T1; SE8405499D0; DE3578647D1; NO168928B; DK499985A; EP0186947A1; US4986980A; EP0186947B1; DK499985D0; SE8405499L; DK167998B1

Description

wn 15 20 25” 30 35 465 9Ü7 vis liten molekylstorlek är emellertid inte väsentligt för- bättrad i jämförelse med oorganiska paramagnetiska salters.

Komplex omfattande en paramagnetisk metall och ett pro- tein, såsom en antikropp, uppenbaras av DE-A1-3 401 052.

I jämförelse med ovan nämnda enkla organiska komplex med låg molekylstorlek uppvisar sådana komplex förbättrad. effekt. med åtskilliga nackdelar.

Emellertid är användningen av proteiner belastad Proteiner är substanser med mycket komplicerad struktur och har i allmänhet begränsad stabilitet och användbarhet.

Sålunda är de svåra att formulera i lösning och de bör inte utsättas för värmebehandling, vilket innebär att diagrßtkærnmß- medel innehållande proteiner inte kan steriliseras med an- vändning av värme.HåUbaﬁæ$stiden för sådana diagnosticerings- medel blir begränsad och.proteinerna utövar ofta en egen effekt som inte är önskvärd i samband med den diagnostiska undersökningen. .Möjligheterna att välja material till olika diagnostiska syften eller material med önskat utsöndringssätt och önskad elimineringshastighet från kroppen av ett djur (inkl- mäﬂHiSROrl är också begränsade.

Ett ändamål med föreliggande uppfinning är att åstadkomma ett nytt diagnosticeringsmedel innehållande en paramagnetisk metall, vilket diagnostiqeringsmedel är mer effektivt än para- magnetiska kelat med låg molekylvikt.

Ett annat ändamål med föreliggande uppfinning är att åstadkomma ett diagnosticeringsmedel innehållande en paramag- netisk metall, vilket diagnosticeringsmedel är baserat på väl dokumenterade polymera föreningar med enkel struktur och vil- ket exempelvis lätt kan formuleras och har god hållbarhetstid och är väl tolererbart. _ Ytterligare ett ändamål med föreliggande uppfinning är att åstadkomma ett diagnosticeringsmedel innehållande en para- ; magnetisk metall och vars distribution och eliminering lätt kan varieras med användning av polymerer med olika molekyl- vikter och modifierade strukturer.

Dessa och andra ändamål uppnås i enlighet med föreliggan- de uppfinning genom ett diagnosticeringsmedel av det inlednings- 10 15 20 25 30 35 465 907 vis nämnda slaget, vilket har de i krav 1 angivna känneteck- Ilen .

(I det följande kommer den del av den makromolekylära produkten som består av det polymera eller polymeriserade kol- hydratet eller den polymeriseradeíf sockeralkoholen eller derivatet därav att hänvisas till såsom "den'makromolekylära produktens grundmolekyl".- Uttrycket "polymert kolhydrat" såsom det ge- nomgående användes i beskrivningen och i kraven betecknar en naturligt förekommande polymer uppbyggd av kolhydratmonomerer.

Uttrycket "polymeriserat kolhydrat", såsom det gaxmgàaxkaanvän- des i beskrivningen och i kraven betecknar en syntetisk poly- -mer erhållen genom polymerisation av kolhydratmolekyler, even- tuellt med hjälp av åtminstone bifunktionella kopplings- eller tvärbindningsmedel. På liknande sätt används uttrycket "polymeriserad sockeralkohol" för att beteckna en syntetisk polymer erhållen genom polymerisation av sockeralkoholmoleky- ler, eventuellt med hjälp av åtminstone bifunktionella kopp- lings- eller tvärbindningsmedel.) En av nämnda makromolekylära produkts fördelar är att makromolekylernas molekylstorlek lätt kan väljas för att passa olika behovj_NM- och ultraljudundersökningar för diagnostiska ändamål. I allmänhet väljes en medelmolekylvikt (ﬁw) för nämnda produkt av åtminstone 1000, företrädesvis åtminstone 3000.

Den fysiologiskt tolererbara, vattenlösliga, hydroxylgnqmr haltiga, makromolekylära produkten kan exempelvis vara baserad på en vattenlöslig polysackarid såsom en glukan, t.ex. stär- kelse, amylos, amylopektin (inkl. makromolekylära dextriner därav), glykogen, dextran och pullulan, eller en fruktan, t.ex. inulin och levan, eller någon annan fysiologiskt tole- rerbar, vattenlöslig polysackarid av vegetabiliskt, mikro- biellt eller animalt ursprung.

Exempel på polymeriserade kolhydrater eller sockeralkoho- ler, vilka kan utgöra grunden i de makromolekylära produkterna 10 15 20 25 30 35 465 907 enligt föreliggande uppfinning är s.k. polyglukos, vilken er- hålles genom polymerisation av glukos, och vattenlösliga makro- molekylära produkter erhållna genom tvärbindning av kolhydra- ter eller sockeralkoholer (t.ex. mannitol eller sorbitol) med åtminstone ett bifunktionellt tvärbindningsmedel, t.ex. med epiklorhydrin, en diepoxid eller motsvarande halogenhydrin eller med ett bifunktionellt acyleringsmedel. Ett exempel på en sådan produkt, vilken är kommersiellt tillgänglig, är Ficoll som erhålles genom tvärbindning av sukros med hjälp av epi- klorhydrin (se t.ex. SE-B-209 018 och US-A-3 300 474).

Ytterligare exempel på substanser vilka kan utgöra grun- (från Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Sverige), den till den makromolekylära produkten i enlighet med uppfin- ningen är vattenlösliga, fysiologiskt tolererbara derivat av ovan nämnda polysackarider, exempelvis hydroxialkyl-, karboxi- alkyl-, acyl- eller alkylderivat, t.ex. hydroxietyl-, dihydroxi- propyl-, karboximetyl-, acetyl- eller metylderivat, av nämnda polysackarider. Vattenlösliga derivat av olösliga polysacka- rider (t.ex. av cellulosa, exempelvis för undersökning av mag- tarmkanalen) är även av intresse för detta ändamål.

De mißtanser som ifrågakommer som grunden till den makro- molekylära produkten är kommersiellt tillgängliga eller utför- ligt beskrivna i litteraturen. Fraktioner av önskad molekyl- vikt erhålles genom konventionella metoder.

Den makromolekylära produkten väljs i enlighet med den avsedda användningen för diagnosticeringsmedlet. Sålunda kan exempelvis en produkt som inte är nedbrytbar i kroppen väljas för undersökning av kroppshåligheter med utförselgångar utåt, t.ex. mag-tarmkanalen. Produkter,vilka inte är nedbrytbara i kroppen, kan även användas för parenteral administrering förutsatt att makromolekylernas molekylstorlek inte väljs större än att de kan utsöndras med urinen. Produkter som är nedbrytbara i kroppen till mindre utsöndringsbara fragment, kan väljas exempelvis för parenteral administrering när det är önskvärt att makromolekylernas molekylstorlek är så stor att de inte utsöndras med urinen. Exempelvis kan makromole- kylerna vara enzymatiskt nedbrytbara med hydrolaser, t.ex. endohydrolaser, vilka hydrolyserar glykosidiska bindningar f? 10 15 20 25 30 35 465 907 i makromolekylerna. Exempelvis väljs i enlighet med en spe- ciellt lämplig utföringsform av uppfinningen makromolekyler, vilka är nedbrytbara av a-amylas. I detta fall användes makro- molekyler baserade på stärkelse och andra polysackarider, vil- ka är nedbrytbara av a-amylas, och nedbrytbara derivat därav.

Sålunda väljs inte substitutionsgraden hos sådana derivat hög- re än att derivatet är nedbrytbart, dvs. medelsubstitutions- graden är ofta mindre än 0,6 och företrädesvis mindre än 0,5 (dvs. mindre än en substituent per 2 glukosenheter), exempel- vis mindre än 0,3 eller 0,2.

Makromolekylerna kan vara neutrala eller ha en negativ eller positiv nettoladdning i lösning. För parenteral använd- ning är makromolekyler med ingen nettoladdning eller en nega- tiv nettoladdning i lösning föredragna. En negativ nettoladd- ning erhålles exempelvis genom att införa karboxylgrupper el- ler andra negativt laddade grupper i makromolekylerna, om så- dana grupper inte redan är närvarande i makromolekylerna.

Såsom nämnts ovan är det möjligt att välja den mest lämp- liga molekylstorleken på makromolekylerna för varje diagnos- tisk undersökning som skall utföras. Molekylvikten Ü* kan exempelvis vara i omrâdet J 000 till 10 000 000, t.ex. inom området 3 000 till 1 000 000. att makromolekylerna (utan föregående nedbrytning) skall ut- Exempelvis när det är önskvärt söndras med urinen efter parenteral administrering är molekyl- vikten företrädesvis mindre än 40 000, exempelvis mindre än 30 000 eller mindre än 20 000,och när det är önskvärt att de inte skall snabbt utsöndras med urinen är molekylvikten före- trädesvis högre än 40 000, exempelvis högre än 50 000 eller högre än 70 000 eller högre än 90 000. För parenteral använd- ning är molekylvikten för makromolekylerna i de flesta fall lägre än 500 000, exempelvis lägre än 300 000 eller lägre än 200 000 eller lägre än 100 000 (t.ex. inom området 1 000 till 200 000 eller inom området 3 000 - 100 000). För mag-tarm- kanalen kan ett vitt molekylviktsområde väljas, exempelvis molekylvikter högre än 1 000 och lägre än 10 000 000, men i de flesta fall högre än 3 000 och lägre än 1 000 000, t.ex. inom området 5 000 till 500 000.

A465 907' 10 15 20 25 30 35 För exempelvis mag-tarmkanalen är det möjligt att välja alla de makromolekylära produkter som nämnts ovan, medan för parenteral användning exempelvis makromolekyler baserade på glukaner med d-glykosidiska bindningar (t.ex. stärkelse, dex- tran eller pullulan) eller fruktaner med ß-glykosidiska bind- ningar (t.ex. inulin eller levan) är speciellt föredragna.

Den icke-radioaktiva, paramagnetiska metallen väljes företrädesvis från elementgruppen med atomnummer 21-29, 42, 44 och 57-70, varvid element med atomnummer 24-29 eller 62-69 är speciellt föredragna. Exempel på lämpliga lantanider är gadolinium, europium, dysprosium, holmium och erbium. Exem- pel på andra lämpliga element är mangan, järn, nickel krom och.koppar.H Märkatomen av paramagnetisk metall är kemiskt bunden i den makromolekylära produkten.. Det polymera eller polymerise- rade kolhydratet eller den polymeriserade sockeralkoholen el- ler derivatet därav har (ursprungligen närvarande) metallbin- dande strukturer eller har försetts med metallbindande struk- Det är.välkänt att ett stort antal strukturer binder metaller av'de-typer som är av turer för den metall som skall.bindas.

Sådana strukturer införesflätt i polymera eller polymeriserade.kolhydrat eller polymerisera-- de sockeralkoholer eller derivat därav om de inte redan är när- intresse i detta sammanhang. varande i dessa makromolekyler. Exempelvis har olösliga så- dana produkter använts för att extrahera tungmetalljoner från vattenlösningar eller för att binda metalliska radionuklider.

För att säkerställa att den paramagnetiska metallen i diagnos- ticeringsmedlet enligt uppfinningen är fast bunden till den makromolekylära pordukten, är den bunden i en kelatkomplex- struktur.. Många grupper är kända vilka binder metalljoner i kealtkomplex, i vilka komplex metallen kan ingå t.ex. i en 4-, 5- eller 6-ledig ring innehållande nämnda metall och två metall- 'koordinerande atomer.

Företrädesvis innehåller kelatkomplexet åtminstone tvâ 5- eller 6 lediga ringar innehålalnde metallen, speciellt fyra till åtta 5- eller 6-lediga ringar. Sådana 5- och 6- lediga ringar innehåller metallen och tvâ metallkoordinerande 10 15 20 25 30 35 465 907 atomer skilda från varandra genom två respektive tre atomer.

I enlighet med en annan aspekt är företrädesvis en av de metallkoordinerande atomerna en kväveatom och den andra en kväveatom, en svavelatom eller en syreatom. Kväveatomen kan exempelvis vara kväveatomen i en amino-, imino- eller nitril- grupp. Svavelatomen kan exempelvis vara svavelatomen i en merkapto-, tioeter- eller tionogrupp. vis vara syreatomen i en keto-, karboxylat-, sulfonat-, sulfat-, fosfonat-, fosfat-, nitrat-, hydroxyl- eller etergrupp. De metallkoordinerande atomerna ingår i kelatbildande grup- per, vilka företrädesvis innehåller åtminstone tvâ sekvenser, som kan vara lika eller olika och vilka förutom de metall- koordinerande aümernazüunhåller 2 eller 3 kolatomer (vid 5- respektive 6-lediga ringar i kelatkomplexet), varvid eventuellt Syreatomen kan exempel- en av kolatomerna kan vara ersatt med en syre- eller svavel- eller kväveatom. Exempelvis kan de kelatbildande grupperna ha den allmänna formeln -N-[(CH2)n-N]m-R3 R] R2 i vilken n är 2 eller 3, m är ett helt tal 1, 2, 3 eller högre, i allmänhet lägre än JOOO, t.ex. lägre än 100 eller lägre än 50 såsom 1-50, eller 2-6, och RJ, R2 och R3, vilka kan vara lika eller olika, vardera representerar en väteatom eller en grupp -CH2-COOH eller -CH2-CH2-COOH. ve karboxietylgrupperna kan vara ersatta med sulfcmetyl- res- pektive sulfoetyl-, fosfometyl- respektive fosfoetyl-, amino- Karboximetyl- respekti- etyl- respektive aminopropylgrupper eller andra ekvivalenta grupper . _ De kelatbildande grupperna kan bindas kovalent till hyd- roxylgrupper i det polymera eller polymeriserade kolhydratet eller den polymeriserade sockeralkoholen eller derivatet där- av genom i och för sig kända metoder. Exempelvis när man an- vänder en aminopolykarboxylsyra, såsom etylendiamintetraättik- syra (EDTA), dietylentriaminpentaättiksyra (DTPA) eller tri- etylentetraaminhexaättiksyra (TTHA) eller N-hydroxietyl- etylendiamintriättiksyra (HEDTA), för att införa kelatbildande 10 15 20 25 30 35 465 907 grupper kan en karboxylgrupp i nämnda syror användas för att åstadkomma en esterbindning till den makromolekylära produk- tens grundmolekyl genom reaktion i närvaro av en karbodiimid eller ett annat kopplingsmedel. En anhydrid eller syrahalid av sådana polykarboxylsyror kan även användas. En aminopoly- karboxylsyra innehållande en primär eller sekundär aminogrupp kan reageras med en makromolekylär substans innehållande kar- boxylgrupper till bildning av en amidbindning med användning av konventionella metoder för att åstadkomma sådana bindning- ar.

Reaktiva grupper kan även införas i den makromolekylära produktens grundmolekyl, t.ex en polysackarid, på i och för sig känt sätt och sedan reageras med tiol- eller aminogrupper eller andra nukleofila delar i den substans som användes för att införa kelatbildande grupper. Exempel på sådana grupper är aldehyd- och ketogrupper, halogenacetyl-, azid-, isocyanat-, isotiocyanat-, s-triazinyl- och divinylsulfongrupper, kolsyra- estergrupper, imidokolsyraestergrupper (bildade genom brom- cyanaktivering), Qxirangrupper och grupper som lätt kan om- vandlas till oxiranderivat och reaktiva disulfider. Å andra sidan möjliggör aktivering av hydroxylgrupper i den makromole- kylära produktens grundmolekyl med en bas en reaktion med elektrofila delar i den substans som används för att införa kelatbildande grupper.

Den fullständiga kelatbildande gruppen kan bindas direkt till den makromolekylära produktens grundmolekyl eller kan byggas upp successivt genom att binda ett utgångsmaterial för nämnda grupp till nämnda grundmolekyl och sedan modifiera nämnda utgångsmaterial kemiskt. Exempelvis kan en förening med den allmänna formeln HZN-[(CH2)n-NH]m-H, i vilken m och n definieras som ovan, först bindas till nämnda grundmolekyl genom i och för sig kända metoder, varefter aminogrupperna kan karboximetyleras eller karboxietyleras i önskad utsträck- ning.

Om så önskas kan en bryggbildande grupp införas mellan de kelatbildande grupperna och den makromolekylära produktens grundmolekyl på i och för sig känt sätt. 'n 10 15 20 25 30 35 465 907 Den paramagnetiska metallen kan införas i den makromole- kylära produkten genom att reagera den makromolekylära mellan- produkt som innehåller kelatbildande grupper med ett överskott av ett vattenlösligt salt av den paramagnetiska metallen i vattenhaltig lösning vid lämpligt pH-värde, vanligen 2-7, t.ex. 5-6. Rening utföres t.ex. genom dialys, ultrafiltrering eller fällning och isolering genom filtrering, indunstning eller frystorkning.

Såsom nämnts ovan kan den makromolekylära produkten i lösning ha en laddning, vilken har en fysiologiskt gOdt&g~ bar motjon. Exempel på lämpliga katjoner i detta sammanhang är natrium- och kaliumjonerna och katjonerna av icke-toxiska aminer såsom tris(hydroximetyl)aminometan, etanolamin, di- etanolamin och N-metylglukamin. Exempel på användbara an- joner är kloridjonen och anjonen av icke-toxiska organiska syror.

Diagnosticeringsmedlet enligt uppfinningen kan exempel- vis vara i form av en lösning av den fysiologiskt tolererbara, vattenlösliga, hydroxylgrupphaltiga, makromolekylära produkten i ett vattenhaltigt medium eller vara i torr form, t.ex. i frystorkad form eller som ett pulver eller tabletter eller i kapslar. Tabletterna kan vara av den typ som löses i vatten före administrering eller också kan tabletterna vara av den typ som avses att bli administrerad oralt och lösas i mag- tarmkanalen, eventuellt med fördröjd upplösning.

För parenteral administrering användes en lösning i ett sterilt fysiologiskt godtagbart medium, t.ex. en isotonisk vattenhaltig lösning. För oral eller rektal administrering användes en lösning i ett fysiologiskt godtagbart medium, t.ex. en vattenhaltig lösning, eventuellt innehållande visko- sitetsökande substanser. De vattenhaltiga lösningarna kan justeras till det önskade pH-värdet med hjälp av en fysiolo- giskt godtagbar buffert. Även andra tillsatser vilka sedvanligen användes inom den farmaceutiska industrin kan tillsättas vid de olika formule- ringarna; exempelvis kan arommedel och färgämnen införlivas i kompositioner för oral användning.

Koncentrationen av den paramagnetiska metallen i diagnos- ticeringsmedlet blir beroende på administreringsformen och de 10 15 20 25 30 35 10 465 907 speciella organ eller vävnader som skall studeras. I allmän- 6 till 10 mmol av den paramagnetiska metallen per kg kroppsvikt, före- till 1o'1 Metallhalten 1 den makromolekylära produkten är i allmänhet 0,001 - 30 vikt-%, het kommer de totala doserna att ligga i området 10- trädesvis omkring 10-3 mmol/kg. företrädesvis mer än 0,01 vikt-%, t.ex. mer än 0,1 vikt-% och exempelvis mindre än 20 vikt-% eller mindre än 10 vikt-% räk- nat på den makromolekylära produktens totala vikt i form av torr substans.

Den makromolekylära produktens koncentration i en lösning att användas i NMR- eller ultraljuddiagnos är vanligen större än 0,01 vikt-%, exempelvis större än 0,1 vikt-%, t.ex. större än 1 vikt-% och mindre än 35 vikt-%, exempelvis mindre än 25 vikt-%, t.ex. mindre än 15 vikt-% beräknat på lösningens tota- la vikt. Exempelvis ligger koncentrationen i området 1-15 vikt-% beräknat på lösningens totala vikt.

Diagnosticeringsmedlet i enlighet med uppfinningen kan användas i NMR-avbildning på grund av att den makromolekylära produkten minskar relaxationstiderna. Det kan även användas i NMR-undersökningar på grund av nämnda produkts effekt på de kemiska skiften eller det kan användas i ultraljudundersök- ningar beroende på inverkan på ljudhastigheten.

Uppfinningen avser även en diagnosticeringsmetod vilken Omfattar administrering av en verksam mängd av ett diagnosti- ceringsmedel enligt uppfinningen till ett djur (inkl. männi- skorl och undersökning av djurkroppen med användnhr;av“Nm-eller ultraljudteknik.

Uppfinningen kommer nu att belysas ytterligare med hjälp av ett antal utföringsexempel.

Följande förkortningar används i exemplen: dimetylsulfoxid DMSO = DTPA = dietylentriaminpentaättiksyra O DTPP = dietylentriaminpentafosfonsyra = EDTA = etylendiamintetraättiksyra TTHA = trietylentetraminhexaättiksyra SRRE = relaxationshastighetsökning (specific relaxation rate enhancementï WS = löslighet i vatten 10 15 20 25 30 35 11 465 907 Éxempel 1 1,0 g trietylentetraminhexaättiksyra 4-dimetylaminopyridin sattes till en lösning av 2,0 g dextran med medelmolekylvikt (HQ) 40 000 (Dextran T 40, från Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Sverige) i torr dimetylsulfoxid (DMSO). 1,9 g N-(3-dimetylaminopropyl)-N'-etylkarbodiimid- hydroklorid tillsattes och lösningen rördes i 22 tim vid rums- Under tillsats av 100 ml destillerat vatten kyl- (TTHA) och 100 mg temperatur. des lösningen i ett isvattenbad. Lösningen rördes i 30 min och pH-värdet justerades till 6,3. En lösning av 0,40 g MnCl2-4H2O i 20 ml destillerat vatten tillsattes. justerades till 5,8 och blandningen rördes i 30 min.

Lösningen dialyserades mot 0,9 % NaCl till dess de ut- pH-värdet vändiga lösningarna var fria från paramagnetiska föreningar (omkring 5 dagar), följt av dialys med destillerat vatten.

Vattenlösningen indunstades och produkten torkades i vakuum vid 50oC. 2,5 g vita flagor innehållande 0,25 % (w/W) Mn erhölls. Löslighet i vatten (WS) > 50 mg/ml.

Specifik relaxationshastighetsökning (SRRE) mättes i en blMR- protonspinnanalysator (RADX Corp., Houston, Texas, USA) vid 10 MHz i glycerol : vatten (1:2,13) (v:v) vid 37OC: 5,5 s_1 I Exempel 2 1,0 g TTHA och 100 mg 4-dimetylaminopyridin sattes till en lösning av 2,0 g dextran ﬁw 40 000 (Dextran T 40, från Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Sverige) i 200 ml torr DMSO. 1,9 g N-(3-dimetylaminopropyll-N'-etylkarbodiimid- hydroklorid tillsattes och lösningen rördes i 22 tim vid rums- temperatur. Under tillsats av JOO ml destillerat vatten kyl- des lösningen i ett isvattenbad. Lösningen rördes i 30 min och pH-värdet justerades till 6,3. En lösning av 0,76 g GdCl3-6H2O i 20 ml destillerat vatten tillsattes, justerades till 5,8 och blandningen rördes om i 30 min. pH-värdet Pro- dukten renades och isolerades såsom beskrivits i exempel 1. 2,4 g vita flagor innehållande J,0 % (w/w) Gd erhölls.

WS > 50 mg/ml. SRRE 9,0 s_1 mM_1. 10 15 20 25 30 35 12 465 907 âxempel 3 1,4 g av bisanhydriden av dietylentriaminpentaättiksyra (DTPA), framställd från DTPA i enlighet med den metod som be- (1975) 704 av W.C. Eckelman gt al., sattes till en lösning av 2,0 g dextran, ﬁw 70 000 (Dextran T 70, från Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, skrivits i J. Pharm. Sci. 64, Sverige) i 100 ml torr DMSO under omrörning vid rumstempera- tur. Blandningen rördes om vid rumstemperatur i 20 tim, kyl- des i ett isvattenbad och 100 ml destillerat vatten tillsattes efter hand. en rördes om i 7 tim och pH-värdet justerades till 6,5. En lösning av 0,85 g MnCl2-4H2O i 20 ml destillerat vatten till- sattes, pH-värdet justerades till 5,7 och lösningen rördes om Isvattenbadet avlägsnades och reaktionsblandning- i 30 min. Produkten renades och isolerades såsom beskrivits 3,0 g vita lätt gula flagor innehållande 4,7 % ws > 50 mg/ml. sRRE 7,7 s* ml/Fï. i exempel 1.

(W/w) Mn erhölls. Éxempel 4 DTPA bands till dextran, EQ 70 000 (Dextran T 70, från Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Sverige) såsom beskri- vits i exempel 3, vilket gav en lösning av DTPA-dextran.

En lösning av 1,16 g FeCl3-6H2O i 20.ml destillerat vat- ten sattes till lösningen av DTPA-dextran vid ett pH-värde av 6,5, pH-värdet justerades till 5,7 och lösningen rördes om i 30 min. Produkten renades och isolerades såsom beskrivits i 4,0 g ljusbruna transparenta flagor innehållande WS > 50 mg/ml. 1 -1 exempel 1. 4,6 % (w/w) Fe erhölls. sRRE 5,0 s' mm . gxempel 5 En lösning av 1,80 g GdCl3-6H2O i 20 ml vatten sattes till en lösning av 2,0 g dextran, MW 70 000 (Dextran T 70, från Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Sverige) i 100 ml destillerat vatten vid ett pH-värde av 5,8. pH-värdet juste- Produkten 1,7 g färglösa transparenta flagor innehållande 0,7 % (w/W) Gd er- hölls. ws > so mg/ml. sRRE n,2 5"] mlfj. rades till 5,8 och lösningen rördes om i 30 min. renades och isolerade såsom beskrivits i exempel 1. 10 15 20 25 30 35 13 465 907 Exempel 6 DTPA bands till dextran, MW 70 000 (Dextran T 70, Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Sverige) såsom beskri- från vits i exempel 3, vilket gav en lösning av DTPA-dextran.

En lösning av 1,6 g GdCl3-6H2O i 20 ml destillerat vatten sattes till lösningen av DTPA-dextran, pH-värdet justerades till 5,7 och lösningen rördes om i 30 min. Produkten renades 3,2 g färglösa WS > 50 mg/ml. och isolerades såsom beskrivits i exempel 1. flagor innehållande 4,7 % (w/w) Gd erhölls. sRRE 8,3 s* m4. Éxempel 7 3,0 g dietylentriaminpentafosfonsyra (DTPP) framställd i enlighet med den metod som beskrivits i J. Org. Chem. 31 (1966) 1603 av K. Moedritzer och R.R. vatten. 0,95 g Gd2O3 tillsattes och blandningen âterlopps- Blandningen kyldes och Gd-DTPP-komplexet Irani löstes i 60 ml kokades i 3 tim. fälldes ut och isolerades genom filtrering och torkades. 1,1 gêﬂïåßtiïﬂïä komplexet och 100 mg 4-dimetylamino- 70 000 (Dextran T 70, från Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Sverigel i 200 ml torr DMSO.

N'-etyl-karbodiimidhydroklorid tillsattes och lösningen rör- Under tillsats av 100 ml Pro- pyridin sattes till en lösning av 2,0 g dextran EQ 2,5 g N-(3-dimetylaminopropyl)- des om i 22 tim vid rumstemperatur. destillerat vatten kyldes lösningen i ett isvattenbad. dukten renades och isolerades såsom beskrivits i exempel 1. 2,1 g vita flagor innehållande 1,0 % (w/W) Gd erhölls. ws > 50 mg/ml. sRRE 0,9 ef] mr/fï. åxempel 8 DTPA bands till 2,0 g dextran, ﬁw 2-10 från Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Sverige) såsom be- 6 (Dextran T 2000, skrivits i exempel 3, vilket gav en lösning av DTPA-dextran, En lösning av 0,86 g FeCl2-4H2O i 20 ml destillerat vat- ten sattes till lösningen av DTPA-dextran vid pH 6,5, pH-vär- det justerades till 5,7 och lösningen rördes om i 30 min.

Produkten renades och isolerades såsom beskrivits i exempel 1. 10 15 20 25 30 35 14 465 907 3,3 g gula till bruna flagor innehållande 3,6 % (w/w) Fe erhölls. ws > so mg/ml. SRRE 2,0 s'1 mM'1.

Exempel 9 DTPA bands till 2,0 g aextran ñ¿ 2-106 (nextran T zooo, från Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Sverige) såsom be- skrivits i exempel 3, vilket gav en lösning av DTPA-dextran.

En lösning av 1,08 g Cw¶%¿5H2O i 20 ml destillerat vat- ten sattes till lösningen av DTPA-dextran vid pH 6,5, pH-vär- det justerades till 5,7 och lösningen rördes om i 30 min.

Produkten renades och isolerades såsom beskrivits i exempel 1. 3,5 g1ﬂå.flm¥m~innehållande 5,2 % (w/w) Cu erhölls. WS > 25 mg/ml. SRRE 0,6 s_1 mM_1.

Exempel 10 DTPA bands till 2,0 g dextran, HQ 2-106 (Dextran T 2000, från Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Sverige) såsom be- skrivits i exempel 3, vilket gav en lösning av DTPA-dextran.

En lösning av 1,66 g ErCl3 (innehållande 40 % vatten) i 20 ml destillerat vatten sattes till lösningen av DTPA-dextran vid pH 6,5, pH-värdet justerades till 5,7 och lösningen rör- des om i 30 min. Produkten renades och isolerades såsom be- 3,1 g rosafärgade flagor innehållande WS > 50 mg/ml. SRRE 0,05 s_1 mM_1. skrivits i exempel 1. 8,4 % (W/W) Er erhölls.

Exempel 11 100 g dextran fraktionerat till ﬁæ 80 000 löstes i en lösning av 160 g natriumhydroxid och 2 g natriumborhydrid i 500 ml destillerat vatten. tillsattes och blandningen rördes om under återloppskokning på ett oljebaa vid 12o°c 1 22 tim. rades blandningen till pH 7 med koncentrerad saltsyra. dukten fälldes ut med etanol, löstes i 500 ml destillerat vat- 230 g 2-kloretylaminhydroklorid Efter kylning neutralise- Pro- 1 ten och dialyserades. Reduktion av volymen genom indunstning, ° utfällning med etanol och torkning i vakuum gav 65 g amino- etyldextran, ﬁw ~ 80 000, substitutionsgrad 0,35. 2,0 g aminoetyldextran löstes i 200 ml torr DMSO, 1,03 g av bisanhydriden av etylendiamintetraättiksyra (EDTA) fram- ställd från EDTA i enlighet med den metod som beskrivits i 10 15 20 25 30 35 465 907 J. Pharm. Sci. 64 (1975) 704 av W.C. Eckelman et al., till- sattes och blandningen rördes om vid rumstemperatur i 16 tim.

Blandningen kyldes, 200 ml destillerat vatten tillsattes och pH-värdet justerades till 5,8. Efter omrörning vid rumstempe- ratur i 6 tim tillsattes en lösning av 0,88 g MnCl2-4H2O i 20 ml destillerat vatten, pH-värdet justerades till 5,7 och produkten renades och isolerades såsom beskrivits i exempel 1. 3,8 g vita flagor innehållande 1,7 % (w/W) Mn erhölls. WS > 50 mg/ml. SRRE 12,8 s_1 mM_1.

Exempel 12 2,0 g aminoetyldextran (se exempel 11) löstes i 200 ml torr DMSO, 1,3 g av bisanhydriden av DTPA tillsattes och blandningen rördes om i 16 tim vid rumstemperatur. en kyldes, 250 ml destillerat vatten tillsattes och pH-värdet Blandning- justerades till 5,8. Efter omrörning vid rumstemperatur i 6 tim tillsattes en lösning av 1,47 g GdCl3-6H2O i 20 ml destil- lerat vatten, pH-värdet justerades till 5,0 och produkten re- nades och isolerades såsom beskrivits i exempel 1. 3,6 9 Vit fast substans innehållande 7,1 % (w/W) Gd erhölls. WS > 50 mg/ml. SRRE 1,7 s_1 mM_1.

Exempel 13 2,0 g tioldextran (Dex-OOCCH2CH(COOH)SH) ÜW 70 000 och sugstitutionsgrad 0,16 (framställd genom förestring av dextran med S-acetylmerkaptobärnstenssyraanhydrid i enlighet med den metod som beskrivits i Bioinorg. Chem. 1 (1971) 65 av B.P.

Garber och A.L. Fluharty) löstes i 200 ml destillerat vatten.

En lösning av 0,42 g CuSO4-5H2O i 50 ml destillerat vatten tillsattes vid pH 6,0. Sedan tillsatsen blivit fullständig justerades pH-värdet till 5,8. Produkten renades, isolerades 1,85 g mörkgröna WS > 25 mg/ml. och torkades såsom beskrivits i exempel 1. flagor innehållande 1,6 % (w/W) Cu erhölls. sRRE 0,6 ef] mmq. Éxempel 14 200 g dextran, MW 70 ooo, (Dextran T 70, Fine Chemicals AB, Uppsala, Sverige) löstes i 600 ml destille- från Pharmacia 10 15 20 25 30 16 465 907 rat vatten. 600 ml 40%-ig natriumhydroxid tillsattes. 0,5 g natriumborhydrid följt av 300 g klorättiksyra löstes i bland- ningen vid rumstemperatur. En ytterligare portion om 24 g natriumhydroxid löstes i blandningen, vilken lämnades att stå Blandningen neutraliserades med Produkten fälldes ut med 185 g karboximetyldextran- vid rumstemperatur i 2 tim. 30%-ig ättiksyra och dialyserades. etanol och torkades i vakuum. natriumsalt erhölls. ﬁw 65 000. 2,0 g karboximetyldextran-natriumsalt löstes i 100 ml destillerat vatten vid pH 5,8. 0,29 g FeCl3~6H2O i 20 ml destillerat vatten tillsattes och pH-värdet justerades till Substitutionsgrad 0,11. 5,6 och produkten renades och isolerades såsom beskrivits i 1,9 g bruna transparenta flagor innehållande 3,2 % ws > 50 mg/ml. SRRE 0,07 s'1 mM']. exempel 1. (w/W) Fe erhölls.

Exempel 15 2,0 g karboximetyldextran-natriumsalt (se exempel 14) 0,40 g Gac13« 6H2O i 20 ml destillerat vatten tillsattes och pH-värdet jus- löstes i 100 ml destillerat vatten vid pH 5,8. terades till 5,6 och produkten renades och isolerades såsom beskrivits i exempel 1. innehållande 2,8 % (w/W) Gd erhölls. 0,2 s'1 mM'1. 1,75 g färglösa transparenta flagor WS > 50 mg/ml. SRRE Exempel 16 2,0 dextranfosfat, framställt genom fosforylering av dextran med POCl3 i enlighet med den metod som beskrivits i 74 800 och substitu- tionsgrad 0,13, löstes i 200 ml destillerat vatten. amerikanska patentskriften 2.970.141, HQ pH-värdet justerades till 6,2 och en lösning av 0,48 g Eu(NOà)3-6H2O i 20 ml destillerat vatten tillsattes. pH-värdet justerades till 5,9 och en olöslig biprodukt avlägsnades genom centrifugering och den vattenlösliga produkten renades och isolerades såsom beskrivits i exempel 1. 0,65 g vita färglösa flagor inne- 4 hållande 1,0 % (w/W) Eu erhölls. WS > 50 mg/ml. SRRE 0,45 s_1 mM-1. 10 15 20 25 30 35 17 465 907 Exempel 17 2,0 g dextranfosfat, framställt genom fosforylering av dextran med POCl3 i enlighet med den metod som beskrivits i amerikanska patentskriften 2.970.141, MW 74 800 och substitu- tionsgrad 0,13, löstes i 200 ml destillerat vatten. pH-vär- det justerades till 6,2 och en lösning av 0,40 g GdCl3-6H2O i 20 ml destillerat vatten tillsattes. pH-värdet justerades till 5,9 och en olöslig biprodukt avlägsnades genom Centrifu- gering och den vattenlösliga produkten renades och isolerades 0,55 g vita flagor innehållande sRRE 16 s* 'i såsom beskrivits i exempel 1. 3,1 % Gd erhölls. WS > 50 mg/ml. mM .

Exempel 18 2,0 g hydroxietylstärkelse, framställd genom hydroxiety- lering av vaxartad stärkelse med etylenoxid i enlighet med den metod som beskrivits i amerikanska patentskriften 2.516.634, HW 131 000 och substitutionsgrad 0,52, löstes i 60 ml torr DMSO, 1,7 g av bisanhydriden av DTPA framställd såsom i exem- pel 3 tillsattes och blandningen rördes om vid rumstemperatur Under tillsats av 100 ml destillerat vatten kyldes Lösningen rördes om i 30 min och i 16 tim. lösningen i ett isvattenbad. pH-värdet justerades till 6,0. i 20 ml vatten tillsattes, pH-värdet justerades till 5,0 och Stärkelse- En lösning av 1,23 g NiCl2-6H2O blandningen rördes om vid rumstemperatur i 30 min. derivatet renades och isolerades såsom beskrivits i exempel 1. 3,6 g gröna flagor innehållande 8,5 % (w/W) Ni erhölls. ws > 5 mg/ml. SRRE 0,01 s'] mM'].

Exempel 19 2,0 g hydroxipropylstärkelse, framställd genom hydroxi- propylering av majsstärkelse i enlighet med den metod som be- skrivits i Stärke 23 (1971) 430 av D.C. Leegwater och J.B.

Lutsn, MW 49 ooo och substitutionsgrad 0,75, löstes i 100 m1 torr DMSO, 1,03 g av bisanhydriden av EDTA (framställd som i exempel 11) tillsattes och blandningen rördes om vid rumstem- Blandningen kyldes och 100 ml destillerat Efter peratur i 16 tim. vatten tillsattes och pH-värdet justerades till 6,2. 10 15 20 25 30 35 18 465 907 omrörning vid rumstemperatur i 6 tim tillsattes en lösning av 1,79 g GdCl3-6H2O i 20 ml destillerat vatten, pH-värdet juste- rades till 5,8 och produkten renades och isolerades såsom be- 3,4 g gulaktiga flagor innehållande 4,7 WS > 50 mg/ml. 1 -1 l skrivits i exempel 1. % (w/w) Ga erhölls. SRRE 10,5 S' mm . Éxempel 20 ï 2,0 g natriumkarboximetylcellulosa, EQ 90 000, substitu- tionsgrad 0,8 (Blanose från Hercules Inc., Wilmington, Delaware, USA) löstes i 200 ml destillerat vatten, pH-värdet justerades till 6,0 och en lösning av 0,41 g CuSO4-5H2O i 50 ml destillerat vatten tillsattes. pH-värdet justerades till 5,2, lösningen rördes i 1 tim och produkten renades, isolera- des och torkades såsom beskrivits i exempel 1. 1,7 g blå fla- gor innehållande 2,2 % (w/w) Cu erhölls. WS > 25 mg/ml. 1 1 SRRE 0,8 s' mn" .

Exempel 21 2,0 g natriumkarboximetylcellulosa, ﬁw 90 000, substitu- tionsgrad 0,8, (Blanose från Hercules Inc., Wilmington, Delaware, USA) löstes i 200 ml destillerat vatten, pH-värdet justerades till 5,6 och en lösning av 160 mg GdCl3-6H2O i 50 ml destillerat vatten tillsattes. pH-värdet justerades till 5,2, lösningen rördes om i 2 tim och produkten renades och isolerades såsom beskrivits i exempel 1. 1,4 g transparenta vita flagor innehållande 2,7 % (w/w) Gd erhölls. WS > 50 mg/ml.

SRRE 5,8 s'1 mM'1. âxempel 22 'LO g av bisanhydriden av DTPA sattes till en lösning av No I-3754 från Sigma Chemical Company, Bland- 1 ningen rördes om vid rumstemperatur i 20 tim följt av frys- 10 g inulin (Sigma St. Louis, USA) i 200 ml torr DMSO vid rumstemperatur. torkning av lösningen. Det fasta materialet återupplöstes i L 250 ml destillerat vatten, lösningen rördes om över natten och pH-värdet justerades till 5,0. En lösning av 8,0 g GdCl3- 6H2O i 75 ml destillerat vatten tillsattes, pH-värdet justera- des till 5,5 och lösningen rördes om i 1 tim. Blandníngen 10 15 20 25 30 19 465 907 ultrafiltrerades med O,9%-ig NaCl följt av destillerat vatten.

Vattenlösningen indunstades och produkten torkades i vakuum vid 5o°c. (w/w) Gd erhölls. 13,1 g vit fast substans innehållande 9,8 % ws > 50 mg/ml. SRRE 6,6 s"1 mM'1.

Exempel 23 2,0 g av en sampolymer av sukros och epiklorhydrin, HQ 70 000 (Ficoll 70, från Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Sverige) löstes i 200 ml torr DMSO. av EDTA tillsattes och blandningen rördes om vid rumstempera- Under tillsats av 100 ml destillerat vatten 1,03 g av bisanhydriden tur i 16 tim. kyldes reaktionsblandningen i ett isvattenbad och pH-värdet justerades till 5,8. En lösning av 0,88 g MnCl2-4H2O i 20 ml destillerat vatten tillsattes. och produkten renades och isolerades såsom beskrivits i exem- pH-värdet justerades till 5,7 pel 1. 2,8 g vita flagor innehållande 0,3 % (w/w) Mn er- hölls. ws > so mg/ml. SRRE 19,2 S71 mM'].

Exempel 24 EDTA bands till 2,0 g av en sampolymer av sukros och epiklorhydrin, Må 400 ooo (Fico11 Chemicals AB, Uppsala, Sverige) såsom beskrivits i exempel 23, vilket ledde till en lösning av EDTA-tvärbunden sukros.

En lösning av 1,4 g FeCl3-6H2O i 20 ml destillerat vatten tillsattes, pH-värdet justerades till 5,7 och produkten rena- 3,2 g bruna 400 från Pharmacia Fine des och isolerades såsom beskrivits i exempel 1. flagor innehållande 2,7 % (w/wl Fe erhölls. WS > 50 mg/ml.

SRRE 0,5 5"] mM'1.

Exempel 25 0,425 g gadolinium (IIII-DTPA-dextran 40 framställdes i enlighet med exempel 6 och.löstes i 10 ml av en vattenlös- NaCl. Lösningen sterilfiltrerades och fylldes i en 10 ml flaska. ning av 0,9 % Lösningen innehöll 2.mg Gd/ml.

Exempel 26 0,200 g europium (III)-dextranfosfat framställdes i en- lighet med exempel 16 och löstes i 100 ml destillerat vatten. 20 465 907 2,0 g natriumkarboximetylcellulosa (ßlanoseqä från Hercules Inc., Wilmington, Delaware, USA) löstes även i denna lösning och lösningen fylldes i en 100 ml flaska. Lösningen inne- höll 20 ng Eu/ml. §xemEel 27 0,306 g gadolinium (III)-DTPA-inulin framställdes i en- lighet med exempel 22 och löstes i 10 ml 0,9 % vattenlösning av NaCl. Lösningen sterilfiltrerades och fylldes i en 10 ml flaska. Lösningen innehöll 3 mg Gd/ml.

Claims

10 15 20 25 30 35 .å/v 465 907 PATENTKRAV

1. Diagnosticeringsmedel innehållande åtminstone en icke-radio- aktiv paramagnetisk metall kemiskt bunden till en fysiologiskt tolererbar, vattenlöslig, hydnmqdgrupphaltig makromolekylär produkt, k ä n n e t e c k n a t av att den makromolekylära produkten består av åtminstone ett polymert eller polymeriserat kolhydrat eller en polymeriserad sockeralkohol eller derivat därav, vartill den eller de paramagnetiska metallerna är kemiskt bundna i ett kelatkomplex, i vars kelatringar en av de metall- koordinerande atomerna är en kväveatom och den andra är en kväve-, syre- eller svavelatom.

2. Diagnosticeringsmedel enligt krav 1, k äån n e t e c k - n a t av att medelmolekylvikten (MW) för den makromolekylära produkten är åtminstone 1000, företrädesvis åtminstone 3000.

3. Diagnosticeringsmedel enligt krav 1 eller 2, k ä n.n e - t e c k nia t av att den makromolekylära produkten är nedbryt- bar i kroppen hos ett djur, inklusive människa.

4. Diagnosticeringsmedel enligt krav 3, k ä n n e t e c k - n a t av att den makromolekylära produkten är enzymatiskt ned- brytbar av hydrolaser, företrädesvis av (X-amylas.

5. ; Diagnosticeringsmedel enligt något av kraven 1-4, k ä n - n e t e c k n a t av att den icke-radioaktiva paramagnetiska metallen är vald ur gruppen av element med atomnummer 21-29, 42, 44 och 57-70, företrädesvis 24-29 och 62-69.

6. Diagnosticeringsmedel enligt krav 5, k ä nån e t e c k - n a t av att den icke-radioaktiva paramagnetiska metallen är gadolinium, erbium, europium, dysprosium, holmium, mangan, järn, nickel, krom eller koppar.

7. Diagnosticeringsmedel enligt något av kraven 1-6, k ä n - n e t e c k n a t av att den makromolekylära produkten är en produkt, som har kelatbildande grupper med den allmänna formeln 10 15 20 25 30 35 4 6 5 9 Ü 7 2.9» -NR1 - [(0112 ) n-NRJm-R3 i vilken n är 2 eller 3,'m är ett helt tal med värdet 1 eller högre och R1, R2 och R3, vilka kan vara lika eller olika, var- dera representerar en väteatom eller en metyl- eller etylgrupp, som är substituerad med en karboxyl-, sulfo-, fosfo- eller aminogrupp.

8. Diagnosticeringsmedel enligt något av kraven 1-7, k ä n - n e t e c k n a t av att kelatkomplexet innehåller åtminstone två 5- eller 6-ledade ringar innehållande metallen, företrä- desvis fyra till åtta 5- eller 6-ledade ringar.

9. Diagnosticeringsmedel enligt mågot av kraven 1-8, k ä n - n e t e c k n a t av att den makromolekylära produkten är löst i en fysiologiskt godtagbar vattenhaltig vätska.

10. Diagnosticeringsmedel enligt krav 9, k ä n n e t e c k - n a t» av att den vattenhaltiga vätskan även innehåller visko- sitetsökande substanser och/eller substanser som reglerar det osmotiska trycket.