SE1051015A1 - Förfaranden för framställning av näringsmedium för tillväxt och/eller groning av växtembryon - Google Patents

Abstract

41 SAM MAN DRAG Ett förfarande för framställning av ett förbättrat näringsmedium inbe-5 gripande ett adsorbentmaterial för odling av växtembryon beskrivs.

Description

15 20 25 30 2 tionen av en eller flera komponenter i ett första näringsmedium efter inkuba- tion med en önskad mängd adsorbentmaterial; och (b) framställning av ett för- bättrat näringsmedium inbegripande samma komponenter som det första nä- ringsmediet, varvid det förbättrade näringsmediet inbegriper: (i) en ökad kon- centration av en eller flera komponenter som vid steg (a) fastställdes ha en reducerad koncentration i närvaro av absorbentmaterialet; och (ii) samma typ av absorbentmaterial i ett koncentrationsområde som är tvåfaldigt i förhållan- de till det som användes enligt steg (a).

Enligt en annan aspekt av uppfinningen tillhandahålls ett förfarande för framställning av ett förbättrat näringsmedium inbegripande ett adsorbent- material för odling av växtceller. Förfarandet enligt denna aspekt av uppfin- ningen inbegriper (a) inkubation av ett första näringsmedium inbegripande en förutbestämd initial koncentration av komponenter inbegripande en eller flera kolkällor, vitaminer, mineraler och aminosyror med en önskad mängd adsor- bentmaterial för tillsättning till ett förbättrat näringsmedium; (b) bestämning av huruvida det föreligger en reduktion av koncentrationen av en eller flera av komponenterna i det första näringsmediet efter inkubationen vid steg (a)jäm- fört med den förutbestämda initiala koncentrationen av komponenten; och (c) framställning av ett förbättrat näringsmedium inbegripande samma kompo- nenter som det första näringsmediet, varvid det förbättrade näringsmediet in- begriper: (i) en ökad koncentration av nämnda en eller flera komponenter som vid steg (b) fastställdes ha en reducerad koncentration i närvaro av ad- sorbentmaterialet; och (ii) samma typ av adsorbentmaterial i ett koncentra- tionsområde som är högst tvåfaldigt jämfört med det som användes vid steg (a).

Förfarandena för framställning av ett förbättrat näringsmedium är an- vändbara för tillväxt och/eller groning av ett växtembryo, såsom ett barrträds- embryo.

BESKRIVNING AV RITNINGEN Ovanstående aspekter och många av de åtföljande fördelarna med föreliggande uppfinning inses lättare genom hänvisning till följande detaljera- de beskrivning betraktad tillsammans med den åtföljande ritningen. 10 15 20 25 30 3 I FIGUR 1 visas i tvärsnittsvy ett exempel på ett tillverkat frö inbe- gripande ett växtembryo enligt olika utföringsformer av uppfinningen.

DETALJERAD BESKRIVNING Med hjälp av föreliggande beskrivningsdel tillhandahålls tillverkade frön inbegripande ett modifierat näringsmedium, vilket resulterar i en förbättrad groningsfrekvens jämfört med tillverkade frön inbegripande ett standard- mässigt näringsmedium innehållande näringsämnesbehandlat träkol.

Det här använda uttrycket ”ett somatiskt växtembryo” hänför sig till ett embryo som producerats genom odling av totipotenta växtceller, såsom meri- stemvävnad, vid laboratoriebetingelser där cellerna som inbegriper vävnaden separeras från varandra och tvingas utvecklas till mycket små fullständiga embryon. Alternativt kan somatiska embryon produceras genom induktion av ”klyvningspolyembryogenes” av zygotiska embryon. Metoder för produktion av somatiska växtembryon som är lämpliga för användning vid förfarandena enligt uppfinningen är standardmässiga inom teknikområdet och har tidigare beskrivits (se t ex USA-patentskrifterna nr 4 957 866, 5 034 326, 5 036 007, 5 041 382, 5 236 841, 5 294 549, 5 482 857, 5 563 061 och 5 821 126). Växt- vävnad kan t ex odlas i ett initeringsmedium som inkluderar hormoner för ini- tiering av bildningen av embryogena celler, såsom embryosuspensormassor med förmåga att utvecklas till somatiska embryon. De embryogena cellerna kan därefter odlas vidare i ett underhållsmedium som befrämjar etablering och förökning av de embryogena cellerna. Därefter kan de förökade embryo- gena cellerna odlas i ett utvecklingsmedium som befrämjar utvecklingen av somatiska embryon, som dessutom kan underkastas efterutvecklingsbehand- lingar, såsom behandlingar med kyla. De somatiska embryon som används vid förfarandena enligt uppfinningen har fullbordat utvecklingsskedet av den somatiska embryogenesprocessen. De kan också ha underkastats en eller flera efterutvecklingsbehandlingar.

Vanligtvis har växtembryona som används enligt uppfinningen en skottände och en rotände. Hos vissa växtarter inkluderar skottänden ett eller flera hjärtblad (bladliknande strukturer) i ett visst utvecklingsskede. Växt- embryon som är lämpliga för användning vid förfarandena enligt uppfinningen kan härröra från vilken växtart som helst, såsom dihjärtbladsförsedda eller 10 15 20 25 30 4 monohjärtbladsförsedda växter, gymnospermer, såsom zygotiska eller soma- tiska embryon (t ex tall, såsom gul sydstatstall (”Lob|o||y pine”), gran eller douglasgran. För användning i tillverkade frön 20 enligt föreliggande upp- finning utvecklas växtembryot vanligtvis tillräckligt för att ha en skottände och en rotämnesände. Hos vissa växtarter inkluderar skottänden ett eller flera hjärtblad i något utvecklingsskede. Hos andra typer av växter är hjärtbladet eller hjärtbladen belägna på andra ställen än i skottänden.

Det här använda uttrycket ”groning” hänför sig till en fysiologisk pro- cess som resulterar i förlängning av ett växtembryo längs dess axel, och denna är fullständig när embryot har förlängts till den punkt då det skjuter ut från fröhöljet eller det tillverkade fröets lock.

Det här använda uttrycket "fullständig groning” hänför sig till ett tillver- kat frö vars rot har trängt ut genom fröhöljet eller det tillverkade fröets lock.

Ett tillverkat frö för användning vid uppfinningen inbegriper ett växt- embryo, ett hölje till det tillverkade fröet och ett näringsmedium. I FIGUR 1 visas i tvärsnittsvy ett exempel på ett tillverkat frö 20 inbegripande ett växt- embryo 42 placerat däri. Såsom visas i FIGUR 1 är embryot 42 placerat inuti en hålighet 34, står i funktionell kontakt med ett näringsmedium 26 och är på lämpligt sätt inneslutet däri med hjälp av en levande ändtillslutning 43. Det in- ses att FIGUR 1 tillhandahåller en representativ utföringsform av ett tillverkat frö 20 inbegripande ett växtembryo, ett hölje till ett tillverkat frö som innesluter det somatiska växtembryot och som inbegriper en mynning, ett närings- medium i funktionell kontakt med växtembryot och ett lock som tillsluter det somatiska växtembryot inuti det tillverkade fröet; men förfarandet är emellertid inte begränsat till den särskilda utföringsformen av det i FIGUR 1 visade till- verkade fröet. I det i FIGUR 1 visade exemplet på utföringsform inbegriper det tillverkade fröet 20 ett fröhölje 24, ett näringsmedium 26, en bottentillslutning 28 och en eventuell cylcap (”cylcap”) 22 (skottbegränsning). I det i FIGUR 1 visade exemplet på utföringsform inbegriper det tillverkade fröet 20 ett växt- embryo 42, ett fröhölje 24, ett näringsmedium 26 i funktionell kontakt med växtembryot och en eventuell cylcap 22 (skottbegränsning).

Det här använda uttrycket "tillverkat fröhölje” hänför sig till en struktur som är analog med den för ett naturligt fröhölje som skyddar växtembryot och 10 15 20 25 30 5 andra inre strukturer hos det tillverkade fröet från mekanisk skada, uttorkning, attack av mikrober, svampar, insekter, nematoder, fåglar och andra patoge- ner, herbivorer och skadedjur, för att nämna några funktioner. Fröhöljet 24 kan vara tillverkat av ett flertal material inkluderande, dock inte begränsade till, cellulosamaterial, glas, plast, formbar plast, härdade polymerhartser, pa- raffin, vaxer, lacker och kombinationer därav, såsom ett vaximpregnerat papper. Materialen av vilka fröhöljet är tillverkat är i allmänhet icke-toxiska och ger en grad av styvhet. Fröhöljet kan vara bionedbrytbart, även om frö- höljet vanligtvis förblir intakt och beständigt mot penetrering av växtpatogener tills efter emergensen av det groende embryot. Fröhöljet kan vara format med utgångspunkt från en del av ett rörformigt material. Fröhöljet kan vara ett av- klippt sugrör av fibermaterial, såsom papper. Sugrörsdelarna kan vara för- behandlade i ett lämpligt beläggningsmaterial, såsom vax. Alternativt kan frö- höljet vara format med utgångspunkt från en rörformig del av ett bionedbryt- bart plastmaterial. Ett sådant material är polymjölksyra (”PLA”), som säljs av MAT-UR i Los Angeles, Kalifornien. Ett annat lämpligt material är en poly- kaprolakton (”PCL”) blandning, såsom CAPA 6800 (Perstorp Polyols Inc., Toledo, Oklahoma 43612) med eller utan ett mjukningsmedel iform av 1% Tegomer H Sl6440 (Degussa Goldschmidt Chemical Corp, 914 East Randolph Road, Hopewell, Virginia 23860). Sådana bionedbrytbara plaströr kräver eller kräver ej en vaxbeläggning, eftersom sådana rör redan är bestän- diga mot omgivande element. Tillsatser, såsom antibiotika och planttillväxt- regulatorer, kan t ex sättas till fröhöljet genom införlivning däri för åstadkom- mande av ett eller flera skikt av fröhöljet eller genom beläggning eller på annat vis behandling av skiktet eller skikten med tillsatsen med hjälp av kon- ventionella medel.

Nämnda cylcap 22, även känd som skottbegränsning eller hjärtblads- begränsning, framställs lämpligtvis med utgångspunkt från ett poröst material med en hårdhet som är tillräckligt stark för att motstå punktering eller fraktur pga ett groende embryo, såsom ett keramiskt material eller ett porslinsmate- rial, och inkluderar en ändtillslutningsportion 30 och en hjärtbladsbegräns- ningsportion 32. Begränsningsportionen 32 har en inneryta för kontakt och omslutning av åtminstone skottänden hos ett växtembryo och motstår penet- 10 15 20 25 30 6 ration av skottänden under groning. Skottbegränsningen förhindrar embryots skottände, såsom hjärtbladen, från att växa in i och inneslutas i näringsmediet (även benämnt gametofytmedium). Hjärtbladsbegränsningsportionen 32 är Iämpligtvis integralt eller enhetligt formad tillsammans med ändtillslutnings- portionen 30. Nämnda cylcap 22 inkluderar även en sig i längdriktningen sträckande hålighet 34 som sträcker sig genom ändtillslutningsportionen 30 och delvis genom ena änden av hjärtbladsbegränsningsportionen 32. Den öppna änden av håligheten 34 är känd som en hjärtbladsbegränsningsöpp- ning 36. Håligheten 34 är storleksanpassad till att mottaga ett växtembryo 42 däri. Såsom visas i FIGUR 1 inbegriper nämnda cylcap 22 ett flertal porer 27, varvid porerna 27 ger näringsmediet 26 tillgång till insidan av håligheten 34 inbegripande embryot 42 och tillåter därför näringsmediet 26 att funktionellt komma i kontakt med embryot 42 vid betingelser som är tillräckliga för att ge ett konditionerat embryo, såsom beskrivs här.

Begränsningen är porös för att ge embryot tillgång till vatten, närings- ämnen och syre. Skottbegränsningen kan vara tillverkad av vilket lämpligt material som helst som inkluderar, men som inte är begränsat till, glasartat material, metallmaterial, elastmaterial, keramiskt material, lermaterial, gips- material, cementmaterial, stärkelseartat material, kittliknande material, synte- tiskt polymermaterial, naturligt polymermaterial och klistermaterial. Exempel på skottbegränsningar beskrivs i USA-patentskriften nr 5 687 504 (t ex spalt 3, rad 61, till spalt 4, rad 13; spalt 18, rad 7, till spalt 22, rad 2), som härmed är införlivad genom referens.

Såsom dessutom visas i FIGUR 1 omger vid en utföringsform av upp- finningen adsorbentmaterialet 80 embryot 42 i håligheten 34, antingen full- ständigt eller partiellt, och ökar ytarean av embryot 42, som står i funktionell kontakt med näringsmediet 26, vilket tillhandahåller ett flertal vägar för nä- ringsämnena från näringsmediet 26 för att nå embryot 42. Även om det är föredraget att adsorbentmaterialet 80 väsentligen centrerar växtembryot 42 inuti håligheten 34, behöver växtembryot 42 inte vara positionerat på så sätt.

Adsorbentmaterialet 80 behöver endast positionera embryot 42 inuti hålig- heten 34 på vilket känt sätt som helst för att sätta växtembryot 42 i funktionell kontakt med näringsmediet 26. Vid vissa utföringsformer av uppfinningen 10 15 20 25 30 7 behöver dessutom fyllmaterialet 80 endast fylla en eller två sidor, antingen fullständigt eller partiellt, av utrymmet mellan embryot 42 och väggarna till håligheten 34.

Företrädesvis är fyllmaterialet 80 en adsorbent, såsom aktiverat träkol, Dowex-hartser, zeoliter, aluminiumoxid, lera, diatomit, silikagel och kiselgur.

Under sammansättning av det tillverkade fröet 20 placeras fyllmaterialet 80 i håligheten 34 till nämnda cylcap 22 på vilket inom tekniken känt sätt som helst, inkluderande manuellt. Fyllmaterialet 80 är företrädesvis, men inte nöd- vändigtvis, placerat i håligheten 34 på så sätt att det väsentligen centrerar embryon 42 i håligheten 34. Centreringen av embryot 42 i håligheten 34 ökar ytarean för embryot 42 som står i funktionell kontakt med näringsmediet 26.

Det här använda uttrycket "funktionell kontakt” avses mena en position där embryot 42 tar upp näringsämnen från näringsmediet 26.

Vid vissa utföringsformer är fyllmaterialet 80 träkol. Företrädesvis före- ligger träkolet i form av ett pulver och aktiveras genom förbehandling med en syra, såsom HCI eller fosforsyra. Aktivt träkol är kommersiellt tillgängligt.

Pulverformigt aktivt träkol av typ NORIT® CNSP eller DARCO® KB-G fram- ställs genom kemisk aktivering genom användning av en fosforsyraprocess och ärtillgängliga från Norit Americas Inc., Marshall, Texas, 75671.

Vid vissa utföringsformer är fyllmaterialet 80 näringsämnesbehandlat träkol. Det här använda uttrycket "näringsämnesbehandlat" träkol hänför sig till träkol som varit i kontakt med ett medium som innehåller ett flertal närings- ämnen, såsom en kolkälla, vitaminer, mineraler och aminosyror, på så sätt att träkolet absorberar och bevarar näringsämnena från mediet. Ett representa- tivt medium som används för framställning av näringsämnesbehandlat träkol är mediet KE64, såsom beskrivs i Exempel 1. Ett exempel på ett förfarande för framställning av näringsämnesbehandlat träkol för användning som ett fyll- material 80 för insättning i håligheten 34 tillhandahålls i Exempel 1.

I de tillverkade fröna och vid förfarandena enligt uppfinningen står nä- ringsmediet 26 (annars benämnt "gametofytmedium") i funktionell kontakt med växtembryot som placerats i det tillverkade fröet 20. Det här använda uttrycket "näringsmedium" hänför sig till en källa av näringsämnen, såsom vitaminer, mineraler, kol och energikällor, och andra fördelaktiga föreningar 10 15 20 25 30 8 som använts av embryot under groning. Näringsmediet är således analogt med gametofyten för ett naturligt frö.

Enligt en aspekt av uppfinningen tillhandahålls ett förfarande för fram- ställning av ett förbättrat näringsmedium inbegripande ett adsorbentmaterial för odling av växtceller. Förfarandet enligt denna aspekt av uppfinningen in- begriper (a) bestämning av huruvida det föreligger en reduktion av koncentra- tionen av en eller flera komponenter i ett första näringsmedium efter inkuba- tion med en önskad mängd adsorbentmaterial; (b) framställning av ett förbätt- rat näringsmedium inbegripande samma komponenter som det första nä- ringsmediet, varvid det förbättrade näringsmediet inbegriper: (i) en ökad kon- centration av nämnda en eller flera komponenter som vid steget (a) bestäm- des ha en reducerad koncentration i närvaro av adsorbentmaterialet; och (ii) samma typ av adsorbentmaterial i ett koncentrationsområde som är högst tväfaldigt jämfört med det som användes vid steg (a).

Enligt en annan aspekt av uppfinningen tillhandahålls ett förfarande för framställning av ett förbättrat näringsmedium inbegripande ett adsorbent- material för odling av växtceller. Förfarandet enligt denna aspekt av uppfin- ningen inbegriper (a) inkubation av ett första näringsmedium inbegripande en förutbestämd initial koncentration av komponenter inbegripande en eller flera kolkällor, vitaminer, mineraler och aminosyror, med en önskad mängd adsor- bentmaterial för tillsättning till ett förbättrat näringsmedium; (b) bestämning av huruvida det föreligger en reduktion av koncentrationen av en eller flera av komponenterna i det första näringsmediet efter inkubationen enligt steget (a) jämfört med den förutbestämda initiala koncentrationen av komponenten; och (c) framställning av ett förbättrat näringsmedium inbegripande samma kompo- nenter som det första näringsmediet, varvid det förbättrade näringsmediet in- begriper: (i) en ökad koncentration av nämnda en eller flera komponenter som vid steget (b) bestämdes ha en reducerad koncentration i närvaro av adsorbentmaterialet; och (ii) samma typ av adsorbentmaterial i ett koncentra- tionsområde som är högst tvåfaldigt jämfört med det som användes vid steget (8)- Förfarandena enligt uppfinning är användbara för framställning av ett förbättrat näringsmedium inbegripande ett absorbentmaterial, såsom träkol, 10 15 20 25 30 9 för användning vid tillväxt och/eller groning av växtembryon. Det förbättrade näringsmediet som framställts enligt uppfinningen är användbart för fram- ställning och groning av tillverkade frön i ett flertal olika sammanhang.

Enligt de olika aspekterna av uppfinningen inkuberas ett första närings- medium inbegripande en förutbestämd initial koncentration av komponenter inbegripande en eller flera kolkällor, vitaminer, mineraler och aminosyror med ett absorbentmaterial under en tidsperiod som är tillräcklig för att de olika komponenterna i mediet skall adsorberas till adsorbentmaterialet. Lämpliga tidsperioderför inkubation av det första näringsmediet med adsorbentkompo- sitionen sträcker sig frän minst cirka 10 minuter upp till flera dagar eller en vecka eller mer, säsom minst 15 minuter, minst 30 minuter, minst 1 timme, minst 2 timmar, minst 3 timmar, minst 4 timmar, minst 8 timmar, upp till 24 timmar, 48 timmar eller längre.

Lämpliga adsorbentmaterial för användning vid förfarandena för fram- ställning av ett modifierat (eller förbättrat) näringsmedium inkluderar, dock utan begränsning därtill, träkol, polyvinylpolypyrrolidon och silikageler. Vid vissa utföringsformer är adsorbentmaterialet i det första och modifierade (för- bättrade) näringsmediet från 1,0 g/l till 100 g/l träkol. Vid vissa utföringsformer är träkolet som satts till det första och modifierade (förbättrade) näringsmediet frän 1,0 g/l till 100 g/l ej näringsämnesbehandlat träkol (t ex från 5 g/l, 20 g/l till 100 g/l, frän 50 g/l till 100 g/l, frän 60 g/l till 100 g/l, eller frän 50 g/l till 80 g/l, eller cirka 60 g/l). Det här använda uttrycket ”ej näringsämnesbehandlat” träkol hänför sig till träkol (t ex rent träkol eller aktivt träkol) som inte har bringats i kontakt med ett medium som innehåller ett flertal näringsämnen, så- som en kolkälla, vitaminer, mineraler och aminosyror, varvid träkolet absorbe- rar och bevarar näringsämnen frän mediet.

Enligt denna aspekt av uppfinningen inkluderar det första och modifie- rade (förbättrade) näringsmediet samma typ av adsorbentkomposition (t ex träkol). Koncentrationen av adsorbentkomposition i det förbättrade närings- mediet ligger vanligtvis inom ett koncentrationsomräde som är cirka tväfaldigt till femfaldigt i förhållande till koncentrationen av adsorbenten som inkubera- des i det första näringsmediet. Vid vissa utföringsformer av förfarandet är koncentrationen av adsorbentkompositionen i det förbättrade näringsmediet 10 15 20 25 30 10 samma som koncentrationen av adsorbent som inkuberades i det första nä- ringsmediet.

Efter det att det första näringsmediet har inkuberats med adsorbent- kompositionen enligt steg (a), utförs en analys för bestämning av huruvida det föreligger en reduktion av koncentrationen av en eller flera av komponenterna i det första näringsmediet efter inkubation jämfört med den initiala koncentra- tionen av komponenten i det första näringsmediet. I TABELLERNA 3 och 4 visas t ex en jämförelse av mediumkomponenterna före och efter inkubation med träkol. För nämnda en eller flera komponenteri näringsmediet som fast- ställts har reducerats avseende koncentrationen i det första näringsmediet efter inkubation med adsorbentmaterialet, görs en justering för ökning av kon- centrationen av nämnda en eller flera komponenter i det förbättrade närings- mediet. Vid vissa utföringsformer av förfarandet görs en justering på så sätt att ökningen i koncentration av komponenten i det förbättrade näringsmediet motsvarar reduktionen i koncentration som observerats i det första närings- mediet efter inkubation med adsorbentkompositionen. Vid vissa utförings- former av förfarandet görs justeringen till den koncentration av komponenten i det förbättrade näringsmediet som dessutom tar i beaktande minst en av (1) effekten av den ökade koncentrationen av den särskilda komponenten på me- diets totala pH-värde; (2) interaktionen med andra komponenter i mediet (dvs utfällning); eller (3) en maximal halt av en särskild komponent med avseende pä viabilitet av växtembryot som ska bringas i kontakt med näringsmediet.

Vid vissa utföringsformer utförs förfarandet enligt denna aspekt av upp- finningen som förberedelse för uppskalning på så sätt att det första närings- mediet som inkuberats med adsorbentkompositionen enligt steg (a) har en volym som är cirka 1/4 till 1/100 (såsom 1/5, 1/10, 1/50, 1/75 upp till 1/100) av totalvolymen av det förbättrade näringsmediet enligt steget (c).

Vid vissa utföringsformer inbegriperförfarandet dessutom placering av det första näringsmediet från steg (a) i en första uppsättning av tillverkade frön och placering av det förbättrade näringsmediet frän steg (c) i en andra uppsättning av tillverkade frön, placering av ett barrträdsembryo i funktionell kontakt med näringsmediet i vart och ett av de tillverkade fröna från den förs- ta och andra uppsättningen av tillverkade frön, placering av de tillverkade 10 15 20 25 30 11 fröna i en omgivning som leder till planttillväxt och jämförelse av gronings- frekvenserna för embryona från den första och andra uppsättningen av till- verkade frön för bestämning av om det föreligger en effekt av det förbättrade näringsmediet på groningsfrekvensen.

Enligt denna aspekt av uppfinningen inkluderar det första närings- mediet och det modifierade (förbättrade) näringsmediet vanligtvis samma komponenter, varvid det modifierade (förbättrade) näringsmediet inbegriper en ökad koncentration av minst en eller flera av komponenterna i jämförelse med det första näringsmediet. Vid vissa utföringsformer av förfarandet inbe- griper det första och modifierade näringsmediet minst två komponenter som är valda från den grupp som består av NH4NO3, KH2PO4, myoinositol, tiamin- HCI, pyridoxin-HCl, nikotinsyra, riboflavin, kalciumpantotenat, biotin och fol- syra, DL-serin, L-prolin, L-arginin-HCI och L-alanin.

Näringsmediet inkluderar vanligtvis även CuClg, CaClg, MgSO4, ferri- citrat, MnClg, H3BO3, ZnSO4 och (NH4)2MoO4, såsom beskrivs med hänvis- ning till mediet som betecknas ”MS09”, såsom beskrivs i Exempel 1, 3 och 4.

Vid vissa utföringsformer inkluderar det förbättrade näringsmediet FeSO4 i en koncentration av från cirka 5 mg/I till 25 mg/I, såsom från cirka 10 mg/I till cir- ka 15 mg/l. Vid vissa utföringsformer inkluderar det förbättrade näringsmediet MgSO4 i en koncentration av från cirka 600 mg/l till cirka 1500 mg/l, såsom från cirka 800 mg/I till cirka 1200 mg/l.

Näringsmediet kan dessutom inbegripa aminosyror. Lämpliga amino- syror kan inkludera aminosyror som vanligtvis finns införlivade i proteiner, lik- som aminosyror som vanligtvis inte är införlivade i proteiner, såsom arginino- succinat, citrullin, kanavanin, ornitin och D-stereoisomerer. Vid en utförings- form inkluderar näringsmediet även minst en aminosyra som är vald från den grupp som består av från 85 mg/l till 100 mg/l DL-serin; från 55 mg/l till 70 mg/I L-prolin, från 300 mg/I till 600 mg/I L-arginin-HCI och från 55 mg/I till 70 mg/I L-alanin.

Näringsmediet inbegriper vanligtvis dessutom en eller flera kolkällor, vitaminer och mineraler. Lämpliga kolkällor inkluderar, men är inte begränsa- de till, monosackarider, disackarider och/eller stärkelser. Det modifierade 10 15 20 25 30 12 näringsmediet kan även inkludera en eller flera komponenter som är involve- rade i kvävemetabolismen, såsom urea eller polyaminer.

Näringsmediet kan inkludera syrebärande ämnen för förbättring av både absorptionen av syre och retentionen av syre hos näringsmediet, vilket möjliggör att mediet upprätthåller en syrekoncentration som är högre än den som annars skulle föreligga i mediet enbart pga absorptionen av syre från atmosfären. Exempel på syrebärande ämnen inkluderar perfluorkolväten, så- som FC-77, och ytaktiva ämnen, såsom Pluronic F-68, tillgängligt från BASF Corp., Parsippany, N.J. Exempel på syrebärande ämnen beskrivs i USA- patentskriften nr 5 564 224 (t ex spalt 9, rad 44, till spalt 11, rad 67), som här- med är införlivad genom referens.

Näringsmediet kan även innehålla hormoner. Lämpliga hormoner inklu- derar, men är inte begränsade till, abscisinsyra, cytokininer, auxiner och gib- berelliner. Abscisinsyra är ett seskviterpenoidväxthormon som är implikerat i ett flertal växtfysiologiska processer (se t ex Milborrow, J. Exp. Botany 52:1 145-1164 (2001 ); Leung & Giraudat, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol.

Biol. 49:199-123 (1998)). Auxiner är planttillväxthormoner som befrämjar cell- delning och -tillväxt. Exempel på auxiner för användning i groningsmediet in- kluderar, men är inte begränsade till, 2,4-diklorfenoxiättiksyra, indol-3-ättik- syra, indol-3-smörsyra, naftalenättiksyra och klorogensyra. Cytokininer är planttillväxthormoner som påverkar organiskationen hos celler under delning.

Exempel på cytokininer för användning igroningsmediet inkluderar, men är inte begränsade till, t ex 6-bensylaminopurin, 6-furfurylaminopurin, divätezea- tin, zeatin, kinetin och zeatinribosid. Gibberelliner är en klass av diterpenoid- växthormoner (se t ex Krishnamoorthy, Gibberellins and Plant Growth, John Wiley & Sons (1975)). Representativa exempel på gibberelliner som är an- vändbara vid utövandet av föreliggande uppfinning inkluderar gibberellinsyra, gibberellin 3, gibberellin 4 och gibberellin 7. Ett exempel på en användbar blandning av gibberelliner är en blandning av gibberellin 4 och gibberellin 7 (benämnd gibberellin 4/7), såsom den typ av gibberellin 4/7 som säljs av Abbott Laboratories, Chicago, Illinois. När abscisinsyra förekommer i det mo- difierade näringsmediet används den vanligtvis i en koncentration i området från cirka 1 mg/l till cirka 200 mg/l. Vid närvaro i näringsmediet är koncentra- 10 15 20 25 30 13 tionen av gibberel|in(er) vanligtvis mellan 0,1 mg/I och cirka 500 mg/l. Auxiner kan t ex användas i en koncentration av från 0,1 mg/l till 200 mg/l. Cytokininer kan användas, t ex i en koncentration av från 0,1 mg/I till 100 mg/l.

Näringsmediet kan även inkludera antimikrobiella ämnen. Lämpliga antimikrobiella ämnen är tillgängliga från Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, och säljs som produkt nr A5955. Antimikrobiella medel kan t ex användas i en koncentration av 1 ml/l.

Förfarandena enligt uppfinningen kan också utföras med närings- medium som inkluderar ett ämne som gör att mediet är halvfast eller har en stelnad konsistens vid normala omgivande betingelser. Näringsmediet kan t ex förekomma i form av en hydratiserad gel. En ”gel” är ett ämne som be- reds som en kolloidal lösning och som bildar eller kan bringas att bilda ett halvfast material. En sådan omvandling av en flytande gellösning till ett halv- fast material benämns här ”härdning” eller ”stelning” av gelen. Uttrycket ”hyd- ratiserad gel” hänför sig till en vatteninnehällande gel. Sådana geler framställs genom först upplösning i vatten (där vattnet fungerar som lösningsmedel eller ”kontinuerlig fas”) av ett hydrofilt polymert ämne (som fungerar som löst ämne eller ”dispers fas”), som vid härdning kombineras med den kontinuerliga fasen för bildning av det halvfasta materialet. Vattnet blir således homogent as- socierat med de upplösta molekylerna utan någon betydande separation av den kontinuerliga fasen från den dispersa fasen. Vattenmolekyler kan emel- lertid fritt avlägsnas från en härdad hydratiserad gel, såsom genom förång- ning eller uppsugning av ett groende embryo. I härdat tillstånd har dessa ge- ler egenskapen av eftergivliga fastämnen, såsom en gelatinmassa, där efter- givligheten gradvis minskar och gelen blir mer ”fast” vid beröring när den rela- tiva mängden av vatten i gelen minskar.

Förutom att vara vattenlösliga är lämpliga lösta ämnen för gelen varken cytotoxiska eller väsentligen fytotoxiska. Det här använda uttrycket ”väsentli- gen icke-fytotoxiskt” ämne är ett ämne som inte på något betydande sätt in- terfererar med normal växtutveckling, såsom genom att avdöda ett betydande antal växtceller, väsentligen förändra den cellulära differentieringen eller mog- naden, orsaka mutationer, förstöra ett betydande antal cellmembraner eller 10 15 20 25 30 14 på ett betydande sätt avbryta den cellulära metabolismen eller på ett betydan- de sätt avbryta någon annan process.

Lämpliga lösta ämnen för gelen inkluderar, men är inte begränsade till, följande: natriumalginat, agar, agaros, amylos, pektin, dextran, gelatin, stär- kelse, amylopektin, modifierade cellulosor, såsom metylcellulosa och hydroxi- etylcellulosa, och polyakrylamid. Andra hydrofila lösta ämnen i gelen kan ock- så användas, så länge som de har liknande hydratiserings- och gelnings- egenskaper och saknar toxicitet.

Gelerna bereds vanligtvis genom upplösning av ett ämne som ska lö- sas i gelen, vanligtvis i en fin partikelform, i vatten för bildning av en gellös- ning. Beroende på det särskilda ämnet som ska lösas i gelen är upphettning vanligtvis nödvändig, ibland ända till kokning, innan ämnet som ska lösas i gelen löses upp. Efterföljande kylning gör att många gellösningar ”stelnar” eller ”härdas” reversibelt (gelas). Exempel inkluderar gelatin, agar och aga- ros. Sådana lösta ämnen i gelen benämns ”reversibla”, eftersom återupphett- ning av en härdad gel återbildar gellösningen. Lösningar av andra lösta äm- nen igelen kräver ett ”komplexbildande” ämne, som tjänar till att kemiskt här- da gelen genom tvärbindning av lösta molekyler i gelen. Natriumalginat här- das t ex genom tillsättning av kalciumnitrat (Ca(NO3)2) eller salter av andra tvåvärda joner till gellösningen, såsom, dock utan begränsning till, kalcium, barium, bly, koppar, strontium, kadmium, zink, nickel, kobolt, magnesium och järn. Många av de lösta ämnena i gelen som kräver komplexbildande medel härdas irreversibelt, varvid återupphettning inte återetablerar gellösningen.

Koncentrationen av det lösta ämnet i gelen som krävs för beredning av en tillfredsställande gel enligt föreliggande uppfinning varierar beroende på det särskilda lösta ämnet för gelen. En användbar koncentration av natrium- alginat ligger t ex inom ett område av cirka O,5% till cirka 2,5% (vikt/volym), företrädesvis cirka 0,9% till 1,5% (vikt/volym). En användbar koncentration av agar ligger i området cirka 0,8% till cirka 2,5% (vikt/volym), företrädesvis cirka 1,8% (vikt/volym). Geler som härdats genom komplexbildning kräver i allmän- het mindre löst ämne för gelen för bildning av en tillfredsställande gel jämfört med ”reversibla” geler. 10 15 20 25 30 15 Genom utövandet av förfarandena enligt denna aspekt av uppfinningen har föreliggande uppfinnare åstadkommit ett modifierat (förbättrat) närings- medium för användning i tillverkade frön, såsom beskrivs i Exempel 2. Såsom beskrivs i Exempel 3 och 4 har föreliggande uppfinnare dessutom med hjälp av försök upptäckt att ett tillverkat frö inbegripande ett modifierat närings- medium innehållande från 10 g/l till 100 g/l av ett ej näringsämnesbehandlat adsorbentmaterial och från 350 mg/I till 450 mg/I NH4NO3, från 2000 mg/I till 3000 mg/I KH2PO4 och minst en komponent som är vald från den grupp som består av från 150 mg/I till 300 mg/I myoinositol, från 1,5 mg/I till 3,0 mg/I tiamin-HCI, från 0,30 mg/I till 0,80 mg/l pyridoxin-HCI, från 1,5 mg/I till 3,0 mg/I nikotinsyra, från 0,15 mg/I till 0,30 mg/I riboflavin, från 0,75 mg/I till 2,0 mg/I kalciumpantotenat, från 0,01 mg/I till 0,03 mg/I biotin och från 0,15 mg/I till 0,30 mg/I folsyra, ger en förbättring i groningsgraden och normaliteten för groddämnen jämfört med ett tillverkat frö inbegripande ett konventionellt nä- ringsmedium (dvs KE64) inkluderande 60 g/l näringsämnesbehandlat träkol.

Vid vissa utföringsformer inbegriper det modifierade näringsmediet för användning i det tillverkade fröet cirka 60 g/l ej näringsämnesbehandlat trä- kol, från cirka 350 mg/ till cirka 375 mg/I NH4NO3, från cirka 2000 mg/I till cirka 2100 mg/I KH2PO4 och minst en komponent som är vald från den grupp som består av cirka 200 mg/I myoinositol, cirka 2,0 mg/l tiamin-HCI, cirka 0,50 mg/I pyridoxin-HCI, cirka 2,0 mg/I nikotinsyra, cirka 0,26 mg/I riboflavin, cirka 1,0 mg/I kalciumpantotenat, cirka 0,02 mg/I biotin och cirka 0,25 mg/I folsyra.

Vid vissa utföringsformer inbegriper det tillverkade fröet dessutom en skottbegränsning, där skottbegränsningen inbegriper en hålighet som är stor- leksanpassad till att motta barrträdsembryot. Vid vissa utföringsformer in- begriper det tillverkade fröet dessutom ett barrträdsembryo placerat i skott- begränsningens hålighet.

Vid vissa utföringsformer inbegriper det tillverkade fröet dessutom ett adsorbentmaterial, såsom träkol, i håligheten. Vid vissa utföringsformer är trä- kolet i håligheten näringsämnesbehandlat.

I ett exempel på en utföringsform inbegriper det tillverkade fröet ett näringsmedium som inbegriper cirka 60 g/l ej näringsämnesbehandlat träkol, från cirka 350 mg/ till cirka 375 mg/I NH4NO3, från cirka 2000 mg/I till cirka 10 15 20 25 30 16 2100 mg/l KH2PO4 och minst en komponent som är vald från den grupp som består av cirka 200 mg/I myoinositol, cirka 2,0 mg/I tiamin-HCI, cirka 0,50 mg/I pyridoxin-HCI, cirka 2,0 mg/l nikotinsyra, cirka 0,26 mg/l ribofiavin, cirka 1,0 mg/I kalciumpantotenat, cirka 0,02 mg/I biotin och cirka 0,25 mg/I folsyra.

Medlet MS09, som beskrivs i Exempel 1, 3 och 4, är ett exempel på ett modi- fierat näringsmedium för användning i tillverkade fröer och vid förfarandena för groning, såsom beskrivs här.

Det modifierade (förbättrade) näringsmediet som bildats med hjälp av förfarandena enligt uppfinningen och tillverkade frön inbegripande det modi- fierade näringsmediet kan användas för groning av ett barrträdsembryo. För- farandet enligt denna aspekt av uppfinningen inbegriper (a) placering av ett barrträdsembryo ifunktionell kontakt med ett näringsmedium i ett tillverkat frö, varvid näringsmediet inbegriperfrån 10 g/l till 100 g/l träkol frän 350 mg/I till 450 mg/I NH4NO3, från 2000 mg/I till 3000 mg/I KH2PO4 och minst en kompo- nent som är vald från den grupp som består av från 150 mg/I till 300 mg/l myoinositol, från 1,5 mg/I till 3,0 mg/I tiamin-HCI, från 0,30 mg/I till 0,80 mg/I pyridoxin-HCI, från 1,5 mg/I till 3,0 mg/I nikotinsyra, från 0,15 mg/I till 0,30 mg/I ribofiavin, från 0,75 mg/I till 2,0 mg/I kalciumpantotenat, från 0,01 mg/I till 0,03 mg/I biotin och från 0,15 mg/I till 0,30 mg/I folsyra; och (b) placering av det tillverkade fröet i en miljö som leder till planttillväxt för möjliggörande av att embryot växer och gror med utgångspunkt från det tillverkade fröet.

Såsom beskrivits ovan harföreliggande uppfinnare med hjälp av försök upptäckt att ett tillverkat frö inbegripande ett modifierat näringsmedium för- bättrar groningsfrekvensen för barrträdsembryon jämfört med ett standard- mässigt näringsmedium (t ex KE64). Det modifierade näringsmediet som be- skrivs här i samband med de tillverkade fröerna är också användbart vid för- faranden för groning av ett embryo. Vid sådana utföringsformer av förfarandet är träkolet i det modifierade näringsmediet inte näringsämnesbehandlat före tillsättningen till mediet. Vid vissa utföringsformer inbegriper det modifierade näringsmediet från 10 g/l till 100 g/l träkol. Vid vissa utföringsformer är trä- kolet som sätts till det modifierade näringsmediet från 10 g/l till 100 g/l ej nä- ringsämnesbehandlat träkol (såsom från 20 g/l till 100 g/l, från 50 g/l till 100 g/l, från 60 g/l till 100 g/l eller från 50 g/l till 80 g/l, eller cirka 60 g/l). 10 15 20 25 17 Vid vissa utföringsformer av förfarandet inbegriper det modifierade nä- ringsmediet för användning i det tillverkade fröet cirka 60 g/l ej näringsämnes- behandlat träkol, från cirka 350 mg/ till cirka 375 mg/I NH4NO3, från cirka 2000 mg/I till cirka 2100 mg/I KH2PO4 och minst en komponent som är vald från den grupp som består av cirka 200 mg/I myoinositol, cirka 2,0 mg/I tiamin-HCI, cirka 0,50 mg/I pyridoxin-HCI, cirka 2,0 mg/I nikotinsyra, cirka 0,26 mg/I riboflavin, cirka 1,0 mg/I kalciumpantotenat, cirka 0,02 mg/I biotin och cirka 0,25 mg/I folsyra.

Följande exempel belyser endast det bästa sättet som för närvarande är tilltänkt för utövande av uppfinningen, men detta bör inte tolkas som be- gränsande för uppfinningen.

EXEMPEL 1 I detta exempel tillhandahålls ett representativt förfarande för framställ- ning av ett lämpligt näringsmedium, näringsämnesbehandlat träkol och repre- sentativa tillverkade frön som är lämpliga för användning vid förfarandena enligt uppfinningen.

Förfaranden: 1. Närinqsmedium (KE64-50): framställs genom kombination av bas- mediet KE64 (Tabell 1) med komponenterna i Tabell 2, såsom beskrivits.

KE64-50 bereds med utgångspunkt från i förväg beredda förrådslösningar.

Den erforderliga mängden av varje förrådslösning (som inte är värmelabil) sätts till vatten. Kemikalier som inte härrör från förrådslösningar (såsom träkol och agar) vägs upp och sätts direkt till mediet. Efter det att de ej värmelabila kemikalierna och föreningarna tillsatts, justeras mediets volym till en lämplig nivå, och pH-värdet justeras till 5,7. Medlet steriliseras därefter genom auto- klavering under 25 minuter.

TABELL 1: FORMULERING AV BASMEDIET KE64 Mediumkomponent Slutkoncentration (mg/I) NH4NO3 301,1 H3BO3 10,0 (NH4)2MoO4 0,06 CaClz-ZHZO 299,2 KH2PO4 1800,0 MgSO4-7H2O 1000,0 18 Filtersteriliserade, värmelabila komponenter (Tabell 2) tillsätts efter det att mediet har kylts till 40°C.

Mediumkomponent Slutkoncentration (mg/I) lVlnCl2-4H2O 6,0 ZnSO4-7H2O 0,8 CuCl2-2H2O 0,5 Ferricitrat 60 mg/I Pluronic F-68 10 g/l Agar 18 g/l TABELL 2: Komponenter satta till basmediet KE64 Mediumkomponent Slutkoncentration (mM) Slutkoncentration (mg/I) Myoinositol O,5549 100,0 Tiamin-HCI 0,0030 1,0 Pyridoxin-HCI 0,0012 0,25 Nikotinsyra 0,0081 1,0 Riboflavin 0,0021 0,125 Kalcium pantotenat 0,50 Biotin 0,0003 0,0010 Folsyra 0,8077 0,1250 L-asparagin 1,8255 106,7 L-glutamin 0,3646 266,7 L-lysin-2HCl 0,7612 53,3 DL-serin 0,4631 80 L-prolin 1,5310 53,3 L-arginin-HCI 0,4552 266,7 Urea 13,3200 800 L-valin 0,5983 53,3 L-alanin 0,2203 53,3 L-leucin 0,2448 80 L-treonin 0,3226 26,7 L-fenylalanin 0,1720 53,3 L-histidin 0,1308 26,7 L-tryptofan 0,2035 26,7 L-isoleucin 1,2930 26,7 L-metionin 0,7100 26,7 L-glycin 0,0003 53,3 L-tyrosin 0,2242 53,3 L-cystein 0,6098 26,7 Sackaros 50 g/l Gibberillinsyra (GAW) 0,1 Antimikrobiella ämnen 1,0 ml/I 10 15 20 25 30 19 2. Framställninq av träkol för tillsättninq till mediet och/eller till korro- sionshåliqheten i de tillverkade fröerna A. Framställninq av närinqsämnesbehandlat träkol: Basmediet KE64 (Tabell 1)framställs såsom beskrivs i Exempel 1, men utan Pluronic F-68 och utan agar. Näringsämnesbehandlat träkol bereds enligt följande: 23,3 g träkol av 100 mesh sätts till 1 liter basmedium av typ KE64. Komponenterna auto- klaveras och får svalna till 40°C. Komponenterna i Tabell 2, som beskrivs i Exempel 1, tillsätts sterilt till basmediet KE64, och mediet omrörs under minst 2 timmar för blandning av komponenterna. Medlet filtreras genom filterpapper av typ Whatman nr 1 i en Buchnertratt för uppsamling av träkolet. En fukt- balansvåg används för bestämning av fukthalten i träkolskakan, och torrvikten av träkolet beräknas. Om det näringsämnesförsedda träkolet ska sättas till håligheten hos det tillverkade fröet, torkas det först tills det blir ett flytande material.

B. Framställninq av ei närinqsämnesbehandlat träkol: Träkol av 100 mesh som aktiverats kemiskt genom användning av en fosforsyraprocess (NORIT® CNSP) erhölls från Norit Americas Inc., Marshall, Texas. 3. Framställninq av tillverkade frön: Representativa förfaranden som användes för framställning av tillverkade frön beskrivs i USA-patentskrifterna nr 6 119 395, 5 701 699 och 5 427 593, som här är införlivade genom refe- rens.

Rent allmänt inkluderar tillverkade frön ett fröhölje (24), ett närings- medium (26), ett växtembryo (42) och eventuellt en hjärtbladsbegränsning (22). Ett tillverkat frö som inte inkluderar något växtembryo (42) är känt som ett ”fröråämne”. Fröråämnet är vanligtvis en cylindrisk kapsel med en sluten ände och en öppen ände.

Näringsmediet (26), även benämnt ”gametofytmedium”, är analogt med gametofyten hos ett naturligt frö och är placerat i fröhöljet i syfte att väsentli- gen fylla det inre av fröhöljet. Exempel på näringsmedium (26) för användning i de tillverkade fröerna inkluderar det ovan beskrivna KE64 eller ett modifierat näringsmedium, som såsom beskrivs här kan inkludera från 0 g/l till 100 g/l av en adsorbentkomposition, såsom träkol. Träkolet för användning i närings- 10 15 20 25 30 20 mediet kan vara förbehandlat med näringsämnen, säsom beskrivs ovan, eller kan det vara rent, ej näringsämnesbehandlat träkol.

En sig i Iängdriktningen sträckande härd porös insats, känd som koty- ledonbegränsning (22) är centralt belägen i ena änden av fröhöljet som om- ges av näringsmediet och inkluderar en centralt belägen hålighet (34), även benämnd ”korrosionshälighet”, som partiellt sträcker sig genom hjärtblads- begränsningens längd. Håligheten (34) är storleksanpassad till att motta ett växtembryo (42) däri. Det välkända växtembryot inkluderar en rotämnesände och en hjärtbladsände. Växtembryot avsätts i håligheten för hjärtblads- begränsningen (22) med hjärtbladsänden först. Växtembryot tillsluts därefter i fröräämnet med hjälp av en ändtillslutning (43). En försvagad punkt i ändtill- slutningen (43) möjliggör att växtembryots rotämnesände kan penetrera änd- tillslutningen.

Vid ett exempel på ett förfarande för framställning av ett tillverkat frö för användning enligt uppfinningen framställs fröhöljet genom avskärning av en polykaprolaktonslang till en lämplig längd. Keramiska skottbegränsningar framställs genom injektion av en porslinsremsa i en förformad mall med hjälp av en näl i centrum för ästadkommande av den skottaccepterande häligheten.

Remsan fär torka till en konsistens som möjliggör avlägsnande av den för- formade begränsningen. Begränsningen upphettas därefter till en temperatur som möjliggör att porslinet bildar en porös men sammansmält struktur. Be- gränsningen kan tvättas med syra för avlägsnande av föroreningar, om sä är önskvärt. Locken framställs genom försträckning av ParafilmW' (Pechiney Plastic Packaging, Chicago, Illinois 60631).

Det tillverkade fröet sätts samman genom termobondning av den kera- miska skottbegränsningen (22) till fröhöljet (24). Fröhöljet (24) fylls därefter med näringsmedium (26), och ett embryo sätts in i häligheten (34) i hjärt- bladsbegränsningen (22) med hjärtbladsänden först. Torrt träkolsfyllmaterial (80) (antingen näringsämnesbehandlat eller ej näringsämnesbehandlat) kan fyllas i hjärtbladsbegränsningen efter det att embryot förts in i häligheten (34).

Efter det att träkolet har tillsatts, tillsluts fröna med en andra ändtillslutning ge- nom placering därav över den öppna änden av fröet och sammansmältning av locken till ytan med hjälp av värme. De primära ändtillslutningarna doppas 10 15 20 25 30 21 i blåvaxblandning före vidhäftning till den andra ändtillslutningen. Detta be- främjar en tillfredsställande bindning mellan de primära och sekundära ändtill- slutningarna. Fröna penslas därefter med antimikrobiella medel. 4. Framställnind av växtembrvon: Zygotiska embryon bereds med utgångspunkt från botaniska frön.

Fröna ytsteriliseras med hjälp av metoder som är liknande de som beskrivits tidigare (Cyr et al, Seed Sci. Res. 1:91-97 (1991)). Fröna knäcks så att de öppnas, och de zygotiska embryona dissekeras ut från megagametofyten med hjälp av en skalpell och pincett i ett dragskåp med laminärt flöde.

Somatiska embryon framställs med hjälp av standardmetoder som tidi- gare beskrivits (se t ex USA-patentskrifterna nr 4 957 866, 5 034 326, 5 036 007, 5 041 382, 5 236 841, 5 294 549, 5 482 857, 5 563 061 och 5 821 126). Växtvävnad kan t ex odlas i ett initieringsmedium som inkluderar hormoner för initiering av bildning av embryogena celler, såsom embryo- suspensormassor med förmåga att utvecklas till somatiska embryon. De embryogena cellerna kan därefter odlas vidare i ett uppehållsmedium som befrämjar etablering och förökning av de embryogena cellerna. Därefter kan de förökade embryogena cellerna odlas i ett utvecklingsmedium som befräm- jar utveckling av somatiska embryon, som dessutom kan underkastas efter- utvecklingsbehandlingar, såsom behandlingar med kyla. De somatiska embryon som används vid förfarandena enligt uppfinningen harfullbordat ut- vecklingsskedet i den somatiska embryogenesprocessen. De kan också ha underkastats en eller flera efterutvecklingsbehandlingar. 5. Groning: En lämplig mängd steril sand bereds genom bränning av 2 liter sand vid en temperatur av 191 °C (375°F) under 24 timmar. Sanden sätts därefter till i förväg steriliserade tråg, och 285 ml vatten tillsätts. Fåror åstad- koms därefter, och lådan tillsluts. Lådan som innehåller sanden autoklaveras därefter under 1 timme vid 121 °C och ett tryck av 1 atmosfär.

De tillverkade fröerna sås i sanden och tillåts gro. Vanligtvis odlas de tillverkade fröna i kontinuerligt ljus vid rumstemperatur (23°C) under fyra-fem veckor. Åtskilliga parametrar kan mätas för bestämning av groningsfrekvensen för de tillverkade fröna och groddämnenas kvalitet. 10 15 20 25 30 22 Vid en fastställd tidpunkt efter säning kan längderna av rotämnet, hypokotylen, hjärtbladen och epikotylen hos groddämnena mätas.

Uttrycket ”rotämne” hänför sig till den del av ett växtembryo som ut- vecklas till den primära roten hos den resulterande plantan.

Uttrycket ”hjärtblad” hänför sig allmänt till den första, det första paret eller den första kransen (beroende på växttypen) av bladliknande strukturer pä växtembryot som huvudsakligen tjänar till att göra näringsämnesföreningar i fröet tillgängliga för embryot under utveckling, men som i vissa fall fungerar som näringsämnesförvaring eller fotosyntesstrukturer.

Uttrycket ”hypokotyl” hänför sig till den del av ett växtembryo eller en groddplanta som är belägen under hjärtbladen, men ovanför rotämnet.

Uttrycket ”epikotyl” hänför sig till den del av groddplantans stam som befinner sig ovanför hjärtbladen.

Groningsgraden kan mätas och normaliteten för groddämnena kan ocksä bedömas. Ett ”normalt groddämne” eller ”normalitet” betecknar när- varon av samtliga förväntade delar av en växt vid utvärderingstillfället. I fallet med gymnospermer karakteriseras normalitet av att rotämnet har en längd av mer än 3 mm och inga synliga urskiljningsbara missbildningarjämfört med ut- seendet hos embryon som grott med utgångspunkt från ett naturligt frö.

”Onormal” innebär att vävnad på minst ett organ är svälld och att roten och hjärtbladen är döda. "Fullständigt extraherad men onormal” innebär att grodd- ämnet har trängt ut fullständigt från häligheten, men att det inte är normalt.

"Oförändrat" innebär att embryot inte har förändrats från dag ett av försöket (dvs ingen groning har skett).

EXEMPEL 2 I detta exempel beskrivs beredning av ett modifierat näringsmedium för anvädning i tillverkade frön innehållande ej näringsämnesbehandlat träkol.

Förfaranden: KE64-mediet, som framställts säsom beskrivs i Exempel 1, inkuberades i närvaro eller frånvaro av näringsämnesbehandlat eller ej näringsämnesbehandlat träkol, och koncentrationen av mediumkomponenter- na mättes efter inkubation.

Det näringsämnesbehandlade träkolet av 100-mesh bereddes säsom beskrivs i Exempel 1. 10 Testade betingelser: 1. KE64-medium utan tillsatt träkol (prov 012). 2. KE64-medium plus 60 g/l ej näringsämnesbehandlat träkol av 100 mesh (prov 013). 3. KE64-medium plus 60 g/I näringsämnesbehandlat träkol av 100 mesh (prov 014). 23 Träkol tillsattes där så anges, blandades och inkuberades under 2 tim- mar. Koncentrationen av mediumkomponenterna analyserades såsom visas nedan i Tabell 2.

TABELL 3: Jämförelse av uppmätt koncentration av mediumkomponenter före och efter inkubation i närvaro av träkol. Mätresultaten anges i mg/l, såvida inget annat anges.

KE64-medium KE64-medium plus träkol KE64-medium KE64-medium plus träkol (näringsämnes- (inget träkol) (inget träkol) (obehandlat) behandlat) Förväntad slut- Uppmätt Uppmätt Uppmätt koncentration koncentration koncentration koncentration (mg/I) (mg/I) (mg/I) (mg/I) Medium kom ponent "B" ”C” ”D” ”E” NH4NO3 301,1 322,3 296,8 381,3 H3BO3 10,0 11,4 9,7 11,4 (NH4)2MoO4 0,06 0,08 0,02 0,02 CaCl2-2H2O 299,2 275,9 124,7 271,1 KH2PO4 1800,0 1573 2513 1907 MgSO4-7H2O 1000,0 987,3 635,6 960,9 MnCl2-4H2O 6,0 3,8 1,7 3,9 ZnSO4-7H2O 0,8 0,15 0,09 0,10 CuClz-ZHZO 0,5 0,27 <0,01 <0,01 Myoinositol 100,0 ND ND ND Tiamin-HCI 1,0 ND ND ND Pyridoxin-HCI 0,25 ND ND ND Nikotinsyra 1,0 ND ND ND Riboflavin 0,13 ND ND ND Kalciumpantotenat 0,50 ND ND ND Biotin 0,0010 ND ND ND Folsyra 0,1250 ND ND ND L-asparagin/serin 187 191 155 204 L-glutamin/histidin 293 231 166 206 24 KE64-medium KE64-medium plus träkol KE64-medium KE64-medium plus träkol (näringsämnes- (inget träkol) (inget träkol) (obehandlat) behandlat) Förväntad slut- Uppmätt Uppmätt Uppmätt koncentration koncentration koncentration koncentration (mg/I) (mg/I) (mg/I) (mg/I) Mediumkomponent ”B” ”C” ”D” ”E” L-lysin-HCI 53,3 43 21 32 DL-serin 80,0 ND ND ND L-prolin 53,3 94 87 100 L-arginin-HCI 266,7 256 43 76 L-valin 53,3 50 41 49 L-alanin 53,3 45 40 49 L-leucin 80,0 75 48 64 L-treonin 26.7 44 37 42 L-fenylalanin 53,3 51 5 10 L-tryptofan 26,7 19 ND ND L-isoleucin 26,7 25 16 22 L-metionin 26,7 18 ND ND L-glycin 53,3 52 40 51 L-tyrosin 53,3 56 3 6 L-cystein 26,7 ND ND ND Sackaros 50,0 g/l 52,8 g/l 49,2 g/l 63,2 g/l Urea 800 ND ND ND TABELL 4: Analys av resultaten i TABELL 3 Ökning i näringsämnes- koncentration i supernatant Koncentration pga tillsättning absorberad till av behandlat Justerings- träkol, mg/I träkol till faktor för Ny start- mediet, mg/I mediet koncentration (C-D) (E-C) (E/C) (HxB) Mediumkomponent ”F” ”G” ”H” ”l” NH4NO3 25,5 59,0 1,2 361,3 H3BO3 1,7 0,0 1,0 10,00

Claims (20)

10 15 20 25 30 37 PATENTKRAV

1. Förfarande för framställning av ett förbättrat näringsmedium inbegripande ett adsorbentmaterial för odling av växtceller, varvid förfarandet inbegriper: (a) bestämning huruvida det föreligger en reduktion av koncentrationen av en eller flera komponenter i ett första näringsmedium efter inkubation med en önskad mängd adsorbentmaterial; och (b) framställning av ett förbättrat näringsmedium inbegripande samma komponenter som det första näringsmediet, varvid det förbättrade närings- mediet inbegriper: (i) en ökad koncentration av nämnda en eller flera komponenter som vid steg (a) bestämdes ha reducerad koncentration i närvaro av adsor- bentmaterialet; och (ii) samma typ av adsorbentmaterial inom ett koncentrations- område som är högst tvåfaldigt jämfört med det som användes vid steg (a).

2. Förfarande enligt krav 1, varvid adsorbentmaterialet är valt från den grupp som består av träkol, polyvinylpyrrolidon och silikagel.

3. Förfarande enligt krav 1, varvid adsorbentmaterialet är träkol.

4. Förfarande enligt krav 3, varvid koncentrationen av träkol som ska sättas till det förbättrade näringsmediet är från cirka 1 g/l till cirka 100 g/l.

5. Förfarande enligt krav 3, varvid träkolet inte näringsämnesbehandlas före tillsättningen till näringsmediet.

6. Förfarande enligt krav 3, varvid näringsmediet är avsett för tillväxt av barr- trädsceller.

7. Förfarande enligt krav 1, varvid det förbättrade näringsmediet inbegriper minst 2 komponenter som är valda från den grupp som består av NH4NO3, 10 15 20 25 30 38 KH2PO4, MgSO4, FeSO4, myoinositol, tiamin-HCI, pyridoxin-HCI, nikotinsyra, riboflavin, kalciumpantotenat, biotin och folsyra, DL-serin, L-prolin, L-arginin- HCI och L-alanin.

8. Förfarande enligt kravet 1, varvid det dessutom inbegriper placering av det första näringsmediet från steg (a) i en första uppsättning av tillverkade frön och placering av det förbättrade näringsmediet från steg (b) i en andra upp- sättning av tillverkade frön, placering av ett barrträdsembryo i funktionell kontakt med näringsmediet i vart och ett av de tillverkade fröna från den första och den andra uppsättningen av tillverkade frön, placering av de till- verkade fröna i en miljö som leder till planttillväxt och jämförelse av gronings- frekvenserna för embryona frän den första och andra uppsättningen av till- verkade frön.

9. Förfarande för framställning av ett förbättrat näringsmedium inbegripande ett adsorbentmaterial för odling av växtceller, varvid förfarandet inbegriper: (a) inkubation av ett första näringsmedium inbegripande en förut- bestämd initial koncentration av komponenter inbegripande en eller flera kol- källor, vitaminer, mineraler och aminosyror med en önskad mängd adsorbent- material för tillsättning till ett förbättrat näringsmedium; (b) bestämning huruvida det föreligger en reduktion av koncentrationen av en eller flera av komponenterna i det första näringsmediet efter inkubatio- nen vid steg (a) jämfört med den förutbestämda initiala koncentrationen av komponenten; och (c) framställning av ett förbättrat näringsmedium inbegripande samma komponenter som det första näringsmediet, varvid det förbättrade närings- mediet inbegriper: (i) en ökad koncentration av nämnda en ellerflera komponenter som vid steg (b) bestämdes ha en reducerad koncentration i närvaro av adsorbentmaterialet; och (ii) samma typ av adsorbentmaterial i ett koncentrationsområde som är högst tväfaldigtjämfört med det som användes vid steg (a). 10 15 20 25 30 39

10. Förfarande enligt kravet 9, varvid det första näringsmediet inkuberas med adsorbentmaterialet under en tidsperiod av minst 10 minuter upp till en vecka.

11. Förfarande enligt kravet 9, varvid adsorbentmaterialet är valt från den grupp som består av träkol, polyvinylpolypyrrolidon och silikagel.

12. Förfarande enligt kravet 9, varvid adsorbentmaterialet är träkol.

13. Förfarande enligt kravet 12, varvid koncentrationen av träkol som ska sät- tas till det förbättrade näringsmediet ärfrän 1 g/l till cirka 100 g/l.

14. Förfarande enligt kravet 12, varvid träkolet inte näringsämnesbehandlas före tillsättningen till näringsmediet.

15. Förfarande enligt kravet 9, varvid näringsmediet är avsett för tillväxt av barrträdsceller.

16. Förfarande enligt kravet 9, varvid näringsmediet inbegriper minst tvä kom- ponenter som är valda från den grupp som består av NH4NO3, KH2PO4, MgSO4, FeSO4, myoinositol, tiamin-HCI, pyridoxin-HCI, nikotinsyra, riboflavin, kalciumpantotenat, biotin och folsyra, DL-serin, L-prolin, L-arginin-HCI och L- alanin.

17. Förfarande enligt kravet 9, varvid volymen av näringsmediet som inkube- rats vid steg (a) är 1/4 till 1/1000 av volymen av det förbättrade näringsmediet frän steg (c).

18. Förfarande enligt kravet 9, varvid det dessutom inbegriper placering av det förbättrade näringsmediet frän steg (c) i ett eller flera tillverkade frön.

19. Förfarande enligt kravet 18, varvid det dessutom inbegriper placering av ett barrträdsembryo ifunktionell kontakt med näringsmediet i det tillverkade fröet. 10 40

20. Förfarande enligt kravet 9, varvid det dessutom inbegriper placering av det första näringsmediet från steg (a) i en första uppsättning av tillverkade frön och placering av det förbättrade näringsmediet från steg (b) i en andra uppsättning av tillverkade frön, placering av ett barrträdsembryo i funktionell kontakt med näringsmediet i vart och ett av de tillverkade fröna från den första och den andra uppsättningen av tillverkade frön, placering av de till- verkade fröna i en miljö som leder till planttillväxt och jämförelse av gronings- frekvenserna för embryona från den första och andra uppsättningen av till- verkade frön.