RU2838337C2 - Optical device for single-molecule dna sequencing based on real-time parallel fluorescence detection - Google Patents
Optical device for single-molecule dna sequencing based on real-time parallel fluorescence detection Download PDFInfo
- Publication number
- RU2838337C2 RU2838337C2 RU2024136066A RU2024136066A RU2838337C2 RU 2838337 C2 RU2838337 C2 RU 2838337C2 RU 2024136066 A RU2024136066 A RU 2024136066A RU 2024136066 A RU2024136066 A RU 2024136066A RU 2838337 C2 RU2838337 C2 RU 2838337C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- planar substrate
- wells
- detector
- nanosized
- exciting radiation
- Prior art date
Links
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 title claims abstract description 61
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 title claims description 7
- 230000005855 radiation Effects 0.000 claims abstract description 64
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 57
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 28
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims abstract description 10
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 5
- 230000005284 excitation Effects 0.000 claims description 22
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 16
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 238000009434 installation Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 13
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 11
- 108091006146 Channels Proteins 0.000 description 8
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 7
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 102100030569 Nuclear receptor corepressor 2 Human genes 0.000 description 5
- 101710153660 Nuclear receptor corepressor 2 Proteins 0.000 description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 3
- 238000000295 emission spectrum Methods 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 2
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000010972 statistical evaluation Methods 0.000 description 2
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 1
- 101000694017 Homo sapiens Sodium channel protein type 5 subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
Abstract
Description
Группа изобретений относится к области аналитического приборостроения, а более конкретно к устройствам, предназначенным для определения первичной структуры единичных молекул ДНК, выделенных из биологических образцов, с целью обеспечения потребностей медицины и научных исследований.The group of inventions relates to the field of analytical instrumentation, and more specifically to devices intended for determining the primary structure of single DNA molecules isolated from biological samples, in order to meet the needs of medicine and scientific research.
Основной технологией для установления первичной структуры молекул ДНК является секвенирование. В результате секвенирования определяются последовательности нуклеотидов в молекулах ДНК. Одним из методов секвенирования, позволяющих определять структуру единичных молекул ДНК и не требующего предварительной наработки копий исследуемых молекул, является метод секвенирования единичной молекулы в реальном времени (далее - SMRT-секвенирование). В общем виде, процесс SMRT-секвенирования сводится к следующему. Комплексы из полимеразы и исследуемых образцов, одноцепочечных линейных или кольцевых фрагментов ДНК (далее - комплексы ДНК-полимераза), загружаются в реакционную ячейку, где закрепляются на дне волноводов нулевой моды (далее - наноразмерные колодцы). После добавления в реакционную ячейку ионов металлов, например Mg2+, флуоресцентно-меченные нуклеотиды, диффундирующие в растворе в реакционной ячейке, встраиваются полимеразой в комплекс по принципу комплементарности. Различные флуоресцентные метки, прикрепленные и однозначно соответствующие каждому из типов встраиваемых нуклеотидов, можно дифференцировать оптическими методами. Эмиссионные излучения от наноразмерных колодцев с иммобилизированными на их дне единственными комплексами ДНК-полимераза, индуцируемые системой возбуждения, регистрируются матричным детектором и интерпретируются как последовательность нуклеотидов в анализируемых фрагментах ДНК. Реализация SMRT-секвенирования известна из уровня техники, в частности, комплексы ДНК-полимераза описаны в патентах №№ US 8153375 B2 и US 9416414 B2, наноразмерные колодцы - в патентах №№ US 6917726 B2 и US 7315019 B2.The main technology for establishing the primary structure of DNA molecules is sequencing. As a result of sequencing, the nucleotide sequences in DNA molecules are determined. One of the sequencing methods that allows determining the structure of single DNA molecules and does not require preliminary production of copies of the molecules under study is the method of single-molecule sequencing in real time (hereinafter - SMRT sequencing). In general, the SMRT sequencing process is as follows. Complexes of polymerase and the samples under study, single-stranded linear or circular DNA fragments (hereinafter - DNA-polymerase complexes), are loaded into the reaction cell, where they are fixed to the bottom of zero-mode waveguides (hereinafter - nanoscale wells). After adding metal ions, such as Mg 2+ , to the reaction cell, fluorescently labeled nucleotides diffusing in the solution in the reaction cell are built into the complex by the polymerase according to the principle of complementarity. Various fluorescent labels attached to and uniquely corresponding to each type of embedded nucleotides can be differentiated by optical methods. Emission emissions from nanosized wells with single DNA-polymerase complexes immobilized at their bottom, induced by the excitation system, are recorded by a matrix detector and interpreted as a nucleotide sequence in the analyzed DNA fragments. The implementation of SMRT sequencing is known from the prior art, in particular, DNA-polymerase complexes are described in patents Nos. US 8153375 B2 and US 9416414 B2, nanosized wells - in patents Nos. US 6917726 B2 and US 7315019 B2.
Устройство, реализующее SMRT-секвенирование, должно обеспечивать непрерывность детектирования эмиссионных излучений. Это связано с невозможностью синхронизации процессов встраивания полимеразой нуклеотидов и интервального режима работы детектора, состоящего из последовательностей накопления сигнала флуоресценции и его обработки. Необходимость непрерывного детектирования накладывает требование соответствия поля зрения детектора всему множеству наноразмерных колодцев на подложке реакционной ячейки. Для обеспечения улучшенной статистической оценки данных необходимо проецировать флуоресцентный сигнал на множестве пикселей детектора, превышающих минимальный пороговый уровень, желательным является предоставление достаточных данных о сигнале по меньшей мере с 2 пикселей детектора. Таким образом, все наноразмерные колодцы должны быть в поле зрения детектора, а флуоресцентному сигналу от каждого наноразмерного колодца должно соответствовать не менее 2 пикселей детектора.The device implementing SMRT sequencing must ensure continuous detection of emission emissions. This is due to the impossibility of synchronizing the processes of nucleotide polymerase incorporation and the interval mode of detector operation, consisting of sequences of fluorescence signal accumulation and its processing. The need for continuous detection imposes a requirement for the detector's field of view to correspond to the entire set of nanosized wells on the reaction cell substrate. To ensure improved statistical evaluation of the data, it is necessary to project the fluorescent signal onto a set of detector pixels exceeding the minimum threshold level; it is desirable to provide sufficient data on the signal from at least 2 detector pixels. Thus, all nanosized wells must be in the detector's field of view, and the fluorescent signal from each nanosized well must correspond to at least 2 detector pixels.
В известных патентах №№ US 8264687 B2 и US 11162138 B2 представлены варианты реализации детектора устройства для SMRT-секвенирования. Лазеры с различными длинами волн через соответствующие оптические фильтры освещают подложку реакционной ячейки. Флуоресцентные сигналы, излучаемые образцами в наноразмерных колодцах, пропускаются через каскад дихроичных фильтров. Таким образом, эти сигналы разделяются на четыре спектральных канала, каждый из которых поступает на свой матричный детектор.The known patents Nos. US 8264687 B2 and US 11162138 B2 present embodiments of the detector of the device for SMRT sequencing. Lasers with different wavelengths illuminate the substrate of the reaction cell through appropriate optical filters. Fluorescent signals emitted by samples in nanosized wells are passed through a cascade of dichroic filters. Thus, these signals are divided into four spectral channels, each of which is fed to its own matrix detector.
Недостатком технического решения является его сложность, поскольку необходимо использовать четыре детектора, соответствующих четырем спектральным каналам. Другим недостатком является необходимость синхронизации в реальном времени и совмещения изображений всех наноразмерных колодцев в четырех каналах.The disadvantage of the technical solution is its complexity, since it is necessary to use four detectors corresponding to four spectral channels. Another disadvantage is the need for real-time synchronization and superposition of images of all nano-sized wells in four channels.
В патентах США №№ US 7805081 B2 и US 8053742 B2 предложена оптическая схема, в которой различные спектры излучения от каждого наноразмерного колодца направляются через дифракционную решетку, призму или набор дифракционных решеток и/или призм для пространственного разделения отдельных спектров и направления их на различные участки детектора. В систему также включены оптические компоненты для фильтрации фонового освещения и ограничения спектра эмиссионного излучения, поступающего на детектор.U.S. Patent Nos. US 7,805,081 B2 and US 8,053,742 B2 propose an optical system in which the different emission spectra from each nanometer-sized well are directed through a diffraction grating, a prism, or an array of diffraction gratings and/or prisms to spatially separate the individual spectra and direct them to different areas of a detector. The system also includes optical components for filtering background illumination and limiting the emission spectrum reaching the detector.
Недостатком патентов является отсутствие решений, направленных на оптимизацию топологии и увеличение плотности расположения наноразмерных колодцев на подложке реакционной ячейки.The disadvantage of the patents is the lack of solutions aimed at optimizing the topology and increasing the density of the nanoscale wells on the substrate of the reaction cell.
В патентах США №№ US 11640022 B2, US 10724090 B2 и US 10578788 B2 предложено устройство с интегрированными элементами, в котором оптическое возбуждение обеспечивается при помощи волноводов, а детектирование осуществляется множеством детекторов. При этом, каждому наноразмерному колодцу соответствует не менее одного детектора.US Patents Nos. US 11640022 B2, US 10724090 B2 and US 10578788 B2 propose a device with integrated elements in which optical excitation is provided by waveguides and detection is performed by multiple detectors. In this case, each nano-sized well corresponds to at least one detector.
Недостатком устройства является ее сложность и экономическая необоснованность при необходимости однократного использования реакционной ячейки.The disadvantage of the device is its complexity and economic unjustification when it is necessary to use the reaction cell only once.
В патентах №№ US 5578832 A и US 8053742 B2 предложено разделить оптические пути возбуждающего излучения и эмиссионного излучения: эмиссионное излучение направляется к детектору через объектив, центральная ось которого совпадает с нормалью к поверхности планарной подложки реакционной ячейки; возбуждающее излучение подводится не через объектив, а под углом к указанной нормали. Дополнительно предложено отраженное от подложки возбуждающее излучение направлять на фотодиоды, таким образом обеспечивая контролируемое регулирование положения фокальной плоскости и мощности источника возбуждающего излучения.In patents Nos. US 5578832 A and US 8053742 B2 it is proposed to separate the optical paths of the exciting radiation and the emission radiation: the emission radiation is directed to the detector through an objective, the central axis of which coincides with the normal to the surface of the planar substrate of the reaction cell; the exciting radiation is supplied not through the objective, but at an angle to the said normal. It is additionally proposed to direct the exciting radiation reflected from the substrate to photodiodes, thus ensuring controlled regulation of the position of the focal plane and the power of the exciting radiation source.
Недостатком этого технического решения является отсутствие обоснования выбора угла падения возбуждающего излучения.The disadvantage of this technical solution is the lack of justification for the choice of the angle of incidence of the exciting radiation.
Ближайшим из известных изобретений по технической сущности и назначению является патент № US 7692783 B2. В патенте предложено обеспечивать различное расстояние между параллельными рядами наноразмерных колодцев по осям X и Y для увеличения пространственного разложения спектра сигналов от каждого наноразмерного колодца без их взаимного пересечения на детекторе. Для примера приводятся значения 7,55 и 1,335 мкм соответственно. Недостатком патента является неоптимальное использование площади подложки реакционной ячейки и усложнение технологии ее производства.The closest known invention in technical essence and purpose is patent No. US 7692783 B2. The patent proposes to provide different distances between parallel rows of nanosized wells along the X and Y axes to increase the spatial decomposition of the signal spectrum from each nanosized well without their mutual intersection on the detector. As an example, the values 7.55 and 1.335 μm are given, respectively. The disadvantage of the patent is the non-optimal use of the reaction cell substrate area and the complication of its production technology.
Целью предлагаемой группы изобретений является упрощение устройства для одномолекулярного секвенирования ДНК и повышение производительности этого устройства за счет оптимизации плотности расположения наноразмерных колодцев на подложке реакционной ячейки и увеличение отношения сигнал/шум флуоресцентных сигналов, регистрируемых детектором.The aim of the proposed group of inventions is to simplify a device for single-molecule DNA sequencing and to increase the productivity of this device by optimizing the density of the arrangement of nanosized wells on the substrate of the reaction cell and increasing the signal-to-noise ratio of fluorescent signals recorded by the detector.
Указанная цель достигается за счет создания оптического устройства для одномолекулярного секвенирования ДНК на основе параллельного детектирования флуоресценции в режиме реального времени, которое включает платформу для установки реакционной ячейки, содержащей планарную подложку с множеством наноразмерных колодцев, расположенных параллельными рядами в направлении взаимно перпендикулярных осей X и Y и содержащих реактивы и исследуемые образцы, источник возбуждающего излучения, детектор, блок управления и регистрации и оптическую систему, сконфигурированную для направления возбуждающего излучения от источника возбуждающего излучения на планарную подложку и для проецирования на детекторе спектрально разделенных флуоресцентных излучений от наноразмерных колодцев под углом относительно оси X параллельных рядов наноразмерных колодцев.The said objective is achieved by creating an optical device for single-molecule DNA sequencing based on parallel fluorescence detection in real time, which includes a platform for installing a reaction cell containing a planar substrate with a plurality of nanosized wells arranged in parallel rows in the direction of mutually perpendicular axes X and Y and containing reagents and test samples, a source of exciting radiation, a detector, a control and recording unit, and an optical system configured to direct the exciting radiation from the source of exciting radiation onto the planar substrate and to project spectrally separated fluorescent radiation from the nanosized wells onto the detector at an angle relative to the X axis of the parallel rows of nanosized wells.
В одном из вариантов реализации оптического устройства для одномолекулярного секвенирования ДНК на основе параллельного детектирования флуоресценции в режиме реального времени выбраны равные расстояния между рядами наноразмерных колодцев на планарной подложке по осям X и Y.In one embodiment of an optical device for single-molecule DNA sequencing based on parallel fluorescence detection in real time, equal distances are selected between rows of nanosized wells on a planar substrate along the X and Y axes.
В другом варианте реализации оптического устройства для одномолекулярного секвенирования ДНК на основе параллельного детектирования флуоресценции в режиме реального времени расстояния между рядами наноразмерных колодцев на планарной подложке по осям X и Y увеличиваются по мере отдаления от центра планарной подложки.In another embodiment of an optical device for single-molecule DNA sequencing based on parallel real-time fluorescence detection, the distances between rows of nanoscale wells on a planar substrate along the X and Y axes increase with distance from the center of the planar substrate.
Также указанная цель достигается за счет создания оптического устройства для одномолекулярного секвенирования ДНК на основе параллельного детектирования флуоресценции в режиме реального времени, которое включает платформу для установки реакционной ячейки, содержащей планарную подложку с множеством наноразмерных колодцев, расположенных параллельными рядами в направлении взаимно перпендикулярных осей X и Y и содержащих реактивы и исследуемые образцы, источник возбуждающего излучения, детектор, оптическую систему, сконфигурированную для направления возбуждающего излучения от источника возбуждающего излучения на планарную подложку под углом Θ = 10-45° относительно поверхности планарной подложки и для проецирования на детекторе спектрально разделенных флуоресцентных излучений от наноразмерных колодцев, и блок управления и регистрации.The said objective is also achieved by creating an optical device for single-molecule DNA sequencing based on parallel fluorescence detection in real time, which includes a platform for installing a reaction cell containing a planar substrate with a plurality of nanosized wells arranged in parallel rows in the direction of mutually perpendicular axes X and Y and containing reagents and samples under study, a source of exciting radiation, a detector, an optical system configured to direct the exciting radiation from the source of exciting radiation onto the planar substrate at an angle of Θ = 10-45° relative to the surface of the planar substrate and to project spectrally separated fluorescent radiation from the nanosized wells onto the detector, and a control and recording unit.
В одном из вариантов реализации оптического устройства для одномолекулярного секвенирования ДНК на основе параллельного детектирования флуоресценции в режиме реального времени оптическая система имеет в своем составе блок фотодиодов для регистрации отраженного от планарной подложки возбуждающего излучения.In one embodiment of an optical device for single-molecule DNA sequencing based on parallel detection of fluorescence in real time, the optical system includes a block of photodiodes for recording the exciting radiation reflected from a planar substrate.
В другом варианте реализации оптического устройства для одномолекулярного секвенирования ДНК на основе параллельного детектирования флуоресценции в режиме реального времени оптическая система имеет в своем составе систему зеркал, увеличивающих длину оптического пути отраженного возбуждающего излучения от планарной подложки до блока фотодиодов.In another embodiment of an optical device for single-molecule DNA sequencing based on parallel detection of fluorescence in real time, the optical system includes a system of mirrors that increase the length of the optical path of the reflected excitation radiation from the planar substrate to the photodiode block.
В ещё одном из вариантов реализации оптического устройства для одномолекулярного секвенирования ДНК на основе параллельного детектирования флуоресценции в режиме реального времени блок управления и регистрации или часть блока управления и регистрации реализованы в виде компьютера.In another embodiment of the optical device for single-molecule DNA sequencing based on parallel detection of fluorescence in real time, the control and recording unit or part of the control and recording unit is implemented in the form of a computer.
Более полное представление о раскрываемом изобретении может быть получено из нижеследующего раздела “Осуществление изобретения” совместно с прилагаемыми чертежами, на которых представлено:A more complete understanding of the disclosed invention can be obtained from the following section “Implementation of the invention” together with the attached drawings, which show:
ФИГ. 1 - Блок-схема, отражающая функциональный состав и соединения составных частей предлагаемого устройства;FIG. 1 - Block diagram reflecting the functional composition and connections of the component parts of the proposed device;
ФИГ. 2 - Схематическое изображение распространения возбуждающего излучения, отраженного возбуждающего излучения и эмиссионного возбуждения от объектов в наноразмерных колодцах планарной подложки;FIG. 2 - Schematic representation of the propagation of exciting radiation, reflected exciting radiation and emission excitation from objects in nanosized wells of a planar substrate;
ФИГ. 3 - Схематическое изображение оптических систем детектирования без пространственного разделения спектральных каналов эмиссионного излучения (А) и с пространственным разделением (Б) и примеры соответствующих изображений с детектора (справа);FIG. 3 - Schematic representation of optical detection systems without spatial separation of spectral channels of emission radiation (A) and with spatial separation (B) and examples of corresponding images from the detector (on the right);
ФИГ. 4 - Схематическое изображение наноразмерных колодцев и пространственно разделенных спектральных каналов эмиссионного излучения, расположенных между наноразмерными колодцами по оси X (А) и под углами относительно оси X (Б и В);FIG. 4 - Schematic representation of nanoscale wells and spatially separated spectral channels of emission radiation located between the nanoscale wells along the X axis (A) and at angles relative to the X axis (B and C);
ФИГ. 5 - Углы поворота осей спектрального разложения эмиссионного излучения относительно оси X.FIG. 5 - Angles of rotation of the axes of spectral decomposition of emission radiation relative to the X axis.
Осуществление изобретенияImplementation of the invention
Далее будут раскрыты некоторые примеры для формирования общего представления о принципах конструкции, функционирования, изготовления и применения устройств, раскрытых в настоящем описании. Несколько примеров проиллюстрированы на прилагаемых чертежах. Специалистам в данной области техники будет понятно, что конкретные устройства, раскрытые в настоящем описании и проиллюстрированные на прилагаемых чертежах, не являются ограничивающими примерами, а также то, что объем настоящего раскрытия определен исключительно формулой изобретения. Отличительные признаки, проиллюстрированные или раскрытые на одном примере, могут быть скомбинированы с отличительными признаками других примеров. Предполагается, что подобные модификации или варианты входят в объем настоящего раскрытия.Some examples will now be disclosed to form a general idea of the principles of design, operation, manufacture and use of the devices disclosed in the present description. Several examples are illustrated in the accompanying drawings. It will be understood by those skilled in the art that the specific devices disclosed in the present description and illustrated in the accompanying drawings are not limiting examples, and that the scope of the present disclosure is determined solely by the claims. Distinctive features illustrated or disclosed in one example may be combined with distinctive features of other examples. It is assumed that such modifications or variations are included in the scope of the present disclosure.
В предлагаемом устройстве для одновременного детектирования оптических сигналов флуоресценции в режиме реального времени при секвенировании ДНК использованы технические решения, приведенные на блок-схеме, изображенной на ФИГ. 1.The proposed device for simultaneous detection of optical fluorescence signals in real time during DNA sequencing uses the technical solutions shown in the block diagram depicted in FIG. 1.
Предлагаемое устройство имеет в своем составе платформу 1, в которую помещается реакционная ячейка 2, внутри которой располагается планарная подложка 3 с множеством наноразмерных колодцев; источник возбуждающего излучения 4; детектор 5; оптическую систему 6 и блок управления и регистрации 7.The proposed device comprises a platform 1, into which a reaction cell 2 is placed, inside which a planar substrate 3 with a plurality of nanosized wells is located; a source of exciting radiation 4; a detector 5; an optical system 6 and a control and recording unit 7.
Наноразмерные колодцы расположены параллельными рядами в направлении взаимно перпендикулярных осей X и Y на планарной подложке 3. Согласно одному из вариантов реализации оптического устройства для одномолекулярного секвенирования ДНК на основе параллельного детектирования флуоресценции в режиме реального времени расстояния между рядами наноразмерных колодцев на планарной подложке 3 по осям X и Y являются равными. Согласно другому варианту реализации оптического устройства для одномолекулярного секвенирования ДНК на основе параллельного детектирования флуоресценции в режиме реального времени расстояния между рядами наноразмерных колодцев на планарной подложке 3 по осям X и Y увеличиваются по мере отдаления от центра планарной подложки 3.The nano-sized wells are arranged in parallel rows in the direction of mutually perpendicular axes X and Y on the planar substrate 3. According to one embodiment of the optical device for single-molecule DNA sequencing based on parallel detection of fluorescence in real time, the distances between the rows of nano-sized wells on the planar substrate 3 along the X and Y axes are equal. According to another embodiment of the optical device for single-molecule DNA sequencing based on parallel detection of fluorescence in real time, the distances between the rows of nano-sized wells on the planar substrate 3 along the X and Y axes increase as they move away from the center of the planar substrate 3.
Планарная подложка 3 расположена внутри реакционной ячейки 1 таким образом, что при установке на платформу 1 она однозначным образом позиционируется относительно источника возбуждающего излучения 4, детектора 5 и оптической системы 6 по осям X, Y и Z. Конструкция платформы 1 позволяет установить на нее реакционную ячейку 2 таким образом, чтобы обеспечить устойчивость и неподвижность реакционной ячейки 2 относительно платформы 1 при загрузке в устройство и во время работы устройства.The planar substrate 3 is located inside the reaction cell 1 in such a way that when installed on the platform 1 it is uniquely positioned relative to the source of exciting radiation 4, the detector 5 and the optical system 6 along the X, Y and Z axes. The design of the platform 1 allows the reaction cell 2 to be installed on it in such a way as to ensure the stability and immobility of the reaction cell 2 relative to the platform 1 when loaded into the device and during operation of the device.
Платформа 1 может быть выполнена подвижной, в этом случае после установки в нее реакционной ячейки 2 она перемещает реакционную ячейку 2 относительно источника возбуждающего излучения 4, детектора 5 и оптической системы 6. Реакционная ячейка 2 может помещаться на платформу 1 с помощью устройства захвата и позиционирования. Платформа 1 и/или устройство захвата и позиционирования может приводиться в движение ручным, полуавтоматическим или автоматическим способом путем получения управляющих команд от блока управления и регистрации 7.The platform 1 can be made movable, in which case after the reaction cell 2 is installed in it, it moves the reaction cell 2 relative to the source of exciting radiation 4, the detector 5 and the optical system 6. The reaction cell 2 can be placed on the platform 1 using a gripping and positioning device. The platform 1 and/or the gripping and positioning device can be set in motion manually, semi-automatically or automatically by receiving control commands from the control and registration unit 7.
Положение платформы 1 и/или устройства захвата и позиционирования может определяться датчиками, такие как оптопары, при этом сигнал о положении платформы отправляется на блок управления и регистрации 7.The position of the platform 1 and/or the capture and positioning device can be determined by sensors such as optocouplers, and the signal about the position of the platform is sent to the control and registration unit 7.
Платформа 1 может вмещать несколько реакционных ячеек, в этом случае она позволяет перемещать указанные реакционные ячейки относительно источника возбуждающего излучения 4, детектора 5 и оптической системы 6 в положения, позволяющие выполнять этапы секвенирования с помощью каждой реакционной ячейки последовательно.Platform 1 can accommodate several reaction cells, in which case it allows said reaction cells to be moved relative to the source of exciting radiation 4, detector 5 and optical system 6 into positions that allow sequencing steps to be performed using each reaction cell sequentially.
Платформа 1 может иметь в своем составе модуль термостатирования, обеспечивающий поддержание необходимых для проведения этапов секвенирования температур реакционной ячейки 2. Обеспечение температурных режимов может быть реализовано резистивными нагревателями, элементами Пельтье и/или конвективными способами. Температурные режимы обеспечиваются блоком управления и регистрации 7, соединенным двусторонней связью с платформой 1, на основании показателей температурных датчиков, представляющих собой резистивные датчики и/или термопары.Platform 1 may include a thermostat module that ensures the maintenance of the temperatures of the reaction cell 2 required for performing the sequencing stages. Temperature conditions may be provided by resistive heaters, Peltier elements and/or convective methods. Temperature conditions are provided by the control and recording unit 7, connected by a two-way communication with platform 1, based on the readings of temperature sensors, which are resistive sensors and/or thermocouples.
В соответствии с ФИГ. 1 и ФИГ. 2 оптическая система 6 состоит из оптической системы возбуждения 601 и оптической системы детектирования 602. Оптическая система 6 может дополнительно содержать модуль улавливания 603. Элементы оптической системы возбуждения 601, оптической системы детектирования 602 и модуля улавливания 603 могут быть общими для этих систем и модуля. Оптическая система 6, основанная на пропускании возбуждающих и эмиссионных излучений и/или их отражении, включает в себя объектив и ряд дополнительных оптических компонентов, используемых для направления, фильтрации, фокусировки и разделения оптических сигналов. В оптическую систему 6 также могут быть включены оптические фильтры для фильтрации фонового излучения и ограничения спектрального диапазона возбуждающего и/или эмиссионного излучений.In accordance with FIG. 1 and FIG. 2, the optical system 6 consists of an excitation optical system 601 and a detection optical system 602. The optical system 6 may additionally contain a capture module 603. The elements of the excitation optical system 601, the detection optical system 602 and the capture module 603 may be common to these systems and the module. The optical system 6, based on the transmission of excitation and emission radiation and/or their reflection, includes an objective and a number of additional optical components used to direct, filter, focus and separate optical signals. Optical filters for filtering background radiation and limiting the spectral range of the excitation and/or emission radiation may also be included in the optical system 6.
В соответствии с ФИГ. 1 и ФИГ. 2 оптическая система возбуждения 601 направляет возбуждающее излучение 604 от источника возбуждающего излучения 4 на планарную подложку 3. В качестве источника возбуждения 6 могут выступать один или несколько лазеров с длинами волн излучения 488 нм, 633 нм и др. Оптическая система детектирования 602 направляет эмиссионное излучение 605 от объектов в наноразмерных колодцах планарной подложки 3 на детектор 5, при этом, обеспечивая их спектральное разделение клиновидной призмой, дифракционной решеткой, системой клиновидных призм и/или системой дифракционных решеток для пространственного разделения спектрально различных компонентов сигнала и проецирования компонентов сигнала на детекторе 5.In accordance with FIG. 1 and FIG. 2, the optical excitation system 601 directs the excitation radiation 604 from the excitation radiation source 4 onto the planar substrate 3. One or more lasers with radiation wavelengths of 488 nm, 633 nm, etc. can act as the excitation source 6. The optical detection system 602 directs the emission radiation 605 from objects in the nano-sized wells of the planar substrate 3 onto the detector 5, while providing their spectral separation by a wedge prism, a diffraction grating, a system of wedge prisms and/or a system of diffraction gratings for spatial separation of spectrally different signal components and projection of the signal components onto the detector 5.
Согласно ФИГ. 2 ось оптического пути возбуждающего излучения 604 от оптической системы возбуждения 601 находится под углом Θ относительно поверхности планарной подложки 3. Угол Θ имеет оптимальное значение, определяемое двумя факторами: (1) необходимостью эффективного возбуждения объектов в наноразмерных колодцах планарной подложки 3, чем ближе значение этого угла к нормали к планарной подложке 3, тем выше эффективность, (2) необходимостью одновременного возбуждения большого числа наноразмерных колодцев с минимальным сопутствующим фоном паразитной люминесценции, возникающей от планарной подложки 3 реакционной ячейки 2 - чем больше значение угла от нормали, тем лучше. Проведенные исследования показали, что существует интервал допустимых углов, при которых удовлетворяются оба фактора, позволяя регистрировать эмиссионное излучение единичных флуоресцентно-меченных нуклеотидов в наноразмерных колодцах с отношением сигнал/шум не менее 2. Этот диапазон углов соответствует значениям от 45° до 80° от нормали к планарной подложке 3, т.е. c углом Θ = 10-45°.According to FIG. 2, the axis of the optical path of the exciting radiation 604 from the optical excitation system 601 is at an angle Θ relative to the surface of the planar substrate 3. The angle Θ has an optimal value determined by two factors: (1) the need for efficient excitation of objects in nanosized wells of the planar substrate 3, the closer the value of this angle to the normal to the planar substrate 3, the higher the efficiency, (2) the need for simultaneous excitation of a large number of nanosized wells with a minimum accompanying background of parasitic luminescence arising from the planar substrate 3 of the reaction cell 2 - the greater the value of the angle from the normal, the better. The conducted studies have shown that there is a range of acceptable angles at which both factors are satisfied, allowing the emission radiation of single fluorescently labeled nucleotides to be recorded in nanosized wells with a signal/noise ratio of at least 2. This range of angles corresponds to values from 45° to 80° from the normal to the planar substrate 3, i.e. with an angle Θ = 10-45°.
Модуль улавливания 603 предназначен для улавливания отраженного возбуждающего излучения 606, отраженного от планарной подложки 3. Модуль улавливания 603 может иметь в своем составе блок фотодиодов для регистрации отраженного возбуждающего излучения 606, для контролируемого регулирования положения фокальной плоскости и/или для контролируемого регулирования мощности источника возбуждающего излучения 4.The capture module 603 is intended for capturing the reflected exciting radiation 606 reflected from the planar substrate 3. The capture module 603 may include a photodiode unit for recording the reflected exciting radiation 606, for controlled regulation of the position of the focal plane and/or for controlled regulation of the power of the exciting radiation source 4.
Оптическая система может иметь в своем составе систему зеркал, увеличивающих длину оптического пути отраженного возбуждающего излучения 606 от планарной подложки 3 до блока фотодиодов модуля улавливания 603 для увеличения точности регулирования положения фокальной плоскости.The optical system may include a system of mirrors that increase the length of the optical path of the reflected exciting radiation 606 from the planar substrate 3 to the photodiode block of the capture module 603 to increase the accuracy of regulating the position of the focal plane.
Модуль улавливания 603 может иметь в своем составе ловушку излучения, позволяющую поглотить отраженное возбуждающее излучение 606 для уменьшения фонового излучения, регистрируемого детектором 5.The capture module 603 may include a radiation trap that allows the reflected exciting radiation 606 to be absorbed in order to reduce the background radiation recorded by the detector 5.
Модуль улавливания 603 может иметь в своем составе систему зеркал и/или фильтров, позволяющих разделить отраженное возбуждающее излучение 606 спектрально и/или пространственно на описанные выше ловушку для излучения и/или блок фотодиодов.The capture module 603 may include a system of mirrors and/or filters that allow the reflected exciting radiation 606 to be divided spectrally and/or spatially into the radiation trap and/or photodiode block described above.
Детектор 5 представляет собой матричный детектор, предпочтительно, диодный матричный детектор или устройство с зарядовой связью (CCD, ICCD или EMCCD). В случае таких матричных детекторов может быть желательно, чтобы оптическая система 6 обеспечивала проецирование флуоресценции на детектор 5 в конкретной желаемой конфигурации. На ФИГ. 3 показан наноразмерный колодец, сформированный в слое алюминия планарной подложки 3. В наноразмерном колодце одновременно размещены 4 флуоресцентные метки, характеризующиеся различными спектрами эмиссионного излучения: Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5. В оптическую систему детектирования 602, изображенную на ФИГ. 3Б, дополнительно, относительно оптической системы детектирования 602, изображенной на ФИГ. 3А, добавлена система клиновидных призм 607. Это позволило пространственно разделить спектральные каналы эмиссионного возбуждения от 4-х флуоресцентных меток в наноразмерном колодце и различить спектральные каналы монохроматическим детектором 5 (изображение показано на ФИГ. 3Б справа).The detector 5 is a matrix detector, preferably a diode matrix detector or a charge-coupled device (CCD, ICCD or EMCCD). In the case of such matrix detectors, it may be desirable for the optical system 6 to provide for the projection of fluorescence onto the detector 5 in a specific desired configuration. FIG. 3 shows a nanoscale well formed in an aluminum layer of a planar substrate 3. Four fluorescent labels characterized by different emission spectra are simultaneously placed in the nanoscale well: Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5. In the optical detection system 602 shown in FIG. 3B, additionally, relative to the optical detection system 602 shown in FIG. 3A, a system of wedge prisms 607 was added. This made it possible to spatially separate the spectral channels of emission excitation from 4 fluorescent labels in a nanosized well and to distinguish the spectral channels with a monochromatic detector 5 (the image is shown in FIG. 3B on the right).
Для обеспечения улучшенной статистической оценки данных необходимо проецировать флуоресцентный сигнал в каждом спектральном канале на множестве пикселей детектора 5, превышающих минимальный пороговый уровень. Например, желательно предоставление достаточных данных о сигнале по меньшей мере с 2 пикселей, предпочтительно с 4 пикселей и более.In order to provide an improved statistical evaluation of the data, it is necessary to project the fluorescent signal in each spectral channel on a plurality of pixels of the detector 5, exceeding the minimum threshold level. For example, it is desirable to provide sufficient data on the signal from at least 2 pixels, preferably from 4 pixels or more.
На ФИГ. 4 приведены изображения спектрально разделенных флуоресцентных излучений от планарной подложки 3 на детекторе 5. В известных изобретениях изображения спектрально разделенных излучений расположены между наноразмерными колодцами по оси X (ФИГ. 4А). В предлагаемом устройстве изображения излучений на детекторе 5 расположены между изображениями наноразмерными колодцами под углами относительно оси X (ФИГ. 4Б и 3В).FIG. 4 shows images of spectrally separated fluorescent radiations from planar substrate 3 on detector 5. In known inventions, images of spectrally separated radiations are located between nanosized wells along the X axis (FIG. 4A). In the proposed device, images of radiations on detector 5 are located between images of nanosized wells at angles relative to the X axis (FIG. 4B and 3C).
Оптимальная величина промежутков между наноразмерными колодцами определяется путем совмещения спектрально разделенных флуоресцентных излучений между наноразмерными колодцами, расположенными согласно ФИГ. 4Б и 4В под углом 45° или 63° (ФИГ. 5) против часовой стрелки. Выбор этих углов осуществляется поворотом планарной подложки 3, элементов оптической системы 6 и/или детектора 5. Предпочтительным является обеспечение направления оси спектрально разделенных эмиссионных излучений от планарной подложки 3 параллельно или перпендикулярно длинного края матрицы детектора 5.The optimum size of the gaps between the nanosized wells is determined by combining the spectrally separated fluorescent emissions between the nanosized wells located according to FIG. 4B and 4C at an angle of 45° or 63° (FIG. 5) counterclockwise. The selection of these angles is carried out by rotating the planar substrate 3, the elements of the optical system 6 and/or the detector 5. It is preferable to ensure that the direction of the axis of the spectrally separated emission emissions from the planar substrate 3 is parallel or perpendicular to the long edge of the detector matrix 5.
В результате поворота оси спектрального разделения эмиссионных излучений на детекторе располагаются под углом относительно оси X между наноразмерными колодцами в разных рядах.As a result of the rotation of the spectral separation axis, the emission radiations on the detector are located at an angle relative to the X axis between nanosized wells in different rows.
При реализации угла поворота 45° (ФИГ. 4Б) и при сохранении площади спектрального разделения эмиссионных излучений на детекторе 5 и количества наноразмерных колодцев площадь планарной подложки 3 уменьшается в 1,98 раз, что равнозначно идентичному увеличению производительности устройства.When implementing a rotation angle of 45° (FIG. 4B) and maintaining the area of spectral separation of emission radiation on detector 5 and the number of nanosized wells, the area of planar substrate 3 decreases by 1.98 times, which is equivalent to an identical increase in the device’s performance.
При реализации угла поворота 63° (ФИГ. 4В) и при сохранении площади спектрального разделения эмиссионных излучений на детекторе 5 и количества наноразмерных колодцев площадь планарной подложки 3 уменьшается в 5 раз.When implementing a rotation angle of 63° (FIG. 4B) and maintaining the area of spectral separation of emission radiation on detector 5 and the number of nanosized wells, the area of planar substrate 3 decreases by 5 times.
Блок управления и регистрации 7 соединен двусторонней связью с источником возбуждения 4 и детектором 5 и предназначен для включения источника возбуждения 4 и контроля его работы, а также для управления детектором 5 и выполнения регистрации сигналов флуоресценции, полученных с детектора 5.The control and registration unit 7 is connected by a two-way communication with the excitation source 4 and the detector 5 and is intended to turn on the excitation source 4 and control its operation, as well as to control the detector 5 and perform the registration of fluorescence signals received from the detector 5.
На основе обработанных сигналов с детектора 5 блок управления и регистрации 7 может выполнять определение и оптимизацию качества фокусировки изображений, определять координаты Z планарной подложки 3 или элементов оптической системы 6 при оптимальном качестве фокусировки изображения. Для оценки качества фокусировки могут быть использованы экстремальные или локальные экстремальные значения таких параметров, как отношение сигнала изображения к шуму, среднеквадратическое отклонение интенсивностей пикселей в изображении и коэффициент вариации контрастности пикселей. Для оптимизации качества фокусировки изображений могут использоваться данные от блока фотодиодов. Качество фокусировки имеет оптимальное значение в центре планарной подложки 3. Поэтому предложено увеличивать расстояния между рядами наноразмерных колодцев на планарной подложке 3 по осям X и Y по мере отдаления от центра планарной подложки 3.Based on the processed signals from the detector 5, the control and recording unit 7 can determine and optimize the quality of image focusing, determine the Z coordinates of the planar substrate 3 or the elements of the optical system 6 at the optimal quality of image focusing. To assess the quality of focusing, extreme or local extreme values of such parameters as the image signal to noise ratio, the standard deviation of pixel intensities in the image, and the pixel contrast variation coefficient can be used. To optimize the quality of image focusing, data from the photodiode unit can be used. The quality of focusing has an optimal value in the center of the planar substrate 3. Therefore, it is proposed to increase the distances between the rows of nanosized wells on the planar substrate 3 along the X and Y axes as they move away from the center of the planar substrate 3.
Согласно одному из вариантов реализации изобретения блок управления и регистрации 7 или часть блока управления и регистрации 7 могут быть реализованы с использованием любой подходящей аппаратной платформы, включая, без ограничений: настольный компьютер; мобильное устройство (например, планшетный компьютер, ноутбук или нетбук); смартфон; или подобное.According to one embodiment of the invention, the control and registration unit 7 or part of the control and registration unit 7 can be implemented using any suitable hardware platform, including, without limitation: a desktop computer; a mobile device (for example, a tablet computer, laptop or netbook); a smartphone; or the like.
Claims (19)
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2024136066A RU2024136066A (en) | 2025-02-17 |
| RU2838337C2 true RU2838337C2 (en) | 2025-04-14 |
Family
ID=
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7692783B2 (en) * | 2006-02-13 | 2010-04-06 | Pacific Biosciences Of California | Methods and systems for simultaneous real-time monitoring of optical signals from multiple sources |
| US9359641B2 (en) * | 2010-04-30 | 2016-06-07 | Complete Genomics, Inc. | Method and system for accurate alignment and registration of array for DNA sequencing |
| RU2786926C1 (en) * | 2021-12-10 | 2022-12-26 | Российская Федерация, от имени которой выступает Министерство здравоохранения Российской Федерации | System and method for image formation of fluorescence objects during dna sequencing |
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7692783B2 (en) * | 2006-02-13 | 2010-04-06 | Pacific Biosciences Of California | Methods and systems for simultaneous real-time monitoring of optical signals from multiple sources |
| US9359641B2 (en) * | 2010-04-30 | 2016-06-07 | Complete Genomics, Inc. | Method and system for accurate alignment and registration of array for DNA sequencing |
| RU2806069C2 (en) * | 2017-07-26 | 2023-10-25 | Мохамед Мохамед Адель ЕЛЬ-СОККАРЫ | Concentration-based dna sequencing device |
| RU2786926C1 (en) * | 2021-12-10 | 2022-12-26 | Российская Федерация, от имени которой выступает Министерство здравоохранения Российской Федерации | System and method for image formation of fluorescence objects during dna sequencing |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20250305041A1 (en) | Systems and methods for assessing biological samples | |
| US9488571B2 (en) | Two-dimensional spectral imaging system | |
| US7817273B2 (en) | Two-dimensional spectral imaging system | |
| EP2201352B2 (en) | Fluorescence excitation and detection system and method | |
| EP1830174B1 (en) | Multi-channel fluorescence sample analyzer | |
| US6427126B1 (en) | Automatic sequencer/genotyper having extended spectral response | |
| US7715001B2 (en) | Methods and systems for simultaneous real-time monitoring of optical signals from multiple sources | |
| US8264687B2 (en) | Methods and systems for simultaneous real-time monitoring of optical signals from multiple sources | |
| JP2009526997A (en) | Method and system for simultaneously monitoring optical signals from multiple sources in real time | |
| US7532326B2 (en) | Multiple-label fluorescence imaging using excitation-emission matrices | |
| CN115266662A (en) | Hyperspectral sequencing method and system and gene sequencer | |
| WO2007011549A1 (en) | Two-dimensional spectral imaging system | |
| RU2838337C2 (en) | Optical device for single-molecule dna sequencing based on real-time parallel fluorescence detection | |
| KR100818351B1 (en) | Multichannel biochip scanner | |
| US20070171409A1 (en) | Method and apparatus for dense spectrum unmixing and image reconstruction of a sample | |
| CN118703322A (en) | Digital polymerase chain reaction detection device and method |