RU2838163C1 - Recombinant strain with modified bbd29_09525 gene for producing l-glutamic acid, as well as method for its construction and its application - Google Patents
Recombinant strain with modified bbd29_09525 gene for producing l-glutamic acid, as well as method for its construction and its application Download PDFInfo
- Publication number
- RU2838163C1 RU2838163C1 RU2023119340A RU2023119340A RU2838163C1 RU 2838163 C1 RU2838163 C1 RU 2838163C1 RU 2023119340 A RU2023119340 A RU 2023119340A RU 2023119340 A RU2023119340 A RU 2023119340A RU 2838163 C1 RU2838163 C1 RU 2838163C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- bbd29
- gene
- sequence
- glutamic acid
- seq
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 164
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 title claims abstract description 161
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 title claims abstract description 82
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 53
- 238000010276 construction Methods 0.000 title abstract description 17
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 67
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 52
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims abstract description 43
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 31
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 26
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 24
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 23
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 85
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 32
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 82
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 79
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 63
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 62
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 62
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 62
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 53
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 description 40
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 28
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 26
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 26
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 24
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 20
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 17
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 16
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 16
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 15
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 15
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 15
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 15
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 14
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 13
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 12
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 12
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 11
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 11
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 10
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 10
- KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-N 2-oxoglutaric acid Chemical compound OC(=O)CCC(=O)C(O)=O KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 9
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 9
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 9
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 9
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 9
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 8
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 8
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 8
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 8
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 8
- 238000013461 design Methods 0.000 description 7
- 102000005396 glutamine synthetase Human genes 0.000 description 7
- 108020002326 glutamine synthetase Proteins 0.000 description 7
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 7
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 7
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 7
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 7
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 7
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 6
- 108010047495 alanylglycine Proteins 0.000 description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 6
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 6
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 6
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 6
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 5
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 4
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 108010038633 aspartylglutamate Proteins 0.000 description 4
- 108010089804 glycyl-threonine Proteins 0.000 description 4
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 4
- 101000950981 Bacillus subtilis (strain 168) Catabolic NAD-specific glutamate dehydrogenase RocG Proteins 0.000 description 3
- 102000016901 Glutamate dehydrogenase Human genes 0.000 description 3
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000003929 Transaminases Human genes 0.000 description 3
- 108090000340 Transaminases Proteins 0.000 description 3
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- HWXBTNAVRSUOJR-UHFFFAOYSA-N alpha-hydroxyglutaric acid Natural products OC(=O)C(O)CCC(O)=O HWXBTNAVRSUOJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940009533 alpha-ketoglutaric acid Drugs 0.000 description 3
- -1 ammonium ions Chemical class 0.000 description 3
- 230000037429 base substitution Effects 0.000 description 3
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 3
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 3
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 3
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 3
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 3
- CWFMWBHMIMNZLN-NAKRPEOUSA-N (2s)-1-[(2s)-2-[[(2s,3s)-2-amino-3-methylpentanoyl]amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O CWFMWBHMIMNZLN-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 2
- CUVSTAMIHSSVKL-UWVGGRQHSA-N (4s)-4-[(2-aminoacetyl)amino]-5-[[(2s)-6-amino-1-(carboxymethylamino)-1-oxohexan-2-yl]amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound NCCCC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CN CUVSTAMIHSSVKL-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- BUANFPRKJKJSRR-ACZMJKKPSA-N Ala-Ala-Gln Chemical compound C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C([O-])=O)CCC(N)=O BUANFPRKJKJSRR-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 2
- FJVAQLJNTSUQPY-CIUDSAMLSA-N Ala-Ala-Lys Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN FJVAQLJNTSUQPY-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- WXERCAHAIKMTKX-ZLUOBGJFSA-N Ala-Asp-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O WXERCAHAIKMTKX-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 2
- MCKSLROAGSDNFC-ACZMJKKPSA-N Ala-Asp-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O MCKSLROAGSDNFC-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 2
- CSAHOYQKNHGDHX-ACZMJKKPSA-N Ala-Gln-Asn Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O CSAHOYQKNHGDHX-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 2
- ZODMADSIQZZBSQ-FXQIFTODSA-N Ala-Gln-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O ZODMADSIQZZBSQ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- LMFXXZPPZDCPTA-ZKWXMUAHSA-N Ala-Gly-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N LMFXXZPPZDCPTA-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- VNYMOTCMNHJGTG-JBDRJPRFSA-N Ala-Ile-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O VNYMOTCMNHJGTG-JBDRJPRFSA-N 0.000 description 2
- NOGFDULFCFXBHB-CIUDSAMLSA-N Ala-Leu-Cys Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N NOGFDULFCFXBHB-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- AWZKCUCQJNTBAD-SRVKXCTJSA-N Ala-Leu-Lys Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN AWZKCUCQJNTBAD-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- MDNAVFBZPROEHO-UHFFFAOYSA-N Ala-Lys-Val Natural products CC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(C)N)CCCCN MDNAVFBZPROEHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NZGRHTKZFSVPAN-BIIVOSGPSA-N Ala-Ser-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N NZGRHTKZFSVPAN-BIIVOSGPSA-N 0.000 description 2
- VHAQSYHSDKERBS-XPUUQOCRSA-N Ala-Val-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(O)=O VHAQSYHSDKERBS-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 2
- HJDNZFIYILEIKR-OSUNSFLBSA-N Arg-Ile-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O HJDNZFIYILEIKR-OSUNSFLBSA-N 0.000 description 2
- JBIRFLWXWDSDTR-CYDGBPFRSA-N Arg-Met-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N JBIRFLWXWDSDTR-CYDGBPFRSA-N 0.000 description 2
- KXOPYFNQLVUOAQ-FXQIFTODSA-N Arg-Ser-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O KXOPYFNQLVUOAQ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- LYJXHXGPWDTLKW-HJGDQZAQSA-N Arg-Thr-Gln Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)O LYJXHXGPWDTLKW-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 2
- PJOPLXOCKACMLK-KKUMJFAQSA-N Arg-Tyr-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O PJOPLXOCKACMLK-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- VLIJAPRTSXSGFY-STQMWFEESA-N Arg-Tyr-Gly Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 VLIJAPRTSXSGFY-STQMWFEESA-N 0.000 description 2
- LLQIAIUAKGNOSE-NHCYSSNCSA-N Arg-Val-Gln Chemical compound NC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N LLQIAIUAKGNOSE-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 2
- HZPSDHRYYIORKR-WHFBIAKZSA-N Asn-Ala-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O HZPSDHRYYIORKR-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- NUHQMYUWLUSRJX-BIIVOSGPSA-N Asn-Ala-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N NUHQMYUWLUSRJX-BIIVOSGPSA-N 0.000 description 2
- NJIKKGUVGUBICV-ZLUOBGJFSA-N Asp-Ala-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O NJIKKGUVGUBICV-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 2
- VAWNQIGQPUOPQW-ACZMJKKPSA-N Asp-Glu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O VAWNQIGQPUOPQW-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 2
- POTCZYQVVNXUIG-BQBZGAKWSA-N Asp-Gly-Pro Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O POTCZYQVVNXUIG-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- CYCKJEFVFNRWEZ-UGYAYLCHSA-N Asp-Ile-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O CYCKJEFVFNRWEZ-UGYAYLCHSA-N 0.000 description 2
- UZFHNLYQWMGUHU-DCAQKATOSA-N Asp-Lys-Arg Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O UZFHNLYQWMGUHU-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- VWWAFGHMPWBKEP-GMOBBJLQSA-N Asp-Met-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N VWWAFGHMPWBKEP-GMOBBJLQSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JIVJQYNNAYFXDG-LKXGYXEUSA-N Cys-Thr-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O JIVJQYNNAYFXDG-LKXGYXEUSA-N 0.000 description 2
- 108010072062 GEKG peptide Proteins 0.000 description 2
- FFVXLVGUJBCKRX-UKJIMTQDSA-N Gln-Ile-Val Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N FFVXLVGUJBCKRX-UKJIMTQDSA-N 0.000 description 2
- OUBUHIODTNUUTC-WDCWCFNPSA-N Gln-Thr-Lys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N)O OUBUHIODTNUUTC-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 2
- RBSKVTZUFMIWFU-XEGUGMAKSA-N Gln-Trp-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O RBSKVTZUFMIWFU-XEGUGMAKSA-N 0.000 description 2
- JKDBRTNMYXYLHO-JYJNAYRXSA-N Gln-Tyr-Leu Chemical compound NC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 JKDBRTNMYXYLHO-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 2
- MKRDNSWGJWTBKZ-GVXVVHGQSA-N Gln-Val-Lys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N MKRDNSWGJWTBKZ-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 2
- FYBSCGZLICNOBA-XQXXSGGOSA-N Glu-Ala-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O FYBSCGZLICNOBA-XQXXSGGOSA-N 0.000 description 2
- IYAUFWMUCGBFMQ-CIUDSAMLSA-N Glu-Arg-Cys Chemical compound C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)CN=C(N)N IYAUFWMUCGBFMQ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- SJPMNHCEWPTRBR-BQBZGAKWSA-N Glu-Glu-Gly Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O SJPMNHCEWPTRBR-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- MUSGDMDGNGXULI-DCAQKATOSA-N Glu-Glu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O MUSGDMDGNGXULI-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- HPJLZFTUUJKWAJ-JHEQGTHGSA-N Glu-Gly-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O HPJLZFTUUJKWAJ-JHEQGTHGSA-N 0.000 description 2
- VMKCPNBBPGGQBJ-GUBZILKMSA-N Glu-Leu-Asn Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N VMKCPNBBPGGQBJ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- MWMJCGBSIORNCD-AVGNSLFASA-N Glu-Leu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O MWMJCGBSIORNCD-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- LHIPZASLKPYDPI-AVGNSLFASA-N Glu-Phe-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O LHIPZASLKPYDPI-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- YRMZCZIRHYCNHX-RYUDHWBXSA-N Glu-Phe-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)NCC(O)=O YRMZCZIRHYCNHX-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 2
- RGJKYNUINKGPJN-RWRJDSDZSA-N Glu-Thr-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N RGJKYNUINKGPJN-RWRJDSDZSA-N 0.000 description 2
- ZTNHPMZHAILHRB-JSGCOSHPSA-N Glu-Trp-Gly Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)N)C(=O)NCC(O)=O)=CNC2=C1 ZTNHPMZHAILHRB-JSGCOSHPSA-N 0.000 description 2
- LZEUDRYSAZAJIO-AUTRQRHGSA-N Glu-Val-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O LZEUDRYSAZAJIO-AUTRQRHGSA-N 0.000 description 2
- VIPDPMHGICREIS-GVXVVHGQSA-N Glu-Val-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O VIPDPMHGICREIS-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 2
- ZYRXTRTUCAVNBQ-GVXVVHGQSA-N Glu-Val-Lys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N ZYRXTRTUCAVNBQ-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 2
- JBRBACJPBZNFMF-YUMQZZPRSA-N Gly-Ala-Lys Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN JBRBACJPBZNFMF-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- LJPIRKICOISLKN-WHFBIAKZSA-N Gly-Ala-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O LJPIRKICOISLKN-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- CLODWIOAKCSBAN-BQBZGAKWSA-N Gly-Arg-Asp Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](NC(=O)CN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O CLODWIOAKCSBAN-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- PMNHJLASAAWELO-FOHZUACHSA-N Gly-Asp-Thr Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O PMNHJLASAAWELO-FOHZUACHSA-N 0.000 description 2
- JPWIMMUNWUKOAD-STQMWFEESA-N Gly-Asp-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)CN JPWIMMUNWUKOAD-STQMWFEESA-N 0.000 description 2
- LPCKHUXOGVNZRS-YUMQZZPRSA-N Gly-His-Ser Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O LPCKHUXOGVNZRS-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- BHPQOIPBLYJNAW-NGZCFLSTSA-N Gly-Ile-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)CN BHPQOIPBLYJNAW-NGZCFLSTSA-N 0.000 description 2
- VEPBEGNDJYANCF-QWRGUYRKSA-N Gly-Lys-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CCCCN VEPBEGNDJYANCF-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- WMGHDYWNHNLGBV-ONGXEEELSA-N Gly-Phe-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CC=CC=C1 WMGHDYWNHNLGBV-ONGXEEELSA-N 0.000 description 2
- IEGFSKKANYKBDU-QWHCGFSZSA-N Gly-Phe-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CC=CC=C2)NC(=O)CN)C(=O)O IEGFSKKANYKBDU-QWHCGFSZSA-N 0.000 description 2
- DBUNZBWUWCIELX-JHEQGTHGSA-N Gly-Thr-Glu Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O DBUNZBWUWCIELX-JHEQGTHGSA-N 0.000 description 2
- JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N H-Gly-Phe-OH Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RVKIPWVMZANZLI-UHFFFAOYSA-N H-Lys-Trp-OH Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C(N)CCCCN)C(O)=O)=CNC2=C1 RVKIPWVMZANZLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- STWGDDDFLUFCCA-GVXVVHGQSA-N His-Glu-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O STWGDDDFLUFCCA-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 2
- TWROVBNEHJSXDG-IHRRRGAJSA-N His-Leu-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O TWROVBNEHJSXDG-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- VCBWXASUBZIFLQ-IHRRRGAJSA-N His-Pro-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O VCBWXASUBZIFLQ-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- XGBVLRJLHUVCNK-DCAQKATOSA-N His-Val-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XGBVLRJLHUVCNK-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000829171 Hypocrea virens (strain Gv29-8 / FGSC 10586) Effector TSP1 Proteins 0.000 description 2
- RWIKBYVJQAJYDP-BJDJZHNGSA-N Ile-Ala-Lys Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN RWIKBYVJQAJYDP-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 2
- DMHGKBGOUAJRHU-UHFFFAOYSA-N Ile-Arg-Pro Natural products CCC(C)C(N)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(=O)N1CCCC1C(O)=O DMHGKBGOUAJRHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QYZYJFXHXYUZMZ-UGYAYLCHSA-N Ile-Asn-Asn Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N QYZYJFXHXYUZMZ-UGYAYLCHSA-N 0.000 description 2
- SCHZQZPYHBWYEQ-PEFMBERDSA-N Ile-Asn-Glu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N SCHZQZPYHBWYEQ-PEFMBERDSA-N 0.000 description 2
- LGMUPVWZEYYUMU-YVNDNENWSA-N Ile-Glu-Gln Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)N LGMUPVWZEYYUMU-YVNDNENWSA-N 0.000 description 2
- UIEZQYNXCYHMQS-BJDJZHNGSA-N Ile-Lys-Ala Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)O)N UIEZQYNXCYHMQS-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 2
- GLYJPWIRLBAIJH-UHFFFAOYSA-N Ile-Lys-Pro Natural products CCC(C)C(N)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)N1CCCC1C(O)=O GLYJPWIRLBAIJH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CAHCWMVNBZJVAW-NAKRPEOUSA-N Ile-Pro-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N CAHCWMVNBZJVAW-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 2
- APQYGMBHIVXFML-OSUNSFLBSA-N Ile-Val-Thr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)N APQYGMBHIVXFML-OSUNSFLBSA-N 0.000 description 2
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 241000880493 Leptailurus serval Species 0.000 description 2
- BQSLGJHIAGOZCD-CIUDSAMLSA-N Leu-Ala-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BQSLGJHIAGOZCD-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- GRZSCTXVCDUIPO-SRVKXCTJSA-N Leu-Arg-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O GRZSCTXVCDUIPO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- HASRFYOMVPJRPU-SRVKXCTJSA-N Leu-Arg-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O HASRFYOMVPJRPU-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- CLVUXCBGKUECIT-HJGDQZAQSA-N Leu-Asp-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O CLVUXCBGKUECIT-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 2
- WIDZHJTYKYBLSR-DCAQKATOSA-N Leu-Glu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O WIDZHJTYKYBLSR-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- OGUUKPXUTHOIAV-SDDRHHMPSA-N Leu-Glu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N OGUUKPXUTHOIAV-SDDRHHMPSA-N 0.000 description 2
- POZULHZYLPGXMR-ONGXEEELSA-N Leu-Gly-Val Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O POZULHZYLPGXMR-ONGXEEELSA-N 0.000 description 2
- QJXHMYMRGDOHRU-NHCYSSNCSA-N Leu-Ile-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(O)=O QJXHMYMRGDOHRU-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 2
- YOKVEHGYYQEQOP-QWRGUYRKSA-N Leu-Leu-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O YOKVEHGYYQEQOP-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- PJWOOBTYQNNRBF-BZSNNMDCSA-N Leu-Phe-Lys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N PJWOOBTYQNNRBF-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 2
- KWLWZYMNUZJKMZ-IHRRRGAJSA-N Leu-Pro-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O KWLWZYMNUZJKMZ-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- DAYQSYGBCUKVKT-VOAKCMCISA-N Leu-Thr-Lys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O DAYQSYGBCUKVKT-VOAKCMCISA-N 0.000 description 2
- MPGHETGWWWUHPY-CIUDSAMLSA-N Lys-Ala-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN MPGHETGWWWUHPY-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- UWKNTTJNVSYXPC-CIUDSAMLSA-N Lys-Ala-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN UWKNTTJNVSYXPC-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- HIIZIQUUHIXUJY-GUBZILKMSA-N Lys-Asp-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O HIIZIQUUHIXUJY-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- GCMWRRQAKQXDED-IUCAKERBSA-N Lys-Glu-Gly Chemical compound [NH3+]CCCC[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CCC([O-])=O)C(=O)NCC([O-])=O GCMWRRQAKQXDED-IUCAKERBSA-N 0.000 description 2
- RBEATVHTWHTHTJ-KKUMJFAQSA-N Lys-Leu-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O RBEATVHTWHTHTJ-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- PIXVFCBYEGPZPA-JYJNAYRXSA-N Lys-Phe-Gln Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N PIXVFCBYEGPZPA-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 2
- LNMKRJJLEFASGA-BZSNNMDCSA-N Lys-Phe-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O LNMKRJJLEFASGA-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 2
- JOSAKOKSPXROGQ-BJDJZHNGSA-N Lys-Ser-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O JOSAKOKSPXROGQ-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 2
- DLCAXBGXGOVUCD-PPCPHDFISA-N Lys-Thr-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O DLCAXBGXGOVUCD-PPCPHDFISA-N 0.000 description 2
- RPWTZTBIFGENIA-VOAKCMCISA-N Lys-Thr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O RPWTZTBIFGENIA-VOAKCMCISA-N 0.000 description 2
- UGCIQUYEJIEHKX-GVXVVHGQSA-N Lys-Val-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O UGCIQUYEJIEHKX-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 2
- QAHFGYLFLVGBNW-DCAQKATOSA-N Met-Ala-Lys Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN QAHFGYLFLVGBNW-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- UZVWDRPUTHXQAM-FXQIFTODSA-N Met-Asp-Ala Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O UZVWDRPUTHXQAM-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- BQHLZUMZOXUWNU-DCAQKATOSA-N Met-Pro-Glu Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N BQHLZUMZOXUWNU-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- RDLSEGZJMYGFNS-FXQIFTODSA-N Met-Ser-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O RDLSEGZJMYGFNS-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- MIXPUVSPPOWTCR-FXQIFTODSA-N Met-Ser-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O MIXPUVSPPOWTCR-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- NSMXRFMGZYTFEX-KJEVXHAQSA-N Met-Thr-Tyr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCSC)N)O NSMXRFMGZYTFEX-KJEVXHAQSA-N 0.000 description 2
- XZFYRXDAULDNFX-UHFFFAOYSA-N N-L-cysteinyl-L-phenylalanine Natural products SCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XZFYRXDAULDNFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N N-alpha-L-glutamyl-L-phenylalanine Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010079364 N-glycylalanine Proteins 0.000 description 2
- 108010087066 N2-tryptophyllysine Proteins 0.000 description 2
- BQVUABVGYYSDCJ-UHFFFAOYSA-N Nalpha-L-Leucyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C(N)CC(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 BQVUABVGYYSDCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- LLGTYVHITPVGKR-RYUDHWBXSA-N Phe-Gln-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O LLGTYVHITPVGKR-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 2
- HOYQLNNGMHXZDW-KKUMJFAQSA-N Phe-Glu-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O HOYQLNNGMHXZDW-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- CDQCFGOQNYOICK-IHRRRGAJSA-N Phe-Glu-Gln Chemical compound NC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 CDQCFGOQNYOICK-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- JEBWZLWTRPZQRX-QWRGUYRKSA-N Phe-Gly-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O JEBWZLWTRPZQRX-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- YYKZDTVQHTUKDW-RYUDHWBXSA-N Phe-Gly-Gln Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)N YYKZDTVQHTUKDW-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 2
- NPLGQVKZFGJWAI-QWHCGFSZSA-N Phe-Gly-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)CNC(=O)[C@H](CC2=CC=CC=C2)N)C(=O)O NPLGQVKZFGJWAI-QWHCGFSZSA-N 0.000 description 2
- BIYWZVCPZIFGPY-QWRGUYRKSA-N Phe-Gly-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BIYWZVCPZIFGPY-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- WKTSCAXSYITIJJ-PCBIJLKTSA-N Phe-Ile-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O WKTSCAXSYITIJJ-PCBIJLKTSA-N 0.000 description 2
- ZVRJWDUPIDMHDN-ULQDDVLXSA-N Phe-Pro-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 ZVRJWDUPIDMHDN-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 2
- XDMMOISUAHXXFD-SRVKXCTJSA-N Phe-Ser-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O XDMMOISUAHXXFD-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- WDOCBGZHAQQIBL-IHPCNDPISA-N Phe-Trp-Ser Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 WDOCBGZHAQQIBL-IHPCNDPISA-N 0.000 description 2
- KIZQGKLMXKGDIV-BQBZGAKWSA-N Pro-Ala-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 KIZQGKLMXKGDIV-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- IFMDQWDAJUMMJC-DCAQKATOSA-N Pro-Ala-Leu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O IFMDQWDAJUMMJC-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- CJZTUKSFZUSNCC-FXQIFTODSA-N Pro-Asp-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 CJZTUKSFZUSNCC-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- QAAYIXYLEMRULP-SRVKXCTJSA-N Pro-Pro-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1NCCC1 QAAYIXYLEMRULP-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- UGDMQJSXSSZUKL-IHRRRGAJSA-N Pro-Ser-Tyr Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC2=CC=C(C=C2)O)C(=O)O UGDMQJSXSSZUKL-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- RSTWKJFWBKFOFC-JYJNAYRXSA-N Pro-Trp-Asn Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O RSTWKJFWBKFOFC-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 2
- ZMLRZBWCXPQADC-TUAOUCFPSA-N Pro-Val-Pro Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@@H]2CCCN2 ZMLRZBWCXPQADC-TUAOUCFPSA-N 0.000 description 2
- IYCBDVBJWDXQRR-FXQIFTODSA-N Ser-Ala-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O IYCBDVBJWDXQRR-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- QWZIOCFPXMAXET-CIUDSAMLSA-N Ser-Arg-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O QWZIOCFPXMAXET-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- YRBGKVIWMNEVCZ-WDSKDSINSA-N Ser-Glu-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O YRBGKVIWMNEVCZ-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- GZFAWAQTEYDKII-YUMQZZPRSA-N Ser-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CO GZFAWAQTEYDKII-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- YIUWWXVTYLANCJ-NAKRPEOUSA-N Ser-Ile-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O YIUWWXVTYLANCJ-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 2
- NMZXJDSKEGFDLJ-DCAQKATOSA-N Ser-Pro-Lys Chemical compound C1C[C@H](N(C1)C(=O)[C@H](CO)N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O NMZXJDSKEGFDLJ-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- XQJCEKXQUJQNNK-ZLUOBGJFSA-N Ser-Ser-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XQJCEKXQUJQNNK-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 2
- NERYDXBVARJIQS-JYBASQMISA-N Ser-Trp-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)NC(=O)[C@H](CO)N)O NERYDXBVARJIQS-JYBASQMISA-N 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HJOSVGCWOTYJFG-WDCWCFNPSA-N Thr-Glu-Lys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N)O HJOSVGCWOTYJFG-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 2
- XOWKUMFHEZLKLT-CIQUZCHMSA-N Thr-Ile-Ala Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O XOWKUMFHEZLKLT-CIQUZCHMSA-N 0.000 description 2
- RFKVQLIXNVEOMB-WEDXCCLWSA-N Thr-Leu-Gly Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)O)N)O RFKVQLIXNVEOMB-WEDXCCLWSA-N 0.000 description 2
- BBPCSGKKPJUYRB-UVOCVTCTSA-N Thr-Thr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O BBPCSGKKPJUYRB-UVOCVTCTSA-N 0.000 description 2
- HLDFBNPSURDYEN-VHWLVUOQSA-N Trp-Ile-Asp Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)N HLDFBNPSURDYEN-VHWLVUOQSA-N 0.000 description 2
- AIISTODACBDQLW-WDSOQIARSA-N Trp-Leu-Arg Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O)=CNC2=C1 AIISTODACBDQLW-WDSOQIARSA-N 0.000 description 2
- ZZDFLJFVSNQINX-HWHUXHBOSA-N Trp-Thr-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CNC3=CC=CC=C32)N)O ZZDFLJFVSNQINX-HWHUXHBOSA-N 0.000 description 2
- CNLKDWSAORJEMW-KWQFWETISA-N Tyr-Gly-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O CNLKDWSAORJEMW-KWQFWETISA-N 0.000 description 2
- BSCBBPKDVOZICB-KKUMJFAQSA-N Tyr-Leu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O BSCBBPKDVOZICB-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- CDKZJGMPZHPAJC-ULQDDVLXSA-N Tyr-Leu-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 CDKZJGMPZHPAJC-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 2
- AOIZTZRWMSPPAY-KAOXEZKKSA-N Tyr-Thr-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)N)O AOIZTZRWMSPPAY-KAOXEZKKSA-N 0.000 description 2
- ASQFIHTXXMFENG-XPUUQOCRSA-N Val-Ala-Gly Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O ASQFIHTXXMFENG-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 2
- LABUITCFCAABSV-BPNCWPANSA-N Val-Ala-Tyr Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 LABUITCFCAABSV-BPNCWPANSA-N 0.000 description 2
- LABUITCFCAABSV-UHFFFAOYSA-N Val-Ala-Tyr Natural products CC(C)C(N)C(=O)NC(C)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 LABUITCFCAABSV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CELJCNRXKZPTCX-XPUUQOCRSA-N Val-Gly-Ala Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O CELJCNRXKZPTCX-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 2
- ZIGZPYJXIWLQFC-QTKMDUPCSA-N Val-His-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O ZIGZPYJXIWLQFC-QTKMDUPCSA-N 0.000 description 2
- VXDSPJJQUQDCKH-UKJIMTQDSA-N Val-Ile-Glu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N VXDSPJJQUQDCKH-UKJIMTQDSA-N 0.000 description 2
- SDUBQHUJJWQTEU-XUXIUFHCSA-N Val-Ile-Lys Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N SDUBQHUJJWQTEU-XUXIUFHCSA-N 0.000 description 2
- XXWBHOWRARMUOC-NHCYSSNCSA-N Val-Lys-Asn Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N XXWBHOWRARMUOC-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 2
- VSCIANXXVZOYOC-AVGNSLFASA-N Val-Pro-His Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)O)N VSCIANXXVZOYOC-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- GUIYPEKUEMQBIK-JSGCOSHPSA-N Val-Tyr-Gly Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1ccc(O)cc1)C(=O)NCC(O)=O GUIYPEKUEMQBIK-JSGCOSHPSA-N 0.000 description 2
- 101150063416 add gene Proteins 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 108010077245 asparaginyl-proline Proteins 0.000 description 2
- 108010069205 aspartyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 2
- 108010093581 aspartyl-proline Proteins 0.000 description 2
- 108010047857 aspartylglycine Proteins 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 108010068404 exorphin B4 Proteins 0.000 description 2
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 description 2
- 108010028188 glycyl-histidyl-serine Proteins 0.000 description 2
- 108010020688 glycylhistidine Proteins 0.000 description 2
- 108010015792 glycyllysine Proteins 0.000 description 2
- 108010037850 glycylvaline Proteins 0.000 description 2
- 108010025306 histidylleucine Proteins 0.000 description 2
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 108010078274 isoleucylvaline Proteins 0.000 description 2
- 108010091871 leucylmethionine Proteins 0.000 description 2
- 108010064235 lysylglycine Proteins 0.000 description 2
- 108010038320 lysylphenylalanine Proteins 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 150000003147 proline derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 108010031719 prolyl-serine Proteins 0.000 description 2
- 108010070643 prolylglutamic acid Proteins 0.000 description 2
- 108010053725 prolylvaline Proteins 0.000 description 2
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 2
- 108010048818 seryl-histidine Proteins 0.000 description 2
- 108010026333 seryl-proline Proteins 0.000 description 2
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 2
- 108010073969 valyllysine Proteins 0.000 description 2
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 2
- 241000186146 Brevibacterium Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001517047 Corynebacterium acetoacidophilum Species 0.000 description 1
- 241000186145 Corynebacterium ammoniagenes Species 0.000 description 1
- 241000186248 Corynebacterium callunae Species 0.000 description 1
- 241000572303 Corynebacterium pekinense Species 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000724791 Filamentous phage Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- XQPHBAKJJJZOBX-SRVKXCTJSA-N Pro-Lys-Glu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O XQPHBAKJJJZOBX-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- GVMUJUPXFQFBBZ-GUBZILKMSA-N Ser-Lys-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O GVMUJUPXFQFBBZ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 241000319304 [Brevibacterium] flavum Species 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000340 anti-metabolite Effects 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 229940100197 antimetabolite Drugs 0.000 description 1
- 239000002256 antimetabolite Substances 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012219 cassette mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 229960004793 sucrose Drugs 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000004102 tricarboxylic acid cycle Effects 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Abstract
Description
Область техникиField of technology
Настоящее изобретение относится к области техники генной инженерии и микроорганизмов и, в частности, относится к рекомбинантному штамму для продуцирования (получения) L-глутаминовой кислоты, а также способу его конструирования и применения.The present invention relates to the field of genetic engineering and microorganisms and, in particular, relates to a recombinant strain for producing (obtaining) L-glutamic acid, as well as a method for constructing and using it.
Уровень техникиState of the art
L-глутаминовая кислота представляет собой важную аминокислоту, которую используют в пищевых продуктах, в клинической медицине и в других областях.L-glutamic acid is an important amino acid used in food, clinical medicine and other fields.
Традиционно L-глутаминовую кислоту получают в основном путем ферментации с использованием продуцирующих L-глутаминовую кислоту бактерий, принадлежащих к роду Brevibactehum, Corynebacterium или Microtatobiotes, или их мутантов.Traditionally, L-glutamic acid is mainly obtained by fermentation using L-glutamic acid-producing bacteria belonging to the genus Brevibactehum, Corynebacterium or Microtatobiotes, or their mutants.
L-глутаминовая кислота синтезируется путем биосинтеза из α-кетоглутаровой кислоты, промежуточного продукта цикла лимонной кислоты в клетках микроорганизмов. Существует два биосинтетических пути образования L-глутаминовой кислоты из α-кетоглутаровой кислоты через ассимиляцию ионов аммония. Один путь представлен синтезом L-глутаминовой кислоты путем катализа глутаматдегидрогеназой (GDH) в присутствии ионов аммония в высокой концентрации. Другой путь (путь GS/GOGAT) представлен синтезом L-глутаминовой кислоты глутаминсинтетазой и аминотрансферазой глутамина-оксоглутаровой кислоты. Глутаминсинтетаза (GS) катализирует конверсию L-глутаминовой кислоты и ионов аммония в глутамин; аминотрансфераза глутамина-оксоглутаровой кислоты, также известная как «глутаминсинтетаза» (GOGAT), катализирует синтез L-глутаминовой кислоты, в ходе которого две молекулы L-глутаминовой кислоты синтезируются из одной молекулы глутамина, которая была синтезирована GS из одной молекулы α-кетоглутаровой кислоты.L-glutamic acid is synthesized by biosynthesis from α-ketoglutaric acid, an intermediate product of the citric acid cycle in the cells of microorganisms. There are two biosynthetic pathways for the formation of L-glutamic acid from α-ketoglutaric acid through the assimilation of ammonium ions. One pathway is represented by the synthesis of L-glutamic acid catalyzed by glutamate dehydrogenase (GDH) in the presence of high concentrations of ammonium ions. The other pathway (GS/GOGAT pathway) is represented by the synthesis of L-glutamic acid by glutamine synthetase and glutamine oxoglutaric acid aminotransferase. Glutamine synthetase (GS) catalyzes the conversion of L-glutamic acid and ammonium ions to glutamine; Glutamine oxoglutaric acid aminotransferase, also known as "glutamine synthetase" (GOGAT), catalyzes the synthesis of L-glutamic acid, during which two molecules of L-glutamic acid are synthesized from one molecule of glutamine, which was synthesized by GS from one molecule of α-ketoglutaric acid.
Улучшение получения L-аминокислот путем ферментации может относиться к методикам ферментации, таким как перемешивание и подача кислорода; или к составу питательной среды, например, к концентрации сахара во время ферментации; или к переработке ферментативного бульона в продукт в подходящей форме, например, путем высушивания и грануляции ферментативного бульона, или с помощью ионообменной хроматографии; или может относиться к собственным свойствам соответствующих продуцирующих микроорганизмов.Improvement of the production of L-amino acids by fermentation may relate to the fermentation techniques, such as stirring and supply of oxygen; or to the composition of the culture medium, such as the sugar concentration during fermentation; or to the processing of the fermentation broth into a product in a suitable form, such as by drying and granulating the fermentation broth, or by ion exchange chromatography; or may relate to the intrinsic properties of the respective producing microorganisms.
Способы улучшения свойств указанных продуцирующих микроорганизмов, включают мутагенез, выбор и скрининг мутантов. Штамм, полученный указанным способом, устойчив к антиметаболитам или ауксотрофен по метаболитам, имеющим регуляторное значение, и продуцирует L-аминокислоты, и т.п.Methods for improving the properties of said producing microorganisms include mutagenesis, selection and screening of mutants. The strain obtained by said method is resistant to antimetabolites or auxotrophic for metabolites of regulatory significance and produces L-amino acids, etc.
Хотя существует значительное число способов, способных усиливать способность к продуцированию L-глутаминовой кислоты, сохраняется потребность в разработке способов продуцирования L-глутаминовой кислоты для удовлетворения растущего спроса.Although there are a significant number of methods that can enhance the ability to produce L-glutamic acid, there remains a need to develop methods for producing L-glutamic acid to meet the growing demand.
Краткое описание изобретенияBrief description of the invention
Задача настоящего изобретения заключается в разработке новой методики для усиления способности бактерии к продуцированию L-глутаминовой кислоты, с обеспечением таким образом способа эффективного продуцирования L-глутаминовой кислоты.The object of the present invention is to develop a new method for enhancing the ability of a bacterium to produce L-glutamic acid, thereby providing a method for efficiently producing L-glutamic acid.
В ходе исследований для решения вышеуказанной задачи авторы настоящего изобретения обнаружили, что ген BBD29_09525 или гомологичный ему ген бактерии может быть модифицирован или улучшен в отношении экспрессии указанного гена для обеспечения усиленной способности бактерии к продуцированию L-глутаминовой кислоты. Настоящее изобретение было выполнено с учетом этих находок.In the course of studies to solve the above problem, the inventors of the present invention found that the BBD29_09525 gene or a homologous gene of the bacterium can be modified or improved in relation to the expression of said gene to provide an enhanced ability of the bacterium to produce L-glutamic acid. The present invention was made taking these findings into account.
Согласно настоящему изобретению предложена бактерия для выработки L-глутаминовой кислоты с улучшенной экспрессией полинуклеотида, кодирующего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 или гомологичную ей последовательность. Согласно настоящему изобретению также предложен способ получения L-глутаминовой кислоты с использованием микроорганизма.According to the present invention, a bacterium for producing L-glutamic acid with improved expression of a polynucleotide encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or a sequence homologous thereto is proposed. According to the present invention, a method for producing L-glutamic acid using a microorganism is also proposed.
Согласно первому аспекту настоящего изобретения предложена бактерия для продуцирования L-глутаминовой кислоты, обладающая улучшенной экспрессией полинуклеотида, кодирующего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 или гомологичную ей последовательность. В соответствии с настоящим изобретением улучшенная экспрессия представляет собой усиленную экспрессию полинуклеотида, или присутствие точечной мутации в полинуклеотиде, который кодирует аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 или гомологичную ей последовательность, или присутствие точечной мутации в полинуклеотиде и усиленную экспрессию полинуклеотида, который кодирует аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 или гомологичную ей последовательность.According to the first aspect of the present invention, a bacterium for producing L-glutamic acid is proposed, which has an improved expression of a polynucleotide encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or a sequence homologous thereto. According to the present invention, the improved expression is an enhanced expression of a polynucleotide, or the presence of a point mutation in a polynucleotide encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or a sequence homologous thereto, or the presence of a point mutation in a polynucleotide and an enhanced expression of a polynucleotide encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or a sequence homologous thereto.
Аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 3 или гомологичная ей последовательность представляет собой белок, кодируемый геном BBD29_09525 или гомологичным ему геном.The amino acid sequence SEQ ID NO: 3 or a sequence homologous thereto represents a protein encoded by the BBD29_09525 gene or a gene homologous thereto.
Указанная бактерия имеет усиленную способность к продуцированию L-глутаминовой кислоты по сравнению с немодифицированным штаммом.The indicated bacterium has an enhanced ability to produce L-glutamic acid compared to the unmodified strain.
Согласно настоящему изобретению термин «бактерия, обладающая способностью к продуцированию L-глутаминовой кислоты» относится к бактерии, обладающей такой способностью к продуцированию и накоплению целевой L-глутаминовой кислоты в культуральной среде и/или в клетке указанной бактерии, что L-глутаминовая кислота может быть собрана при культивировании бактерии в культуральной среде. Бактерия, обладающая способностью к продуцированию L-глутаминовой кислоты, может представлять собой бактерию, способную к накоплению целевой L-глутаминовой кислоты в культуральной среде и/или в клетке указанной бактерии в большем количестве, чем у немодифицированного штамма.According to the present invention, the term "bacterium having the ability to produce L-glutamic acid" refers to a bacterium having such an ability to produce and accumulate target L-glutamic acid in a culture medium and/or in a cell of said bacterium that L-glutamic acid can be collected when culturing the bacterium in the culture medium. The bacterium having the ability to produce L-glutamic acid may be a bacterium capable of accumulating target L-glutamic acid in a culture medium and/or in a cell of said bacterium in a larger amount than that of an unmodified strain.
Термин «немодифицированный штамм» относится к контрольному штамму, который не был модифицирован таким образом, чтобы включать некий специфический признак. Таким образом, примеры немодифицированного штамма включают штамм дикого типа и исходный штамм.The term "unmodified strain" refers to a control strain that has not been modified to include a specific trait. Thus, examples of an unmodified strain include the wild-type strain and the original strain.
Бактерия, обладающая способностью к продуцированию L-глутаминовой кислоты, может представлять собой бактерию, способную к накоплению целевой L-глутаминовой кислоты в культуральной среде в количестве, предпочтительно превышающем 0,5 г/л, и более предпочтительно превышающем 1,0 г/л.The bacterium having the ability to produce L-glutamic acid may be a bacterium capable of accumulating the target L-glutamic acid in a culture medium in an amount preferably exceeding 0.5 g/L, and more preferably exceeding 1.0 g/L.
Согласно настоящему изобретению термин «L-глутаминовая кислота» относится к L-глутаминовой кислоте в свободной форме, к ее соли или смеси, если не указано иное.According to the present invention, the term "L-glutamic acid" refers to L-glutamic acid in free form, a salt thereof or a mixture thereof, unless otherwise specified.
Указанный полинуклеотид может кодировать аминокислотную последовательность, обладающую приблизительно 90% или более, приблизительно 92% или более, приблизительно 95% или более, приблизительно 97% или более, приблизительно 98% или более, или приблизительно 99% или более гомологией последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3. В настоящем документе термин «гомология» относится к проценту идентичности двух полинуклеотидов или двух полипептидов как модулей. Гомология последовательностей может быть измерена между одним модулем и другим модулем с применением способа, известного в данной области техники. Например, такая гомология последовательностей может быть измерена с помощью алгоритма BLAST.Said polynucleotide may encode an amino acid sequence having about 90% or more, about 92% or more, about 95% or more, about 97% or more, about 98% or more, or about 99% or more sequence homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3. As used herein, the term "homology" refers to the percentage of identity of two polynucleotides or two polypeptides as modules. Sequence homology may be measured between one module and another module using a method known in the art. For example, such sequence homology may be measured using the BLAST algorithm.
Экспрессия полинуклеотида может быть усилена: путем замены или мутирования регуляторной последовательности экспрессии, введения мутации в последовательность полинуклеотида, и путем увеличения числа копий полинуклеотида, инсертированных в хромосому или введенных с помощью вектора, или комбинации перечисленного, и т.п.The expression of a polynucleotide can be enhanced by: replacing or mutating the expression regulatory sequence, introducing a mutation into the polynucleotide sequence, and by increasing the number of copies of the polynucleotide inserted into the chromosome or introduced using a vector, or a combination of the above, etc.
Регуляторная последовательность экспрессии полинуклеотида может быть модифицирована. Регуляторная последовательность экспрессии контролирует экспрессию полинуклеотида, который функционально с ней связан, и может содержать, например, промоторы, терминаторы, энхансеры, сайленсеры и т.п. Полинуклеотид может иметь измененный инициирующий кодон. Полинуклеотид может быть включен в определенный сайт хромосомы, с увеличением таким образом числа копий. Согласно настоящему документу определенный сайт может включать, например, сайт транспозона или межгенный сайт. Кроме того, полинуклеотид может быть включен в экспрессионный вектор, а указанный экспрессионный вектор введен в клетку-хозяина, с увеличением таким образом числа копий.The expression regulatory sequence of the polynucleotide may be modified. The expression regulatory sequence controls the expression of the polynucleotide that is functionally linked to it and may contain, for example, promoters, terminators, enhancers, silencers, etc. The polynucleotide may have a modified initiation codon. The polynucleotide may be included in a specific site of the chromosome, thereby increasing the copy number. According to the present document, the specific site may include, for example, a transposon site or an intergenic site. In addition, the polynucleotide may be included in an expression vector, and said expression vector introduced into a host cell, thereby increasing the copy number.
Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения полинуклеотид или имеющий точечную мутацию полинуклеотид включают в определенный сайт хромосомы микроорганизма с увеличением таким образом числа копий.According to one embodiment of the present invention, a polynucleotide or a polynucleotide having a point mutation is included in a specific site of a chromosome of a microorganism, thereby increasing the number of copies.
Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения полинуклеотид с последовательностью промотора, или имеющий точечную мутацию полинуклеотид с последовательностью промотора встраивают в определенный сайт хромосомы микроорганизма, со сверхэкспрессией таким образом последовательности нуклеиновой кислоты.According to one embodiment of the present invention, a polynucleotide with a promoter sequence, or a polynucleotide with a promoter sequence having a point mutation, is inserted into a specific site of a chromosome of a microorganism, thereby overexpressing the nucleic acid sequence.
Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения полинуклеотид или имеющий точечную мутацию полинуклеотид включают в экспрессионный вектор, а указанный экспрессионный вектор вводят в клетку-хозяина, с увеличением таким образом числа копий.According to one embodiment of the present invention, a polynucleotide or a polynucleotide having a point mutation is included in an expression vector, and said expression vector is introduced into a host cell, thereby increasing the copy number.
Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения полинуклеотид с последовательностью промотора, или имеющий точечную мутацию полинуклеотид с последовательностью промотора включают в экспрессионный вектор, а указанный экспрессионный вектор вводят в клетку-хозяина, с обеспечением таким образом сверхэкспрессии последовательности аминокислот.According to one embodiment of the present invention, a polynucleotide with a promoter sequence, or a polynucleotide with a promoter sequence having a point mutation, is included in an expression vector, and said expression vector is introduced into a host cell, thereby ensuring overexpression of the amino acid sequence.
Согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения указанный полинуклеотид может содержать последовательность нуклеотидов SEQ ID NO: 1.According to a specific embodiment of the present invention, said polynucleotide may comprise the nucleotide sequence SEQ ID NO: 1.
Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения полинуклеотид, кодирующий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, имеет точечную мутацию, такую, что пролин в положении 113 в последовательности аминокислот SEQ ID NO: 3, заменен на другую аминокислоту.According to one embodiment of the present invention, a polynucleotide encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 has a point mutation such that proline at position 113 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 is replaced by another amino acid.
В соответствии с настоящим изобретением предпочтительно пролин в положении 113 заменен на серин.According to the present invention, preferably proline at position 113 is replaced by serine.
В соответствии с настоящим изобретением последовательность, представленная в SEQ ID NO: 4, представляет собой последовательность аминокислот после замены пролина на серин в положении 113 в последовательности аминокислот, представленной в SEQ ID NO: 3.According to the present invention, the sequence presented in SEQ ID NO: 4 is the amino acid sequence after substitution of proline for serine at position 113 in the amino acid sequence presented in SEQ ID NO: 3.
Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения последовательность полинуклеотида, имеющего точечную мутацию, образуется в результате мутации основания в положении 337 последовательности полинуклеотида, представленной в SEQIDNO: 1.According to one embodiment of the present invention, the polynucleotide sequence having a point mutation is formed as a result of a mutation of the base at position 337 of the polynucleotide sequence presented in SEQIDNO: 1.
Согласно настоящему изобретению указанная мутация включает мутацию основания в положении 337 последовательности полинуклеотида, представленной в SEQ ID NO: 1, с заменой цитозина (С) на тимин (Т).According to the present invention, said mutation comprises a mutation of the base at position 337 of the polynucleotide sequence presented in SEQ ID NO: 1, with the replacement of cytosine (C) with thymine (T).
Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения последовательность полинуклеотида, имеющего точечную мутацию, содержит последовательность полинуклеотида, представленную в SEQ ID NO: 2.According to one embodiment of the present invention, the sequence of a polynucleotide having a point mutation comprises the sequence of a polynucleotide presented in SEQ ID NO: 2.
В настоящем документе термин «функционально связанный» относится к функциональной связи между регуляторной последовательностью и последовательностью полинуклеотида, за счет которой регуляторная последовательность контролирует транскрипцию и/или трансляцию указанной последовательности полинуклеотида. Регуляторная последовательность может представлять собой сильный промотор, который может повышать уровень экспрессии полинуклеотида. Регуляторная последовательность может представлять собой промотор, происходящий из микроорганизма, принадлежащего к роду Corynebacterium, или может представлять собой промотор, происходящий из других микроорганизмов. Например, указанный промотор может представлять собой промотор trc, промотор gap, промотор tac, промотор Т7, промотор lac, промотор trp, промотор araBAD или промотор cj7.As used herein, the term "operably linked" refers to a functional relationship between a regulatory sequence and a polynucleotide sequence, by which the regulatory sequence controls transcription and/or translation of said polynucleotide sequence. The regulatory sequence may be a strong promoter that can increase the expression level of the polynucleotide. The regulatory sequence may be a promoter derived from a microorganism belonging to the genus Corynebacterium, or may be a promoter derived from other microorganisms. For example, said promoter may be a trc promoter, a gap promoter, a tac promoter, a T7 promoter, a lac promoter, a trp promoter, an araBAD promoter, or a cj7 promoter.
Согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения промотор представляет собой промотор полинуклеотида, кодирующего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 (ген BBD29_09525).According to a specific embodiment of the present invention, the promoter is a promoter of a polynucleotide encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 (gene BBD29_09525).
В настоящем документе термин «вектор» относится к полинуклеотидной конструкции, содержащей регуляторную последовательность гена и последовательность гена, и выполненной с возможностью экспрессии целевого гена в подходящей клетке-хозяине. Термин "вектор" может также относиться к полинуклеотидной конструкции, содержащей последовательность для гомологичной рекомбинации, такой, что при введении этого вектора в клетку-хозяина может быть изменена регуляторная последовательность эндогенного гена в геноме клетки-хозяина, или целевой ген, который может экспрессироваться, может быть инсертирован в определенный сайт генома хозяина. Таким образом, вектор для применения по настоящему изобретению может дополнительно содержать селективный маркер для определения введения вектора в клетку-хозяина или инсерции вектора в хромосому клетки-хозяина. Селективный маркер может включать маркер, обеспечивающий селектируемый фенотип, такой как лекарственная устойчивость, ауксотрофность, устойчивость к цитотоксическим агентам или экспрессия поверхностного белка. На среде, обработанной таким селективным агентом, может быть выбрана трансформированная клетка, поскольку только клетка, которая экспрессирует селективный маркер, может выживать или проявлять иные фенотипические черты. Вектор согласно описанию в настоящем документе хорошо известен специалистам в данной области техники и включает в том числе, но не ограничиваясь перечисленным: плазмиду, бактериофаг (такой как λ бактериофаг или нитевидный бактериофаг М13, и т.п.), космиду или вирусный вектор.As used herein, the term "vector" refers to a polynucleotide construct comprising a gene regulatory sequence and a gene sequence and capable of expressing a target gene in a suitable host cell. The term "vector" may also refer to a polynucleotide construct comprising a sequence for homologous recombination, such that upon introduction of the vector into a host cell, the regulatory sequence of an endogenous gene in the host cell genome may be altered, or a target gene that can be expressed may be inserted into a specific site in the host genome. Thus, a vector for use in the present invention may further comprise a selectable marker for determining the introduction of the vector into a host cell or the insertion of the vector into a chromosome of the host cell. The selectable marker may include a marker providing a selectable phenotype, such as drug resistance, auxotrophy, resistance to cytotoxic agents, or expression of a surface protein. On a medium treated with such a selective agent, a transformed cell can be selected, since only a cell that expresses the selective marker can survive or exhibit other phenotypic traits. The vector as described herein is well known to those skilled in the art and includes, but is not limited to, a plasmid, a bacteriophage (such as a λ bacteriophage or a filamentous bacteriophage M13, etc.), a cosmid, or a viral vector.
Согласно некоторым конкретным вариантам реализации настоящего изобретения в качестве вектора используют плазмиду pK18mobsacB и плазмиду pXMJ19.According to some specific embodiments of the present invention, the plasmid pK18mobsacB and the plasmid pXMJ19 are used as a vector.
В настоящем документе термин «трансформация» относится к введению полинуклеотида в клетку-хозяина таким образом, чтобы указанный полинуклеотид мог быть репликативно-компетентным в качестве элемента, чужеродного для генома, или за счет встраивания в геном клетки-хозяина. Способ трансформации вектором, применяемый согласно настоящему изобретению, может включать способ введения нуклеиновой кислоты в клетку. Кроме того, в соответствии с описанием близких методик, может быть использован подходящий для клетки-хозяина способ, задействующий электрические импульсы.In the present document, the term "transformation" refers to the introduction of a polynucleotide into a host cell in such a way that said polynucleotide can be replicatively competent as an element foreign to the genome or by integration into the genome of the host cell. The method of transformation with a vector used according to the present invention may include a method of introducing a nucleic acid into a cell. In addition, according to the description of related techniques, a method suitable for the host cell involving electrical impulses may be used.
Согласно настоящему изобретению микроорганизм может представлять собой дрожжи, бактерию, водоросль или гриб.According to the present invention, the microorganism may be a yeast, a bacterium, an alga or a fungus.
В соответствии с настоящим изобретением указанная бактерия может представлять собой микроорганизм, принадлежащий к роду Corynebacterium, такой как Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium acetoglutamicum, Corynebacterium callunae, Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium pekinense, Brevibacterium saccharolyticum, Brevibacterium roseum и Brevibacterium thiogenitalis и т.п.According to the present invention, said bacterium may be a microorganism belonging to the genus Corynebacterium, such as Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium acetoglutamicum, Corynebacterium callunae, Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium pekinense, Brevibacterium saccharolyticum, Brevibacterium roseum and Brevibacterium thiogenitalis, etc.
Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения указанный микроорганизм, принадлежащий к роду Corynebacterium, представляет собой Corynebacterium glutamicum АТСС 13869.According to one embodiment of the present invention, said microorganism belonging to the genus Corynebacterium is Corynebacterium glutamicum ATCC 13869.
Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения указанный микроорганизм, принадлежащий к роду Corynebacterium, представляет собой Corynebacterium glutamicum YPGLU001, который обеспечивает высокие уровни продуцирования глутаминовой кислоты, и депонирован как штамм с названием: Corynebacterium glutamicum; латинское название: Corynebacterium glutamicum; штамм №: YPGLU001 в Китайском главном центре коллекций микробиологических культур («China General Microbiological Culture Collection Center»), сокращенно «CGMCC», адрес: No. 3, Yard 1, Beichen West Road, Chaoyang District, Beijing, 23 ноября 2020 г., под номером доступа: CGMCC №21220.According to one embodiment of the present invention, said microorganism belonging to the genus Corynebacterium is Corynebacterium glutamicum YPGLU001, which provides high levels of glutamic acid production, and is deposited as a strain named: Corynebacterium glutamicum; Latin name: Corynebacterium glutamicum; Strain No.: YPGLU001 at the China General Microbiological Culture Collection Center, abbreviated as “CGMCC”, address: No. 3, Yard 1, Beichen West Road, Chaoyang District, Beijing, on November 23, 2020, under accession number: CGMCC No. 21220.
В соответствии с настоящим изобретением указанная бактерия может также иметь дополнительные улучшения, связанные с повышением уровней продуцирования L-глутаминовой кислоты, такие как усиление или снижение активности, или экспрессии генов глутаматдегидрогеназы, глутаминсинтетазы, аминотрансферазы глутамина оксоглутаровой кислоты и т.п., или замена генов чужеродными генами.According to the present invention, said bacterium may also have additional improvements associated with increasing the levels of L-glutamic acid production, such as increasing or decreasing the activity or expression of genes for glutamate dehydrogenase, glutamine synthetase, glutamine oxoglutaric acid aminotransferase, etc., or replacing the genes with foreign genes.
Согласно второму аспекту настоящего изобретения предложены последовательность полинуклеотида (полинуклеотидная последовательность), аминокислотная последовательность, кодируемая указанной последовательностью полинуклеотида, рекомбинантный вектор, содержащий указанную последовательность полинуклеотида, и рекомбинантный штамм, содержащий указанную последовательность полинуклеотида.According to the second aspect of the present invention, there are provided a polynucleotide sequence (polynucleotide sequence), an amino acid sequence encoded by said polynucleotide sequence, a recombinant vector containing said polynucleotide sequence, and a recombinant strain containing said polynucleotide sequence.
В соответствии с настоящим изобретением указанная последовательность полинуклеотида включает полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, где пролин в положении 113 в последовательности заменен на другую аминокислоту.According to the present invention, said polynucleotide sequence comprises a polynucleotide encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, wherein proline at position 113 in the sequence is replaced by another amino acid.
В соответствии с настоящим изобретением предпочтительно пролин в положении 113 заменен на серин.According to the present invention, preferably proline at position 113 is replaced by serine.
В соответствии с настоящим изобретением, последовательность, представленная в SEQ ID NO: 4, представляет собой последовательность аминокислот после замены пролина на серин в положении 113 в последовательности аминокислот, представленной в SEQ ID NO: 3.According to the present invention, the sequence presented in SEQ ID NO: 4 is the amino acid sequence after substitution of proline for serine at position 113 in the amino acid sequence presented in SEQ ID NO: 3.
В соответствии с настоящим изобретением предпочтительно указанный полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, содержит последовательность полинуклеотида, представленную в SEQ ID NO: 1.According to the present invention, preferably said polynucleotide encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 comprises the polynucleotide sequence presented in SEQ ID NO: 1.
Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения указанная последовательность полинуклеотида образуется в результате мутации основания в положении 337 в последовательности полинуклеотида, представленной в SEQ ID NO: 1.According to one embodiment of the present invention, said polynucleotide sequence is formed as a result of a mutation of the base at position 337 in the polynucleotide sequence presented in SEQ ID NO: 1.
В соответствии с настоящим изобретением мутация относится к изменению основания/нуклеотида в сайте, и способ осуществления мутации может представлять собой по меньшей мере один способ, выбранный из мутагенеза, сайт-направленного ПЦР-мутагенеза и/или гомологичной рекомбинации, и т.п. Согласно настоящему изобретению предпочтительно используют сайт-направленный ПЦР-мутагенез и/или гомологичную рекомбинацию.According to the present invention, mutation refers to a change in a base/nucleotide at a site, and the method for carrying out the mutation may be at least one method selected from mutagenesis, site-directed PCR mutagenesis and/or homologous recombination, etc. According to the present invention, site-directed PCR mutagenesis and/or homologous recombination are preferably used.
Согласно настоящему изобретению мутация включает мутацию основания в положении 337 в последовательности полинуклеотида, представленной в SEQ ID NO: 1, с заменой цитозина (С) на тимин (Т).According to the present invention, the mutation comprises a mutation of the base at position 337 in the polynucleotide sequence presented in SEQ ID NO: 1, with the replacement of cytosine (C) with thymine (T).
Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения последовательность полинуклеотида содержит последовательность полинуклеотида SEQ ID NO: 2.According to one embodiment of the present invention, the polynucleotide sequence comprises the polynucleotide sequence SEQ ID NO: 2.
В соответствии с настоящим изобретением последовательность аминокислот содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO: 4.According to the present invention, the amino acid sequence comprises the amino acid sequence SEQ ID NO: 4.
В соответствии с настоящим изобретением рекомбинантный вектор конструируют путем введения последовательности полинуклеотида в плазмиду.According to the present invention, a recombinant vector is constructed by introducing a polynucleotide sequence into a plasmid.
Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения плазмида представляет собой плазмиду pK18mobsacB.According to one embodiment of the present invention, the plasmid is plasmid pK18mobsacB.
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения плазмида представляет собой плазмиду pXMJ19.According to another embodiment of the present invention, the plasmid is plasmid pXMJ19.
В частности, указанные последовательность полинуклеотида и плазмида могут быть сконструированы в виде рекомбинантного вектора с помощью системы рекомбинации NEBuider.In particular, the said polynucleotide sequence and plasmid can be constructed as a recombinant vector using the NEBuider recombination system.
В соответствии с настоящим изобретением указанный рекомбинантный штамм содержит указанную последовательность полинуклеотида.According to the present invention, said recombinant strain contains said polynucleotide sequence.
Во варианте реализации настоящего изобретения исходный штамм для рекомбинантного штамма представляет собой Corynebacterium glutamicum CGMCC №21220.In an embodiment of the present invention, the parent strain for the recombinant strain is Corynebacterium glutamicum CGMCC No. 21220.
В одном из вариантом реализации настоящего изобретения исходный штамм для рекомбинантного штамма представляет собой АТСС 13869.In one embodiment of the present invention, the parent strain for the recombinant strain is ATCC 13869.
Согласно третьему аспекту настоящего изобретения также предложен способ конструирования рекомбинантного штамма, продуцирующего L-глутаминовую кислоту.According to a third aspect of the present invention, a method for constructing a recombinant strain producing L-glutamic acid is also provided.
В соответствии с настоящим изобретением способ конструирования включает следующий этап:According to the present invention, the design method comprises the following step:
модификацию последовательности полинуклеотида гена BBD29_09525 дикого типа, представленной в SEQ ID NO: 1, у штамма-хозяина, чтобы вызвать мутацию основания в положении 337 с получением рекомбинантного штамма, содержащего кодирующий мутированный BBD29_09525 ген.modifying the polynucleotide sequence of the wild-type BBD29_09525 gene shown in SEQ ID NO: 1 in a host strain to cause a base mutation at position 337 to obtain a recombinant strain containing the encoding mutated BBD29_09525 gene.
В соответствии со способом конструирования согласно настоящему изобретению конструирование включает по меньшей мере что-либо одно из мутагенеза, сайт-направленного ПЦР-мутагенеза и/или гомологичной рекомбинации, и т.п.According to the construction method according to the present invention, the construction includes at least one of mutagenesis, site-directed PCR mutagenesis and/or homologous recombination, etc.
В соответствии со способом конструирования согласно настоящему изобретению мутация относится к мутации основания в положении 337 в SEQ ID NO: 1 с заменой цитозина (С) на тимин (Т). В частности, последовательность полинуклеотида, содержащая кодирующий мутированный BBD29_09525 ген, представлена в SEQ ID NO: 2.According to the construction method of the present invention, the mutation refers to a mutation of the base at position 337 in SEQ ID NO: 1 with the replacement of cytosine (C) with thymine (T). In particular, the polynucleotide sequence containing the gene encoding the mutated BBD29_09525 is presented in SEQ ID NO: 2.
Кроме того, способ конструирования включает следующие этапы:In addition, the design method includes the following steps:
(1) модификацию последовательности нуклеотидов гена BBD29_09525 дикого типа, представленной в SEQ ID NO: 1, чтобы вызвать мутацию основания в положении 337, с получением последовательности полинуклеотида мутированного гена BBD29_09525;(1) modifying the nucleotide sequence of the wild-type BBD29_09525 gene shown in SEQ ID NO: 1 to cause a base mutation at position 337, thereby obtaining a polynucleotide sequence of a mutated BBD29_09525 gene;
(2) соединение мутированной последовательности полинуклеотида с плазмидой для конструирования рекомбинантного вектора;(2) combining the mutated polynucleotide sequence with a plasmid to construct a recombinant vector;
(3) введение указанного рекомбинантного вектора в штамм-хозяин с получением рекомбинантного штамма, содержащего мутированный кодирующий BBD29_09525 ген.(3) introducing said recombinant vector into a host strain to obtain a recombinant strain containing a mutated gene encoding BBD29_09525.
В соответствии со способом конструирования согласно настоящему изобретению указанный этап (1) включает конструирование гена BBD29_09525 с точечной мутацией: в соответствии с геномной последовательностью немодифицированного штамма синтез двух пар праймеров P1, Р2 и Р3, Р4 для амплификации фрагмента гена BBD29_09525, и введение точечной мутации в ген BBD29_09525 дикого типа, SEQ ID NO: 1, с применением сайт-направленного ПЦР-мутагенеза с получением последовательности нуклеотидов гена BBD29_09525 с точечной мутацией, SEQ ID NO: 2, обозначенного как BBD29_09525 С337Т.According to the construction method according to the present invention, said step (1) comprises constructing a BBD29_09525 gene with a point mutation: in accordance with the genomic sequence of the unmodified strain, synthesizing two pairs of primers P1, P2 and P3, P4 to amplify a fragment of the BBD29_09525 gene, and introducing a point mutation into the wild-type BBD29_09525 gene, SEQ ID NO: 1, using site-directed PCR mutagenesis to obtain a nucleotide sequence of the BBD29_09525 gene with a point mutation, SEQ ID NO: 2, designated as BBD29_09525 C337T .
Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения геном немодифицированного штамма может происходить из штамма АТСС13869, геномную последовательность которого можно найти на вебсайте NCBI.According to one embodiment of the present invention, the genome of the unmodified strain may be derived from strain ATCC13869, the genomic sequence of which can be found on the NCBI website.
Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения на этапе (1) используют следующие праймеры:According to one embodiment of the present invention, the following primers are used in step (1):
Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения ПЦР-амплификацию осуществляют следующим образом: предварительная денатурация в течение 5 минут при 94°С, денатурация в течение 30 с при 94°С, ренатурация в течение 30 с при 52°С и удлинение в течение 45 с при 72°С в ходе 30 циклов, и избыточное удлинение в течение 10 мин при 72°С.According to one embodiment of the present invention, PCR amplification is carried out as follows: preliminary denaturation for 5 minutes at 94°C, denaturation for 30 seconds at 94°C, renaturation for 30 seconds at 52°C and extension for 45 seconds at 72°C for 30 cycles, and overextension for 10 minutes at 72°C.
Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения ПЦР-амплификацию с перекрывающимися праймерами осуществляют следующим образом: предварительная денатурация в течение 5 минут при 94°С, денатурация в течение 30 с при 94°С, ренатурация в течение 30 с при 52°С и удлинение в течение 90 с при 72°С в ходе 30 циклов, и избыточное удлинение в течение 10 мин при 72°С.According to one embodiment of the present invention, PCR amplification with overlapping primers is carried out as follows: pre-denaturation for 5 minutes at 94°C, denaturation for 30 seconds at 94°C, renaturation for 30 seconds at 52°C and extension for 90 seconds at 72°C for 30 cycles, and over-extension for 10 minutes at 72°C.
В соответствии со способом конструирования согласно настоящему изобретению этапAccording to the design method according to the present invention, the step
(2) включает конструирование рекомбинантной плазмиды, включающей сборку выделенного и очищенного BBD29_09525 с плазмидой pKlSmobsacB с помощью системы рекомбинации NEBuider с получением рекомбинантной плазмиды.(2) involves the construction of a recombinant plasmid comprising the assembly of isolated and purified BBD29_09525 with the pKlSmobsacB plasmid using the NEBuider recombination system to produce a recombinant plasmid.
В соответствии со способом конструирования согласно настоящему изобретению этапAccording to the design method according to the present invention, the step
(3) включает конструирование рекомбинантного штамма путем трансформации рекомбинантной плазмидой штамма-хозяина с получением рекомбинантного штамма.(3) involves constructing a recombinant strain by transforming a host strain with a recombinant plasmid to produce a recombinant strain.
Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения трансформацию на этапе (3) осуществляют методом электротрансформации.According to one embodiment of the present invention, the transformation at stage (3) is carried out by an electrotransformation method.
Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения штамм-хозяин представляет собой АТСС 13869.According to one embodiment of the present invention, the host strain is ATCC 13869.
Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения штамм-хозяин представляет собой Corynebacterium glutamicum CGMCC №21220.According to one embodiment of the present invention, the host strain is Corynebacterium glutamicum CGMCC No. 21220.
Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения указанная рекомбинация достигается путем гомологичной рекомбинации.According to one embodiment of the present invention, said recombination is achieved by homologous recombination.
Согласно четвертому аспекту настоящего изобретения также предложен способ конструирования рекомбинантного штамма, продуцирующего L-глутаминовую кислоту.According to a fourth aspect of the present invention, there is also provided a method for constructing a recombinant strain producing L-glutamic acid.
В соответствии с настоящим изобретением способ конструирования включает следующие этапы:According to the present invention, the design method comprises the following steps:
амплификация 5'- и 3'-фрагментов плеч гомологии BBD29_09525 и последовательности кодирующей области гена BBD29_09525 с областью его промотора, и введение гена BBD29_09525 или BBD29_09525C337T в геном штамма-хозяина путем гомологичной рекомбинации, что позволит указанному штамму сверхэкспрессировать ген BBD29_09525 или BBD29_09525C337T.amplification of the 5'- and 3'-fragments of the homology arms of BBD29_09525 and the sequence of the coding region of the BBD29_09525 gene with the region of its promoter, and introduction of the BBD29_09525 or BBD29_09525 C337T gene into the genome of the host strain by homologous recombination, which will allow the said strain to overexpress the BBD29_09525 or BBD29_09525 C337T gene.
Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения используют следующие праймеры для амплификации 5'-фрагментов плеч гомологии:According to one embodiment of the present invention, the following primers are used to amplify the 5' fragments of the homology arms:
Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения используют следующие праймеры для амплификации 3'-фрагментов плеча гомологии:According to one embodiment of the present invention, the following primers are used to amplify the 3' fragments of the homology arm:
Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения используют следующие праймеры для амплификации последовательности кодирующей области гена и области его промотора:According to one embodiment of the present invention, the following primers are used to amplify the sequence of the coding region of the gene and the region of its promoter:
Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения, опять же с вышеупомянутыми Р7/Р12 в качестве праймеров, осуществляют амплификацию с применением в качестве матриц смеси трех фрагментов, амплифицированного 5'-фрагмента плеча гомологии, 3'-фрагмента плеча гомологии и фрагмента последовательности кодирующей области гена и области его промотора, с получением единого фрагмента плеча гомологии.According to one embodiment of the present invention, again with the above-mentioned P7/P12 as primers, amplification is carried out using as templates a mixture of three fragments, an amplified 5' fragment of the homology arm, a 3' fragment of the homology arm and a fragment of the sequence of the coding region of the gene and the region of its promoter, with the production of a single fragment of the homology arm.
Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения используемая ПЦР-система содержит: 10 × буфер Ex Taq Buffer: 5 мкл, смесь dNTP (2,5 мМ каждый): 4 мкл, Mg2+(25 мМ): 4 мкл, праймеры (10 пМ): каждого по 2 мкл; и Ex Taq (5 Ед/мкл): 0,25 мкл, в общем объеме 50 мкл. ПЦР-амплификацию осуществляют следующим образом: предварительная денатурация в течение 5 минут при 94°С, денатурация в течение 30 с при 94°С, ренатурация в течение 30 с при 52°С, удлинение в течение 120 с при 72°С (30 циклов) и избыточное удлинение в течение 10 мин при 72°С.According to one embodiment of the present invention, the PCR system used comprises: 10× Ex Taq Buffer: 5 μl, dNTP mix (2.5 mM each): 4 μl, Mg2 + (25 mM): 4 μl, primers (10 pM): 2 μl each; and Ex Taq (5 U/μl): 0.25 μl, in a total volume of 50 μl. PCR amplification is carried out as follows: pre-denaturation for 5 minutes at 94°C, denaturation for 30 s at 94°C, renaturation for 30 s at 52°C, extension for 120 s at 72°C (30 cycles) and over-extension for 10 min at 72°C.
Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения используют систему рекомбинации NEBuider для сборки челночной плазмиды PK18mobsacB с единым фрагментом плеча гомологии для получения интегративной плазмиды.According to one embodiment of the present invention, the NEBuider recombination system is used to assemble the shuttle plasmid PK18mobsacB with a single homology arm fragment to produce an integrative plasmid.
Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения штамма-хозяин трансфицируют указанной интегративной плазмидой для введения гена BBD29_09525 или BBD29_09525C337T в геном штамма-хозяина путем гомологичной рекомбинации.According to one embodiment of the present invention, the host strain is transfected with said integrative plasmid to introduce the BBD29_09525 or BBD29_09525 C337T gene into the host strain genome by homologous recombination.
Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения штамм-хозяин представляет собой Corynebacterium glutamicum CGMCC №21220.According to one embodiment of the present invention, the host strain is Corynebacterium glutamicum CGMCC No. 21220.
Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения штамм-хозяин представляет собой АТСС 13869.According to one embodiment of the present invention, the host strain is ATCC 13869.
Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения указанный штамм-хозяин представляет собой штамм, несущий последовательность полинуклеотида, представленную в SEQ ID NO: 2.According to one embodiment of the present invention, said host strain is a strain carrying the polynucleotide sequence presented in SEQ ID NO: 2.
Согласно пятому аспекту настоящего изобретения также предложен способ конструирования рекомбинантного штамма, продуцирующего L-глутаминовую кислоту.According to a fifth aspect of the present invention, there is also provided a method for constructing a recombinant strain producing L-glutamic acid.
В соответствии с настоящим изобретением способ конструирования включает следующие этапы:According to the present invention, the design method comprises the following steps:
амплификация последовательности кодирующей области гена BBD29_09525 и области промотора, или последовательности кодирующей области гена BBD29_09525C337T и области промотора, конструирование сверхэкспрессирующего плазмидного вектора и трансформация указанным вектором штамма-хозяина, что позволяет указанному штамму сверхэкспрессировать ген BBD29_09525 или BBD29_09525 С337Т.amplifying the sequence of the coding region of the BBD29_09525 gene and the promoter region, or the sequence of the coding region of the BBD29_09525 C337T gene and the promoter region, constructing an overexpression plasmid vector and transforming the host strain with said vector, which allows said strain to overexpress the BBD29_09525 gene or BBD29_09525 C337T .
Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения используют следующие праймеры для амплификации последовательности кодирующей области гена и области его промотора:According to one embodiment of the present invention, the following primers are used to amplify the sequence of the coding region of the gene and the region of its promoter:
Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения указанная ПЦР-система содержит: 10 × буфер Ex Taq Buffer: 5 мкл, смесь dNTP (2,5 мМ каждый): 4 мкл, Mg2+(25 мМ): 4 мкл, праймеры (10 пМ): по 2 мкл каждого, Ex Taq (5 Ед/мкл): 0,25 мкл, в общем объеме 50 мкл. ПЦР-амплификацию осуществляют следующим образом: предварительная денатурация в течение 5 минут при 94°С, денатурация в течение 30 с при 94°С, ренатурация в течение 30 с при 52°С, удлинение в течение 120 с при 72°С (30 циклов) и избыточное удлинение в течение 10 мин при 72°С.According to one embodiment of the present invention, the PCR system comprises: 10× Ex Taq Buffer: 5 μl, dNTP mix (2.5 mM each): 4 μl, Mg2 + (25 mM): 4 μl, primers (10 pM): 2 μl each, Ex Taq (5 U/μl): 0.25 μl, in a total volume of 50 μl. PCR amplification is carried out as follows: pre-denaturation for 5 minutes at 94°C, denaturation for 30 s at 94°C, renaturation for 30 s at 52°C, extension for 120 s at 72°C (30 cycles) and over-extension for 10 min at 72°C.
Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения систему рекомбинации NEBuider применяют для сборки челночной плазмиды pXMJ19 с фрагментом BBD29_09525 или BBD29_09525С337Т, имеющим собственные промоторы, с получением сверхэкспрессирующей плазмиды.According to one embodiment of the present invention, the NEBuider recombination system is used to assemble the shuttle plasmid pXMJ19 with the BBD29_09525 or BBD29_09525 C337T fragment, which have their own promoters, to obtain an overexpression plasmid.
Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения штамм-хозяин представляет собой Corynebacterium glutamicum CGMCC №21220.According to one embodiment of the present invention, the host strain is Corynebacterium glutamicum CGMCC No. 21220.
Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения штамм-хозяин представляет собой АТСС 13869.According to one embodiment of the present invention, the host strain is ATCC 13869.
Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения указанный штамм-хозяин представляет собой штамм, несущий последовательность полинуклеотида, представленную в SEQ ID NO: 2.According to one embodiment of the present invention, said host strain is a strain carrying the polynucleotide sequence presented in SEQ ID NO: 2.
Рекомбинантный штамм, предложенный согласно настоящему изобретению, может индивидуально применяться при ферментации для продуцирования L-глутаминовой кислоты, и может также применяться для продуцирования L-глутаминовой кислоты при гибридной ферментации с другими продуцирующими L-глутаминовую кислоту бактериями.The recombinant strain provided according to the present invention can be used individually in fermentation for producing L-glutamic acid, and can also be used for producing L-glutamic acid in hybrid fermentation with other L-glutamic acid-producing bacteria.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложен способ получения L-глутаминовой кислоты, который включает культивирование бактерии; и получение L-глутаминовой кислоты из культуры.According to another aspect of the present invention, there is provided a method for producing L-glutamic acid, which comprises culturing a bacterium; and obtaining L-glutamic acid from the culture.
Бактерия может быть культивирована в подходящей культуральной среде в условиях культивирования, известных в данной области техники. Культуральная среда может содержать: источник углерода, источник азота, следовые элементы и комбинацию перечисленного. При культивировании могут корректироваться значения рН культуры. Кроме того, может предотвращаться образование пузырьков при культивировании, например, с применением пеногасителя для предотвращения образования пузырьков. Кроме того, в культуру могут вводиться газы при культивировании. Указанные газы могут включать любые газы, способные поддерживать аэробные условия в культуре. При культивировании температура культуры может составлять от 20°С до 45°С. Вырабатываемая L-глутаминовая кислота может быть выделена из культуры, т.е. культуру обрабатывают серной кислотой или соляной кислотой и т.п., с последующим применением комбинации таких способов, как анионообменная хроматография, конденсация, кристаллизация и изоэлектрическое осаждение.The bacterium may be cultured in a suitable culture medium under culture conditions known in the art. The culture medium may contain: a carbon source, a nitrogen source, trace elements, and a combination thereof. During the culture, the pH values of the culture may be adjusted. In addition, bubble formation during the culture may be prevented, for example, by using an antifoaming agent to prevent bubble formation. In addition, gases may be introduced into the culture during the culture. These gases may include any gases capable of maintaining aerobic conditions in the culture. During the culture, the temperature may be from 20°C to 45°C. The produced L-glutamic acid may be isolated from the culture, i.e. the culture is treated with sulfuric acid or hydrochloric acid, etc., followed by using a combination of methods such as anion exchange chromatography, condensation, crystallization, and isoelectric precipitation.
Согласно настоящему изобретению:According to the present invention:
SEQ ID NO: 1: последовательность ORF BBD29_09525 дикого типаSEQ ID NO: 1: ORF sequence of wild-type BBD29_09525
SEQ ID NO: 3: последовательность аминокислот белка, кодируемого BBD29_09525 дикого типаSEQ ID NO:3: Amino acid sequence of the protein encoded by wild-type BBD29_09525
SEQ ID NO: 4: последовательность аминокислот белка, кодируемого BBD29_09525P113SSEQ ID NO: 4: amino acid sequence of the protein encoded by BBD29_09525P113S
BBD29_09525P113S представляет собой BBD29_09525 P113S.BBD29_09525 P113S is BBD29_09525 P113S.
Согласно настоящему изобретению также предложен белок, обозначенный как белок BBD29_09525P113S, отличающийся тем, что указанный белок может представлять собой любое из:According to the present invention, there is also provided a protein designated as protein BBD29_09525 P113S , characterized in that said protein can be any of:
А1) белка, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4;A1) a protein having the amino acid sequence SEQ ID NO: 4;
А2) белка, обладающего 80% или более идентичностью белку, указанному в А1), и имеющего ту же функцию, что и белок, указанный в А1), полученного путем осуществления в последовательности аминокислот, представленной в SEQ ID NO: 4, замены, и/или делеции, и/или добавления остатков аминокислот;A2) a protein having 80% or more identity to the protein specified in A1) and having the same function as the protein specified in A1), obtained by implementing in the amino acid sequence presented in SEQ ID NO: 4, a substitution and/or deletion and/or addition of amino acid residues;
A3) слитого белка, имеющего туже функцию, полученного путем присоединения метки к N-концу и/или С-концу А1) или А2).A3) a fusion protein having the same function, obtained by attaching a label to the N-terminus and/or C-terminus of A1) or A2).
Согласно настоящему изобретению также предложена молекула нуклеиновой кислоты, обозначенная как BBD29_09525, причем указанная молекула нуклеиновой кислоты BBD29_09525C337T может представлять собой любое из:According to the present invention, there is also provided a nucleic acid molecule designated as BBD29_09525, wherein said nucleic acid molecule BBD29_09525 C337T may be any of:
B1) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей белок BBD29_09525P113S;B1) nucleic acid molecules encoding the protein BBD29_09525 P113S ;
B2) молекулы ДНК, кодирующая последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 2;B2) a DNA molecule, the coding sequence of which is presented in SEQ ID NO: 2;
B3) молекулы ДНК, нуклеотидная последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 2.B3) DNA molecules, the nucleotide sequence of which is presented in SEQ ID NO: 2.
Молекула ДНК, представленная в SEQ ID NO: 2, представляет собой ген BBD29-09525C337T согласно настоящему изобретению.The DNA molecule represented in SEQ ID NO: 2 is the BBD29-09525 C337T gene according to the present invention.
Молекула ДНК, представленная в SEQ ID NO: 2 (ген BBD29_09525С337Т), кодирует белок BBD29_09525 P113S, представленный в SEQ ID NO: 4.The DNA molecule presented in SEQ ID NO: 2 (gene BBD29_09525 C337T ) encodes the protein BBD29_09525 P113S presented in SEQ ID NO: 4.
Присутствием серина (S) в положении 113 в последовательности аминокислот белка BBD29_09525 P113S (SEQ ID NO: 4) обусловлено мутацией пролина (Р).The presence of serine (S) at position 113 in the amino acid sequence of protein BBD29_09525 P113S (SEQ ID NO: 4) is due to a proline (P) mutation.
Согласно настоящему изобретению также предложен биоматериал, где указанный биоматериал может представлять собой любое из:According to the present invention, a biomaterial is also provided, wherein said biomaterial may be any of:
B1) экспрессионной кассеты, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты BBD29_09525C337T;B1) an expression cassette containing the nucleic acid molecule BBD29_09525 C337T ;
B2) рекомбинантного вектора, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты BBD29_09525С337Т, или рекомбинантного вектора, содержащего экспрессионную кассету по С1);B2) a recombinant vector containing the nucleic acid molecule BBD29_09525 C337T , or a recombinant vector containing the expression cassette for C1);
B3) рекомбинантного микроорганизма, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты BBD29_09525С337Т, или рекомбинантного микроорганизма, содержащего экспрессионную кассету по С1), или рекомбинантного микроорганизма, содержащего рекомбинантный вектор по С2).B3) a recombinant microorganism containing a nucleic acid molecule BBD29_09525 C337T , or a recombinant microorganism containing an expression cassette according to C1), or a recombinant microorganism containing a recombinant vector according to C2).
Согласно настоящему изобретению также предложено любое из следующих применений любого из Dl) - D8):The present invention also provides any of the following uses of any of Dl) to D8):
F1) применение любого из D1) D8) для регуляции продуцирования L-глутаминовой кислоты у микроорганизма;F1) the use of any of D1) D8) to regulate the production of L-glutamic acid in a microorganism;
F2) применение любого из D1) - D8) для конструирования генетически сконструированной (модифицированной) бактерии для продуцирования L-глутаминовой кислоты;F2) the use of any of D1) - D8) to construct a genetically engineered (modified) bacterium to produce L-glutamic acid;
F3) применение любого из D1) - D8) для продуцирования L-глутаминовой кислоты; где Dl) D8) представляет собой: D1) белок BBD29_09525P113S;F3) use of any of D1) - D8) for the production of L-glutamic acid; where D1) D8) is: D1) BBD29_09525 P113S protein;
D2) молекулу нуклеиновой кислоты BBD29_095250337; D3) биоматериал;D2) nucleic acid molecule BBD29_09525 0337 ; D3) biomaterial;
D4) молекулу ДНК, последовательность нуклеотидов которой представляет собой SEQ ID NO: 1;D4) a DNA molecule whose nucleotide sequence is SEQ ID NO: 1;
D5) молекулу ДНК, обладающую идентичностью 90% или более с молекулой ДНК, представленной в SEQ ID NO: 1, и имеющую ту же функцию, что и указанная молекула ДНК, полученную путем осуществления в последовательности нуклеотидов, представленной в SEQ ID NO: 1, модификации, и/или замены, и/или делеции, и/или добавления одного или нескольких нуклеотидов;D5) a DNA molecule having an identity of 90% or more with the DNA molecule presented in SEQ ID NO: 1 and having the same function as said DNA molecule, obtained by implementing in the nucleotide sequence presented in SEQ ID NO: 1 a modification and/or substitution and/or deletion and/or addition of one or more nucleotides;
D6) экспрессионную кассету, содержащую молекулу ДНК по D4) или D5);D6) an expression cassette containing a DNA molecule according to D4) or D5);
D7) рекомбинантный вектор, содержащий молекулу ДНК по D4) или D5), или рекомбинантный вектор, содержащий экспрессионную кассету по D6);D7) a recombinant vector containing a DNA molecule according to D4) or D5), or a recombinant vector containing an expression cassette according to D6);
D8) рекомбинантный микроорганизм, содержащий молекулу ДНК по D4) или D5), или рекомбинантный микроорганизм, содержащий экспрессионную кассету по D6), или рекомбинантный микроорганизм, содержащий рекомбинантный вектор по D7).D8) a recombinant microorganism containing a DNA molecule according to D4) or D5), or a recombinant microorganism containing an expression cassette according to D6), or a recombinant microorganism containing a recombinant vector according to D7).
Молекула ДНК, представленная в SEQ ID NO: 1, представляет собой ген BBD29_09525 согласно настоящему изобретению.The DNA molecule represented in SEQ ID NO: 1 is the BBD29_09525 gene according to the present invention.
Молекула ДНК, представленная в SEQ ID NO: 1 (ген BBD29_09525), кодирует белок, представленный в SEQ ID NO: 3.The DNA molecule shown in SEQ ID NO: 1 (gene BBD29_09525) encodes the protein shown in SEQ ID NO: 3.
В настоящем документе «идентичность» относится к идентичности последовательностей аминокислот или последовательностей нуклеотидов. Международные сайты поиска гомологии в сети Интернет могут применяться для определения идентичности последовательностей аминокислот, например, страница BLAST на главной странице вебсайта NCBI. Например, в Advanced BLAST2.1 может быть использована программа blastp со значением параметра Expect value, установленным на 10, всеми фильтрами в режиме OFF, BLOSUM62 в качестве матрицы и значениями штрафа за введение пропуска, штрафа за удлинение пропуска на один остаток и коэффициента лямбда (Lambda ratio), установленными на 11, 1 и 0,85 (устанавливаемые по умолчанию значения), соответственно, и выполнен поиск идентичности между парой последовательностей аминокислот для расчета, после чего можно получить значение идентичности (%).In this document, "identity" refers to the identity of amino acid sequences or nucleotide sequences. International homology search sites on the Internet can be used to determine the identity of amino acid sequences, such as the BLAST page on the main page of the NCBI website. For example, in Advanced BLAST2.1, the blastp program can be used with the Expect value set to 10, all filters set to OFF, BLOSUM62 as the matrix, and the gap introduction penalty, one-residue gap extension penalty, and Lambda ratio set to 11, 1, and 0.85 (the default values), respectively, and the identity search is performed between a pair of amino acid sequences to calculate, and then the identity value (%) can be obtained.
Согласно настоящему документу идентичность 80% или более может представлять собой по меньшей мере 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность.According to the present document, an identity of 80% or more may be at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% identity.
Согласно настоящему документу идентичность 90% или более может представлять собой по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность.According to this document, an identity of 90% or more may be at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% identity.
Регуляция продуцирования L-глутаминовой кислоты у микроорганизма согласно описанию в настоящем документе может представлять собой повышение или понижение уровня накопления L-глутаминовой кислоты у микроорганизма (т.е. стимуляцию или ингибирование биосинтеза L-глутаминовой кислоты).The regulation of L-glutamic acid production in a microorganism as described herein may be an increase or decrease in the level of L-glutamic acid accumulation in the microorganism (i.e., stimulation or inhibition of L-glutamic acid biosynthesis).
Согласно настоящему изобретению также предложен способ повышения продуцирования L-глутаминовой кислоты у микроорганизма, при этом указанный способ включает любое из:According to the present invention, a method for increasing the production of L-glutamic acid in a microorganism is also provided, wherein said method comprises any of:
Е1) повышения уровня экспрессии или содержания молекулы нуклеиновой кислоты BBD29_09525C337T в целевом микроорганизме с получением микроорганизма, продуцирующего больше L-глутаминовой кислоты, чем целевой микроорганизм;E1) increasing the expression level or content of the BBD29_09525 C337T nucleic acid molecule in a target microorganism to obtain a microorganism producing more L-glutamic acid than the target microorganism;
Е2) повышения уровня экспрессии или содержания молекулы ДНК по D4) или D5) в целевом микроорганизме с получением микроорганизма, продуцирующего больше L-глутаминовой кислоты, чем целевой микроорганизм;E2) increasing the expression level or content of the DNA molecule according to D4) or D5) in the target microorganism to obtain a microorganism producing more L-glutamic acid than the target microorganism;
Е3) осуществления мутации в молекуле ДНК, последовательность нуклеотидов которой представляет собой SEQ ID NO: 1, в целевом микроорганизме с получением микроорганизма, продуцирующего больше L-глутаминовой кислоты, чем целевой микроорганизм.E3) implementing a mutation in a DNA molecule, the nucleotide sequence of which is SEQ ID NO: 1, in a target microorganism to obtain a microorganism producing more L-glutamic acid than the target microorganism.
Согласно описанному выше способу указанная мутация может представлять собой точечную мутацию, т.е. мутацию одного нуклеотида.According to the method described above, the said mutation may be a point mutation, i.e. a mutation of one nucleotide.
В описанном выше способе точечная мутация может представлять собой мутацию остатка пролина в положении 113 в последовательности аминокислот, кодируемой молекулой ДНК, представленной в SEQ ID NO: 1, на остаток другой аминокислоты.In the above method, the point mutation may be a mutation of the proline residue at position 113 in the amino acid sequence encoded by the DNA molecule shown in SEQ ID NO: 1 to a different amino acid residue.
В описанном выше способе точечная мутация может представлять собой мутацию пролина в положении 113 в последовательности аминокислот, кодируемой молекулой ДНК, представленной в SEQ ID NO: 1, на серин, что обеспечивает получение мутированного белка BBD29_09525 P113S, последовательность аминокислот которого представляет собой SEQ ID NO: 4.In the above method, the point mutation may be a mutation of proline at position 113 in the amino acid sequence encoded by the DNA molecule represented in SEQ ID NO: 1 to serine, which provides the mutated protein BBD29_09525 P113S, the amino acid sequence of which is SEQ ID NO: 4.
Мутация относится к изменению одного или нескольких оснований в гене в результате сайт-направленной мутации, что приводит к изменению аминокислотного состава соответствующего белка, с получением таким образом нового белка или обеспечением новой функции исходного белка, то есть представляет собой сайт-направленную мутацию генов. Методики осуществления сайт-направленных мутаций генов, такие как опосредованный олигонуклеотидными праймерами сайт-направленный мутагенез, ПНР-опосредованный сайт-направленный мутагенез или кассетный мутагенез, хорошо известны специалистам в данной области техники.Mutation refers to a change in one or more bases in a gene as a result of a site-directed mutation, which results in a change in the amino acid composition of the corresponding protein, thereby obtaining a new protein or providing a new function to the original protein, i.e., it is a site-directed mutation of genes. Techniques for performing site-directed mutations of genes, such as oligonucleotide primer-mediated site-directed mutagenesis, PCR-mediated site-directed mutagenesis, or cassette mutagenesis, are well known to those skilled in the art.
Точечная мутация согласно описанию в настоящем документе может представлять собой замену одного основания, инсерцию одного основания или делецию одного основания, и в особенности замену одного основания. Замена одного основания может представлять собой аллельную замену.A point mutation as described herein may be a single base substitution, a single base insertion, or a single base deletion, and in particular a single base substitution. A single base substitution may be an allelic substitution.
Точечная мутация может заключаться в осуществлении модификации нуклеиновой кислоты с заменой цитозина (С) в положении 337 гена BBD29_09525 (SEQ ID NO: 1).A point mutation may involve a nucleic acid modification with a cytosine (C) substitution at position 337 of the BBD29_09525 gene (SEQ ID NO: 1).
В частности, точечная мутация может заключаться в осуществлении мутации цитозина (С) в положении 337 гена BBD29_09525 (SEQ ID NO: 1) на тимин (Т) с получением молекулы ДНК, представленной в SEQ ID NO: 2.In particular, the point mutation may consist of mutating cytosine (C) at position 337 of the BBD29_09525 gene (SEQ ID NO: 1) to thymine (T) to produce the DNA molecule presented in SEQ ID NO: 2.
В настоящем документе рекомбинантный вектор может представлять собой, в частности, рекомбинантный вектор pK18-BBD29_09525C337T, PK18mobsacB-BBD29_09525, PK18mobsacB-BBD29_09525 С337Т, pXMJ19-BBD29_09525 или pXMJ19-BBD29_09525C337T.In the present document, the recombinant vector may be, in particular, the recombinant vector pK18-BBD29_09525 C337T , PK18mobsacB-BBD29_09525, PK18mobsacB- BBD29_09525 C337T, pXMJ19-BBD29_09525 or pXMJ19-BBD29_09525 C337T .
Рекомбинантный вектор pK18-BBD29_09525C337T представляет собой рекомбинантный вектор, полученный путем замены фрагмента (фрагмента малого размера) между сайтами распознавания Xbal I WBamH I в векторе pK18mobsacB на фрагмент ДНК, представленный положениями 37 1466 SEQ ID NO: 29 в перечне последовательностей, при сохранении в неизмененном виде других последовательностей вектора pK18mobsacB. Рекомбинантный вектор pK18-BBD29_09525C337T содержит молекулу ДНК, представленную положениями 1-1051 в мутированном гене BBD29_09525 С337Т ; представленном в SEQ ID NO: 2.The recombinant vector pK18-BBD29_09525 C337T is a recombinant vector obtained by replacing the fragment (small fragment) between the recognition sites Xbal I WBamH I in the pK18mobsacB vector with the DNA fragment represented by positions 37-1466 of SEQ ID NO: 29 in the sequence listing, while maintaining other sequences of the pK18mobsacB vector unchanged. The recombinant vector pK18-BBD29_09525 C337T contains the DNA molecule represented by positions 1-1051 in the mutated BBD29_09525 C337T gene ; represented in SEQ ID NO: 2.
Рекомбинантный вектор PK18mobsacB-BBD29_09525 применяют для интеграции экзогенного гена BBD29_09525 в хромосому хозяина для сверхэкспрессии гена BBD29_09525 дикого типа у бактерии-продуцента. Рекомбинантный вектор pK18mobsacB-BBD29_09525 представляет собой рекомбинантный вектор, полученный путем замены фрагмента (фрагмента малого размера) между сайтами распознавания Xbal I и/ВатН I в векторе pK18mobsacB на фрагмент ДНК, представленный положениями 37-3407 SEQ ID NO: 30 в перечне последовательностей, при сохранении в неизмененном виде других последовательностей вектора pK18mobsacB.The recombinant vector PK18mobsacB-BBD29_09525 is used to integrate the exogenous BBD29_09525 gene into the host chromosome for overexpression of the wild-type BBD29_09525 gene in the producer bacterium. The recombinant vector pK18mobsacB-BBD29_09525 is a recombinant vector obtained by replacing the fragment (small fragment) between the recognition sites Xbal I and /BamH I in the pK18mobsacB vector with the DNA fragment represented by positions 37-3407 of SEQ ID NO: 30 in the sequence listing, while maintaining other sequences of the pK18mobsacB vector unchanged.
Рекомбинантный вектор PK18mobsacB-BBD29_09525C337T применяют для интеграции экзогенного гена BBD29_09525 в хромосому хозяина для сверхэкспрессии мутантного типа гена BBD29_09525C337T у бактерии-продуцента. Рекомбинантный вектор pK18mobsacB-BBD29_09525C337T представляет собой рекомбинантный вектор, полученный путем замены фрагмента (фрагмента малого размера) между сайтами распознавания Xbal I и/ВатН I в векторе pK18mobsacB на фрагмент ДНК, представленный положениями 37-3407 SEQ ID NO: 31 в перечне последовательностей, при сохранении в неизмененном виде других последовательностей вектора pK18mobsacB.The recombinant vector PK18mobsacB-BBD29_09525 C337T is used for the integration of the exogenous BBD29_09525 gene into the host chromosome for overexpression of the mutant type of the BBD29_09525 C337T gene in the producer bacterium. The recombinant vector pK18mobsacB-BBD29_09525 C337T is a recombinant vector obtained by replacing the fragment (small fragment) between the recognition sites Xbal I and /BamH I in the pK18mobsacB vector with the DNA fragment represented by positions 37-3407 of SEQ ID NO: 31 in the sequence listing, while maintaining other sequences of the pK18mobsacB vector unchanged.
Рекомбинантный вектор pXMJ19-BBD29_09525 применяют для экспрессии с помощью плазмиды экзогенного гена BBD29_09525 вне хромосомы для сверхэкспрессии гена BBD29_09525 дикого типа у бактерии-продуцента. Рекомбинантный вектор pXMJ19-BBD29_09525 представляет собой рекомбинантный вектор, полученный путем замены фрагмента (фрагмента малого размера) между сайтами распознавания EcoR I и Kpn I в векторе pXMJ19 на фрагмент ДНК, представленный положениями 37-1927 SEQ ID NO: 32 в перечне последовательностей, при сохранении в неизмененном виде других последовательностей вектора pXMJ19.The recombinant vector pXMJ19-BBD29_09525 is used for the plasmid-based expression of the exogenous BBD29_09525 gene outside the chromosome for overexpression of the wild-type BBD29_09525 gene in the producer bacterium. The recombinant vector pXMJ19-BBD29_09525 is a recombinant vector obtained by replacing the fragment (small fragment) between the EcoRI and KpnI recognition sites in the pXMJ19 vector with the DNA fragment represented by positions 37-1927 of SEQ ID NO: 32 in the sequence listing, while maintaining other sequences of the pXMJ19 vector unchanged.
Рекомбинантный вектор pXMJ19-BBD29_09525С337Т применяют для экспрессии с помощью плазмиды экзогенного гена BBD29_09525С337Т вне хромосомы для сверхэкспрессии мутантного типа гена BBD29_09525С337Т у бактерии-продуцента. Рекомбинантный вектор pXMJ19-BBD29_09525C337T представляет собой рекомбинантный вектор, полученный путем замены фрагмента (фрагмента малого размера) между сайтами распознавания EcoR I и Kpn I в векторе pXMJ19 на фрагмент ДНК, представленный положениями 37-1927 SEQ ID NO: 33 в перечне последовательностей, при сохранении в неизмененном виде других последовательностей вектора pXMJ19.The recombinant vector pXMJ19-BBD29_09525 C337T is used for the expression of the exogenous BBD29_09525 C337T gene outside the chromosome using a plasmid for overexpression of the mutant type of the BBD29_09525 C337T gene in the producer bacterium. The recombinant vector pXMJ19-BBD29_09525 C337T is a recombinant vector obtained by replacing the fragment (small fragment) between the EcoRI and KpnI recognition sites in the pXMJ19 vector with the DNA fragment represented by positions 37-1927 of SEQ ID NO: 33 in the sequence listing, while maintaining other sequences of the pXMJ19 vector unchanged.
Все рекомбинантные векторы из pK18-BBD29_09525С337Т, PK18mobsacB-BBD29_09525, PK18mobsacB-BBD29_09525C337T, pXMJ19-BBD29_09525 и pXMJ19-BBD29_09525C337T включены в заявленный объем настоящего изобретения.All recombinant vectors from pK18-BBD29_09525 C337T , PK18mobsacB-BBD29_09525, PK18mobsacB-BBD29_09525 C337T , pXMJ19-BBD29_09525 and pXMJ19-BBD29_09525 C337T are included within the claimed scope of the present invention.
В настоящем документе рекомбинантный микроорганизм может представлять собой, в частности, рекомбинантную бактерию YPG-007, YPG-008, YPG-009, YPG-010 или YPG-011.In the present document, the recombinant microorganism may be, in particular, a recombinant bacterium YPG-007, YPG-008, YPG-009, YPG-010 or YPG-011.
Рекомбинантная бактерия YPG-007 представляет собой рекомбинантную бактерию, полученную путем трансформации рекомбинантного вектора pK18-BBD29_09525C337T в Corynebacterium glutamicum CGMCC №21220, и указанная рекомбинантная бактерия YPG-007 содержит мутированный ген BBD29_09525, представленный в SEQ ID NO: 2.The recombinant bacterium YPG-007 is a recombinant bacterium obtained by transforming the recombinant vector pK18-BBD29_09525 C337T into Corynebacterium glutamicum CGMCC No. 21220, and said recombinant bacterium YPG-007 contains the mutated BBD29_09525 gene shown in SEQ ID NO: 2.
Рекомбинантная бактерия YPG-008 содержит двухкопийный ген BBD29_09525, представленный в SEQ ID NO: 1; рекомбинантная бактерия, содержащая двухкопийный ген BBD29_09525, способна значимо и устойчиво повышать уровень экспрессии гена BBD29_09525. Рекомбинантная бактерия YPG-008 представляет собой сконструированную бактерию, сверхэкспрессирующую ген BBD29_09525 дикого типа из генома.The recombinant bacterium YPG-008 contains a two-copy BBD29_09525 gene shown in SEQ ID NO: 1; the recombinant bacterium containing the two-copy BBD29_09525 gene is capable of significantly and stably increasing the expression level of the BBD29_09525 gene. The recombinant bacterium YPG-008 is an engineered bacterium that overexpresses the wild-type BBD29_09525 gene from the genome.
Рекомбинантная бактерия YPG-009 содержит мутированный ген BBD29_09525C337T, представленный в SEQ ID NO: 2; указанная рекомбинантная бактерия YPG-009 представляет собой сконструированную бактерию, сверхэкспрессирующую мутантный тип гена BBD29_09525С337Т из генома.The recombinant bacterium YPG-009 contains the mutated BBD29_09525 C337T gene shown in SEQ ID NO: 2; said recombinant bacterium YPG-009 is an engineered bacterium overexpressing the mutant type of the BBD29_09525 C337T gene from the genome.
Рекомбинантная бактерия YPG-010 содержит двухкопийный ген BBD29_09525, представленный в SEQ ID NO: 1; указанная рекомбинантная бактерия YPG-010 представляет собой сконструированную бактерию, сверхэкспрессирующую ген BBD29_09525 дикого типа на плазмиде, т.е. сверхэкспрессия происходит вне хромосомы с помощью плазмиды pXMJ19-BBD29_09525.The recombinant bacterium YPG-010 contains a two-copy BBD29_09525 gene shown in SEQ ID NO: 1; said recombinant bacterium YPG-010 is an engineered bacterium overexpressing the wild-type BBD29_09525 gene on a plasmid, i.e., overexpression occurs extrachromosomally using the plasmid pXMJ19-BBD29_09525.
Рекомбинантная бактерия YPG-011 содержит мутированный ген BBD29_09525C337T, представленный в SEQ ID NO: 2; рекомбинантная бактерия YPG-011 представляет собой сконструированную бактерию, сверхэкспрессирующую мутантный тип гена BBD29_09525 С337Т на плазмиде, т.е. сверхэкспрессия происходит вне хромосомы с помощью плазмиды pXMJ19-BBD29_09525C337T.The recombinant bacterium YPG-011 contains the mutated BBD29_09525 C337T gene shown in SEQ ID NO: 2; the recombinant bacterium YPG-011 is an engineered bacterium overexpressing the mutant type of BBD29_09525 C337T gene on a plasmid, i.e., overexpression occurs extrachromosomally using the plasmid pXMJ19-BBD29_09525 C337T .
Все рекомбинантные бактерии из YPG-007, YPG-008, YPG-009, YPG-010 и YPG-011 включены в заявленный объем настоящего изобретения.All recombinant bacteria from YPG-007, YPG-008, YPG-009, YPG-010 and YPG-011 are included within the claimed scope of the present invention.
Согласно настоящему изобретению также предложен способ конструирования рекомбинантного микроорганизма, при этом указанный способ включает по меньшей мере что-либо одно из:According to the present invention, there is also provided a method for constructing a recombinant microorganism, wherein said method comprises at least one of:
F1) введения молекулы нуклеиновой кислоты BBD29_09525C337T в целевой микроорганизм с получением рекомбинантного микроорганизма;F1) introducing the nucleic acid molecule BBD29_09525 C337T into the target microorganism to obtain a recombinant microorganism;
F2) введения молекулы ДНК, представленной в SEQ ID NO: 1, в целевой микроорганизм с получением рекомбинантного микроорганизма;F2) introducing the DNA molecule presented in SEQ ID NO: 1 into a target microorganism to obtain a recombinant microorganism;
F3) редактирования молекулы ДНК, представленной в SEQ ID NO: 1, с использованием средства редактирования генов (такого как редактирование генов с изменением одного основания) для введения молекулы ДНК, представленной в SEQ ID NO: 2, в целевой микроорганизм.F3) editing the DNA molecule as set forth in SEQ ID NO: 1 using a gene editing tool (such as single base editing) to introduce the DNA molecule as set forth in SEQ ID NO: 2 into a target microorganism.
Указанное введение может быть представлено трансформацией бактерии-хозяина трансформация вектором, несущим молекулу ДНК согласно настоящему изобретению, любыми известными способами трансформации, такими как способ химической трансформации или способ электротрансформации. Введенная молекула ДНК может 5 быть однокопийной или многокопийной. Введение может быть представлено интеграцией экзогенного гена в хромосому хозяина, или экспрессией вне хромосомы с помощью плазмиды.Said introduction can be represented by transformation of the host bacterium by a vector carrying the DNA molecule according to the present invention, by any known transformation methods, such as a chemical transformation method or an electrotransformation method. The introduced DNA molecule can be single-copy or multi-copy. The introduction can be represented by integration of an exogenous gene into the host chromosome, or expression outside the chromosome using a plasmid.
Согласно настоящему изобретению также предложен способ получения L-глутаминовой кислоты, при этом указанный способ включает продуцирование L-10 глутаминовой кислоты любым из рекомбинантных микроорганизмов согласно описанию в настоящем документе.According to the present invention, there is also provided a method for producing L-glutamic acid, wherein said method comprises producing L-10 glutamic acid by any of the recombinant microorganisms as described herein.
Описанный выше способ может представлять собой получение L-глутаминовой кислоты ферментативным способом, а рекомбинантный микроорганизм может относиться к роду Corynebacterium, и в частности, представлять собой Corynebacterium 15 glutamicum и его варианты.The above-described method may be a method for producing L-glutamic acid by a fermentative method, and the recombinant microorganism may belong to the genus Corynebacterium, and in particular, be Corynebacterium 15 glutamicum and its variants.
Информация о депонировании: Название штамма: Corynebacterium glutamicum; Латинское название: Corynebacterium glutamicum; штамм №: YPGLU001; Депозитарное учреждение: Китайский главный центр коллекций микробиологических культур, сокращенно CGMCC; адрес: No. 3, Yard 1, Beichen West Road, Chaoyang District, Beijing; 20 Дата депонирования: 23 ноября 2020 г.; номер доступа в депозитарном центре: CGMCC №21220.Deposit information: Strain name: Corynebacterium glutamicum; Latin name: Corynebacterium glutamicum; Strain No.: YPGLU001; Depository institution: China General Microbiological Culture Collection Center, abbreviated as CGMCC; Address: No. 3, Yard 1, Beichen West Road, Chaoyang District, Beijing; 20 Deposit date: November 23, 2020; Depository accession number: CGMCC No. 21220.
Наилучшие способы реализации изобретенияThe best ways to implement the invention
Настоящее изобретение будет подробно описано ниже на конкретных вариантах реализации; указанные примеры приведены исключительно для иллюстрации настоящего изобретения, но не для ограничения объема настоящего изобретения. Примеры, представленные ниже, могут применяться в качестве руководства для дальнейшего улучшения специалистами в данной области техники, и не подразумевают каких-либо ограничений настоящего изобретения.The present invention will be described in detail below with respect to specific embodiments; the examples given are provided solely to illustrate the present invention, but not to limit the scope of the present invention. The examples provided below can be used as a guide for further improvement by those skilled in the art, and do not imply any limitations of the present invention.
Если конкретным образом не указано иное, все экспериментальные методы в приведенных ниже примерах представляют собой обычные способы, которые осуществляют в соответствии с методиками или условиями, описанными в литературе, относящейся к данной области техники, или в соответствии с инструкциями по применению продуктов. Если конкретным образом не указано иное, материалы и реагенты, используемые в приведенных ниже примерах, могут быть коммерчески доступными.Unless specifically stated otherwise, all experimental methods in the examples below are conventional methods that are carried out in accordance with procedures or conditions described in the literature related to the art or in accordance with product instructions for use. Unless specifically stated otherwise, materials and reagents used in the examples below may be commercially available.
В приведенных ниже примерах состав основной среды, используемой для культивирования штамма, одинаковый, а сахарозу, канамицин или хлорамфеникол добавляют в состав основной среды по мере необходимости. Состав основной среды приведен в табл. 1:In the examples below, the composition of the basic medium used to cultivate the strain is the same, and sucrose, kanamycin, or chloramphenicol are added to the basic medium as needed. The composition of the basic medium is given in Table 1:
Corynebacterium glutamicum YPGLU001 CGMCC №21220 в примерах ниже был депонирован в Китайском главном центре коллекций микробиологических культур (сокращенно CGMCC, адрес: No. 3, Yard 1, Beichen West Road, Chaoyang District, Beijing, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences) 23 ноября 2020 г. под номером доступа CGMCC №21220. Corynebacterium glutamicum YPGLU001 также известен как Corynebacterium glutamicum CGMCC №21220.Corynebacterium glutamicum YPGLU001 CGMCC#21220 in the examples below was deposited at the China General Microbiological Culture Collection Center (abbreviated as CGMCC, Address: No. 3, Yard 1, Beichen West Road, Chaoyang District, Beijing, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences) on November 23, 2020 under the accession number CGMCC#21220. Corynebacterium glutamicum YPGLU001 is also known as Corynebacterium glutamicum CGMCC#21220.
Пример 1. Конструирование вектора для трансформации pK18-BBD29_09525, содержащего кодирующую область гена BBD29_09525 с точечной мутациейExample 1. Construction of pK18-BBD29_09525 transformation vector containing the coding region of the BBD29_09525 gene with a point mutation
В соответствии с последовательностью генома Corynebacterium glutamicum АТСС13869, опубликованной в NCBI, разрабатывали и синтезировали два пары праймеров для амплификации последовательности кодирующей области гена BBD29_09525, и вводили точечную мутацию в штамм Corynebacterium glutamicum CGMCC №21220 путем аллельной замены (подтверждено соответствие кодирующей области гена BBD29_09525 на хромосоме штамма АТСС13869 при секвенировании). Последовательность аминокислот, соответствующая кодируемому белку, представлена в SEQ ID NO: 3, с заменой цитозина (С) в положении 337 последовательности нуклеотидов гена BBD29_09525 на тимин (Т) (SEQ ID NO: 2: BBD29_09525 С337Т), соответственно, с заменой пролина (Р) в положении 113 в последовательности аминокислот, соответствующей кодируемому белку, на серин (S) (SEQ ID NO: 4: BBD29_09525 P113S).According to the genome sequence of Corynebacterium glutamicum ATCC13869 published in NCBI, two pairs of primers were designed and synthesized to amplify the sequence of the coding region of the BBD29_09525 gene, and a point mutation was introduced into the Corynebacterium glutamicum strain CGMCC No. 21220 by allelic replacement (the coding region of the BBD29_09525 gene was confirmed to match the chromosome of the ATCC13869 strain by sequencing). The amino acid sequence corresponding to the encoded protein is presented in SEQ ID NO: 3, with the replacement of cytosine (C) at position 337 of the nucleotide sequence of the BBD29_09525 gene with thymine (T) (SEQ ID NO: 2: BBD29_09525 C337T), respectively, with the replacement of proline (P) at position 113 in the amino acid sequence corresponding to the encoded protein with serine (S) (SEQ ID NO: 4: BBD29_09525 P113S).
Точечная мутация представляет собой мутацию цитозина (С) в положении 337 в последовательности нуклеотидов гена BBD29_09525 (SEQ ID NO: 1) на тимин (Т), обеспечивающую получение молекулы ДНК, представленной в SEQ ID NO: 2 (мутированный ген BBD29_09525, обозначенный как BBD29_09525C337T).The point mutation is a mutation of cytosine (C) at position 337 in the nucleotide sequence of the BBD29_09525 gene (SEQ ID NO: 1) to thymine (T), providing the DNA molecule presented in SEQ ID NO: 2 (mutated BBD29_09525 gene, designated as BBD29_09525 C337T ).
При этом молекула ДНК, представленная в SEQ ID NO: 1, кодирует белок, имеющий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 3 (указанный белок обозначен как белок BBD29_09525).In this case, the DNA molecule presented in SEQ ID NO: 1 encodes a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 (the said protein is designated as protein BBD29_09525).
Молекула ДНК, представленная в SEQ ID NO: 2, кодирует мутантный белок, последовательность аминокислот которого представлена SEQ ID NO: 4 (указанный мутантный белок обозначен как BBD29_09525P113S). Присутствие серина (S) в положении 113 в последовательности аминокислот мутантного белка BBD29_09525P113S (SEQ ID NO: 4) обусловлено мутацией пролина (Р).The DNA molecule presented in SEQ ID NO: 2 encodes a mutant protein whose amino acid sequence is presented in SEQ ID NO: 4 (said mutant protein is designated as BBD29_09525 P113S ). The presence of serine (S) at position 113 in the amino acid sequence of the mutant protein BBD29_09525 P113S (SEQ ID NO: 4) is due to a proline (P) mutation.
Методику ПЦР с перекрывающимися праймерами используют для сайт-направленного мутагенеза генов со следующими разработанными праймерами (синтезированы Invitrogen Corporation, Шанхай). Основание, где происходит мутация, выделено жирным шрифтом:The overlapping primer PCR technique is used for site-directed mutagenesis of genes with the following designed primers (synthesized by Invitrogen Corporation, Shanghai). The base where the mutation occurs is highlighted in bold:
Способ конструирования: используя Corynebacterium glutamicum АТСС13869 в качестве матрицы, осуществляют ПЦР-амплификацию с соответствующими праймерами P1, Р2 и Р3, Р4 с получением двух фрагментов ДНК кодирующей области гена BBD29_09525, каждый из которых содержит мутированное основание и имеет размер 766 и.о. и 768 и.о., соответственно (BBD29_09525 Up и BBD29_09525 Down).Construction method: using Corynebacterium glutamicum ATCC13869 as a template, PCR amplification was carried out with the corresponding primers P1, P2 and P3, P4 to obtain two DNA fragments of the coding region of the BBD29_09525 gene, each of which contains a mutated base and has a size of 766 bp and 768 bp, respectively (BBD29_09525 Up and BBD29_09525 Down).
ПЦР-система: 10 × буфер Ex Taq Buffer: 5 мкл, смесь dNTP (каждый 2,5 мМ): 4 мкл, Mg2+(25 мМ): 4 мкл, праймеры (10 пМ): по 2 мкл каждого, Ex Taq (5 Ед/мкл): 0,25 мкл, в общем объеме 50 мкл.PCR system: 10× Ex Taq Buffer: 5 µl, dNTP mix (each 2.5 mM): 4 µl, Mg2 + (25 mM): 4 µl, primers (10 pM): 2 µl each, Ex Taq (5 U/µl): 0.25 µl, total volume 50 µl.
Вышеуказанную ПЦР-амплификацию осуществляют путем предварительной денатурации в течение 5 минут при 94°С, денатурации в течение 30 с при 94°С, ренатурации в течение 30 с при 52°С, удлинения в течение 45 с при 72°С в течение 30 циклов и избыточного удлинения в течение 10 мин при 72°С с получением двух фрагментов ДНК, содержащих кодирующую область гена BBD29_09525, каждый из которых имеет размер 766 п.о. и 768 и.о. (BBD29_09525 Up и BBD29_09525 Down).The above PCR amplification was carried out by pre-denaturation for 5 min at 94°C, denaturation for 30 s at 94°C, renaturation for 30 s at 52°C, extension for 45 s at 72°C for 30 cycles, and over-extension for 10 min at 72°C to obtain two DNA fragments containing the coding region of the BBD29_09525 gene, each having a size of 766 bp and 768 i.p. (BBD29_09525 Up and BBD29_09525 Down).
Указанные два фрагмента ДНК (BBD29_09525 Up и BBD29_09525 Down) выделяют посредством электрофореза на агарозном геле и очищают, после чего извлекают целевые полосы. Указанные два фрагмента ДНК затем используют в качестве матрицы с Р1 и Р4 в качестве праймеров для ПЦР-амплификации с перекрывающимися праймерами с получением фрагмента длиной 1504 п.о., обозначенного как BBD29_09525 Up-Down (последовательность представлена в SEQ ID NO: 29). В молекуле ДНК, представленной в SEQ ID NO: 29, положения 37-1087 представляют собой фрагмент гена BBD29_09525C337T с сайтом мутации (т.е. положения 1-1051 SEQ ID NO: 2).The two DNA fragments (BBD29_09525 Up and BBD29_09525 Down) were isolated by agarose gel electrophoresis and purified, and the target bands were recovered. The two DNA fragments were then used as a template with P1 and P4 as primers for overlapping PCR amplification to generate a 1504 bp fragment designated as BBD29_09525 Up-Down (the sequence is provided in SEQ ID NO: 29). In the DNA molecule provided in SEQ ID NO: 29, positions 37-1087 represent the BBD29_09525 C337T gene fragment with the mutation site (i.e. positions 1-1051 of SEQ ID NO: 2).
ПЦР-система с перекрывающимися праймерами: 10 × буфер Ex Taq: 5 мкл, смесь dNTP (каждый 2,5 мМ): 4 мкл, Mg2+(25 мМ): 4 мкл, праймеры (10 пМ): 2 мкл каждого, Ex Taq (5 Ед/мкл): 0,25 мкл, в общем объеме 50 мкл.Overlapping primer PCR system: 10× Ex Taq buffer: 5 µl, dNTP mix (each 2.5 mM): 4 µl, Mg2 + (25 mM): 4 µl, primers (10 pM): 2 µl each, Ex Taq (5 U/µl): 0.25 µl, in a total volume of 50 µl.
ПЦР-амплификацию с перекрывающимися праймерами осуществляют путем предварительной денатурации в течение 5 минут при 94°С, денатурации в течение 30 с при 94°С, ренатурации в течение 30 с при 52°С, удлинения в течение 90 с при 72°С в течение 30 циклов и избыточного удлинения в течение 10 мин при 72°С.PCR amplification with overlapping primers was performed by pre-denaturation for 5 min at 94°C, denaturation for 30 s at 94°C, renaturation for 30 s at 52°C, extension for 90 s at 72°C for 30 cycles, and over-extension for 10 min at 72°C.
Фрагмент ДНК BBD29_09525 Up-Down (SEQ ID NO: 29) содержит сайт мутации для введения модификации нуклеиновой кислоты в положении 337 кодирующей области гена BBD29_09525 у Corynebacterium glutamicum CGMCC №21220, в частности, изменения цитозина (С) в положении 337 кодирующей области гена BBD29_09525 у Corynebacterium glutamicum CGMCC №21220 на тимин (Т), в конечном итоге обуславливающего изменение аминокислоты в положении 113 кодируемого белка с пролина (Р) на серин (S).The BBD29_09525 Up-Down DNA fragment (SEQ ID NO: 29) contains a mutation site for introducing a nucleic acid modification at position 337 of the coding region of the BBD29_09525 gene in Corynebacterium glutamicum CGMCC #21220, in particular, a change in cytosine (C) at position 337 of the coding region of the BBD29_09525 gene in Corynebacterium glutamicum CGMCC #21220 to thymine (T), ultimately causing an amino acid change at position 113 of the encoded protein from proline (P) to serine (S).
После расщепления плазмиды pK18mobsacB (приобретена у Addgene Corporation) Xba I /BamH I, BBD29_09525C337T и линеаризированную плазмиду pK18mobsacB выделяют посредством электрофореза на агарозном геле и очищают, с последующей сборкой с применением системы рекомбинации NEBuider, получая вектор рК18-BBD29_09525C337T, плазмиду, содержащую маркер устойчивости к канамицину. При этом вектор pK18-BBD29_09525 отправляют для секвенирования и идентификации в компанию, осуществляющую секвенирование, и содержащий корректную точечную мутацию (С-Т) вектор pK18-BBD29_09525 отправляют на хранение.After digestion of pK18mobsacB plasmid (purchased from Addgene Corporation) with Xba I /BamH I, BBD29_09525 C337T and the linearized pK18mobsacB plasmid were isolated by agarose gel electrophoresis and purified, followed by assembly using the NEBuider recombination system to yield pK18-BBD29_09525 C337T vector, a plasmid containing a kanamycin resistance marker. In this case, the pK18-BBD29_09525 vector was sent to a sequencing company for sequencing and identification, and the pK18-BBD29_09525 vector containing the correct point mutation (C-T) was stored.
В частности, фрагмент ДНК (BBD29_09525 Up-Down) очищают после выделения посредством электрофореза на агарозном геле, с последующим лигированием в плазмиду pK18mobsacB (приобретена у Addgene Corporation, расщеплена Xbal I/BamH I), очищенную после расщепления ферментами (Xbal I/BamH I) в течение 30 минут при 50°С с применением фермента NEBuilder (приобретен у NEB Corporation). Выросший одиночный клон после трансформации продукта лигирования DH5a (приобретен у TAKARA Corporation), подвергают ПЦР-идентификации для обнаружения положительного рекомбинантного вектора pK18-BBD29_09525С337Т, содержащего маркер устойчивости к канамицину (Kanr). Корректно расщепленный рекомбинантный вектор pK18-BBD29-09525C337T отправляют для секвенирования и идентификации в компанию, осуществляющую секвенирование, а содержащий корректную точечную мутацию (С-Т) рекомбинантный вектор pK18-BBD29_09525С337Т отправляют на хранение.Specifically, the DNA fragment (BBD29_09525 Up-Down) was purified after isolation by agarose gel electrophoresis, followed by ligation into the plasmid pK18mobsacB (purchased from Addgene Corporation, digested with Xbal I/BamH I) purified after enzyme digestion (Xbal I/BamH I) for 30 min at 50°C using NEBuilder enzyme (purchased from NEB Corporation). The grown single clone after transformation of the ligation product with DH5a (purchased from TAKARA Corporation) was subjected to PCR identification to detect the positive recombinant vector pK18-BBD29_09525 C337T containing the kanamycin resistance marker (Kan r ). The correctly digested recombinant vector pK18-BBD29-09525 C337T is sent to a sequencing company for sequencing and identification, and the recombinant vector pK18-BBD29_09525 C337T containing the correct point mutation (C-T) is sent to storage.
Рекомбинантный вектор pK18-BBD29_09525С337Т представляет собой рекомбинантный вектор, полученный путем замены фрагмента (фрагмента малого размера) между сайтами распознавания Xbal I и/BamH I в векторе pK18mobsacB на фрагмент ДНК, представленный положениями 37-1466 SEQ ID NO: 29 в перечне последовательностей, при сохранении в неизмененном виде других последовательностей вектора pK18mobsacB.The recombinant vector pK18-BBD29_09525 C337T is a recombinant vector obtained by replacing the fragment (small fragment) between the recognition sites Xbal I and/BamHI in the vector pK18mobsacB with the DNA fragment represented by positions 37-1466 of SEQ ID NO: 29 in the sequence listing, while maintaining other sequences of the vector pK18mobsacB unchanged.
Рекомбинантный вектор pK18-BBD29_09525C337T содержит молекулу ДНК, представленную положениями 1-1051 в мутированном гене BBD29_09525C337T, представленном в SEQ ID NO: 2The recombinant vector pK18-BBD29_09525 C337T contains the DNA molecule represented by positions 1-1051 in the mutated gene BBD29_09525 C337T represented in SEQ ID NO: 2
Пример 2. Конструирование сконструированного штамма, содержащего BBD29_09525С337Т с точечной мутациейExample 2. Construction of an engineered strain containing BBD29_09525 C337T with a point mutation
Способ конструирования: Плазмидой pK18-BBD29_09525С337Т после аллельной замены согласно примеру 1 электротрансформируют Corynebacterium glutamicum CGMCC №21220 для культивирования в культуральной среде. См. в табл. 1 ингредиенты среды и условия культивирования. Каждую из выросших моноколоний идентифицируют с применением праймера Р1 и универсального праймера M13R для определения положительного штамма по полосе, соответствующей размеру приблизительно 1511 п.о., полученной при амплификации. Положительный штамм культивируют на культуральной среде, содержащей 15% сахарозы, и выросшие моноколонии культивируют на культуральных средах с канамицином и без канамицина, соответственно. Штаммы, растущие на культуральной среде без канамицина и не растущие на культуральной среде с канамицином, выбирают для дальнейшей идентификации с помощью ПЦР со следующими праймерами (синтезированы Invitrogen Corporation, Шанхай):Construction method: Plasmid pK18-BBD29_09525 C337T after allelic replacement according to Example 1 was electrotransformed into Corynebacterium glutamicum CGMCC No. 21220 for cultivation in a culture medium. See Table 1 for the ingredients of the medium and cultivation conditions. Each of the grown monocolonies was identified using primer P1 and universal primer M13R for determining the positive strain by a band corresponding to a size of approximately 1511 bp obtained during amplification. The positive strain was cultured on a culture medium containing 15% sucrose, and the grown monocolonies were cultured on culture media with and without kanamycin, respectively. Strains growing on culture medium without kanamycin and not growing on culture medium with kanamycin were selected for further identification by PCR with the following primers (synthesized by Invitrogen Corporation, Shanghai):
Описанные выше амплифицированные продукты ПЦР подвергают денатурации при высокой температуре и на ледяной бане, после чего проводят SSCP-электрофорез (с амплифицированным фрагментом вектора pK18-BBD29_09525 С337Т в качестве положительного контроля, амплифицированным фрагментом АТСС13869 в качестве отрицательного контроля, и водой в качестве холостого контроля). См. в табл. 2 описание подготовки ПААГ для SSCP-электрофореза и условий электрофореза. Поскольку фрагменты отличаются структурой, их локализация при электрофорезе будет разной. Соответственно, штамм, характеризующийся успешной аллельной заменой, представляет собой такой штамм, локализация фрагмента которого при электрофорезе не совпадает с локализацией отрицательного контрольного фрагмента, и совпадает с локализацией положительного контрольного фрагмента. Праймеры Р5 и Р6 используют также для ПЦР-амплификации целевого фрагмента штамма, характеризующегося успешной аллельной заменой, который затем лигируют в вектор PMD19-T для секвенирования. Используя выравнивание последовательностей для мутированной последовательности оснований, подтверждают успешность аллельной замены у указанного штамма, который обозначен как YPG-007.The above amplified PCR products were denatured at high temperature and in an ice bath, after which SSCP electrophoresis was performed (with the amplified fragment of the pK18-BBD29_09525 C337T vector as a positive control, the amplified fragment of ATCC13869 as a negative control, and water as a blank control). See Table 2 for a description of the PAGE preparation for SSCP electrophoresis and the electrophoresis conditions. Since the fragments differ in structure, their localization during electrophoresis will be different. Accordingly, a strain characterized by a successful allelic substitution is a strain whose fragment localization during electrophoresis does not coincide with the localization of the negative control fragment, but coincides with the localization of the positive control fragment. Primers P5 and P6 are also used to PCR amplify the target fragment of the strain characterized by a successful allelic substitution, which is then ligated into the PMD19-T vector for sequencing. Using sequence alignment for the mutated base sequence, the success of the allelic substitution in this strain, designated YPG-007, is confirmed.
Рекомбинантная бактерия YPG-007 содержит мутированный ген BBD29_09525C337T SEQ ID NO: 2.Recombinant bacterium YPG-007 contains the mutated gene BBD29_09525 C337T SEQ ID NO: 2.
Пример 3. Конструирование сконструированного штамма со сверхэкспрессируемым геном BBD29_09525 или BBD29_09525C337T в геномеExample 3. Construction of an engineered strain with overexpressed BBD29_09525 or BBD29_09525 C337T gene in the genome
Для дополнительного изучения и подтверждения того, что сверхэкспрессия гена BBD29_09525 дикого типа или его производного мутантного гена BBD29_09525 у бактерии-продуцента может повышать продуцирование L-глутаминовой кислоты, экзогенный ген интегрируют в хромосому хозяина для конструирования сконструированного штамма с геном BBD29_09525 или геном BBD29_09525, сверхэкспрессируемым из генома.To further study and confirm that overexpression of the wild-type BBD29_09525 gene or its derived mutant BBD29_09525 gene in the producer bacterium can enhance the production of L-glutamic acid, the exogenous gene was integrated into the host chromosome to construct an engineered strain with the BBD29_09525 gene or the BBD29_09525 gene overexpressed from the genome.
В соответствии с последовательностью генома Corynebacterium glutamicum АТСС13869, опубликованной в базе NCBI, разрабатывали и синтезировали три пары праймеров для амплификации 5'- и 3'-фрагментов плеч гомологии, а также последовательности кодирующей области гена BBD29_09525 и области промотора для введения гена BBD29_09525 или BBD29_09525С337Т в штамм Corynebacterium glutamicum CGMCC №21220 путем гомологичной рекомбинации.According to the genome sequence of Corynebacterium glutamicum ATCC13869 published in the NCBI database, three pairs of primers were designed and synthesized to amplify the 5'- and 3'-fragments of the homology arms, as well as the coding region sequence of the BBD29_09525 gene and the promoter region for introducing the BBD29_09525 or BBD29_09525 C337T gene into the Corynebacterium glutamicum CGMCC strain No. 21220 by homologous recombination.
Разработаны следующие праймеры (синтезированы mvitrogen Corporation, Шанхай):The following primers were developed (synthesized by mvitrogen Corporation, Shanghai):
Способ конструирования: Используя Corynebacterium glutamicum АТСС13869 или YPG-007, соответственно, в качестве матрицы, осуществляют ПЦР-амплификацию с праймерами Р7/Р8, Р9/Р10 и Р11/Р22, соответственно, с получением 5'-фрагмента плеча гомологии длиной около 807 п.о., фрагмента кодирующей области гена BBD29_09525 и области промотора длиной 1931 п.о. или фрагмента кодирующей области гена BBD29_09525 С337Т и области промотора длиной около 1931 п.о., и 3'-фрагмента плеча гомологии длиной около 787 п.о. Кроме того, с применением Р7/Р12 в качестве праймеров осуществляют амплификацию со смесью трех описанных выше амплифицированных фрагментов в качестве матрицы с получением единых фрагментов плеч гомологии 1 и 2 (единый фрагмент плеч гомологии 1 длиной 3445 п.о., согласно SEQ ID NO: 30; и единый фрагмент плеч гомологии 2 длиной 3445 п.о., согласно SEQ ID NO: 31). После завершения ПЦР-реакции осуществляют электрофорез амплифицированных продуктов для выделения требуемого фрагмента ДНК длиной приблизительно 3445 п.о. с применением набора с колонкой для выделения ДНК на геле (TIANGEN), который лигируют, используя систему рекомбинации NEBuider, в челночную плазмиду PK18mobsacB, расщепленную Xba I и выделенную с получением интегративной плазмиды (т.е. рекомбинантного вектора) PK18mobsacB-BBD29_09525 или PK18mobsacB-BBD29_09525. Указанная плазмида содержит маркер устойчивости к канамицину, благодаря чему путем скрининга с канамицином может быть получен рекомбинантный штамм, содержащий интегрированную в геном плазмиду.Construction method: Using Corynebacterium glutamicum ATCC13869 or YPG-007, respectively, as a template, PCR amplification was carried out with primers P7/P8, P9/P10 and P11/P22, respectively, to obtain a 5' fragment of the homology arm of about 807 bp in length, a fragment of the coding region of the BBD29_09525 gene and the promoter region of about 1931 bp in length or a fragment of the coding region of the BBD29_09525 C337T gene and the promoter region of about 1931 bp in length, and a 3' fragment of the homology arm of about 787 bp in length. In addition, using P7/P12 as primers, amplification is carried out with a mixture of the three amplified fragments described above as a template to obtain single fragments of homology arms 1 and 2 (a single fragment of homology arms 1 of 3445 bp in length, according to SEQ ID NO: 30; and a single fragment of homology arms 2 of 3445 bp in length, according to SEQ ID NO: 31). After completion of the PCR reaction, electrophoresis of the amplified products is carried out to isolate the desired DNA fragment of approximately 3445 bp in length. using a DNA gel column extraction kit (TIANGEN), which was ligated using the NEBuider recombination system into the shuttle plasmid PK18mobsacB digested with Xba I and isolated to obtain an integrative plasmid (i.e., a recombinant vector) PK18mobsacB-BBD29_09525 or PK18mobsacB-BBD29_09525. This plasmid contains a kanamycin resistance marker, so that a recombinant strain containing the plasmid integrated into the genome can be obtained by screening with kanamycin.
Рекомбинантный вектор pK18mobsacB-BBD29_09525 представляет собой рекомбинантный вектор, полученный путем замены фрагмента (фрагмента малого размера) между сайтами распознавания Xbal I и/BamH I в векторе pK18mobsacB на фрагмент ДНК, представленный положениями 37-3407 SEQ ID NO: 30 в перечне последовательностей, при сохранении в неизмененном виде других последовательностей вектора pK18mobsacB.The recombinant vector pK18mobsacB-BBD29_09525 is a recombinant vector obtained by replacing the fragment (small fragment) between the recognition sites of Xbal I and/BamHI in the vector pK18mobsacB with the DNA fragment represented by positions 37-3407 of SEQ ID NO: 30 in the sequence listing, while maintaining other sequences of the vector pK18mobsacB unchanged.
Рекомбинантный вектор pK18mobsacB-BBD29_09525С337Т представляет собой рекомбинантный вектор, полученный путем замены фрагмента (фрагмента малого размера) между сайтами распознавания Xbal I и/BamH I в векторе pK18mobsacB на фрагмент ДНК, представленный положениями 37-3407 SEQ ID NO: 31 в перечне последовательностей, при сохранении в неизмененном виде других последовательностей вектора pK18mobsacB. ПЦР-система: 10 × буфер Ex Taq Buffer: 5 мкл, смесь dNTP (каждый 2,5 мМ): 4 мкл, Mg2+(25 мМ): 4 мкл, праймеры (10 пМ): по 2 мкл каждого, Ex Taq (5 Ед/мкл): 0,25 мкл, в общем объеме 50 мкл.The recombinant vector pK18mobsacB-BBD29_09525 C337T is a recombinant vector obtained by replacing the fragment (small fragment) between the recognition sites Xbal I and/BamHI in the vector pK18mobsacB with the DNA fragment represented by positions 37-3407 of SEQ ID NO: 31 in the sequence listing, while maintaining other sequences of the vector pK18mobsacB unchanged. PCR system: 10× Ex Taq Buffer: 5 µl, dNTP mix (each 2.5 mM): 4 µl, Mg2 + (25 mM): 4 µl, primers (10 pM): 2 µl each, Ex Taq (5 U/µl): 0.25 µl, total volume 50 µl.
ПЦР-амплификацию осуществляют путем предварительной денатурации в течение 5 минут при 94°С, денатурации в течение 30 с при 94°С, ренатурации в течение 30 с при 52°С, удлинения в течение 120 с при 72°С (30 циклов) и избыточного удлинения в течение 10 мин при 72°С.PCR amplification was performed by pre-denaturation for 5 min at 94°C, denaturation for 30 s at 94°C, renaturation for 30 s at 52°C, extension for 120 s at 72°C (30 cycles) and over-extension for 10 min at 72°C.
Каждую из этих двух интегративных плазмид (PK18mobsacB-BBD29_09525 и PK18mobsacB-BBD29_09525C337T) вводят в штамм Corynebacterium glutamicum CGMCC №21220 путем электротрансформации, и осуществляют ПЦР-идентификацию выросших моноколоний с праймерами Р13/Р14 для обнаружения положительного штамма, содержащего фрагмент длиной приблизительно 1821 п.о., полученный при ПЦР-амплификации, тогда как штамм, не содержащий каких-либо амплифицированных этим способом фрагментов, представляет собой исходный штамм. При скрининге с 15% сахарозы положительный штамм культивируют на культуральных средах с канамицином и без канамицина, соответственно, и штаммы, растущие на культуральной среде без канамицина и не растущие на культуральной среде с канамицином подвергают дальнейшей ПЦР с праймерами Р15/Р16 для идентификации. Штамм, из которого амплифицирован фрагмент длиной приблизительно 1769 п.о., представляет собой штамм с геном BBD29_09525 или BBD29_09525С337Т, интегрированным в геном Corynebacterium glutamicum CGMCC №21220, обозначенный как YPG-008 (без точечной мутации) и YPG-009 (с точечной мутацией).Each of these two integrative plasmids (PK18mobsacB-BBD29_09525 and PK18mobsacB-BBD29_09525 C337T ) was introduced into the Corynebacterium glutamicum CGMCC #21220 strain by electrotransformation, and PCR identification of the grown monocolonies was carried out with primers P13/P14 to detect a positive strain containing a fragment of approximately 1821 bp obtained by PCR amplification, while the strain not containing any fragments amplified by this method is the original strain. In the 15% sucrose screening, the positive strain was cultured on culture media with and without kanamycin, respectively, and the strains growing on the culture media without kanamycin and not growing on the culture media with kanamycin were further subjected to PCR with primers P15/P16 for identification. The strain from which the approximately 1769 bp fragment was amplified was the strain with the BBD29_09525 or BBD29_09525 C337T gene integrated into the genome of Corynebacterium glutamicum CGMCC #21220, designated as YPG-008 (without point mutation) and YPG-009 (with point mutation).
Рекомбинантная бактерия YPG-008 содержит двухкопийный ген BBD29_09525 согласно SEQ ID NO: 1; указанная рекомбинантная бактерия, содержащая двухкопийный ген BBD29_09525, способна значимо и устойчиво повышать уровень экспрессии гена BBD29_09525. Рекомбинантная бактерия YPG-008 представляет собой сконструированную бактерию, сверхэкспрессирующую ген BBD29_09525 дикого типа из генома.The recombinant bacterium YPG-008 comprises a two-copy BBD29_09525 gene according to SEQ ID NO: 1; said recombinant bacterium containing the two-copy BBD29_09525 gene is capable of significantly and stably increasing the expression level of the BBD29_09525 gene. The recombinant bacterium YPG-008 is an engineered bacterium that overexpresses the wild-type BBD29_09525 gene from the genome.
Рекомбинантная бактерия YPG-009 содержит мутированный ген BBD29_09525C337T согласно SEQ ID NO: 2; рекомбинантная бактерия YPG-009 представляет собой сконструированную бактерию, сверхэкспрессирующую мутантный ген BBD29_09525C337T из генома.The recombinant bacterium YPG-009 contains the mutated BBD29_09525 C337T gene according to SEQ ID NO: 2; the recombinant bacterium YPG-009 is an engineered bacterium overexpressing the mutant BBD29_09525 C337T gene from the genome.
Праймеры для ПЦР-идентификации представлены ниже:Primers for PCR identification are presented below:
Пример 4. Конструирование модифицированного штамма, сверхэкспрессирующего ген BBD29_09525 или BBD29_09525C337T с плазмидыExample 4. Construction of a modified strain overexpressing the BBD29_09525 or BBD29_09525 C337T gene from a plasmid
В соответствии с последовательностью генома Corynebacterium glutamicum АТСС13869, опубликованной в базе NCBI, разрабатывали и синтезировали пару праймеров для амплификации последовательности кодирующей области гена BBD29_09525 и области промотора. Разработаны следующие праймеры (синтезированы hwitrogen Corporation, Шанхай):According to the genome sequence of Corynebacterium glutamicum ATCC13869 published in the NCBI database, a pair of primers were designed and synthesized to amplify the sequence of the coding region of the BBD29_09525 gene and the promoter region. The following primers were designed (synthesized by hwitrogen Corporation, Shanghai):
Способ конструирования: Используя YPG-008 или YPG-007, соответственно, в качестве матрицы, осуществляют ПЦР-амплификацию с праймерами Р17/р18 с получением фрагмента гена BBD29_09525 и его промотора длиной 1961 п.о. (SEQ ID NO: 32) или фрагмента гена BBD29_09525 С337Ти его промотора длиной 1961 п.о. (SEQ ID NO: 33). Осуществляют электрофорез амплифицированных продуктов для выделения требуемого фрагмента ДНК в 1961 и.о. с применением набора с колонкой для выделения ДНК на геле, который лигируют с использованием системы рекомбинации NEBuider в челночную плазмиду pXMJ19, расщепленную EcoR I/Kpn I, и выделяют, получая сверхэкспрессирующую плазмиду (т.е. рекомбинантный вектор) pXMJ19-BBD29_09525 или pXMJ19-BBD29_09525. Указанная плазмида содержит маркер устойчивости к хлорамфениколу, и трансформация штамма плазмидой может быть достигнута при скрининге с хлорамфениколом.Construction method: Using YPG-008 or YPG-007, respectively, as a template, PCR amplification is carried out with primers P17/p18 to obtain a fragment of the BBD29_09525 gene and its promoter of 1961 bp in length (SEQ ID NO: 32) or a fragment of the BBD29_09525 C337T gene and its promoter of 1961 bp in length (SEQ ID NO: 33). Electrophoresis of the amplified products is carried out to isolate the desired DNA fragment of 1961 bp. using a DNA gel extraction column kit, which is ligated using the NEBuider recombination system into the shuttle plasmid pXMJ19 digested with EcoRI/KpnI and isolated to obtain an overexpression plasmid (i.e., a recombinant vector) pXMJ19-BBD29_09525 or pXMJ19-BBD29_09525. This plasmid contains a chloramphenicol resistance marker, and transformation of the strain with the plasmid can be achieved by screening with chloramphenicol.
Рекомбинантный вектор pXMJ19-BBD29_09525 представляет собой рекомбинантный вектор, полученный путем замены фрагмента (фрагмента малого размера) между сайтами распознавания EcoR I и Kpn I в векторе pXMJ19 на фрагмент ДНК, представленный положениями 37-1927 SEQ ID NO: 32 в перечне последовательностей, при сохранении в неизмененном виде других последовательностей вектора pXMJ19.The recombinant vector pXMJ19-BBD29_09525 is a recombinant vector obtained by replacing the fragment (small fragment) between the EcoRI and KpnI recognition sites in the pXMJ19 vector with the DNA fragment represented by positions 37-1927 of SEQ ID NO: 32 in the sequence listing, while maintaining other sequences of the pXMJ19 vector unchanged.
Рекомбинантный вектор pXMJ19-BBD29_09525C337T представляет собой рекомбинантный вектор, полученный путем замены фрагмента (фрагмента малого размера) между сайтами распознавания EcoR I и Kpn I в векторе pXMJ19 на фрагмент ДНК, представленный положениями 37-1927 SEQ ID NO: 33 в перечне последовательностей, при сохранении в неизмененном виде других последовательностей вектора pXMJ19.The recombinant vector pXMJ19-BBD29_09525 C337T is a recombinant vector obtained by replacing the fragment (small fragment) between the EcoRI and KpnI recognition sites in the pXMJ19 vector with the DNA fragment represented by positions 37-1927 of SEQ ID NO: 33 in the sequence listing, while maintaining other sequences of the pXMJ19 vector unchanged.
ПЦР-система: 10 × буфер Ex Taq Buffer: 5 мкл, смесь dNTP (каждый 2,5 мМ): 4 мкл, Mg2+(25 мМ): 4 мкл, праймеры (10 пМ): по 2 мкл каждого, Ex Taq (5 Ед/мкл): 0,25 мкл, в общем объеме 50 мкл.PCR system: 10× Ex Taq Buffer: 5 µl, dNTP mix (each 2.5 mM): 4 µl, Mg2 + (25 mM): 4 µl, primers (10 pM): 2 µl each, Ex Taq (5 U/µl): 0.25 µl, total volume 50 µl.
ПЦР-амплификацию осуществляют путем предварительной денатурации в течение 5 минут при 94°С, денатурации в течение 30 с при 94°С, ренатурации в течение 30 с при 52°С и удлинения в течение 120 с при 72°С (30 циклов) и избыточного удлинения в течение 10 мин при 72°С.PCR amplification was performed by pre-denaturation for 5 min at 94°C, denaturation for 30 s at 94°C, renaturation for 30 s at 52°C and extension for 120 s at 72°C (30 cycles) and over-extension for 10 min at 72°C.
Каждую из двух плазмид (pXMJ19-BBD29_09525 и pXMJ19-BBD29_09525 С337Т) вводят в штамм Corynebacterium glutamicum CGMCC №21220 путем электротрансформации, и осуществляют ПЦР-идентификацию выросших моноколоний с праймерами M13R (-48) и р18 для обнаружения трансформированного штамма, содержащего фрагмент длиной приблизительно 2000 п.о., полученный при ПЦР-амплификации, обозначенного как YPG-010 (без точечной мутации) и YPG-011 (с точечной мутацией).Each of the two plasmids (pXMJ19-BBD29_09525 and pXMJ19-BBD29_09525 C337T) were introduced into the Corynebacterium glutamicum CGMCC #21220 strain by electrotransformation, and PCR identification of the grown monocolonies was carried out with primers M13R (-48) and p18 to detect the transformed strain containing a fragment of approximately 2000 bp in length obtained by PCR amplification, designated as YPG-010 (without point mutation) and YPG-011 (with point mutation).
Рекомбинантная бактерия YPG-010 содержит двухкопийный ген BBD29_09525 согласно SEQ ID NO: 1; рекомбинантная бактерия YPG-010 представляет собой сконструированную бактерию, сверхэкспрессирующую ген BBD29_09525 дикого типа на плазмиде, т.е. сверхэкспрессия происходит вне хромосомы с плазмиды pXMJ19-BBD29_09525.The recombinant bacterium YPG-010 contains a two-copy BBD29_09525 gene according to SEQ ID NO: 1; the recombinant bacterium YPG-010 is an engineered bacterium overexpressing the wild-type BBD29_09525 gene on a plasmid, i.e., overexpression occurs extrachromosomally from the plasmid pXMJ19-BBD29_09525.
Рекомбинантная бактерия YPG-011 содержит мутированный ген BBD29_09525C337T согласно SEQ ID NO: 2; рекомбинантная бактерия YPG-011 представляет собой сконструированную бактерию, сверхэкспрессирующую мутантный ген BBD29_09525С337Т на плазмиде, т.е. сверхэкспрессия происходит вне хромосомы с плазмиды pXMJ19-BBD29_09525C337T.The recombinant bacterium YPG-011 contains the mutated BBD29_09525 C337T gene according to SEQ ID NO: 2; the recombinant bacterium YPG-011 is an engineered bacterium overexpressing the mutant BBD29_09525 C337T gene on a plasmid, i.e., overexpression occurs extrachromosomally from the plasmid pXMJ19-BBD29_09525 C337T .
Пример 5. Конструирование сконструированного штамма с делетированным в геноме геном BBD29_09525.Example 5. Construction of a constructed strain with the BBD29_09525 gene deleted from the genome.
В соответствии с последовательностью генома Corynebacterium glutamicum АТСС13869, опубликованной в базе NCBI, синтезируют две пары праймеров для амплификации фрагментов на обоих концах кодирующей области гена BBD29_09525, в виде 5'- и 3'-фрагментов плеч гомологии. Разработаны следующие праймеры (синтезированы Invitrogen Corporation, Шанхай):According to the genome sequence of Corynebacterium glutamicum ATCC13869 published in the NCBI database, two pairs of primers were synthesized to amplify fragments at both ends of the coding region of the BBD29_09525 gene, in the form of 5'- and 3'-fragments of the homology arms. The following primers were developed (synthesized by Invitrogen Corporation, Shanghai):
Способ конструирования: Используя в качестве матрицы Corynebacterium glutamicum АТСС13869, осуществляют ПЦР-амплификацию с праймерами Р19/Р20 и Р21/Р22, соответственно, с получением 5'-фрагмента плеча гомологии длиной 804 п.о. и 3'-фрагмента плеча гомологии длиной 807 п.о. Кроме того, Р19/Р22 используют в качестве праймеров для ПЦР с перекрывающимися праймерами с получением единого фрагмента плеча гомологии длиной 1571 п.о. После завершения ПЦР-реакции проводят электрофорез амплифицированных продуктов для выделения требуемого фрагмента ДНК длиной 1571 п.о. с применением набора с колонкой для выделения ДНК на геле, который лигируют с помощью системы рекомбинации NEBuider в челночную плазмиду, плазмиду pkl8mobsacB, расщепленную Xba I и выделенную с получением нокаутной плазмиды. Указанная плазмида содержит маркер устойчивости к канамицину.Construction method: Using Corynebacterium glutamicum ATCC13869 as a template, PCR amplification was carried out with primers P19/P20 and P21/P22, respectively, to obtain a 5' fragment of the homology arm of 804 bp in length and a 3' fragment of the homology arm of 807 bp in length. In addition, P19/P22 were used as primers for PCR with overlapping primers to obtain a single fragment of the homology arm of 1571 bp in length. After completion of the PCR reaction, electrophoresis of the amplified products was carried out to isolate the desired DNA fragment of 1571 bp in length. using a DNA gel extraction column kit, which was ligated using the NEBuider recombination system into a shuttle plasmid, the pkl8mobsacB plasmid digested with Xba I and isolated to produce a knockout plasmid. This plasmid contains a kanamycin resistance marker.
Указанной нокаутной плазмидой электротрансформируют штамм Corynebacterium glutamicum CGMCC №21220 и осуществляют ПЦР-идентификацию выросших моноколоний, в каждом случае со следующими праймерами (синтезированы Invitrogen Corporation, Шанхай):The specified knockout plasmid is electrotransformed into the Corynebacterium glutamicum CGMCC No. 21220 strain and PCR identification of the grown monocolonies is carried out, in each case with the following primers (synthesized by Invitrogen Corporation, Shanghai):
Штамм с полосами, соответствующими 1497 п.о. и 3000 п.о., амплифицированными в ходе описанной выше ПЦР-амплификации, представляет собой положительный штамм, тогда как штамм с единственной амплифицированной полосой, соответствующей 3000 п.о., представляет собой исходный штамм. При скрининге на культуральной среде с 15% сахарозы положительный штамм культивируют на культуральных средах с канамицином и без канамицина, соответственно, и выбирают штаммы, растущие на культуральной среде без канамицина и не растущие на культуральной среде с канамицином, для дальнейшей ПЦР-идентификации с праймерами Р23/Р24. Штамм с амплифицированной полосой, соответствующей 1497 п.о., представляет собой генетически сконструированный штамм с нокаутом кодирующей области гена BBD29_09525, обозначенный как YPG-012 (нокаутирован ген BBD29_09525 в геноме Corynebacterium glutamicum CGMCC №21220).The strain with bands corresponding to 1497 bp and 3000 bp amplified in the PCR amplification described above is the positive strain, while the strain with a single amplified band corresponding to 3000 bp is the original strain. When screening on a culture medium with 15% sucrose, the positive strain is cultured on culture media with and without kanamycin, respectively, and strains growing on the culture medium without kanamycin and not growing on the culture medium with kanamycin are selected for further PCR identification with primers P23/P24. The strain with an amplified band corresponding to 1497 bp is a genetically engineered strain with a knockout of the coding region of the BBD29_09525 gene, designated as YPG-012 (the BBD29_09525 gene in the genome of Corynebacterium glutamicum CGMCC No. 21220 is knocked out).
Пример 6. Эксперименты с ферментацией для получения L-глутаминовой кислотыExample 6. Fermentation experiments to produce L-glutamic acid
Эксперименты с ферментацией осуществляют на штаммах (YPG-007, YPG-008, YPG-009, YPG-010, YPG-011 и YPG-012), сконструированных согласно приведенным выше примерам 2-5, и исходном штамме Corynebacterium glutamicum CGMCC №21220, в ферментативном реакторе типа BLBIO-5GC-4-H (приобретен у Shanghai Bailun Biological Technology Co., Ltd.); культуральная среда представлена в табл. 3, процесс управления представлен в табл. 4. Для каждого штамма эксперименты проводят в трех повторностях. Результаты приведены в табл. 5.Fermentation experiments were carried out on the strains (YPG-007, YPG-008, YPG-009, YPG-010, YPG-011, and YPG-012) constructed according to Examples 2 to 5 above and the original strain Corynebacterium glutamicum CGMCC No. 21220, in a BLBIO-5GC-4-H fermentation reactor (purchased from Shanghai Bailun Biological Technology Co., Ltd.); the culture medium is shown in Table 3, and the control process is shown in Table 4. For each strain, the experiments were carried out in triplicate. The results are shown in Table 5.
Результаты из табл. 5 демонстрируют, что сверхэкспрессия гена BBD29_09525, или точечная мутация в кодирующей области гена BBD29_09525, BBD29_09525С337Т, и/или сверхэкспрессия гена BBD29_09525 или мутантного гена BBD29_09525С337Т у Corynebacterium glutamicum способствуют повышению продуцирования L-глутаминовой кислоты, тогда как ослабление экспрессии или нокаут гена BBD29_09525 неблагоприятны для накопления L-глутаминовой кислоты.The results in Table 5 demonstrate that overexpression of the BBD29_09525 gene, or point mutation in the coding region of the BBD29_09525 gene, BBD29_09525 C337T , and/or overexpression of the BBD29_09525 gene or the mutant BBD29_09525 C337T gene in Corynebacterium glutamicum promote the increase of L-glutamic acid production, whereas weakening of the expression or knockout of the BBD29_09525 gene is unfavorable for the accumulation of L-glutamic acid.
Настоящее изобретение было подробно описано выше. Специалисты в данной области техники смогут широко реализовать настоящее изобретение на практике, используя эквивалентные параметры, концентрации и условия без отступления от существа и объема настоящего изобретения, не прибегая к избыточному экспериментированию. Хотя были предложены конкретные примеры реализации настоящего изобретения, следует понимать, что возможны его дальнейшие улучшения. Таким образом, в соответствии с принципами настоящего изобретения, настоящим документом охвачены все варианты, применения или улучшения настоящего изобретения, в том числе изменения, вносимые с использованием обычных методик, известных в данной области техники, выходящие за пределы заявленного в настоящем документе объема изобретения. Некоторые существенные признаки могут быть использованы в соответствии с прилагаемой формулой изобретения.The present invention has been described in detail above. Those skilled in the art will be able to widely practice the present invention using equivalent parameters, concentrations and conditions without departing from the spirit and scope of the present invention, without resorting to excessive experimentation. Although specific examples of the present invention have been given, it should be understood that further improvements are possible. Thus, in accordance with the principles of the present invention, all variations, applications or improvements of the present invention are covered by the present document, including changes made using conventional techniques known in the art, going beyond the scope of the invention claimed herein. Some essential features can be used in accordance with the appended claims.
Промышленное применениеIndustrial application
Согласно настоящему изобретению было обнаружено, что через снижение экспрессии или нокаут гена BBD29_09525 кодируемый этим геном продукт влияет на способность к продуцированию L-глутаминовой кислоты, и что рекомбинантный штамм, полученный путем введения точечной мутации в кодирующую последовательность, или путем увеличения числа копий, или сверхэкспрессии указанного гена, способствует продуцированию глутаминовой кислоты в более высокой концентрации по сравнению с немодифицированным штаммом.According to the present invention, it was found that by reducing the expression or knockout of the BBD29_09525 gene, the product encoded by this gene affects the ability to produce L-glutamic acid, and that a recombinant strain obtained by introducing a point mutation into the coding sequence, or by increasing the copy number, or overexpressing said gene, promotes the production of glutamic acid in a higher concentration compared to an unmodified strain.
В частности, согласно настоящему изобретению сначала конструируют генетически сконструированную бактерию YPG-007 с точечной мутацией (С-Т) путем введения точечной мутации в кодирующую область гена BBD29_09525 (SEQ ID NO: 1) Corynebacterium glutamicum CGMCC №21220 путем аллельной замены. Для дополнительного изучения и подтверждения того, что сверхэкспрессия гена BBD29_09525 дикого типа или мутантного гена BBD29_09525 С337Т у бактерии-продуцента может повышать продуцирование L-глутаминовой кислоты, экзогенный ген интегрируют в хромосому хозяина или экспрессируют вне хромосомы плазмидой, соответственно, конструируя таким образом сконструированные бактерии YPG-008, YPG-009, YPG-010 и YPG-011, сверхэкспрессирующие ген BBD29_09525 или ген BBD29_09525С337Т из генома и плазмиды. Эксперименты предполагают, что ген BBD29_09525 и его варианты вовлечены в биосинтез L-глутаминовой кислоты. Используя сверхэкспрессию или нокаут гена BBD29 11265, или сайт-направленную мутацию (такую как точечная мутация) в указанном гене, можно регулировать уровень накопления L-глутаминовой кислоты у микроорганизма. Точечная мутация в кодирующей области гена BBD29_09525 или сверхэкспрессия гена BBD29_09525 или его мутантного гена BBD29_09525С337Т у бактерии-продуцента способствует повышению продуцирования и увеличению показателя конверсии L-глутаминовой кислоты, тогда как нокаут или ослабление экспрессии гена BBD29_09525 неблагоприятны для накопления L-глутаминовой кислоты. Ген BBD29_09525 и его вариант (такой как ген BBD29_09525 С337Т) могут применяться для конструирования генетически сконструированного штамма для продуцирования L-глутаминовой кислоты, чтобы способствовать повышению продуцирования L-глутаминовой кислоты, и для получения высокопродуктивного и высококачественного штамма для промышленного производства, полезного для широкого диапазона вариантов применения и имеющего высокую экономическую ценность для промышленного производства L-глутаминовой кислоты.In particular, according to the present invention, a genetically engineered bacterium YPG-007 with a point mutation (C-T) is first constructed by introducing a point mutation into the coding region of the BBD29_09525 gene (SEQ ID NO: 1) of Corynebacterium glutamicum CGMCC No. 21220 by allelic substitution. To further investigate and confirm that overexpression of the wild-type BBD29_09525 gene or the mutant BBD29_09525 C337T gene in the producer bacterium can enhance the production of L-glutamic acid, the exogenous gene was integrated into the host chromosome or expressed extrachromosomally by a plasmid, respectively, thereby constructing engineered bacteria YPG-008, YPG-009, YPG-010 and YPG-011 overexpressing the BBD29_09525 gene or the BBD29_09525 C337T gene from the genome and the plasmid. The experiments suggest that the BBD29_09525 gene and its variants are involved in the biosynthesis of L-glutamic acid. By overexpressing or knocking out the BBD29 11265 gene, or by a site-directed mutation (such as a point mutation) in the said gene, it is possible to regulate the accumulation level of L-glutamic acid in a microorganism. A point mutation in the coding region of the BBD29_09525 gene or overexpressing the BBD29_09525 gene or its mutant gene BBD29_09525 C337T in a producer bacterium promotes an increase in the production and conversion rate of L-glutamic acid, whereas a knockout or weakening of the expression of the BBD29_09525 gene is unfavorable for the accumulation of L-glutamic acid. The BBD29_09525 gene and its variant (such as the BBD29_09525 C337T gene) can be used to construct a genetically engineered strain for producing L-glutamic acid to promote the increase in the production of L-glutamic acid, and to obtain a highly productive and high-quality strain for industrial production useful for a wide range of applications and having high economic value for the industrial production of L-glutamic acid.
--->--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙSEQUENCE LIST
<110> INNER MONGOLIA EPPEN BIOTECHCO., LTD / ИННЕР МОНГОЛИА ЭППЕН БИОТЕХ<110> INNER MONGOLIA EPPEN BIOTECHCO., LTD / INNER MONGOLIA EPPEN BIOTECH
КО., ЛТДCO., LTD
<120> Recombinant Strain with Modified Gene BBD29_09525 for Producing <120> Recombinant Strain with Modified Gene BBD29_09525 for Producing
L-Glutamic Acid, and Method for Constructing the Same and Use L-Glutamic Acid, and Method for Constructing the Same and Use
Thereof / РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ С МОДИФИЦИРОВАННЫМ ГЕНОМ BBD29_09525Thereof / RECOMBINANT STRAIN WITH MODIFIED GENE BBD29_09525
ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ L-ГЛУТАМИНОВОЙ КИСЛОТЫ, А ТАКЖЕ СПОСОБ ЕГО FOR OBTAINING L-GLUTAMIC ACID, AS WELL AS A METHOD FOR ITS
КОНСТРУИРОВАНИЯ И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕDESIGN AND ITS APPLICATION
<130> GNPDH21085<130> GNPDH21085
<150> CN202011631266.8<150>CN202011631266.8
<151> 2020-12-30<151> 2020-12-30
<160> 33 <160> 33
<170> PatentIn, версия 3.5<170> PatentIn, version 3.5
<210> 1<210> 1
<211> 1503<211> 1503
<212> ДНК<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum<213> Corynebacterium glutamicum
<220><220>
<221> CDS/Кодирующая последовательность<221> CDS/Coding Sequence
<222> (1)..(1503)<222> (1)..(1503)
<400> 1<400> 1
atgtcagatt ccccgaagaa cgcaccgagg attaccgatg aggcagatgt agttctcatt 60atgtcagatt ccccgaagaa cgcaccgagg attaccgatg aggcagatgt agttctcatt 60
ggtgccggta tcatgagctc cacgctgggt gcaatgctgc gtcagctgga gccaagctgg 120ggtgccggta tcatgagctc cacgctgggt gcaatgctgc gtcagctgga gccaagctgg 120
actcagatcg tcttcgagcg tttggatgga ccggcacaag agtcgtcctc cccgtggaac 180actcagatcg tcttcgagcg tttggatgga ccggcacaag agtcgtcctc cccgtggaac 180
aatgcaggaa ccggccactc tgctctatgc gagctgaact acaccccaga ggttaagggc 240aatgcaggaa ccggccactc tgctctatgc gagctgaact acaccccaga ggttaagggc 240
aaggttgaaa ttgccaaggc tgtaggaatc aacgagaagt tccaggtttc ccgtcagttc 300aaggttgaaa ttgccaaggc tgtaggaatc aacgagaagt tccaggtttc ccgtcagttc 300
tggtctcacc tcgttgaaga gggcgtgctg gctgatccta aggaattcat caaccctgtt 360tggtctcacc tcgttgaaga gggcgtgctg gctgatccta aggaattcat caaccctgtt 360
cctcacgtat ctttcggcca gggcgcagac caggttgcat acatcaaggc tcgctacgaa 420cctcacgtat ctttcggcca gggcgcagac caggttgcat acatcaaggc tcgctacgaa 420
gctttgaagg atcacccact cttccagggc atgacctacg ctgacgatga agctaccttc 480gctttgaagg atcacccact cttccagggc atgacctacg ctgacgatga agctaccttc 480
accgagaagc tgcctttgat ggcaaagggc cgtgacttct ctgatccagt agcaatctct 540accgagaagc tgcctttgat ggcaaagggc cgtgacttct ctgatccagt agcaatctct 540
tggatcgatg aaggcaccga catcaactac ggtgctcaga ccaagcagta cctggatgca 600tggatcgatg aaggcaccga catcaactac ggtgctcaga ccaagcagta cctggatgca 600
tctgaagttg aaggcactga aatccgctat ggccacgaag tcaagagcat caaggctgat 660tctgaagttg aaggcactga aatccgctat ggccacgaag tcaagagcat caaggctgat 660
ggcgcaaagt ggatcgtgac cgtcaagaac gtacacactg gcgacaccaa gaccatcaag 720ggcgcaaagt ggatcgtgac cgtcaagaac gtacacactg gcgacaccaa gaccatcaag 720
gcaaacttcg tgttcgtcgg cgcaggcggg tacgcactgg atctgcttcg cagcgcaggc 780gcaaacttcg tgttcgtcgg cgcaggcggg tacgcactgg atctgcttcg cagcgcaggc 780
atcccacagg tcaagggctt cgctggattc ccagtatccg gcctgtggct tcgttgcacc 840atcccacagg tcaagggctt cgctggattc ccagtatccg gcctgtggct tcgttgcacc 840
aacgaggaac tgatcgagca gcacgcagcc aaggtatatg gcaaggcatc tgttggcgct 900aacgaggaac tgatcgagca gcacgcagcc aaggtatatg gcaaggcatc tgttggcgct 900
cctccaatgt ctgttcctca ccttgacacc cgcgttatcg agggtgaaaa gggtctgctc 960cctccaatgt ctgttcctca ccttgacacc cgcgttatcg agggtgaaaa gggtctgctc 960
tttggacctt acggtggctg gacccctaag ttcttgaagg aaggctccta cctggacctg 1020tttggacctt acggtggctg gacccctaag ttcttgaagg aaggctccta cctggacctg 1020
ttcaagtcca tccgcccaga caacattcct tcctaccttg gcgttgctgc tcaggaattt 1080ttcaagtcca tccgcccaga caacattcct tcctaccttg gcgttgctgc tcaggaattt 1080
gatctgacca agtaccttgt cactgaagtt ctcaaggacc aggacaagcg tatggatgct 1140gatctgacca agtaccttgt cactgaagtt ctcaaggacc aggacaagcg tatggatgct 1140
cttcgcgagt acatgccaga ggcacaaaac ggcgattggg agaccatcgt tgccggacag 1200cttcgcgagt acatgccaga ggcacaaaac ggcgattggg agaccatcgt tgccggacag 1200
cgtgttcagg ttattaagcc tgcaggattc cctaagttcg gttccctgga attcggcacc 1260cgtgttcagg ttattaagcc tgcaggattc cctaagttcg gttccctgga attcggcacc 1260
accttgatca acaactccga aggcaccatc gccggattgc tcggtgcttc ccctggagca 1320accttgatca acaactccga aggcaccatc gccggattgc tcggtgcttc ccctggagca 1320
tccatcgcac cttccgcaat gatcgagctg cttgagcgtt gcttcggtga ccgcatgatc 1380tccatcgcac cttccgcaat gatcgagctg cttgagcgtt gcttcggtga ccgcatgatc 1380
gagtggggcg acaagctgaa ggacatgatc ccttcctacg gcaagaagct tgcttccgag 1440gagtggggcg acaagctgaa ggacatgatc ccttcctacg gcaagaagct tgcttccgag 1440
ccagcactgt ttgagcagca gtgggcacgc acccagaaga ccctgaagct tgaggaagcc 1500ccagcactgt ttgagcagca gtgggcacgc acccagaaga ccctgaagct tgaggaagcc 1500
taa 1503taa 1503
<210> 2<210> 2
<211> 1503<211> 1503
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<220><220>
<221> CDS/Кодирующая последовательность<221> CDS/Coding Sequence
<222> (1)..(1503)<222> (1)..(1503)
<400> 2<400> 2
atgtcagatt ccccgaagaa cgcaccgagg attaccgatg aggcagatgt agttctcatt 60atgtcagatt ccccgaagaa cgcaccgagg attaccgatg aggcagatgt agttctcatt 60
ggtgccggta tcatgagctc cacgctgggt gcaatgctgc gtcagctgga gccaagctgg 120ggtgccggta tcatgagctc cacgctgggt gcaatgctgc gtcagctgga gccaagctgg 120
actcagatcg tcttcgagcg tttggatgga ccggcacaag agtcgtcctc cccgtggaac 180actcagatcg tcttcgagcg tttggatgga ccggcacaag agtcgtcctc cccgtggaac 180
aatgcaggaa ccggccactc tgctctatgc gagctgaact acaccccaga ggttaagggc 240aatgcaggaa ccggccactc tgctctatgc gagctgaact acaccccaga ggttaagggc 240
aaggttgaaa ttgccaaggc tgtaggaatc aacgagaagt tccaggtttc ccgtcagttc 300aaggttgaaa ttgccaaggc tgtaggaatc aacgagaagt tccaggtttc ccgtcagttc 300
tggtctcacc tcgttgaaga gggcgtgctg gctgattcta aggaattcat caaccctgtt 360tggtctcacc tcgttgaaga gggcgtgctg gctgattcta aggaattcat caaccctgtt 360
cctcacgtat ctttcggcca gggcgcagac caggttgcat acatcaaggc tcgctacgaa 420cctcacgtat ctttcggcca gggcgcagac caggttgcat acatcaaggc tcgctacgaa 420
gctttgaagg atcacccact cttccagggc atgacctacg ctgacgatga agctaccttc 480gctttgaagg atcacccact cttccagggc atgacctacg ctgacgatga agctaccttc 480
accgagaagc tgcctttgat ggcaaagggc cgtgacttct ctgatccagt agcaatctct 540accgagaagc tgcctttgat ggcaaagggc cgtgacttct ctgatccagt agcaatctct 540
tggatcgatg aaggcaccga catcaactac ggtgctcaga ccaagcagta cctggatgca 600tggatcgatg aaggcaccga catcaactac ggtgctcaga ccaagcagta cctggatgca 600
tctgaagttg aaggcactga aatccgctat ggccacgaag tcaagagcat caaggctgat 660tctgaagttg aaggcactga aatccgctat ggccacgaag tcaagagcat caaggctgat 660
ggcgcaaagt ggatcgtgac cgtcaagaac gtacacactg gcgacaccaa gaccatcaag 720ggcgcaaagt ggatcgtgac cgtcaagaac gtacacactg gcgacaccaa gaccatcaag 720
gcaaacttcg tgttcgtcgg cgcaggcggg tacgcactgg atctgcttcg cagcgcaggc 780gcaaacttcg tgttcgtcgg cgcaggcggg tacgcactgg atctgcttcg cagcgcaggc 780
atcccacagg tcaagggctt cgctggattc ccagtatccg gcctgtggct tcgttgcacc 840atcccacagg tcaagggctt cgctggattc ccagtatccg gcctgtggct tcgttgcacc 840
aacgaggaac tgatcgagca gcacgcagcc aaggtatatg gcaaggcatc tgttggcgct 900aacgaggaac tgatcgagca gcacgcagcc aaggtatatg gcaaggcatc tgttggcgct 900
cctccaatgt ctgttcctca ccttgacacc cgcgttatcg agggtgaaaa gggtctgctc 960cctccaatgt ctgttcctca ccttgacacc cgcgttatcg agggtgaaaa gggtctgctc 960
tttggacctt acggtggctg gacccctaag ttcttgaagg aaggctccta cctggacctg 1020tttggacctt acggtggctg gacccctaag ttcttgaagg aaggctccta cctggacctg 1020
ttcaagtcca tccgcccaga caacattcct tcctaccttg gcgttgctgc tcaggaattt 1080ttcaagtcca tccgcccaga caacattcct tcctaccttg gcgttgctgc tcaggaattt 1080
gatctgacca agtaccttgt cactgaagtt ctcaaggacc aggacaagcg tatggatgct 1140gatctgacca agtaccttgt cactgaagtt ctcaaggacc aggacaagcg tatggatgct 1140
cttcgcgagt acatgccaga ggcacaaaac ggcgattggg agaccatcgt tgccggacag 1200cttcgcgagt acatgccaga ggcacaaaac ggcgattggg agaccatcgt tgccggacag 1200
cgtgttcagg ttattaagcc tgcaggattc cctaagttcg gttccctgga attcggcacc 1260cgtgttcagg ttattaagcc tgcaggattc cctaagttcg gttccctgga attcggcacc 1260
accttgatca acaactccga aggcaccatc gccggattgc tcggtgcttc ccctggagca 1320accttgatca acaactccga aggcaccatc gccggattgc tcggtgcttc ccctggagca 1320
tccatcgcac cttccgcaat gatcgagctg cttgagcgtt gcttcggtga ccgcatgatc 1380tccatcgcac cttccgcaat gatcgagctg cttgagcgtt gcttcggtga ccgcatgatc 1380
gagtggggcg acaagctgaa ggacatgatc ccttcctacg gcaagaagct tgcttccgag 1440gagtggggcg acaagctgaa ggacatgatc ccttcctacg gcaagaagct tgcttccgag 1440
ccagcactgt ttgagcagca gtgggcacgc acccagaaga ccctgaagct tgaggaagcc 1500ccagcactgt ttgagcagca gtgggcacgc acccagaaga ccctgaagct tgaggaagcc 1500
taa 1503taa 1503
<210> 3<210> 3
<211> 500<211> 500
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Corynebacterium glutamicum<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 3<400> 3
Met Ser Asp Ser Pro Lys Asn Ala Pro Arg Ile Thr Asp Glu Ala Asp Met Ser Asp Ser Pro Lys Asn Ala Pro Arg Ile Thr Asp Glu Ala Asp
1 5 10 15 1 5 10 15
Val Val Leu Ile Gly Ala Gly Ile Met Ser Ser Thr Leu Gly Ala Met Val Val Leu Ile Gly Ala Gly Ile Met Ser Ser Thr Leu Gly Ala Met
20 25 30 20 25 30
Leu Arg Gln Leu Glu Pro Ser Trp Thr Gln Ile Val Phe Glu Arg Leu Leu Arg Gln Leu Glu Pro Ser Trp Thr Gln Ile Val Phe Glu Arg Leu
35 40 45 35 40 45
Asp Gly Pro Ala Gln Glu Ser Ser Ser Pro Trp Asn Asn Ala Gly Thr Asp Gly Pro Ala Gln Glu Ser Ser Ser Pro Trp Asn Asn Ala Gly Thr
50 55 60 50 55 60
Gly His Ser Ala Leu Cys Glu Leu Asn Tyr Thr Pro Glu Val Lys Gly Gly His Ser Ala Leu Cys Glu Leu Asn Tyr Thr Pro Glu Val Lys Gly
65 70 75 80 65 70 75 80
Lys Val Glu Ile Ala Lys Ala Val Gly Ile Asn Glu Lys Phe Gln Val Lys Val Glu Ile Ala Lys Ala Val Gly Ile Asn Glu Lys Phe Gln Val
85 90 95 85 90 95
Ser Arg Gln Phe Trp Ser His Leu Val Glu Glu Gly Val Leu Ala Asp Ser Arg Gln Phe Trp Ser His Leu Val Glu Glu Gly Val Leu Ala Asp
100 105 110 100 105 110
Pro Lys Glu Phe Ile Asn Pro Val Pro His Val Ser Phe Gly Gln Gly Pro Lys Glu Phe Ile Asn Pro Val Pro His Val Ser Phe Gly Gln Gly
115 120 125 115 120 125
Ala Asp Gln Val Ala Tyr Ile Lys Ala Arg Tyr Glu Ala Leu Lys Asp Ala Asp Gln Val Ala Tyr Ile Lys Ala Arg Tyr Glu Ala Leu Lys Asp
130 135 140 130 135 140
His Pro Leu Phe Gln Gly Met Thr Tyr Ala Asp Asp Glu Ala Thr Phe His Pro Leu Phe Gln Gly Met Thr Tyr Ala Asp Asp Glu Ala Thr Phe
145 150 155 160 145 150 155 160
Thr Glu Lys Leu Pro Leu Met Ala Lys Gly Arg Asp Phe Ser Asp Pro Thr Glu Lys Leu Pro Leu Met Ala Lys Gly Arg Asp Phe Ser Asp Pro
165 170 175 165 170 175
Val Ala Ile Ser Trp Ile Asp Glu Gly Thr Asp Ile Asn Tyr Gly Ala Val Ala Ile Ser Trp Ile Asp Glu Gly Thr Asp Ile Asn Tyr Gly Ala
180 185 190 180 185 190
Gln Thr Lys Gln Tyr Leu Asp Ala Ser Glu Val Glu Gly Thr Glu Ile Gln Thr Lys Gln Tyr Leu Asp Ala Ser Glu Val Glu Gly Thr Glu Ile
195 200 205 195 200 205
Arg Tyr Gly His Glu Val Lys Ser Ile Lys Ala Asp Gly Ala Lys Trp Arg Tyr Gly His Glu Val Lys Ser Ile Lys Ala Asp Gly Ala Lys Trp
210 215 220 210 215 220
Ile Val Thr Val Lys Asn Val His Thr Gly Asp Thr Lys Thr Ile Lys Ile Val Thr Val Lys Asn Val His Thr Gly Asp Thr Lys Thr Ile Lys
225 230 235 240 225 230 235 240
Ala Asn Phe Val Phe Val Gly Ala Gly Gly Tyr Ala Leu Asp Leu Leu Ala Asn Phe Val Phe Val Gly Ala Gly Gly Tyr Ala Leu Asp Leu Leu
245 250 255 245 250 255
Arg Ser Ala Gly Ile Pro Gln Val Lys Gly Phe Ala Gly Phe Pro Val Arg Ser Ala Gly Ile Pro Gln Val Lys Gly Phe Ala Gly Phe Pro Val
260 265 270 260 265 270
Ser Gly Leu Trp Leu Arg Cys Thr Asn Glu Glu Leu Ile Glu Gln His Ser Gly Leu Trp Leu Arg Cys Thr Asn Glu Glu Leu Ile Glu Gln His
275 280 285 275 280 285
Ala Ala Lys Val Tyr Gly Lys Ala Ser Val Gly Ala Pro Pro Met Ser Ala Ala Lys Val Tyr Gly Lys Ala Ser Val Gly Ala Pro Pro Met Ser
290 295 300 290 295 300
Val Pro His Leu Asp Thr Arg Val Ile Glu Gly Glu Lys Gly Leu Leu Val Pro His Leu Asp Thr Arg Val Ile Glu Gly Glu Lys Gly Leu Leu
305 310 315 320 305 310 315 320
Phe Gly Pro Tyr Gly Gly Trp Thr Pro Lys Phe Leu Lys Glu Gly Ser Phe Gly Pro Tyr Gly Gly Trp Thr Pro Lys Phe Leu Lys Glu Gly Ser
325 330 335 325 330 335
Tyr Leu Asp Leu Phe Lys Ser Ile Arg Pro Asp Asn Ile Pro Ser Tyr Tyr Leu Asp Leu Phe Lys Ser Ile Arg Pro Asp Asn Ile Pro Ser Tyr
340 345 350 340 345 350
Leu Gly Val Ala Ala Gln Glu Phe Asp Leu Thr Lys Tyr Leu Val Thr Leu Gly Val Ala Ala Gln Glu Phe Asp Leu Thr Lys Tyr Leu Val Thr
355 360 365 355 360 365
Glu Val Leu Lys Asp Gln Asp Lys Arg Met Asp Ala Leu Arg Glu Tyr Glu Val Leu Lys Asp Gln Asp Lys Arg Met Asp Ala Leu Arg Glu Tyr
370 375 380 370 375 380
Met Pro Glu Ala Gln Asn Gly Asp Trp Glu Thr Ile Val Ala Gly Gln Met Pro Glu Ala Gln Asn Gly Asp Trp Glu Thr Ile Val Ala Gly Gln
385 390 395 400 385 390 395 400
Arg Val Gln Val Ile Lys Pro Ala Gly Phe Pro Lys Phe Gly Ser Leu Arg Val Gln Val Ile Lys Pro Ala Gly Phe Pro Lys Phe Gly Ser Leu
405 410 415 405 410 415
Glu Phe Gly Thr Thr Leu Ile Asn Asn Ser Glu Gly Thr Ile Ala Gly Glu Phe Gly Thr Thr Leu Ile Asn Asn Ser Glu Gly Thr Ile Ala Gly
420 425 430 420 425 430
Leu Leu Gly Ala Ser Pro Gly Ala Ser Ile Ala Pro Ser Ala Met Ile Leu Leu Gly Ala Ser Pro Gly Ala Ser Ile Ala Pro Ser Ala Met Ile
435 440 445 435 440 445
Glu Leu Leu Glu Arg Cys Phe Gly Asp Arg Met Ile Glu Trp Gly Asp Glu Leu Leu Glu Arg Cys Phe Gly Asp Arg Met Ile Glu Trp Gly Asp
450 455 460 450 455 460
Lys Leu Lys Asp Met Ile Pro Ser Tyr Gly Lys Lys Leu Ala Ser Glu Lys Leu Lys Asp Met Ile Pro Ser Tyr Gly Lys Lys Leu Ala Ser Glu
465 470 475 480 465 470 475 480
Pro Ala Leu Phe Glu Gln Gln Trp Ala Arg Thr Gln Lys Thr Leu Lys Pro Ala Leu Phe Glu Gln Gln Trp Ala Arg Thr Gln Lys Thr Leu Lys
485 490 495 485 490 495
Leu Glu Glu Ala Leu Glu Glu Ala
500 500
<210> 4<210> 4
<211> 500<211> 500
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 4<400> 4
Met Ser Asp Ser Pro Lys Asn Ala Pro Arg Ile Thr Asp Glu Ala Asp Met Ser Asp Ser Pro Lys Asn Ala Pro Arg Ile Thr Asp Glu Ala Asp
1 5 10 15 1 5 10 15
Val Val Leu Ile Gly Ala Gly Ile Met Ser Ser Thr Leu Gly Ala Met Val Val Leu Ile Gly Ala Gly Ile Met Ser Ser Thr Leu Gly Ala Met
20 25 30 20 25 30
Leu Arg Gln Leu Glu Pro Ser Trp Thr Gln Ile Val Phe Glu Arg Leu Leu Arg Gln Leu Glu Pro Ser Trp Thr Gln Ile Val Phe Glu Arg Leu
35 40 45 35 40 45
Asp Gly Pro Ala Gln Glu Ser Ser Ser Pro Trp Asn Asn Ala Gly Thr Asp Gly Pro Ala Gln Glu Ser Ser Ser Pro Trp Asn Asn Ala Gly Thr
50 55 60 50 55 60
Gly His Ser Ala Leu Cys Glu Leu Asn Tyr Thr Pro Glu Val Lys Gly Gly His Ser Ala Leu Cys Glu Leu Asn Tyr Thr Pro Glu Val Lys Gly
65 70 75 80 65 70 75 80
Lys Val Glu Ile Ala Lys Ala Val Gly Ile Asn Glu Lys Phe Gln Val Lys Val Glu Ile Ala Lys Ala Val Gly Ile Asn Glu Lys Phe Gln Val
85 90 95 85 90 95
Ser Arg Gln Phe Trp Ser His Leu Val Glu Glu Gly Val Leu Ala Asp Ser Arg Gln Phe Trp Ser His Leu Val Glu Glu Gly Val Leu Ala Asp
100 105 110 100 105 110
Ser Lys Glu Phe Ile Asn Pro Val Pro His Val Ser Phe Gly Gln Gly Ser Lys Glu Phe Ile Asn Pro Val Pro His Val Ser Phe Gly Gln Gly
115 120 125 115 120 125
Ala Asp Gln Val Ala Tyr Ile Lys Ala Arg Tyr Glu Ala Leu Lys Asp Ala Asp Gln Val Ala Tyr Ile Lys Ala Arg Tyr Glu Ala Leu Lys Asp
130 135 140 130 135 140
His Pro Leu Phe Gln Gly Met Thr Tyr Ala Asp Asp Glu Ala Thr Phe His Pro Leu Phe Gln Gly Met Thr Tyr Ala Asp Asp Glu Ala Thr Phe
145 150 155 160 145 150 155 160
Thr Glu Lys Leu Pro Leu Met Ala Lys Gly Arg Asp Phe Ser Asp Pro Thr Glu Lys Leu Pro Leu Met Ala Lys Gly Arg Asp Phe Ser Asp Pro
165 170 175 165 170 175
Val Ala Ile Ser Trp Ile Asp Glu Gly Thr Asp Ile Asn Tyr Gly Ala Val Ala Ile Ser Trp Ile Asp Glu Gly Thr Asp Ile Asn Tyr Gly Ala
180 185 190 180 185 190
Gln Thr Lys Gln Tyr Leu Asp Ala Ser Glu Val Glu Gly Thr Glu Ile Gln Thr Lys Gln Tyr Leu Asp Ala Ser Glu Val Glu Gly Thr Glu Ile
195 200 205 195 200 205
Arg Tyr Gly His Glu Val Lys Ser Ile Lys Ala Asp Gly Ala Lys Trp Arg Tyr Gly His Glu Val Lys Ser Ile Lys Ala Asp Gly Ala Lys Trp
210 215 220 210 215 220
Ile Val Thr Val Lys Asn Val His Thr Gly Asp Thr Lys Thr Ile Lys Ile Val Thr Val Lys Asn Val His Thr Gly Asp Thr Lys Thr Ile Lys
225 230 235 240 225 230 235 240
Ala Asn Phe Val Phe Val Gly Ala Gly Gly Tyr Ala Leu Asp Leu Leu Ala Asn Phe Val Phe Val Gly Ala Gly Gly Tyr Ala Leu Asp Leu Leu
245 250 255 245 250 255
Arg Ser Ala Gly Ile Pro Gln Val Lys Gly Phe Ala Gly Phe Pro Val Arg Ser Ala Gly Ile Pro Gln Val Lys Gly Phe Ala Gly Phe Pro Val
260 265 270 260 265 270
Ser Gly Leu Trp Leu Arg Cys Thr Asn Glu Glu Leu Ile Glu Gln His Ser Gly Leu Trp Leu Arg Cys Thr Asn Glu Glu Leu Ile Glu Gln His
275 280 285 275 280 285
Ala Ala Lys Val Tyr Gly Lys Ala Ser Val Gly Ala Pro Pro Met Ser Ala Ala Lys Val Tyr Gly Lys Ala Ser Val Gly Ala Pro Pro Met Ser
290 295 300 290 295 300
Val Pro His Leu Asp Thr Arg Val Ile Glu Gly Glu Lys Gly Leu Leu Val Pro His Leu Asp Thr Arg Val Ile Glu Gly Glu Lys Gly Leu Leu
305 310 315 320 305 310 315 320
Phe Gly Pro Tyr Gly Gly Trp Thr Pro Lys Phe Leu Lys Glu Gly Ser Phe Gly Pro Tyr Gly Gly Trp Thr Pro Lys Phe Leu Lys Glu Gly Ser
325 330 335 325 330 335
Tyr Leu Asp Leu Phe Lys Ser Ile Arg Pro Asp Asn Ile Pro Ser Tyr Tyr Leu Asp Leu Phe Lys Ser Ile Arg Pro Asp Asn Ile Pro Ser Tyr
340 345 350 340 345 350
Leu Gly Val Ala Ala Gln Glu Phe Asp Leu Thr Lys Tyr Leu Val Thr Leu Gly Val Ala Ala Gln Glu Phe Asp Leu Thr Lys Tyr Leu Val Thr
355 360 365 355 360 365
Glu Val Leu Lys Asp Gln Asp Lys Arg Met Asp Ala Leu Arg Glu Tyr Glu Val Leu Lys Asp Gln Asp Lys Arg Met Asp Ala Leu Arg Glu Tyr
370 375 380 370 375 380
Met Pro Glu Ala Gln Asn Gly Asp Trp Glu Thr Ile Val Ala Gly Gln Met Pro Glu Ala Gln Asn Gly Asp Trp Glu Thr Ile Val Ala Gly Gln
385 390 395 400 385 390 395 400
Arg Val Gln Val Ile Lys Pro Ala Gly Phe Pro Lys Phe Gly Ser Leu Arg Val Gln Val Ile Lys Pro Ala Gly Phe Pro Lys Phe Gly Ser Leu
405 410 415 405 410 415
Glu Phe Gly Thr Thr Leu Ile Asn Asn Ser Glu Gly Thr Ile Ala Gly Glu Phe Gly Thr Thr Leu Ile Asn Asn Ser Glu Gly Thr Ile Ala Gly
420 425 430 420 425 430
Leu Leu Gly Ala Ser Pro Gly Ala Ser Ile Ala Pro Ser Ala Met Ile Leu Leu Gly Ala Ser Pro Gly Ala Ser Ile Ala Pro Ser Ala Met Ile
435 440 445 435 440 445
Glu Leu Leu Glu Arg Cys Phe Gly Asp Arg Met Ile Glu Trp Gly Asp Glu Leu Leu Glu Arg Cys Phe Gly Asp Arg Met Ile Glu Trp Gly Asp
450 455 460 450 455 460
Lys Leu Lys Asp Met Ile Pro Ser Tyr Gly Lys Lys Leu Ala Ser Glu Lys Leu Lys Asp Met Ile Pro Ser Tyr Gly Lys Lys Leu Ala Ser Glu
465 470 475 480 465 470 475 480
Pro Ala Leu Phe Glu Gln Gln Trp Ala Arg Thr Gln Lys Thr Leu Lys Pro Ala Leu Phe Glu Gln Gln Trp Ala Arg Thr Gln Lys Thr Leu Lys
485 490 495 485 490 495
Leu Glu Glu Ala Leu Glu Glu Ala
500 500
<210> 5<210> 5
<211> 56<211> 56
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 5<400> 5
cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctagaagg aatgttgtct gggcgg 56cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctagaagg aatgttgtct gggcgg 56
<210> 6<210> 6
<211> 30<211> 30
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 6<400> 6
ggcgtgctgg ctgattctaa ggaattcatc 30ggcgtgctgg ctgattctaa ggaattcatc 30
<210> 7<210> 7
<211> 30<211> 30
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 7<400> 7
gatgaattcc ttagaatcag ccagcacgcc 30gatgaattcc ttagaatcag ccagcacgcc 30
<210> 8<210> 8
<211> 58<211> 58
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 8<400> 8
cagctatgac catgattacg aattcgagct cggtacccga taggtcgatt gttggtgt 58cagctatgac catgattacg aattcgagct cggtacccga taggtcgatt gttggtgt 58
<210> 9<210> 9
<211> 20<211> 20
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 9<400> 9
catcaaaggc agcttctcgg 20catcaaaggc agcttctcgg 20
<210> 10<210> 10
<211> 20<211> 20
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 10<400> 10
actacacccc agaggttaag 20actacacccc agaggttaag 20
<210> 11<210> 11
<211> 56<211> 56
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 11<400> 11
cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctaggacc cgcttgccat acgaag 56cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctaggacc cgcttgccat acgaag 56
<210> 12<210> 12
<211> 41<211> 41
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 12<400> 12
ctgaagcttg aggaagccta aatctactca tctgaagaat c 41ctgaagcttg aggaagccta aatctactca tctgaagaat c 41
<210> 13<210> 13
<211> 41<211> 41
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 13<400> 13
gattcttcag atgagtagat ttaggcttcc tcaagcttca g 41gattcttcag atgagtagat ttaggcttcc tcaagcttca g 41
<210> 14<210> 14
<211> 39<211> 39
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 14<400> 14
caaaccagag tgcccacgaa atgtataacg ataggtcga 39caaaccagag tgcccacgaa atgtataacg ataggtcga 39
<210> 15<210> 15
<211> 39<211> 39
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 15<400> 15
tcgacctatc gttatacatt tcgtgggcac tctggtttg 39tcgacctatc gttatacatt tcgtgggcac tctggtttg 39
<210> 16<210> 16
<211> 58<211> 58
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 16<400> 16
cagctatgac catgattacg aattcgagct cggtacccca taagaaacaa ccacttcc 58cagctatgac catgattacg aattcgagct cggtacccca taagaaacaa ccacttcc 58
<210> 17<210> 17
<211> 20<211> 20
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 17<400> 17
gtccaaggtg acggccgcac 20gtccaaggtg acggccgcac 20
<210> 18<210> 18
<211> 20<211> 20
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 18<400> 18
tgacttctct gatccagtag 20tgacttctct gatccagtag 20
<210> 19<210> 19
<211> 20<211> 20
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 19<400> 19
gtactgcttg gtctgagcac 20gtactgcttg gtctgagcac 20
<210> 20<210> 20
<211> 20<211> 20
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 20<400> 20
atattcggcc cagcagcagc 20atattcggcc cagcagcagc 20
<210> 21<210> 21
<211> 57<211> 57
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 21<400> 21
gcttgcatgc ctgcaggtcg actctagagg atccccttag gcttcctcaa gcttcag 57gcttgcatgc ctgcaggtcg actctagagg atccccttag gcttcctcaa gcttcag 57
<210> 22<210> 22
<211> 53<211> 53
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 22<400> 22
atcaggctga aaatcttctc tcatccgcca aaacatgtat aacgataggt cga 53atcaggctga aaatcttctc tcatccgcca aaacatgtat aacgataggt cga 53
<210> 23<210> 23
<211> 56<211> 56
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 23<400> 23
cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctaggcct gactgatttt gggctg 56cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctaggcct gactgatttt gggctg 56
<210> 24<210> 24
<211> 40<211> 40
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 24<400> 24
gagataaaag gaagttgaac atcttctaac tgctttcttt 40gagataaaag gaagttgaac atcttctaac tgctttcttt 40
<210> 25<210> 25
<211> 40<211> 40
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 25<400> 25
aaagaaagca gttagaagat gttcaacttc cttttatctc 40aaagaaagca gttagaagat gttcaacttc cttttatctc 40
<210> 26<210> 26
<211> 58<211> 58
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 26<400> 26
cagctatgac catgattacg aattcgagct cggtacccag atgacctcgg cagcagct 58cagctatgac catgattacg aattcgagct cggtacccag atgacctcgg cagcagct 58
<210> 27<210> 27
<211> 20<211> 20
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 27<400> 27
gcctgactga ttttgggctg 20gcctgactga ttttgggctg 20
<210> 28<210> 28
<211> 20<211> 20
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 28<400> 28
agatgacctc ggcagcagct 20agatgacctc ggcagcagct 20
<210> 29<210> 29
<211> 1504<211> 1504
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 29<400> 29
cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctagaagg aatgttgtct gggcggatgg 60cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctagaagg aatgttgtct gggcggatgg 60
acttgaacag gtccaggtag gagccttcct tcaagaactt aggggtccag ccaccgtaag 120acttgaacag gtccaggtag gagccttcct tcaagaactt aggggtccag ccaccgtaag 120
gtccaaagag cagacccttt tcaccctcga taacgcgggt gtcaaggtga ggaacagaca 180gtccaaagag cagacccttt tcaccctcga taacgcgggt gtcaaggtga ggaacagaca 180
ttggaggagc gccaacagat gccttgccat ataccttggc tgcgtgctgc tcgatcagtt 240ttggagggagc gccaacagat gccttgccat ataccttggc tgcgtgctgc tcgatcagtt 240
cctcgttggt gcaacgaagc cacaggccgg atactgggaa tccagcgaag cccttgacct 300cctcgttggt gcaacgaagc cacaggccgg atactgggaa tccagcgaag cccttgacct 300
gtgggatgcc tgcgctgcga agcagatcca gtgcgtaccc gcctgcgccg acgaacacga 360gtgggatgcc tgcgctgcga agcagatcca gtgcgtaccc gcctgcgccg acgaacacga 360
agtttgcctt gatggtcttg gtgtcgccag tgtgtacgtt cttgacggtc acgatccact 420agtttgcctt gatggtcttg gtgtcgccag tgtgtacgtt cttgacggtc acgatccact 420
ttgcgccatc agccttgatg ctcttgactt cgtggccata gcggatttca gtgccttcaa 480ttgcgccatc agccttgatg ctcttgactt cgtggccata gcggatttca gtgccttcaa 480
cttcagatgc atccaggtac tgcttggtct gagcaccgta gttgatgtcg gtgccttcat 540cttcagatgc atccaggtac tgcttggtct gagcaccgta gttgatgtcg gtgccttcat 540
cgatccaaga gattgctact ggatcagaga agtcacggcc ctttgccatc aaaggcagct 600cgatccaaga gattgctact ggatcagaga agtcacggcc ctttgccatc aaaggcagct 600
tctcggtgaa ggtagcttca tcgtcagcgt aggtcatgcc ctggaagagt gggtgatcct 660tctcggtgaa ggtagcttca tcgtcagcgt aggtcatgcc ctggaagagt gggtgatcct 660
tcaaagcttc gtagcgagcc ttgatgtatg caacctggtc tgcgccctgg ccgaaagata 720tcaaagcttc gtagcgagcc ttgatgtatg caacctggtc tgcgccctgg ccgaaagata 720
cgtgaggaac agggttgatg aattccttag aatcagccag cacgccctct tcaacgaggt 780cgtgaggaac agggttgatg aattccttag aatcagccag cacgccctct tcaacgaggt 780
gagaccagaa ctgacgggaa acctggaact tctcgttgat tcctacagcc ttggcaattt 840gagaccagaa ctgacgggaa acctggaact tctcgttgat tcctacagcc ttggcaattt 840
caaccttgcc cttaacctct ggggtgtagt tcagctcgca tagagcagag tggccggttc 900caaccttgcc cttaacctct ggggtgtagt tcagctcgca tagagcagag tggccggttc 900
ctgcattgtt ccacggggag gacgactctt gtgccggtcc atccaaacgc tcgaagacga 960ctgcattgtt ccacggggag gacgactctt gtgccggtcc atccaaacgc tcgaagacga 960
tctgagtcca gcttggctcc agctgacgca gcattgcacc cagcgtggag ctcatgatac 1020tctgagtcca gcttggctcc agctgacgca gcattgcacc cagcgtggag ctcatgatac 1020
cggcaccaat gagaactaca tctgcctcat cggtaatcct cggtgcgttc ttcggggaat 1080cggcaccaat gagaactaca tctgcctcat cggtaatcct cggtgcgttc ttcggggaat 1080
ctgacatgtt caacttcctt ttatctccgc gagttctctg ccgaacacca acacaaggcg 1140ctgacatgtt caacttcctt ttatctccgc gagttctctg ccgaacacca acacaaggcg 1140
tcatctcata aatgatcgcc agcacccgaa tgcaagtgtt ggccatattt ttgactgacg 1200tcatctcata aatgatcgcc agcacccgaa tgcaagtgtt ggccatattt ttgactgacg 1200
cgtggggcgt tacccttctt gtttcttaca agaaagcgtg ggtacacatt gtccgtaaat 1260cgtggggcgt tacccttctt gtttcttaca agaaagcgtg ggtacacatt gtccgtaaat 1260
atagagtgta cgcctgccac ctcgagctga ataaacaagc acgggatatt cccctttctc 1320atagagtgta cgcctgccac ctcgagctga ataaacaagc acgggatatt cccctttctc 1320
atgcgaattc ctcccccgtg ctaccccctc ccccaatttg caaagttagt aaatgtgaaa 1380atgcgaattc ctcccccgtg ctaccccctc ccccaatttg caaagttagt aaatgtgaaa 1380
ttcgcaaaca tgagtagtat cgcggaagtt tcaccacgtg aacctttcag tcggctcgcg 1440ttcgcaaaca tgagtagtat cgcggaagtt tcaccacgtg aacctttcag tcggctcgcg 1440
cacaccacac caacaatcga cctatcgggt accgagctcg aattcgtaat catggtcata 1500cacaccacac caacaatcga cctatcgggt accgagctcg aattcgtaat catggtcata 1500
gctg 1504gctg 1504
<210> 30<210> 30
<211> 3445<211> 3445
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 30<400> 30
cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctaggacc cgcttgccat acgaagtcct 60cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctaggacc cgcttgccat acgaagtcct 60
ggagaagatc tccacccgca tcaccaacga agttccagac gtaaaccgcg tggttttgga 120ggagaagatc tccacccgca tcaccaacga agttccagac gtaaaccgcg tggttttgga 120
cgtaacctcc aagccaccag gaaccatcga atgggagtag gccttaaatg agccttcgtt 180cgtaacctcc aagccaccag gaaccatcga atgggagtag gccttaaatg agccttcgtt 180
aagcggcaat caccttatcg gtgattgccg ctttcccatt tctccgggtt ttctggaact 240aagcggcaat caccttatcg gtgattgccg ctttcccatt tctccgggtt ttctggaact 240
ttttgggcgt atgctgggaa tgatcttatt attttgattt cagaaagcag gagagaccag 300ttttgggcgt atgctgggaa tgatcttatt attttgattt cagaaagcag gagagaccag 300
atgagcgaaa tccttgaaac ctactgggca ccccacttcg gaaacaccga tgaagccgca 360atgagcgaaa tccttgaaac ctactgggca ccccacttcg gaaacaccga tgaagccgca 360
gcactcgttt catacttggc acaagcttcc ggtgatccta ttgaggttca caccctgttc 420gcactcgttt catacttggc acaagcttcc ggtgatccta ttgaggttca caccctgttc 420
ggggatttag gtttagacgg actctctgga aactacaccg acactgagat cgacggctac 480ggggatttag gtttagacgg actctctgga aactacaccg acactgagat cgacggctac 480
ggcgacgcat tcctgctggt tgcagcacta gcagtgttga tggctgaaaa caaagcatcc 540ggcgacgcat tcctgctggt tgcagcacta gcagtgttga tggctgaaaa caaagcatcc 540
ggcggcgtga atctgggtga agttggggga gctgataaat cgatccggct gcatgttgaa 600ggcggcgtga atctgggtga agttggggga gctgataaat cgatccggct gcatgttgaa 600
tccaaggaaa acacccagat caacaccgca ttgaagtact ttgcgctttc cccagaagac 660tccaaggaaa acacccagat caacaccgca ttgaagtact ttgcgctttc cccagaagac 660
cacgcagcgg cagatcgctt cgatgaggat gacctgtctg agcttgccaa cttgagtgaa 720cacgcagcgg cagatcgctt cgatgaggat gacctgtctg agcttgccaa cttgagtgaa 720
gagctgcgcg gacagctgga ctaattgctg cccgtttaag gagtccgatt cttcagatga 780gagctgcgcg gacagctgga ctaattgctg cccgtttaag gagtccgatt cttcagatga 780
gtagatttag gcttcctcaa gcttcagggt cttctgggtg cgtgcccact gctgctcaaa 840gtagatttag gcttcctcaa gcttcagggt cttctgggtg cgtgcccact gctgctcaaa 840
cagtgctggc tcggaagcaa gcttcttgcc gtaggaaggg atcatgtcct tcagcttgtc 900cagtgctggc tcggaagcaa gcttcttgcc gtaggaaggg atcatgtcct tcagcttgtc 900
gccccactcg atcatgcggt caccgaagca acgctcaagc agctcgatca ttgcggaagg 960gccccactcg atcatgcggt caccgaagca acgctcaagc agctcgatca ttgcggaagg 960
tgcgatggat gctccagggg aagcaccgag caatccggcg atggtgcctt cggagttgtt 1020tgcgatggat gctccagggg aagcaccgag caatccggcg atggtgcctt cggagttgtt 1020
gatcaaggtg gtgccgaatt ccagggaacc gaacttaggg aatcctgcag gcttaataac 1080gatcaaggtg gtgccgaatt ccagggaacc gaacttaggg aatcctgcag gcttaataac 1080
ctgaacacgc tgtccggcaa cgatggtctc ccaatcgccg ttttgtgcct ctggcatgta 1140ctgaacacgc tgtccggcaa cgatggtctc ccaatcgccg ttttgtgcct ctggcatgta 1140
ctcgcgaaga gcatccatac gcttgtcctg gtccttgaga acttcagtga caaggtactt 1200ctcgcgaaga gcatccatac gcttgtcctg gtccttgaga acttcagtga caaggtactt 1200
ggtcagatca aattcctgag cagcaacgcc aaggtaggaa ggaatgttgt ctgggcggat 1260ggtcagatca aattcctgag cagcaacgcc aaggtaggaa ggaatgttgt ctgggcggat 1260
ggacttgaac aggtccaggt aggagccttc cttcaagaac ttaggggtcc agccaccgta 1320ggacttgaac aggtccaggt aggagccttc cttcaagaac ttaggggtcc agccaccgta 1320
aggtccaaag agcagaccct tttcaccctc gataacgcgg gtgtcaaggt gaggaacaga 1380aggtccaaag agcagaccct tttcaccctc gataacgcgg gtgtcaaggt gaggaacaga 1380
cattggagga gcgccaacag atgccttgcc atataccttg gctgcgtgct gctcgatcag 1440cattggagga gcgccaacag atgccttgcc atataccttg gctgcgtgct gctcgatcag 1440
ttcctcgttg gtgcaacgaa gccacaggcc ggatactggg aatccagcga agcccttgac 1500ttcctcgttg gtgcaacgaa gccacaggcc ggatactggg aatccagcga agcccttgac 1500
ctgtgggatg cctgcgctgc gaagcagatc cagtgcgtac ccgcctgcgc cgacgaacac 1560ctgtgggatg cctgcgctgc gaagcagatc cagtgcgtac ccgcctgcgc cgacgaacac 1560
gaagtttgcc ttgatggtct tggtgtcgcc agtgtgtacg ttcttgacgg tcacgatcca 1620gaagtttgcc ttgatggtct tggtgtcgcc agtgtgtacg ttcttgacgg tcacgatcca 1620
ctttgcgcca tcagccttga tgctcttgac ttcgtggcca tagcggattt cagtgccttc 1680ctttgcgcca tcagccttga tgctcttgac ttcgtggcca tagcggattt cagtgccttc 1680
aacttcagat gcatccaggt actgcttggt ctgagcaccg tagttgatgt cggtgccttc 1740aacttcagat gcatccaggt actgcttggt ctgagcaccg tagttgatgt cggtgccttc 1740
atcgatccaa gagattgcta ctggatcaga gaagtcacgg ccctttgcca tcaaaggcag 1800atcgatccaa gagattgcta ctggatcaga gaagtcacgg ccctttgcca tcaaaggcag 1800
cttctcggtg aaggtagctt catcgtcagc gtaggtcatg ccctggaaga gtgggtgatc 1860cttctcggtg aaggtagctt catcgtcagc gtaggtcatg ccctggaaga gtgggtgatc 1860
cttcaaagct tcgtagcgag ccttgatgta tgcaacctgg tctgcgccct ggccgaaaga 1920cttcaaagct tcgtagcgag ccttgatgta tgcaacctgg tctgcgccct ggccgaaaga 1920
tacgtgagga acagggttga tgaattcctt aggatcagcc agcacgccct cttcaacgag 1980tacgtgagga acagggttga tgaattcctt aggatcagcc agcacgccct cttcaacgag 1980
gtgagaccag aactgacggg aaacctggaa cttctcgttg attcctacag ccttggcaat 2040gtgagaccag aactgacggg aaacctggaa cttctcgttg attcctacag ccttggcaat 2040
ttcaaccttg cccttaacct ctggggtgta gttcagctcg catagagcag agtggccggt 2100ttcaaccttg cccttaacct ctggggtgta gttcagctcg catagagcag agtggccggt 2100
tcctgcattg ttccacgggg aggacgactc ttgtgccggt ccatccaaac gctcgaagac 2160tcctgcattg ttccacgggg aggacgactc ttgtgccggt ccatccaaac gctcgaagac 2160
gatctgagtc cagcttggct ccagctgacg cagcattgca cccagcgtgg agctcatgat 2220gatctgagtc cagcttggct ccagctgacg cagcattgca cccagcgtgg agctcatgat 2220
accggcacca atgagaacta catctgcctc atcggtaatc ctcggtgcgt tcttcgggga 2280accggcacca atgagaacta catctgcctc atcggtaatc ctcggtgcgt tcttcgggga 2280
atctgacatg ttcaacttcc ttttatctcc gcgagttctc tgccgaacac caacacaagg 2340atctgacatg ttcaacttcc ttttatctcc gcgagttctc tgccgaacac caacacaagg 2340
cgtcatctca taaatgatcg ccagcacccg aatgcaagtg ttggccatat ttttgactga 2400cgtcatctca taaatgatcg ccagcacccg aatgcaagtg ttggccatat ttttgactga 2400
cgcgtggggc gttacccttc ttgtttctta caagaaagcg tgggtacaca ttgtccgtaa 2460cgcgtggggc gttacccttc ttgtttctta caagaaagcg tgggtacaca ttgtccgtaa 2460
atatagagtg tacgcctgcc acctcgagct gaataaacaa gcacgggata ttcccctttc 2520atatagagtg tacgcctgcc acctcgagct gaataaacaa gcacgggata ttcccctttc 2520
tcatgcgaat tcctcccccg tgctaccccc tcccccaatt tgcaaagtta gtaaatgtga 2580tcatgcgaat tcctcccccg tgctaccccc tcccccaatt tgcaaagtta gtaaatgtga 2580
aattcgcaaa catgagtagt atcgcggaag tttcaccacg tgaacctttc agtcggctcg 2640aattcgcaaa catgagtagt atcgcggaag tttcaccacg tgaacctttc agtcggctcg 2640
cgcacaccac accaacaatc gacctatcgt tatacatttc gtgggcactc tggtttggtt 2700cgcacaccac accaacaatc gacctatcgt tatacatttc gtgggcactc tggtttggtt 2700
accaggatgg gttagtcatt ctgatcagcg aattccacgt tcacatcgcc aattccagag 2760accaggatgg gttagtcatt ctgatcagcg aattccacgt tcacatcgcc aattccagag 2760
ttcacaacca gattcagcat tggaccttct agatcagcat tgtgggcggt gagatctcca 2820ttcacaacca gattcagcat tggaccttct agatcagcat tgtgggcggt gagatctcca 2820
acatcacagc gcgctgtgcc cacaccggcg gtacaactta ggctcacggg cacatcatcg 2880acatcacagc gcgctgtgcc cacaccggcg gtacaactta ggctcacggg cacatcatcg 2880
ggcagggtga ccatgacttc gccgatccct gaggtgattt ggatgttttg ttcctgatcc 2940ggcagggtga ccatgacttc gccgatccct gaggtgattt ggatgttttg ttcctgatcc 2940
aattgggtga ggtggctgaa atcgaggttc atttcaccca cgccagaggt gtagctgctg 3000aattgggtga ggtggctgaa atcgaggttc atttcaccca cgccagaggt gtagctgctg 3000
aggagttcat cgttggtggg gatgagattg acatcgccga ttccagggtc gtcttcaaag 3060aggagttcat cgttggtggg gatgagattg acatcgccga ttccagggtc gtcttcaaag 3060
tagatgggat cgatatttga aataaacagg cctgcgaggg cgctcatgac aactccggta 3120tagatgggat cgatatttga aataaacagg cctgcgaggg cgctcatgac aactccggta 3120
ccaactacac cgccgacaat ccatggccac acatggcgct ttttctgagg cttttgtgga 3180ccaactacac cgccgacaat ccatggccac acatggcgct ttttctgagg cttttgtgga 3180
gggacttgta catcccaggt gttgtattgg ttttgggcaa gtggatccca atgaggcgct 3240gggacttgta catcccaggt gttgtattgg ttttgggcaa gtggatccca atgaggcgct 3240
tcgggggttt gttgcgcgaa gggtgcatag tagccctcaa cgggggtgat agtgcttaga 3300tcggggggttt gttgcgcgaa gggtgcatag tagccctcaa cgggggtgat agtgcttaga 3300
tctggttggg gttgtgggta gagatcttcg tttttcatgg tggcatcctc agaaacagtg 3360tctggttggg gttgtgggta gagatcttcg tttttcatgg tggcatcctc agaaacagtg 3360
aattcagtgg tgagtagtcc gcggggtgga agtggttgtt tcttatgggg taccgagctc 3420aattcagtgg tgagtagtcc gcggggtgga agtggttgtt tcttatgggg taccgagctc 3420
gaattcgtaa tcatggtcat agctg 3445gaattcgtaa tcatggtcat agctg 3445
<210> 31<210> 31
<211> 3445<211> 3445
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 31<400> 31
cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctaggacc cgcttgccat acgaagtcct 60cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctaggacc cgcttgccat acgaagtcct 60
ggagaagatc tccacccgca tcaccaacga agttccagac gtaaaccgcg tggttttgga 120ggagaagatc tccacccgca tcaccaacga agttccagac gtaaaccgcg tggttttgga 120
cgtaacctcc aagccaccag gaaccatcga atgggagtag gccttaaatg agccttcgtt 180cgtaacctcc aagccaccag gaaccatcga atgggagtag gccttaaatg agccttcgtt 180
aagcggcaat caccttatcg gtgattgccg ctttcccatt tctccgggtt ttctggaact 240aagcggcaat caccttatcg gtgattgccg ctttcccatt tctccgggtt ttctggaact 240
ttttgggcgt atgctgggaa tgatcttatt attttgattt cagaaagcag gagagaccag 300ttttgggcgt atgctgggaa tgatcttatt attttgattt cagaaagcag gagagaccag 300
atgagcgaaa tccttgaaac ctactgggca ccccacttcg gaaacaccga tgaagccgca 360atgagcgaaa tccttgaaac ctactgggca ccccacttcg gaaacaccga tgaagccgca 360
gcactcgttt catacttggc acaagcttcc ggtgatccta ttgaggttca caccctgttc 420gcactcgttt catacttggc acaagcttcc ggtgatccta ttgaggttca caccctgttc 420
ggggatttag gtttagacgg actctctgga aactacaccg acactgagat cgacggctac 480ggggatttag gtttagacgg actctctgga aactacaccg acactgagat cgacggctac 480
ggcgacgcat tcctgctggt tgcagcacta gcagtgttga tggctgaaaa caaagcatcc 540ggcgacgcat tcctgctggt tgcagcacta gcagtgttga tggctgaaaa caaagcatcc 540
ggcggcgtga atctgggtga agttggggga gctgataaat cgatccggct gcatgttgaa 600ggcggcgtga atctgggtga agttggggga gctgataaat cgatccggct gcatgttgaa 600
tccaaggaaa acacccagat caacaccgca ttgaagtact ttgcgctttc cccagaagac 660tccaaggaaa acacccagat caacaccgca ttgaagtact ttgcgctttc cccagaagac 660
cacgcagcgg cagatcgctt cgatgaggat gacctgtctg agcttgccaa cttgagtgaa 720cacgcagcgg cagatcgctt cgatgaggat gacctgtctg agcttgccaa cttgagtgaa 720
gagctgcgcg gacagctgga ctaattgctg cccgtttaag gagtccgatt cttcagatga 780gagctgcgcg gacagctgga ctaattgctg cccgtttaag gagtccgatt cttcagatga 780
gtagatttag gcttcctcaa gcttcagggt cttctgggtg cgtgcccact gctgctcaaa 840gtagatttag gcttcctcaa gcttcagggt cttctgggtg cgtgcccact gctgctcaaa 840
cagtgctggc tcggaagcaa gcttcttgcc gtaggaaggg atcatgtcct tcagcttgtc 900cagtgctggc tcggaagcaa gcttcttgcc gtaggaaggg atcatgtcct tcagcttgtc 900
gccccactcg atcatgcggt caccgaagca acgctcaagc agctcgatca ttgcggaagg 960gccccactcg atcatgcggt caccgaagca acgctcaagc agctcgatca ttgcggaagg 960
tgcgatggat gctccagggg aagcaccgag caatccggcg atggtgcctt cggagttgtt 1020tgcgatggat gctccagggg aagcaccgag caatccggcg atggtgcctt cggagttgtt 1020
gatcaaggtg gtgccgaatt ccagggaacc gaacttaggg aatcctgcag gcttaataac 1080gatcaaggtg gtgccgaatt ccagggaacc gaacttaggg aatcctgcag gcttaataac 1080
ctgaacacgc tgtccggcaa cgatggtctc ccaatcgccg ttttgtgcct ctggcatgta 1140ctgaacacgc tgtccggcaa cgatggtctc ccaatcgccg ttttgtgcct ctggcatgta 1140
ctcgcgaaga gcatccatac gcttgtcctg gtccttgaga acttcagtga caaggtactt 1200ctcgcgaaga gcatccatac gcttgtcctg gtccttgaga acttcagtga caaggtactt 1200
ggtcagatca aattcctgag cagcaacgcc aaggtaggaa ggaatgttgt ctgggcggat 1260ggtcagatca aattcctgag cagcaacgcc aaggtaggaa ggaatgttgt ctgggcggat 1260
ggacttgaac aggtccaggt aggagccttc cttcaagaac ttaggggtcc agccaccgta 1320ggacttgaac aggtccaggt aggagccttc cttcaagaac ttaggggtcc agccaccgta 1320
aggtccaaag agcagaccct tttcaccctc gataacgcgg gtgtcaaggt gaggaacaga 1380aggtccaaag agcagaccct tttcaccctc gataacgcgg gtgtcaaggt gaggaacaga 1380
cattggagga gcgccaacag atgccttgcc atataccttg gctgcgtgct gctcgatcag 1440cattggagga gcgccaacag atgccttgcc atataccttg gctgcgtgct gctcgatcag 1440
ttcctcgttg gtgcaacgaa gccacaggcc ggatactggg aatccagcga agcccttgac 1500ttcctcgttg gtgcaacgaa gccacaggcc ggatactggg aatccagcga agcccttgac 1500
ctgtgggatg cctgcgctgc gaagcagatc cagtgcgtac ccgcctgcgc cgacgaacac 1560ctgtgggatg cctgcgctgc gaagcagatc cagtgcgtac ccgcctgcgc cgacgaacac 1560
gaagtttgcc ttgatggtct tggtgtcgcc agtgtgtacg ttcttgacgg tcacgatcca 1620gaagtttgcc ttgatggtct tggtgtcgcc agtgtgtacg ttcttgacgg tcacgatcca 1620
ctttgcgcca tcagccttga tgctcttgac ttcgtggcca tagcggattt cagtgccttc 1680ctttgcgcca tcagccttga tgctcttgac ttcgtggcca tagcggattt cagtgccttc 1680
aacttcagat gcatccaggt actgcttggt ctgagcaccg tagttgatgt cggtgccttc 1740aacttcagat gcatccaggt actgcttggt ctgagcaccg tagttgatgt cggtgccttc 1740
atcgatccaa gagattgcta ctggatcaga gaagtcacgg ccctttgcca tcaaaggcag 1800atcgatccaa gagattgcta ctggatcaga gaagtcacgg ccctttgcca tcaaaggcag 1800
cttctcggtg aaggtagctt catcgtcagc gtaggtcatg ccctggaaga gtgggtgatc 1860cttctcggtg aaggtagctt catcgtcagc gtaggtcatg ccctggaaga gtgggtgatc 1860
cttcaaagct tcgtagcgag ccttgatgta tgcaacctgg tctgcgccct ggccgaaaga 1920cttcaaagct tcgtagcgag ccttgatgta tgcaacctgg tctgcgccct ggccgaaaga 1920
tacgtgagga acagggttga tgaattcctt agaatcagcc agcacgccct cttcaacgag 1980tacgtgagga acagggttga tgaattcctt agaatcagcc agcacgccct cttcaacgag 1980
gtgagaccag aactgacggg aaacctggaa cttctcgttg attcctacag ccttggcaat 2040gtgagaccag aactgacggg aaacctggaa cttctcgttg attcctacag ccttggcaat 2040
ttcaaccttg cccttaacct ctggggtgta gttcagctcg catagagcag agtggccggt 2100ttcaaccttg cccttaacct ctggggtgta gttcagctcg catagagcag agtggccggt 2100
tcctgcattg ttccacgggg aggacgactc ttgtgccggt ccatccaaac gctcgaagac 2160tcctgcattg ttccacgggg aggacgactc ttgtgccggt ccatccaaac gctcgaagac 2160
gatctgagtc cagcttggct ccagctgacg cagcattgca cccagcgtgg agctcatgat 2220gatctgagtc cagcttggct ccagctgacg cagcattgca cccagcgtgg agctcatgat 2220
accggcacca atgagaacta catctgcctc atcggtaatc ctcggtgcgt tcttcgggga 2280accggcacca atgagaacta catctgcctc atcggtaatc ctcggtgcgt tcttcgggga 2280
atctgacatg ttcaacttcc ttttatctcc gcgagttctc tgccgaacac caacacaagg 2340atctgacatg ttcaacttcc ttttatctcc gcgagttctc tgccgaacac caacacaagg 2340
cgtcatctca taaatgatcg ccagcacccg aatgcaagtg ttggccatat ttttgactga 2400cgtcatctca taaatgatcg ccagcacccg aatgcaagtg ttggccatat ttttgactga 2400
cgcgtggggc gttacccttc ttgtttctta caagaaagcg tgggtacaca ttgtccgtaa 2460cgcgtggggc gttacccttc ttgtttctta caagaaagcg tgggtacaca ttgtccgtaa 2460
atatagagtg tacgcctgcc acctcgagct gaataaacaa gcacgggata ttcccctttc 2520atatagagtg tacgcctgcc acctcgagct gaataaacaa gcacgggata ttcccctttc 2520
tcatgcgaat tcctcccccg tgctaccccc tcccccaatt tgcaaagtta gtaaatgtga 2580tcatgcgaat tcctcccccg tgctaccccc tcccccaatt tgcaaagtta gtaaatgtga 2580
aattcgcaaa catgagtagt atcgcggaag tttcaccacg tgaacctttc agtcggctcg 2640aattcgcaaa catgagtagt atcgcggaag tttcaccacg tgaacctttc agtcggctcg 2640
cgcacaccac accaacaatc gacctatcgt tatacatttc gtgggcactc tggtttggtt 2700cgcacaccac accaacaatc gacctatcgt tatacatttc gtgggcactc tggtttggtt 2700
accaggatgg gttagtcatt ctgatcagcg aattccacgt tcacatcgcc aattccagag 2760accaggatgg gttagtcatt ctgatcagcg aattccacgt tcacatcgcc aattccagag 2760
ttcacaacca gattcagcat tggaccttct agatcagcat tgtgggcggt gagatctcca 2820ttcacaacca gattcagcat tggaccttct agatcagcat tgtgggcggt gagatctcca 2820
acatcacagc gcgctgtgcc cacaccggcg gtacaactta ggctcacggg cacatcatcg 2880acatcacagc gcgctgtgcc cacaccggcg gtacaactta ggctcacggg cacatcatcg 2880
ggcagggtga ccatgacttc gccgatccct gaggtgattt ggatgttttg ttcctgatcc 2940ggcagggtga ccatgacttc gccgatccct gaggtgattt ggatgttttg ttcctgatcc 2940
aattgggtga ggtggctgaa atcgaggttc atttcaccca cgccagaggt gtagctgctg 3000aattgggtga ggtggctgaa atcgaggttc atttcaccca cgccagaggt gtagctgctg 3000
aggagttcat cgttggtggg gatgagattg acatcgccga ttccagggtc gtcttcaaag 3060aggagttcat cgttggtggg gatgagattg acatcgccga ttccagggtc gtcttcaaag 3060
tagatgggat cgatatttga aataaacagg cctgcgaggg cgctcatgac aactccggta 3120tagatgggat cgatatttga aataaacagg cctgcgaggg cgctcatgac aactccggta 3120
ccaactacac cgccgacaat ccatggccac acatggcgct ttttctgagg cttttgtgga 3180ccaactacac cgccgacaat ccatggccac acatggcgct ttttctgagg cttttgtgga 3180
gggacttgta catcccaggt gttgtattgg ttttgggcaa gtggatccca atgaggcgct 3240gggacttgta catcccaggt gttgtattgg ttttgggcaa gtggatccca atgaggcgct 3240
tcgggggttt gttgcgcgaa gggtgcatag tagccctcaa cgggggtgat agtgcttaga 3300tcggggggttt gttgcgcgaa gggtgcatag tagccctcaa cgggggtgat agtgcttaga 3300
tctggttggg gttgtgggta gagatcttcg tttttcatgg tggcatcctc agaaacagtg 3360tctggttggg gttgtgggta gagatcttcg tttttcatgg tggcatcctc agaaacagtg 3360
aattcagtgg tgagtagtcc gcggggtgga agtggttgtt tcttatgggg taccgagctc 3420aattcagtgg tgagtagtcc gcggggtgga agtggttgtt tcttatgggg taccgagctc 3420
gaattcgtaa tcatggtcat agctg 3445gaattcgtaa tcatggtcat agctg 3445
<210> 32<210> 32
<211> 1961<211> 1961
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 32<400> 32
gcttgcatgc ctgcaggtcg actctagagg atccccttag gcttcctcaa gcttcagggt 60gcttgcatgc ctgcaggtcg actctagagg atccccttag gcttcctcaa gcttcaggt 60
cttctgggtg cgtgcccact gctgctcaaa cagtgctggc tcggaagcaa gcttcttgcc 120cttctgggtg cgtgcccact gctgctcaaa cagtgctggc tcggaagcaa gcttcttgcc 120
gtaggaaggg atcatgtcct tcagcttgtc gccccactcg atcatgcggt caccgaagca 180gtaggaaggg atcatgtcct tcagcttgtc gccccactcg atcatgcggt caccgaagca 180
acgctcaagc agctcgatca ttgcggaagg tgcgatggat gctccagggg aagcaccgag 240acgctcaagc agctcgatca ttgcggaagg tgcgatggat gctccagggg aagcaccgag 240
caatccggcg atggtgcctt cggagttgtt gatcaaggtg gtgccgaatt ccagggaacc 300caatccggcg atggtgcctt cggagttgtt gatcaaggtg gtgccgaatt ccagggaacc 300
gaacttaggg aatcctgcag gcttaataac ctgaacacgc tgtccggcaa cgatggtctc 360gaacttaggg aatcctgcag gcttaataac ctgaacacgc tgtccggcaa cgatggtctc 360
ccaatcgccg ttttgtgcct ctggcatgta ctcgcgaaga gcatccatac gcttgtcctg 420ccaatcgccg ttttgtgcct ctggcatgta ctcgcgaaga gcatccatac gcttgtcctg 420
gtccttgaga acttcagtga caaggtactt ggtcagatca aattcctgag cagcaacgcc 480gtccttgaga acttcagtga caaggtactt ggtcagatca aattcctgag cagcaacgcc 480
aaggtaggaa ggaatgttgt ctgggcggat ggacttgaac aggtccaggt aggagccttc 540aaggtaggaa ggaatgttgt ctgggcggat ggacttgaac aggtccaggt aggagccttc 540
cttcaagaac ttaggggtcc agccaccgta aggtccaaag agcagaccct tttcaccctc 600cttcaagaac ttaggggtcc agccaccgta aggtccaaag agcagaccct tttcaccctc 600
gataacgcgg gtgtcaaggt gaggaacaga cattggagga gcgccaacag atgccttgcc 660gataacgcgg gtgtcaaggt gaggaacaga cattggagga gcgccaacag atgccttgcc 660
atataccttg gctgcgtgct gctcgatcag ttcctcgttg gtgcaacgaa gccacaggcc 720atataccttg gctgcgtgct gctcgatcag ttcctcgttg gtgcaacgaa gccacaggcc 720
ggatactggg aatccagcga agcccttgac ctgtgggatg cctgcgctgc gaagcagatc 780ggatactggg aatccagcga agcccttgac ctgtgggatg cctgcgctgc gaagcagatc 780
cagtgcgtac ccgcctgcgc cgacgaacac gaagtttgcc ttgatggtct tggtgtcgcc 840cagtgcgtac ccgcctgcgc cgacgaacac gaagtttgcc ttgatggtct tggtgtcgcc 840
agtgtgtacg ttcttgacgg tcacgatcca ctttgcgcca tcagccttga tgctcttgac 900agtgtgtacg ttcttgacgg tcacgatcca ctttgcgcca tcagccttga tgctcttgac 900
ttcgtggcca tagcggattt cagtgccttc aacttcagat gcatccaggt actgcttggt 960ttcgtggcca tagcggattt cagtgccttc aacttcagat gcatccaggt actgcttggt 960
ctgagcaccg tagttgatgt cggtgccttc atcgatccaa gagattgcta ctggatcaga 1020ctgagcaccg tagttgatgt cggtgccttc atcgatccaa gagattgcta ctggatcaga 1020
gaagtcacgg ccctttgcca tcaaaggcag cttctcggtg aaggtagctt catcgtcagc 1080gaagtcacgg ccctttgcca tcaaaggcag cttctcggtg aaggtagctt catcgtcagc 1080
gtaggtcatg ccctggaaga gtgggtgatc cttcaaagct tcgtagcgag ccttgatgta 1140gtaggtcatg ccctggaaga gtgggtgatc cttcaaagct tcgtagcgag ccttgatgta 1140
tgcaacctgg tctgcgccct ggccgaaaga tacgtgagga acagggttga tgaattcctt 1200tgcaacctgg tctgcgccct ggccgaaaga tacgtgagga acagggttga tgaattcctt 1200
aggatcagcc agcacgccct cttcaacgag gtgagaccag aactgacggg aaacctggaa 1260aggatcagcc agcacgccct cttcaacgag gtgagaccag aactgacggg aaacctggaa 1260
cttctcgttg attcctacag ccttggcaat ttcaaccttg cccttaacct ctggggtgta 1320cttctcgttg attcctacag ccttggcaat ttcaaccttg cccttaacct ctggggtgta 1320
gttcagctcg catagagcag agtggccggt tcctgcattg ttccacgggg aggacgactc 1380gttcagctcg catagagcag agtggccggt tcctgcattg ttccacgggg aggacgactc 1380
ttgtgccggt ccatccaaac gctcgaagac gatctgagtc cagcttggct ccagctgacg 1440ttgtgccggt ccatccaaac gctcgaagac gatctgagtc cagcttggct ccagctgacg 1440
cagcattgca cccagcgtgg agctcatgat accggcacca atgagaacta catctgcctc 1500cagcattgca cccagcgtgg agctcatgat accggcacca atgagaacta catctgcctc 1500
atcggtaatc ctcggtgcgt tcttcgggga atctgacatg ttcaacttcc ttttatctcc 1560atcggtaatc ctcggtgcgt tcttcgggga atctgacatg ttcaacttcc ttttatctcc 1560
gcgagttctc tgccgaacac caacacaagg cgtcatctca taaatgatcg ccagcacccg 1620gcgagttctc tgccgaacac caacacaagg cgtcatctca taaatgatcg ccagcacccg 1620
aatgcaagtg ttggccatat ttttgactga cgcgtggggc gttacccttc ttgtttctta 1680aatgcaagtg ttggccatat ttttgactga cgcgtggggc gttacccttc ttgtttctta 1680
caagaaagcg tgggtacaca ttgtccgtaa atatagagtg tacgcctgcc acctcgagct 1740caagaaagcg tgggtacaca ttgtccgtaa atatagagtg tacgcctgcc acctcgagct 1740
gaataaacaa gcacgggata ttcccctttc tcatgcgaat tcctcccccg tgctaccccc 1800gaataaacaa gcacgggata ttcccctttc tcatgcgaat tcctcccccg tgctaccccc 1800
tcccccaatt tgcaaagtta gtaaatgtga aattcgcaaa catgagtagt atcgcggaag 1860tcccccaatt tgcaaagtta gtaaatgtga aattcgcaaa catgagtagt atcgcggaag 1860
tttcaccacg tgaacctttc agtcggctcg cgcacaccac accaacaatc gacctatcgt 1920tttcaccacg tgaacctttc agtcggctcg cgcacaccac accaacaatc gacctatcgt 1920
tatacatgtt ttggcggatg agagaagatt ttcagcctga t 1961tatacatgtt ttggcggatg agagaagatt ttcagcctga t 1961
<210> 33<210> 33
<211> 1961<211> 1961
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Искусственная последовательность<223> Artificial sequence
<400> 33<400> 33
gcttgcatgc ctgcaggtcg actctagagg atccccttag gcttcctcaa gcttcagggt 60gcttgcatgc ctgcaggtcg actctagagg atccccttag gcttcctcaa gcttcaggt 60
cttctgggtg cgtgcccact gctgctcaaa cagtgctggc tcggaagcaa gcttcttgcc 120cttctgggtg cgtgcccact gctgctcaaa cagtgctggc tcggaagcaa gcttcttgcc 120
gtaggaaggg atcatgtcct tcagcttgtc gccccactcg atcatgcggt caccgaagca 180gtaggaaggg atcatgtcct tcagcttgtc gccccactcg atcatgcggt caccgaagca 180
acgctcaagc agctcgatca ttgcggaagg tgcgatggat gctccagggg aagcaccgag 240acgctcaagc agctcgatca ttgcggaagg tgcgatggat gctccagggg aagcaccgag 240
caatccggcg atggtgcctt cggagttgtt gatcaaggtg gtgccgaatt ccagggaacc 300caatccggcg atggtgcctt cggagttgtt gatcaaggtg gtgccgaatt ccagggaacc 300
gaacttaggg aatcctgcag gcttaataac ctgaacacgc tgtccggcaa cgatggtctc 360gaacttaggg aatcctgcag gcttaataac ctgaacacgc tgtccggcaa cgatggtctc 360
ccaatcgccg ttttgtgcct ctggcatgta ctcgcgaaga gcatccatac gcttgtcctg 420ccaatcgccg ttttgtgcct ctggcatgta ctcgcgaaga gcatccatac gcttgtcctg 420
gtccttgaga acttcagtga caaggtactt ggtcagatca aattcctgag cagcaacgcc 480gtccttgaga acttcagtga caaggtactt ggtcagatca aattcctgag cagcaacgcc 480
aaggtaggaa ggaatgttgt ctgggcggat ggacttgaac aggtccaggt aggagccttc 540aaggtaggaa ggaatgttgt ctgggcggat ggacttgaac aggtccaggt aggagccttc 540
cttcaagaac ttaggggtcc agccaccgta aggtccaaag agcagaccct tttcaccctc 600cttcaagaac ttaggggtcc agccaccgta aggtccaaag agcagaccct tttcaccctc 600
gataacgcgg gtgtcaaggt gaggaacaga cattggagga gcgccaacag atgccttgcc 660gataacgcgg gtgtcaaggt gaggaacaga cattggagga gcgccaacag atgccttgcc 660
atataccttg gctgcgtgct gctcgatcag ttcctcgttg gtgcaacgaa gccacaggcc 720atataccttg gctgcgtgct gctcgatcag ttcctcgttg gtgcaacgaa gccacaggcc 720
ggatactggg aatccagcga agcccttgac ctgtgggatg cctgcgctgc gaagcagatc 780ggatactggg aatccagcga agcccttgac ctgtgggatg cctgcgctgc gaagcagatc 780
cagtgcgtac ccgcctgcgc cgacgaacac gaagtttgcc ttgatggtct tggtgtcgcc 840cagtgcgtac ccgcctgcgc cgacgaacac gaagtttgcc ttgatggtct tggtgtcgcc 840
agtgtgtacg ttcttgacgg tcacgatcca ctttgcgcca tcagccttga tgctcttgac 900agtgtgtacg ttcttgacgg tcacgatcca ctttgcgcca tcagccttga tgctcttgac 900
ttcgtggcca tagcggattt cagtgccttc aacttcagat gcatccaggt actgcttggt 960ttcgtggcca tagcggattt cagtgccttc aacttcagat gcatccaggt actgcttggt 960
ctgagcaccg tagttgatgt cggtgccttc atcgatccaa gagattgcta ctggatcaga 1020ctgagcaccg tagttgatgt cggtgccttc atcgatccaa gagattgcta ctggatcaga 1020
gaagtcacgg ccctttgcca tcaaaggcag cttctcggtg aaggtagctt catcgtcagc 1080gaagtcacgg ccctttgcca tcaaaggcag cttctcggtg aaggtagctt catcgtcagc 1080
gtaggtcatg ccctggaaga gtgggtgatc cttcaaagct tcgtagcgag ccttgatgta 1140gtaggtcatg ccctggaaga gtgggtgatc cttcaaagct tcgtagcgag ccttgatgta 1140
tgcaacctgg tctgcgccct ggccgaaaga tacgtgagga acagggttga tgaattcctt 1200tgcaacctgg tctgcgccct ggccgaaaga tacgtgagga acagggttga tgaattcctt 1200
agaatcagcc agcacgccct cttcaacgag gtgagaccag aactgacggg aaacctggaa 1260agaatcagcc agcacgccct cttcaacgag gtgagaccag aactgacggg aaacctggaa 1260
cttctcgttg attcctacag ccttggcaat ttcaaccttg cccttaacct ctggggtgta 1320cttctcgttg attcctacag ccttggcaat ttcaaccttg cccttaacct ctggggtgta 1320
gttcagctcg catagagcag agtggccggt tcctgcattg ttccacgggg aggacgactc 1380gttcagctcg catagagcag agtggccggt tcctgcattg ttccacgggg aggacgactc 1380
ttgtgccggt ccatccaaac gctcgaagac gatctgagtc cagcttggct ccagctgacg 1440ttgtgccggt ccatccaaac gctcgaagac gatctgagtc cagcttggct ccagctgacg 1440
cagcattgca cccagcgtgg agctcatgat accggcacca atgagaacta catctgcctc 1500cagcattgca cccagcgtgg agctcatgat accggcacca atgagaacta catctgcctc 1500
atcggtaatc ctcggtgcgt tcttcgggga atctgacatg ttcaacttcc ttttatctcc 1560atcggtaatc ctcggtgcgt tcttcgggga atctgacatg ttcaacttcc ttttatctcc 1560
gcgagttctc tgccgaacac caacacaagg cgtcatctca taaatgatcg ccagcacccg 1620gcgagttctc tgccgaacac caacacaagg cgtcatctca taaatgatcg ccagcacccg 1620
aatgcaagtg ttggccatat ttttgactga cgcgtggggc gttacccttc ttgtttctta 1680aatgcaagtg ttggccatat ttttgactga cgcgtggggc gttacccttc ttgtttctta 1680
caagaaagcg tgggtacaca ttgtccgtaa atatagagtg tacgcctgcc acctcgagct 1740caagaaagcg tgggtacaca ttgtccgtaa atatagagtg tacgcctgcc acctcgagct 1740
gaataaacaa gcacgggata ttcccctttc tcatgcgaat tcctcccccg tgctaccccc 1800gaataaacaa gcacgggata ttcccctttc tcatgcgaat tcctcccccg tgctaccccc 1800
tcccccaatt tgcaaagtta gtaaatgtga aattcgcaaa catgagtagt atcgcggaag 1860tcccccaatt tgcaaagtta gtaaatgtga aattcgcaaa catgagtagt atcgcggaag 1860
tttcaccacg tgaacctttc agtcggctcg cgcacaccac accaacaatc gacctatcgt 1920tttcaccacg tgaacctttc agtcggctcg cgcacaccac accaacaatc gacctatcgt 1920
tatacatgtt ttggcggatg agagaagatt ttcagcctga t 1961tatacatgtt ttggcggatg agagaagatt ttcagcctga t 1961
<---<---
Claims (9)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011631266.8 | 2020-12-30 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2838163C1 true RU2838163C1 (en) | 2025-04-11 |
Family
ID=
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2261272C2 (en) * | 1999-08-20 | 2005-09-27 | Адзиномото Ко., Инк. | Strain enterobacter agglomerans, method for preparing l-glutamic acid (variants) and method for preparing microorganism for producing l-glutamic acid |
| WO2020135658A1 (en) * | 2018-12-28 | 2020-07-02 | 丰益(上海)生物技术研发中心有限公司 | Polypeptide having phospholipase c activity and use thereof |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2261272C2 (en) * | 1999-08-20 | 2005-09-27 | Адзиномото Ко., Инк. | Strain enterobacter agglomerans, method for preparing l-glutamic acid (variants) and method for preparing microorganism for producing l-glutamic acid |
| WO2020135658A1 (en) * | 2018-12-28 | 2020-07-02 | 丰益(上海)生物技术研发中心有限公司 | Polypeptide having phospholipase c activity and use thereof |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| SHYAMKUMAR, R., MOORTHY et al., Production of L-glutamic Acid with Corynebacterium glutamicum (NCIM 2168) and Pseudomonas reptilivora (NCIM 2598): A Study on Immobilization and Reusability, Avicenna journal of medical biotechnology, 2014, 6(3), 163-168. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR20250019107A (en) | NCgl2747 gene mutant and its application in L-lysine production | |
| CN111979164A (en) | A recombinant strain producing L-lysine and its construction method and application | |
| CN115873814B (en) | Application of bifunctional methylenetetrahydrofolate dehydrogenase encoding gene folD in L-amino acid synthesis | |
| CN111979165A (en) | A recombinant strain producing L-lysine and its construction method and application | |
| KR102434925B1 (en) | Microorganism having inhanced activity of 3-methyl-2-oxobutanoate hydroxymethyltransferase and uses thereof | |
| JP2024505626A (en) | L-glutamic acid producing recombinant strain with modified gene BBD29_04920, its construction method and application | |
| JP7644133B2 (en) | L-lysine producing recombinant strain, its construction method and use | |
| JP2024505808A (en) | Bacterial strain with enhanced L-glutamic acid production ability and its construction method and application | |
| CN111961635A (en) | Recombinant strain for producing L-lysine and construction method and application thereof | |
| JP7789070B2 (en) | L-glutamic acid producing recombinant strain with modified gene BBD29_09525, and its construction method and application | |
| RU2838163C1 (en) | Recombinant strain with modified bbd29_09525 gene for producing l-glutamic acid, as well as method for its construction and its application | |
| RU2841248C1 (en) | Recombinant strain with modified bbd29_11265 gene for producing l-glutamic acid, as well as method for construction and use thereof | |
| CN112625992B (en) | A kind of recombinant strain with modified gene BBD29_11265 producing L-glutamic acid and its construction method and application | |
| US20240076701A1 (en) | Recombinant strain with modified gene bbd29_14900, and method for constructing the same and use thereof | |
| RU2841249C2 (en) | Recombinant strain with modified bbd29_04920 gene for producing l-glutamic acid, as well as method for construction and use thereof | |
| CN114181288A (en) | Method for preparing L-valine and gene used therefor and protein encoded by the gene | |
| KR20230042224A (en) | Recombinant strains producing L-amino acids and their construction methods and applications | |
| RU2832108C1 (en) | Recombinant strain producing l-lysine, methods for construction and use thereof | |
| KR20230045051A (en) | Recombinant strains producing L-amino acids and their construction methods and applications | |
| RU2841768C2 (en) | Recombinant strain with modified bbd29_14900 gene, method for construction and use thereof | |
| CN114315998B (en) | CEY17_RS00300 gene mutant and application thereof in preparation of L-valine | |
| RU2841163C2 (en) | Strain having high ability to produce l-glutamic acid, as well as method for construction and use thereof | |
| CN117264924B (en) | BBD29_11900 gene mutant and application thereof in preparation of L-glutamic acid |