RU2838145C1 - Lipid-polymer system for simultaneous delivery of two antibacterial compounds - Google Patents
Lipid-polymer system for simultaneous delivery of two antibacterial compounds Download PDFInfo
- Publication number
- RU2838145C1 RU2838145C1 RU2023133084A RU2023133084A RU2838145C1 RU 2838145 C1 RU2838145 C1 RU 2838145C1 RU 2023133084 A RU2023133084 A RU 2023133084A RU 2023133084 A RU2023133084 A RU 2023133084A RU 2838145 C1 RU2838145 C1 RU 2838145C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cyclodextrin
- chitosan
- antibacterial compound
- logp value
- polymer
- Prior art date
Links
Abstract
Description
Область техники, к которой относится изобретениеField of technology to which the invention relates
Изобретение относится к медицине и нанобиотехнологиям, в частности к средствам для доставки активных агентов с пролонгированным действием. Система доставки представляет собой комплекс на основе конъюгата хитозана с производными β-циклодекстрина, в который включена молекула фторхинолонового соединения, с липосомальной формой гидрофобного антимикробного соединения. Система доставки может быть использована в фармацевтике для производства формуляции лекарственного средства пролонгированного действия при ингаляционном введении.The invention relates to medicine and nanobiotechnology, in particular to means for delivering active agents with prolonged action. The delivery system is a complex based on a chitosan conjugate with β-cyclodextrin derivatives, which includes a fluoroquinolone compound molecule, with a liposomal form of a hydrophobic antimicrobial compound. The delivery system can be used in pharmaceuticals for producing a formulation of a prolonged-action drug for inhalation administration.
Уровень техникиState of the art
Липосомы в качестве носителей активного агента способны значительно улучшать биофармацевтические свойства лекарственной формуляции за счет сохранности структуры при разбавлении раствора, вариабельной проницаемости бислоя для различных молекул, способности к образованию комплексов включения с препаратами, обладающими различной растворимостью в воде. Особенностью структуры поверхности липосом является возможность нацеливания данной системы на клетки при использовании лигандов разного типа (белков, пептидов, гликолипидов, лектинов и др.).Liposomes as carriers of an active agent can significantly improve the biopharmaceutical properties of a medicinal formulation due to the preservation of the structure upon dilution of the solution, variable permeability of the bilayer for various molecules, and the ability to form inclusion complexes with drugs that have different solubility in water. A feature of the liposome surface structure is the ability to target this system to cells using ligands of different types (proteins, peptides, glycolipids, lectins, etc.).
Несмотря на большое количество преимуществ при использовании липосомальных наноконтейнеров, их стабильность в кровотоке остается параметром, требующим улучшений. При попадании в кровь поверхность липосом покрывают опсонины, белки сыворотки крови, в результате чего мононуклеарная фагоцитарная система (МФС) может извлекать липосомальные частицы из кровотока. Скорость извлечения частиц напрямую зависит от их размера - мелкие частицы обладают большим временем циркуляции по сравнению с крупными частицами [Immordino M.L., Dosio F., Cattel L. Stealth liposomes: review of the basic science, rationale, and clinical applications, existing and potential. // International journal of nanomedicine. - 2006. - V. 1, № 3. - P. 297-315].Despite the large number of advantages of using liposomal nanocontainers, their stability in the bloodstream remains a parameter that requires improvement. When entering the blood, the surface of liposomes is coated with opsonins, blood serum proteins, as a result of which the mononuclear phagocyte system (MPS) can extract liposomal particles from the bloodstream. The rate of particle extraction directly depends on their size - small particles have a longer circulation time compared to large particles [Immordino M.L., Dosio F., Cattel L. Stealth liposomes: review of the basic science, rationale, and clinical applications, existing and potential. // International journal of nanomedicine. - 2006. - V. 1, № 3. - P. 297-315].
Однако это очевидное ограничение липосом было использовано для эффективной доставки противомикробных препаратов, используемых для лечения инфекций, локализованных в МФС, например, для терапии туберкулеза [Deol P., Khuller G.K., Joshi K. Therapeutic efficacies of isoniazid and rifampin encapsulated in lung-specific stealth liposomes against Mycobacterium tuberculosis infection induced in mice // Antimicrobial Agents and Chemotherapy. - 1997. - V. 41, № 6. - P. 1211-1214]. Тем не менее, когда биологическая мишень находится за пределами МФС, использование липосом, которые However, this apparent limitation of liposomes has been exploited for the efficient delivery of antimicrobial drugs used to treat infections localized in the MFS, such as tuberculosis therapy [Deol P., Khuller G.K., Joshi K. Therapeutic efficacies of isoniazid and rifampin encapsulated in lung-specific stealth liposomes against Mycobacterium tuberculosis infection induced in mice // Antimicrobial Agents and Chemotherapy. - 1997. - V. 41, No. 6. - P. 1211-1214]. However, when the biological target is outside the MFS, the use of liposomes, which
способны выходить из этой системы, оправдано для достижения более длительного времени циркуляции. Поиск липосом с более длительным временем циркуляции начался с разработки определенных липидных композиций, обладающих стерической стабильностью. Такого эффекта можно достичь при использовании полиэтиленгликоля, функционализация которым поверхности липосом которым служит барьером против атак МФС [Immordino M.L., Dosio F., Cattel L. Stealth liposomes: review of the basic science, rationale, and clinical applications, existing and potential. // International journal of nanomedicine. - 2006. - V. 1, № 3. - P. 297-315].able to exit this system, is justified for achieving a longer circulation time. The search for liposomes with a longer circulation time began with the development of certain lipid compositions with steric stability. This effect can be achieved using polyethylene glycol, the functionalization of the liposome surface with which serves as a barrier against attacks by the MPS [Immordino M.L., Dosio F., Cattel L. Stealth liposomes: review of the basic science, rationale, and clinical applications, existing and potential. // International journal of nanomedicine. - 2006. - V. 1, № 3. - P. 297-315].
Использование ингаляционных систем доставки позволяет практически исключить влияние МФС на распределение липосом в кровотоке. В таком случае размер липосом должен строго контролироваться. После вдыхания и распределения липосомы могут перемещаться во внелегочные участки и достигать других органов. Чтобы достичь этого, им необходимо проникнуть через эпителий дыхательных путей в интерстициальную ткань, получить доступ к кровотоку и, как следствие, распределиться через кровеносную или лимфатическую систему [Medina C., Santos-Martinez M.J., Radomski A., Corrigan O.I., Radomski M.W. Nanoparticles: pharmacological and toxicological significance // British Journal of Pharmacology. - 2007. - V. 150, № 5. - P. 552-558].The use of inhalation delivery systems allows to virtually eliminate the influence of MFS on the distribution of liposomes in the bloodstream. In this case, the size of liposomes should be strictly controlled. After inhalation and distribution, liposomes can move to extrapulmonary sites and reach other organs. To achieve this, they need to penetrate the epithelium of the respiratory tract into the interstitial tissue, gain access to the bloodstream and, as a result, be distributed through the circulatory or lymphatic system [Medina C., Santos-Martinez M.J., Radomski A., Corrigan O.I., Radomski M.W. Nanoparticles: pharmacological and toxicological significance // British Journal of Pharmacology. - 2007. - V. 150, № 5. - P. 552-558].
Сродство липосом к липидам легочного сурфактанта приводит к их слиянию на поверхности, в результате чего высвобождение инкапсулированной молекулы может происходить слишком быстро для осуществления эффективной терапии со сниженными побочными эффектами от использования агрессивных препаратов.The affinity of liposomes for pulmonary surfactant lipids leads to their fusion on the surface, resulting in the release of the encapsulated molecule being too rapid to provide effective therapy with reduced side effects from the use of aggressive drugs.
Для решения данной проблемы поверхность липосом функционализируют различными агентами, противодействующими агрегации. К примеру, для снижения фагоцитоза используют модификацию поверхности полиэтиленгликолем (ПЭГ), который дополнительно позволяет проникать в слизистую оболочку при хронических обструктивных заболеваниях легких [Yuan H., Chen C.-Y., Chai G., Du Y.-Z., Hu F.-Q. Improved Transport and Absorption through Gastrointestinal Tract by PEGylated Solid Lipid Nanoparticles // Mol Pharm. - 2013. - V. 10, № 5. - P. 1865-1873]. Хитозан (Хит), напротив, можно использовать для модификации поверхности наночастиц для улучшения мукоадгезии. Таким образом, липосомы, функционализированные хитозаном, могут находиться в целевом участке в течение более длительного периода времени, улучшая усвоение лекарственного средства, биодоступность и терапевтическую эффективность. Это свойство особенно эффективно при лечения необструктивных заболеваний легких, включая аллергию и рак легких [van Rijt S.H., Bein T., Meiners S. Medical nanoparticles for next generation drug delivery to the lungs // European Respiratory Journal. - 2014. - V. 44, № 3. - P. 765-774].To solve this problem, the surface of liposomes is functionalized with various agents that counteract aggregation. For example, to reduce phagocytosis, the surface is modified with polyethylene glycol (PEG), which additionally allows penetration into the mucous membrane in chronic obstructive pulmonary diseases [Yuan H., Chen C.-Y., Chai G., Du Y.-Z., Hu F.-Q. Improved Transport and Absorption through Gastrointestinal Tract by PEGylated Solid Lipid Nanoparticles // Mol Pharm. - 2013. - V. 10, No. 5. - P. 1865-1873]. Chitosan (Chit), on the contrary, can be used to modify the surface of nanoparticles to improve mucoadhesion. Thus, liposomes functionalized with chitosan can be in the target area for a longer period of time, improving drug absorption, bioavailability and therapeutic efficacy. This property is particularly effective in the treatment of non-obstructive lung diseases, including allergies and lung cancer [van Rijt S.H., Bein T., Meiners S. Medical nanoparticles for next generation drug delivery to the lungs // European Respiratory Journal. - 2014. - V. 44, No. 3. - P. 765-774].
Циклодекстрины (ЦД) представляют собой природные и синтетические макроциклы, состоящие из шести, семи и восьми D-глюкопиранозных остатков, соединенных между собой 1,4-α-гликозидной связью.Cyclodextrins (CDs) are natural and synthetic macrocycles consisting of six, seven and eight D-glucopyranose residues linked together by a 1,4-α-glycosidic bond.
Одной из важных характеристик циклодекстринов является образование комплексов включения «гость-хозяин» как в растворе, так и в твердом состоянии, в котором каждая гостевая молекула окружена гидрофобной средой полости циклодекстрина, что позволяет использовать циклодекстрины в качестве перспективных носителей гидрофобных и амфифильных препаратов. Образование комплекса приводит к изменению физико-химических свойств молекул «гостя» и может иметь значительный фармацевтический потенциал, позволяя повысить растворимость некоторых препаратов за счет гидрофильной наружной оболочки и усилить проникновение лекарств через биологические мембраны [Loftsson T., Moya-Ortega M.D., Alvarez-Lorenzo C., Concheiro A. Pharmacokinetics of cyclodextrins and drugs after oral and parenteral administration of drug/cyclodextrin complexes // Journal of Pharmacy and Pharmacology. - 2016. - V. 68, № 5. - P. 544-555]. Поскольку ЦД биосовместимы и нетоксичны, данные олигосахариды широко применяются для получения лекарственных формуляций с пониженной вероятностью возникновения побочных эффектов, а также улучшенными биодоступностью и проницаемостью препарата сквозь биологические барьеры.One of the important characteristics of cyclodextrins is the formation of host-guest inclusion complexes both in solution and in the solid state, in which each guest molecule is surrounded by a hydrophobic environment of the cyclodextrin cavity, which allows using cyclodextrins as promising carriers of hydrophobic and amphiphilic drugs. The formation of the complex leads to a change in the physicochemical properties of the guest molecules and can have significant pharmaceutical potential, allowing to increase the solubility of some drugs due to the hydrophilic outer shell and enhance the penetration of drugs through biological membranes [Loftsson T., Moya-Ortega M.D., Alvarez-Lorenzo C., Concheiro A. Pharmacokinetics of cyclodextrins and drugs after oral and parenteral administration of drug/cyclodextrin complexes // Journal of Pharmacy and Pharmacology. - 2016. - V. 68, No. 5. - P. 544-555]. Since CDs are biocompatible and non-toxic, these oligosaccharides are widely used to produce drug formulations with a reduced likelihood of side effects, as well as improved bioavailability and drug permeability through biological barriers.
β-ЦД наиболее широко применяется в качестве «хозяина» при связывании лекарств - малых органических молекул вследствие простой технологии получении и оптимального набора физико-химических свойств, в первую очередь, размера внутренней полости. Однако невысокая растворимость и потенциальная нефторотоксичность ограничивают применение в фармацевтической промышленности. Напротив, производные β-ЦД с различными заместителями характеризуются высокими показателями растворимости и эффективности комплексообразования вследствие дополнительной стабилизации вне гидрофобной полости β-ЦД.β-CD is most widely used as a "host" for binding drugs - small organic molecules due to the simple technology of production and the optimal set of physicochemical properties, primarily the size of the internal cavity. However, low solubility and potential non-fluorotoxicity limit the use in the pharmaceutical industry. In contrast, β-CD derivatives with various substituents are characterized by high solubility and complexation efficiency due to additional stabilization outside the hydrophobic cavity of β-CD.
В качестве носителей антибактериальных препаратов широко распространены полимерные наночастицы, для которых характерны структурная стабильность, обеспечивающая защиту включенной молекулы от деградации и выведения из организма, возможность регулировки размера и заряда поверхности и кинетики высвобождения лекарства из матрицы [Misra R., Acharya S., Dilnawaz F., Sahoo S.K. Sustained antibacterial activity of doxycycline-loaded polylactide-co-glycolide) and poly(ε-caprolactone) nanoparticles // Nanomedicine. - 2009. - V. 4, № 5. - P. 519-530].Polymer nanoparticles are widely used as carriers of antibacterial drugs. They are characterized by structural stability, which ensures protection of the included molecule from degradation and elimination from the body, the ability to regulate the size and charge of the surface and the kinetics of drug release from the matrix [Misra R., Acharya S., Dilnawaz F., Sahoo S.K. Sustained antibacterial activity of doxycycline-loaded polylactide-co-glycolide) and poly(ε-caprolactone) nanoparticles // Nanomedicine. - 2009. - V. 4, No. 5. - P. 519-530].
В том случае, когда лекарство инкапсулировано или ковалентно присоединено в виде пролекарства, увеличение эффективности действия препарата происходит без изменения молекулярной структуры и реакции клеток-мишеней с лекарством [Xiao H., Song H., Yang Q., Cai H., Qi R., Yan L., Liu S., Zheng Y., Huang Y., Liu T., Jing X. A prodrug strategy to deliver cisplatin(IV) and paclitaxel in nanomicelles to improve efficacy and tolerance // Biomaterials. - 2012. - V. 33, № 27. - P. 6507-6519]. Во время фазы распределения в кровотоке наноразмерные контейнеры защищают лекарство от компонентов плазмы и сохраняют его стабильность. Поскольку многие молекулы лекарственных средств гидрофобны, их связывание с гидрофильными носителями повышает их растворимость и сводит к минимуму потребность в дополнительных солюбилизирующих вспомогательных веществах, которые могут вызывать нежелательные побочные эффекты [Duncan R. Development of HPMA copolymer-anticancer conjugates: Clinical experience and lessons learnt // Advanced Drug Delivery Reviews. - 2009. - V. 61, № 13. - P. 1131-1148; Kopeček J., Kopečková P. HPMA copolymers: Origins, early developments, present, and future☆ // Advanced Drug Delivery Reviews. - 2010. - V. 62, № 2. - P. 122-149]. Из-за увеличенного размера носителя по сравнению с молекулой лекарственного средства период полувыведения из плазмы, накопление в ткани-мишени и клиренса лекарственного средства могут быть увеличены.When a drug is encapsulated or covalently attached as a prodrug, the drug's efficacy is increased without changing the molecular structure and reaction of target cells with the drug [Xiao H., Song H., Yang Q., Cai H., Qi R., Yan L., Liu S., Zheng Y., Huang Y., Liu T., Jing X. A prodrug strategy to deliver cisplatin(IV) and paclitaxel in nanomicelles to improve efficacy and tolerance // Biomaterials. - 2012. - V. 33, No. 27. - P. 6507-6519]. During the distribution phase in the bloodstream, nanosized containers protect the drug from plasma components and maintain its stability. Since many drug molecules are hydrophobic, their binding to hydrophilic carriers increases their solubility and minimizes the need for additional solubilizing excipients that can cause unwanted side effects [Duncan R. Development of HPMA copolymer-anticancer conjugates: Clinical experience and lessons learnt // Advanced Drug Delivery Reviews. - 2009. - Vol. 61, № 13. - P. 1131-1148; Kopeček J., Kopečková P. HPMA copolymers: Origins, early developments, present, and future☆ // Advanced Drug Delivery Reviews. - 2010. - Vol. 62, № 2. - P. 122-149]. Due to the increased size of the carrier compared to the drug molecule, the plasma half-life, accumulation in the target tissue, and clearance of the drug can be increased.
Хитозан является одним из наиболее распространенных полимеров, используемых при ингаляционной доставке за счет высокой мукоадгезии, что увеличивает эффективность всасывания лекарственного средства. Ранее было показано, что положительный заряд хитозана «открывает» межклеточные плотные соединения эпителия легких, тем самым увеличивая поглощение [Chopra S., Mahdi S., Kaur J., Iqbal Z., Talegaonkar S., Ahmad F.J. Advances and potential applications of chitosan derivatives as mucoadhesive biomaterials in modern drug delivery // Journal of Pharmacy and Pharmacology. - 2010. - V. 58, № 8. - P. 1021-1032]. Интересно, что хитозан обладает антибактериальной активностью за счет связывания с фосфорильными группами и липополисахаридами на мембранах бактериальных клеток, что является дополнительным преимуществом в борьбе с легочными бактериальными инфекциями [Mohammed M., Syeda J., Wasan K., Wasan E. An Overview of Chitosan Nanoparticles and Its Application in Non-Parenteral Drug Delivery // Pharmaceutics. - 2017. - V. 9, № 4. - P. 53].Chitosan is one of the most common polymers used in inhalation delivery due to its high mucoadhesion, which increases the efficiency of drug absorption. It has been previously shown that the positive charge of chitosan "opens" the intercellular tight junctions of the lung epithelium, thereby increasing absorption [Chopra S., Mahdi S., Kaur J., Iqbal Z., Talegaonkar S., Ahmad F.J. Advances and potential applications of chitosan derivatives as mucoadhesive biomaterials in modern drug delivery // Journal of Pharmacy and Pharmacology. - 2010. - V. 58, № 8. - P. 1021-1032]. Interestingly, chitosan has antibacterial activity due to binding to phosphoryl groups and lipopolysaccharides on bacterial cell membranes, which is an additional advantage in the fight against pulmonary bacterial infections [Mohammed M., Syeda J., Wasan K., Wasan E. An Overview of Chitosan Nanoparticles and Its Application in Non-Parenteral Drug Delivery // Pharmaceutics. - 2017. - V. 9, No. 4. - P. 53].
Из уровня техники известны липосомальные формы рифампицина с высокой степенью загрузки лекарственного препарата в систему (RU2223764 C1). Получаемые липосомы имеют размер 100-500 нм, однако процесс синтеза данной системы методически сложен - необходимо использование и высушивание органического растворителя, гомогенизирование системы и фильтрация с использованием ядерного фильтра. Такая система доставки содержит только рифампицин, в то время как для лечения резистентных форм туберкулеза предпочтительнее использовать комбинацию антибактериальных препаратов. К недостаткам описанной системы также относится использование нестабилизированных композиций, что требует лиофилизации как дополнительной стадии технологического процесса, а также недостаточную пролонгированность высвобождения содержимого.Liposomal forms of rifampicin with a high degree of loading of the drug into the system are known from the state of the art (RU2223764 C1). The resulting liposomes have a size of 100-500 nm, but the process of synthesis of this system is methodologically complex - it is necessary to use and dry an organic solvent, homogenize the system and filter using a nuclear filter. Such a delivery system contains only rifampicin, while for the treatment of resistant forms of tuberculosis it is preferable to use a combination of antibacterial drugs. The disadvantages of the described system also include the use of unstabilized compositions, which requires lyophilization as an additional stage of the technological process, as well as insufficient prolongation of the release of the contents.
Комбинированные системы рифампицина с антибактериальными препаратами также известны из уровня техники. Известна система, сочетающая рифампицин, этамбутол, изониазид, пиразиномид и пиридоксин при определенном соотношении компонентов и в качестве носителя метацель - это фирменное наименование метиловых эфиров целлюлозы, содержащих 14-30% метоксильных групп (RU2195937 C1). Однако известная система не предполагает ингаляционный способ доставки и подходит исключительно для внутривенного введения. Данная система позволяет осуществлять высвобождение препаратов в течение 4 ч. - этого времени недостаточно для поддержания постоянной терапевтической концентрации лекарственных молекул.Combination systems of rifampicin with antibacterial drugs are also known from the state of the art. A system is known that combines rifampicin, ethambutol, isoniazid, pyrazinomide and pyridoxine in a certain ratio of components and metacel as a carrier - this is a brand name for methyl cellulose ethers containing 14-30% methoxyl groups (RU2195937 C1). However, the known system does not imply an inhalation method of delivery and is suitable exclusively for intravenous administration. This system allows for the release of drugs for 4 hours - this time is insufficient to maintain a constant therapeutic concentration of drug molecules.
Известно сочетание рифампицина с левофлоксацином (а также изониазидом, пиразинамидом и пиридоксин гидрохлоридом) для противотуберкулезной терапии (RU2247559 C1). Предлагаемое лекарственное средство выполняют в виде различных твердых лекарственных форм - таблеток, капсул, гранул, порошков. Данная система характеризуется высокой антибактериальной активностью in vitro (в т.ч. и на лекарственно-устойчивые штаммы микобактерий туберкулеза), но данная лекарственная форма вводится перорально и не предполагает наличие какой-либо системы доставки препаратов в легкие, поэтому не позволяет достигать пролонгированного высвобождения препарата.A combination of rifampicin with levofloxacin (as well as isoniazid, pyrazinamide and pyridoxine hydrochloride) is known for anti-tuberculosis therapy (RU2247559 C1). The proposed drug is available in various solid dosage forms - tablets, capsules, granules, powders. This system is characterized by high antibacterial activity in vitro (including against drug-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis), but this dosage form is administered orally and does not imply the presence of any system for delivering drugs to the lungs, therefore it does not allow for prolonged release of the drug.
Для ингаляционного введения подходит система, состоящая из этамбутола, изониазида, рифампицина и пиразинамида, содержащая стабилизированные наночастицы серебра (RU2412715 C2). Данная система обладает высокой антибактериальной активностью, однако получение стабилизированных наночастиц серебра является сложной методической задачей.A system consisting of ethambutol, isoniazid, rifampicin and pyrazinamide containing stabilized silver nanoparticles (RU2412715 C2) is suitable for inhalation administration. This system has high antibacterial activity, but obtaining stabilized silver nanoparticles is a complex methodological task.
Таким образом, техническая проблема, решаемая посредством заявляемого изобретения, заключается в необходимости преодоления недостатков, присущих аналогам и прототипу за счет создания комбинированной системы одновременной доставки лекарственного препарата из группы фторхинолонов, и гидрофобных препаратов, которая обладает пролонгированным действием.Thus, the technical problem solved by the claimed invention is the need to overcome the shortcomings inherent in analogues and the prototype by creating a combined system for the simultaneous delivery of a drug from the fluoroquinolone group and hydrophobic drugs, which has a prolonged effect.
Раскрытие изобретенияDisclosure of invention
Техническим результатом, на достижение которого направлено заявленное изобретение, является обеспечение контролируемого пролонгированного действия лекарственных соединений (молекул) при повышении биодоступности, время высвобождения - не менее 400 минут. Контролируемое пролонгированное действие лекарственных соединений реализуется за счет включения гидрофобной молекулы лекарственного соединения в липосомальную везикулу, а гидрофильного соединения (молекулы активного вещества) в поры циклодекстрина, ковалентно пришитые к цепи хитозана. Повышение биодоступности реализуется за счет получение частиц в суспензии с гидродинамическим радиусом 100-300 нм, а также использования биосовместимого контейнера.The technical result, which the claimed invention is aimed at achieving, is to ensure controlled prolonged action of medicinal compounds (molecules) with increased bioavailability, the release time is not less than 400 minutes. Controlled prolonged action of medicinal compounds is implemented by including a hydrophobic molecule of a medicinal compound in a liposomal vesicle, and a hydrophilic compound (molecule of an active substance) in cyclodextrin pores covalently stitched to a chitosan chain. Increased bioavailability is implemented by obtaining particles in suspension with a hydrodynamic radius of 100-300 nm, as well as using a biocompatible container.
Кроме того, преимуществом заявленного изобретения является возможность использования системы доставки для ингаляционного введения за счет стабильности и оптимального размера частиц, а также мукоадегезивных свойств хитозана.In addition, the advantage of the claimed invention is the possibility of using the delivery system for inhalation administration due to the stability and optimal particle size, as well as the mucoadhesive properties of chitosan.
Получение комбинированной системы включает в себя шесть стадий, минимальное время протекания самих реакций составляет 20 часов. Существенным преимуществом данного изобретения, которым не обладают известные ранее системы, является возможность достижения контролируемого пролонгированного высвобождения лекарственного препарата из группы фторхинолонов и гидрофобных препаратов в терапевтических концентрациях.The production of the combined system includes six stages, the minimum time of the reactions themselves is 20 hours. A significant advantage of this invention, which previously known systems do not have, is the possibility of achieving controlled prolonged release of a drug from the group of fluoroquinolones and hydrophobic drugs in therapeutic concentrations.
Технический результат достигается комбинированной липидно-полимерной системой доставки лекарственных средств, представляющей собой комплекс липосомальной формы гидрофобного антибактериального соединения с величиной logP не менее 4,0 и конъюгата на основе хитозана 5 - 120 кДа, модифицированного по аминогруппам циклодекстрином с присоединенным гидрофильным антибактериальным соединением с величиной logP не более - 0,4. В качестве циклодекстрина используют 2-гидроксипропил-β-циклодекстрин, моно-(6-(гексаметилендиамин)-6-дезокси)-β-циклодекстрин; в качестве гидрофильного соединения с величиной logP не более -0,4 используют соединения фторхинолонового ряда, выбранного из группы: левофлоксацин, офлоксацин, моксифлоксацин, ципрофлоксацин. В качестве гидрофобного низкомолекулярного антибактериального соединения используют рифампицин, рапамицин, бета-кариофеллен. При этом мольное соотношение гидрофобного соединения в липосомах к соединению в циклодекстрине соответствует терапевтическому и составляет от 4:1 до 10:1.The technical result is achieved by a combined lipid-polymer drug delivery system, which is a complex of a liposomal form of a hydrophobic antibacterial compound with a logP value of at least 4.0 and a conjugate based on chitosan 5 - 120 kDa, modified by amino groups of cyclodextrin with an attached hydrophilic antibacterial compound with a logP value of no more than - 0.4. 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin, mono-(6-(hexamethylenediamine)-6-deoxy)-β-cyclodextrin are used as the cyclodextrin; fluoroquinolone compounds selected from the group: levofloxacin, ofloxacin, moxifloxacin, ciprofloxacin are used as the hydrophilic compound with a logP value of no more than -0.4. Rifampicin, rapamycin, beta-caryophyllene are used as hydrophobic low-molecular antibacterial compounds. The molar ratio of the hydrophobic compound in liposomes to the compound in cyclodextrin corresponds to the therapeutic one and ranges from 4:1 to 10:1.
Также технический результат достигается способом синтеза системы доставки, заключающимся в том, что синтез проводят с помощью реакции тозилирования производного β-циклодекстрина и замещения по амино-группе хитозана в присутствии диметилформамида при температуре 95±5°С. Из тозилированного производного β-циклодекстрина и хитозана 5-120 кДа в присутствии диметилформамида при температуре 95±5°С образуют конъюгат, одновременно проводят получение липосомальных форм гидрофобного соединения способом гидратации липидной пленки раствором лекарственной молекулы (лекарственного соединения, вещества) в 0,01-0,02 М натрий-фосфатном буферном растворе, затем проводят включение соединения в полимерный конъюгат в кислой среде при pH=3,5-4,5. Основомольное соотношение свободных аминогруппы хитозана : производное β-циклодекстрина составляет от 1:1 до 1:20, а основомольное соотношение липосом к полимеру составляет от 1:1 до 1:8.The technical result is also achieved by a method for synthesizing a delivery system, which consists in the fact that the synthesis is carried out using a tosylation reaction of a β-cyclodextrin derivative and substitution at the amino group of chitosan in the presence of dimethylformamide at a temperature of 95±5°C. A conjugate is formed from a tosylated β-cyclodextrin derivative and 5-120 kDa chitosan in the presence of dimethylformamide at a temperature of 95±5°C, and liposomal forms of the hydrophobic compound are simultaneously obtained by hydrating a lipid film with a solution of a medicinal molecule (medicinal compound, substance) in a 0.01-0.02 M sodium phosphate buffer solution, then the compound is included in the polymer conjugate in an acidic medium at pH=3.5-4.5. The molar ratio of free amino groups of chitosan: β-cyclodextrin derivative is from 1:1 to 1:20, and the molar ratio of liposomes to polymer is from 1:1 to 1:8.
Краткое описание чертежейBrief description of the drawings
Изобретение поясняется чертежами, где на фиг. 1 представлено схематичное строение комбинированной системы.The invention is explained by drawings, where Fig. 1 shows a schematic structure of a combined system.
На фиг. 2 представлены микрофотографии СЭМ комбинированной системы для NH2-ЦД (А, Б) и NH2-ЦД-Хит (В, Г). Ускоряющее напряжение 5 кВ.Fig. 2 shows SEM micrographs of the combined system for NH 2 -CD (A, B) and NH 2 -CD-Chit (C, D). Accelerating voltage 5 kV.
На фиг. 3 представлены кривые одновременного высвобождения лекарственных молекул из комбинированной системы - Левофлоксацин более темная линия и Рифампицин (светлая линия) из комбинированной системы, состоящей из липосом ДПФХ:КЛ 80:20, нагруженных Риф, с носителем NH2-ЦД-Хит, нагруженным Лев. Натрий-фосфатный буферный раствор 0,01 М, рН = 7,4, Т = 37°С.Fig. 3 shows the curves of the simultaneous release of medicinal molecules from the combined system - Levofloxacin, darker line, and Rifampicin (light line) from the combined system consisting of liposomes DPPC:CL 80:20, loaded with Rif, with the carrier NH2-CD-Chit, loaded with Lev. Sodium phosphate buffer solution 0.01 M, pH = 7.4, T = 37°C.
Осуществление изобретенияImplementation of the invention
Для разработки комбинированной системы доставки предложено использовать комплексы лекарственной молекулы с конъюгатами на основе хитозана с молекулярной массой от 5 до 120 кДа и 2-гидроксипропил-β-циклодекстрином, моно-(6-(гексаметилендиамин)-6-дезокси)-β-циклодекстрином, комплексами данных молекул с фторхинолонами, например левофлоксацином, офлоксацином, моксифлоксацином, ципрофлоксацином с нейтральными (дипальмитоилфосфатидилхолин ДПФХ100%) и анионными (дипальмитоилфосфатидилхолин : кардиолипин (КЛ) 80:20) липосомальными формами рифампицина, а также иных гидрофобных веществ с биологической активностью, например рапамицина, бета-кариофеллена. Синтез систем доставки проводят с помощью реакции тозилирования производного β-циклодекстрина и замещения по амино-группе хитозана в присутствии диметилформамида при температуре 95±5°С.To develop a combined delivery system, it is proposed to use complexes of a drug molecule with conjugates based on chitosan with a molecular weight of 5 to 120 kDa and 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin, mono-(6-(hexamethylenediamine)-6-deoxy)-β-cyclodextrin, complexes of these molecules with fluoroquinolones, such as levofloxacin, ofloxacin, moxifloxacin, ciprofloxacin with neutral (dipalmitoylphosphatidylcholine DPPC100%) and anionic (dipalmitoylphosphatidylcholine: cardiolipin (CL) 80:20) liposomal forms of rifampicin, as well as other hydrophobic substances with biological activity, such as rapamycin, beta-caryophyllene. The synthesis of delivery systems is carried out using a tosylation reaction of a β-cyclodextrin derivative and substitution at the amino group of chitosan in the presence of dimethylformamide at a temperature of 95±5°C.
Преимущества предложенной методики синтеза по сравнению с известными для похожих систем - высокий процент включения лекарственного препарата в пространственную сетку полимерной системы доставки (20% для левофлоксацина и 30% для рифампицина), простота очистки и выделения синтезированной системы.The advantages of the proposed synthesis method compared to those known for similar systems are a high percentage of inclusion of the drug in the spatial network of the polymer delivery system (20% for levofloxacin and 30% for rifampicin), ease of purification and isolation of the synthesized system.
На первой стадии синтеза из тозилированного производного β-циклодекстрина и хитозана 5-120 кДа в присутствии диметилформамида при температуре 95±5°С образуется конъюгат, используемый в качестве носителя менее гидрофобного препарата, например, левофлоксацина. Получение комплекса включения препарата в полимерный конъюгат происходит в кислой среде при pH=3,5-4,5 (HCl). Отдельно происходит получение липосомальных форм гидрофобного препарата из группы фторхинолонов, например рифампицина, методом гидратации липидной пленки раствором лекарственной молекуле в натрий-фосфатном буферном растворе (0,01-0,02 М).In the first stage of synthesis, a conjugate is formed from a tosylated derivative of β-cyclodextrin and chitosan of 5-120 kDa in the presence of dimethylformamide at a temperature of 95±5°C, which is used as a carrier of a less hydrophobic drug, for example, levofloxacin. The preparation of a drug inclusion complex in a polymer conjugate occurs in an acidic medium at pH=3.5-4.5 (HCl). Separately, liposomal forms of a hydrophobic drug from the fluoroquinolone group, for example, rifampicin, are obtained by hydrating the lipid film with a solution of the drug molecule in a sodium phosphate buffer solution (0.01-0.02 M).
Все используемые реагенты являются коммерчески доступными, все процедуры, если не оговорено особо, осуществляли при комнатной температуре или температуре окружающей среды, то есть в диапазоне от 18 до 25°C.All reagents used were commercially available and all procedures, unless otherwise stated, were performed at room or ambient temperature, i.e., in the range of 18 to 25°C.
Комбинированную систему получали путем соединения комплекса включения левофлоксацина в конъюгат хитозана и производных β-циклодекстрина с липосомальной формой рифампицина (фиг. 1). Мольное соотношение левофлоксацина к рифампицину составляет от 4:1 до 10:1 и соответствует терапевтическому.The combined system was obtained by combining the inclusion complex of levofloxacin in a chitosan conjugate and β-cyclodextrin derivatives with a liposomal form of rifampicin (Fig. 1). The molar ratio of levofloxacin to rifampicin ranges from 4:1 to 10:1 and corresponds to the therapeutic one.
Таким образом, способ синтеза комбинированной системы методически прост, включает в себя три стадии: получение и очистка конъюгата хитозана с производным β-циклодекстрина, получение комплексов синтезированного полимерного носителя с левофлоксацином, получение липосомальной формы рифампицина и объединение данных систем. Возможно получение систем с заданным размером (100-600 нм). Антибактериальное действие комбинированной системы в агаре на двух штаммах: грамотрицательных бактериях Escherichia coli ATCC 25922 и грамположительных бактериях Bacillus subtilis ATCC 6633 указывает на наличие тенденции к пролонгированному действию по сравнению с действием свободного лекарственного препарата.Thus, the method of synthesis of the combined system is methodically simple, includes three stages: obtaining and purifying the chitosan conjugate with a β-cyclodextrin derivative, obtaining complexes of the synthesized polymer carrier with levofloxacin, obtaining a liposomal form of rifampicin and combining these systems. It is possible to obtain systems with a given size (100-600 nm). The antibacterial action of the combined system in agar on two strains: gram-negative bacteria Escherichia coli ATCC 25922 and gram-positive bacteria Bacillus subtilis ATCC 6633 indicates a tendency to prolonged action compared to the action of the free drug.
Важным аспектом представленной технологии с точки зрения ее дальнейшего применения для различных систем введения лекарства является оценка скорости высвобождения лекарственных препаратов из комбинированной системы в зависимости от выбора липосомальной формы рифампицина и производного β-циклодекстрина, что позволит использовать разработанную систему доставки для достижения пролонгированного высвобождения.An important aspect of the presented technology from the point of view of its further application for various drug delivery systems is the assessment of the rate of drug release from the combined system depending on the choice of the liposomal form of rifampicin and the β-cyclodextrin derivative, which will allow the use of the developed delivery system to achieve prolonged release.
Структура системы подтверждается методами ИК-спектроскопии Фурье, сканирующей электронной микроскопии, исследованиями размера частиц и ζ-потенциала.The structure of the system is confirmed by Fourier transform IR spectroscopy, scanning electron microscopy, particle size studies and ζ-potential.
Ниже представлено более подробное описание заявляемого изобретения. Настоящее изобретение может подвергаться различным изменениям и модификациям, понятным специалисту на основе прочтения данного описания. Такие изменения не ограничивают объем притязаний. Например, могут изменяться способы получения комплексов включения производного циклодекстрина и лекарственной молекулы (сухое или термомеханическое смешение и последующее растворение комплекса в буфере, использование сверхкритических технологий и т.д.), очистки продукта от органического растворителя и непрореагировавших веществ, а также методы концентрации и сушки полученного вещества.A more detailed description of the claimed invention is provided below. The present invention may be subject to various changes and modifications that are understandable to a specialist based on reading this description. Such changes do not limit the scope of claims. For example, the methods for obtaining inclusion complexes of a cyclodextrin derivative and a medicinal molecule (dry or thermomechanical mixing and subsequent dissolution of the complex in a buffer, use of supercritical technologies, etc.), purification of the product from an organic solvent and unreacted substances, as well as methods for concentrating and drying the resulting substance may change.
Пример 1.Example 1.
Синтез конъюгатов хитозана и производных β-циклодекстрина осуществляли согласно методике без существенных изменений [Yuan Z., Ye Y., Gao F., Yuan H., Lan M., Lou K., Wang W. Chitosan-graft-β-cyclodextrin nanoparticles as a carrier for controlled drug release // Int. J. Pharm. - 2013. - V. 446, № 1-2. - P. 191-198]. Для этого к раствору хитозана в уксусной кислоте (рН = 4,0) по каплям приливали растворы полученных на первой стадии тозилированных производных β-циклодекстрина в ДМФА. Реакционную смесь держали в термостате при 95°С в течение 16 часов, после чего проводили диализ продуктов в диализных мешках «Orange Scientific» с молекулярной массой отсечения 12-14 кДа против дистиллированной воды в течение суток.Synthesis of chitosan conjugates and β-cyclodextrin derivatives was carried out according to the method without significant changes [Yuan Z., Ye Y., Gao F., Yuan H., Lan M., Lou K., Wang W. Chitosan-graft-β-cyclodextrin nanoparticles as a carrier for controlled drug release // Int. J. Pharm. - 2013. - V. 446, No. 1-2. - P. 191-198]. For this purpose, solutions of tosylated β-cyclodextrin derivatives obtained in the first stage in DMF were added dropwise to a solution of chitosan in acetic acid (pH = 4.0). The reaction mixture was kept in a thermostat at 95°C for 16 hours, after which the products were dialyzed in Orange Scientific dialysis bags with a molecular weight cutoff of 12–14 kDa against distilled water for 24 hours.
Комплексы левофлоксацина с амино-производным β-циклодекстрина получали добавлением к раствору левофлоксацина в HCl (pH=4,0) концентрацией 3 мг/мл требуемого количества раствора производного β-циклодекстрина с тем же pH, доводили объем до 0,5 мл. Концентрация левофлоксацина поддерживалась постоянной во всех образцах и была равна 1 мг/мл, мольный избыток производного β-ЦД варьировался в интервале от 0,1 до 10. Комплексы инкубировали при 37°С в течение 60 минут.Complexes of levofloxacin with the amino derivative of β-cyclodextrin were obtained by adding the required amount of the β-cyclodextrin derivative solution with the same pH to a solution of levofloxacin in HCl (pH=4.0) with a concentration of 3 mg/ml, the volume was brought to 0.5 ml. The concentration of levofloxacin was maintained constant in all samples and was equal to 1 mg/ml, the molar excess of the β-CD derivative varied in the range from 0.1 to 10. The complexes were incubated at 37°C for 60 minutes.
Липосомы получали методом гидратации липидной пленки с последующей обработкой ультразвуком. Растворы ДПФХ и КЛ в хлороформе (25 мг/мл) в необходимом массовом соотношении (ДПФХ 100% и ДПФХ:КЛ 80:20) помещали в круглодонную колбу, затем удаляли растворитель на роторном испарителе при температуре ниже 55°С. Полученную тонкую пленку диспергировали в 0,01 М натрий-фосфатном буферном Liposomes were obtained by hydration of the lipid film followed by ultrasonic treatment. Solutions of DPPC and CL in chloroform (25 mg/ml) in the required mass ratio (DPPC 100% and DPPC:CL 80:20) were placed in a round-bottomed flask, then the solvent was removed on a rotary evaporator at a temperature below 55°C. The resulting thin film was dispersed in 0.01 M sodium phosphate buffer
растворе (рН = 7,4) до концентрации липидов 5 мг/мл, далее колбу подвергали воздействию ультразвуковой ванны (37 Гц) в течение 5 минут. Непрозрачную суспензию переносили в пластиковую пробирку и обрабатывали ультразвуком (22 кГц) в течение 10 минут в непрерывном режиме при постоянном охлаждении на диспергаторе 4710 «Cole-Parmer Instrument».solution (pH = 7.4) to a lipid concentration of 5 mg/ml, then the flask was exposed to an ultrasonic bath (37 Hz) for 5 minutes. The opaque suspension was transferred to a plastic tube and treated with ultrasound (22 kHz) for 10 minutes in a continuous mode with constant cooling on a 4710 Cole-Parmer Instrument disperser.
Липосомальные формы рифампицина получали аналогичным образом с некоторыми изменениями: тонкую липидную пленку диспергировали в 0,01 М натрий-фосфатном буферном растворе (рН = 7,4), содержащем рифампицин в концентрации 2 мг/мл. Несвязавшийся препарат отделяли с помощью диализа против 0,01 М натрий-фосфатного буферного раствора (рН = 7,4) в диализных мешках «Serva» с молекулярной массой отсечения 3500 Да в течение 120 минут при температуре 4°С.Liposomal forms of rifampicin were prepared similarly with some modifications: a thin lipid film was dispersed in 0.01 M sodium phosphate buffer solution (pH = 7.4) containing rifampicin at a concentration of 2 mg/ml. Unbound drug was separated by dialysis against 0.01 M sodium phosphate buffer solution (pH = 7.4) in Serva dialysis bags with a molecular weight cutoff of 3500 Da for 120 minutes at a temperature of 4°C.
Комбинированную систему получали путем смешивания комплексов включения левофлоксацина с липосомальной формой рифампицина.The combination system was obtained by mixing inclusion complexes of levofloxacin with a liposomal form of rifampicin.
Пример 2.Example 2.
Синтез комбинированной системы проводили аналогично примеру 1. При этом использовали для получения тозилированного производного β-циклодекстрина дистиллированную воду в качестве растворителя.The synthesis of the combined system was carried out similarly to Example 1. In this case, distilled water was used as a solvent to obtain the tosylated derivative of β-cyclodextrin.
Пример 3.Example 3.
Синтез комбинированной системы проводили аналогично примеру 1. При этом использовали для получения тозилированного производного β-циклодекстрина равную смесь дистиллированной воды и ДМФА в качестве растворителя.The synthesis of the combined system was carried out similarly to example 1. In this case, an equal mixture of distilled water and DMF was used as a solvent to obtain the tosylated derivative of β-cyclodextrin.
Анализ структуры и свойств комбинированной системы.Analysis of the structure and properties of the combined system.
Характеризацию конъюгата хитозана с 2-гидроксипропил-бета-циклодекстрином (ГП-ЦД-Хит) проводили с помощью титрования свободных амино-групп 2,4,6-тринитробензолсульфокислотой (ТНБС). Для этого к растворам ГП-ЦД-Хит и Хит в боратном буфере (pH = 9,0) добавляли ТНБС, регистрировали оптическую плотность при длине волны 420 нм в течение 60 минут на спектрометре УФ- и видимого диапазона Cary eclipse UV-Vis spectrometer в кварцевой кювете Hellma Analytics при температуре 22°С. Начальная концентрация ТНБС при титровании хитозана была 1⋅10-3 М, при титровании ГП-ЦД-Хит 2⋅10-3 М, концентрации ГП-ЦД-Хит и Хит 2 мг/л.Characterization of the chitosan conjugate with 2-hydroxypropyl-beta-cyclodextrin (HP-CD-Chit) was carried out by titration of free amino groups with 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS). For this purpose, TNBS was added to solutions of HP-CD-Chit and Chit in a borate buffer (pH = 9.0), the optical density was recorded at a wavelength of 420 nm for 60 minutes on a Cary eclipse UV-Vis spectrometer in a Hellma Analytics quartz cuvette at a temperature of 22°C. The initial concentration of TNBS during the titration of chitosan was 1⋅10 -3 M, during the titration of HP-CD-Chit 2⋅10 -3 M, the concentrations of HP-CD-Chit and Chit 2 mg/l.
УФ-спектры комплексов включения регистрировали на спектрометре УФ- и видимого диапазона AmerSharm Biosciences UltraSpec 2100 pro трижды в интервале от 200 до 400 нм в кварцевой кювете Hellma Analytics при температуре 22 °С. Исходные образцы разбавлялись HCl (pH = 4,0) до концентрации Лев 3⋅10-5 М.UV spectra of inclusion complexes were recorded on an AmerSharm Biosciences UltraSpec 2100 pro UV/visible spectrometer three times in the range from 200 to 400 nm in a Hellma Analytics quartz cuvette at 22 °C. The initial samples were diluted with HCl (pH = 4.0) to a concentration of Lev 3⋅10 -5 M.
ИК-спектры комплексов регистрировали на ИК-спектрометре Фурье Tensor 27 «Bruker» (Германия), оснащенного MCT-детектором, охлаждаемым жидким азотом, с термостатом фирмы «Huber» (США). Измерения проводили в термостатируемой ячейке нарушенного полного внутреннего отражения (НПВО, BioATR-II, «Bruker», Германия) с использованием кристалла однократного отражения ZnSe, при 22°С и постоянной скорости продувки системы сухим воздухом аппаратом «Jun-Air» (Германия). На кристалл ячейки НПВО наносили аликвоту (50 мкл) образца, спектр регистрировали трижды в интервале от 4000 до 950 см-1, с разрешением 1 см-1; производили 70-кратное сканирование и усреднение. Фон регистрировали аналогично. Спектры анализировали с помощью программы Opus 7.0.The IR spectra of the complexes were recorded on a Tensor 27 Fourier IR spectrometer (Bruker) (Germany) equipped with an MCT detector cooled with liquid nitrogen and a thermostat from Huber (USA). The measurements were carried out in a thermostatted attenuated total reflection (ATR) cell (BioATR-II, Bruker, Germany) using a single-reflection ZnSe crystal at 22°C and a constant flow rate of dry air through the system using a Jun-Air apparatus (Germany). An aliquot (50 μl) of the sample was applied to the ATR cell crystal, the spectrum was recorded three times in the range from 4000 to 950 cm -1 , with a resolution of 1 cm -1 ; 70-fold scanning and averaging were performed. The background was recorded similarly. The spectra were analyzed using the Opus 7.0 program.
Спектры флуоресценции комплексов регистрировали на флуоресцентном спектрометре Varian Cary трижды в интервале от 350 до 650 нм при длине волны возбуждения λex = 288 нм в кварцевой кювете Hellma Analytics. Исходные образцы разбавлялись HCl (pH = 4,0) до концентрации левофлоксацина 3⋅10-5 М.The fluorescence spectra of the complexes were recorded on a Varian Cary fluorescence spectrometer three times in the range from 350 to 650 nm at an excitation wavelength of λ ex = 288 nm in a Hellma Analytics quartz cuvette. The initial samples were diluted with HCl (pH = 4.0) to a levofloxacin concentration of 3⋅10 -5 M.
ζ-потенциалы и размеры частиц измерялись с использованием системы Malvern Zetasizer Nano ZS (Великобритания), оснащенной гелий-неоновым лазером (5 мВт, 633 нм) в качестве источника света. Эксперимент проводился в термостатированной ячейке при 22°C.ζ-potentials and particle sizes were measured using a Malvern Zetasizer Nano ZS system (UK) equipped with a HeNe laser (5 mW, 633 nm) as a light source. The experiment was carried out in a thermostatted cell at 22°C.
Морфологию конъюгатов хитозана с производными β-циклодекстрина исследовали методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) на микроскопе JIB-4501 JEOL (Германия) с многолучевой системой при ускоряющем напряжении 5 кВ. Образцы порошка, помещенные на пластины СЭМ, были покрыты слоем золота толщиной 15 нм с помощью установки для напыления Q150R Plus от Quorum Technologies (Великобритания) (фиг.2).The morphology of chitosan conjugates with β-cyclodextrin derivatives was studied by scanning electron microscopy (SEM) using a JIB-4501 JEOL microscope (Germany) with a multi-beam system at an accelerating voltage of 5 kV. Powder samples placed on SEM plates were coated with a 15 nm thick gold layer using a Q150R Plus sputtering system from Quorum Technologies (UK) (Fig. 2).
Исследование антибактериальной активности лекарственных форм in vitro проводили методом диффузии в агаре [Balouiri M., Sadiki M., Ibnsouda S.K. Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review // Journal of Pharmaceutical Analysis. - 2016. - V. 6, № 2. - P. 71-79] с использованием питательной среды Luria-Bertani (рН 7,4). Ночную культуру Escherichia coli ATCC 25922 или Bacillus subtilis ATCC 6633 (Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов НИЦ «Курчатовский институт», Москва, Россия) разбавили до 0,5 стандарта мутности по Мак-Фарланду. Далее 500 мкл бактериальной суспензии распределяли по поверхности твердой питательной среды стеклянным шпателем. Через 20 минут из агара были удалены диски диаметром ~ 9 мм с помощью стерильного пластикового наконечника на 1 мл и в образовавшиеся лунки были помещены исследуемые образцы (по 50 мкл). Чашки Петри инкубировали при 37°С в течение 24 ч. Далее измеряли диаметры возникших зон ингибирования бактериального роста. Минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) определяли как концентрацию образца, при которой диаметр зоны ингибирования соответствует 9 мм. Эксперименты проводили независимо трижды, полученные значения усреднены и представлены со стандартным отклонением.The in vitro antibacterial activity of the medicinal forms was studied by the agar diffusion method [Balouiri M., Sadiki M., Ibnsouda S.K. Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review // Journal of Pharmaceutical Analysis. - 2016. - V. 6, No. 2. - P. 71-79] using Luria-Bertani nutrient medium (pH 7.4). The overnight culture of Escherichia coli ATCC 25922 or Bacillus subtilis ATCC 6633 (All-Russian Collection of Industrial Microorganisms, National Research Center "Kurchatov Institute", Moscow, Russia) was diluted to 0.5 McFarland turbidity standard. Then 500 μl of the bacterial suspension was distributed over the surface of the solid nutrient medium with a glass spatula. After 20 minutes, disks of ~9 mm in diameter were removed from the agar using a sterile 1 ml plastic tip and the test samples (50 μl each) were placed in the resulting wells. The Petri dishes were incubated at 37°C for 24 h. The diameters of the resulting bacterial growth inhibition zones were then measured. The minimum inhibitory concentration (MIC) was defined as the sample concentration at which the inhibition zone diameter corresponded to 9 mm. The experiments were carried out independently three times, the obtained values were averaged and presented with a standard deviation.
Высвобождение лекарственных препаратовDrug release
Эксперименты по кинетике высвобождения левофлоксацина из производных β-циклодекстрина проводили в растворе HCl (pH = 4,0) при температуре 37°С и скорости вращения 120 об/мин. Для этого комплексы Лев-ЦД объемом 1 мл помещали в диализный мешок «Orange Scientific» с молекулярной массой отсечения 12-14 кДа против 10 мл внешнего раствора HCl (pH = 4,0). Концентрация Лев составляла 3⋅10-5 М, концентрация торов ЦД - 1,5⋅10-5 М. Отбор проб объемом 100 мкл проводили в течение суток, поддерживая постоянный объем внешнего раствора. Образцы анализировали методом УФ-спектроскопии для определения доли высвобожденного препарата.Experiments on the kinetics of levofloxacin release from β-cyclodextrin derivatives were carried out in an HCl solution (pH = 4.0) at a temperature of 37°C and a rotation speed of 120 rpm. For this purpose, 1 ml of Lev-CD complexes were placed in an Orange Scientific dialysis bag with a molecular weight cutoff of 12-14 kDa against 10 ml of an external HCl solution (pH = 4.0). The Lev concentration was 3⋅10 -5 M, the concentration of CD tori was 1.5⋅10 -5 M. Samples of 100 μl were taken over the course of 24 hours, maintaining a constant volume of the external solution. The samples were analyzed by UV spectroscopy to determine the proportion of the released drug.
Эксперименты по кинетике высвобождения рифампицина из липосом проводили в 0,01 М натрий-фосфатном буферном растворе (рН = 7,4) при температуре 37°С и скорости вращения 120 об/мин. Для этого липосомальные формы рифампицина объемом 1 мл помещали в диализный мешок «Orange Scientific» с молекулярной массой отсечения 12-14 кДа против 10 мл внешнего 0,01 М натрий-фосфатного буферного раствора (рН = 7,4). Отбор проб объемом 100 мкл проводили в течение суток, поддерживая постоянный объем внешнего раствора. Образцы анализировали методом УФ-спектроскопии для определения доли высвобожденного препарата.Experiments on the kinetics of rifampicin release from liposomes were carried out in 0.01 M sodium phosphate buffer solution (pH = 7.4) at a temperature of 37°C and a rotation speed of 120 rpm. For this purpose, liposomal forms of rifampicin with a volume of 1 ml were placed in an Orange Scientific dialysis bag with a molecular weight cutoff of 12-14 kDa against 10 ml of an external 0.01 M sodium phosphate buffer solution (pH = 7.4). Samples of 100 μl were taken over the course of 24 hours, maintaining a constant volume of the external solution. The samples were analyzed by UV spectroscopy to determine the proportion of the released drug.
Эксперименты по кинетике одновременного высвобождения рифампицина и левофлоксацина из комбинированной системы проводили в 0,01 М натрий-фосфатном буферном растворе (рН = 7,4) при температуре 37°С и скорости вращения 120 об/мин. Для этого получали комплексы липосом (5 мг/мл), нагруженных рифампицином (2 мг/мл), с комплексом NH2-ЦД-Хит-Лев в осново-мольном соотношении 1:7. Полученные комплексы объемом 1 мл помещали в 10 мл внешнего 0,01 М натрий-фосфатного буферного раствора (рН = 7,4). Отбор проб объемом 100 мкл проводили в течение суток, поддерживая постоянный объем внешнего раствора. Образцы анализировали методом УФ-спектроскопии для определения доли высвобожденного препарата.Experiments on the kinetics of the simultaneous release of rifampicin and levofloxacin from the combined system were carried out in 0.01 M sodium phosphate buffer solution (pH = 7.4) at a temperature of 37°C and a rotation speed of 120 rpm. For this purpose, complexes of liposomes (5 mg/ml) loaded with rifampicin (2 mg/ml) with the NH 2 -CD-Chit-Lev complex were obtained in a base-molar ratio of 1:7. The resulting complexes with a volume of 1 ml were placed in 10 ml of an external 0.01 M sodium phosphate buffer solution (pH = 7.4). Samples of 100 μl were collected over a day, maintaining a constant volume of the external solution. The samples were analyzed by UV spectroscopy to determine the proportion of the released drug.
Изучение высвобождения лекарственных препаратов проводили путем описания кинетических кривых моделями нулевого и первого порядков, Хигучи, Корсмейера-Пеппаса и Хиксона-Кроуэлла согласно уравнениям (1-5):The study of drug release was carried out by describing kinetic curves using zero- and first-order models, Higuchi, Korsmeyer-Peppas and Hickson-Crowell according to equations (1-5):
где - время, мин; - количество препарата, высвобожденного за время , %; - исходное количество препарата, %; - максимальное количество препарата, %; - константа высвобождения нулевого порядка, мин-1; - константа высвобождения первого порядка, мин-1; - константа высвобождения Хигучи, мин-0.5; - константа высвобождения Корсмейера-Пеппаса; - показатель высвобождения; - константа высвобождения Хиксона-Кроуэлла, мин-1.Where - time, min; - the amount of drug released over time , %; - initial amount of the drug, %; - maximum amount of the drug, %; - zero-order release constant, min -1 ; - first order release constant, min -1 ; - Higuchi release constant, min -0.5 ; - Korsmeyer-Peppas release constant; - release rate; - Hickson-Crowell release constant, min -1 .
Наиболее подходящую модель для каждой системы определяли по наибольшему значению коэффициента детерминации (R2).The most suitable model for each system was determined by the highest value of the determination coefficient (R 2 ).
Высвобождение препаратов из комбинированной системы на основе липосомальной формы рифампицина (Риф) и левофлоксацина (Лев), загруженного в NH2-ЦД-Хит, отличается от высвобождения из отдельных конструкций липосомальной формы рифампицина (ЛРиф) и комплекса левофлоксацина с бета-циклодекстрином (Лев-β-ЦД-содержащий лиганд) (фиг. 3).The release of drugs from a combined system based on the liposomal form of rifampicin (Rif) and levofloxacin (Lev) loaded into NH2 -CD-Chit differs from the release from separate constructs of the liposomal form of rifampicin (LRif) and the complex of levofloxacin with beta-cyclodextrin (Lev-β-CD-containing ligand) (Fig. 3).
Наибольший интерес представляет система, состоящая из липосомальной формы Риф, функционализированной NH2-ЦД-Хит, причем торы β-ЦД нагружены Лев. В экспериментах по высвобождению лекарств из такой системы при 37°С в натрий-фосфатном буферном растворе было установлено, что высвобождение левофлоксацина замедляется относительно контрольной системы - комплекса Лев с NH2-ЦД-Хит.Of greatest interest is the system consisting of the liposomal form of Rif, functionalized with NH 2 -CD-Chit, with the β-CD tori loaded with Lev. In experiments on the release of drugs from such a system at 37°C in a sodium phosphate buffer solution, it was found that the release of levofloxacin slows down relative to the control system - the Lev complex with NH 2 -CD-Chit.
Так, спустя 10 часов после начала эксперимента доля выхода Лев превышает 90%, в то время как в комбинированной системе она составляет 77%, достигая максимального значения, а тангенс угла наклона становится меньше на 20% (табл. 1).Thus, 10 hours after the start of the experiment, the share of Lev output exceeds 90%, while in the combined system it is 77%, reaching the maximum value, and the slope tangent becomes 20% less (Table 1).
Таблица 1. Параметры, характеризующие высвобождение Лев из NH2-ЦД-Хит и комбинированной системы, содержащей ЛРиф ДПФХ:КЛ 80:20 + Лев-NH2-ЦД-Хит.Table 1. Parameters characterizing the release of Lev from NH 2 -CD-Chit and a combined system containing LRif DPPC:CL 80:20 + Lev-NH 2 -CD-Chit.
Процесс высвобождения рифампицина из комбинированной системы неординарен: загрузка в полимерный конъюгат Лев приводит к замедлению высвобождения Риф относительно аналогичной системы без Лев: в течение 5 часов происходит высвобождение 40% и 28% препарата во внешний раствор соответственно (табл. 2). Тангенс угла наклона начального участка кривой отличается на 32%, что дает основание предполагать увеличение плотности полимерной оболочки.The process of rifampicin release from the combined system is unusual: loading Lev into the polymer conjugate leads to a slowdown in the release of Rif relative to a similar system without Lev: within 5 hours, 40% and 28% of the drug are released into the external solution, respectively (Table 2). The tangent of the slope of the initial section of the curve differs by 32%, which gives grounds to assume an increase in the density of the polymer shell.
Таблица 2. Параметры, характеризующие высвобождение Риф из липосом ДПФХ:КЛ 80:20 в присутствии NH2-ЦД-Хит и комплекса Лев-NH2-ЦД-Хит.Table 2. Parameters characterizing the release of Rif from DPPC:CL 80:20 liposomes in the presence of NH 2 -CD-Chit and the Lev-NH 2 -CD-Chit complex.
Коэффициент детерминации является важной мерой того, в какой степени модель высвобождения описывает экспериментальные данные, поэтому для оценки соответствия уравнения используемой модели было проведено сравнение значений коэффициента детерминации (R2). Значения R2, полученные при обработке экспериментальных данных, представлены в табл. 3.The coefficient of determination is an important measure of the extent to which the release model describes the experimental data, therefore, to assess the suitability of the equation to the model used, a comparison of the values of the coefficient of determination (R 2 ) was carried out. The values of R 2 obtained from processing the experimental data are presented in Table 3.
Таблица 3. Значения коэффициента детерминации R2, полученные при обработке с помощью различных моделей кривых высвобождения препаратов липосомальных форм Риф без полимерной оболочки и покрытых полимером, Лев в немодифицированном производном β-циклодекстрина и в конъюгате NH2-ЦД-Хит.Table 3. Values of the determination coefficient R 2 obtained by processing the release curves of liposomal forms of Rif without a polymer shell and coated with a polymer, Lev in an unmodified derivative of β-cyclodextrin and in the NH 2 -CD-Chit conjugate using various models.
Для комбинированной системы на основе липосомальных форм рифампицина и комплексов левофлоксацина с полимерными конъюгатами производных β-циклодекстрина с хитозаном установлено, что высвобождение левофлоксацина замедляется, однако описывается моделью Хигучи в обоих случаях. Высвобождение рифампицина из липосом при образовании комплексов с полимерными конъюгатами характеризуется сменой модели Хигучи на модель Корсмейера-Пеппаса с определяющим типом диффузии против закона Фика.For a combined system based on liposomal forms of rifampicin and levofloxacin complexes with polymer conjugates of β-cyclodextrin derivatives with chitosan, it was found that the release of levofloxacin slows down, but is described by the Higuchi model in both cases. The release of rifampicin from liposomes during the formation of complexes with polymer conjugates is characterized by a change from the Higuchi model to the Korsmeyer-Peppas model with a determining type of diffusion against the Fick law.
Исследование антибактериальной активности комбинированных систем.Study of antibacterial activity of combined systems.
Исследование антибактериальной активности систем проводилась методом диффузии в агаре [Balouiri M., Sadiki M., Ibnsouda S.K. Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review // Journal of Pharmaceutical Analysis. - 2016. - V. 6, № 2. - P. 71-79] на двух штаммах: грамотрицательных бактериях Escherichia coli ATCC 25922 и грамположительных бактериях Bacillus subtilis ATCC 6633.The study of the antibacterial activity of the systems was carried out using the agar diffusion method [Balouiri M., Sadiki M., Ibnsouda S.K. Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review // Journal of Pharmaceutical Analysis. - 2016. - V. 6, No. 2. - P. 71-79] on two strains: gram-negative bacteria Escherichia coli ATCC 25922 and gram-positive bacteria Bacillus subtilis ATCC 6633.
Определены МИК для свободных препаратов Лев и Риф, а также их формуляций (табл. 4).MICs were determined for free Lev and Rif preparations, as well as their formulations (Table 4).
Таблица 4. Значения МИК (мкг/мл) исследуемых образцов.Table 4. MIC values (μg/ml) of the studied samples.
(Лев : Риф = 4 : 1 по моль) Lev-NH 2 -CD-Hit + LRif DPPH:CL 80:20
(Leo:Reef = 4:1 by mole)
Исследование in vitro свойств данной системы было проведено только на B. subtilis, поскольку высокие значения МИКРиф для E. coli не позволяют использовать концентрации Лев, приемлемые для используемой методики.The in vitro study of the properties of this system was carried out only on B. subtilis, since the high MIC values of Reef for E. coli do not allow the use of Lev concentrations acceptable for the method used.
Таким образом, установлено, что Лев-NH2-ЦД-Хит + ЛРиф ДПФХ:КЛ 80:20 проявляет антибактериальную активность против грамположительных бактерий, МИК составляет 0,24 ± 0,02 мкг/мл. В качестве контроля использовали комбинацию свободных лекарственных молекул в заданном соотношении. Показано, что комбинированная система обладает сравнимым действием с контролем, что указывает на отсутствие негативного влияния системы доставки на in vitro свойства лекарственной композиции.Thus, it was established that Lev-NH 2 -CD-Chit + LRif DPPC:CL 80:20 exhibits antibacterial activity against gram-positive bacteria, MIC is 0.24 ± 0.02 μg/ml. A combination of free drug molecules in a given ratio was used as a control. It was shown that the combined system has a comparable effect with the control, which indicates the absence of a negative effect of the delivery system on the in vitro properties of the drug composition.
Claims (6)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2838145C1 true RU2838145C1 (en) | 2025-04-11 |
Family
ID=
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2223764C1 (en) * | 2002-07-16 | 2004-02-20 | Закрытое акционерное общество "АИП-Наука" | Method for preparing rifampicin liposomal form |
| RU2354378C1 (en) * | 2007-07-09 | 2009-05-10 | Открытое акционерное общество "Химико-фармацевтический комбинат "АКРИХИН" (ОАО "АКРИХИН") | Combined anti-tuberculosis preparation |
| RU2642786C2 (en) * | 2015-01-30 | 2018-01-26 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) | Liposomal suspensions stabiliser |
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2223764C1 (en) * | 2002-07-16 | 2004-02-20 | Закрытое акционерное общество "АИП-Наука" | Method for preparing rifampicin liposomal form |
| RU2354378C1 (en) * | 2007-07-09 | 2009-05-10 | Открытое акционерное общество "Химико-фармацевтический комбинат "АКРИХИН" (ОАО "АКРИХИН") | Combined anti-tuberculosis preparation |
| RU2642786C2 (en) * | 2015-01-30 | 2018-01-26 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) | Liposomal suspensions stabiliser |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Wean Sin Cheow et al. Factors affecting drug encapsulation and stability of lipid-polymer hybrid nanoparticles / Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2011, V. 85, N. 2, pp. 214-220. Irina M. Le-Deygen et al. Conjugates of Chitosan with -Cyclodextrins as Promising Carriers for the Delivery of Levofloxacin: Spectral and Microbiological Studies / Life, 2023, V. 13, N. 2, pp. 272 (1-15). Jacopo Forte et al. Mucoadhesive Rifampicin-Liposomes for the Treatment of Pulmonary Infection by Mycobacterium abscessus: Chitosan or ε-Poly-L-Lysine Decoration / Biomolecules, 2023, V. 13, N. 6, pp. 924 (1-20). * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Molinaro et al. | Leukocyte-mimicking nanovesicles for effective doxorubicin delivery to treat breast cancer and melanoma | |
| Rezaei et al. | Evaluation of release kinetics and mechanisms of curcumin and curcumin-β-cyclodextrin inclusion complex incorporated in electrospun almond gum/PVA nanofibers in simulated saliva and simulated gastrointestinal conditions | |
| Ray et al. | Polysorbate 80 coated crosslinked chitosan nanoparticles of ropinirole hydrochloride for brain targeting | |
| Menon et al. | Polymeric nanoparticles for pulmonary protein and DNA delivery | |
| TWI638667B (en) | Membrane encapsulated nanoparticle and method of use | |
| US10117886B2 (en) | Hyaluronidase and a low density second PEG layer on the surface of therapeutic-encapsulated nanoparticles to enhance nanoparticle diffusion and circulation | |
| Lin et al. | Hybrid bicelles as a pH-sensitive nanocarrier for hydrophobic drug delivery | |
| Mohamed-Ahmed et al. | Noncovalent complexation of amphotericin-B with poly (α-glutamic acid) | |
| R Naik et al. | Liposomes as potential carrier system for targeted delivery of polyene antibiotics | |
| JP2019513837A (en) | Anti-infective composition comprising phytoglycogen nanoparticles | |
| Atre et al. | A brief overview of quality by design approach for developing pharmaceutical liposomes as nano-sized parenteral drug delivery systems | |
| CN100562341C (en) | Application of Drug-loaded Micelle Targeting Chitooligosaccharide-Fatty Acid Graft to the Nucleus | |
| CN107158377B (en) | Light-controlled temperature-sensitive liposome and preparation method and application thereof | |
| EP3616726B1 (en) | Protein particle wrapped with medicine insoluble in water and preparation method therefor | |
| RU2838145C1 (en) | Lipid-polymer system for simultaneous delivery of two antibacterial compounds | |
| Ning et al. | Carboxymethyl dextran-coated liposomes: Toward a robust drug delivery platform | |
| Karewicz | Polymeric and liposomal nanocarriers for controlled drug delivery | |
| Charumathy et al. | Recent update on liposome-based drug delivery system | |
| Shariatinia | Functionalized chitosan in drug delivery | |
| TWI472341B (en) | Oligomeric nanoparticle complex release system | |
| CN112516071A (en) | Injection preparation of 3-boranophenyl-1-carbamic acid cholesterol ester and preparation method thereof | |
| Malviya et al. | Nanosponges: A Targeted Drug Delivery System | |
| Kumar et al. | Nanotechnology: A focus on treatment of tuberculosis | |
| Haranath et al. | Impact of Vroman’s Effect on Pharmacodynamics and Pharmacokinetics on Nanoparticulate Drug Delivery Systems | |
| Sadman et al. | Stealth Drug Delivery of Mouse Serum Albumin‐Coated Paclitaxel‐Loaded Gelatin Nanoparticles for Targeted Cancer Therapy in Mice |