RU2836935C1 - Коллагенсодержащий гидрогель из опорных и соединительных тканей человека и способ его получения - Google Patents
Коллагенсодержащий гидрогель из опорных и соединительных тканей человека и способ его получения Download PDFInfo
- Publication number
- RU2836935C1 RU2836935C1 RU2024106062A RU2024106062A RU2836935C1 RU 2836935 C1 RU2836935 C1 RU 2836935C1 RU 2024106062 A RU2024106062 A RU 2024106062A RU 2024106062 A RU2024106062 A RU 2024106062A RU 2836935 C1 RU2836935 C1 RU 2836935C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- solution
- collagen
- hydrogel
- added
- centrifuged
- Prior art date
Links
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 title claims abstract description 70
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 title claims abstract description 70
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 title claims abstract description 68
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 title claims abstract description 53
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 title claims abstract description 17
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 title claims abstract description 17
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 17
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 30
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 29
- 239000012620 biological material Substances 0.000 claims abstract description 19
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 claims abstract description 18
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims abstract description 10
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 claims abstract description 10
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 claims abstract description 10
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 9
- SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N L-rhamnopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N 0.000 claims abstract description 9
- PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N L-rhamnose Natural products CC(O)C(O)C(O)C(O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 9
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 9
- 239000002696 acid base indicator Substances 0.000 claims abstract description 9
- 239000003513 alkali Substances 0.000 claims abstract description 9
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 claims abstract description 9
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 claims abstract description 9
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 claims abstract description 9
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims abstract description 9
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- 229960003531 phenolsulfonphthalein Drugs 0.000 claims abstract description 9
- 230000005855 radiation Effects 0.000 claims abstract description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 69
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 3
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 abstract description 5
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 abstract description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 31
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 26
- 239000000463 material Substances 0.000 description 24
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 21
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 20
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 20
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 12
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 10
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 10
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 10
- 230000009965 odorless effect Effects 0.000 description 10
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 7
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- 229940096422 collagen type i Drugs 0.000 description 6
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 239000000512 collagen gel Substances 0.000 description 5
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 5
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 101710150334 Spectrin beta chain, non-erythrocytic 2 Proteins 0.000 description 4
- 102100031864 Spectrin beta chain, non-erythrocytic 2 Human genes 0.000 description 4
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 239000000515 collagen sponge Substances 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 4
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 4
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 4
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010042106 Collagen Type IX Proteins 0.000 description 3
- 102000004427 Collagen Type IX Human genes 0.000 description 3
- 102100029376 Cryptochrome-1 Human genes 0.000 description 3
- 101710119765 Cryptochrome-1 Proteins 0.000 description 3
- 102000007301 ELAV-Like Protein 3 Human genes 0.000 description 3
- 108010008796 ELAV-Like Protein 3 Proteins 0.000 description 3
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 3
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 3
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100025310 Integrin alpha-10 Human genes 0.000 description 3
- 102100031837 Neuroblast differentiation-associated protein AHNAK Human genes 0.000 description 3
- 102100026747 Osteomodulin Human genes 0.000 description 3
- 102100025733 Protein Jumonji Human genes 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 3
- 210000001691 amnion Anatomy 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 3
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 3
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 3
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 3
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 3
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 3
- 108010035006 integrin alpha 10 Proteins 0.000 description 3
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 108010078960 osteoadherin Proteins 0.000 description 3
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 3
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 3
- 238000002278 reconstructive surgery Methods 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 3
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 3
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 3
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 3
- 102000006268 Alanine-tRNA ligase Human genes 0.000 description 2
- 108010058060 Alanine-tRNA ligase Proteins 0.000 description 2
- 102100037468 Bifunctional peptidase and arginyl-hydroxylase JMJD5 Human genes 0.000 description 2
- 102000009268 Collagen Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010048623 Collagen Receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000000503 Collagen Type II Human genes 0.000 description 2
- 108010041390 Collagen Type II Proteins 0.000 description 2
- 108010043741 Collagen Type VI Proteins 0.000 description 2
- 102000002734 Collagen Type VI Human genes 0.000 description 2
- 101001025948 Homo sapiens Bifunctional peptidase and arginyl-hydroxylase JMJD5 Proteins 0.000 description 2
- 101001056567 Homo sapiens Protein Jumonji Proteins 0.000 description 2
- 241001417092 Macrouridae Species 0.000 description 2
- 101710154564 Neuroblast differentiation-associated protein AHNAK Proteins 0.000 description 2
- 101710109667 Spectrin beta chain Proteins 0.000 description 2
- 235000009233 Stachytarpheta cayennensis Nutrition 0.000 description 2
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 235000015110 jellies Nutrition 0.000 description 2
- 239000008274 jelly Substances 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonium chloride Substances [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100137549 Arabidopsis thaliana PRF5 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010042086 Collagen Type IV Proteins 0.000 description 1
- 102000004266 Collagen Type IV Human genes 0.000 description 1
- 102100033601 Collagen alpha-1(I) chain Human genes 0.000 description 1
- 102100029136 Collagen alpha-1(II) chain Human genes 0.000 description 1
- 102100031544 Collagen alpha-1(XXVII) chain Human genes 0.000 description 1
- 102100029078 Collagen alpha-1(XXVIII) chain Human genes 0.000 description 1
- 102100036213 Collagen alpha-2(I) chain Human genes 0.000 description 1
- 102100033781 Collagen alpha-2(IV) chain Human genes 0.000 description 1
- 102100030976 Collagen alpha-2(IX) chain Human genes 0.000 description 1
- 102100031518 Collagen alpha-2(VI) chain Human genes 0.000 description 1
- 108050001049 Extracellular proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000005033 Fourier transform infrared spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000771163 Homo sapiens Collagen alpha-1(II) chain Proteins 0.000 description 1
- 101000940372 Homo sapiens Collagen alpha-1(XXVII) chain Proteins 0.000 description 1
- 101000770661 Homo sapiens Collagen alpha-1(XXVIII) chain Proteins 0.000 description 1
- 101000875067 Homo sapiens Collagen alpha-2(I) chain Proteins 0.000 description 1
- 101000710876 Homo sapiens Collagen alpha-2(IV) chain Proteins 0.000 description 1
- 101000919645 Homo sapiens Collagen alpha-2(IX) chain Proteins 0.000 description 1
- 101000941585 Homo sapiens Collagen alpha-2(VI) chain Proteins 0.000 description 1
- 101000775053 Homo sapiens Neuroblast differentiation-associated protein AHNAK Proteins 0.000 description 1
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 1
- 101150054426 PRO4 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 101710092024 Protein Jumonji Proteins 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 1
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002001 anti-metastasis Effects 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000006065 biodegradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002308 calcification Effects 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000036570 collagen biosynthesis Effects 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000005115 demineralization Methods 0.000 description 1
- 230000002328 demineralizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 1
- 210000003195 fascia Anatomy 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- -1 for example Proteins 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 210000003035 hyaline cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 230000001146 hypoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000004957 immunoregulator effect Effects 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 1
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000005959 oncogenic signaling Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 230000035409 positive regulation of cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000000575 proteomic method Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000001698 pyrogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- 230000025366 tissue development Effects 0.000 description 1
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к области реконструктивно-регенеративной медицины. Способ получения коллагенсодержащего гидрогеля для регенерации опорных и соединительных тканей человека с концентрацией коллагена 1,86-3,00 мг/мл заключается в том, что биоматериалы опорных и соединительных тканей человека, изготовленные из биоимплантатов торговой марки «Лиопласт», измельчают на лабораторной мельнице при комнатной температуре с последующей экстракцией полученной массы в 30% уксусной кислоте в течение 7 дней при температуре 5°С; полученный раствор центрифугируют, в него добавляют кислотно-основный индикатор феноловый красный и нейтрализуют слабым раствором щелочи до достижения значения рН=7,2-7,4, охлаждают раствор и добавляют в него бидистиллированную воду в соотношении 1:50, перемешивают и центрифугируют, проводят диализ полученного раствора с использованием диализных мешков 6-14 кДа, раствор полимеризуют путем постепенного повышения температуры до 37°С, в полученный гидрогель добавляют 1% раствор аскорбиновой кислоты и 1% водный раствор рамнозы, проводят гомогенизацию гидрогеля, лиофилизацию и стерилизацию радиационным методом. Изобретение обеспечивает создание коллагенсодержащего гидрогеля, не являющегося цитотоксичным. 4 ил., 2 табл., 4 пр.
Description
Изобретение относится к области реконструктивно-регенеративной и персонифицированной медицины и касается способа получения коллагенсодержащего бесклеточного гидрогеля из аллогенных материалов.
Регенерация опорных и соединительных тканей человека - одно из ведущих направлений и задач реконструктивной хирургии. Для этих целей в настоящее время используются разнообразные материалы, клеточные культуры, факторы, стимулирующие регенерацию. В качестве связующего звена данных компонентов широко используют гели, в том числе на основе коллагенов - важнейших белков соединительной ткани. Коллаген биосовместим, легко комбинируется с другими материалами, гидрофилен, способствует высокой пористости создаваемых конструкций, обладает оптимальным биоразложением [1, 2].
На сегодня имеется большое количество научных данных в области создания коллагенсодержащих гидрогелей. В основном в качестве источников сырья для получения таковых используют биоматериалы ксеногенного происхождения, например крысиные хвосты, кожа крупного рогатого скота и другие, а также материалы аллогенного происхождения.
Аллогенные биоматериалы имеют ряд преимуществ в сравнении с ксеногенными. Они обладают хорошей биосовместимостью, способностью к биодеградации, биомиметичностью, оптимальной механической эластичностью, способностью к обеспечению структурной поддержки и благоприятной среды для адгезии клеток, и дальнейшего развития тканей, значительно низким иммунным ответом, а также максимальным соответствием критериям репаративной регенерации в плане резорбции с замещением вновь образуемой собственной тканью.
Известен способ получения стерильного прозрачного концентрированного раствора биосовместимого коллагена для изготовления биомедицинских клеточных продуктов или трехмерных тканеинженерных конструкций [3]. Способ включает экстракцию коллагенсодержащей ткани в растворе разбавленной органической кислоты; многократную очистку кислого водно-солевого экстракта от иммуногенных макромолекул, пирогенных примесей; обычных и спорообразующих микроорганизмов, а также надмолекулярных агрегатов коллагена; доведение раствора коллагена до требуемой концентрации в нем белка.
Известен способ изготовления 3D-коллагенового матрикса на основе аллогенной или ксеногенной соединительнотканной оболочки, включающий ее механическую очистку от жировой ткани, обработку гипертоническими растворами солей, экспозицию в растворе щелочи с последующей нейтрализацией, обработку сырья раствором угольной кислоты, полученным путем насыщения воды углекислым газом высокого давления, помещения материала в морозильник при 60-80°С на 6-12 часов, лиофилизацию и стерилизацию [4].
Известен способ изготовления бесклеточного гидрогеля из Вартонова студня пуповины человека, включающий стерилизацию пуповины 10% раствором перекиси водорода, ее препарирование, фрагментирование и гомогенизацию, децеллюляризацию, отмывку от реагента и открепившихся клеток, нейтрализацию раствором гидроокиси натрия, лиофилизацию [5].
Известен способ получения коллагенового геля, включающий выделение коллагена 1 типа из сухожилий крысиных хвостов, отличающийся тем, что извлеченные из крысиных хвостов сухожилия экстрагируют в 0,5 М уксусной кислоте, раствор центрифугируют, вносят в чашку Петри, добавляют 0,8 мл 10-кратной среды М 199 и концентрированный раствор аммиака до доведения рН до 7,0-7,2 и выдерживают в течение 5 мин, полученный в результате коллагеновый гель промывают в стерильной дистиллированной воде 3 раза в течение 30 мин [6]. Данный способ взят нами за прототип.
Целью изобретения является разработка способа получения и создания коллагенсодержащего гидрогеля из аллогенных материалов опорных и соединительных тканей человека с материала с приближенным по своему составу к комплексу белковых компонентов исходного материала, не являющегося цитотоксичным.
Эта цель достигается тем, что биоматериалы опорных и соединительных тканей человека, изготовленные из биоимплантатов торговой марки «Лиопласт»®, измельчают на лабораторной мельнице при комнатной температуре с последующей экстракцией полученной массы в 30% уксусной кислоте в течение 7 дней при температуре 5°С; полученный раствор центрифугируют, в него добавляют кислотно-основный индикатор феноловый красный и нейтрализуют слабым раствором щелочи до достижения значения рН=7,2-7,4, охлаждают раствор и добавляют в него бидистиллированную воду в соотношении 1:50, перемешивают и центрифугируют, проводят диализ полученного раствора с использованием диализных мешков 6-14 кДa, раствор полимеризуют путем постепенного повышения температуры до 37°С, в полученный гидрогель добавляют 1% раствор аскорбиновой кислоты и 1% водный раствор рамнозы, проводят гомогенизацию гидрогеля, лиофилизацию и стерилизацию радиационным методом. Коллагенсодержащий гидрогель из опорных и соединительных тканей человека не является цитотоксичным, максимально приближен по своему составу к комплексу белковых компонентов исходного материала, прозрачный, однородный по структуре, обеспечивающий стабильность поддержания заданной формы с pH=7,2-7,4, не обладающий запахом, с показателем вязкости в пределах 15-28 Па*с, концентрацией коллагена 1,86-3,0 мг/мл.
Преимущества предложенного изобретения перед аналогами и прототипом:
1. В качестве исходного сырья используют аллогенные биоматериалы опорных и соединительных тканей человека торговой марки «Лиопласт»® [7,8]. Данные биоматериалы производят в Самарском Банке тканей НИИ БиоТех Самарского государственного медицинского университета (сертификат соответствия ISO 13485:2016, рег. № RU CMS-RU.PT02.00115; сертификат ISO 9001:2015, рег. № TIC 15 100 159171). Они представляют собой бесклеточные продукты матрикса, содержащие комплекс биологически активных веществ (каркасных коллагеновых и внеклеточных белков - стимуляторов и ингибиторов регенеративного процесса), необходимых для обеспечения репаративной регенерации поврежденных тканей пациента [8].
2. Основные модули производственного процесса биоматериалов «Лиопласт»®: низкочастотная ультразвуковая обработка, лиофилизация и радиационная стерилизация. Биоматериалы в процессе производства уже подверглись децеллюляризации, деминерализации, делипидизации. Кроме того, они лишены патогенов, неиммуногенны. Материалы «Лиопласт»® широко применяются в современной реконструктивной хирургии, в том числе для замещения дефектов, регенерации опорных и соединительных тканей. Поэтому производимый из них коллагенсодержащий гидрогель безопасен.
3. В материалах «Лиопласт»® сохранен приближенный к нативной ткани, комплекс белковых компонентов естественного происхождения, который сохраняется и в коллагенсодержащем гидрогеле [8]. Это необходимо в дальнейшем при его использовании для нормальной жизнедеятельности клеток, что позволяет поддерживать в физиологических параметрах репаративный характер регенеративных процессов и контролируемую пролиферацию клеток опорных и соединительных тканей. Белковый состав коллагенсодержащего геля максимально приближен по своему составу к комплексу белковых компонентов исходного материала, обеспечивает оптимальные адгезивные свойства и управление регенерацией в необходимом направлении.
4. Добавление после центрифугирования к раствору кислотно-основного индикатора фенолового красного обусловлено присутствием аналогичного компонента в составе питательной среды М199, что является важным для дальнейшей корректной оценки значения кислотности среды в процессе тестировании полученных коллагенсодержащих гидрогелей на клетках.
5. Добавление в раствор коллагена после полимеризации 1% раствора аскорбиновой кислоты необходимо для придания раствору прозрачности, а также в качестве ценного компонента, отвечающего за антиокисдантную активность и повышение уровня кислорода, что особо важно для нормальной жизнедеятельности клеток и регенерации тканей в условиях гипоксии при отсутствии должного снабжения кислородом напечатанных конструктов на этапах биопринтинга и постбиопринтинга и в перспективе для использования данного гидрогеля при восстановлении костных и хрящевых дефектов.
6. Добавление в раствор коллагена после полимеризации 1% раствора рамнозы объясняется наличием ряда ценных свойств моносахарида, таких как стимуляция пролиферации клеток и биосинтеза коллагена, модулирование биосинтеза матрикса, и наличием подтвержденной противовоспалительной и иммунорегуляторной биологической активностью, что в совокупности оказывает положительное влияние в усилении формирования опорных и соединительных тканей.
Изобретение реализуется следующим образом. Материалы «Лиопласт»®, произведенные на основе костной, хрящевой ткани, сухожилий, фасций, амниона, но не ограниченные ими, измельчают на лабораторной мельнице при комнатной температуре с последующей экстракцией полученной массы в 30% уксусной кислоте в течение 7 дней при температуре 5°С. Полученный раствор коллагена центрифугируют, тем самым отделяя раствор коллагена от нерастворенных частей биоматериала.
В полученный раствор коллагена добавляют кислотно-основный индикатор феноловый красный, затем раствор нейтрализуют слабым раствором щелочи до достижения рН 7,2-7,4 и охлаждают. В раствор коллагена добавляют бидистиллированную воду в соотношении 1:50 (гель : вода), что позволяет сократить количество повторностей отмывки исходного раствора, затем тщательно перемешивают и центрифугируют.
Полного удаления солей из полученного геля коллагена добиваются путем диализа раствора коллагена с использованием диализных мешков 6-14 кДa. После очистки раствора раствор коллагена полимеризуют путем постепенного повышения температуры до 37°С. В полученный гидрогель добавляют 1% раствор аскорбиновой кислоты и 1% водный раствор рамнозы, проводят гомогенизацию гидрогеля.
В результате получают прозрачный гидрогель, однородный по структуре, обеспечивающий стабильность поддержания заданной формы с pH=7,2-7,4, не обладающий запахом, с показателем вязкости геля (ƞ) в пределах 15-28 Па*с (при крутящем моменте - 1,33 Н*м, частоте вращения - 17,38 об/мин, напряжении сдвига - 635,31 Па, скорости сдвига - 150 с-1 и t=18-19°С).
На Фиг. 1 представлен описанный гидрогель.
Гель лиофилизируют и стерилизуют радиационным методом, что обеспечивает длительную сохранность полученного геля.
Использование коллагенсодержащего гидрогеля имеет преимущества применения в репаративной регенерации перед ксеногенными и синтетическими аналогами, благодаря наличию в биоактивном материале - гидрогелей комплекса белков с сохранением всех типов структурированного коллагена, присущего для конкретных видов соединительных и опорных тканей.
Результаты исследований коллагенсодержащих гидрогелей на примере гидрогеля, полученного из костного биоматериала «Лиопласт»®
Предлагаемый способ позволяет сохранить структуру коллагеновых белков, к примеру, коллагена I типа, целостность которого в итоговом образце гидрогеля подтверждается электрофоретическим исследованием (Фиг. 2). На Фиг. 2 представлены результаты электрофоретического исследования коллагенсодержащего гидрогеля, полученного из костных биоматериалов «Лиопласт»®, в 10% ПААГ по методу Laemmli (1979), где: 1 - маркеры (10 мкл); 2 - стандарт сравнения, коллаген I+III типа (25 мкл); 3 - коллагенсодержащий гидрогель с преимущественным содержанием коллагена I типа (лиофилизат) (35 мкл); 4 - редуцированная форма коллагена гидрогеля (р-а); 4 - белки-маркеры с указанием молекулярной массы (три эталонных белка: 25, 50, 75 кДа).
Электрофорез белков образцов исследуемых материалов проводили с использованием денатурирующей системы, в 10% полиакриламидном геле (ПААГ) по методу Laemmli. Применяли камеру для вертикального электрофореза с размерами стекол 7×8 см (WIX -easy PRO4 Mini) Wix Technology CO., LTD производства КНР.
Использовали белки-маркеры «Al blue prestained standards» (Bio-Rad,США) для градиентного геля 4-20% с молекулярной массой 10-250 кДa и тремя эталонными белками 25, 50, 75 кДа. На дорожку наносили 10 мкл исходного раствора. В качестве стандарта сравнения использовали также коллаген I+III типа С13 («Имтек», Россия). Белки исследуемых образцов солюбилизировали в буфере 0,0625 М трис-HCl, рН 6,8, содержащем 25% глицерин, 4% додецилсульфат натрия (1 мг/мл).
Перед анализом к образцам добавляли β-меркаптоэтанол (5% от полученного объема). Все материалы инкубировали на кипящей водяной бане 5-10 мин. После добавления 0,04% раствора бромфенолового синего подготовленные растворы использовали для нанесения на дорожки ПААГ: коллаген I+III типа 25 мкл, все остальные образцы по 35 мкл. Электрофорез проводили при напряжении 160-180 V в течение часа. Гели после окрашивания в растворе кумасси G-250 отмывали 7% уксусной кислотой 2-3 дня.
Полученные результаты разделения исследуемых белков в 10% ПААГ позволяют выявить наряду с молекулярной формой коллагена его полимеры, включающие большее количество цепочек и не прошедшие полную диссоциацию в ходе подготовки материала к электрофорезу. Молекулярная масса олигомеров достигает 180 кДа. Коллагенсодержащий гель, полученный по разработанному способу из костного материала «Лиопласт»®, распределяется в 10 % ПААГ подобно стандарту сравнения (коллаген I+III тип; ВКНЦ России), мигрирует в геле с такой же скоростью, что и коллаген I+III типа. Это свидетельствует о достаточно высокой степени очистки белка и сходстве его характеристик в двух сравниваемых образцах коллагена. Предварительная оценка состояния белка в образцах гидрогелей позволяет сделать вывод о расщеплении (редукции или диссоциации) коллагена с выделением трех полипептидных цепочек.
Проводили оценку аллогенных коллагенсодержащих гидрогелей, полученных из костной ткани методом ИК-Фурье спектроскопии (Фиг. 3). На Фиг. 3 представлены усредненные спектры ИК-Фурье исследуемых групп образцов, где: I - коллагенсодержащий аллогенный гидрогель (лиофилизат); II - стандартный образец коллагена I типа (Human, лиофилизат).
На спектре образца лиофилизата коллагенсодержащего гидрогеля отмечается присутствие полос, которые характерных для амидных групп, представленных полосой валентного колебания карбонильной группы ν=(С-О), характерной для Амида I (полоса поглощения при 1640 см-1) и полосами поглощения при 1551 см-1 ν=(N-H), характерными для Амида II. Также для Амида III отмечаются полосы поглощения при 1234 см-1 ν=(N-H). В сравнительном аспекте полученный спектр коллагенсодержащего материала (I) сравнивали со спектром лиофилизата человеческого коллагена I типа (Human) (II), для которого отмечаются схожие характеристики спектральных данных, что говорит о сохранности структуры коллагеновых белков на этапах технологического процесса получения гидрогеля.
Полученные из разных биоматериалов «Лиопласт»®, гидрогели не цитотоксичны, что подтверждается данными их исследования на клетках (фибробластах). Выявление жизнеспособных и поврежденных клеток в опытных и контрольных лунках проводили при помощи МТТ-теста (колориметрический метод, планшетный ридер). Колориметрический тест для оценки метаболической активности клеток. Интенсивность окрашивания количественно определяли при помощи планшетного ридера. При этом интенсивность окраски была пропорциональна числу живых клеток. Число живых и поврежденных клеток оценивали в процентах по отношению к контрольным образцам.
Для данного исследования была использована культура фибробластов. Визуализацию жизнеспособных клеток на поверхности гидрогелей проводили с помощью набора флуорофоров Live-Dead, который относится к витальным красителям, поскольку не оказывает отрицательного воздействия на морфофункциональное состояние клеток, то есть не обладает цитотоксичностью. Исследование in vitro на клеточных культурах фибробластов продемонстрировало цитоадгезивность материала и отсутствие цитотоксичности.
Схема эксперимента была следующей: Использовали 48-луночный планшет. 6 лунок - контрольные. Дно обрабатывали желатином и засевали клетки в дозе 2×104.
- 6 лунок с питательной средой без клеток.
- 6 лунок. Дно обрабатывали полученным гелем, а затем засевали клетки в той же дозе (2×104).
- 6 лунок с гелем, но без клеток.
- 6 лунок, заселенные клетками на желатине в качестве контроля.
Через 48 часов от момента заселения клеток планшет изымали из эксперимента и проводили метаболический тест (МТТ).
Результаты осмотра нативной культуры
На Фиг. 4 приведены результаты тестирования гидрогеля на клетках - фибробластах (Увеличение ×100), где:
- А, Б - 5 суток эксперимента. Контрольная культура фибробластов на поверхности, обработанной желатином, и культура фибробластов в лунках, дно которых обработаны гелем. Нативная культура. Инвертированный микроскоп. Фазовый контраст;
- В, Г - 5 суток эксперимента. Контрольная культура фибробластов и культура фибробластов в присутствии гидрогеля соответственно. Флуоресцентная визуализация клеток (набор Live-Dead). Инвертированный микроскоп с флуоресцентным модулем.
Фибробласты в контрольных лунках равномерно распределены по всему дну. Клетки четко визуализировали. Они имели вытянутую форму, в центре располагалось ядро (Фиг. 4-А). Фибробласты в опытных лунках сохраняли структуру монослоя. Клетки четко визуализировали при осмотре практически не отличались от контроля (Фиг. 4-Б). При окраске флуорофорами монослоя в контрольных лунках визуализировали жизнеспособные клетки гомогенно окрашенные в зеленый цвет. Монослой плотный. Границы клеток четко определяли (Фиг. 4-В). При окраске монослоя в опытных лунках выявляли единичные поврежденные клетки, ядра которых были окрашены ярко-красным цветом. При подсчете поврежденные клетки составляли не более 1 % от всего количества клеток, что говорило об их незначительном повреждении (Фиг. 4-Г).
Результаты МТТ - теста представлены в Таблице 1. Жизнеспособность клеток в опытных группах достоверно снижалась на 28,7% по сравнению с контролем.
Таблица 1
| Показатели | Клетки (контроль) | Среда 10% | Клетки+Гидрогель (опыт) | Среда+Гидрогель |
| Оптическая плотность (Е): Среднее, М Ошибка среднего, m Жизнеспособность клеток (% от контроля) Количество лунок, n Уровень значимости р (сравнение с контролем) |
0,939 0,053 100% 6 |
0,094 0,002 6 |
0,696 0,051 71,3%* 6 р=0,006 (р<0,05) |
0,091 0,001 6 |
% = (Еопыт-Есреда+гель)/(Еконтр.-Есреда)*100.
* жизнеспособность клеток в опытных группах достоверно снижается на 28,7% по сравнению с контролем.
Материал содержит набор белков, необходимых для осуществления репаративного процесса напечатанного конструкта, что подтверждается данными протеомного анализа. Присутствие в биополимере широкого спектра специфических белков естественного происхождения, обладающих как ингибирующим, так и стимулирующим действием на процессы пролиферации и дифференцировки клеток, позволяет поддерживать в физиологических параметрах репаративный характер регенеративных процессов и контролируемую пролиферацию клеток опорных тканей. Эти белки вызывают антиметастатические процессы, ингибируют онкогенную передачу сигналов. Белковый состав данного скаффолда обеспечивает их оптимальные адгезивные свойства и управление регенерацией в необходимом направлении.
Сравнительные результаты масс-спектрометрического анализа аллогенного коллагенсодержащего гидрогеля, полученного из костного биоматериала «Лиопласт»® с данным же материалом до обработки представлены в Таблице 2.
Таблица 2
| № п/п | Белки нативной костной ткани | Белки гидрогеля костной ткани | Кодирующий ген | Масса, кДа |
| 1. | Collagen alpha-2(I) chain | Collagen alpha-2(I) chain | COL1A2 | 129.2 |
| 2. | Collagen alpha-1(I) chain | Collagen alpha-1(I) chain | COL1A1 | 138.9 |
| 3. | Collagen alpha-1(II) chain | Collagen alpha-1(II) chain | COL2A1 | 141.7 |
| 4. | Collagen alpha-2(IV) chain | Collagen alpha-2(IV) chain | COL4A2 | 167.4 |
| Collagen alpha-2(VI) chain | Collagen alpha-2(VI) chain | COL6A2 | 108.0-168.0 | |
| 5. | Collagen alpha-2(IX) chain | Collagen alpha-2(IX) chain | COL9A2 | 65.1 |
| Collagen alpha-2(XII) chain | Collagen alpha-2(XII) chain | COL12A2 | 108.0-168.0 | |
| 6. | Collagen alpha-1(XXVII) chain | Collagen alpha-1(XXVII) chain | COL27A1 | 186.8 |
| 7. | Collagen alpha-1(XXVIII) chain | Collagen alpha-1(XXVIII) chain | COL28A1 | 116.6 |
| 8. | Integrin alpha-10 | Integrin alpha-10 | ITGA10 | 127.5 |
| 9. | Spectrin beta chain (Spectrin beta chain, non-erythrocytic 2), non-erythrocytic и Neuroblast differentiation-associated protein AHNAK | Spectrin beta chain (Spectrin beta chain, non-erythrocytic 2), non-erythrocytic и Neuroblast differentiation-associated protein AHNAK | SPTBN2 AHNAK | 271.2 |
| 10. | Cryptochrome-1 | Cryptochrome-1 | CRY1 | 66.4 |
| 11. | Alanine-tRNA-ligase Alanine--tRNA ligase, mitochondrial |
Alanine-tRNA-ligase Alanine-tRNA-ligase, mitochondrial |
AARS2 | 107.6 |
| 12. | Protein Jumonji | Protein Jumonji | JARID2 | 138.3 |
| 13. | ELAV-like protein 3 | ELAV-like protein 3 | ELAVL3 | 39.5 |
| 14. | Bifunctional peptidase and arginylhydroxylase JMJD5 KDM8 | Bifunctional peptidase and arginylhydroxylase JMJD5 KDM8 | JMJD5 KDM8 |
47.2 |
| 15. | Фибронектин | Фибронектин | FN1 | 262.6 |
| 16. | Остеомодулин | Остеомодулин | OMD | 49.4 |
В образцах отмечается присутствие основных типов коллагена. Среди которых образующий фибриллы коллаген I типа; специфичный для хрящевой ткани II тип; коллаген IV типа - основной структурный компонент базальных мембран. В этой же группе IX тип коллагена, являющийся компонентом гиалинового хряща, коллаген XXVII типа, играющий важную роль при кальцификации хряща и переходе хряща в кость, а также коллаген XXVIII типа, который может действовать как связывающий клетки белок и коллагены VI и XII типов.
Наряду с этим выявлены мембранные рецепторы коллагена, интегрины - Integrin alpha-10 (ITGA10) - мембранные рецепторы коллагена, что в совокупности позволяет выдвинуть предположение об участии компонентов коллагеновых носителей в инициации сигнальных путей и каскадов ферментативных реакций в популяции клеток, развивающихся на подобных носителях. А также белки: Spectrin beta chain, non-erythrocytic 2 (SPTBN2), non-erythrocytic, Neuroblast differentiation-associated protein AHNAK, Cryptochrome-1 (CRY1), Alanine--tRNA ligase mitochondrial (AARS2), Protein Jumonji (JARID2), ELAV-like protein 3 (ELAVL3), Bifunctional peptidase and arginylhydroxylase (JMJD5), Фибронектин (FN1), Остеомодулин (OMD) и ряд других белков в органическом матриксе аллогенного коллагенсодержащего материала человека.
Таким образом, коллагенсодержащие гели, поученные разработанным способом, обладали заявленными характеристиками и могли быть использованы в дальнейшем в качестве компонента биочернил в технологии 3D-биопринтинга, создании инъекционных (шприцевых форм), формирования комбинированных клеточных конструктов для восстановления поврежденных и разрушенных опорных, соединительных и эпителиальных тканей.
Способ создания коллагенсодержащих гелей иллюстрируется примерами.
Пример 1
Способ получения коллагенсодержащего геля из костного биоматериала «Лиопласт»®. Биоматериал измельчают на лабораторной мельнице при комнатной температуре с последующей экстракцией полученной массы в 30% уксусной кислоте в течение 7 дней при температуре 5°С; полученный раствор центрифугируют, в него добавляют кислотно-основный индикатор феноловый красный и нейтрализуют слабым раствором щелочи до достижения значения рН=7,2, охлаждают раствор и добавляют в него бидистиллированную воду в соотношении 1:50 по объему (гель:вода), перемешивают и центрифугируют, проводят диализ полученного раствора с использованием диализных мешков 6 кДa, раствор полимеризуют путем постепенного повышения температуры до 37°С, до достижения состояния состояния геля, в полученный гидрогель добавляют 1% раствора аскорбиновой кислоты и 1% водного раствора рамнозы, проводят гомогенизацию гидрогеля. Был получен прозрачный, однородный по структуре, обеспечивающий стабильность поддержания заданной формы с pH=7,2, не обладающий запахом, с показателем вязкости 15 Па*с, концентрацией коллагена 1,86 мг/мл.
Получение лиофилизата коллагенового геля осуществляли на аппарате лиофильной сушилки марки «AK Lyogene 2-55» (Россия). Время лиофилизации - 17 часов; значение температуры конденсора: -76°С; значение параметра вакуумирования: 0,100 мбар; значение температуры полок: +37°С. Итоговый образец представляет собой однородную коллагеновую губку без запаха белого цвета, которую, а дальнейшем подвергали стерилизации радиационным методом - гамма-облучением.
Пример 2
Способ получения коллагенсодержащего геля из биоматериала хряща «Лиопласт»®. Хрящ измельчают на лабораторной мельнице при комнатной температуре с последующей экстракцией полученной массы в 30% уксусной кислоте в течение 7 дней при температуре 5°С; полученный раствор центрифугируют, в него добавляют кислотно-основный индикатор феноловый красный и нейтрализуют слабым раствором щелочи до достижения значения рН=7,4, охлаждают раствор и добавляют в него бидистиллированную воду в соотношении 1:50, перемешивают и центрифугируют, проводят диализ полученного раствора с использованием диализных мешков 14 кДa, раствор полимеризуют путем постепенного повышения температуры до 37°С, в полученный гидрогель добавляют 1% раствор аскорбиновой кислоты и 1% водный раствор рамнозы, проводят гомогенизацию гидрогеля. Был получен прозрачный, однородный по структуре, обеспечивающий стабильность поддержания заданной формы с pH=7,4, не обладающий запахом, с показателем вязкости 28 Па*с, концентрацией коллагена 1,54 мг/мл.
После аналогичной лиофилизации итоговый образец геля представляет собой однородную коллагеновую губку без запаха белого цвета, которую в дальнейшем подвергали стерилизации радиационным методом - гамма-облучением.
Пример 3
Способ получения коллагенсодержащего геля из биоматериала сухожилия «Лиопласт»®. Сухожилие измельчают на лабораторной мельнице при комнатной температуре с последующей экстракцией полученной массы в 30% уксусной кислоте в течение 7 дней при температуре 5°С; полученный раствор центрифугируют, в него добавляют кислотно-основный индикатор феноловый красный и нейтрализуют слабым раствором щелочи до достижения значения рН=7,3, охлаждают раствор и добавляют в него бидистиллированную воду в соотношении 1:50, перемешивают и центрифугируют, проводят диализ полученного раствора с использованием диализных мешков 10 кДa, раствор полимеризуют путем постепенного повышения температуры до 37°С в течение получаса, в полученный гидрогель добавляют 1% раствор аскорбиновой кислоты и 1% водный раствор рамнозы, проводят гомогенизацию гидрогеля. Был получен прозрачный, однородный по структуре, обеспечивающий стабильность поддержания заданной формы с pH=7,3, не обладающий запахом, с показателем вязкости 24 Па*с, концентрацией коллагена 3,00 мг/мл.
После аналогичной лиофилизации итоговый образец геля представляет собой однородную коллагеновую губку без запаха белого цвета, которую в дальнейшем подвергали стерилизации радиационным методом - гамма-облучением.
Пример 4
Способ получения коллагенсодержащего геля из биоматериала «Лиопласт»® амниона. Амнион измельчают на лабораторной мельнице при комнатной температуре с последующей экстракцией полученной массы в 30% уксусной кислоте в течение 7 дней при температуре 5°С; полученный раствор центрифугируют, в него добавляют кислотно-основный индикатор феноловый красный и нейтрализуют слабым раствором щелочи до достижения значения рН=7,2, охлаждают раствор и добавляют в него бидистиллированную воду в соотношении 1:50, перемешивают и центрифугируют, проводят диализ полученного раствора с использованием диализных мешков 8 кДa, раствор полимеризуют путем постепенного повышения температуры до 37°С, в полученный гидрогель добавляют 1% раствор аскорбиновой кислоты и 1% водный раствор рамнозы, проводят гомогенизацию гидрогеля. Был получен прозрачный, однородный по структуре, обеспечивающий стабильность поддержания заданной формы с pH=7,2, не обладающий запахом, с показателем вязкости 24 Па*с, концентрацией коллагена 2,33 мг/мл.
После аналогичной лиофилизации итоговый образец геля представляет собой однородную коллагеновую губку без запаха белого цвета, которую в дальнейшем подвергали стерилизации радиационным методом - гамма-облучением.
Таким образом, полученные коллагенсодержащие гели могут быть использованы в дальнейшем в качестве компонента биочернил в технологии 3D-биопринтинга при создании инъекционных (шприцевых форм), формировании комбинированных клеточных конструктов для восстановления поврежденных и разрушенных опорных, соединительных и эпителиальных тканей в реконструктивной хирургии.
ИСТОЧНИКИ ЛИТЕРАТУРЫ
1. Gelse K, Pöschl E, Aigner T. Collagens - structure, function, and biosynthesis. Adv Drug Deliv Rev 2003;55:1531-46. DOI: 10.1016/j.addr.2003.08.002.
2. Glowacki J, Mizuno S. Collagen scaffolds for tissue engineering. Biopolymers 2008;89:338-44. DOI: 10.1002/bip.20871.
3. Патент РФ на изобретение № 2715715 от 3.03.2020 «Стерильный прозрачный концентрированный раствор биосовместимого коллагена, способ его получения и применения».
4. Патент РФ на изобретение № 2683328 от 28.03.2019 C2 «Способ изготовления 3D коллагенового матрикса».
5. Патент РФ на изобретение № 2745995 от 5.04.2021 «Способ изготовления бесклеточного гидрогеля из вартонова студня пуповины человека для внутрисуставного применения».
6. Патент РФ на изобретение № 2791324 «Способ получения коллагенового геля для использования в медицине и косметологии».
7. Патент РФ на изобретение № 2366173 от 10.09.2009 «Способ изготовления крупноблочных лиофилизированных костных имплантатов».
8. https://lyoplast.com/manufacture/ Производство. Очистка и обработка материала. Получение биоимплантов.
Claims (1)
- Способ получения коллагенсодержащего гидрогеля для регенерации опорных и соединительных тканей человека с концентрацией коллагена 1,86-3,00 мг/мл, заключающийся в том, что биоматериалы опорных и соединительных тканей человека, изготовленные из биоимплантатов торговой марки «Лиопласт», измельчают на лабораторной мельнице при комнатной температуре с последующей экстракцией полученной массы в 30% уксусной кислоте в течение 7 дней при температуре 5°С; полученный раствор центрифугируют, в него добавляют кислотно-основный индикатор феноловый красный и нейтрализуют слабым раствором щелочи до достижения значения рН=7,2-7,4, охлаждают раствор и добавляют в него бидистиллированную воду в соотношении 1:50, перемешивают и центрифугируют, проводят диализ полученного раствора с использованием диализных мешков 6-14 кДа, раствор полимеризуют путем постепенного повышения температуры до 37°С, в полученный гидрогель добавляют 1% раствор аскорбиновой кислоты и 1% водный раствор рамнозы, проводят гомогенизацию гидрогеля, лиофилизацию и стерилизацию радиационным методом.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2836935C1 true RU2836935C1 (ru) | 2025-03-24 |
Family
ID=
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010053918A1 (en) * | 2008-11-05 | 2010-05-14 | Hancock Jaffe Laboratories, Inc. | Composite containing collagen and elastin as a dermal expander and tissue filler |
| RU2442612C2 (ru) * | 2006-08-02 | 2012-02-20 | Бакстер Интернэшнл Инк. | Быстродействующий герметик и способы его применения и изготовления |
| US20170224873A1 (en) * | 2011-09-06 | 2017-08-10 | Allergan, Inc. | Crosslinked hyaluronic acid-collagen gels for improving tissue graft viability and soft tissue augmentation |
| RU2709723C1 (ru) * | 2019-05-29 | 2019-12-19 | Эрнест Арамович Базикян | Способ регенерации костной ткани челюстей |
| RU2791324C1 (ru) * | 2021-12-27 | 2023-03-07 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Алтайский государственный университет" | Способ получения коллагенового геля для использования в медицине и косметологии |
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2442612C2 (ru) * | 2006-08-02 | 2012-02-20 | Бакстер Интернэшнл Инк. | Быстродействующий герметик и способы его применения и изготовления |
| WO2010053918A1 (en) * | 2008-11-05 | 2010-05-14 | Hancock Jaffe Laboratories, Inc. | Composite containing collagen and elastin as a dermal expander and tissue filler |
| US20170224873A1 (en) * | 2011-09-06 | 2017-08-10 | Allergan, Inc. | Crosslinked hyaluronic acid-collagen gels for improving tissue graft viability and soft tissue augmentation |
| RU2709723C1 (ru) * | 2019-05-29 | 2019-12-19 | Эрнест Арамович Базикян | Способ регенерации костной ткани челюстей |
| RU2791324C1 (ru) * | 2021-12-27 | 2023-03-07 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Алтайский государственный университет" | Способ получения коллагенового геля для использования в медицине и косметологии |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Liu et al. | Alginate/gelatin‐based hydrogel with soy protein/peptide powder for 3D printing tissue‐engineering scaffolds to promote angiogenesis | |
| US5166187A (en) | Biomaterials with a base of mixtures of collagen, chitosan and glycosaminoglycans, process for preparing them and their application in human medicine | |
| CN112980001B (zh) | 一种胶原蛋白复合透明质酸凝胶、细胞外基质仿生材料及制备方法 | |
| CN104055795B (zh) | 一种可注射植入剂及其制备方法 | |
| CN106039416A (zh) | 壳聚糖—丝胶蛋白复合生物支架及其制备方法和应用 | |
| Zhong et al. | Investigation on repairing diabetic foot ulcer based on 3D bio-printing Gel/dECM/Qcs composite scaffolds | |
| CN113663137B (zh) | 复合生物补片及其制备方法及应用 | |
| EP3511029B1 (en) | Dermal layer for grafting having improved graft survival rate and method for producing same | |
| CN110167608A (zh) | 3d可打印生物凝胶及其使用方法 | |
| CN110559486A (zh) | 用于牙槽骨缺损区植骨用复合胶原膜及其制备方法 | |
| KR20180028229A (ko) | 고농도, 고순도의 동종 콜라겐 제조 방법 및 동종 콜라겐 지지체의 제조방법 | |
| Wang et al. | A highly biocompatible CE-crosslinked collagen implant with exceptional anti-calcification and collagen regeneration capabilities for aging skin rejuvenation | |
| KR102232371B1 (ko) | 피부 이상 치료용 바이오물질 장치 및 국소 조성물 | |
| RU2836935C1 (ru) | Коллагенсодержащий гидрогель из опорных и соединительных тканей человека и способ его получения | |
| RU2836308C1 (ru) | Коллагенсодержащий гидрогель из костной ткани человека и способ его получения | |
| CN1800372A (zh) | 组织工程化细胞外基质的制备方法 | |
| JPWO2003094985A1 (ja) | 人工細胞外マトリックス及びその製造方法 | |
| WO2022178907A1 (zh) | 多肽在促进软骨再生或修复中的用途 | |
| RU2715715C1 (ru) | Стерильный прозрачный концентрированный раствор биосовместимого коллагена, способ его получения и применения | |
| CN112118860B (zh) | 用于治疗人体皮肤溃疡、烧伤以及创面的胶原蛋白-层粘连蛋白基质的生产方法 | |
| KR20060091350A (ko) | 해양생물로부터 추출된 콜라겐을 이용하여 제조된 조직공학용 고분자 지지체 및 그 콜라겐의 추출방법 | |
| US20080085211A1 (en) | Method for Sterilizing Biological Materials | |
| Wang et al. | Injectable visible light cross-linking aldehyde-based methacrylated hyaluronic acid hydrogels enhance cartilage repair via improved BMSC homing and chondrogenic differentiation | |
| RU2832796C1 (ru) | Способ получения композиции биополимерного микрогетерогенного коллагенсодержащего гидрогеля | |
| RU2791324C1 (ru) | Способ получения коллагенового геля для использования в медицине и косметологии |