RU2834894C2

RU2834894C2 - Противовирусные клетки вето центральной памяти cd8+ при гаплоидентичной трансплантации стволовых клеток

Info

Publication number: RU2834894C2
Application number: RU2022105687A
Authority: RU
Inventors: Яир РЕЙСНЕР; Эстер БАЧАР-ЛУСТИГ; Ассаф ЛАСК; Нога ОР-ГЕВА; Ротем ГИДРОН БУДОВСКИ; Ракефет СИДЛИК МУСКАТЕЛЬ
Original assignee: Йеда Ресеарч Энд Девелопмент Ко. Лтд.; Бод Оф Редженс, Зе Юнивёрсити Оф Техас Систем
Priority date: 2019-08-06
Filing date: 2020-08-06
Publication date: 2025-02-17

Abstract

Группа изобретений относится к области биотехнологии и может быть использована в медицине. Изобретение раскрывает способы получения выделенной популяции иммунных клеток, не индуцирующих реакцию «трансплантат против хозяина» (GVHD), имеющих фенотип Т-лимфоцитов центральной памяти (Тсm), причем указанные клетки являются клетками, индуцирующими толерантность, и/или обладают активностью против заболевания, а также способны возвращаться в лимфатические узлы после трансплантации. 6 н. и 18 з.п. ф-лы, 3 пр., 6 табл., 8 ил.

Description

Ссылка на родственные заявки

Согласно настоящей заявке испрашивается приоритет в соответствии с предварительной заявкой на выдачу патента США №62/883164, поданной 6 августа 2019 г., содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки во всей своей полноте.

Область техники и предшествующий уровень техники настоящего изобретения

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящее изобретение относится к клеткам вето, полученным из Т-клеток памяти, и, более конкретно, но не исключительно, к способам их получения и применения при терапии для достижения стабильной и долгосрочной трансплантации клеток или ткани.

Представление о том, что «кондиционирование» высокодозированной ×имиолучевой терапией имеет решающее значение для достижения стойкой ремиссии при аллогенной трансплантации гемопоэтических клеток (алло-НСТ) при гематологических злокачественных новообразованиях, было изменено, выделяя иммунный эффект «трансплантат против злокачественного новообразования» вновь сформированной иммунной системы, полученной от донора, в сочетании с последующей иммунотерапией. Однако снижение кондиционирования, при котором сохраняется более сильная иммунная система хозяина, способная защитить пациента от летальной инфекции в ранний период после трансплантации, также связано с повышенным риском отторжения трансплантата. При гаплоидентичной НСТ это можно преодолеть, используя насыщенные Т-клетками трансплантаты, поскольку аллореактивные Т-клетки в трансплантате способны атаковать Т-клетки хозяина и обеспечивать путь для приживления донорских стволовых клеток. Однако такие аллореактивные Т-клетки также связаны с опасной для жизни реактивностью «трансплантат против хозяина» (GVH), требующей применения сильнодействующих иммуносупрессивных лекарственных средств после трансплантации. В последние годы был достигнут некоторый прогресс в снижении тяжести реакции «трансплантат против хозяина» (GVHD) с использованием высоких доз циклофосфамида (CY) после трансплантации. Тем не менее, хроническая GVHD остается проблемой и требует длительного применения иммуносупрессивных препаратов, что неблагоприятно влияет на эффект «трансплантат против злокачественного новообразования». Кроме того, возникновение GVHD у многих пациентов связано с плохой функцией тимуса, что еще больше ограничивает адекватный противоопухолевый иммунитет.

Для того, чтобы преодолеть это препятствие, можно использовать «мегадозовую» гапло идентичную НСТ, обедненную Т-клетками, которая не связана с риском GVHD даже в отсутствие посттрансплантационной иммуносупрессивной терапии. Однако достижение приживления трансплантата после немиелоаблативного (NMA) кондиционирования остается серьезной проблемой из-за высокого уровня клонов против Т-клеток донора, выживающих после схемы кондиционирования перед трансплантацией. Одним из подходов, используемых для решения этой проблемы, является применение высокой дозы CY вскоре после трансплантации (раскрыто в публикациях РСТ №WO 2013/093920 и WO 2013/093919).

Кроме того, рассматривались различные подходы к получению клеток, индуцирующих толерантность (например, клетки вето), лишенных реактивности в отношении GVH, и их применение в качестве адъювантной терапии при трансплантации трансплантата, некоторые из которых приведены ниже.

В публикации РСТ №WO 2001/49243 раскрыто применение неаллореактивных цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL) против сторонних, где неаллореактивные CTL против сторонних получают путем направления Т-лимфоцитов донора против сторонних антигена или антигенов (в отсутствие экзогенного IL-2), при этом доза по существу обеднена Т-лимфоцитами (например, Т-клетками CD4⁺ и/или природными клетками-киллерами CD56⁺), способными развиваться в аллореактивные CTL.

В публикации РСТ №WO 2007/023491 раскрыто применение толерогенных клеток для уменьшения или предотвращения отторжения несингенного трансплантата у субъекта. Описанные толерогенные Т-регуляторные клетки (например, клетки CD4⁺CD25⁺) могут быть получены от любого донора, который является несингенным в отношении как субъекта, так и трансплантата («сторонние» толерогенные клетки). Трансплантат (например, костный мозг) может быть получен от любого донора трансплантата, являющегося аллогенным или ксеногенным по отношению к субъекту.

В публикации РСТ №WO 2010/049935 раскрыто применение не индуцирующих GVHD против сторонних клеток, имеющих фенотип Т-лимфоцитов центральной памяти (Tcm), причем клетки являются клетками, индуцирующими толерантность, и способны после трансплантации возвращаться в лимфатические узлы. Согласно WO 2010/049935 клетки получают посредством контакта несингенных мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) со сторонним антигеном или антигенами в культуре, лишенной цитокинов, и затем культивирования клеток в присутствии IL-15 в условия×, которые допускают пролиферацию клеток, имеющих фенотип Tcm.

В публикации РСТ №WO 2012/032526 раскрыто применение не индуцирующих GVHD против сторонних клеток, имеющих фенотип Tcm, при этом клетки являются клетками, индуцирующими толерантность и способными после трансплантации возвращаться в лимфатические узлы, при лечении заболевания. Согласно WO 2012/032526 клетки получают посредством контакта РВМС со сторонним антигеном или антигенами в присутствии или в отсутствие IL-21 в условиях, позволяющих исключить GVH-реактивные клетки (например, культивирование в течение 1-5 дней), а затем культивирования клеток в присутствии IL-15 в условия×, которые обеспечивают пролиферацию клеток, имеющих фенотип Tcm.

В публикации РСТ №WO 2013/035099 раскрыто применение не индуцирующих GVHD против сторонних клеток, имеющих фенотип Т-лимфоцитов центральной памяти (Tcm), причем клетки являются клетками, индуцирующими толерантность, и/или обладают активностью против заболевания, и способны возвращаться в лимфатические узлы после трансплантации. Согласно WO 2013/035099 клетки получают посредством контакта РВМС со сторонним антигеном или антигенами в присутствии IL-21 для того, чтобы обеспечить обогащение антиген-реактивных клеток, а затем культивирования клеток в присутствии IL-21, IL-15 и IL-7 в среде, свободной от антигена, обеспечивая таким образом пролиферацию клеток, имеющих фенотип Tcm.

В публикации РСТ № WO 2018/002924 раскрыты клетки вето, полученные из Т-клеток памяти, способы их получения и применения при трансплантации и лечении заболеваний. В соответствии с WO 2018/002924 клетки вето являются не индуцирующими GVHD против сторонних клетками, имеющими фенотип Tcm, являются клетками, индуцирующими толерантность, и/или обладают активностью против заболевания и способны после трансплантации возвращаться в лимфатические узлы.

Дополнительный уровень техники включает публикации РСТ № WO 2017/009852, WO 2017/009853 и WO2018/134824.

Краткое раскрытие настоящего изобретения

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящее изобретение относится к способу получения выделенной популяции клеток, не индуцирующих реакцию «трансплантат против хозяина» (GVHD), имеющих фенотип Т-лимфоцитов центральной памяти (Tcm), причем указанные клетки являются клетками, индуцирующими толерантность, и/или обладают активностью против заболевания и способны возвращаться в лимфатические узлы после трансплантации, где способ предусматривает:

(a) контакт первой популяции мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) от субъекта-донора с антителом, способным связываться с клетками, экспрессирующими CD14⁺, и отбор клеток, экспрессирующих CD14⁺, способных созревать в антиген-презентирующие клетки,

(b) загрузку антиген-презентирующих клеток вирусными пептидами,

(c) обработку второй популяции РВМС того же субъекта-донора как и для указанной первой популяции РВМС с одним или несколькими агентами, способными истощать клетки, экспрессирующие CD4⁺, CD56⁺ и CD45RA⁺, таким образом, чтобы получить популяцию клеток, содержащих Т-клетки памяти, экспрессирующие фенотип CD45RA^-CD8⁺,

(d) контакт популяции клеток, содержащей Т-клетки памяти с антиген-презентирующими клетками, загруженными вирусными пептидами, со стадии (b) в присутствии IL-21, позволяя таким образом обогащение вирус-реактивных Т-клеток памяти, и

(e) культивирование клеток, полученных на стадии (d), в присутствии IL-21, IL-15 и/или IL-7, обеспечивая таким образом пролиферацию клеток, имеющих фенотип Tcm, получая посредством этого выделенную популяцию клеток, не индуцирующих GVHD, имеющих фенотип Tcm.

(a) обеспечение популяции клеток, содержащей Т-клетки, где Т-клетки в популяции клеток содержат по меньшей мере 40% Т-клеток памяти, экспрессирующих фенотип CD45RA^-CD8⁺, и обеднены клетками, экспрессирующиими CD4⁺, CD56⁺ и CD45RA⁺, и

(b) контакт популяции клеток, содержащей Т-клетки памяти, с вирусными пептидами, происходящими из 4-10 типов вирусов, где по меньшей мере один из указанных вирусов содержит вирус ВК, в присутствии IL-21, позволяя таким образом обогащение вирус-реактивных Т-клеток памяти, и

(с) культивирование клеток, полученных на стадии (b), в присутствии IL-21, IL-15 и/или IL-7, обеспечивая таким образом пролиферацию клеток, имеющих фенотип Tcm, получая посредством этого выделенную популяцию клеток, не индуцирующих GVHD, имеющих фенотип Tcm.

(a) контакт первой популяции мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) от субъекта-донора с антителом, способным к отбору клеток, экспрессирующих CD14⁺, и отбор клеток, экспрессирующих CD14⁺, способных созревать в дендритные клетки,

(b) загрузку дендритных клеток вирусными пептидами, происходящими из 4-10 типов вирусов, где по меньшей мере один из указанных вирусов содержит вирус ВК,

(c) обработку второй популяции РВМС того же субъекта-донора, как и для указанной первой популяции РВМС с одним или несколькими агентами, способными истощать клетки, экспрессирующие CD4⁺, CD56⁺ и CD45RA⁺, с получением таким образом популяции клеток, содержащей Т-клетки памяти, экспрессирующие фенотип CD45RA^-CD8⁺,

(d) контакт популяции клеток, содержащей Т-клетки памяти, с дендритными клетками, загруженными вирусными пептидами, со стадии (b) в присутствии IL-21, позволяя таким образом обогащение вирус-реактивных Т-клеток памяти, и

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящее изобретение относится к выделенной популяции клеток, не индуцирующих GVHD, содержащей клетки, имеющие фенотип Т-лимфоцитов центральной памяти (Tcm), причем указанные клетки являются клетками, индуцирующими толерантность, и/или обладают активностью против заболевания и способны возвращаться в лимфатические узлы после трансплантации, полученной способом согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного ингредиента выделенную популяцию клеток, не индуцирующих GVHD, согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения и фармацевтически приемлемый носитель.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания у субъекта, нуждающегося в этом, причем способ предусматривает введение субъекту терапевтически эффективного количества выделенной популяции клеток, не индуцирующих GVHD, согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения, с лечением посредством этого заболевания у субъекта.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящее изобретение относится к применению выделенной популяции клеток, не индуцирующих GVHD, согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения заболевания у субъекта, нуждающегося в этом.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящее изобретение относится к способу уменьшения отторжения трансплантата и/или реакции «трансплантат против хозяина» (GVHD), и/или индукции донор-специфической толерантности у субъекта, нуждающегося в этом, где субъект нуждается в несингенном трансплантате клеток или ткани, причем способ предусматривает введение субъекту терапевтически эффективного количества выделенной популяции клеток, не индуцирующих GVHD, согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения, со снижением посредством этого отторжения трансплантата и/или GVHD у субъекта.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящее изобретение относится к применению выделенной популяции клеток, не индуцирующих GVHD, согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения для получения лекарственного средства, предназначенного для снижения отторжения трансплантата и/или реакции «трансплантат против хозяина» (GVHD), и/или индукции донор-специфической толерантности у субъекта, нуждающегося в этом, где субъект нуждается в несингенном трансплантате клеток или ткани.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения субъекта, нуждающегося в указанном несингенном трансплантате клеток или ткани, причем способ предусматривает:

(а) трансплантацию трансплантата клеток или ткани субъекту и

(b) введение субъекту терапевтически эффективного количества выделенной популяции клеток, не индуцирующих GVHD, согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения, с лечением посредством этого субъекта, нуждающегося в указанном несингенном трансплантате клеток или ткани.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящее изобретение относится к применению выделенной популяции клеток, не индуцирующих GVHD, согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения для полученного лекарственного средства, предназначенного в качестве адъювантной терапии при несингенном трансплантате клеток или ткани субъекту, где субъект нуждается в несингенном трансплантате клеток или ткани.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения субъекта, нуждающегося в трансплантации незрелых гемопоэтических клеток, причем способ предусматривает:

(a) кондиционирование субъекта согласно протоколу немиелоаблативного кондиционирования перед трансплантацией, где немиелоаблативное кондиционирование предусматривает тотальное облучение тела (TBI) и химиотерапевтическое средство, где TBI и ×имиотерапевтическое средство вводят на день от -7 до -1 перед трансплантацией (например, на день от -7 до -2, например, на день от -6 до -1, перед трансплантацией),

(b) трансплантацию субъекту дозы незрелых гемопоэтических клеток, обедненных Т-клетками, где незрелые гемопоэтические клетки, обедненные Т-клетками, содержат менее 5×10⁵ Т клеток CD3⁺ на килограмм идеальной массы тела субъекта, и где незрелые гемопоэтические клетки, обедненные Т-клетками, содержат по меньшей мере 5×10⁶ клеток CD34⁺на килограмм идеальной массы тела субъекта,

(c) введение субъекту терапевтически эффективного количества циклофосфамида, где терапевтически эффективное количество циклофосфамида содержит 25-200 мг циклофосфамида на килограмм идеальной массы тела субъекта, и где терапевтически эффективное количество циклофосфамида подлежит введению субъекту в виде двух доз через 3 и 4 дня после трансплантации незрелых гемопоэтических клеток, обедненных Т-клетками, и

(d) введение субъекту терапевтически эффективного количества выделенной популяции клеток, не индуцирующих GVHD, согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения, где выделенную популяцию клеток, не индуцирующих GVHD, вводят на день 6-9 после трансплантации незрелых гемопоэтических клеток, обедненных Т-клетками.

с лечением посредством этого субъекта, нуждающегося в трансплантации незрелых гемопоэтических клеток.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения первая популяция РВМС и вторая популяция РВМС происходят из одной и той же партии.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения Т-клетки памяти, экспрессирующие фенотип CD45RA^-CD8⁺, составляют по меньшей мере 40% Т-клеток в популяции клеток.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения агентом является антитело.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения контакт в присутствии IL-21 проводят в течение от 12 часов до 6 дней.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения контакт в присутствии IL-21 проводят в течение 3 дней.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения культивирование в присутствии любого из IL-21, IL-15 и/или IL-7 проводят в течение от 6 до 12 дней.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения культивирование в присутствии любого из IL-21, IL-15 и/или IL-7 проводят в течение 9 дней.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения культивирование дополнительно предусматривает добавление глюкозы до концентрации по меньшей мере 50 мг/дл.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения вирусные пептиды представлены на антиген-презентирующих клетках.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения антиген-презентирующие клетки получают способом, предусматривающим контакт РВМС от субъекта-донор а с антителом, способным связываться с клетками, экспрессирующими CD14⁺, и отбор клеток, экспрессирующих CD14⁺, способных созревать в антиген-презентирующие клетки.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения антиген-презентирующие клетки происходят из того же субъекта-донора, что и популяция клеток, содержащих Т-клетки памяти.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения на отбор клеток, экспрессирующих CD14⁺, не влияет адгезия к пластику.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения антиген-презентирующие клетки содержат дендритные клетки.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения дендритные клетки представляют собой зрелые дендритные клетки.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения дендритные клетки получают способом, предусматривающим культивирование клеток, экспрессирующих CD14⁺, в культуре, содержащей факторы созревания дендритных клеток.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения вирусные пептиды происходят из 1-10 типов вирусов.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения вирусные пептиды происходят из 2-10 типов вирусов.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения вирусные пептиды происходят из 4-10 типов вирусов.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения по меньшей мере один из вирусных пептидов содержит по меньшей мере один пептид из вируса ВК. Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения вирусные пептиды содержат пептид вируса Эпштейна-Барр (EBV), пептид цитомегаловируса (CMV), пептид вируса ВК и пептид аденовируса (Adv).

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения вирусные пептиды содержат по меньшей мере один из EBV-LMP2, EBV-BZLF1, EBV-EBNA1, EBV select, CMV-pp65, CMV-IE-1, Adv-пентона, Adv-гексона, BKV LT, BKV (капсид VP1), BKV (капсидный белок VP2), BKV (капсидный белок VP2, изоформа VP3), BKV (малый Т-антиген).

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения вирусные пептиды содержат по меньшей мере один из AdV5 гексона, hCMV рр65, EBV select и BKV LT.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения вирусные пептиды содержат AdV5 гексон, hCMV рр65, EBV select и BKV LT.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения вирусные пептиды дополнительно содержат по меньшей мере один тип из бактериального пептида, грибкового пептида или опухолевого пептида.

Согласно некоторым вариантам осуществления вирусные пептиды и по меньшей мере один тип из бактериального пептида, грибкового пептида или опухолевого пептида используют вместе.

Согласно некоторым вариантам осуществления вирусные пептиды и по меньшей мере один тип из бактериального пептида, грибкового пептида или опухолевого пептида используют раздельно.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения РВМС являются несингенными в отношении субъекта.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения РВМС являются алло генными в отношении субъекта.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения популяция клеток, содержащая Т-клетки памяти, является несингенной в отношении субъекта.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения популяция клеток, содержащая Т-клетки памяти, является аллогенной в отношении субъекта.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения клетки, имеющие фенотип Tcm, содержат характерный признак CD3⁺, CD8⁺, CD62L⁺, CD45RA^-, CD45RO⁺.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения клетки, имеющие фенотип Tcm, содержат по меньшей мере 30% выделенной популяции клеток, не индуцирующих GVHD.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения выделенная популяция клеток, не индуцирующих GVHD, составлена для введения в виде свежих клеток.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения выделенная популяция клеток, не индуцирующих GVHD, составлена для введения в виде криоконсервированных клеток.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения способ дополнительно предусматривает трансплантацию трансплантата клеток или ткани субъекту.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения лекарственное средство дополнительно содержит трансплантат клеток или ткани.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения способ дополнительно предусматривает введение субъекту генетически модифицированных Т-клеток.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения лекарственное средство дополнительно содержит генетически модифицированные Т-клетки.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения генетически модифицированные Т-клетки содержат CAR-T-клетки или TCR-трансгенные Т-клетки.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения трансплантат клеток или ткани содержит незрелые гемопоэтические клетки.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения заболеванием является злокачественное заболевание.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения злокачественным заболеванием является солидная опухоль или метастаз опухоли.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения злокачественным заболеванием является гематологическая злокачественная опухоль.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения злокачественное заболевание выбрано из группы, состоящей из лейкоза, лимфомы, миеломы, меланомы, саркомы, нейробластомы, рака толстой кишки, колоректального рака, рака молочной железы, рака яичников, рака пищевода, синовиальноклеточного рака, рака печени, рака поджелудочной железы и метастаза или рецидива.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения заболеванием является незлокачественное заболевание.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения незлокачественное заболевание выбрано из группы, состоящей из функциональной недостаточности или дисфункции органов, гематологического заболевания, заболевания, связанного с трансплантатом, инфекционного заболевания, генетического заболевания или нарушения, серповидноклеточной анемии, аутоимунного заболевания и метаболического нарушения.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения незлокачественное заболевание выбрано из группы, состоящей из апластической анемии, тяжелого иммунодефицитного состояния и незлокачественной недостаточности костного мозга.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения выделенная популяция клеток, не индуцирующих GVHD, предназначена для введения после трансплантата клеток или ткани (например, несингенный трансплантат клеток или ткани).

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения выделенная популяция клеток, не индуцирующих GVHD, предназначена для введения на день 6-9 после трансплантата клеток или ткани (например, несингенный трансплантат клеток или ткани).

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения выделенная популяция клеток, не индуцирующих GVHD, предназначена для введения на день 7 после трансплантата клеток или ткани (например, несингенный трансплантат клеток или ткани).

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения выделенная популяция клеток, не индуцирующих GVHD, предназначена для введения при дозе по меньшей мере 2,5×10⁶ CD8⁺ клеток на кг идеальной массы тела.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения несингенный трансплантат клеток или ткани содержит незрелые гемопоэтические клетки.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения незрелые гемопоэтические клетки содержат незрелые гемопоэтические клетки, обедненные Т-клетками.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения незрелые гемопоэтические клетки содержат по меньшей мере 5×10⁶ CD34⁺ клеток на килограмм идеальной массы тела субъекта.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения незрелые гемопоэтические клетки обеднены клетками, экспрессирующими CD3⁺и/или CD19+.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения незрелые гемопоэтические клетки содержат менее 4×10⁵ клеток, экспрессирующих CD3⁺, на кг идеальной массы тела субъекта.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения незрелые гемопоэтические клетки содержат менее 3×10⁵ клеток, экспрессирующих CD3⁺, на кг идеальной массы тела субъекта.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения незрелые гемопоэтические клетки содержат менее 2×10⁵ клеток, экспрессирующих CD3⁺, на кг идеальной массы тела субъекта.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения способ дополнительно предусматривает кондиционирование субъекта согласно протоколу немиелоаблативного кондиционирования перед трансплантацией.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения способ дополнительно предусматривает протокол немиелоаблативного кондиционирования перед трансплантацией.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения протокол немиелоаблативного кондиционирования предусматривает по меньшей мере одно из тотального облучения тела (TBI), частичного облучения тела (TLI), химиотерапевтического средства, иммунотерапии антителами или костимулирующей блокады.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения TBI содержит одну или фракционированную дозу облучения в диапазоне 1-5 Гр.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения TBI вводят на день -1 перед трансплантацией.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения TBI вводят на день трансплантации, например, утром на день 0, и трансплантацию проводят в тот же день, например, вечером.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения химиотерапевтическое средство содержит по меньшей мере одно из Флударабина, Циклофосфамида, Рапамицина, Бусульфана, Трисульфана, Мелфалана или Тиотепа.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения протокол немиелоаблативного кондиционирования предусматривает сокращение количества Т-клеток.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения протокол немиелоаблативного кондиционирования не предусматривает сокращение количества Т-клеток.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения сокращение Т-клеток проводят посредством по меньшей мере одного из антитимоцитарный глобулин (ATG) антител, анти-CD52 антител или анти-CD3 (OKT3) антител.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения способ дополнительно предусматривает введение субъекту терапевтически эффективного количества циклофосфамида после трансплантации.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящее изобретение дополнительно содержит терапевтически эффективное количество циклофосфамида, где циклофосфамид подлежит введению субъекту после несингенного трансплантата клеток или ткани.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения терапевтически эффективное количество циклофосфамида содержит 25-200 мг циклофосфамида на килограмм идеальной массы тела субъекта.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения терапевтически эффективное количество циклофосфамида подлежит введению субъекту в виде двух доз через 3 и 4 дня после трансплантата.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения протокол немиелоаблативного кондиционирования перед трансплантацией предусматривает сокращение количества Т-клеток.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения сокращение количества Т-клеток проводят посредством антитимоцитарного глобулина (ATG).

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения протокол немиелоаблативного кондиционирования перед трансплантацией не предусматривает сокращение количества Т-клеток.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения кортикостероиды не вводят.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения субъект не подвергается ×роническому лечению с профилактикой GVHD после трансплантации.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения субъектом является субъект-человек.

Если не указано иное, все технические и/или научные термины, используемые в настоящем документе, имеют то же значение, которое обычно понимается специалистом в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Хотя способы и материалы, подобные или эквивалентные тем, что описаны в настоящем документе, могут быть использованы при осуществлении на практике или при тестировании вариантов осуществления настоящего изобретения, примерные способы и/или материалы описаны ниже. В случае противоречия описание настоящего изобретения, включая определения, будет иметь преимущественную силу. Кроме того, материалы, способы и примеры являются только иллюстративными и не предназначены для обязательного ограничения.

Краткое описание чертежей

Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения описаны в настоящем документе только в качестве примера со ссылкой на прилагаемые чертежи. Обращаясь к детальному рассмотрению чертежей, следует подчеркнуть, что показанные детальные признаки приведены в качестве примера и в целях иллюстративного обсуждения вариантов осуществления настоящего изобретения. В этом отношении описание, приведенное вместе с чертежами, делает очевидным для специалистов в данной области техники как варианты осуществления изобретения могут быть реализованы на практике. На чертежах:

На фиг.1 приведена блок-схема, иллюстрирующая обработку и тестирование противовирусных клеток вето CD8⁺в соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения.

На фиг.2 представлена блок-схема обработки и тестирования СВ34⁺-обогащенных и CD3⁺CD19⁺-обедненных клеток в соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения.

На фиг.3 приведено схематическое изображение схемы кондиционирования субъекта-реципиента с трансплантатом свежих незрелых гемопоэтических клеток для применения в соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения.

На фиг.4 приведено схематическое изображение схемы кондиционирования субъекта-реципиента с трансплантатом криоконсервированных незрелых гемопоэтических клеток для применения в соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения.

На фиг.5 приведено схематическое изображение комбинированного протокола, сочетающего трансплантацию гемопоэтических стволовых клеток с несоответствующей мегадозой, обедненной Т-клетками, с посттрансплантационной высокой дозой CY, после немиелоаблативного кондиционирования путем сокращения Т-клеток (с ATG), Флударабином и TBI 3 Гр.

На фиг.6 приведен график, иллюстрирующий, что инфузия клеток вето на день 7 позволяет преодолеть отторжение трансплантата при отсутствии сокращения Т-клеток у реципиентов. Мышам-реципиентам С3Н трансплантировали мегадозу клеток Balb/Nude (H2d) ВМ, обедненных Т-клетками, после TBI 3,5 Гр. Подвергшиеся трансплантации мыши также получали либо CY после трансплантации (100 мг/кг) надень 3-4 (обозначается Nu/BN + СТХ), либо 5×10⁶ Balb/c вето Tcm (H2d) на день 7 после трансплантации (обозначается Nu/ BN + Tcm D-7), либо и то и другое (обозначается Nu/BN + Tcm D7+СТХ). Процент донорских клеток в периферической крови анализировали с помощью FACS с использованием антител против донора и против хозяина (H2^d и H2^k). Каждая точка представляет одну мышь, принадлежащую к соответствующей группе.

На фиг.7 приведено схематическое изображение протокола лечения без ATG, который заменен введением клеток вето на день 7.

На фиг.8А-С приведена противовирусная активность клеток Tcm, как определено внутриклеточным окрашиванием INF-γ и TNF-α. Клетки Вето-Tcm совместно культивировали с соответствующей смесью вирусных пептидов (EBV, CMV, Adeno, BKV) в присутствии Brefeldin A (eBioscience) при 37°С и 5% СО₂ в течение 6 часов. Клетки фиксировали, пермеабилизировали (набор Invitrogen Fix & Perm) и иммуноокрашивали в отношении CD45, CD3, CD8, IFNγ и TNFα (BD). Положительный контроль включал независимую от TCR стимуляцию РМА/иономицином. Клетки гейтировали по лимфоцитарному гейту CD45⁺/FSC и CD3⁺CD8⁺.

Описание конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения

Принципы и реализация настоящего изобретения могут быть лучше поняты со ссылкой на чертежи и сопровождающее описание.

Перед подробным пояснением по меньшей мере одного варианта осуществления настоящего изобретения, необходимо отметить, что настоящее изобретение не обязательно ограничено в своем применении детальными признаками, изложенными в последующем описании или проиллюстрированными примерами. Настоящее изобретение допускает другие варианты осуществления или может быть осуществлено на практике или реализовано различными способами. Кроме того, следует понимать, что фразеология и терминология, используемые в настоящем документе, предназначены для целей описания и не должны рассматриваться как ограничивающие.

При реализации настоящего изобретения на практике, авторы настоящего изобретения открыли усовершенствованный протокол получения крупномасштабных доз клеток, индуцирующих толерантность (например, клетки вето), которые также обладают активностью против заболевания (например, противовирусной активностью), не индуцирующих реакцию трансплантат против хозяина (GVH). Эти клетки получали путем продуцирования вирус-презентирующих дендритных клеток (путем отбора CD14⁺ клеток из РВМС, культивирования в факторах созревания и загрузки специфической комбинацией вирусных пептидов) и последующего истощения аллореактивных клонов из Т-клеток памяти CD8 посредством специфической комбинации вирусных пептидов, используемых для активации вирусного антигена. Кроме того, авторы настоящего изобретения обнаружили, что добавление в мегадозы аллогенной трансплантации гемопоэтических клеток (алло-НСТ), обедненные Т-клетками, этих облегчающих трансплантацию клеток вето (например, вводимые после НСТ, например, на день +7 после НСТ) может повышать толерантность хозяина против Т-клеток донора, обеспечивая приживление трансплантата при отсутствии GVHD после безопасного немиелоаблативного (NMA) кондиционирования (например, предусматривающего TBI и ×имиотерапевтическое средство, такое как Флударабин), с минимальной посттрансплантационной иммуносупрессивной терапией, включающей циклофосфамид (например, день +3 и +4 после НСТ).

Кратко, немобилизованные мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) получали от донора клеток и фракционировали с использованием фиколла с получением мононукле арных клеток (MNC). MNC разделяли на две фракции, одну для получения клеток-стимуляторов (т.е. антиген-презентирующих клеток, презентирующих вирусные пептиды), а вторую для получения противовирусных клеток вето центральной памяти CD8⁺. Соответственно, клетки-стимуляторы получали из первой фракции MNC путем отбора клеток, экспрессирующих CD14⁺, из фракции MNC с помощью CD14-связывающих моноклональных антител, клетки, экспрессирующие CD14⁺, выращивали с факторами созревания дендритных клеток, включающими IL-4, GM-CSF, IFN-γ и LPS в течение 16 часов. Затем зрелые дендритные клетки (mDC) загружали вирусными пептидами, содержащими EBV, CMV, BKV и аденовирус, и облучали (например, 25 Гр). Параллельно клетки памяти обогащали второй фракцией MNC путем отрицательного отбора клеток, экспрессирующих CD4^-CD56^-CD45RA^-, с использованием CD4⁺, CD56⁺ и CD45RA⁺антител, конъюгированных с суперпарамагнитными частицами. CD4^-CD56^-CD45RA^--обедненные клетки совместно культивировали с дендритными клетками, загруженными вирусом (при соотношении клеток и DC 5:1) в течение 3 дней в среде для роста Т-клеток, лишенной цитокинов и дополненной только IL-21 (такие условия обеспечивают пролиферацию вирус-реактивных Т-клеток памяти CD8 и исключение GVH-реактивных клеток). Через 3 дня Т-клетки культивировали в присутствии IL-21, IL-15 и IL-7 еще 9 дней (такие условия обеспечивают пролиферацию клеток, имеющих фенотип Tcm). Клеточную среду заменяли каждые 2 дня, а уровни глюкозы и рН контролировали и регулировали при необходимости. Полученная популяция клеток содержит противовирусные клетки вето центральной памяти CD8⁺, как определено иммунофенотипированием (например, по экспрессии CD3⁺CD8⁺CD62L⁺CD45RO⁺) и функциональными иммунными исследованиями (например, путем оценки противовирусной активности, например, путем повторной стимуляции клеток Tcm против исходных вирусных пептидов, используемых в начале культивирования, и измерения процентного содержания клеток TNFγ⁺TNF⁺, например, с помощью FACS).

Противовирусное клетки вето центральной памяти CD8⁺способствует приживлению аллогенного трансплантата гемопоэтических клеток, обогащенных CD34⁺, обедненных CD3⁺CD19⁺(т.е. мегадозы аллогенного трансплантата гемопоэтических стволовых клеток (HSC), обедненного Т-клетками) после схемы немиелоаблативного (NMA) кондиционирования. Так, например, субъект-реципиент может получать ежедневное лечение флударабином в дни от -6 до -3 (или на день от -7 до -4) с последующим TBI низкой дозой на день -1 (или на день -2) (т.е. на день 6 - 3, на день 7 - 4, на день 1 или на день 2, соответственно, перед трансплантацией) в качестве подготовительной схемы. В дни +3 и +4 (т.е. дни 3-4 после трансплантации) пациент получает циклофосфамид (CY) с последующей инфузией клеток вето на день +7 (т.е. день +7 после трансплантации). Необязательно, ATG можно вводить ежедневно в дни от -9 до -7 (или в дни от -10 до -8) перед трансплантацией, индуцируя таким образом сокращение Т-клеток у субъекта-реципиента.

В целом, противовирусные клетки вето центральной памяти CD8⁺обеспечивают лечение заболевания (например, защиту от вирусных инфекций или лечение вирусных инфекций) в сочетании с усиленным приживлением донорских гемопоэтических клеток-предшественников благодаря их способности индуцировать иммунную толерантность к донорским клеткам. Кроме того, клетки вето обеспечивают приживление мегадозы аллогенного трансплантата HSC, обедненного Т-клетками, без длительной иммуносупрессии после безопасной немиелоаблативной схемы. Кроме того, предоставленный крупномасштабный протокол позволяет получать противовирусные клетки вето центральной памяти CD8⁺ в дозах, подходящих для применения для лечения субъекта-человека.

Таким образом, согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к способу получения выделенной популяции клеток, не индуцирующих реакцию «трансплантат против хозяина» (GVHD), имеющих фенотип Т-лимфоцитов центральной памяти (Tcm), причем указанные клетки являются клетками, индуцирующими толерантность, и/или обладают активностью против заболевания и способны возвращаться в лимфатические узлы после трансплантации, где способ предусматривает:

(c) обработку второй популяции РВМС того же субъекта-донора, как и для указанной первой популяции РВМС одним или несколькими агентами, способными истощать клетки, экспрессирующие CD4⁺, CD56⁺ и CD45RA⁺, с получением таким образом популяции клеток, содержащей Т-клетки памяти, экспрессирующие фенотип CD45RA^-CD8⁺,

(d) контакт популяции клеток, содержащей Т-клетки памяти, с антиген-презентирующими клетками, загруженными вирусными пептидами, со стадии (b) в присутствии IL-21, позволяя таким образом обогащение вирус-реактивных Т-клеток памяти, и

Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к способу получения выделенной популяции клеток, не индуцирующих реакцию «трансплантат против хозяина» (GVHD), имеющих фенотип Т-лимфоцитов центральной памяти (Tcm), причем указанные клетки являются клетками, индуцирующими толерантность, и/или обладают активностью против заболевания и способны возвращаться в лимфатические узлы после трансплантации, где способ предусматривает:

(a) обеспечение популяции клеток, содержащей Т-клетки, где Т-клетки в популяции клеток содержат по меньшей мере 40% Т-клеток памяти, экспрессирующих фенотип CD45RA^-CD8⁺, и обеднены клетками, экспрессирующими CD4⁺, CD56⁺ и CD45RA⁺, и

(b) контакт популяции клеток, содержащей Т-клетки памяти, с вирусными пептидами, происходящими из 4-10 типов вирусов, где по меньшей мере один из вирусов содержит вирус ВК, в присутствии IL-21, позволяя таким образом обогащение вирус-реактивных Т-клеток памяти, и

(c) культивирование клеток, полученных на стадии (b), в присутствии IL-21, IL-15 и/или IL-7, обеспечивая таким образом пролиферацию клеток, имеющих фенотип Tcm, получая посредством этого выделенную популяцию клеток, не индуцирующих GVHD, имеющих фенотип Tcm.

Термин «выделенные» относится к клеткам, которые были выделены из их естественной среды (например, организм человека).

Согласно одному варианту осуществления популяция клеток относится к гетерогенной смеси клеток.

В контексте настоящего изобретения термин «нет реакции «трансплантат против хозяина» или «нет GVHD» относится к существенно сниженной или отсутствующей реактивности индуцировать реакцию «трансплантат против хозяина». Таким образом, клетки согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения получают таким образом, чтобы они незначительно индуцировали реакцию «трансплантат против хозяина» (GVHD), о чем свидетельствуют выживаемость, масса и общий внешний вид субъекта подвергшегося трансплантации, через 30-120 дней после трансплантации. Способы оценки субъекта на сниженную GVHD хорошо известны специалистам в данной области техники.

Согласно одному варианту осуществления клетки согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения имеют на по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или даже 100% сниженную реактивность против хозяина по сравнению с клетками, не полученными в соответствии с настоящим изобретением.

В контексте настоящего изобретения фраза «фенотип Т-лимфоцитов центральной памяти (Tcm)» относится к подмножеству Т-клеток, которые присутствуют в лимфатических узлах. Клетки, имеющие фенотип Tcm, у человека обычно содержат характерный признак CD3⁺/CD8⁺/CD62L⁺/CD45RO⁺/CD45RA^-. Очевидно, что клетки Tcm могут экспрессировать все ×арактерные маркеры в одной клетке или могут экспрессировать только часть характерных маркеров в одной клетке. Определение фенотипа клеток можно проводить с использованием любого способа, известного специалисту в данной области техники, такого как, например, сортировка флуоресцентно-активированных клеток (FACS), или ELIS А с введение метки и захватом.

Согласно одному варианту осуществления по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 99% или даже 100% выделенной популяции клеток, не индуцирующих GVHD, имеют характерный признак клеток Tcm.

Согласно конкретному варианту осуществления клетки, имеющие фенотип Tcm, содержат 20% выделенной популяции клеток, не индуцирующих GVHD.

Согласно конкретному варианту осуществления клетки, имеющие фенотип Tcm, содержат 30% выделенной популяции клеток, не индуцирующих GVHD.

Согласно конкретному варианту осуществления клетки, имеющие фенотип Tcm, содержат 40% выделенной популяции клеток, не индуцирующих GVHD.

Согласно конкретному варианту осуществления клетки, имеющие фенотип Tcm, содержат 50% выделенной популяции клеток, не индуцирующих GVHD.

Согласно конкретному варианту осуществления клетки, имеющие фенотип Tcm, содержат 60% выделенной популяции клеток, не индуцирующих GVHD.

Согласно конкретному варианту осуществления клетки, имеющие фенотип Tcm, содержат 70% выделенной популяции клеток, не индуцирующих GVHD.

Согласно конкретному варианту осуществления приблизительно 10-20%, приблизительно 10-30%, приблизительно 10-40%, приблизительно 10-50%, приблизительно 20-30%, приблизительно 20-40%, приблизительно 30-50%, приблизительно 40-60%, приблизительно 50-70%, приблизительно 60-80%, приблизительно 70-90%, приблизительно 80-100% или приблизительно 90-100% выделенной популяции клеток, не индуцирующих GVHD, имеют характерный признак клеток Tcm.

Согласно конкретному варианту осуществления клетки, имеющие фенотип Tcm, содержат 10-30% выделенной популяции клеток, не индуцирующих GVHD.

Согласно конкретному варианту осуществления клетки, имеющие фенотип Tcm, содержат 10-50% выделенной популяции клеток, не индуцирующих GVHD.

Согласно конкретному варианту осуществления клетки, имеющие фенотип Tcm, содержат 20-40% выделенной популяции клеток, не индуцирующих GVHD.

Согласно конкретному варианту осуществления клетки, имеющие фенотип Tcm, содержат 30-50% выделенной популяции клеток, не индуцирующих GVHD.

Согласно конкретному варианту осуществления клетки, имеющие фенотип Tcm, содержат 50-70% выделенной популяции клеток, не индуцирующих GVHD.

Клетки, не индуцирующие GVHD, имеющие фенотип Tcm, согласно настоящему изобретению также упоминаются в настоящем документе как «клетки Tcm».

Как указано, клетки Tcm обычно размещаются в лимфатических узлах после трансплантации. Согласно некоторым вариантам осуществления выделенная популяция клеток согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения может размещаться в любом из лимфатических узлов после трансплантации, как например, периферических лимфатических узлах и мезентериальных лимфатических узлах. Природа размещения этих клеток позволяет им быстро и эффективно проявлять их вето-эффект.

Клетки, не индуцирующие GVHD, имеющие фенотип Tcm согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения, представляют собой клетки, индуцирующие толерантность.

В контексте настоящего изобретения фраза «клетки, индуцирующие толерантность» относится к клеткам, которые вызывают снижение реактивности клеток реципиента (например, Т-клеток реципиента) при их контакте с клетками донора по сравнению с реактивностью клеток реципиента в отсутствие введенных клеток, индуцирующих толерантность. К клеткам, индуцирующим толерантность, относятся клетки вето (т.е. Т-клетки, которые приводят к апоптозу Т-клеток хозяина при контакте с ними), как ранее описано в публикации РСТ № WO 2001/049243 и WO 2002/102971.

Термин «вето-активность» относится к иммунным клеткам (например, Т- клеткам, происходящим из донора), которые приводят к инактивации Т-клеток реципиента против донора при распознавании и связывании с клетками вето. Согласно одному варианту осуществления инактивация приводит к апоптозу Т-клеток реципиента против донора.

Клетки, не индуцирующие GVHD, имеющие фенотип Tcm, согласно настоящему изобретению также упоминаются в настоящем документе как «клетки вето».

Дополнительно или альтернативно, выделенная популяция клеток, не индуцирующих GVHD, имеющих фенотип Tcm, согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения имеет активность против заболевания.

Термин «активность против заболевания» относится к функции клеток Tcm против больных клеток. Активность против заболевания может быть непосредственно направлена против больной клетки, например, уничтожая способность больной клетки. Эта активность может быть обусловлена независимым от TCR уничтожением, опосредованным связыванием LFA1-I/CAM1 [Arditti et al., Blood (2005) 105(8):3365-71. Epub 2004 Jul 6]. Дополнительно или альтернативно, активность против заболевания может быть непрямой, например, посредством активации других типов клеток (например, Т-клетки CD4⁺, В-клетки, моноциты, макрофаги, NK-клетки), что приводит к гибели больной клетки, например, путем уничтожения, апоптоза или секреции других факторов, например, антител, цитокинов и т.д.).

Термин «противовирусная активность» относится к функции клеток Tcm против инфицированной вирусом клетки (например, экспрессия вирусного антигена/антигенов в контексте комплекса МНС-пептида на поверхности клетки). Как правило, противовирусная активность приводит к уничтожению инфицированной вирусом клетки.

Термин «противоопухолевая активность» относится к функции клеток Tcm в отношении опухолевой клетки. Обычно противоопухолевая активность приводит к гибели опухолевых клеток. Согласно конкретному варианту осуществления противоопухолевая активность включает активность трансплантата против лейкоза/лимфомы (GVL).

Больная клетка может включать, например, инфицированную вирусом клетку, бактериально инфицированную клетку, раковую клетку [например, клетку солидной опухоли или лейкоза/лимфомы, также называемые в настоящем документе активностью трансплантат против лейкоза (GVL) клеток Tcm], клетку, связанную с аутоиммунным заболеванием, клетку, связанную с аллергической реакцией, или клетку, измененную из-за стресса, радиации или возраста.

Согласно некоторым вариантам осуществления клетки, не индуцирующие GVHD, согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения, имеющие фенотип Tcm, могут быть негенетически модифицированными клетками или генетически модифицированными клетками (например, клетками, которые были генетически сконструированы для экспрессии или отсутствия экспрессии определенных генов, маркеров или пептидов или для секреции или отсутствия секреции определенных цитокинов) в зависимости от необходимого применения (например, заболевания, которое подлежит лечению). Такие определения находятся в пределах компетенции специалиста в данной области техники.

Согласно одному варианту осуществления клетки Tcm экспрессируют химерный антигенный рецептор (CAR) или модифицированный Т-клеточный рецептор (TCR).

Соответственно, клетки Tcm согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения могут быть трансдуцированы для экспрессии TCR или CAR.

В контексте настоящего изобретения «трансдукция TCR» относится к клонированию двух цепей (т.е. полипептидных цепей), таких как альфа-цепь Т-клеточного рецептора (TCR), бета-цепь TCR, гамма-цепь TCR, дельта-цепь TCR или их комбинация (например, αβ-цепи или γδ-цепи). Согласно одному варианту осуществления TCR содержит вариабельную область TCR (например, α- и β-цепи или γ- и δ-цепи). Способы трансдукции клеток (например, Т-клеток) с TCR (например, в полученные TCR-T-клетки) известны в данной области техники и раскрыты, например, в Nicholson et al. Adv Hematol. 2012, 2012:404081, Wang and Riviere Cancer Gene Ther. 2015 Mar, 22(2):85-94) и Lamers et al., Cancer Gene Therapy (2002) 9, 613-623.

В контексте настоящего изобретения «трансдукция CAR» относится к клонированию последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей химерный антигенный рецептор (CAR), где CAR содержит фрагмент распознавания антигена и фрагмент активации Т-клеток. Химерный антигенный рецептор (CAR) представляет собой искусственно сконструированный гибридный белок или полипептид, содержащий антигенсвязывающий домен антитела (например, одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv)), связанный с сигнальным доменом Т-клетки или доменом активации Т-клетки. Способ трансдукции клеток (например, Т -клеток) с CAR (например, с получением CAR-T) известен в данной области техники и раскрыт в Davila et al. Oncoimmunology. 2012 Dec 1,1(9): 1577-1583, Wang and Riviere Cancer Gene Ther. 2015 Mar,22(2):85-94) и Maus et al. Blood. 2014 Apr24, 123(17):2625-35.

Согласно одному варианту осуществления генетически модифицированные клетки Tcm экспрессируют трансгенные TCR (TCR-T) или CAR (CAR-T).

Таким образом, выделенная популяция клеток, не индуцирующих GVHD, имеющих фенотип Tcm, согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения может быть генетически модифицирована для терапии (например, противораковой клеточной терапии) путем перенаправления клеточной специфичности (например, Т-клеточной специфичности), путем стимулирования представления рецептора, направленного на антиген заболевания (например, опухолевый антигена), путем трансдукции с Т-клеточным рецептором (TCR) или химерным антигенным рецептором (CAR). Например, клетки Tcm, экспрессирующие TCR или CAR, могут быть получены для нацеливания на злокачественные заболевания, например, фолликулярную лимфому (CD20 или GD2), нейробластому (CD171), неходжкинскую лимфому (CD20), лимфому (CD19), глиобластому (IL13Ra2), хронический лимфолейкоз или CLL и острый лимфолейкоз или ALL (в обоих случаях CD19).

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящее изобретение относится к способу получения выделенной популяции клеток, не индуцирующих GVHD, имеющих фенотип Tcm.

Согласно одному варианту осуществления способ предусматривает контакт первой популяции мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) от субъекта-донора с антителом, способным связываться с клетками, экспрессирующими CD14⁺, и отбор клеток, экспрессирующих CD14⁺, способных созревать в антиген-презентирующие клетки.

Термин «субъект-донор» относится к человеку.

Согласно одному варианту осуществления субъект-донор является несингенным в отношении субъекта (например, аллогенным), как подробно раскрыто далее в настоящем документе.

Термин «мононуклеарные клетки периферический крови (РВМС)» относится к фракции образца крови, содержащей лимфоциты (включая Т-клетки, В-клетки, NK-клетки и т.д.) и моноциты.

Согласно одному варианту осуществления РВМС являются несингенными в отношении субъекта-реципиента (например, аллогенными), как подробно раскрыто далее в настоящем документе.

Согласно одному варианту осуществления РВМС, используемые для получения клеток, не индуцирующих GVHD, имеющих фенотип Tcm, являются немобилизованными (т.е. непримированными) РВМС, т.е. клетками, не полученными посредством использования лекарственных средств для воздействия на перемещение гемопоэтических предшественников (например, стволовых клеток) из костного мозга в периферическое кровообращение.

Согласно одному варианту осуществления РВМС собирали за 5-15 дней (например, 7-10 дней, например, 7 дней, например, 8 дней) до запланированной даты трансплантации гемопоэтических клеток (НСТ) (т.е. День 0), как подробно раскрыто далее в настоящем документе. Однако следует понимать, что РВМС можно собирать в любой момент времени до запланированной даты трансплантации. Такие РВМС можно ×ранить в имеющемся виде или обрабатывать, как описано ниже, а затем хранить для будущего использования (например, криоконсервированные).

Согласно одному варианту осуществления РВМС собирают у субъекта-донора с применением стандартных методик. Согласно конкретному варианту осуществления РВМС собирают с помощью лейкафереза, т.е. способа, который по существу удаляет РВМС у субъекта-донора, возвращая субъекту-донору оставшиеся компоненты крови.

Согласно одному варианту осуществления методика сбора РВМС (например, лейкаферез) обеспечивает, например, 0,01-1000×10¹⁰ мононуклеарных клеток (MNC), например, 0,1-100×10¹⁰, например, 1×10¹⁰MNC.

Согласно одному варианту осуществления методика сбора РВМС (например, лейкаферез) обеспечивает минимум 500×10⁶ мононуклеарных клеток (MNC), например, от 500×10¹⁰ до 1000×10¹⁰MNC, например, 1×10¹⁰MNC.

Согласно одному варианту осуществления РВМС собирают за одну процедуру сбора.

Согласно одному варианту осуществления РВМС собирают за две, три, четыре, пять или более процедур сбора (например, для того, чтобы получить требуемое количество MNC).

Согласно одному варианту осуществления, если РВМС собирают (например, у одного и того же субъекта-донора) за две или более процедуры сбора, РВМС можно объединять вместе (например, для дальнейшей обработки) или использовать раздельно.

Согласно одному варианту осуществления любая из вышеупомянутых коллекций может упоминаться как партия. Альтернативно, любая группа коллекций (например, от одного и того же субъекта-донора в контексте сбора в течение нескольких дней, например, 1, 2, 3, 4, 5 дней, например, 3 дней) может упоминаться как партия.

Согласно одному варианту осуществления любая из вышеупомянутых коллекций может храниться в пробирке для сбора в течение одного или нескольких дней (например, например, 1, 2, 3, 4, 5 дней, например, 1-2 дней) до дальнейшей обработки (например, выделение MNC, как раскрыто ниже).

Согласно одному варианту осуществления мононуклеарные клетки (MNC) выделяют из РВМС. Любая стандартная методика, известная в данной области техники, может быть использована для выделения MNC из РВМС. Например, согласно одному варианту осуществления собранные РВМС разводят (например, при соотношении 1:2) фосфатно-солевым буфером Дульбекко (DPBS), например, без кальция и магния и, например, с добавлением, например, 0,6% ACD-A и 0,5% 25% HAS, a MNC выделяют разделением в градиенте плотности с применением фиколла. После разделения в градиенте плотности с применением фиколла препарат MNC согласно одному варианту осуществления промывают от тромбоцитов (т.е. промытый от тромбоцитов), например, 1-5 раз, например, 1-3 раза, например, дважды, ручным центрифугированием и ресуспендируют в буфере для промывки (например, PBS с ACD-A и 0,5% 25% HSA).

Препарат РВМС или препарат МНК согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения делят на две фракции (например, равные фракции). Одну фракцию РВМС или MNC далее процессируют в антиген-презентирующие клетка (т.е. упоминаемые в настоящем документе как первая популяция РВМС), а вторую фракцию РВМС или MNC (т.е. упоминаемые в настоящем документе как вторая популяция РВМС) обогащают Т-клетками памяти CD8⁺.

Согласно одному варианту осуществления первая популяция РВМС и вторая популяция РВМС происходят из одной и той же партии.

Альтернативно, можно применять два препарата РВМС из различных процедур сбора РВМС. Таким образом, согласно одному варианту осуществления первая популяция РВМС и вторая популяция РВМС происходят из разных партий.

Согласно одному варианту осуществления антиген-презентирующие клетки (например, дендритные клетки) получают посредством сначала контакта первой популяции РВМС с антителом, способным связываться с клетками, экспрессирующими CD14⁺, и отбора клеток, экспрессирующих CD14⁺.

Согласно одному варианту осуществления антитело, способное связывать клетки, экспрессирующие CD14⁺, представляет собой CD14 моноклональное антитело. Такие антитела могут быть получены коммерческим путем, например, у BD Biosciences, Santa Cruz Biotechnology и R&D Systems.

Отбор клеток, экспрессирующих CD14⁺, с применением CD 14 моноклональных антител можно проводить с применением любого способа, известного в данной области техники, как например, посредством применения магнитно-активируемой сортировки клеток (MACS™), доступной от, например, Miltenyi Biotec, FACS сортера и/или ELISA с введением метки и захватом.

Согласно одному варианту осуществления можно комбинировать различные способы истощения/разделения, например, магнитную сортировку клеток можно комбинировать с FACS для того, чтобы повысить качество разделения или сделать возможным сортировку по нескольким параметрам.

Согласно одному варианту осуществления на отбор клеток, экспрессирующих CD14⁺, не влияет адгезия к пластику.

Согласно одному варианту осуществления клетки, экспрессирующие CD14⁺, отбирают посредством магнитных методик разделения. Различные магнитные шарики доступны из ряда источников, включая, например, Dynal (Norway), Advanced Magnetics (Cambridge, MA, U.S.A.), Immuncon (Philadelphia, U.S.A.), Immunotec (Marseille, France), Invitrogen, Stem cell Technologies (U.S. A), Cellpro (U.S. А) и Miltenyi Biotec GmbH (Germany). Альтернативно, антитела могут быть биотинилированы или конъюгированы с дигоксигенином и использоваться в сочетании с аффинными колонками, покрытыми авидином или антидигоксигенином.

Согласно одному варианту осуществления CD14 моноклональные антитела конъюгированы с магнитными частицами.

Согласно конкретному варианту осуществления магнитные частицы содержат суперпарамагнитные частицы декстрана железа.

Согласно конкретному варианту осуществления CD14-меченые клетки обрабатывают на колонке CliniMACS®.

Согласно конкретному варианту осуществления CD14-меченые клетки отбирают на SuperMACS™ II с применением колонки XS Separation.

Согласно одному варианту осуществления CD14 магнитно-меченые клетки (т.е. клетки, экспрессирующие CD14⁺) удерживаются на разделительной колонке (т.е. положительный отбор), а клетки CD14^- удаляются. Затем клетки CD14⁺ высвобождают из колонки и собирают. Согласно одному варианту осуществления образцы из каждой фракции отбирают для подсчета клеток, определения жизнеспособности и/или проведения иммунофенотипирования.

Согласно одному варианту осуществления жизнеспособность оценивают по положительной экспрессии 7AAD, т.е. клетки 7AAD⁺.

Согласно одному варианту осуществления препарат клеток, обогащенных CD14⁺, ресуспендируют при концентрации клеток, например, 1-10×10⁶ клеток/мл, например, 3×10⁶ клеток/мл, в среде для культивирования клеток (например, в среде для культивирования дендритных клеток, например, CellGro /1% HSA). Согласно одному варианту осуществления среда для культивирования клеток дополнена цитокинами и факторами роста. Определение используемых цитокинов и факторов роста находится в компетенции специалиста в данной области. Например, в среду для культивирования клеток добавляют IL -4 (например, 200-2000 МЕ/мл, например, 1000 МЕ/мл) и GM-CSF (например, 1000-4000 МЕ/мл, например, 2000 МЕ/мл). Затем клеточную суспензию засеивают (например, в планшеты для культивирования клеток, например, планшеты Cell Factory) и инкубируют в течение 12-36 часов, например, в течение 16-24 часов, например, в течение 24 часов, при 37°С, 5% CO₂.

Согласно одному варианту осуществления для того, чтобы индуцировать созревание клеток, экспрессирующих CD14⁺, в антиген-презентирующие клетки (например, дендритные клетки), препарат клеток, обогащенный CD14⁺, культивировали в присутствии факторов созревания (например, факторов созревания дендритных клеток). Определение факторов созревания находится в компетенции специалиста в данной области техники. Таким образом, согласно одному варианту осуществления засеянные (например, в планшеты для культивирования клеток, например, планшеты Cell Factory) CD14⁺-обогащенные клетки культивируют в присутствии IL-4 (например, 200-2000 МЕ/мл, например, 1000 МЕ/мл), GM-CSF (например, 1000-4000 МЕ/мл, например, 2000 МЕ/мл), LPS (например, 10-100 нг/мл, например, 40 нг/мл) и IFN-y (например, 50-500 МЕ/мл, например, 200 МЕ/мл) в течение 10-24 часов, например, в течение 14-18 часов, например, в течение 16 часов, при 37°С, 5% СО₂.

После периода культивирования антиген-презентирующие клетки (например, зрелые дендритные клетки, т.е. mDC) получают из клеточной культуры. Согласно одному варианту осуществления неадгезивные Т-клетки удаляют и антиген-презентирующие клетки (т.е. адгезивные Т-клетки) отделяют от культуральных планшетов с помощью любого способа, известного в данной области техники (например, путем добавления ледяного буфера, например, ACD-A с 0,5% буфера 25% HAS и DPBS и инкубирования на льду или пакетах с замороженным гелем в течение 10-60 минут, например, 30 минут). Собранные антиген-презентирующие клетки затем центрифугируют, промывают и ресуспендируют (например, в ACD-A с 0,5% буфера 25% HAS и DPBS).

Согласно одному варианту осуществления антиген-презентирующие клетки (например, mDC) загружены антигеном или антигенами.

В контексте настоящего изобретения фраза «загрузка» относится к присоединению антигена или антигенов (например, пептидов) к пептидам МНС (например, МНС класса I или II), представленным в комплексе пептид-МНС на поверхности антигенпрезентирующей клетки (АРС).

В контексте настоящего изобретения фраза «антиген или антигены» относится к растворимой или нерастворимой (такой как связанная с мембраной) молекуле, способной индуцировать иммунный ответ.

Например, антиген или антигены могут представлять собой целые клетки (например, живые или мертвые клетки), клеточные фракции (например, лизированные клетки), клеточные антигены (например, антигены клеточной поверхности), белковый экстракт, очищенный белок или синтетический пептид.

Согласно одному варианту осуществления антиген или антигены содержат вирусные антигены.

Согласно одному варианту осуществления вирусные антигены происходят из по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 или более различных типов вирусов.

Согласно одному варианту осуществления вирусные антигены происходят из 1-50, 1-40, 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, 2-50, 2-40, 2-30, 2-20, 2-10, 2-8, 2-6, 2-4, 3-50, 3-40, 3-30, 3-20, 3-10, 3-9, 3-7, 3-5, 3-4, 4-50, 4-40, 4-30, 4-20, 4-10, 4-8 или 4-6 типов вирусов.

Согласно конкретному варианту осуществления вирусные антигены происходят из 1-20 типов вирусов.

Согласно конкретному варианту осуществления вирусные антигены происходят из 1-10 типов вирусов.

Согласно конкретному варианту осуществления вирусные антигены происходят из 1-4 типов вирусов.

Согласно конкретному варианту осуществления вирусные антигены происходят из 2-10 типов вирусов.

Согласно конкретному варианту осуществления вирусные антигены происходят из 2-4 типов вирусов.

Согласно конкретному варианту осуществления вирусные антигены происходят из 4-20 типов вирусов.

Согласно конкретному варианту осуществления вирусные антигены происходят из 4-10 типов вирусов.

Согласно конкретному варианту осуществления вирусные антигены происходят из 4-8 типов вирусов.

Согласно конкретному варианту осуществления вирусные антигены происходят из 4-6 типов вирусов.

Примеры вирусов, из которых антигены могут происходить (т.е. происходящие из), включают без ограничения вирус Эпштейна-Барр (EBV), аденовирус (Adv), цитомегаловирус (CMV), вирусы простуды, вирусы гриппа, вирусы гепатита А, В и С, простой герпес, ВИЧ, грипп, японский энцефалит, корь, полиомиелит, бешенство, респираторно-синцитиальный вирус, краснуху, оспу, ветряную оспу, ротавирус, вирус Западного Нила, полиомавирус (например, вирус ВК), вирус Зика, парвовирус (например, парвовирус В19), вирус ветряной оспы (VZV), вирус простого герпеса (HSV), тяжелый острый респираторный синдром (SARS) и коронавирус тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2).

Конкретные примеры вирусов и их соответствующих антигенов включают без ограничения антигены вируса BK, которые включают без ограничения BKV LT, BKV (капсид VP1), BKV (капсидный белок VP2), BKV (капсидный белок VP2, изоформа VP3), BKV (малый Т-антиген), аденовирусные антигены, которые включают без ограничения Adv-пентон или Adv-гексон, антигены CMV, которые включают без ограничения оболочечный гликопротеин В, CMV IE-1 и CMV рр65, UL28, UL32,UL36, UL40, UL48,UL55,UL84, UL94, UL99 UL103, UL151, UL153, US 29, US 32, антигены EBV, которые включают без ограничения EBV LMP2, EBV BZLF1, EBV EBNA1, EBV Р18 и EBV Р23, антигены гепатита, которые включают без ограничения белки S, М и L вируса гепатита В, пре-S антиген вируса гепатита В, HBCAG DELTA, HBV НВЕ, РНК гепатита вируса С, HCV NS3 и HCV NS4, антигены вируса простого герпеса, которые включают без ограничения непосредственно ранние белки и гликопротеин D, антигены ВИЧ, которые включают без ограничения генные продукты генов gag, pol и env, такие как HIV gp32, HIV gp41, HIV gp120, HIV gp160, HIV P17/24, HIV P24, HIV P55 GAG, HIV P66 POL, HIV TAT, HIV GP36, белок Nef и обратную транскриптазу, антигены гриппа, которые включают без ограничения гемагглютинин и нейраминидазу, антигены вируса японского энцефалита, которые включают без ограничения белки Е, М-Е, M-E-NS1, NS1, NS1-NS2A и 80% Е, антигены кори, которые включают без ограничения слитый белок вируса кори, антигены бешенства, которые включают без ограничения гликопротеин бешенства и нуклеопротеин бешенства, антигены респираторно-синцитиального вируса, которые включают без ограничения слитый белок RSV и белок М2, ротавирусные антигены, которые включают без ограничения VP7sc, антигены краснухи, которые включают без ограничения белки Е1 и Е2, антигены тяжелого острого респираторного синдрома (SARS-CoV), которые включают без ограничения SI, RBD, Nuclekapsid и Plpro, антигены коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2), которые включают без ограничения S1, S2, S1 + S2 ECD, RBD, N антиген, S антиген и нуклекапсид, и антигены вируса ветряной оспы, которые включают без ограничения gpl и gpll.

Согласно одному варианту осуществления антиген или антигены содержат вирусные пептиды (или их фрагменты).

Согласно одному варианту осуществления вирусные пептиды содержат 1-50, 1-40, 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, 2-50, 2-40, 2-30, 2-20, 2-10, 2-8, 2-6, 2-4, 3-50, 3-40, 3-30, 3-20, 3-10, 3-9, 3-7, 3-5, 3-4, 4-50, 4-40, 4-30, 4-20, 4-10, 4-8 или 4-6 вирусных пептидов.

Согласно конкретному варианту осуществления вирусные пептиды содержат 4-50 вирусных пептидов (например, в одном составе или в нескольких составах).

Согласно конкретному варианту осуществления вирусные пептиды содержат 4-40 вирусных пептида (например, в одном составе или в нескольких составах).

Согласно конкретному варианту осуществления вирусные пептиды содержат 4-30 вирусных пептидов (например, в одном составе или в нескольких составах).

Согласно конкретному варианту осуществления вирусные пептиды содержат 4-20 вирусных пептидов (например, в одном составе или в нескольких составах).

Согласно конкретному варианту осуществления вирусные пептиды содержат 4-10 вирусных пептидов (например, в одном составе или в нескольких составах).

Согласно конкретному варианту осуществления вирусные пептиды содержат 4-8 вирусных пептидов (например, в одном составе или в нескольких составах).

Согласно конкретному варианту осуществления вирусные пептиды содержат 4-6 вирусных пептидов (например, в одном составе или в нескольких составах).

Согласно одному варианту осуществления вирусные пептиды содержат 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 вирусных пептидов (например, в одном составе или в нескольких составах).

Согласно конкретному варианту осуществления вирусные пептиды содержат 4 вирусных пептидов (например, в одном составе или в нескольких составах).

Согласно конкретному варианту осуществления вирусные пептиды содержат 5 вирусных пептидов (например, в одном составе или в нескольких составах).

Согласно конкретному варианту осуществления вирусные пептиды содержат 6 вирусных пептидов (например, в одном составе или в нескольких составах).

Согласно конкретному варианту осуществления вирусные пептиды содержат 8 вирусных пептидов (например, в одном составе или в нескольких составах).

Согласно конкретному варианту осуществления вирусные пептиды содержат 10 вирусных пептидов (например, в одном составе или в нескольких составах).

Согласно конкретному варианту осуществления вирусные пептиды содержат 15 вирусных пептидов (например, в одном составе или в нескольких составах).

Согласно конкретному варианту осуществления вирусные пептиды содержат 20 вирусных пептидов (например, в одном составе или в нескольких составах).

Согласно конкретному варианту осуществления вирусные пептиды содержат 30 вирусных пептидов (например, в одном составе или в нескольких составах).

Согласно конкретному варианту осуществления вирусные пептиды содержат 40 вирусных пептидов (например, в одном составе или в нескольких составах).

Согласно конкретному варианту осуществления вирусные пептиды содержат 50 вирусных пептидов (например, в одном составе или в нескольких составах).

Согласно конкретному варианту осуществления вирусные пептиды содержат пептиды из одного организма (т.е. из одного типа вируса).

Согласно конкретному варианту осуществления вирусные пептиды содержат пептиды из двух или более организмов (т.е. смесь 2, 3, 4, 5 или более типов вирусов).

Согласно одному варианту осуществления вирусные пептиды содержат пептид вируса ВК.

Согласно конкретному варианту осуществления вирусные пептиды содержат по меньшей мере один из пептида вируса Эпштейна-Барр (EBV), пептида цитомегаловируса (CMV), пептида вируса ВК и пептида аденовируса (Adv).

Согласно конкретному варианту осуществления вирусные пептиды содержат пептид вируса Эпштейна-Барр (EBV), пептид цитомегаловируса (CMV), пептид вируса ВК и пептид аденовируса (Adv).

Согласно конкретному варианту осуществления вирусные пептиды содержат по меньшей мере один из EBV-LMP2, EBV-BZLF1, EBV-EBNA1, EBV-BRAF1, EBV-BMLF1, EBV-GP340/350 EBNA2, EBV-EBNA3a, EBV-EBNA3b, EBV-EBNA3c, CMV-pp65, CMV-IE-1, Adv-пентона, Adv-гексона, BKV LT, BKV (капсид VP1), BKV (капсидный белок VP2), BKV (капсидный белок VP2, изоформа VP3) и BKV (малый Т-антиген).

Согласно конкретному варианту осуществления вирусные пептиды содержат по меньшей мере один из AdV5 гексона, hCMV рр65, EBV select (как раскрыто ниже) и BKV LT.

Специальное программное обеспечение может быть использовано для анализа последовательностей антигенов с целью выявления иммуногенных коротких пептидов, т.е. пептидов, презентируемых в контексте главного комплекса гистосовместимости (МНС) класса I или МНС класса П.

Согласно конкретному варианту осуществления антиген или антигены содержат смесь пепмиксов, которые представляют собой библиотеки перекрывающихся пептидов (например, 15-меров, перекрывающихся на 11 аминокислот), охватывающие всю белковую последовательность трех вирусов: CMV, EBV и Adeno (такие пепмиксы могут быть коммерчески доступны от, например, JPT Technologies, Berlin, Germany).

Согласно конкретному варианту осуществления вирусные пептиды содержат «EBV select», т.е. коммерческий продукт от Miltenyi Biotec, содержащий 43 рестриктированных пептида МНС класса 1 и класса 2 из 13 различных белков из EBV (например, MACS GMP PepTivator® EBV Select, например, №по каталогу 170-076-143). Дополнительно или альтернативно вирусные пептиды содержат «коллекцию EBV», т.е. коммерческий продукт от JPT, содержащий пепмикс, который включает пептиды из 14 различных антигенов. Дополнительно или альтернативно вирусные пептиды содержат PepMix™ BKV (капсидный белок VP1), PepMix™ BKV (капсидный белок VP2), PepMix™ BKV (капсидный белок VP2, изоформа VP3), PepMix™ BKV (большой Т-антиген), PepMix™ BKV (малый Т-антиген), коммерчески доступные от JPT.

Согласно другому конкретному варианту осуществления антиген или антигены содержат смесь семи пепмиксов, включающих EBV-LMP2, EBV-BZLF1, EBV-EBNA1, CMV-pp65, CMV-IE-1, Adv-пентон и Adv-гексон, при концентрации, например, 100 нг/пептид или 700 нг/смесь семи пептидов.

Согласно одному варианту осуществления антиген или антигены включают антиген или антигены инфекционного организма (например, бактериального, грибкового организма), который обычно поражает иммунно-компроментированных субъектов, таких как пациенты после трансплантации.

Согласно одному варианту осуществления антиген представляет собой бактериальный антиген, такой как без ограничения антиген сибирской язвы, грамотрицательных бацилл, хламидий, дифтерии, гемофильной палочки, Helicobacter pylori, малярии, Mycobacterium tuberculosis, токсина коклюша, пневмококка, риккетсий, стафилококка, стрептококка и столбняка.

В качестве других конкретных примеров бактериальных антигенов антигены сибирской язвы включают без ограничения защитный антиген сибирской язвы, антигены грамотрицательных бацилл включают без ограничения липополисахариды, антигены гемофильной палочки включают без ограничения капсулярные полисахариды, дифтерийные антигены включают без ограничения дифтерийный токсин, антигены Mycobacterium tuberculosis включают без ограничения миколовую кислоту, белок теплового шока 65 (HSP65), главный секретируемый белок 30 кДа и антиген 85А, антигены токсина коклюша включают без ограничения гемагглютинин, пертактин, FIM2, FIM3 и аденилатциклазу, пневмококковые антигены включают без ограничения пневмолизин и пневмококковые капсулярные полисахариды, антигены риккетсий включают без ограничения rompA, стрептококковые антигены включают без ограничения М-белки, а столбнячные антигены включают без ограничения столбнячный токсин.

Согласно одному варианту осуществления антиген представляет собой антиген супербактерий (например, бактерии с множественной лекарственной устойчивостью). Примеры супербактерий включают без ограничения Enterococcus faecium, Clostridium difficile, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa и Enterobacteriaceae (включая Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter spp.).

Согласно одному варианту осуществления антиген является грибковым антигеном. Примеры грибков включают без ограничения кандиды, кокцидиоиды, криптококки, гистоплазму, лейшманию, плазмодий, простейшие, паразитов, шистосом, опоясывающий лишай, токсоплазму и Трипаносому крузи.

В качестве других конкретных примеров грибковых антигенов кокцидиоидные антигены включают без ограничения антигены сферулы, криптококковые антигены включают без ограничения капсулярные полисахариды, антигены гистоплазмы включают без ограничения белок теплового шока 60 (HSP60), антигены лейшмании включают без ограничения gp63 и липофосфогликан, антигены Plasmodium falciparum включают без ограничения поверхностные антигены мерозоитов, повер×ностные антигены спорозоитов, циркумспорозоитные антигены, повер×ностные антигены гаметоцитов/гамет, антигены простейших и других паразитов включая гематостадийный антиген pf 155/RESA, антигены шистосом включают без ограничения глутатион-S-трансферазу и парамиозин, антигены опоясывающего лишая включают без ограничения трихофитии, антигены токсоплазмы включают без ограничения SAG-1 и р30, антигены Трипаносомы крузи включают без ограничения антиген 75-77 кДа и антиген 56 кДа.

Согласно одному варианту осуществления антиген или антигены содержат антигены, связанные со злокачественным заболеванием (например, опухолевые антигены).

Согласно одному варианту осуществления антиген представляет собой антиген (или его часть, например, антигенный эпитоп), экспрессируемый опухолевыми клетками. Согласно одному варианту осуществления антиген (или его часть) происходит из белка, экспрессируемого в гематопоэтической ткани (например, гематопоэтической злокачественной опухоли, такой как антиген лейкоза) или экспрессируемого в солидной опухоли (например, меланоме, раке поджелудочной железы, раке печени, раке желудочно-кишечного тракта и т.д.).

Примеры опухолевых антигенов включают без ограничения А33, BAGE, Вс1-2, антиген созревания В клеток (ВСМА), BCR-ABL, (3-катенин, раково-тестикулярные антигены (СТА например, MAGE-1, MAGE-A2/A3 и NY-ESO-1), СА 125, СА 19-9, СА 50, СА 27.29 (BR 27.29), СА 15-3, CD5, CD19, CD20, CD21, CD22, CD33, CD37, CD45, CD123, СЕА, c-Met, CS-1, циклин B1, DAGE, EBNA, EGFR, ELA2, эфринВ2, рецептор эстрогена, FAP, ферритин, фолат-связывающий белок, GAGE, G250/CA ГХ, GD-2, GM2, gp75, gp100 (Pmel 17), НА-1, НА-2, HER-2/neu, НМ1.24, HPV Е6, HPV Е7, hTERT, Ki-67, LRP, мезотелин, муциноподобный антиген, ассоциированный с раком (MCA), MUC1, р53, PR1, PRAME, PRTN3, RHAMM (CD168), WT-1. Дополнительные опухолевые антигены представлены в Molldrem J. Biology of Blood and Marrow Transplantation (2006) 12:13-18, Alatrash G. and Molldrem J., Expert Rev Hematol. (2011) 4(1): 37-50, Renkvist et al., Cancer Immunol Immunother (2001) 50:3-15, van der Bruggen P, Stroobant V, Vigneron N, Van den Eynde B. Peptide database: T cell-defined tumor antigens. Cancer Immun (2013), www(dot)cancerimmunity(dot)org/peptide/, Rittenhouse, Manderino, and Hass, Laboratory Medicine (1985) 16(9) 556-560, все из которых включены в настоящий документ посредством ссылки.

Согласно одному варианту осуществления антиген или антигены содержат смесь антигенов (например, смесь антигенов одной группы антигенов, как раскрыто, например, вирусных антигенов, или смесь антигенов из разных групп антигенов, например, вирусных и бактериальных антигенов, вирусных и опухолевых антигенов).

Согласно одному варианту осуществления антиген или антигены содержат смесь вирусных пептидов и опухолевых пептидов (например, в одном составе или в нескольких составах).

Согласно одному варианту осуществления антиген или антигены содержат смесь вирусных пептидов и бактериальных пептидов (например, в одном составе или в нескольких составах).

Согласно одному варианту осуществления антиген или антигены содержат смесь вирусных пептидов и грибковых пептидов (например, в одном составе или в нескольких составах).

Согласно одному варианту осуществления загрузку антиген-презентирующих клеток (например, mDC) антигеном или антигенами можно проводить с применением способа, известного в данной области техники.

Согласно одному варианту осуществления для того, чтобы загрузить (например, согласно настоящему изобретению) вирусные пептиды на антиген-презентирующие клетки (например, mDC), вирусные пептиды совместно культивируют с антиген-презентирующими клетками (например, mDC) в течение от 30 минут до 3 часов (например, 1 час) при 37°С, при 5% CO₂. Например, антиген-презентирующие клетки (например, mDC) могут быть загружены пептиваторами (например, AdV5 Гексон, HCMV рр65, EBV select и BKV LT) посредством инкубации в течение от 30 минут до 3 часов (например, 1 час) при 37°С, при 5% CO₂.

После инкубации загруженные вирусным пептидом антиген-презентирующие клетки (например, mDC) промывают и центрифугируют, например, с ACD-A с 0,5% буфера 25% HAS и DPBS, и ресуспендируют в среде для роста клеток (например, в среде для роста Т-клеток).

Согласно одному варианту осуществления загруженные антигеном или антигенами (например, вирусным пептидом) антиген-презентирующие клетки (например, mDC) облучают с помощью источника рентгеновского излучения. Таким образом, согласно одному варианту осуществления загруженные антиген-презентирующие клетки (например, mDC) облучают с приблизительно 1-5 Гр, приблизительно 5-10 Гр, приблизительно 10-20 Гр, приблизительно 10-30 Гр, приблизительно 10-40 Гр, приблизительно 10-50 Гр, приблизительно 20-30 Гр, приблизительно 20-40 Гр, приблизительно 20-50 Гр. Согласно конкретному варианту осуществления DC облучают с приблизительно 10-40 Гр (например, 25-30 Гр например, 30 Гр).

После завершения облучения загруженные антиген-презентирующие клетки (например, загруженные вирусным пептидом mDC промывают, центрифугируют и ресуспендируют в среде для клеточного роста (например, среда для роста Т-клеток).

Загруженные антигеном антиген-презентирующие клетки (например, mDC) затем готовят для применения для получения клеток Tcm из популяции клеток, содержащей Т-клетки памяти CD8, согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения.

Согласно конкретному варианту осуществления антиген-презентирующие клетки содержат дендритные клетки (DC).

Согласно конкретному варианту осуществления, антиген-презентирующие клетки содержат зрелые дендритные клетки (mDC).

Согласно конкретному варианту осуществления, по меньшей мере 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 100% антиген-презентирующих клеток содержат зрелые дендритные клетки (mDC).

Согласно конкретному варианту осуществления антиген-презентирующие клетки содержат облученные дендритные клетки.

Согласно одному варианту осуществления антиген-презентирующие клетки происходят из того же субъекта-до нора, что и популяция клеток (как раскрыто ниже).

Понятно, что антиген-презентирующие клетки могут экспрессировать все из антигенов на одной клетке или могут экспрессировать только часть антигенов на одной клетке. Более того, разные антиген-презентирующие клетки (например, в одном и том же препарате) могут экспрессировать разные антигены. Соответственно, антиген-презентирующие клетки (например, mDC) содержат гетерогенную смесь клеток.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения антиген или антигены (например, вирусные пептиды) могут быть представлены генетически модифицированными антиген-презентирующими клетками или искусственными антиген-презентирующими клетками, презентирующими антигены МНС (также называемые человеческим лейкоцитарным антигеном (HLA)), распознаваемые Т-клетками памяти CD8 (например, клеточная линия, трансфицированная антигеном или антигенами). Дополнительно или альтернативно антиген или антигены (например, вирусные пептиды) согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения могут быть отображены на искусственном носителе (например, липосоме).

Таким образом, антиген-презентирующие клетки (как раскрыто выше), клеточные линии, искусственные носители (такие как липосомы) или искусственные антиген-презентирующие клетки (например, лейкемические или фибробластные клеточные линии, трансфицированные антигеном или антигенами), могут быть использованы для представления коротких синтетических пептидов, слитых или загруженных в них, или для представления белковых экстрактов или очищенных белков. Такие короткие пептиды, белковые экстракты или очищенные белки могут быть пептидами, происходящими из вирусных, бактериальных, грибковых или опухолевых антигенов, или пептидами, представляющими любой другой антиген.

Как указано выше, способ согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения проводят посредством обеспечения популяции клеток, содержащей Т-клетки, где Т-клетки в популяции клеток содержат по меньшей мере 40% Т-клеток памяти, экспрессирующих фенотип CD45RA^-CD8⁺, и обеднены клетками, экспрессирующие CD4⁺, CD56⁺ и CD45RA⁺.

Термин «популяция клеток, содержащая Т-клетки» относится к гетерогенной смеси РВМС, содержащей Т-клетки, В-клетки и миелоидные клетки. Популяция клеток, содержащая Т-клетки, обычно включает Т-клетки, имеющие многочисленные характерные признаки, функции и способные связывать различные антигены (например, цитотоксические

Т-клетки, Т-клетки памяти, эффекторные Т-клетки и т.д.).

Согласно одному варианту осуществления популяция клеток, содержащая Т-клетки, не содержит эритроциты и гранулоциты.

В контексте настоящего изобретения термин «Т-клетки памяти» относится к подмножеству Т-лимфоцитов, которые ранее сталкивались с антигеном и реагировали на него, также упоминаемые как Т-клетки с опытом взаимодействия с антигеном.

Согласно одному варианту осуществления Т-клетки памяти содержат по меньшей мере приблизительно 20%, по меньшей мере приблизительно 30%, по меньшей мере приблизительно 40%, по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 99% или даже 100% Т-клеток в популяции клеток.

Понятно, что в нормальных условиях (т.е. при определении у здорового субъекта) уровень Т-клеток памяти составляет менее 20% от общего числа клеток в популяции клеток, содержащей Т-клетки.

Согласно одному варианту осуществления Т-клетки памяти содержат Т-клетки, экспрессирующие маркер CD8 (т.е. Т-клетки CD8⁺).

Согласно другому варианту осуществления Т-клетки памяти имеют фенотип CD8⁺CD45RO⁺.

Согласно другому варианту осуществления Т-клетки памяти имеют фенотип CD8⁺CD45RA^-.

Согласно другому варианту осуществления Т-клетки памяти имеют фенотип CD8⁺CD45RO⁺CD45RA^-.

Согласно одному варианту осуществления Т-клетки памяти лишены клеток CD45RA⁺.

Согласно одному варианту осуществления Т-клетки памяти лишены клеток CD4⁺ и/или CD56⁺.

Отбор Т-клеток памяти CD8⁺можно проводить путем отбора клеток, совместно экспрессирующих CD8⁺ и CD45RA^-, и/или клеток, совместно экспрессирующих CD8⁺и CD45RO⁺, и может быть проведен посредством применения способа, известного в данной области техники, такого как очистка на основе аффинности (например, такая как посредством применения шариков MACS, сортера FACS и/или ELISA с введением метки и захватом).

Отбор Т-клеток памяти CD8⁺ можно далее проводить путем отбора эффекторных Т-клеток и Т-клеток центральной памяти, причем последние экспрессируют, например, CD62L, CCR7, CD27 и/или CD28.

Для того, чтобы получить популяцию клеток, в которой популяция Т-клеток содержит высокую чистоту Т-клеток памяти (например, по меньшей мере приблизительно 30-50% Т-клеток памяти, например, 40% Т-клеток памяти), или для того, чтобы увеличить число Т-клеток памяти, РВМС могут быть обеднены наивными клетками, например, CD45RA⁺ клетками, CD4⁺ клетками (например, Т-хелперными клетками), CD56⁺ клетками (например, NK клетками) или любыми другими клетками, не имеющими фенотип Т-клеток памяти.

Истощение наивных Т-клеток (например, экспрессирующих CD45RA⁺ клетки), CD4⁺ и/или CD56⁺ клеток можно проводить с применением любого известного способа в данной области техники, такого как очистка на основе аффинности (например, такая как посредством применения шариков MACS, сортера FACS и/или ELISA с введением метки и захватом).

Согласно одному варианту осуществления Т-клетки памяти получают из мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС).

Согласно одному варианту осуществления Т-клетки памяти получают способом, предусматривающим обработку второй популяции РВМС того же субъекта-донора как и для указанной первой популяции РВМС с одним или несколькими агентами, способными истощать клетки, экспрессирующие CD4⁺, CD56⁺ и CD45RA⁺, с получением таким образом популяции клеток, которая включает по меньшей мере 40% Т-клеток памяти, экспрессирующих фенотип CD45RA^-CD8⁺.

Согласно одному варианту осуществления популяция клеток дополнительно содержит В-клетки и миелоидные клетки.

Согласно одному варианту осуществления клетки CD14^-, собранные из первой популяции клеток, объединяют со второй популяцией клеток перед обогащением Т-клеток памяти.

Согласно одному варианту осуществления перед обогащением Т-клеток памяти, клетки CD14^-, полученные из первой популяции клеток, и/или РВМС, полученные из второй популяции клеток, центрифугируют и ресуспендируют при концентрации, например, 10-50×10⁶ клеток/мл, например, 30×10⁶ клеток/мл, в среде для роста клеток, например, среде для роста Т-клеток (например, среда Клика с предпочтительным добавлением RPMI 1640 1:100 Glutamaxe и 5% АВ сыворотки человека) наряду с IL-7 (30 МЕ/мл)). Согласно одному варианту осуществления в среду для роста клеток добавляют IL-7 (например, при концентрации, например, 1-100 МЕ/мл, например, 30 МЕ/мл). Суспензию клеток затем засевают (например, в колбах для тканевых культур) и инкубируют в течение 12-36 часов, например, в течение 16-24 часов, например, в течение 24 часов, при 37°С, 5% СО₂.

Согласно одному варианту осуществления вторую популяцию РВМС центрифугируют и ресуспендируют в буфере (например, в буфере CliniMACS®/0,5% HSA) до минимального соотношения 1:2.

Согласно одному варианту осуществления вторую популяцию РВМС промывают от тромбоцитов (например, промывка от тромбоцитов), центрифугируют и ресуспендируют в буфере (например, в буфере CliniMACS®/0,5% HSA).

Согласно одному варианту осуществления препарат клеток после истощения тромбоцитов согласно одному варианту осуществления инкубируют с IVIg в течение 5-30 минут, например, 10-15 минут. После начальной инкубации CD4⁺, CD56⁺ и/или CD45RA⁺-связывающие агенты добавляют к препарату клеток и инкубируют в течение, например, 10-60 минут, например, 30 минут на орбитальном ротаторе.

Согласно одному варианту осуществления CD4⁺, CD56⁺ и/или CD45RA⁺ -связывающим агентом является антитело.

Согласно конкретному варианту осуществления CD4⁺, CD56⁺ и/или CD45RA⁺-связывающим агентом является моноклональное антитело.

Согласно конкретному варианту осуществления CD4⁺, CD56⁺ и/или CD45RA⁺- моноклональное антитело конъюгировано с магнитными шариками.

Согласно конкретному варианту осуществления CD4⁺, CD56⁺ и/или CD45RA⁺ моноклональное антитело конъюгировано с суперпарамагнитными частицами.

Согласно одному варианту осуществления в конце инкубации клетки промывают посредством центрифугирования и клеточную пеллету ресуспендируют в буфере (например, буфере CliniMACS®/0,5% HSA) с удалением избытка реагента.

Согласно одному варианту осуществления CD4⁺/CD56⁺/CD45RA⁺-меченые клетки отбирают посредством методик магнитного разделения (как подробно раскрыто в настоящем документе выше).

Согласно одному варианту осуществления CD4⁺/CD56⁺/CD45RA⁺-меченые клетки обрабатывают на колонке CliniMACS®.

Согласно одному варианту осуществления CD4⁺/CD56⁺/CD45RA⁺-магнитно-меченые клетки (т.е. клетки, экспрессирующие CD4⁺/CD56⁺/CD45RA⁺) удерживаются разделительной колонкой (т.е. отрицательный отбор), a CD4^-/CD56^-/CD45RA^- клетки собирают. Согласно одному варианту осуществления собранные клетки промывают и ресуспендируют в среде для роста Т-клеток. Согласно одному варианту осуществления образцы из каждой фракции отбирают для подсчета клеток, определения жизнеспособность и/или проведения иммунофенотипирование.

Согласно одному варианту осуществления собранную фракцию клеток CD4^-/CD56^-/CD45RA^- доводят до 0,01-10×10⁶ клеток/мл, например, 2×10⁶ клеток/мл, в среде для роста клеток с добавлением цитокинов и факторов роста. Определение используемых цитокинов и факторов роста находится в компетенции специалиста в данной области техники. Например, в среду для роста Т-клеток добавляют IL-7 (например, при концентрации, например, 1-100 МЕ/мл, например, 30 МЕ/мл). Затем клеточную суспензию засевают (например, в G-Rex®100) и инкубируют в течение 12-36 часов, например, в течение 16-24 часов, например, в течение 24 часов, при 37°С, 5% СО₂.

Для того, чтобы истощить аллореактивные клоны из пула Т-клеток памяти путем активации антигена (например, вирусного антигена), Т-клетки памяти подвергают контакту с антигенными пептидами, например, вирусными пептидами.

Как правило, клетки, не индуцирующие GVHD, имеющие фенотип Tcm, согласно настоящему изобретению получают посредством контакта популяции клеток, содержащей Т-клетки памяти, с антиген-презентирующими клетками, загруженными антигенными пептидами, например, вирусными пептидами (такими, как описанные выше), в культуре с добавлением IL-21 (например, в культуре без цитокинов, т.е. без добавления каких-либо дополнительных цитокинов). Эту стадию, как правило, проводят в течение приблизительно 12-24 часов, приблизительно 12-36 часов, приблизительно 12-72 часов, 12-96 часов, 12-120 часов, приблизительно 24-36 часов, приблизительно 24-48 часов, приблизительно 24-72 часов, приблизительно 36-48 часов, приблизительно 36-72 часов, приблизительно 48-72 часов, приблизительно 48-96 часов, приблизительно 48-120 часов, 0,5-1 дней, 0,5-2 дней, 0,5-3 дней, 0,5-5 дней, 1-2 дней, 1-3 дней, 1-5 дней, 1-7 дней, 1-10 дней, 2-3 дней, 2-4 дней, 2-5 дней, 2-6 дней, 2-8 дней, 3-4 дней, 3-5 дней, 3-7 дней, 4-5 дней, 4-8 дней, 5-7 дней, 6-8 дней или 8-10 дней и обеспечивают обогащение реактивных в отношении антигена (например, вирусного антигена) клеток.

Согласно конкретному варианту осуществления контакт популяции РВМС, обедненной клетками CD4⁺, CD56⁺ и CD45RA⁺ и содержащей Т-клетки памяти CD8⁺ (например, популяция клеток, содержащая Т-клетки, где Т-клетки в популяции клеток содержат по меньшей мере 40% Т-клеток памяти), с антигеном или антигенами (такими, как описанные выше) в культуре с добавлением IL-21 (культуре без цитокинов) проводят в течение 12 часов-6 дней (например, 3 дней).

Контакт популяции клеток, содержащей Т-клетки памяти CD8⁺, с антигеном или антигенами (такими, как описанные выше) в культуре с добавлением IL-21 проводят, как правило, в присутствии приблизительно 0,001-3000 МЕ/мл, 0,01-3000 МЕ/мл, 0,1-3000 МЕ/мл, 1-3000 МЕ/мл, 10-3000 МЕ/мл, 100-3000 МЕ/мл, 1000-3000 МЕ/мл, 0,001-1000 МЕ/мл, 0,01-1000 МЕ/мл, 0,1-1000 МЕ/мл, 1-1000 МЕ/мл, 10-1000 МЕ/мл, 100-1000 МЕ/мл, 250-1000 МЕ/мл, 500-1000 МЕ/мл, 750-1000 МЕ/мл, 10-500 МЕ/мл, 50-500 МЕ/мл, 100-500 МЕ/мл, 250-500 МЕ/мл, 100-250 МЕ/мл, 0,1-100 МЕ/мл, 1-100 МЕ/мл, 10-100 МЕ/мл, 30-100 МЕ/мл, 50-100 МЕ/мл, 1-50 МЕ/мл, 10-50 МЕ/мл, 20-50 МЕ/мл, 30-50 МЕ/мл, 1-30 МЕ/мл, 10-30 МЕ/мл, 20-30 МЕ/мл, 10-20 МЕ/мл, 0,1-10 МЕ/мл или 1-10 МЕ/мл IL-21. Согласно конкретному варианту осуществления концентрация IL-21 составляет 50-500 МЕ/мл (например, 100 МЕ/мл).

Согласно конкретному варианту осуществления контакт популяции клеток, содержащей Т-клетки памяти CD8⁺ с антигеном или антигенами, проводят в свободной от цитокинов культуре (например, с добавлением только IL-21), такое условие культуры обеспечивает выживание и обогащение только тех клеток, которые подвергаются стимуляции и активации антигеном или антигенами (т.е. реактивных в отношении антигена клеток, например, вирус-реактивных Т-клеток памяти), поскольку эти клетки секретируют цитокины (например, IL-2), которые обеспечивают их выживание (все остальные клетки погибают при этих условиях культуры).

Согласно одному варианту осуществления соотношение популяции клеток, содержащей Т-клетки памяти CD8⁺ (т.е. клетки CD4^-CD56^-CD45RA^-), и загруженных антигенным (например, вирусным) пептидом антиген-презентирующих клеток (например, mDC) составляет, как правило, от приблизительно 2:1 до приблизительно 10:1, как например, приблизительно 2:1, приблизительно 3:1, приблизительно 4:1, приблизительно 5:1, приблизительно 6:1, приблизительно 8:1 или приблизительно 10:1. Согласно конкретному варианту осуществления соотношение популяции клеток, содержащей Т-клетки памяти CD8⁺ (т.е. клетки CD4^-CD56^-CD45RA^-), и загруженных антигенным (например, вирусным) пептидом антиген-презентирующих клеток (например, mDC) составляет приблизительно от 2:1 до 8:1, например, приблизительно 5:1.

Согласно конкретному варианту осуществления популяцию клеток, содержащую Т-клетки памяти CD8⁺ (т.е. клетки CD4^-CD56^-CD45RA^-), засевают (например, в G-Rex®100) при концентрации 0,01-10×10⁶ клеток/мл, например, 1×10⁶ клеток/мл, вместе с загруженными вирусным пептидом антиген-презентирующими клетками (например, mDC) при соотношении от приблизительно 2:1 до приблизительно 8:1, например, приблизительно 5:1 (Т-клетки памяти CD8⁺: антиген-презентирующие клетки (например, mDC)) в среде для роста Т-клеток вместе с IL-21 (например, при концентрации 50-500 МЕ/мл, например, 100 МЕ/мл) в течение 1-5 дней (например, 3 дней) в 37°С, 5% СО₂.

Затем полученную популяцию клеток, содержащую Т-клетки памяти CD8⁺(т.е. после культуры с IL-21), культивируют в присутствии IL-21, IL-15 и/или IL-7, обеспечивая таким образом пролиферацию клеток, имеющих фенотип Tcm.Эту стадию, как правило, проводят в течение приблизительно 12-24 часов, приблизительно 12-36 часов, приблизительно 12-72 часов, приблизительно 12-96 часов, приблизительно 12-120 часов, приблизительно 12-240 часов, 24-36 часов, 24-48 часов, приблизительно 24-72 часов, 24-96 часов, 24-120 часов, 24-240 часов, приблизительно 48-72 часов, приблизительно 48-120 часов, приблизительно 48-240 часов, приблизительно 96-240 часов, приблизительно 120-144 часов, приблизительно 120-240 часов, приблизительно 144-240 часов, 0,5-1 дней, 0,5-2 дней, 0,5-3 дней, 0,5-5 дней, 0,5-10 дней, 1-2 дней, 1-3 дней, 1-4 дней, 1-6 дней, 1-8 дней, 1-9 дней, 1-10 дней, 2-3 дней, 2-4 дней, 2-5 дней, 2-6 дней, 2-8 дней, 2-9 дней, 2-10 дней, 4-5 дней, 4-6 дней, 4-8 дней, 4-9 дней, 4-10 дней, 5-6 дней, 5-7 дней, 5-8 дней, 5-9 дней, 5-10 дней, 5-15 дней, 6-7 дней, 6-8 дней, 6-9 дней, 6-10 дней, 6-12 дней, 7-8 дней, 7-9 дней, 7-11 дней, 7-13 дней, 7-15 дней, 8-9 дней, 8-10 дней, 9-10 дней, 9-12 дней, 9-15 дней, 10-12 дней, 10-15 дней, 12-15 дней, 14-16 дней, 14-18 дней, 16-18 дней или 18-20 дней. Согласно конкретному варианту осуществления полученную популяцию клеток, содержащую Т-клетки памяти CD8⁺(т.е. после культуры с IL-21) культивируют в присутствии IL-21, IL-15 и IL-7 в течение приблизительно 6-12 дней (например, 9 дней).

Эту стадию, как правило, проводят в присутствии IL-21 при концентрации приблизительно 0,001-3000 МЕ/мл, 0,01-3000 МЕ/мл, 0,1-3000 МЕ/мл, 1-3000 МЕ/мл, 10-3000 МЕ/мл, 100-3000 МЕ/мл, 1000-3000 МЕ/мл, 0,001-1000 МЕ/мл, 0,01-1000 МЕ/мл, 0,1-1000 МЕ/мл, 1-1000 МЕ/мл, 10-1000 МЕ/мл, 100-1000 МЕ/мл, 250-1000 МЕ/мл, 500-1000 МЕ/мл, 750-1000 МЕ/мл, 10-500 МЕ/мл, 50-500 МЕ/мл, 100-500 МЕ/мл, 250-500 МЕ/мл, 100-250 МЕ/мл, 0,1-100 МЕ/мл, 1-100 МЕ/мл, 10-100 МЕ/мл, 30-100 МЕ/мл, 50-100 МЕ/мл, 1-50 МЕ/мл, 10-50 МЕ/мл, 20-50 МЕ/мл, 30-50 МЕ/мл, 1-30 МЕ/мл, 10-30 МЕ/мл, 20-30 МЕ/мл, 10-20 МЕ/мл, 0,1-10 МЕ/мл или 1-10 МЕ/мл IL-21. Согласно конкретному варианту осуществления концентрация IL-21 составляет 50-500 МЕ/мл (например, 100 МЕ/мл).

Эту стадию далее проводят в присутствии IL-15 при концентрации приблизительно 0,001-3000 МЕ/мл, 0,01-3000 МЕ/мл, 0,1-3000 МЕ/мл, 1-3000 МЕ/мл, 10-3000 МЕ/мл, 100-3000 МЕ/мл, 125-3000 МЕ/мл, 1000-3000 МЕ/мл, 0,001-1000 МЕ/мл, 0,01-1000 МЕ/мл, 0,1-1000 МЕ/мл, 1-1000 МЕ/мл, 10-1000 МЕ/мл, 100-1000 МЕ/мл, 125-1000 МЕ/мл, 250-1000 МЕ/мл, 500-1000 МЕ/мл, 750-1000 МЕ/мл, 10-500 МЕ/мл, 50-500 МЕ/мл, 100-500 МЕ/мл, 125-500 МЕ/мл, 250-500 МЕ/мл, 250-500 МЕ/мл, 125-250 МЕ/мл, 100-250 МЕ/мл, 0,1-100 МЕ/мл, 1-100 МЕ/мл, 10-100 МЕ/мл, 30-100 МЕ/мл, 50-100 МЕ/мл, 1-50 МЕ/мл, 10-50 МЕ/мл, 20-50 МЕ/мл, 30-50 МЕ/мл, 1-30 МЕ/мл, 10-30 МЕ/мл, 20-30 МЕ/мл, 10-20 МЕ/мл, 0,1-10 МЕ/мл или 1-10 МЕ/мл IL-15. Согласно конкретному варианту осуществления концентрация IL-15 составляет 50-500 МЕ/мл (например, 125 МЕ/мл).

Эту стадию далее проводят в присутствии IL-7 при концентрации приблизительно 0,001-3000 МЕ/мл, 0,01-3000 МЕ/мл, 0,1-3000 МЕ/мл, 1-3000 МЕ/мл, 10-3000 МЕ/мл, 30-3000 МЕ/мл, 100-3000 МЕ/мл, 1000-3000 МЕ/мл, 0,001-1000 МЕ/мл, 0,01-1000 МЕ/мл, 0,1-1000 МЕ/мл, 1-1000 МЕ/мл, 10-1000 МЕ/мл, 30-1000 МЕ/мл, 100-1000 МЕ/мл, 250-1000 МЕ/мл, 500-1000 МЕ/мл, 750-1000 МЕ/мл, 10-500 МЕ/мл, 30-500 МЕ/мл, 50-500 МЕ/мл, 100-500 МЕ/мл, 250-500 МЕ/мл, 100-250 МЕ/мл, 0,1-100 МЕ/мл, 1-100 МЕ/мл, 10-100 МЕ/мл, 30-100 МЕ/мл, 50-100 МЕ/мл, 1-50 МЕ/мл, 10-50 МЕ/мл, 20-50 МЕ/мл, 30-50 МЕ/мл, 1-30 МЕ/мл, 10-30 МЕ/мл, 20-30 МЕ/мл, 10-20 МЕ/мл, 0,1-10 МЕ/мл или 1-10 МЕ/мл IL-7. Согласно конкретному варианту осуществления концентрация IL-7 составляет 1-100 МЕ/мл (30 МЕ/мл).

Согласно конкретному варианту осуществления в клеточную культуру, содержащую полученную популяцию клеток, содержащую Т-клетки памяти CD8⁺ (т.е. после культивирования с IL-21), добавляют IL-7 (например, при концентрации, например, 1-100 МЕ/мл, например, 30 МЕ/мл), IL-15 (например, при концентрации, например, 50-500 МЕ/мл, например, 125 МЕ/мл) и IL-21 (например, при концентрации, 50-500 МЕ/мл, например, 100 МЕ/мл) при объеме культуры 50%, и культивируют в течение приблизительно 6-12 дней (например, 9 дней) при добавлении IL-7, IL-15, IL-21 каждые приблизительно 48-96 часов, например, 48 часов, например, 72 часов.

Согласно одному варианту осуществления общая продолжительность времени культивирования для получения клеток Tcm составляет приблизительно 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 17, 19 или 21 дней (например, 12 дней).

Согласно одному варианту осуществления клеточную культуру, содержащую полученную популяцию клеток, содержащую Т-клетки памяти CD8⁺ (т.е. после культивирования с IL-21), контролируют на уровни глюкозы.

Согласно одному варианту осуществления глюкоза содержится при уровне 10-500 мг/дл, например, 50-170 мг/дл.

Согласно одному варианту осуществления, когда содержится при уровне от 170 мг/дл до 130 мг/дл, цитокины IL-7, IL-15, IL-21 добавляют в культуру (как указано выше).

Согласно одному варианту осуществления, когда уровень глюкозы составляет от 129 мг/дл до 100 мг/дл, свежую среду для роста Т-клеток, например, 25% объем, например, 100 мл (например, 25% объема G-Rex® 100, равного 400 мл) плюс цитокины IL-7, IL-15, IL-21 добавляют в культуру.

Согласно одному варианту осуществления, когда уровень глюкозы составляет от 99 мг/дл до 50 мг/дл, свежую среду для роста Т-клеток, например, 50% объем, например, 200 мл (например, 50% объема G-Rex® 100, равного 400 мл) плюс цитокины IL-7, IL-15, IL-21 добавляют в культуру.

Согласно одному варианту осуществления культивирование дополнительно предусматривает добавление глюкозы до концентрации по меньшей мере приблизительно 20 мг/дл, по меньшей мере приблизительно 30 мг/дл, по меньшей мере приблизительно 40 мг/дл, по меньшей мере приблизительно 50 мг/дл, по меньшей мере приблизительно 60 мг/дл, по меньшей мере приблизительно 70 мг/дл, по меньшей мере приблизительно 80 мг/дл, по меньшей мере приблизительно 90 мг/дл, по меньшей мере приблизительно 100 мг/дл

Согласно конкретному варианту осуществления культивирование дополнительно предусматривает добавление глюкозы до концентрации по меньшей мере приблизительно 50 мг/дл.

Согласно одному варианту осуществления клеточную культуру, содержащую полученную популяцию клеток, содержащую Т-клетки памяти CD8⁺ (т.е. после культивирования с IL-21), контролируют на уровни рН. Согласно одному варианту осуществления уровень рН находится в физиологическом диапазоне (например, рН 7,2-7,6). Когда уровень рН не находится в физиологическом диапазоне, уровень рН можно регулировать с применением любого способа, известного в данной области техники.

Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к способу получения выделенной популяции клеток, не индуцирующих реакцию «трансплантат против хозяина» (GVHD), имеющих фенотип Т-лимфоцитов центральной памяти (Tcm), причем указанные клетки являются клетками, индуцирующими толерантность, и/или обладают активностью против заболевания и способны возвращаться в лимфатические узлы после трансплантации, причем способ предусматривает:

(b) загрузку дендритных клеток вирусными пептидами, происходящими из 4-10 типов вирусов, где по меньшей мере один из вирусов содержат вирус ВК,

Согласно одному варианту осуществления культивирование полученной популяции клеток, содержащей Т-клетки памяти CD8⁺ (т.е. после культивирования с IL-21), в присутствии IL-21, IL-15 и/или IL-7 обычно проводят в свободной от антигена среде (т.е. без добавления антигена или антигенов, например, вирусных пептидов). Однако должно быть понятно, что остаточный антиген или антигены (например, вирусные пептиды) могут присутствовать в клеточной культуре после культивирования с IL-21 (т.е. на стадии пролиферации Tcm, предусматривающей, например, добавление IL-21, IL-15 и IL-7), и, таким образом, свободная от антигена среда относится к клеточной культуре без добавления добавки антиген-презентирующих клеток, презентирующих антиген или антигены (например, вирусные пептиды).

Согласно одному варианту осуществления для того, чтобы получить Т-клетки памяти CD8⁺, специфические для антигена или антигенов, антиген (антигены) (например, опухолевой антиген, вирусный антиген) вводят субъекту-донору перед получением у него Т-клеток памяти CD8⁺ (например, перед получением популяции Т-клеток, содержащей по меньшей мере 40% Т-клеток памяти CD8⁺). Можно использовать любой метод иммунизации донора клеток против антигена для того, чтобы вызвать иммунный ответ (например, образование Т-клеток памяти CD8⁺).

Антиген можно вводить как есть или как часть композиции, содержащей адъювант (например, полный адъювант Фрейнда (CFA) или неполный адъювант Фрейнда (IFA)). Согласно одному варианту осуществления антиген вводят субъекту-донору однократно. Согласно одному варианту осуществления субъект-донор получает по меньшей мере одно дополнительное (например, бустерное) введение антигена (например, 2, 3, 4 или более введений). Такое дополнительное введение можно осуществлять через 1, 3, 5, 7, 10, 12, 14, 21, 30 дней или более после первого введения антигена.

Для того, чтобы дополнительно обогатить Т-клетки памяти CD8⁺против определенного антигена/антигенов и истощить аллореактивные клоны из пула Т-клеток памяти, популяцию клеток, содержащую Т-клетки памяти CD8⁺, можно дополнительно ввести в контакт с тем же антигеном или антигенами (например, тот же самый антиген, который вводили донору клеток), как описано выше в настоящем документе.

Должно быть понятно, что образцы клеток и образцы культуральной среды могут быть получены на любой стадии способа получения выделенной популяции клеток, не индуцирующих GVHD, имеющих фенотип Tcm.Их можно использовать для оценки количества клеток, жизнеспособности клеток, стерильности, иммунофенотипирования, уровней глюкозы и рН и т.д. Для реализации таких процедур можно использовать любой способ, известный в данной области техники.

Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к выделенной популяции клеток, не индуцирующих GVHD, содержащей клетки, имеющие фенотип Т-лимфоцитов центральной памяти (Tcm), причем указанные клетки являются клетками, индуцирующими толерантность, и/или обладают активностью против заболевания и способны возвращаться в лимфатические узлы после трансплантации, полученной способом согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения.

После получения клетки, не индуцирующие GVHD, имеющие фенотип Tcm, могут применяться в виде свежих клеток (например, в течение приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дней, например, в течение приблизительно 3 дней).

В качестве альтернативы клетки могут быть криоконсервированы до того, пока они не потребуются (например, в течение 1 недели, 2 недель, 1 месяца, 2 месяцев, 4 месяцев, 6 месяцев, года или более).

Согласно одному варианту осуществления клетки, не индуцирующие GVHD, имеющие фенотип Tcm, согласно настоящему изобретению не встречаются в природе и не являются продуктом природы. Эти клетки обычно получают путем манипуляции ex vivo (т.е. воздействия антигена или антигенов в присутствии специфических цитокинов).

Описанные выше протоколы обычно используют для несингенных применений, и поэтому популяция клеток, содержащая Т-клетки памяти или РВМС, обычно является аллогенной по отношению к субъекту-реципиенту (например, от аллогенного донора). Подобным образом, в случая×, когда ксеногенные применения могут быть полезными, используемые Т-клетки памяти или РВМС могут иметь ксеногенное происхождение, как раскрыто далее. Однако в случая×, когда сингенные применения могут быть полезными, используемая популяция клеток, содержащая Т-клетки памяти или РВМС, может быть аутологичной по отношению к субъекту-реципиенту (например, от субъекта). Такие определения находятся в пределах компетенции специалиста в данной области техники, особенно с учетом представленного раскрытия.

Таким образом, как указано, популяция клеток, содержащая Т-клетки памяти CD8⁺или РВМС, может быть сингенной или несингенной в отношении субъекта.

В контексте настоящего изобретения термин «сингенные» клетки относится к клеткам, которые по существу генетически идентичны субъекту или по существу всем лимфоцитам субъекта. Примеры сингенных клеток включают клетки, происходящие из субъекта (также называемые в данной области техники «аутологичные»), из клона субъекта или из идентичного близнеца субъекта.

В контексте настоящего изобретения термин «несингенные» клетки относится к клеткам, которые по существу генетически не идентичны субъекту или по существу всем лимфоцитам субъекта, таким как аллогенные клетки или ксеногенные клетки.

В контексте настоящего изобретения термин «аллогенный» относится к клеткам, происходящим из субъекта-донора, принадлежащего к тому же виду, что и субъект-реципиент, но который по существу не является клоном субъекта-реципиента. Как правило, аутбредные, незиготные млекопитающие-близнецы одного и того же вида являются аллогенными друг другу. Необходимо отметить, что аллогенная клетка может быть HLA-идентичной, частично HLA-идентичной или HLA-неидентичной (т.е. иметь одну или несколько отличающихся HLA детерминант) по отношению к субъекту-реципиенту.

Согласно одному варианту осуществления донором является человек.

В контексте настоящего изобретения термин «ксеногенный» относится к клетке, которая в значительной степени экспрессирует антигены другого вида по сравнению с видами значительной части лимфоцитов субъекта. Как правило, аутбредные млекопитающие разных видов ксеногенны друг другу.

Настоящее изобретение предусматривает, что ксеногенные клетки происходят из множества видов. Таким образом, согласно одному варианту осуществления клетки могут происходить из любого млекопитающего. Подходящие виды происхождения клеток включают основных одомашненных или домашних животных и приматов. Такие животные включают без ограничения семейство свинообразных (например, свиней), крупный рогатый скот (например, корову), семейство лошадиных (например, лошадь), семейство овечьих (например, коз, овец), семейство кошачьих (например, Felis domesticd), семейство псовых (например, Canis domesticd), грызунов (например, мышь, крыса, кролик, морская свинка, песчанка, хомяк) и приматов (например, шимпанзе, макака-резус, макака, мартышка). Клетки ксеногенного происхождения (например, свиного происхождения) предпочтительно получают из источника, о котором известно, что он свободен от зоонозов, таких как эндогенные ретровирусы свиней. Подобным образом, клетки или ткани человеческого происхождения предпочтительно получают из по существу свободных от патогенов источников.

Таким образом, источник популяции клеток, содержащей Т-клетки памяти CD8⁺или РВМС, будет определен с учетом предполагаемого использования клеток (см. дополнительные подробности ниже) и находится в пределах компетенции специалиста в данной области техники, особенно в свете подробного раскрытия, представленного в настоящем документе.

Использование клеток вето особенно полезно в случая×, когда необходимо устранить отторжение трансплантата, преодолеть реакцию «трансплантат против хозяина» (GVHD) и/или вызвать донор-специфическую толерантность, например, при трансплантации аллогенных или ксеногенных клеток или тканей. Использование клеток вето также может быть полезным для продления срока действия «готовы×» аллогенных генетически модифицированных Т-клеток, таких как CAR-T-клетки или TCR-трансгенные Т-клетки (TCR-T).

Соответственно, клетки вето согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения можно использовать в качестве адъювантной терапии для облегчения приживления генетически модифицированных клеток, трансдуцированных для экспрессии рецептора клеточной поверхности, содержащего сигнальный модуль Т-клеточного рецептора (т.е. внутриклеточную часть рецептора, отвечающую за активацию по меньшей мере одной из нормальных эффекторных функций Т-клетки, в которую был помещен рецептор), например, трансгенного Т-клеточного рецептора (tg-TCR) или химерного антигенного рецептора (CAR), как подробно раскрыто в настоящем документе выше.

Согласно одному варианту осуществления клетки вето согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения можно использовать в сочетании с любыми CAR-T-клетками или TCR-T-клетки (например, CAR-T или TCR-Т-клетками, полученными из клеток донора клеток вето), такими как опухолеспецифические CAR-T или TCR-T-клетки, нацеленные на различные опухолевые антигены, для лечения гемопоэтического рака или солидных опухолей. Примеры этих видов рака и их антигенов, на которые можно воздействовать, включают без ограничения фолликулярную лимфому (CD20 или GD2), нейробластому (CD171), неходжкинскую лимфому (CD20), лимфому (CD19), глиобластому (IL13Ra2), хронический лимфолейкоз или CLL, множественную миелому (ВСМА, CD138, CS1) и острый лимфолейкоз или ALL (в обоих случаях CD19).

Должно быть понятно, что клетки вето и CAR-T/TCR-T- клетки можно использовать одновременно или последовательно друг за другом (например, в один и тот же день или в течение, например, приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 дней друг за другом).

Как указано выше, клетки вето согласно настоящему изобретению дополнительно обладают активностью против заболевания (например, противовирусной активностью или противоопухолевой активностью, например, GVL) и, следовательно, являются полезными в случаях, когда субъект, например субъект с трансплантацией, страдает заболеванием или состоянием (например, злокачественное, вирусное, бактериальное, грибковое, аутоиммунное или аллергическое заболевание или состояние), до или после трансплантации (например, до восстановления иммунитета).

Согласно одному варианту осуществления клетки вето согласно настоящему изобретению полезны для предотвращения вирусной инфекции.

Согласно одному варианту осуществления клетки вето согласно настоящему изобретению полезны для уничтожения раковых клеток, включая остаточные раковые клетки (например, лейкемических клеток).

Согласно одному варианту осуществления клетки вето согласно настоящему изобретению полезны для предотвращения рецидива заболевания (например, рецидив лейкоза).

Таким образом, согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания у субъекта, нуждающегося в этом, причем способ предусматривает введение субъекту терапевтически эффективного количества выделенной популяции клеток, не индуцирующих GVHD, согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения (т.е. клеток Tcm), с лечением посредством этого заболевания у субъекта.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к применению клеток, не индуцирующих GVHD, имеющих фенотип Tcm, согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения заболевания у субъекта, нуждающегося в этом.

В контексте настоящего изобретения термин «лечение» включает прекращение, существенное ингибирование, замедление или обращение вспять прогрессирования состояния, существенное облегчение клинических или эстетических симптомов состояния или существенное предотвращение появления клинических или эстетических симптомов состояния.

В контексте настоящего изобретения термин «субъект» или «субъект, нуждающийся в этом» относится к млекопитающему, предпочтительно человеку, мужского или женского пола любого возраста, которое нуждается в трансплантации клеток или тканей или страдает заболеванием, которое можно лечить клетками Tcm, не индуцирующими GVHD. Как правило, субъект нуждается в трансплантации клеток или тканей (также именуемый в настоящем документе реципиентом) из-за нарушения или патологического или нежелательного состояния, статуса или синдрома, или физической, морфологической или физиологической аномалии, которые поддаются лечению посредством трансплантата клеток или ткани. Примеры таких нарушений приведены далее.

Таким образом, способ согласно настоящему изобретению можно применять для лечения любого заболевания, такого как без ограничения злокачественное заболевание, заболевание, связанное с трансплантацией трансплантата (например, отторжение трансплантата, реакция «трансплантат против хозяина»), инфекционное заболевание (например, вирусное заболевание, грибковое заболевание или бактериальное заболевание), воспалительное заболевание, аутоиммунное заболевание и/или аллергическое заболевание или состояние.

Согласно одному варианту осуществления субъект страдает злокачественными заболеваниями.

Злокачественные заболевания (также называемые раком), которые можно лечить способом согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения, могут представлять собой любую солидную или несолидную опухоль, и/или метастазы опухоли, и/или рецидив заболевания.

Примеры рака включают без ограничения карциному, лимфому, бластому, саркому и лейкемию. Более конкретные примеры таких видов рака включают плоскоклеточный рак, саркому мягких тканей, саркому Капоши, меланому, рак легкого (включая мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, аденокарциному легкого и плоскоклеточный рак легкого), рак брюшины, гепатоцеллюлярный рак, рак кардиального отдела желудка или желудка (включая рак желудочно-кишечного тракта), рак поджелудочной железы, глиобластому, рак шейки матки, рак яичников, рак печени, рак мочевого пузыря, гепатому, рак молочной железы, рак толстой кишки, колоректальный рак, рак прямой кишки, карциному эндометрия или матки, карциноидную карциному, карциному слюнных желез, рак почки или почечный рак, рак печени, рак предстательной железы, рак вульвы, рак щитовидной железы, карциному печени, мезотелиому, множественную миелому, посттрансплантационное лимфопролиферативное заболевание (PTLD) и различные типы рака головы и шеи (например, опухоли головного мозга). Раковые состояния, поддающиеся лечению согласно настоящему изобретению, включают метастатический рак.

Согласно конкретному варианту осуществления злокачественное заболевание представляет собой лейкоз, лимфому, миелому, меланому, саркому, нейробластому, рак толстой кишки, колоректальный рак, рак молочной железы, рак яичников, рак пищевода, синовиальноклеточный рак, рак печени и рак поджелудочной железы.

Согласно одному варианту осуществления злокачественным заболеванием является гематологическая злокачественная опухоль. Иллюстративные гематологические злокачественные опухоли включают без ограничения лейкоз [например, острый лимфатический, острый лимфобластный, острый лимфобластный пре-В-клеточный, острый лимфобластный Т-клеточный лейкоз, острая мегакариобластная, моноцитарная, острая миелогенная, острая миелоидная, острая миелоидная с эозинофилией, В-клеточная, базофильная, хроническая миелоидная, хроническая, В-клеточная, эозинофильная, Фрейда, гранулоцитарная или миелоцитарная, волосатоклеточная, лимфоцитарная, мегакариобластная, моноцитарная, моноцитарно-макрофагальная, миелобластная, миелоидная, миеломоноцитарная, плазмоклеточная, пре-В-клеточная, промиелоцитарная, подострая, Т-клеточная, лимфоидная неоплазия, предрасположенность к миелоидному злокачественному новообразованию, острый нелимфоцитарный лейкоз, Т-клеточный острый лимфолейкоз (T-ALL) и В-клеточный хронический лимфолейкоз (B-CLL)] и лимфому [например, болезнь Ходжкина, неходжкинская лимфома, Беркитта, кожная Т-клеточная, гистиоцитарная, лимфобластная, Т-клеточная, тимусная, В-клеточная, в том числе низкой степени злокачественности/фолликулярная, мелкоклеточная лимфоцитарная (SL) NHL, промежуточная/фолликулярная NHL, диффузная NHL средней степени тяжести, иммунобластная NHL высокой степени злокачественности, лимфобластная NHL высокой степени злокачественности, мелкоклеточная NHL с нерасщепленным ядром высокой степени злокачественности, массивная NHL, мантийноклеточная лимфома, лимфома, связанная со СПИДом и макроглобулинемия Вальденстрема].

Согласно конкретному варианту осуществления гематологическая злокачественной опухолью является фолликулярная лимфома (FL), мантийноклеточная лимфома (MCL), хронический лимфолейкоз (CLL), множественная миелома (ММ), лимфома Ходжкина (HL), неходжкинская лимфома (NHL), ×ронический миелоидный лейкоз (CML), миелопролиферативный синдром (MPD), острый миелоидный лейкоз (AML) или острый лимфолейкоз (ALL).

Согласно одному варианту осуществления субъект страдает незлокачественным заболеванием.

Согласно одному варианту осуществления незлокачественным заболеванием является функциональная недостаточность или дисфункция органов, гематологическое заболевание, заболевание, связанное с трансплантатом, инфекционное заболевание, воспалительное заболевание, аутоимунное заболевание, аллергическое заболевание, генетическое заболевание или нарушение, метаболическое нарушение, травма и ушиб.

Согласно одному варианту осуществления субъект согласно настоящему изобретению может страдать любым из сердечно-сосудистого заболевания, ревматоидного заболевания, заболевания желез, желудочно-кишечного заболевания, кожного заболевания, заболевания печени, неврологического заболевания, мышечного заболевания, заболевания почек, заболевания соединительной ткани, системного заболевания и/или заболевания, связанного с репродукцией, поддающегося лечению трансплантацией клеток или ткани.

Иллюстративные незлокачественные заболевания включают без ограничения тяжелые комбинированные синдромы иммунодефицита (SCID), серповидноклеточную анемию (например, серповидноклеточная анемия), врожденную нейтропению, тромбоцитопению, апластическую анемию (например, тяжелую апластическую анемию), миелодиспластический синдром, моносомию 7, остеопетроз, болезнь Гоше, синдром Гурлера, метахроматическую л ейко дистрофию, лейко дистрофию надпочечников, талассемию, врожденную или генетически обусловленную аномалию кроветворения, аденозиндезаминазу (ADA), волчанку, аутоиммунный гепатит, глютеновую болезнь, сахарный диабет I типа, болезнь Грейвса, синдром Гийена-Барра, тяжелую миастению, ревматоидный артрит, склеродермию и псориаз.

Согласно одному варианту осуществления незлокачественное заболевание можно лечить посредством трансплантации гемопоэтических клеток-предшественников с добавлением клеток вето.

Согласно одному варианту осуществления незлокачественное заболевание можно лечить посредством трансплантации трансплантата клеток или тканей (как раскрыто ниже), с помощью трансплантации гемопоэтических клеток-предшественников и клеток вето (например, индуцирующих донорский химеризм).

Инфекционные заболевания

Примеры инфекционных заболеваний включают без ограничения хронические инфекционные заболевания, подострые инфекционные заболевания, острые инфекционные заболевания, вирусные заболевания, бактериальные заболевания, протозойные заболевания, паразитарные заболевания, грибковые заболевания, микоплазменные заболевания и прионные заболевания.

Конкретные типы вирусных патогенов, вызывающих инфекционные заболевания, поддающиеся лечению согласно настоящему изобретению, включают без ограничения ретровирусы, цирковирусы, парвовирусы, паповавирусы, аденовирусы, герпесвирусы, иридовирусы, поксвирусы, гепаднавирусы, пикорнавирусы, калицивирусы, тогавирусы, флавивирусы, реовирусы, ортомиксовирусы, парамиксовирусы, рабдовирусы, буньявирусы, коронавирусы, аренавирусы и филовирусы.

Конкретные примеры вирусных инфекций, которые можно лечить согласно настоящему изобретению, включают без ограничения инфекции, вызванные синдромом приобретенного иммунодефицита (СПИД), индуцированным вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), грипп, риновирусную инфекцию, вирусный менингит, инфекцию вируса Эпштейна-Барра (EBV), инфекцию вируса гепатита А, В или С, корь, инфекцию вируса папилломы/бородавки, инфекцию цитомегаловируса (CMV), инфекцию вируса простого герпеса, желтую лихорадку, инфекцию вируса Эбола, бешенство, аденовирус (Adv), вирусы простуды, вирусы гриппа, японский энцефалит, полиомиелит, респираторно-синцитиальный вирус, краснуху, оспу, ветряную оспу, ротавирус, вирус Западного Нила и вирус Зика.

Конкретные примеры бактериальных инфекций, которые можно лечить согласно настоящему изобретению, включают без ограничения инфекции, вызванные сибирской язвой, грамотрицательными бациллами, хламидиями, дифтерией, гемофильной инфекцией, Helicobacter pylori, малярией, Mycobacterium tuberculosis, коклюшным токсином, пневмококками, риккетсиями, стафилококками, стрептококками и столбняком.

Конкретные примеры инфекций супербактерий (например, бактерий с множественной лекарственной устойчивостью), которые можно лечить согласно настоящему изобретению, включают без ограничения инфекции, вызванные Enterococcus faecium, Clostridium difficile, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa и Enterobacteriaceae (включая Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter spp).

Конкретные примеры грибковых инфекций, которые можно лечить согласно настоящему изобретению, включают без ограничения инфекции, вызванные кандидами, кокцидиоидами, криптококками, гисто плазмами, лейшманиями, плазмодиями, простейшими, паразитами, шистосомами, опоясывающим лишаем, токсоплазмой и Трипаносомой крузи.

Заболевания, связанные с отторжением трансплантата

Согласно другому варианту осуществления заболевание связано с трансплантацией трансплантата. Примеры заболеваний, связанных с трансплантацией трансплантата, включают без ограничения отторжение трансплантата, хроническое отторжение трансплантата, подострое отторжение трансплантата, сверхострое отторжение трансплантата, острое отторжение трансплантата, отторжение аллотрансплантата, отторжение ксенотрансплантата и реакцию трансплантат против хозяина (GVHD).

Незлокачественное гематологическое заболевание

Примеры незлокачественных гематологических заболеваний включают без ограничения анемию, заболевания костного мозга, тромбоз глубоких вен/легочную эмболию, синдром Даймонда-Блэкфана, гемохроматоз, гемофилию, иммунные гематологические нарушения, нарушения метаболизма железа, серповидноклеточную анемию (например, серповидноклеточную анемию), талассемию, тромбоцитопению и болезнь фон Виллебранда.

Согласно конкретному варианту осуществления незлокачественным заболеванием является серповидноклеточная анемия или аутоимунное заболевание (например, подлежащее лечению посредством НСТ плюс клетки вето, как раскрыто ниже).

Неограничивающие примеры аутоиммунных заболеваний включают без ограничения острый рассеянный энцефаломиелит (ADEM), болезнь Аддисона, агаммаглобулинемию, гнездную алопецию, боковой амиотрофический склероз, болезнь Бехтерева-Штрюмпелля-Мари, антифосфолипидный синдром, антисинтетазный синдром, атопическую аллергию, атопический дерматит, аутоимунную апластическую анемию, аутоимунную кардиомиопатию, аутоимунную энтеропатию, аутоиммунную гемолитическую анемию, агрессивный гепатит, аутоиммунное заболевание внутреннего у×а, аутоиммунный лимфопролиферативный синдром, аутоиммунную периферическую нейропатию, аутоиммунный панкреатит, аутоиммунный полиэндокринный синдром, аутоиммунный прогестероновый дерматит, аутоиммунную тромбоцитопеническую пурпуру, аутоиммунный увеит (например, неинфекционный увеит), синдром Бехчета, глютеиновую болезнь, хронический гломерулонефрит, синдром холодовой агглютинации, болезнь Крона, дерматомиозит, болезнь Вагнера, сахарный диабет первого типа (инсулинозависимый сахарный диабет (T1DM)), атонический фасциит, синдром Гудпасчера, болезнь Грейвса, острый полирадикулит (GBS), энцефалопатию Хашимото, аутоиммунный тиреоидит, идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру, иммунную тромбоцитопеническую пурпуру (ITP), эритематоз (SLE), синдром Миллера-Фишера, смешанное заболевание соединительной ткани, рассеянный склероз (MS), миастению гравис, нарколепсию, вульгарный пемфигус, злокачественное малокровие, полимиозит, билиарный первичный цирроз печени, псориаз, псориатический артрит, рецидивирующий полихондрит, ревматоидный артрит (RA), ревматический полиартрит, системную склеродермию, синдром Шегрена, височный артериит, поперечный миелит, неспецифический язвенный колит (UC), недифференцированное заболевание соединительной ткани, васкулит и синдром Вегенера.

Согласно конкретному варианту осуществления аутоиммунным заболеванием является эритематоз (SLE), рассеянный склероз (MS) и сахарный диабет первого типа (инсулинозависимый сахарный диабет (ТШМ)).

Согласно конкретному варианту осуществления незлокачественным заболеванием является апластическая анемия, тяжелое иммунодефицитное состояние и незлокачественная недостаточность костного мозга.

Как указано выше, для усиления активности против заболевания клеток, не индуцирующих GVHD, имеющих фенотип Tcm, целесообразно выбрать антиген или антигены (например, вирусные антигены), связанные с заболеванием, подлежащим лечению, и получить антиген-специфические клетки Tcm для лечения. Дополнительно или альтернативно, как раскрыто выше, клетки, не индуцирующие GVHD, имеющие фенотип Tcm, могут быть генетически модифицированы для лечения.

Как раскрыто выше, клетки, не индуцирующие GVHD, имеющие фенотип Tcm, согласно настоящему изобретению обладают вето-активностью. Соответственно, клетки Tcm согласно настоящему изобретению можно использовать в качестве адъювантной терапии при трансплантации клеток или тканей. Поскольку клетки, не индуцирующие GVHD, имеющие фенотип Tcm, согласно настоящему изобретению, также обладают активностью против заболевания, способ согласно настоящему изобретению может, кроме того, быть успешно применен для лечения заболевания у субъекта при одновременном облегчении приживления трансплантата клеток или тканей.

Согласно одному варианту осуществления способ дополнительно предусматривает трансплантацию трансплантата клеток или ткани субъекту.

Согласно одному варианту осуществления лекарственное средство дополнительно содержит трансплантат клеток или ткани.

Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения субъекта, нуждающегося в указанном несингенном трансплантате клеток или ткани, причем способ предусматривает: (а) трансплантацию трансплантата клеток или ткани субъекту, и (b) введение субъекту терапевтически эффективного количества выделенной популяции клеток, не индуцирующих GVHD, согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения, с лечением посредством этого субъекта, нуждающегося в трансплантате клеток или ткани.

Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к применению выделенной популяции клеток, не индуцирующих GVHD, согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения для получения лекарственного средства, предназначенного в качестве адъювантной терапии при несингенном трансплантате клеток или ткани субъекту, где субъект нуждается в несингенном трансплантате клеток или ткани.

В контексте настоящего изобретения фраза «трансплантат клеток или ткани» относится к клетке организма (например, отдельной клетке или группе клеток) или ткани (например, твердым тканям/органам или мягким тканям, которые могут быть трансплантированы полностью или частично). Примеры тканей или органов, которые могут быть трансплантированы согласно настоящему изобретению, включают без ограничения печень, поджелудочную железу, селезенку, почку, сердце, легкое, кожу, кишечник и лимфоидные/кроветворные ткани (например, лимфатический узел, пейеровы бляшки, тимус или костный мозг). Примеры клеток, которые можно трансплантировать согласно настоящему изобретению включают без ограничения незрелые гемопоэтические клетки, включая стволовые клетки, клетки сердца, клетки печени, клетки поджелудочной железы, клетки селезенки, клетки легкого, клетки головного мозга, клетки почки, клетки кишечника/клетки кишки, клетки яичников, клетки кожи (например, изолированная популяция любых из этих клеток). Кроме того, настоящее изобретение также предусматривает трансплантацию целых органов, таких как, например, почки, сердце, печень или кожа.

В зависимости от применения и доступных источников клетки или ткани согласно настоящему изобретению могут быть получены из пренатального организма, постнатального организма, взрослого организма или трупного донора. Более того, в зависимости от необходимого применения клетки или ткани могут быть наивными или генетически модифицированными. Такие определения находятся в пределах компетенции специалиста в данной области техники.

Для получения клетки или ткани (например, для трансплантации) можно использовать любой способ, известный в данной области техники.

Согласно конкретному варианту осуществления трансплантат клеток или ткани содержит незрелые гемопоэтические клетки.

В контексте настоящего изобретения фраза «незрелые гемопоэтические клетки» относится к препарату гемопоэтической ткани или клеток, содержащему гемопоэтические клетки-предшественники (например, гемопоэтические стволовые клетки). Такой препарат ткани/клеток включает или происходит из биологического образца, например, костного мозга, мобилизованной периферической крови (например, мобилизация клеток CD34⁺ для повышения их концентрации), пуповинной крови (например, пупочный канатик), печени плода, желточного мешка и/или плаценты. Кроме того, очищенные клетки CD34⁺ или другие гемопоэтические стволовые клетки, такие как клетки CD131⁺, можно использовать в соответствии с настоящим изобретением, либо с расширением ex-vivo, либо без него.

Согласно одному варианту осуществления незрелые гемопоэтические клетки содержат незрелые гемопоэтические клетки, обедненные Т-клетками.

В контексте настоящего изобретения фраза «незрелые гемопоэтические клетки, обедненные Т-клетками» относится к популяции гемопоэтических клеток-предшественников, которые обеднены Т-лимфоцитами. Незрелые гемопоэтические клетки, обедненные Т-клетками, могут включать, например, CD34⁺, CD33⁺ и/или CD56⁺ клетки. Незрелые гемопоэтические клетки, обедненные Т-клетками, могут быть обеднены CD3⁺ клетками, CD2⁺ клетками, CD8⁺ клетками, CD4⁺ клетками, α/β Т- клетками и/или γ/δ Т-клетками.

Согласно одному варианту осуществления, незрелые гемопоэтические клетки содержат обедненные Т-клетками мобилизованные клетки крови, обогащенные CD34^+хнезрелыми гемопоэтическими клетками.

Согласно варианту осуществления, незрелые гемопоэтические клетки, обедненные Т-клетками, содержат по меньшей мере приблизительно 0,1×10⁶ CD34⁺ клеток, 0,5×10⁶ CD34⁺ клеток, 1×10⁶ CD34⁺ клеток, 2×10⁶ CD34⁺ клеток, 3×10⁶ CD34⁺ клеток, 4×10⁶ CD34⁺ клеток, 5×10⁶ CD34⁺ клеток, 6×10⁶ CD34⁺ клеток, 7×10⁶ CD34⁺ клеток, 8×10⁶ CD34⁺ клеток, 9×10⁶ CD34⁺ клеток, 10×10⁶ CD34⁺ клеток, 15×10⁶ CD34⁺ клеток или 20×10⁶ CD34⁺ клеток на кг идеальной массы тела субъекта.

Согласно конкретному варианту осуществления незрелые гемопоэтические клетки, обедненные Т-клетками, содержат по меньшей мере приблизительно 2,5-20×10⁶ CD34⁺ клеток (например, 5-10×10⁶ CD34⁺ клеток) на кг идеальной массы тела субъекта.

Согласно конкретному варианту осуществления незрелые гемопоэтические клетки, обедненные Т-клетками, содержат по меньшей мере приблизительно 5×10⁶ CD34⁺ клеток на кг идеальной массы тела субъекта.

Согласно конкретному варианту осуществления незрелые гемопоэтические клетки, обедненные Т-клетками, содержат по меньшей мере приблизительно 6×10⁶ CD34⁺ клеток на кг идеальной массы тела субъекта.

Согласно конкретному варианту осуществления незрелые гемопоэтические клетки, обедненные Т-клетками, содержат по меньшей мере приблизительно 8×10⁶ CD34⁺ клеток на кг идеальной массы тела субъекта.

Согласно конкретному варианту осуществления незрелые гемопоэтические клетки, обедненные Т-клетками, содержат по меньшей мере приблизительно 10×10⁶ CD34⁺ клеток на кг идеальной массы тела субъекта.

Согласно одному варианту осуществления незрелые гемопоэтические клетки обеднены клетками CD3⁺ и/или CD19⁺.

Согласно варианту осуществления незрелые гемопоэтические клетки, обедненные Т-клетками, содержат менее приблизительно 50×10⁵ CD3⁺ клеток, 40×10⁵ CD3⁺ клеток, 30×10⁵ CD3⁺ клеток, 20×10⁵ CD3⁺ клеток, 15×10⁵ CD3⁺ клеток, 10×10⁵ CD3⁺ клеток, 9×10⁵ CD3⁺ клеток, 8×10⁵ CD3⁺ клеток, 7×10⁵ CD3⁺ клеток, 6×10⁵ CD3⁺ клеток, 5×10⁵ CD3⁺ клеток, 4×10⁵ CD3⁺ клеток, 3×10⁵ CD3⁺ клеток, 2×10⁵ CD3⁺ клеток, 1×10⁵ CD3⁺ клеток, 0,5×10⁵ CD3⁺ клеток или 0,1×10⁵ CD3⁺ клеток на килограмм идеальной массы тела субъекта.

Согласно конкретному варианту осуществления незрелые гемопоэтические клетки, обедненные Т-клетками, содержат менее 1-5×10⁵ CD3⁺ клеток (например, 2-5×10⁵ CD3⁺ клеток) на килограмм идеальной массы тела субъекта.

Согласно конкретному варианту осуществления незрелые гемопоэтические клетки, обедненные Т-клетками, содержат менее 5×10⁵ CD3⁺ клеток на килограмм идеальной массы тела субъекта.

Согласно конкретному варианту осуществления незрелые гемопоэтические клетки, обедненные Т-клетками, содержат менее 4×10⁵ CD3⁺ клеток на килограмм идеальной массы тела субъекта.

Согласно конкретному варианту осуществления незрелые гемопоэтические клетки, обедненные Т-клетками, содержат менее 3×10⁵ CD3⁺ клеток на килограмм идеальной массы тела субъекта.

Согласно конкретному варианту осуществления незрелые гемопоэтические клетки, обедненные Т-клетками, содержат менее 2×10⁵ CD3⁺ клеток на килограмм идеальной массы тела субъекта.

Согласно одному варианту осуществления незрелые гемопоэтические клетки обеднены клетками CD8⁺.

Согласно варианту осуществления, незрелые гемопоэтические клетки, обедненные Т-клетками, содержат менее 1×10⁴-5×10⁵ CD8⁺ клеток (например, 0,1-4×10⁵ CD8⁺ клеток, например, 1-3×10⁵ CD8⁺ клеток) на килограмм идеальной массы тела субъекта.

Согласно варианту осуществления незрелые гемопоэтические клетки, обедненные Т-клетками, содержат менее приблизительно 50×10⁵ CD8⁺ клеток, 25×10⁵ CD8⁺ клеток, 15×10⁵ CD8⁺ клеток, 10×10⁵ CD8⁺ клеток, 9×10⁵ CD8⁺ клеток, 8×10⁵ CD8⁺ клеток, 7×10⁵ CD8⁺ клеток, 6×10⁵ CD8⁺ клеток, 5×10⁵ CD8⁺ клеток, 4×10⁵ CD8⁺ клеток, З×10⁵ CD8⁺ клеток, 2×10⁵ CD8⁺ клеток, 1×10⁵ CD8⁺ клеток, 9×10⁴ CD8⁺ клеток, 8×10⁴ CD8⁺ клеток, 7×10⁴ CD8⁺ клеток, 6×10⁴ CD8⁺ клеток, 5×10⁴ CD8⁺ клеток, 4×10⁴ CD8⁺ клеток, 3×10⁴ CD8⁺ клеток, 2×10⁴ CD8⁺ клеток или 1×10⁴ CD8⁺ клеток на килограмм идеальной массы тела субъекта.

Согласно конкретному варианту осуществления незрелые гемопоэтические клетки, обедненные Т-клетками, содержат менее 5×10⁵ CD8⁺ клеток на килограмм идеальной массы тела субъекта.

Согласно конкретному варианту осуществления незрелые гемопоэтические клетки, обедненные Т-клетками, содержат менее 4х 10⁵ CD8⁺ клеток на килограмм идеальной массы тела субъекта.

Согласно конкретному варианту осуществления незрелые гемопоэтические клетки, обедненные Т-клетками, содержат менее 3×10⁵ CD8⁺ клеток на килограмм идеальной массы тела субъекта.

Согласно варианту осуществления незрелые гемопоэтические клетки, обедненные Т-клетками, содержат менее приблизительно 1×10⁶ CD8⁺TCRα/β^- клеток, 0,5×10⁶ CD8⁺ TCRα/β^- клеток, 1×10⁵ CD8⁺ TCRα/β^- клеток, 0,5×10⁵ CD8⁺ TCRα/β^- клеток, 1×10⁴ CD8⁺ TCRα/β^- клеток, 0,5×10⁴ CD8⁺ TCRα/β^- клеток, 1×10³ CD8⁺ TCRα/β^- клеток или 0,5×10³ CD8⁺ TCRα/β^- клеток на килограмм идеальной массы тела субъекта.

Согласно конкретному варианту осуществления незрелые гемопоэтические клетки, обедненные Т-клетками, содержат менее 1×10⁵ - 1×10⁶ CD8⁺ TCRα/β^- клеток на килограмм идеальной массы тела субъекта.

Согласно конкретному варианту осуществления незрелые гемопоэтические клетки, обедненные Т-клетками, содержат менее 1×10⁶ CD8⁺ TCRα/β^- клеток на килограмм идеальной массы тела субъекта.

Согласно конкретному варианту осуществления незрелые гемопоэтические клетки, обедненные Т-клетками, содержат менее 5×10⁵ CD8⁺ TCRα/β^- клеток на килограмм идеальной массы тела субъекта.

Согласно конкретному варианту осуществления незрелые гемопоэтические клетки, обедненные Т-клетками, содержат менее 1×10⁵ CD8⁺ TCRα/β^- клеток на килограмм идеальной массы тела субъекта.

Согласно одному варианту осуществления незрелые гемопоэтические клетки обеднены клетками В.

Согласно варианту осуществления незрелые гемопоэтические клетки обеднены клетками В (В клетками CD19⁺ и/или CD20⁺).

Согласно варианту осуществления, незрелые гемопоэтические клетки содержат менее приблизительно 50×10⁵ CD19⁺ и/или CD20⁺ клеток, 40×10⁵ CD19⁺ и/или CD20⁺ клеток, 30×10⁵ CD19⁺ и/или CD20⁺ клеток, 20×10⁵ CD19⁺ и/или CD20⁺ клеток, 10×10⁵ CD19⁺ и/или CD20⁺ клеток, 9×10⁵ CD19⁺ и/или CD20⁺ клеток, 8×10⁵ CD19⁺ и/или CD20⁺ клеток, 7×10⁵ CD19⁺ и/или CD20⁺ клеток, 6×10⁵ CD19⁺ и/или CD20⁺ клеток, 5×10⁵ CD19⁺ и/или CD20⁺ клеток, 4×10⁵ CD19⁺ и/или CD20⁺ клеток, 3×10⁵ CD19⁺ и/или CD20⁺ клеток, 2×10⁵ CD19⁺ и/или CD20⁺ клеток или 1×10⁵ CD19⁺ и/или CD20⁺ клеток на килограмм идеальной массы тела субъекта.

Согласно конкретному варианту осуществления незрелые гемопоэтические клетки содержат менее 1-5×10⁵ CD19⁺ и/или CD20⁺ клеток (например, 3-5×10⁵ CD19⁺ и/или CD20⁺ клеток) на килограмм идеальной массы тела субъекта.

Согласно конкретному варианту осуществления незрелые гемопоэтические клетки содержат менее 4×10⁵ CD19⁺ и/или CD20⁺ клеток на килограмм идеальной массы тела субъекта.

Согласно конкретному варианту осуществления незрелые гемопоэтические клетки содержат менее 3×10⁵ CD19⁺ и/или CD20⁺ клеток на килограмм идеальной массы тела субъекта.

Согласно конкретному варианту осуществления, незрелые гемопоэтические клетки содержат менее 2×10⁵ CD19⁺ и/или CD20⁺ клеток на килограмм идеальной массы тела субъекта.

Согласно конкретному варианту осуществления незрелые гемопоэтические клетки, обедненные Т-клетками, содержат две или более партии клеток, например, первую партию, содержащую CD34⁺ отобранные клетки, и вторую партию, содержащую CD3⁺/CD19⁺-обедненные клетки (т.е. полученные от одного и того же донора). Должно быть понятно, что их можно использовать одновременно или последовательно друг за другом (например, в один и тот же день или в течение, например, приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 дней друг за другом, как раскрыто ниже).

Истощение Т-клеток, например, CD3⁺, CD2⁺, TCRα/β⁺, CD4⁺ и/или CD8⁺ клеток, или В клеток, например, CD19⁺ и/или CD20⁺ клеток, можно проводить с использованием любого способа, известного в данной области техники, например, путем исключения (например, уничтожения) с помощью специфических антител или очистки на основе аффинности, например, с использованием способов магнитного разделения клеток, FACS сортера и/или ELIS А с введением метки и захватом.

Такие способы описаны в настоящем документе и в THE HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOrP, Volumes 1 to 4, (D.N. Weir, editor) и FLOW CYTOMETRY AND CELL SORTING (A. Radbruch, editor, Springer Verlag, 1992). Например, клетки можно сортировать, например, с помощью проточной цитометрии или FACS. Таким образом, можно использовать сортировку активированных флуоресценцией клеток (FACS), которая может иметь различную степень цветовых каналов, каналы обнаружения малоуглового и тупого светорассеяния и каналы импеданса. Любые методики разделения, зависящие от лиганда, известные в данной области техники, могут быть использованы в сочетании с методиками как положительного, так и отрицательного разделения, которые основаны на физических свойствах клеток, а не на аффинности антител, включая без ограничения элютриацию и центрифугирование в градиенте плотности.

Другие способы сортировки клеток включают, например, пэннинг и разделение с использованием аффинных методов, включая методы с использованием твердых подложек, таких как планшеты, шарики и колонки. Таким образом, биологические образцы могут быть разделены путем «пэннинга» с антителом, прикрепленным к твердой матрице, например, планшету.

В качестве альтернативы клетки можно сортировать/разделять с помощью методов магнитного разделения, и в некоторых из этих методов используют магнитные шарики. Различные магнитные шарики доступны из ряда источников, включая, например, Dynal (Norway), Advanced Magnetics (Cambridge, MA, U.S.A.), Immuncon (Philadelphia, U.S.A.), Immunotec (Marseille, France), Invitrogen, Stem cell Technologies (U.S.А) и Cellpro (U.S.A). Альтернативно, антитела могут быть биотинилированы или конъюгированы с дигоксигенином и использованы в сочетании с аффинными колонками, покрытыми авидином или антидигоксигенином.

Согласно варианту осуществления можно комбинировать различные способы истощения/разделения, например, сортировку магнитных клеток можно комбинировать с FACS для повышения качества разделения или обеспечения возможности сортировки по нескольким параметрам.

Согласно конкретному варианту осуществления незрелые гемопоэтические клетки, обедненные Т-клетками, получают способом, предусматривающим сбор РВМС от субъекта-донор а (например, один и тот же субъект-донор, у которого собирают немобилизованные РВМС для получения клеток, не индуцирующих GVHD, имеющих фенотип Tcm).

Согласно одному варианту осуществления мобилизацию осуществляют посредством G-CSF.

Согласно одному варианту осуществления мобилизацию осуществляют посредством G-CSF и плериксафора.

Согласно конкретному варианту осуществления сбор мобилизованных РВМС проводят в виде единственного сбора.

Согласно конкретному варианту осуществления сбор мобилизованных РВМС проводят в виде двух, трех, четырех, пяти или более ежедневных сборов, например, трех ежедневных сборов (например, в последующие дни или с интервалом в несколько дней).

Согласно конкретному варианту осуществления резервную фракцию немодифицированных мобилизованных РВМС, содержащую по меньшей мере приблизительно 0,1-5×10⁶ клеток CD34⁺, например, 2×10⁶ CD34⁺ клеток, например, 1×10⁶ CD34⁺ клеток на кг идеальной массы тела (например, полученных из первого сбора), откладывают и криоконсервируют.

Согласно конкретному варианту осуществления коллекции мобилизованных РВМС (например, оставшиеся из сборов первого и второго дня) объединяют, CD34⁺ отбирают (как раскрыто ниже) и криоконсервируют.

Согласно конкретному варианту осуществления коллекцию третьего дня истощают CD3⁺/CD19⁺ клетками (как раскрыто ниже) и криоконсервируют.

Согласно одному варианту осуществления обогащение клеток, экспрессирующих CD34⁺, проводят посредством инкубации РВМС с CD34-связывающим агентом.

Согласно конкретному варианту осуществления CD34-связывающим агентом является антитело.

Согласно конкретному варианту осуществления CD34 антителом является моноклональное антитело.

Согласно конкретному варианту осуществления CD34 моноклональное антитело конъюгировано с магнитными частицами.

Согласно конкретному варианту осуществления CD34 моноклональное антитело конъюгировано с суперпарамагнитными частицами.

Согласно одному варианту осуществления CD34⁺-меченые клетки отбирают методиками магнитного разделения (как подробно раскрыто в настоящем документе выше).

Согласно конкретному варианту осуществления CD34-магнитно-меченые клетки (т.е. CD34⁺-экспрессирующие клетки) удерживаются на разделительной колонке (т.е. положительный отбор), a CD34^- клетки удаляются. Затем CD34⁺ клетки высвобождают из колонки и собирают. Согласно одному варианту осуществления образцы каждой фракции удаляют для подсчета клеток, определения жизнеспособности и/или проведения иммунофенотипирования.

Согласно одному варианту осуществления мобилизованные РВМС истощают тромбоцитами с применением, например, СОВЕ 2991.

Согласно одному варианту осуществления препарат РВМС после истощения тромбоцитов согласно одному варианту осуществления инкубируют с IVIg в течение 5-30 минут, например, 10-15 минут. После первоначальной инкубации к клеточному препарату добавляют CD3⁺ и СВ19+-связывающие агенты и инкубируют в течение, например, 10-60 минут, например, 30 минут, на ротационном шейкере.

Согласно конкретному варианту осуществления CD3- и/или CD19-связывающим агентом является антитело.

Согласно конкретному варианту осуществления CD3 и/или CD19 антитело представляет собой моноклональное антитело.

Согласно конкретному варианту осуществления CD3 и/или CD19 моноклональное антитело конъюгировано с магнитными частицами.

Согласно конкретному варианту осуществления CD3 и/или CD19 моноклональное антитело конъюгировано с суперпарамагнитными частицами.

Согласно одному варианту осуществления в конце инкубации клетки промывают центрифугированием и осадок клеток ресуспендируют в буфере (например, СОВЕ 2991) для удаления избытка реагента.

Согласно одному варианту осуществления CD3⁺/CD19⁺-меченые клетки отбирают методиками магнитного разделения (как подробно раскрыто выше в настоящем документе).

Согласно конкретному варианту осуществления CD3⁺/CD19⁺-меченые клетки обрабатывают на колонке CliniMACS®.

Согласно конкретному варианту осуществления CD3⁺/CD19⁺-магнитно-меченые клетки (т.е. CD3⁺/CD19⁺-экспрессирующие клетки) удерживаются на разделительной колонке (т.е. отрицательный отбор), a CD4^-/CD56^-/CD45RA^- клетки собирают. Согласно одному варианту осуществления собранные клетки (CD3^-/CD19^- клетки) промывают и собирают. Согласно одному варианту осуществления образцы каждой фракции удаляют для подсчета клеток, определения жизнеспособности и/или проведения иммунофенотипирования.

Согласно конкретному варианту осуществления вторую стадию истощения CD3⁺ проводят (как раскрыто выше) в случаях, когда более приблизительно от 1×10⁵ CD3 до 5×10⁵ CD3, например, от 1×10⁵ CD3 до 3×10⁵ CD3, например, 2,5×10⁵ CD3, например, 2×10⁵ CD3, на кг идеальной массы тела присутствуют в собранной фракции клеток.

Альтернативно инфузию только части фракции, обедненной Т-клетками, используют для того, чтобы избежать инфузии более 5×10⁵ CD3, например, 3×10⁵ CD3, например, 2×10⁵ CD3 клеток /кг идеальной массы тела.

Согласно одному варианту осуществления незрелые гемопоэтические клетки, обедненные Т-клетками (т.е. для клеточной трансплантации), и РВМС, используемые для получения клеток, не индуцирующих GVHD, имеющих фенотип Tcm (т.е. для получения клеток вето), получают у одного и того же субъекта-донора.

В зависимости от применения способ можно осуществлять с использованием клетки или ткани, которые являются сингенными или несингенными по отношению к субъекту-реципиенту (например, аллогенными), как раскрыто выше в настоящем документе.

Согласно варианту осуществления настоящего изобретения как субъект-реципиент, так и субъект-донор являются человеком.

Согласно варианту осуществления настоящего изобретения субъект (т.е. субъект-реципиент) страдает заболеванием, которое можно лечить путем трансплантации трансплантата клеток или ткани.

Согласно варианту осуществления настоящего изобретения субъект (т.е. субъект-реципиент) страдает заболеванием, которое можно лечить трансплантацией органа или тканей.

Согласно варианту осуществления настоящего изобретения субъект (т.е. субъект-реципиент) страдает заболеванием, которое можно лечить путем трансплантации незрелых гемопоэтических клеток (например, незрелых гемопоэтических клеток, обедненных Т-клетками).

Согласно варианту осуществления настоящего изобретения субъект (т.е. субъект-реципиент) страдает заболеванием, которое можно лечить путем совместной трансплантации незрелых гемопоэтических клеток и солидного органа или ткани (например, почек, легких, печени, поджелудочной железы, сердца и т.д.).

Согласно варианту осуществления настоящего изобретения субъект (т.е. субъект-реципиент) страдает заболеванием, которое можно лечить путем совместной трансплантации незрелых гемопоэтических клеток и выделенных клеток, полученных из солидного органа или ткани (например, клеток почек, клеток легкого, клеток печени, клеток поджелудочной железы, клеток сердца и т.д., как раскрыто выше).

Согласно варианту осуществления настоящего изобретения субъект (т.е. субъект-реципиент) страдает заболеванием, которое можно лечить путем совместной трансплантации нескольких органов (например, сердечной и легочной тканей).

Согласно одному варианту осуществления клетки, органы или ткани для совместной трансплантации получают от одного и того же донора.

Трансплантацию клетки или ткани субъекту можно осуществлять различными способами в зависимости от различных параметров, таких как, например, тип клетки или ткани, тип, стадия или тяжесть заболевания реципиента (например, тип и стадия злокачественного заболевания), физические или физиологические параметры, специфические для субъекта, и/или желаемый терапевтический результат.

Трансплантацию трансплантата клеток или ткани согласно настоящему изобретению можно осуществлять путем трансплантации трансплантатов клеток или тканей в любое из различных анатомических мест, в зависимости от применения. Трансплантат клеток или тканей может быть трансплантирован в гомотопическое анатомическое место (нормальное анатомическое место для трансплантата) или в эктопическое анатомическое место (аномальное анатомическое место для трансплантата). В зависимости от применения трансплантат клеток или ткани может быть предпочтительно имплантирован под почечную капсулу или в почку, тестикулярный жир, подкожную клетчатку, сальник, воротную вену, печень, селезенку, полость сердца, сердце, грудную полость, легкое, кожу, поджелудочную железу и/или внутрибрюшное пространство.

Незрелые гемопоэтические клетки (например, незрелые гемопоэтические клетки, обедненные Т-клетками) согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения могут быть трансплантированы субъекту с использованием любого способа трансплантации клеток, известного в данной области техники, такого как без ограничения инфузия клеток (например, внутривенное введение) или внутрибрюшинный путь.

После трансплантации трансплантата клеток или ткани субъекту согласно настоящему изобретению предпочтительно, в соответствии со стандартной медицинской практикой, контролировать функцию роста и иммуносовместимость клеток, тканей или органов в соответствии с любой из различных стандартных методик. Например, число клеток незрелых гемопоэтических клеток можно контролировать у субъекта с помощью стандартных анализов крови и костного мозга (например, с помощью анализа FACS). Структурное развитие клеток или тканей можно контролировать с помощью компьютерной томографии или ультразвуковой визуализации.

В зависимости от контекста трансплантации для того, чтобы облегчить приживление трансплантата клеток или тканей, способ может дополнительно предпочтительно предусматривать кондиционирование субъекта в сублетальных, летальных или сверхлетальных условиях перед трансплантацией.

В контексте настоящего изобретения термины «сублетальное», «летальное» и «сверхлетальное» в отношении кондиционирования субъектов согласно настоящему изобретению относятся к миелотоксическим и/или лимфоцитотоксическим обработкам, которые при применении к репрезентативной популяции субъектов, соответственно, обычно являются: не смертельными по существу для всех членов популяции, смертельными для некоторых, но не всех членов популяции, или смертельными по существу для всех членов популяции при нормальных условиях стерильности.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения сублетальное, летальное или сверхлетальное кондиционирование включает тотальное облучение тела (TBI), тотальное облучение лимфоидной ткани (TLI, т.е. облучение всех лимфатических узлов, тимуса и селезенки), частичное облучение тела (например, специфическое облучение легки×, почки, головного мозга и т.д.), миелоаблативное кондиционирование и/или немиелоаблативное кондиционирование, например, с различными комбинациями, включая без ограничения костомулирующую блокаду, химиотерапевтическое средство и/или иммунотерапию антителами. Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения кондиционирование предусматривает комбинацию любого из вышеописанных протоколов кондиционирования (например, химиотерапевтическое средство и TBI, костимулирующая блокада и химиотерапевтическое средство, иммунотерапия антителами и химиотерапевтическое средство и т.д.).

Согласно одному варианту осуществления кондиционирование осуществляют посредством кондиционирования субъекта в сверхлетальных условиях, таких как миелоаблативные условия (т.е. интенсивный режим кондиционирования, при котором клетки костного мозга разрушаются).

В качестве альтернативы кондиционирование осуществляют посредством кондиционирования субъекта в летальных или сублетальных условиях, например, посредством кондиционирования субъекта в миелоредуктивных условиях или немиелоаблативных условиях, соответственно (т.е. кондиционирование пониженной интенсивности, которое является менее агрессивным режимом кондиционирования).

Согласно конкретному варианту осуществления кондиционирование предусматривает немиелоаблативное кондиционирование (например, режимом кондиционирования пониженной интенсивности).

Согласно варианту осуществления кондиционирование пониженной интенсивности проводят в течение до 2 недель (например, 1-10 или 1-7 дней) перед трансплантацией трансплантата клеток или ткани.

Согласно конкретному варианту осуществления немиелоаблативное кондиционирование предусматривает ×имиотерапевтическое средство и TBI/TLI.

Согласно одному варианту осуществления TBI содержит одну или фракционированную дозу облучения в диапазоне 0,5-1 Гр, 0,5-1,5 Гр, 0,5-2 Гр, 0,5-2,5 Гр, 0,5-5 Гр, 0,5-7,5 Гр, 0,5-10 Гр, 0,5-15 Гр, 1-1,5 Гр, 1-2 Гр, 1-2,5 Гр, 1-3 Гр, 1-3,5 Гр, 1-4 Гр, 1-4,5 Гр, 1-5 Гр, 1-7,5 Гр, 1-10 Гр, 2-3 Гр, 2-4 Гр, 2-5 Гр, 2-6 Гр, 2-7 Гр, 2-8 Гр, 2-9 Гр, 2-10 Гр, 3-4 Гр, 3-5 Гр, 3-6 Гр, 3-7 Гр, 3-8 Гр, 3-9 Гр, 3-10 Гр, 4-5 Гр, 4-6 Гр, 4-7 Гр, 4-8 Гр, 4-9 Гр, 4-10 Гр, 5-6 Гр, 5-7 Гр, 5-8 Гр, 5-9 Гр, 5-10 Гр, 6-7 Гр, 6-8 Гр, 6-9 Гр, 6-10 Гр, 7-8 Гр, 7-9 Гр, 7-10 Гр, 8-9 Гр, 8-10 Гр, 10-12 Гр или 10-15 Гр.

Согласно конкретному варианту осуществления TBI содержит одну или фракционированную дозу облучения в диапазоне 1-7,5 Гр.

Согласно конкретному варианту осуществления TBI содержит одну или фракционированную дозу облучения в диапазоне 1-5 Гр.

Согласно конкретному варианту осуществления TBI содержит одну или фракционированную дозу облучения 3 Гр.

Согласно варианту осуществления обработку субъекта посредством TBI проводят за 1-10 дней (например, 1-3 дней) перед трансплантацией. Согласно одному варианту осуществления субъекта один раз подвергают кондиционированию посредством TBI за 1, 2, 3 или 4 дня перед трансплантацией.

Согласно варианту осуществления TBI проводят на день -2 перед трансплантацией.

Согласно варианту осуществления TBI проводят на день -1 перед трансплантацией.

Согласно варианту осуществления TBI проводят в день трансплантации, например, утром в день 0, и трансплантацию проводят в тот же день, например, вечером.

Согласно конкретному варианту осуществления TBI содержит одну или фракционированную дозу облучения на день -1 (т.е. за один день до трансплантации).

Согласно конкретному варианту осуществления ТЫ содержит дозу облучения в диапазоне 0,5-1 Гр, 0,5-1,5 Гр, 0,5-2,5 Гр, 0,5-5 Гр, 0,5-7,5 Гр, 0,5-10 Гр, 0,5-15 Гр, 1-1,5 Гр, 1-2 Гр, 1-2,5 Гр, 1-3 Гр, 1-3,5 Гр, 1-4 Гр, 1-4,5 Гр, 1-1,5 Гр, 1-7,5 Гр, 1-10 Гр, 2-3 Гр, 2-4 Гр, 2-5 Гр, 2-6 Гр, 2-7 Гр, 2-8 Гр, 2-9 Гр, 2-10 Гр, 3-4 Гр, 3-5 Гр, 3-6 Гр, 3-7 Гр, 3-8 Гр, 3-9 Гр, 3-10 Гр, 4-5 Гр, 4-6 Гр, 4-7 Гр, 4-8 Гр, 4-9 Гр, 4-10 Гр, 5-6 Гр, 5-7 Гр, 5-8 Гр, 5-9 Гр, 5-10 Гр, 6-7 Гр, 6-8 Гр, 6-9 Гр, 6-10 Гр, 7-8 Гр, 7-9 Гр, 7-10 Гр, 8-9 Гр, 8-10 Гр, 10-12 Гр, 10-15 Гр, 10-20 Гр, 10-30 Гр, 10-40 Гр, 10-50 Гр, 0,5-20 Гр, 0,5-30 Гр, 0,5-40 Гр или 0,5-50 Гр.

Согласно конкретному варианту осуществления ТЫ содержит одну или фракционированную дозу облучения в диапазоне 1-7,5 Гр.

Согласно конкретному варианту осуществления ТЫ содержит одну или фракционированную дозу облучения в диапазоне 1-5 Гр.

Согласно конкретному варианту осуществления ТЫ содержит одну или фракционированную дозу облучения 3 Гр.

Согласно варианту осуществления обработку субъекта посредством TBI проводят за 1-10 дней (субъекта один раз подвергают кондиционированию посредством ТЫ за 1, 2, 3 или 4 дня перед трансплантацией.

Согласно варианту осуществления TLI проводят на день -2 перед трансплантацией.

Согласно варианту осуществления TLI проводят на день -1 перед трансплантацией.

Согласно варианту осуществления TLI проводят в день трансплантации, например, утром в день 0, и трансплантацию проводят в тот же день, например, вечером.

Согласно конкретному варианту осуществления TLI содержит одну или фракционированную дозу облучения на день -1 (т.е. один день до трансплантации).

Согласно одному варианту осуществления кондиционирование содержит химиотерапевтическое средство. Иллюстративные химиотерапевтические средства включают без ограничения Бусульфан, Бусульфекс, Циклофосфамид, Флударабин, Мелфалан, Милеран, Рапамицин, Трисульфан и Тиотепа. Химиотерапевтическое средство/средства можно вводить субъекту в виде одной дозы или в виде нескольких доз, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более доз (например, ежедневные дозы) перед трансплантацией.

Согласно конкретному варианту осуществления субъекту вводят химиотерапевтическое средство (например, Флударабин, например, при дозе приблизительно 30 мг/м²/день) в течение 3, 4, 5 или 6 последовательных дней (например, 4 последовательных дней) перед трансплантацией (например, на день от -7 до -4, например, на день от -6 до -3).

Флударабин коммерчески доступен, например, от Sanofi Genzyme, Bayer и Teva, например, под торговым наименованием, например, Флудара.

Согласно одному варианту осуществления кондиционирование перед трансплантацией предусматривает in vivo сокращение Т-клеток.

Согласно некоторым вариантам осуществления in-vivo сокращение Т-клеток осуществляют посредством антител.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения антитела содержат анти-CD8 антитело, анит-CD4 антитело, или и то, и другое.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения антитела содержат антитимоцитарный глобулин (ATG) антитела, анти-CD52 антитела или анти-CD3 (ОКТ3) антитела.

Согласно одному варианту осуществления антитело вводят субъекту в виде одной дозы или в виде нескольких доз, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более доз (например, ежедневных доз) перед трансплантацией.

Согласно конкретному варианту осуществления субъекту вводят терапевтическое средство антитело (например, ATG, например, при дозе приблизительно 2 мг на кг идеальной массы тела) в течение 2, 3, 4 или 5 последовательных дней (например, 3 последовательных дней) перед трансплантацией (например, на день от -10 до -8 перед трансплантацией, например, на день от -9 до -7 перед трансплантацией).

Согласно конкретному варианту осуществления субъекта лечат посредством трех введений ATG перед трансплантацией (например, при дозе приблизительно 2 мг на кг идеальной массы тела, например, на день -9, -8 и -7 перед трансплантацией).

Согласно конкретному варианту осуществления субъекта лечат посредством двух введений ATG перед трансплантацией (например, при дозе приблизительно 2 мг на кг идеальной массы тела, например, на день -9 и -8, или -8 и -7 перед трансплантацией).

Согласно конкретному варианту осуществления субъекта лечат посредством одного введения ATG перед трансплантацией (например, при дозе приблизительно 2 мг на кг идеальной массы тела, например, на день -9, -8 или -7 перед трансплантацией).

Согласно конкретному варианту осуществления кондиционирование перед трансплантацией не предусматривает in vivo сокращение Т-клеток.

Согласно конкретному варианту осуществления субъекта не лечат посредством ATG перед трансплантацией.

Необходимо отметить, что если ATG не используют или используют более низкие дозы ATG, например, одна доза или две дозы (например, каждая доза составляет около 2 мг на кг идеальной массы тела), более высокие дозы облучения могут использоваться как часть протокола немиелоаблативного кондиционирования (например, TBI в виде одной или фракционированной дозы облучения 3-5 Гр, например, 3 Гр, 4 Гр или 5 Гр).

Антитимоцитарный глобулин (ATG) антитела коммерчески доступны, например, от Genzyme и Pfizer, например, под торговым наименованием, например, Тимоглобулин и Атгам.

Согласно одному варианту осуществления, когда у субъекта имеется В-клеточное злокачественное новообразование, схема кондиционирования перед трансплантацией включает ритуксимаб (например, при дозе приблизительно 375 мг/м², например, на день -12, -11, -10, -9, -8 или -7), например, надень -10 перед трансплантацией).

Ритуксимаб коммерчески доступен, например, от Genentech и Roche, например, под торговыми марками, например, Мабтера, Риксатон, Труксима, Ритуксан.

Согласно одному варианту осуществления способ предусматривает введение после трансплантации терапевтически эффективного количества циклофосфамида.

Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение дополнительно охватывает введение циклофосфамида перед трансплантацией (например, на день 6, 5, 4 или 3 перед трансплантацией, т.е. день от -6 до -3) в дополнение к введению после трансплантации, как описано в настоящем документе.

Например, в случае трансплантата клеток или ткани терапевтически эффективное количество циклофосфамида составляет приблизительно 1-25 мг, 1-50 мг, 1-75 мг, 1-100 мг, 1-250 мг, 1-500 мг, 1-750 мг, 1-1000 мг, 5-50 мг, 5-75 мг, 5-100 мг, 5-250 мг, 5-500 мг, 5-750 мг, 5-1000 мг, 10-50 мг, 10-75 мг, 10-100 мг, 10-250 мг, 10-500 мг, 10-750 мг, 10-1000 мг, 25-50 мг, 25-75 мг, 25-100 мг, 25-125 мг, 25-200 мг, 25-300 мг, 25-400 мг, 25-500 мг, 25-750 мг, 25-1000 мг, 50-75 мг, 50-100 мг, 50-125 мг, 50-150 мг, 50-175 мг, 50-200 мг, 50-250 мг, 50-500 мг, 50-1000 мг, 75-100 мг, 75-125 мг, 75-150 мг, 75-250 мг, 75-500 мг, 75-1000 мг, 100-125 мг, 100-150 мг, 100-200 мг, 100-300 мг, 100-400 мг, 100-500 мг, 100-1000 мг, 125-150 мг, 125-250 мг, 125-500 мг, 125-1000 мг, 150-200 мг, 150-300 мг, 150-500 мг, 150-1000 мг, 200-300 мг, 200-400 мг, 200-500 мг, 200-750 мг, 200-1000 мг, 250-500 мг, 250-750 мг, 250-1000 мг на килограмм идеальной массы тела субъекта.

Согласно конкретному варианту осуществления терапевтически эффективное количество циклофосфамида составляет приблизительно 25-200 мг на килограмм идеальной массы тела субъекта.

Согласно одному варианту осуществления циклофосфамид вводят в виде одной дозы.

Согласно одному варианту осуществления, циклофосфамид вводят в виде множества доз, например, в виде 2, 3, 4, 5 доз или более.

Согласно конкретному варианту осуществления циклофосфамид вводят в виде двух доз.

Доза каждого введения циклофосфамида может составлять приблизительно 5 мг, 7,5 мг, 10 мг, 20 мг, 30 мг, 40 мг, 50 мг, 60 мг, 70 мг, 80 мг, 90 мг, 100 мг, 110 мг, 120 мг, 130 мг, 140 мг, 150 мг, 160 мг, 170 мг, 180 мг, 190 мг, 200 мг, 210 мг, 220 мг, 230 мг, 240 мг, 250 мг, 260 мг, 270 мг, 280 мг, 290 мг, 300 мг, 350 мг, 400 мг, 450 мг или 500 мг на килограмм идеальной массы тела субъекта.

Согласно конкретному варианту осуществления каждая доза циклофосфамида составляет 50 мг на килограмм идеальной массы тела субъекта.

Как указано, циклофосфамид вводят после трансплантации. Таким образом, например, циклофосфамид можно вводить субъекту через 1, 2, 3, 4, 5 дней после трансплантации (т.е. день +1, +2, +3, +4, +5).

Согласно конкретному варианту осуществления, циклофосфамид вводят субъекту в виде двух доз через 3 и 4 дня после трансплантата.

Циклофосфамид коммерчески доступен от, например, Zydus (German Remedies), Roxane Laboratories Inc-Boehringer higelheim, Bristol-Myers Squibb Co - Mead Johnson and Co и Pfizer - Pharmacia & Upjohn под торговыми наименованиями Эндоксан, Цитоксан, Неозар, Процитокс и Ревиммун.

Согласно одному варианту осуществления субъекта лечат дополнительными поддерживающими лекарственными средствами, например, химиотерапевтическими адъюв антами.

Согласно одному варианту осуществления субъекту вводят дозу Месна (например, 10 мг/кг внутривенным введением «piggy back» (IVPB) непосредственно перед введением первой дозы циклофосфамида (например, за 2 часа, 1 час, 30 минут, 15 минут до введения первой дозы циклофосфамида). Согласно одному варианту осуществления введение Месна повторяют каждые 4 часа, всего 10 доз.

Месна коммерчески доступен, например, от Baxter под торговыми марками Уромитексан и Меснекс.

Согласно одному варианту осуществления субъекта лечат ондансетроном (или другим противорвотным средством) перед каждой дозой циклофосфамида (Су).

Согласно одному варианту осуществления субъект не получает лечение иммуносупрессивным средством (например, за исключением CY и клеток вето, раскрытых в настоящем документе).

Согласно одному варианту осуществления субъекта лечат иммуносупрессивный средством.

Примеры иммуносупрессивных средств включают без ограничения Такролимус (также известный как FK-506 или фужимицин, торговые названия: Програф, Адваграф, Протопик), Микофенолят Мофетил, Микофенолят натрия, Преднизолон, метотрексат, циклофосфамид, циклоспорин, циклоспорин А, хлорохин, гидроксихлорохин, сульфасалазин (сульфасалазопирин), соли золота, D-пеницилламин, лефлуномид, азатиоприн, анакинра, инфликсимаб (REMICADE), этанерцепт, ТЫЕальфа, блокаторы, биологический агент, нацеленный на воспалительный цитокин, и нестероидный противовоспалительный препарат (NSAID). Примеры NSAID включают без ограничения ацетилсалициловую кислоту, салицилат холина магния, дифлунисал, салицилат магния, салсалат, салицилат натрия, диклофенак, этодолак, фенопрофен, флурбипрофен, индометацин, кетопрофен, кеторолак, меклофенамат, напроксен, набуметон, фенилбутазон, пироксикам, сулиндак, толметин, ацетаминофен, ибупрофен, ингибиторы Cox-2, трамадол, рапамицин (сиролимус) и аналоги рапамицина (такие как CCI-779, RAD001, АР23573). Эти агенты можно вводить по отдельности или в комбинации.

Согласно одному варианту осуществления кортикостероиды не вводят в качестве лечения, предшествующего клеткам вето.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к способу лечения субъекта, нуждающегося в трансплантации незрелых гемопоэтических клеток, где способ предусматривает:

(a) кондиционирование субъекта согласно протоколу немиелоаблативного кондиционирования перед трансплантацией, где немиелоаблативное кондиционирование предусматривает тотальное облучение тела (TBI) и химиотерапевтическое средство, где TBI и химиотерапевтическое средство вводят на день -7 до -1 перед трансплантацией (например, на день от -7 до -2, или на день от -6 до -1 перед трансплантацией),

(b) трансплантацию субъекту дозы незрелых гемопоэтических клеток, обедненных Т-клетками, где незрелые гемопоэтические клетки, обедненные Т-клетками, содержат менее 5×10⁵ Т-клеток CD3⁺ на килограмм идеальной массы тела субъекта, и где незрелые гемопоэтические клетки, обедненные Т-клетками, содержат по меньшей мере 5×10⁶ CD34⁺ клеток на килограмм идеальной массы тела субъекта,

(d) введение субъекту терапевтически эффективного количества выделенной популяции клеток, не индуцирующих GVHD, согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения, где выделенную популяцию клеток, не индуцирующих GVHD, вводят на день 7 после трансплантации незрелых гемопоэтических клеток, обедненных Т-клетками,

Согласно конкретному варианту осуществления, TBI вводят в день трансплантации незрелых гемопоэтических клеток, обедненных Т-клетками, например, утром на день 0, и трансплантацию проводят в тот же день, например, вечером.

Согласно конкретному варианту осуществления субъекта лечат следующим образом: Флударабин вводят субъекту в виде 4 последовательных дозах (например, 30 мг/м²/день) в дни от -6 до -3 (до трансплантации), TBI вводят субъекту в виде одной или фракционированной дозы облучения (например, 3-5 Гр, например, 3 Гр) на день -1 перед трансплантацией, в день 0 (т.е. день трансплантации) субъекту вводят (например, IV) мегадозу незрелых гемопоэтических клеток, обедненных Т -клетками, содержащих CD34⁺отобранные клетки и/или СВ"3/СВ19-обедненные клетки (например, клетки, собранные после мобилизации донора, обедненные CD3/CD19-экспрессирующими клетками и/или отобранные по экспрессии CD34, криоконсервированные и размороженные в день трансплантации, как описано в настоящем документе), в дни +3 и +4 субъекту вводят (например, IV) циклофосфамид (CY), каждый раз при дозе, например, 50 мг/кг идеальной массы тела/день, а в день +7 субъекту вводят посредством инфузии противовирусные клетки вето согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения при дозе, например, 2,5-10×10⁶ CD8⁺ клеток на кг идеальной массы тела.

Согласно конкретному варианту осуществления субъекту вводят ATG (тимоглобулин) в виде 3 последовательных доз (например, 2 мг на кг идеальной массы тела) в дни от -9 до -7 (до трансплантации).

Согласно конкретному варианту осуществления субъекта лечат следующим образом: Флударабин вводят субъекту в виде 4 последовательных дозах (например, 30 мг/м²/день) в дни от -7 до -4 (до трансплантации), TBI вводят субъекту в виде одной или фракционированной дозы облучения (например, 3-5 Гр, например, 3 Гр) на день -2 перед трансплантацией, в день-1 субъекту вводят (например, IV) первую дозу мегадозы незрелых гемопоэтических клеток, обедненных Т-клетками, содержащими CD34⁺ отобранные клетки (например, клетки, собранные после мобилизации донора и отобранные по экспрессии CD34 и используемые в качестве свежих клеток, как описано в настоящем документе), в день 0 субъекту вводят (например, IV) вторую дозу мегадозы незрелых гемопоэтических клеток, обедненных Т-клетками, содержащих CD3/CD19-обедненные клетки (например, клетки, собранные после мобилизации донора, обедненные СВЗ/СВ19-экспрессирующими клетками и используемые в качестве свежих клеток, как описано в настоящем документе), в дни +3 и +4 субъекту вводят (например, IV) циклофосфамидом (С Y), в каждом случае при дозе, например, 50 мг/кг идеальной массы тела/день, и на день +7 субъекту вводят противовирусные клетки вето согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения при дозе, например, 2,5-10×10⁶ CD8⁺ клеток на кг идеальной массы тела.

Согласно конкретному варианту осуществления субъекту вводят ATG (тимоглобулин) в виде 3 последовательных доз (например, 2 мг на кг идеальной массы тела) в дни от -10 до -8 (до трансплантации).

Согласно конкретному варианту осуществления субъекту вводят дозу Месна (например, 10 мг/кг внутривенным введением «piggyback» (IVPB) непосредственно перед введением первой дозы циклофосфамида. Согласно одному варианту осуществления это повторяют каждые 4 часа до в общем 10 доз.

Согласно конкретному варианту осуществления субъекта лечат ондансетроном (или другим противорвотным средством) перед каждой дозой циклофосфамида (CY).

Согласно конкретному варианту осуществления лечение, предшествующее клеткам вето, не предусматривает кортикостероиды.

Согласно конкретному варианту осуществления, когда у субъекта имеется В-клеточное злокачественное новообразование, схема кондиционирования перед трансплантацией предусматривает ритуксимаб (например, при дозе около 375 мг/м², например, на день -10 перед трансплантацией).

Число введений и терапевтически эффективное количество предтрансплантационных и посттрансплантационных иммуносупрессивных лекарственных средств и/или иммуносупрессивного облучения можно корректировать по мере необходимости с учетом типа трансплантации и реакции субъекта на схему. Определение числа введений и терапевтически эффективного количества находится в пределах компетенции специалиста в данной области техники, особенно в свете подробного описания, представленного в настоящем документе.

Независимо от типа трансплантата для того, чтобы избежать отторжения трансплантата и реакции «трансплантата против хозяина» (GHVD) и/или для индукции донор-специфической толерантности, в способе согласно настоящему изобретению используются новые клетки Tcm (как подробно описано в настоящем документе выше).

Согласно одному варианту осуществления клетки, не индуцирующие GVHD, имеющие фенотип Tcm (т.е. клетки вето) согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения, используются сами по себе для уменьшения отторжения трансплантата и/или для уменьшения GVHD трансплантированных клеток, тканей или органов (например, трансплантированных от одного и того же донора).

Согласно одному варианту осуществления клетки, не индуцирующие GVHD, имеющие фенотип Tcm (т.е. клетки вето), подлежат введению либо одновременно с, до или после трансплантации трансплантата клеток или тканей.

Согласно одному варианту осуществления клетки, не индуцирующие GVHD, имеющие фенотип Tcm (т.е. клетки вето), подлежат введению либо одновременно с, до или после трансплантации незрелых гемопоэтических клеток (например, незрелых гемопоэтических клеток, обедненных Т-клетками).

Согласно конкретному варианту осуществления клетки, не индуцирующие GVHD, имеющие фенотип Tcm (т.е. клетки вето), подлежат введению после несингенного трансплантата клеток или ткани.

Согласно конкретному варианту осуществления клетки, не индуцирующие GVHD, имеющие фенотип Tcm (т.е. клетки вето), подлежат введению после незрелых гемопоэтических клеток (например, незрелых гемопоэтических клеток, обедненных Т-клетками).

Согласно одному варианту осуществления клетки, не индуцирующие GVHD, имеющие фенотип Tcm (т.е. клетки вето), подлежат введению на день 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 21 после несингенного трансплантата клеток или ткани (например, незрелых гемопоэтических клеток, обедненных Т-клетками).

Согласно одному варианту осуществления клетки, не индуцирующие GVHD, имеющие фенотип Tcm (т.е. клетки вето), подлежат введению на день 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 21 после незрелых гемопоэтических клеток (например, незрелых гемопоэтических клеток, обедненных Т-клетками).

Согласно конкретному варианту осуществления клетки, не индуцирующие GVHD, имеющие фенотип Tcm (т.е. клетки вето), подлежат введению на день 6-9 после несингенного трансплантата клеток или ткани (например, незрелых гемопоэтических клеток, например, незрелых гемопоэтических клеток, обедненных Т-клетками).

Согласно конкретному варианту осуществления клетки, не индуцирующие GVHD, имеющие фенотип Tcm (т.е. клетки вето), подлежат введению на день 9 после несингенного трансплантата клеток или ткани.

Согласно конкретному варианту осуществления клетки, не индуцирующие GVHD, имеющие фенотип Tcm (т.е. клетки вето), подлежат введению на день 8 после несингенного трансплантата клеток или ткани.

Согласно конкретному варианту осуществления клетки, не индуцирующие GVHD, имеющие фенотип Tcm (т.е. клетки вето), подлежат введению на день 7 после несингенного трансплантата клеток или ткани.

Согласно конкретному варианту осуществления клетки, не индуцирующие GVHD, имеющие фенотип Tcm (т.е. клетки вето), подлежат введению на день 6 после несингенного трансплантата клеток или ткани.

Согласно конкретному варианту осуществления клетки, не индуцирующие GVHD, имеющие фенотип Tcm (т.е. клетки вето), подлежат введению на день 9 после незрелых гемопоэтических клеток (например, незрелых гемопоэтических клеток, обедненных Т-клетками).

Согласно конкретному варианту осуществления клетки, не индуцирующие GVHD, имеющие фенотип Tcm (т.е. клетки вето), подлежат введению на день 8 после незрелых гемопоэтических клеток (например, например, незрелых гемопоэтических клеток, обедненных Т-клетками).

Согласно конкретному варианту осуществления клетки, не индуцирующие GVHD, имеющие фенотип Tcm (т.е. клетки вето), подлежат введению на день 7 после незрелых гемопоэтических клеток (например, например, незрелых гемопоэтических клеток, обедненных Т-клетками).

Согласно конкретному варианту осуществления клетки, не индуцирующие GVHD, имеющие фенотип Tcm (т.е. клетки вето), подлежат введению на день 6 после незрелых гемопоэтических клеток (например, незрелых гемопоэтических клеток, обедненных Т-клетками).

Согласно конкретному варианту осуществления, когда клетки вето используют в качестве адъювантной терапии для трансплантации клеток или тканей, полученных из солидного органа или ткани (например, клеток почек, клеток легкого, клеток печени, клеток поджелудочной железы, клеток сердца и т.д., как раскрыто выше), клетки вето можно вводить одновременно с, до или после трансплантации трансплантата клеток или тканей.

Согласно конкретному варианту осуществления, при совместной трансплантации незрелых гемопоэтических клеток (например, незрелых гемопоэтических клеток, обедненных Т-клетками) и клеток или тканей, полученных из солидного органа или ткани (например, клеток почек, клеток легкого, клеток печени, клеток поджелудочной железы, клеток сердца и т.д., как раскрыто выше), клетки вето, незрелые гемопоэтические клетки и клетки или ткани можно вводить в любом порядке (например, клетки почек, незрелые гемопоэтические клетки и клетки вето, незрелые гемопоэтические клетки, клетки почек и клетки вето и т.д.).

Согласно конкретному варианту осуществления, при проведении совместной трансплантации незрелых гемопоэтических клеток (например, незрелых гемопоэтических клеток, обедненных Т-клетками) и клеток или тканей, полученных из солидного органа или ткани (например, клеток почек, клеток легкого, клеток печени, клеток поджелудочной железы, клеток сердца и т.д., как раскрыто выше), клетки вето и незрелые гемопоэтические клетки вводят, в трансплантат клеток или тканей трансплантируют только после установления химеризма (например, незрелые гемопоэтические клетки, клетки вето и клетки почек).

Согласно конкретному варианту осуществления незрелые гемопоэтические клетки можно вводить в виде одного введения, например, содержащего CD3⁺/CD19⁺-обедненные CD34⁺ клетки (например, при применении криоконсервированных клеток, которые размораживают в день трансплантации).

Согласно конкретному варианту осуществления, незрелые гемопоэтические клетки можно вводить в виде двух или более введений, например, первое введение, содержащее СВ34⁺-отобранные клетки, и второе введение, содержащее CD3⁺/CD19⁺-обедненные клетки (например, при использовании свежих клеток, т.е. клеток, которые собирают и используют в течение приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дней, например, в течение приблизительно 1 дня). Следует понимать, что их можно вводить одновременно или последовательно друг за другом (например, в один и тот же день или в течение 1, 2, 3, 4, 5 дней друг за другом).

Клетки, не индуцирующие GVHD, имеющие фенотип Tcm, согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения можно вводить посредством любого способа, известного в данной области техники для трансплантации клеток, такого как без ограничения инфузия клеток (например, внутривенная) или внутрибрюшинный путь.

Согласно одному варианту осуществления клетки, не индуцирующие GVHD, имеющие фенотип Tcm, применяют в виде свежи клеток.

Согласно одному варианту осуществления клетки, не индуцирующие GVHD, имеющие фенотип Tcm, криоконсервированы.

Клетки, не индуцирующие GVHD, имеющие фенотип Tcm, согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения, можно вводить в организм в имеющемся виде или в фармацевтической композиции, в которой они смешаны с подходящими носителями или вспомогательными веществами.

Подобным образом, трансплантат клеток или ткани, например, незрелые гемопоэтические клетки (например, незрелые гемопоэтические клетки, обедненные Т-клетками) согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения, можно вводить в организм в имеющемся виде или в фармацевтической композиции, в которой он смешан с подходящими носителями или вспомогательными веществами.

В контексте настоящего изобретения термин «фармацевтическая композиция» относится к препарату из одного или нескольких активных ингредиентов, описанных в настоящем документе, с другими химическими компонентами, такими как физиологически подходящие носители и вспомогательные вещества. Целью фармацевтической композиции является облегчение введения соединения в организм.

В контексте настоящего изобретения термин «активный ингредиент» относится к клеткам Tcm, ответственным за биологический эффект.

Далее в настоящем документе фразы «физиологически приемлемый носитель» и «фармацевтически приемлемый носитель», которые могут использоваться взаимозаменяемо, относятся к носителю или разбавителю, который не вызывает значительного раздражения организма и не отменяет биологическую активность и свойства вводимого соединения. Адъювант включен в эти фразы.

В контексте настоящего изобретения термин «вспомогательное вещество» относится к инертному веществу, добавляемому в фармацевтическую композицию для дополнительного облегчения введения активного ингредиента. Примеры без ограничения вспомогательных веществ включают карбонат кальция, фосфат кальция, различные сахара и типы крахмала, производные целлюлозы, желатин, растительные масла и полиэтиленгликоли.

Методы составления и введения лекарственных средств можно найти в "Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, PA, latest edition, который включен в настоящий документ посредством ссылки.

Подходящие пути введения могут, например, включать пероральный, ректальный, через слизистую оболочку, особенно трансназальный, кишечный или парентеральный путь введения, включая внутримышечные, подкожные и интрамедуллярные инъекции, а также интратекальные, прямые внутрижелудочковые, внутрисердечные, например, в полость правого или левого желудочка, в общую коронарную артерию, внутривенные, внутрибрюшинные, интраназальные или внутриглазные инъекции.

Обычные подходы к доставке лекарственного средства в центральную нервную систему (CNS) включают нейрохирургические стратегии (например, внутримозговую инъекцию или внутрижелудочковую инфузию), молекулярные манипуляции с агентом (например, получение химерного слитого белка, который содержит транспортный пептид, обладающий аффинностью для молекулы поверхности эндотелиальной клетки, в комбинации с агентом, который сам по себе не способен проникать через ВВВ) в попытке использовать один из эндогенных путей транспорта ВВВ, фармакологические стратегии, предназначенные для повышения растворимости агента в липидах (например, конъюгация водорастворимых агентов с липидными или холестериновыми носителями), а также временное нарушение целостности ВВВ посредством гиперосмотического нарушения (в результате инфузии раствора маннита в сонную артерию или применения биологически активного агента, такого как ангиотензин пептид). Однако каждая из этих стратегий имеет ограничения, такие как неотъемлемые риски, связанные с инвазивной хирургической процедурой, ограничение размера, обусловленное ограничением, присущим эндогенным транспортным системам, потенциально нежелательные биологические побочные эффекты, связанные с системным введением химерной молекулы, состоящей из мотива носителя, который может быть активен за пределами CNS, и возможный риск повреждения головного мозга в областях мозга, где нарушается ВВВ, что делает его неоптимальным способом доставки.

Альтернативно, фармацевтическую композицию можно вводить локально, а не системно, например, путем инъекции фармацевтической композиции непосредственно в область ткани пациента.

Фармацевтические композиции согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения могут быть получены способами, хорошо известными в данной области техники, например, с помощью обычных способов смешивания, растворения, гранулирования, приготовления драже, растирания, эмульгирования, инкапсулирования, захвата или лиофилизации.

Фармацевтические композиции для применения в соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения, таким образом, могут быть получены обычным образом с использованием одного или нескольких физиологически приемлемых носителей, содержащих вспомогательные вещества и добавки, которые облегчают обработку активных ингредиентов в препараты, которые можно использовать в фармацевтике. Надлежащий состав зависит от выбранного пути введения.

Для инъекции активные ингредиенты фармацевтической композиции могут быть получены в виде водных растворов, предпочтительно в физиологически совместимых буферах, таких как раствор Хенкса, раствор Рингера или физиологический солевой буфер. Для введения через слизистую оболочку в препарате используют пенетранты, соответствующие барьеру, который необходимо преодолеть. Такие пенетранты обычно известны в данной области техники.

Фармацевтическую композицию для перорального введения можно легко составить путем объединения активных соединений с фармацевтически приемлемыми носителями, хорошо известными в данной области техники. Такие носители позволяют получить фармацевтическую композицию в виде таблеток, пилюль, драже, капсул, жидкостей, гелей, сиропов, взвесей, суспензий и т.п.для перорального приема пациентом. Фармакологические препараты для перорального применения могут быть получены с использованием твердого вспомогательного вещества, необязательного измельчения полученной смеси и обработки смеси гранул после добавления при необходимости подходящих вспомогательных веществ с получением таблеток или ядер драже. Подходящими вспомогательными веществами являются, в частности, наполнители, такие как сахара, включая лактозу, сахарозу, маннит или сорбит, препараты целлюлозы, такие как, например, кукурузный крахмал, пшеничный крахмал, рисовый крахмал, картофельный крахмал, желатин, трагакантовая камедь, метилцеллюлоза,

гидроксипропилметилцеллюлоза, карбометилцеллюлоза натрия и/или физиологически приемлемые полимеры, такие как поливинилпирролидон (PVP). При необходимости могут быть добавлены разрыхлители, такие как сшитый поливинилпирролидон, агар или альгиновая кислота или ее соль, такая как альгинат натрия.

Ядра драже покрывают подходящими покрытиями. Для этой цели можно использовать концентрированные растворы сахаров, которые необязательно могут содержать гуммиарабик, тальк, поливинилпирролидон, гель карбопол, полиэтиленгликоль, диоксид титана, растворы лаков и подходящие органические растворители или смеси растворителей. Красители или пигменты могут быть добавлены к покрытиям таблеток или драже для идентификации или для ×арактеристики различных комбинаций доз активного соединения.

Фармацевтические композиции, которые можно применять перорально, включают твердые капсулы, изготовленные из желатина, а также мягкие герметичные капсулы, изготовленные из желатина и пластификатора, такого как глицерин или сорбит. Твердые капсулы могут содержать активные ингредиенты в смеси с наполнителем, таким как лактоза, связующими веществами, такими как крахмалы, смазывающими веществами, такими как тальк или стеарат магния, и необязательно стабилизаторами. В мягких капсулах активные ингредиенты могут быть растворены или суспендированы в подходящих жидкостях, таких как жирные масла, жидкий парафин или жидкие полиэтиленгликоли. Кроме того, могут быть добавлены стабилизаторы. Все составы для перорального введения должны быть в дозировках, подходящих для выбранного пути введения.

Для трансбуккального введения композиции могут иметь форму таблеток или пастилок, составленных обычным образом.

Для введения путем назальной ингаляции активные ингредиенты для применения в соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения удобно доставлять в форме аэрозольного спрея из упаковки под давлением или распылителя с использованием подходящего пропеллента, например, ди×лордифторметана, трихлор фтор метана, дихлортетрафторэтана или диоксида углерода. В случае аэрозоля под давлением стандартная дозировка может быть определена путем обеспечения клапана для подачи отмеренного количества. Капсулы и картриджи, например, из желатина для использования в дозаторе, могут быть составлены с использованием порошковой смеси соединения и подходящей порошковой основы, такой как лактоза или крахмал.

Фармацевтическая композиция, описанная в настоящем документе, может быть составлена для парентерального введения, например, путем болюсной инъекции или непрерывной инфузии. Составы для инъекций могут быть представлены в виде стандартной лекарственной формы, например, в ампулах или в многодозовых контейнерах с необязательно добавленным консервантом. Композиции могут представлять собой суспензии, растворы или эмульсии в масляных или водных носителях и могут содержать агенты для состава, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие агенты.

Фармацевтические композиции для парентерального введения включают водные растворы активного препарата в растворимой в воде форме. Кроме того, суспензии активных ингредиентов могут быть получены в виде подходящих суспензий для инъекций на масляной или водной основе. Подходящие липофильные растворители или носители включают жирные масла, такие как кунжутное масло, или синтетические сложные эфиры жирных кислот, такие как этилолеат, триглицериды или липосомы. Водные суспензии для инъекций могут содержать вещества, повышающие вязкость суспензии, такие как натрийкарбоксиметилцеллюлоза, сорбит или декстран. Необязательно суспензия может также содержать подходящие стабилизаторы или агенты, повышающие растворимость активных ингредиентов, что позволяет получать высококонцентрированные растворы.

В качестве альтернативы, активный ингредиент может быть в форме порошка для растворения с подходящим носителем, например, стерильным апирогенным раствором на водной основе, перед применением.

Фармацевтическая композиция согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения также может быть получена в виде ректальных композиций, таких как суппозитории или удерживающие клизмы, с использованием, например, обычных основ для суппозиториев, таких как масло какао или другие глицериды.

Согласно одному варианту осуществления клетки, не индуцирующие GVHD, имеющие фенотип Tcm, составлены для введения в виде свежи клеток.

Согласно одному варианту осуществления клетки, не индуцирующие GVHD, имеющие фенотип Tcm, составлены для введения в виде криоконсервированных клеток.

Фармацевтические композиции, подходящие для использования в контексте некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения, включают композиции, в которых активные ингредиенты содержатся в количестве, эффективном для достижения намеченной цели. Более конкретно, терапевтически эффективное количество означает количество активных ингредиентов (клеток Tcm, не индуцирующих GVHD), эффективное для толеризации (т.е. вето-эффект), эффекта против заболевания, противоопухолевого эффекта и/или восстановления иммунитета без индукции GVHD. Поскольку клетки Tcm в соответствии с настоящим изобретением размещаются в лимфатических узлах после трансплантации, может потребоваться меньшее количество клеток (по сравнению с ранее использовавшейся дозой клеток, см., например, WO 2001/049243) для достижения положительного эффекта (эффектов) клеток (например, толерантность, эффект против заболевания, противоопухолевое действие и/или восстановление иммунитета). Должно быть понятно, что более низкие уровни иммуносупрессоров (обсуждаемых выше) могут быть необходимы в сочетании с клетками Tcm согласно настоящему изобретению. Аналогичным образом, могут потребоваться более низкие уровни немиелоаблативных лекарственных средств (обсуждаемых выше) в сочетании с клетками Tcm согласно настоящему изобретению (например, исключение ATG из протокола кондиционирования перед трансплантацией).

Определение терапевтически эффективного количества находится в пределах компетенции специалистов в данной области техники, особенно в свете подробного описания, представленного в настоящем документе.

Для любого препарата, используемого в способах согласно настоящему изобретению, терапевтически эффективное количество или доза могут быть первоначально оценены посредством анализов in vitro и клеточных культур. Например, дозу можно составить на животных моделях для достижения желаемой концентрации или титра. Такая информация может быть использована для более точного определения полезных доз для человека.

Например, в случае трансплантации клеток (например, трансплантации мегадозы незрелых гемопоэтических клеток, обедненных Т-клетками, как раскрыто в настоящем документе ниже), количество клеток Tcm для инфузии субъекту должно составлять более 1×10⁶ клеток на кг идеальной массы тела. Количество клеток Tcm для инфузии субъекту должно, как правило, быть в интервале от 0,01×10⁶ до 20×10⁶ клеток на кг идеальной массы тела, от 0,01 ×10⁶ до 0,5 ×10⁶ клеток на кг идеальной массы тела, от 0,01 ×10⁶ до 1×10⁶ клеток на кг идеальной массы тела, от 0,01 ×10⁶ до 5×10⁶ клеток на кг идеальной массы тела, от 0,1×10⁶ до 0,5×10⁶ клеток на кг идеальной массы тела, от 0,1×10⁶ до 1×10⁶ клеток на кг идеальной массы тела, от 0,1x106 до 5×10⁶ клеток на кг идеальной массы тела, от 0,5×10⁶ до 1×10⁶ клеток на кг идеальной массы тела, от 0,5×10⁶ до 1×10⁶ клеток на кг идеальной массы тела, от 0,5×10⁶ до 5×10⁶ клеток на кг идеальной массы тела, от 1×10⁶до 5×10⁶ клеток на кг идеальной массы тела, от 1×10⁶ до 20×10⁶ клеток на кг идеальной массы тела, от 5×10⁶ до 20×10⁶ клеток на кг идеальной массы тела, от 10×10⁶ до 15×10⁶ клеток на кг идеальной массы тела, от 10×10⁶ до 20×10⁶ клеток на кг идеальной массы тела или от 15×10⁶ до 20×10⁶ клеток на кг идеальной массы тела.

Согласно конкретному варианту осуществления доза клеток Tcm для инфузии субъекту составляет приблизительно 2,5×10⁶ CD8⁺ клеток на кг идеальной массы тела.

Согласно конкретному варианту осуществления доза клеток Tcm для инфузии субъекту составляет приблизительно 5×10⁶ CD8⁺ клеток на кг идеальной массы тела.

Согласно конкретному варианту осуществления доза клеток Tcm для инфузии субъекту составляет приблизительно 10×10⁶ CD8⁺ клеток на кг идеальной массы тела.

В контексте настоящего изобретения термин «идеальная масса тела» относится к измерению, используемому в клинической практике для корректировки дозировки лекарственного средства, помощи в оценке почечной функции и фармакокинетики (например, у пациентов с ожирением).

Формула для расчета идеальной массы тела в (кг) является следующей:

Мужской пол: IBW = 50 кг + 2,3 кг на каждый дюйм свыше 5 футов.

Женский пол: IBW = 45,5 кг + 2,3 кг на каждый дюйм свыше 5 футов.

Идеальная масса тела подробно раскрыта в Peterson et al. [Am J Clin Nutr 2016,103:1197 203], который включен в настоящий документ посредством ссылки.

Токсичность и терапевтическую эффективность описанных в настоящем документе активных ингредиентов можно определить стандартными фармацевтическими процедурами in vitro, в клеточных культурах или на экспериментальных животных. Данные, полученные в результате этих анализов in vitro и клеточных культур, а также исследований на животных, можно использовать для определения диапазона дозировок для применения у человека. Дозировка может варьироваться в зависимости от используемой лекарственной формы и используемого пути введения. Точный состав, способ введения и дозировка могут быть выбраны врачом в зависимости от состояния пациента (см. например, Fingl, et al., 1975, in "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1 p.l).

Размер и интервал дозы могут быть скорректированы индивидуально для того, чтобы обеспечить достаточное количество активного ингредиента, достаточное для индукции или подавления биологического эффекта (минимальная эффективная концентрация, МЕС). МЕС будет варьироваться для каждого препарата, но ее можно оценить по данным in vitro. Дозы, необходимые для достижения МЕС, будут зависеть от индивидуальных особенностей и пути введения. Для определения концентрации в плазме можно использовать анализы обнаружения.

В зависимости от тяжести и восприимчивости состояния, подлежащего лечению, дозирование может быть однократным или многократным, при этом курс лечения длится от нескольких дней до нескольких недель или до тех пор, пока не будет достигнуто излечение или уменьшение болезненного состояния.

Количество вводимой композиции будет, конечно, зависеть от субъекта, подлежащего лечению, тяжести заболевания, способа введения, решения лечащего врача и т.д.

Композиции согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения, при желании, могут быть представлены в упаковке или дозаторе, таком как набор, одобренный FDA, который может содержать одну или несколько стандартных дозированных форм, содержащих активный ингредиент. Упаковка может, например, содержать металлическую или пластиковую фольгу, такую как блистерная упаковка. Упаковка или дозирующее устройство могут сопровождаться инструкциями по применению. На упаковку или дозатор также может быть нанесено уведомление, связанное с контейнером, в форме, предписанной государственным органом, регулирующим производство, использование или продажу фармацевтических средств, которое раскрывает одобрение органом формы композиций для введения человеку или животному. Такое уведомление, например, может быть маркировкой, одобренной Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США для отпускаемых по рецепту лекарственных средств, или листком-вкладышем в утвержденный продукт. Композиции, содержащие препарат согласно настоящему изобретению, составленный в совместимом фармацевтическом носителе, также могут быть получены, помещены в соответствующий контейнер и промаркированы для лечения указанного состояния, как более подробно описано выше.

Согласно одному варианту осуществления клетки, не индуцирующие GVHD, имеющие фенотип Tcm, согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения, могут быть получены в виде «готового к немедленному использованию» продукта для терапии (например, в виде клеток вето для использования в терапии, как обсуждалось выше).

Согласно одному варианту осуществления субъект не подлежит хроническому лечению (например, в течение длительного периода времени, например, более 8, 9, 10, 12, 14, 21, 25, 30, 45, 60 или 90 дней, например, 10-21 день, например, 10 или 14 дней) с посттрансплантационной профилактикой GVHD (например, кортикостероидами и/или иммусупрессорами).

Согласно одному варианту осуществления в случае рецидива после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток субъект может дополнительно получить лечение инфузиями донорских лимфоцитов (DLI). Например, субъекту можно вводить градуированные дозы Т-клеток, как описано ранее у Dazzi et al. [Dazzi, Szydlo et al., Blood, (2000) 96: 2712-6], который полностью включен в настоящий документ посредством ссылки.

В контексте настоящего изобретения термин «приблизительно» относится к ±10%.

Термины «содержит», «содержащий», «включает», «включающий», «имеющий» и их сопряженные значения означают «включая без ограничения».

Термин «состоящий из» означает «включающий и ограничивающийся».

Термин «состоящий в основном из» означает, что композиция, способ или структура могут включать дополнительные ингредиенты, стадии и/или части, но только в том случае, если дополнительные ингредиенты, стадии и/или части существенно не изменяют основные и новые характеристики заявленной композиции, способа или структуры.

В контексте настоящего изобретения форма единственного числа включает ссылки на множественное число, если из контекста явно не следует иное. Например, термин «соединение» или «по меньшей мере одно соединение» может включать множество соединений, включая их смеси.

В настоящей заявке различные варианты осуществления настоящего изобретения могут быть представлены в формате диапазона. Следует понимать, что описание в формате диапазонов предназначено только для удобства и краткости и не должно рассматриваться как жесткое ограничение объема настоящего изобретения. Соответственно, следует считать, что описание диапазона конкретно раскрывает все возможные поддиапазоны, а также отдельные числовые значения в пределах этого диапазона. Например, описание диапазона, такого как от 1 до 6, должно рассматриваться как имеющее конкретно раскрытые поддиапазоны, такие как от 1 до 3, от 1 до 4, от 1 до 5, от 2 до 4, от 2 до 6, от 3 до 6 и т.д., а также отдельные числа в этом диапазоне, например, 1, 2, 3, 4, 5 и 6. Это применимо независимо от ширины диапазона.

Каждый раз, когда в настоящем документе указывается числовой диапазон, подразумевается, что он включает любое указанное числовое значение (дробное или целое число) в пределах указанного диапазона. Фразы «диапазон/диапазоны между» первым указанным числом и вторым указанным числом и «диапазон/диапазоны от» первого указанного числа и «до» второго указанного числа используются в настоящем документе взаимозаменяемо и включают первое и второе указанные числа и все дробные и целые числа между ними.

В контексте настоящего изобретения термин «способ» относится к способам, средствам, методам и процедурам для выполнения данной задачи, включая без ограничения, способы, средства, методы и процедуры, которые либо известны, либо могут быть легко разработаны на основе известных способов, средств, методов и процедур практикующими специалистами в области химии, фармакологии, биологии, биохимии и медицины.

Очевидно, что некоторые признаки настоящего изобретения, которые для ясности описаны в контексте отдельных вариантов осуществления, также могут быть представлены в комбинации в одном варианте осуществления. И наоборот, различные признаки настоящего изобретения, которые для краткости описаны в контексте одного варианта осуществления, также могут быть предоставлены по отдельности или в любой подходящей подкомбинации или как подходящие в любом другом описанном варианте осуществления настоящего изобретения. Некоторые признаки, описанные в контексте различных вариантов осуществления, не должны считаться существенными признаками этих вариантов осуществления, за исключением случаев, когда вариант осуществления не работает без этих элементов.

Различные варианты осуществления и аспекты настоящего изобретения, описанные выше и заявленные в разделе формулы изобретения ниже, находят экспериментальную поддержку в следующих примерах.

Примеры

Далее приводятся примеры, которые вместе с вышеприведенным описанием иллюстрируют настоящее изобретение не ограничивающим образом.

Как правило, используемая в настоящем документе номенклатура и лабораторные процедуры, используемые в настоящем изобретении, включают молекулярные, биохимические, микробиологические и рекомбинантные методы ДНК. Такие методы подробно описаны в литературе. См., например, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989), "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994), Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989), Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988), Watson et al., "Recombinant DNA^-, Scientific American Books, New York, Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998), методы, как изложено в патентах США №4666828, 4683202, 4801531, 5192659 и 5272057, "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994), "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994), Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994), Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980), доступные иммунологические анализы подробно описаны в патентной и научной литературе, см., например, патенты США№3791932, 3839153, 3850752, 3850578, 3853987,3867517, 3879262, 3901654,3935074, 3984533, 3996345, 4034074, 4098876, 4879219, 5011771 и 5281521, "Oligonucleotide Synthesis" Gait, М. J., ed. (1984), "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985), "Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., Eds. (1984), "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986), "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986), "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, В., (1984) и "Methods in Enzymology" Vol.1-317, Academic Press, "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990), Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996), все они включены посредством ссылки, как если бы они были полностью изложены в настоящем документе. Другие общие ссылки приведены в настоящем документе. Описанные в настоящем документе процедуры считаются хорошо известными в данной области техники и приведены для удобства читателя. Вся информация, содержащаяся в низ, включена в настоящий документе посредством ссылки.

ПРИМЕР 1

Клинический протокол

Критерии Включения Пациентов

• Возраст 12-70 лет

• Пациенты с диагнозом: фолликулярная лимфома (FL), мантийноклеточная лимфома (MCL), хронический лимфолейкоз (CLL), множественная миелома (ММ), лимфома Ходжкина (HL), неходжкинская лимфома (NHL), ×ронический миелоидный лейкоз (CML), миелопролиферативные синдромы (MPD), острый миелоидный лейкоз (AML) или острый лимфолейкоз (ALL).

•Пациенты с апластической анемией и тяжелым иммунодефицитом или незлокачественной недостаточностью костного мозга.

• Пациенты с гемобластозами должны иметь персистирующее или прогрессирующее заболевание, несмотря на начальную химиотерапию, и должны достичь стабильного заболевания или частичного или полного ответа на последнюю химиотерапию.

• Наличие донора клеток

• Статус Карновского ≥70%

• Адекватная функция основных систем органов, о чем свидетельствуют:

- Фракция выброса левого желудочка по меньшей мере 40%

- Легочный функциональный тест (PFT), демонстрирующий скорректированную диффузионную способность по меньшей мере 50% от прогнозируемого значения для концентрации гемоглобина

- Сывороточный креатинин ≤ 1,5 мг/дл.

- SGPT ≤ 200 МЕ/мл

- Билирубин < 1,5 мг/дл (за исключением синдрома Жильбера).

- Отрицательный тест на беременность у женщин с детородным потенциалом.

Критерии исключения пациентов

• ВИЧ-серопозитивный.

• Неконтролируемая инфекция или серьезное медицинское или пси×иатрическое заболевание, ограничивающее переносимость лечения по протоколу

• Активное злокачественное новообразование ЦНС.

План лечения

Есть две коллекции от донора, одна «непримированные» мононуклеарные клетки (MNC) для получения клеток вето и вторая коллекция мобилизованных клеток-предшественников периферической крови (РВРС) для получения мегадозы стволовых клеток трансплантата, обедненной Т-клетками. Обе коллекции соответствуют стандартным процедурам ухода (SOC), и доноры подписывают согласие SOC на донорство.

Сбор непримированных (т.е. немобилизованных) мононуклеарных клеток периферической крови для получения противовирусных Т-клеток CD8⁺ центральной памяти можно проводить в любое время, но обычно это проводят приблизительно за 7 дней до запланированной даты трансплантации (т.е. День 0, то есть D0). Клетки вето либо используют в свежем виде в конце получения и подлежат инфузии на D+7, либо криоконсервируют в конце получения.

Сбор мобилизованных РВРС с использованием G-CSF и плериксафора, если это клинически необходимо, для трансплантации мегадоз может быть завершен за 7 или более дней до сбора мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) для получения противовирусных клеток вето CD8⁺ центральной памяти. В качестве альтернативы можно использовать свежие стволовые клетки CD34⁺, при этом сбор мобилизованных стволовых клеток можно проводить в течение трех дней подряд (день -2, день -1 и день 0), тогда как сбор РВМС для клеток вето можно начинать на день -8. Достигается оптимальная целевая доза клеток РВМС ≥ 10×10⁶ клеток CD34⁺ на кг идеальной массы тела, требуется минимум 5×10⁶ клеток CD34⁺ на кг идеальной массы тела, что включает нефракционированную аликвоту РВРС, содержащую приблизительно 1×10⁶ клеток CD34⁺ на кг идеальной массы тела, для криоконсервации в качестве резервной копии на случай неадекватной продукции клеток веток или отказа трансплантата после трансплантации, или для доступности при лечении недостаточности трансплантата. Если донор не переносит процедуру или невозможно собрать адекватную дозу клеток, можно использовать альтернативного донора, если он доступен.

Мобилизованные РВРС обычно собирают через 3 дня. Коллекции первых 2 дней объединяют и отбирают клетки CD34⁺с помощью устройства CliniMacs (Miltenyi), клетки можно использовать в свежем виде (вместе с клетками третьей коллекции) или можно криоконсервировать. Коллекция третьего дня обеднена содержанием клеток CD3⁺/CD19⁺, клетки могут быть использованы в свежем виде (вместе с клетками коллекций предыдущих 2 дней) или могут быть криоконсервированы. Максимальная доза Т-клеток во всем трансплантате стволовых клеток, обедненном Т-клетками, составляет 2×10⁵ CD3⁺ клеток/кг идеальной массы тела реципиента. Резервную фракцию неманипулированных РВРС удаляют из коллекции первого дня до тех пор, пока на оставшемся продукте РВРС не будет проведена процедура отбора клеток CD34⁺.

При использовании свежих отобранных CD34⁺ и CD3⁺/CD19⁺-обедненных стволовых клеток их обычно вводят на 1-й и 0-й день соответственно. Альтернативно, при использовании криоконсервированных отобранных CD34⁺ и CD3⁺/CD19⁺-обедненных стволовых клеток их обычно размораживают и вводят на 0-й день.

Получение противовирусных Т-клеток вето центральной памяти CD8⁺ (клетки вето)

Подробный протокол для получения клеток вето представлен в Примере 2, приведенном ниже. В этом разделе приводится краткое описание некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения.

Протокол состоит из трех стадий:

Стадия 1. Получение стимуляторов (от дня -8 до дня -5)

Получение донорских дендритных клеток (DC) из моноцитов в РВМС

День -8: Приблизительно 1×10¹⁰ мононуклеарных клеток собирали с помощью лейкафереза и оставляли на ночь.

День -7: Клетки сепарировали посредством обработки фиколом, а затем половину мононуклеарных клеток использовали для выделения моноцитов с помощью магнитных шариков CD 14 (система сортировки магнитных шариков Miltenyi). После этого CD14⁺ моноциты дифференцировали в незрелые DC с помощью гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF) и интерлейкина 4 (IL-4).

Параллельно клетки CD14^- (т.е. CD14 neg) объединяли с половиной исходных мононуклеарных клеток, полученных после выделения с помощью фикола, и ×ранили в течение ночи при 37°С 5% О₂/СО₂ в присутствии IL-7. Эти клетки используются для обогащения CD8⁺ Т-клетками памяти на следующий день.

День -6: Созревание DC путем добавления цитокинового коктейля, включающего липополисахарид (LPS), гамма-интерферон (IFNy), GM-CSF и IL-4 в течение 16 часов инкубации.

День -5: Собирали зрелые DC (mDC), загружали вирусным пептидным коктейлем и облучали.

Стадия 2. Подготовка респондеров и совместное культивирование с загруженными вирусом mDC (от дня -6 до дня -5):

А) Очистка Т-клеток памяти (CD4^-CD56^-CD45^-) (от донорских РВМС-респондеров)

День -6: Донорские клетки CD14^- объединяли с половиной мононуклеарных клеток, которые инкубировали в течение ночи с IL-7, очищали от клеток CD4⁺, CD56⁺ и CD45RA⁺ с помощью магнитных шариков и ×ранили в течение дополнительной ночи при 37°С, 5% О₂/СО₂ в присутствии IL -7.

В) Создание совместной культуры респондера (Донора) и стимулятора (Донорские DC, загруженные вирусным пептидом).

День -5: Очищенные реагирующие Т-клетки памяти (CD4^-CD56^-CD45RA^-) инкубировали в течение 3 дней с mDC, загруженными вирусным пептидом, в присутствии IL-21.

Стадия 3. Дифференциация и размножение противовирусных клеток вето Tcm (от День -5 до День -7)

А) Размножение противовирусных Т-клеток памяти вето CD8⁺(Tcm)

Дни с -5 по -2: Инициация фенотипа Tcm только с IL-21.

Дни с -2 по +7: Размножение культур Tcm путем разделения в соответствии с уровнем потребления глюкозы и добавления среды, дополненной следующими цитокинами: IL-7, IL-15 и IL-21, в зависимости от наблюдаемого размножения в культуре.

День +7: Сбор и инфузия клеток.

Примерный график получения Tcm и получения DC от предполагаемого донора РВМС показан на фиг.1. Клетки собирают и вводят на день +7 после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток.

Аликвоту противовирусных клеток вето центральной памяти CD8⁺оценивали по критериям высвобождения и функциональным иммунным исследованиям (как обсуждается ниже).

План лечения - схема кондиционирования

Включение свежих клеток СР34⁺

Как показано на фиг.3, режим кондиционирования с Дня -10 по День -2 (т.е. с 10-го по 2-й день до трансплантации) включали антитимоцитарный глобулин (ATG) (3 дозы с Дня -10 по День -8), Флударабин (Flu) (4 дозы с Дня -7 по День -4) и тотальное облучение тела (TBI) 3 Гр (однократно на День -2). Трансплантат стволовых клеток, обедненный Т-клетками, вводят в День -1 и День 0. В дни D+3 и+4 после трансплантации (т.е. дни 3 и 4 после трансплантации) пациент получает циклофосфамид (CY) с последующей инфузией клеток вето на D+7 после трансплантации (т.е. на 7-й день после трансплантации). Пациенты с В-клеточными злокачественными новообразованиями могут получать ритуксимаб при дозе 375 мг/м² в День -11.

День и лечение:

-11 Госпитализация/внутривенная (IV) гидратация/ритуксан 375 мг/м² (для В-клеточных злокачественных новообразований)

-10 ATG (Тимоглобулин) 2 мг/кг

-9 ATG (Тимоглобулин) 2 мг/кг

-8 ATG (Тимоглобулин) 2 мг/кг

-7 Флударабин 30 мг/м²

-6 Флударабин 30 мг/м²

-5 Флударабин 30 мг/м²

-4 Флударабин 30 мг/м²

-3 Отдых (без лечения)

-2 TBI 3 Гр за одну фракцию.

-1 Инфузия мегадоз РВРС, обедненных Т-клетками (содержащих отобранные CD34⁺ клетки)

0 Инфузия CD3^-/CD19^- обедненных клеток

+3 Циклофосфамид (CY) 50 мг/кг/день внутривенно

+4 Циклофосфамид (CY) 50 мг/кг/день внутривенно

+7 Инфузия противовирусных клеток вето в указанных дозах.

Следует отметить, что пациенты получали дозу Месны 10 мг/кг внутривенным введением «piggy back» (IVPB) непосредственно перед первой дозой циклофосфамида. Это повторяли каждые 4 часа в общей сложности для 10 доз. Пациенты также получали ондансетрон (или другое противорвотное средство) перед каждой дозой циклофосфамида

(Су).

Премедикация для клеток вето не включает кортикостероиды.

С криоконсервированными клетками СР34⁺

Как показано на фиг.4, с D-9 до D-1 (т.е. с 9-го по 1-й день до трансплантации) пациент получал антитимоцитарный глобулин (ATG), Флударабин (Fu) и низкодозовое тотальное облучение тела (TBI) в качестве подготовительной схемы. На D+3 и +4 после трансплантации (т.е. с 3-го по 4-й день после трансплантации) пациент получал циклофосфамид (CY) с последующей инфузией клеток вето на 7-й день после трансплантации (D+7 после трансплантации). Пациенты с В-клеточными злокачественными новообразованиями могли получать ритуксимаб при дозе 375 мг/м² на День -10.

День и лечение:

-10 Госпитализация/внутривенная (IV) гидратация/ритуксан 375 мг/м² (для В-клеточных злокачественных новообразований)

-9 ATG (Тимоглобулин) 2 мг на кг идеальной массы тела

-8 ATG (Тимоглобулин) 2 мг на кг идеальной массы тела

-7 ATG (Тимоглобулин) 2 мг на кг идеальной массы тела

-6 Флударабин 30 мг/м²

-5 Флударабин 30 мг/м²

-4 Флударабин 30 мг/м²

-3 Флударабин 30 мг/м²

-2 Отдых (без лечения)

-1 TBI 3 Гр за одну фракцию.

0 инфузия мегадоз РВРС, обедненных Т-клетками (содержащих отобранные CD34⁺ клетки и CD3⁺/CD19⁺- обедненные клетки)

+3 Циклофосфамид (CY) 50 мг/кг идеальной массы тела/день внутривенно

+4 Циклофосфамид (CY) 50 мг/кг идеальной массы тела/день внутривенно

+7 Инфузия противовирусных клеток вето в указанных дозах. Следует отметить, что пациенты получали дозу Месны 10 мг/кг внутривенным введением «piggy back» (IVPB) непосредственно перед первой дозой циклофосфамида. Это повторяли каждые 4 часа в общей сложности для 10 доз. Пациенты также получали ондансетрон (или другое противорвотное средство) перед каждой дозой циклофосфамида (Су).

Уровни доз противовирусных клеток вето- увеличение дозы СР8⁺ клеток

Уровень дозы 1: 2,5×10⁶ CD8⁺ клеток на кг идеальной массы тела

Уровень дозы 2: 5,0×10⁶ CD8⁺ клеток на кг идеальной массы тела

Уровень дозы 3: 10×10⁶ CD8⁺ клеток на кг идеальной массы тела Дополнительную посттрансплантационную иммуносупрессивную терапию в качестве профилактики реакции «трансплантат против хозяина» (GVHD) не проводили.

Рассмотрение случая, если количество произведенного клеточного продукта меньше запланированного уровня дозы

Первый уровень дозы составлял 2,5×10⁶ клеток на кг идеальной массы тела. Следует отметить, что более низкую дозу обычно не считали приемлемой.

Для уровня дозы 2 целевая доза составляла 5×10⁶ клеток на кг идеальной массы тела, однако дозу от 2,6 до 5×10⁶ клеток на кг идеальной массы тела считали адекватной и соответствующей уровню дозы 2.

Для уровня дозы 3 целевая доза составляла 10×10⁶ клеток на кг идеальной массы тела, однако дозу от 5,1 до 10×10⁶ клеток на кг идеальной массы тела считали адекватной и считали уровнем дозы 3.

Оценка в ходе исследования

Были приложены усилия для соблюдения расписания мероприятий и всех требований протокола. Отклонениями не считали отклонения в расписании мероприятий и другие требования протокола, не затрагивающие права и безопасность пациента. Такие изменения могли включать лабораторные оценки, выполненные вне графика, и случайные пропуски требуемых образцов для исследований. Пропущенные образцы для корреляционных исследований не являлись отклонением от протокола.

Оценка перед трансплантацией (и уровень):

Стандартную подготовку к трансплантации, а также оценку заболевания проводили до включения в исследование в рамках диагностической или плановой предтрансплантационной оценки. Следующие тесты являлись стандартными тестами перед трансплантацией и не зависели от протокола. Результаты использовали для определения пригодности к трансплантации и не повторялись до начала лечения. Если лечение откладывали более чем на 30 дней после получения согласия, субъект клинических испытаний или уполномоченное лицо должны были определить, какие тесты, если таковые имелись, необходимо было повторить в соответствии с клиническими показаниями.

- OAK, дифференциал и тромбоциты

- Билирубин, сывороточный креатинин и клиренс креатинина, АЛТ, альбумин, электролиты, ЛДГ, щелочная фосфатаза

- Панель инфекционных заболеваний (серология гепатита (В, С), ВИЧ, HTLV, I/II, CMV, скрининг ТРНА), серология токсоплазмы, серология Strongyloides (по показаниям), туберкулез, IRGA (по показаниям)

- РТ и РТТ

- Группа крови и резус фактор (АВО и Rh)

- Пункция костного мозга с цитогенетическими и молекулярными исследованиями по клиническим показаниям

- Анализ базового уровня ×имеризма

- Тест на беременность у женщин детородного возраста

- Функциональный тест легких с DLCO

- Эхокардиограмма для оценки ФВ левого желудочка и давления в легочной артерии

- Рентген грудной клетки и ЭКГ

- Сыворотка на донор-специфические антитела к HLA (DSA) Активный период лечения пациентов, получавших лечение в этом исследовании, длился с начала подготовительного режима (День -9) до Дня +42 после трансплантации. После этого пациенты проходили динамическое наблюдение в соответствии с клиническими показаниями через D+100. После этого собирали данные о рецидивах заболевания, инфекциях, острой и хронической GVHD и выживаемости в соответствии со стандартным наблюдением реципиентов трансплантированных стволовых клеток. Через год пациенты исключались из исследования. Острую GVHD и хроническую GVHD оценивали в соответствии с критериями консенсуса NIH.

Стандартные пост-оценки

Стандартные пост-оценки соответствовали SOC после аллогенной трансплантации. Пункцию костного мозга и анализ периферической крови - для оценки ответа на лечение, приживления трансплантата, химеризма и восстановления иммунитета - выполняли ежемесячно в течение 3 месяцев и по клиническим показаниям.

Коррелятивные исследования

Восстановление иммунитета оценивали с помощью панели иммунофенотипа методом проточной цитометрии, а противовирусные ответы - с помощью анализа тетрамеров. Тест на иммунную толерантность проводили, примерно, через 3 месяца после трансплантации. Пропущенные образцы для корреляционных исследований не являлись отклонением от протокола.

Развитие острой GVHD оценивали и оценивают по согласованным критериям NIH. Рецидив или прогрессирование заболевания оценивали по морфологическому рецидиву злокачественного новообразования у пациента. Собирались данные о бактериальных, вирусных, грибковых и паразитарных инфекциях. Развитие хронической GVHD описано в соответствии с критериями консенсуса NIH. [Jagasia МН, et al. National Institutes of Health Consensus Development Project on Criteria for Clinical Trials in Chronic Graft-versus-Host Disease: I. The 2014 Diagnosis and Staging Working Group report. Biol Blood Marrow Transplant. (2015)21:389-401 e381].

¹Базовые лабораторные тесты: OAK, дифференциал и тромбоциты, билирубин, сывороточный креатинин и клиренс креатинина, АЛТ, альбумин, электролиты, ЛДГ, щелочная фосфатаза, панель инфекционных заболеваний (серология гепатита (В, С), ВИЧ, HTLV, I/II, CMV, скрининг ТРНА), серология токсоплазмы, серология Strongyloides (по показаниям), туберкулез, IRGA (по показаниям), РТ и РТТ, группа крови и резус фактор (АВО и Rh), сыворотка на донор-специфические анти-HLA-антитела (ДСА).

²Тест на беременность (моча) у женщин детородного возраста.

³По клиническим показаниям.

⁴Коррелятивные исследования (восстановление иммунитета должно быть оценено с помощью панели иммунофенотипа методом проточной цитометрии, а противовирусные ответы - с помощью анализа тетрамеров), тест на иммунную толерантность должен будет выполняться лабораторией доктора Яира Рейснера, примерно, через 3 месяца после трансплантации. Пропущенные образцы для корреляционных исследований не будут являться отклонением от протокола.

Поддерживающая терапия

• Отсутствие посттрансплантационных факторов роста

• Посттрансплантационная иммуносупрессивная терапия в качестве профилактики GVHD не проводилась.

• Другие аспекты поддерживающей терапии назначались по клиническим показаниям (например, поддержка гранулоцитарных колониестимулирующих факторов (Г-КСФ) в случаях медленного приживления или лечение GVHD, например, метилпреднизолоном, такролимусом или другими иммунодепрессантами). Сопутствующие лекарственные средства, назначаемые пациенту во время исследования, задокументированы в первичной медицинской карте пациента.

Непредвиденные обстоятельства для неадекватного получения противовирусных клеток вето

Если клетки вето соответствовали критериям высвобождения, но доза клеток меньше уровня дозы целевых клеток: клетки вводили, если доза составляла ≥2,5×10⁶ клеток CD8⁺ на кг идеальной массы тела (уровень дозы 1). В этом случае пациентов оценивали в установленном для них уровне дозы по принципу намерения лечить.

Если доза клеток вето составляла менее 2,5×10⁶ клеток CD8⁺ на кг идеальной массы тела или если клетки вето не соответствовали критериям высвобождения, инфузию этих клеток не проводили. Вместо этого, резервные РВРС плюс РВРС с обедненным Т-клетками вводили для восстановления «стандартного трансплантата РВРС», и пациент получал стандартный подготовительный режим лечения с такролимусом и микофенолатом в качестве стандартной профилактики GVHD.

Инфузия донорских лимфоцитов (DLI) при стойком п. in прогрессирующем заболевании

Если GVHD отсутствовала, пациенты, достигшие приживления трансплантата и имевшие ≥ 5% миелоидных донорских клеток и имевшие прогрессирующее заболевание в любое время или персистирующее заболевание в течение ≥ 3 месяцев после трансплантации, могли получать инфузию донорских лимфоцитов в качестве стандартной терапии или альтернативной терапии.

Лечение отторжения трансплантата

Это немиелоаблативная схема. Ожидали, что в случае отторжения трансплантата, скорее всего, произойдет аутологичное восстановление кроветворения. Приживление определяли как обнаружение донорских клеток с помощью анализа химеризма и восстановления абсолютного количества нейтрофилов, ANC > 0,5×10⁹/л. Пациенты, у которых не происходило приживления донорских клеток и восстановления кроветворения (ANC > 0,5×10⁹/л после 28-го дня) или у которых наблюдалось выздоровление, но впоследствии ANC падало до < 0,5×10⁹/л при не менее чем 3 последовательных определениях в течение 5-дневного периода с клеточностью < 10% в биопсии костного мозга и отсутствием признаков донорского химеризма (не связанного с обратимой инфекцией, миелосупрессивной медикаментозной терапией или прогрессированием заболевания) определялись как отторжение трансплантата и считались неудачей лечения и исключались из исследования. Эти пациенты подлежали повторной трансплантации по клиническим показаниям и могли использовать резервные немодифицированные РВРС.

Вмешательства по поводу GVHD, происходящих после трансплантации

Ниже приведены рекомендации по лечению острой GVHD. Это модифицируется по клиническим показаниям лечащего врача пациента. Острая GVHD

а) Степень I - мониторинг без лекарств (Rx) в течение 1 недели или только местные стероиды.

б) При II-IV степени лечили метилпреднизолоном в дозе 1-2 мг/кг идеальной массы тела в день.

с) Если после добавления метилпреднизолона степень > II сохранялась в течение 48 часов или прогрессировала, можно было добавить такролимус или другие иммуносупрессивные препараты по клиническим показаниям или в соответствии с активными протоколами лечения GVHD.

Пациенты с острой GVHD 3-4 степени, резистентной к стероидам, считались неэффективными при лечении и могли получать другие иммуносупрессивные препараты по клиническим показаниям.

Статистические аспекты

1. Предварительные сведения. Это исследование фазы I-II для определения оптимальной дозы донорских клеток вето, вводимых пациентам с гематологическими злокачественными новообразованиями, включая NHL, AML, CLL или ММ, у которых ранее был рецидив или была заявлена рефрактерность к начальной терапии, и в последующем достигалась частичная или полная ремиссия. Каждый пациент сначала получал аллогенную трансплантацию стволовых клеток (аллоскт) от гаплоидентичного донора с режимом кондиционирования, включающим ATG, флударабин и TBI, с двойным импульсным циклофосфамидом, вводимым в качестве профилактики GVHD на 3-й и 4-й дни после аллоскта, с последующим введением стволовых клеток на 7-й день после аллоскта. Доза клеток вето для каждой когорты пациентов выбирали адаптивно с использованием схемы фазы I-II.

2. Схема определения дозы

Цель: Основная научная цель испытания заключалась в том, чтобы определить оптимальную дозу вето-клеток среди трех уровней 2,5×10⁶, 5×10⁶ и 10⁷ клеток CD8⁺ на килограмм идеальной массы тела, далее именуемых и кодируемых численно в модели доза-результат как дозы 1, 2, 3 (см. Таблицу 1 В ниже). Подбор дозы осуществляли с использованием последовательно адаптивной схемы фаз I-II, основанной на компромиссе EffTox, как обсуждалось ранее. [Thall PF and Cook JD. Dose-finding based on efficacy-toxicity trade-offs. Biometrics (2004) 60:684-693; Thall PF et al. Using effective sample size for prior calibration in Bayesian phase I-II dose-finding. Clinical Trials. (2014) 11:657-666].

Комплексные главные результаты: Для определения дозы: (1) токсичность определяли как GVHD 3 или 4 степени или смерть от любой причины в течение 42 дней после введения вето-клеток; и (2) эффективность определяли как выживание пациента и приживление трансплантата на 42-й день после инфузии клеток вето. Пациента, включенного в исследование, но по какой-либо причине не получившего клетки вето на 7-й день после аллоскта, заменяли в выборке.

Приемлемость дозы: Для двух правил приемлемости дозы EffTox использовали верхний предел вероятности токсичности,20, минимальную вероятность эффективности,80 и пороговые значения апостериорной вероятности,10 или оба критерия приемлемости. Если обнаруживали, что самый низкий уровень дозы являлся неприемлемым с точки зрения либо высокой токсичности, либо низкой эффективности, испытание прекращали и не выбирали уровень дозы клеток вето.

Максимальный размер выборки и размер когорты: Максимум 24 пациента получали лечение в 8 когортах размером 3 (по 3 субъекта клинических испытаний), при этом первая когорта получала дозу d=2, а дозы для всех последующих групп подбирали адаптивно, чтобы максимизировать компромисс между эффективностью и токсичностью, рассчитанного на основе самых последних накопленных данных. Подбор приостанавливали между когортами, если это необходимо, чтобы гарантировать, что 42 дневные результаты эффективности и токсичности оценивали для всех ранее леченных пациентов, чтобы применить правила адаптации результатов.

Предварительная информация: Предварительные значения параметров модели были рассчитаны с использованием программы EffTox версии 4.0.12 на основе выявленных средних предельных вероятностей исхода, приведенных в Таблице 1В, с гипердисперсией, откалиброванной для получения предварительного эффективного размера выборки 1.

Формы компромисса между эффективностью и токсичностью: Для определения форм компромисса использовали три эквивалентные пары вероятности компромисса: (,30, 0), (,55, ,30) и (1, ,80).

3. Рабочие характеристики проекта

Рабочие характеристики (ОС) проекта в соответствии с шестью гипотетическими сценариями доза-результат приведены ниже. Моделирование для вычисления ОС проводили с использованием EffTox, версия 4.0.12 с 2000 повторениями в сценарии с использованием начального числа моделирования 10502.

4. Реализация

Проект EffTox реализовали с использованием веб-сайта отдела проведения клинических испытаний отделения биостатистики онкологического центра им. М.Д. Андерсона (MDACC) www(dot)biostatistics(dot)mdanderson (dot)org/ClinicalTrialConduct/. При необходимости во время проведения исследования следует проконсультироваться со специалистом по биостатистике исследования Питером Таллом или назначенным статистическим аналитиком в отделе биостатистики.

5. Вторичные результаты и анализ данных

Вторичные результаты включали инфекцию, время выживаемости без признаков прогрессирования заболевания (ВБП), время общей выживаемости (ОВ), цитомегаловирус и восстановление иммунитета с 1-летним периодом наблюдения для каждого пациента. Нескорректированные распределения результатов от времени до события оценивали с использованием метода Каплана и Мейера [Kaplan, EL and Meier, P: Nonparametric estimator from incomplete observations. J. American Statistical Association (1958) 53:457-481], и их взаимосвязь с прогностическими ковариатами и уровнем дозы клеток вето оценивали с помощью байесовской кусочно-экспоненциальной регрессии выживания. [Ibrahim JG, Chen М-Н, Sinha D. Bayesian Survival Analysis. Springer, NY (2001)].

Управление данными и протоколами

Соблюдение протокола

Пациентов контролировали на предмет токсичности и приживления еженедельно в течение первых 28 дней и по клиническим показаниям исследователя клинических испытаний и/или назначенного им лица (лиц). Председатель исследования являлся окончательным арбитром токсичности, если существовали расхождение во мнениях.

Критерии исключения из исследования

Пациентов исключали из исследования по любому из следующих признаков:

1) Отзыв согласия пациента на участие.

2) Несоответствующий продукт вето-клеток для инфузии.

3) Прогрессирование болезни.

4) Развитие отторжения трансплантата, требующего повторной трансплантации.

5) Через год после лечения.

6) Нарастающая или неожиданная картина токсичности, наблюдаемая руководителем исследования, считалась неприемлемой.

7) Решение исследователя, когда благополучие и интересы пациента поставлены под угрозу.

8) Несоблюдение, по мнению руководителя исследования, ставившее под угрозу оценку конечных результатов исследования

9) Смерть

Требования к отчетности

Определение нежелательного явления

Нежелательным явлением считали появление или ухудшение любого нежелательного признака, симптома или состояния здоровья, возникавшего после начала приема исследуемого препарата, даже если это явление не считали связанным с исследуемым препаратом. Медицинские состояния/заболевания, имевшиеся до начала приема исследуемого препарата, считали нежелательными явлениями только в том случае, если они ухудшались после начала приема исследуемого препарата. Аномальные лабораторные значения или результаты анализов представляли собой нежелательные явления только в том случае, если они вызывали клинические признаки или симптомы, считавшиеся клинически значимыми или требующие лечения.

Оценка нежелательных явлений

Исследователь или назначенный врач несет ответственность за проверку и предоставление исходной документации по всем нежелательным явлениям, а также за присвоение каждого явления всем субъектам, включенным в исследование.

Нежелательные явления и данные, относящиеся к конкретному протоколу, заносили в Redcap.Redcap использовали в качестве электронной формы отчета о случае для этого протокола.

Степень тяжести нежелательных явлений (АЕ)

Собраны все степени нежелательных явлений, связанных с инфузией анти-вето-клеток. Общая оценка:

Степень 1: Легкая: присутствует дискомфорт без нарушения повседневной активности; лечения, кроме профилактики, не требуется.

Степень 2: Умеренная: присутствует дискомфорт с некоторым нарушением повседневной активности, требуется лечение.

Степень 3: Тяжелая: дискомфорт, нарушающий нормальную повседневную активность, не реагирующий на лечение первой линии.

Степень 4: Угроза жизни: дискомфорт, представляющий непосредственный риск смерти.

Оценка достоверности причинно-следственной связи

Исследовательским компонентом плана лечения в этом исследовании была инфузия вето-клеток.

Нежелательные явления связывали с инфузией клеток вето. Могли возникнуть инфузионные реакции. Никакой другой токсичности не ожидалось.

Следовательно, события, о которых было известно, что они были вызваны инфузией клеток вето, и их прямые последствия оценивали как определенно связанные при оценке причинно-следственной связи.

Когда нельзя было исключить взаимосвязь нежелательного явления между инфузией клеток вето и кондиционированием трансплантата, событие оценивали как вероятное или возможное связанное.

События, о которых было известно, что они были связаны с препаратами, используемыми в качестве химиотерапии, а также с препаратами, используемыми в качестве поддерживающего лечения, оценивали как не связанные с инфузией анти-клеток вето.

Главный исследователь являлся окончательным арбитром в определении оценки причинно-следственной связи.

Нежелательные явления, считающиеся серьезными

Для целей этого исследования аномальные лабораторные данные, которые считались связанными с исходным заболеванием, а также отдельные изменения лабораторных показателей, таких как электролитный магний и метаболический дисбаланс, изменения уровня мочевой кислоты, повышение уровня GPT, GOT, LDH и щелочной фосфатазы, не считали нежелательными явлениями и не вносили их в базу данных.

Отчетность о серьезных нежелательных явлениях (SAE)

Нежелательное явление или предполагаемая нежелательная реакция считались "серьезными", если, по мнению исследователя или спонсора, это приводило к любому из следующих исходов:

• Смерть

• Угрожающая жизни нежелательная реакция на употребление лекарства - любая нежелательная реакция, которая, по мнению первоначального отчета, подвергает пациента непосредственному риску смерти от нежелательной реакции в том виде, в каком он произошел. Он не включает нежелательную реакцию, которая, если бы она произошла в более тяжелой форме, могла бы привести к смерти.

• Стационарная госпитализация или продление существующей госпитализации.

• Постоянная или выраженная нетрудоспособность или существенное нарушение способности вести нормальную жизнедеятельность.

• Врожденная аномалия/врожденный порок.

• Важные медицинские явления, которые могут не привести к смерти, могут быть опасными для жизни или потребовать госпитализации, могут считаться серьезными нежелательными реакциями на употребление лекарственного препарата, если, на основании соответствующего медицинского заключения, они могут представлять угрозу пациенту или субъекту клинического исследования и могут потребовать медицинского или хирургического вмешательства для предотвращения одного из исходов, перечисленных в этом определении.

Примеры таких медицинских явлений включали аллергический бронхоспазм, требующий интенсивного лечения в отделении неотложной помощи или дома, дискразию крови или судороги, не приводящие к госпитализации, или развитие лекарственной зависимости или злоупотребление лекарствами (21 CFR 312.32).

• Важные медицинские явления, как определено выше, также могут считаться серьезными нежелательными явлениями. О любом важном медицинском явлении можно и нужно сообщать как о серьезном нежелательном явлении, если главный исследователь или спонсор IND (исследуемого нового лекарства), офис IND сочтут это целесообразным.

• Обо всех явлениях, происходящих во время проведения испытаний по протоколу и соответствующих определению серьезные нежелательные явления, необходимо сообщать в IRB в соответствии со сроками и процедурами, изложенными в "The University of Texas M. D. Anderson Cancer Center Institutional Review Board Policy for Investigators on Reporting Unanticipated Adverse Events for Drugs and Devices". Если в протоколе не указано иное, обо всех S АЕ, ожидаемых или неожиданных, необходимо сообщать в офис IND, независимо от их принадлежности (в течение 5 рабочих дней с момента получения информации о событии).

• Все опасные для жизни или смертельные случаи, которые являются неожиданными и связаны с исследуемым препаратом, должны иметь письменный отчет, представленный в течение 24 часов (на следующий рабочий день) с момента получения информации о событии Менеджеру проекта по безопасности в офисе IND.

• Если не указано иное, электронное приложение по SAE (eSAE) используется для отчетности по безопасности в офисе IND и MDACC IRB.

• Серьезные нежелательные явления фиксируются с момента первого вмешательства по конкретному протоколу до 30 дней после инфузии анти-вето-клеток, если участник не отзывает свое согласие. За серьезными нежелательными явлениями следует наблюдать до полного клинического выздоровления и возвращения лабораторных показателей к исходному уровню, стабилизации явления или его приемлемого разрешения.

• Кроме того, в офис IND необходимо сообщать о любых серьезных нежелательных явлениях, возникающих по истечении 30-дневного периода времени и связанных с исследуемым лечением.

Справочная информация о лекарственном средстве

Циклофосфамид

Требования к стабильности и ×ранению:

• Перед смешиванием: комнатная температура

• Стабилен в течение 24 часов при комнатной температуре и 6 дней при хранении в холодильнике.

Обычный диапазон дозировки: До 2000 мг/м² однократно, повторяя каждые 3 недели. Меньшие дозы можно давать чаще. Дозы до 1,5 г/м²/день × 4 могут использоваться в сочетании с трансплантацией клеток-предшественников костного мозга или периферической крови.

Известные побочные эффекты и токсичность: Миелосупрессия (лейкопения больше, чем тромбоцитопения), геморрагический цистит, тошнота, рвота, алопеция и редко -аменорея и азооспермия.

Особые меры предосторожности: Адекватная гидратация с 2-3 литрами жидкости в день с обильным диурезом может предотвратить цистит. Из-за значительной почечной экскреции у пациентов с почечной недостаточностью дозу необходимо снизить.

Механизм действия: Циклофосфамид считается классическим бифункциональным алкилирующим агентом, при этом преобладающая реакция алкилирования протекает по 7 атому азота гуанина. Циклофосфамид должен активироваться микросомальными ферментами печени, чтобы повредить молекулу ДНК. Хотя агент активен на протяжении всего клеточного цикла, он наиболее активен во время S-фазы.

Клиническая фармакология Циклофосфамид можно вводить перорально или внутривенно, хотя пероральная абсорбция неполная (30-60% дозы выводится с калом). Максимальные уровни в плазме достигаются в течение одного часа после перорального приема. Т-1/2 в плазме составляет 4-6,5 часов. Приблизительно 60% внутривенной дозы выводится с мочой в течение 24 часов, что требует коррекции дозы у пациентов с почечной недостаточностью. Препарат активируется, а затем дезактивируется микросомальными ферментами печени.

Флударабин (FTJ)

Синонимы (торговые названия и т.д.): Флудара

Терапевтическая классификация: аналог фторированного нуклеозида.

Каждый флакон содержал 50 мг лиофилизированного препарата, который необходимо было развести 2 мл стерильной воды до раствора с концентрацией 25 мг/мл для внутривенного введения.

Фармацевтические данные: порошок для приготовления внутривенного раствора: 50 мг

Приготовление раствора: смешивали каждый флакон с 2 мл стерильной апирогенной воды до получения прозрачного раствора, с конечной концентрацией 25 мг/мл, только для внутривенного введения. Восстановленный раствор следовало использовать в течение 8 часов.

• Используйте надлежащие процедуры для обращения и утилизации химиотерапевтических средств.

Механизм действия: После фосфорилирования до фтор-ара-АТФ лекарство, по-видимому, встраивается в ДНК и ингибирует ДНК-полимеразу альфа, рибонуклеотидредуктазу и ДНК-примазу, тем самым ингибируя синтез ДНК.

Безопасность человека и фармакология: Период полураспада активированного соединения составляет примерно 10 часов, но фармакология изучена не полностью. Экскреция нарушена у пациентов с нарушением функции почек.

Антитимоцитарный глобулин (ATG) (тимоглобулин)

Терапевтическая классификация: Иммунодепрессант

Механизм действия: ATG представляет собой антитимоцитарный глобулин кролика. Это очищенная, стерильная, преимущественно мономерная фракция IgG гипериммунной сыворотки селективного иммунодепрессанта. Считается, что он действует, изменяя количество и функцию лимфоцитов.

Фармацевтические данные: ATG разбавляли 0,9% раствором NaCl. ATG вводили внутривенно в виде 4-часовой инфузии в центральную вену. Белковый раствор от бесцветного до слегка опалесцирующего. ATG не следует разбавлять декстрозой или жидкостями с низким содержанием солей, так как это может привести к преципитации. Вливание кислого раствора может вызвать физическую нестабильность. Хотя другие случаи несовместимости или лекарственного взаимодействия неизвестны, рекомендуется вводить только ATG.

Требования к стабильности и хранению: Доступен для продажи. Раствор для инфузии содержит 1 мг ATG /2 мл. Хранить в холодильнике при температуре от 2°С до 8°С (не замораживать). Разведенный ATG стабилен в течение 24 часов.

Известные побочные эффекты: ATG может вызвать цитопению любой клеточной линии, озноб, лихорадку или отек. Также может развиться синдром, подобный сывороточной болезни. Сообщалось о побочных реакциях, включая сыпь, зуд, крапивницу, волдыри и гиперемию, бронхоспазм, кровотечение и анафилактический шок. Реанимационное оборудование должно быть доступно во время введения. После анафилактической реакции инфузию не следует возобновлять.

Месна

Синонимы (торговые названия и т.д.): Mesnex

Терапевтическая классификация: Ингибитор геморрагического цистита, противоопухолевый агент

Фармацевтические данные: 100 мг/мл раствор для инъекций, 400 мг таблетки для приема внутрь

Обычный диапазон дозировки:

• Нежелательная реакция на циклофосфамид, Высокая доза; Профилактика - Геморрагический цистит; Профилактика: 40% в/в (вес/вес) дозы циклофосфамида через 0, 3, 6, 9 часов и внутривенно жидкости.

• Нежелательная реакция на циклофосфамид, Низкая доза; Профилактика Геморрагический цистит; Профилактика: 20 мг/кг идеальной массы тела ПЕРОРАЛЬНО каждые 3-4 часа.

• Геморрагический цистит; Профилактика - нежелательная реакция на ифосфамид; Профилактика: болюсный внутривенный режим, внутривенное болюсное введение 20% дозы ифосфамида (вес/вес) в 0, 4, 8 часов.

• Геморрагический цистит; Профилактика - нежелательная реакция на ифосфамид; Профилактика: пероральный прием таблеток, внутривенное болюсное введение 20% дозы ифосфамида (вес/вес) во время инфузии, таблетки 40% дозы ифосфамида через 2, 6 часа.

• Геморрагический цистит; Профилактика - нежелательная реакция на ифосфамид; Профилактика: непрерывный внутривенный режим (режим, не одобренный FDA), болюсная доза (20% от общей дозы ифосфамида), затем 40% ифосфамида непрерывно внутривенно.

Известные побочные эффекты и токсичность: Общие нежелательные эффекты: утомляемость, головная боль, тошнота, рвота и диарея (возникают при более высоких дозах (80 мг/кг идеальной массы тела)). Может возникнуть гипотензия.

Особые меры предосторожности: внутривенное введение Месна следует продолжать в течение 12-24 часов после завершения лечения ифосфамидом или циклофосфамидом

Противопоказания: повышенная чувствительность к Месне/другим тиоловым соединениям.

Взаимодействие лекарственных средств: варфарин

Пример 2

Получение противовирусных CD8⁺ клеток вето центральной памяти

Информация о получении и ×арактеристиках клеточных препаратов

Тип клеток и их происхождение

Этот протокол требует сбора двух отдельных препаратов стволовых клеток. Один тип препарата стволовых клеток получали от мобилизованного гаплоидентичного донора, часть которого отбирали по клеткам CD34⁺, а другую часть обедняли клетками CD3⁺/CD19⁺ с помощью устройства Miltenyi CliniMACS® и криоконсервируют.Второй тип препарата представляет собой аллогенные немобилизованные мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) для продукции противовирусных CD8⁺ Т-клеток вето центральной памяти. РВМС использовали для получения дендритных клеток и Т-клеток, отвечающих за память (CD4^-CD56^-CD45RA^-), которые затем совместно культивировали для стимуляции продукции противовирусных CD8⁺ клеток вето центральной памяти (Tcm). Затем клетки Tcm размножали, собирали и проводили инфузию. Этот препарат используется при изготовлении и инфузии клеток Tcm для достижения приживления трансплантата без GVHD после инфузии мегадозы гаплоидентичного донора, обедненной Т-клетками, из клеток, обогащенных CD34⁺.

Производственная лаборатория

Клеточные препараты согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения обрабатывали в Лаборатории клеточной терапии (CTL) Отделения трансплантации стволовых клеток и клеточной терапии (STCCT) в MDACC. В этом помещении есть как лаборатория обработки клеток для препаратов клеток с минимальными манипуляциями, так и классифицированные наборы (класс ISO 7) для препаратов клеток с более чем минимальными манипуляциями. Получение клеток в соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения проводили преимущественно в установках класса ISO 7. CTL также включает лаборатории проточной цитометрии и контроля качества для поддержки клинических испытаний, исследований и разработок.

Соответствующие аккредитации (FACT, CAP, CLIA)

Лаборатория клеточной терапии (SCTCT CTL) зарегистрирована в FDA (FEI №0001670014) и аккредитована Фондом аккредитации клеточной терапии (FACT), Колледжем американских патологоанатомов (САР) и имеет Сертификат об улучшении клинических лабораторий (CLIA) для аккредитации, который выдается Центрами услуг Medicare и Medicaid (CMS).

Исходный материал

РВМС: Для этого протокола требуются два отдельных типа препаратов клеток. Один препарат содержал аллогенные немобилизованные мононукле арные клетки периферической крови для продуцирования противовирусных CD8⁺ Т-клеток вето центральной памяти (Tcm), а другой - мобилизованный гаплоидентичный препарат периферической крови. Оба препарата получают с помощью лейкафереза.

Немобилизованные (непримированные) мононуклеарные клетки периферической крови для производства клеток Tcm собирали примерно за 7 дней до запланированной даты трансплантации (День 0). Выход мононуклеарных целевых клеток при лейкаферезе составил 1×10¹⁰. Клетки Tcm инфузировали на D+7 после инфузии препарата, обогащенного CD34⁺.

Мобилизованные клетки периферической крови собирали в течение 3 дней. В коллекциях 1-го и 2-го дней отбирали CD34⁺, а затем криоконсервировали. Коллекция третьего дня была обеднена клетками CD3⁺/CD19⁺ и ее криоконсервировали. Перед процедурой обогащения можно объединить несколько коллекций. Резервную фракцию немодифицированных РВМС, содержащую 2×10⁶ клеток CD34⁺ на кг идеальной массы тела, брали из коллекции 1-го дня и криоконсервировали.

Описание процесса

Доноров MDACC сначала оценивали на пригодность, включая скрининг приемлемости и медицинский осмотр. Затем доноры получали разрешение, после чего планировали получение клеток. Количества целевых клеток зависели от протокола, и могло потребоваться несколько коллекций. После завершения процедуры сбора клетки транспортировали из места сбора в лабораторию CTL сотрудниками CTL в пластиковых холодильниках для защиты клеток от колебаний температуры и физического повреждения. Затем клеточные препараты регистрировали в CTL.

Тестирование на инфекционные заболевания и предотвращение перекрестного заражения

Оценка подходящих доноров

Все доноры проходили скрининг и тестирование в соответствии с приведенной ниже процедурой. Донор должен был быть протестирован в течение 7 дней на наличие терапевтических клеток (РВМС).

Скрининг доноров на вирус Зика:

Доноры считаются неподходящими, если они имели любой из следующих факторов

риска:

1. Медицинский диагноз инфицирования вирусом Зика за последние 6 месяцев.

2. Проживание или поездка в район с активной передачей вируса Зика в течение последних 6 месяцев.

3. Секс в течение последних 6 месяцев с мужчиной, который, как известно, имеет один из факторов риска, перечисленных в пунктах 1 или 2 выше.

Медицинский анамнез

История болезни донора MDACC и пациента определялась в клинике SCTCT лечащим врачом или уполномоченным им лицом (лицами).

Список тестирований

Все тесты проводились CLIA- сертифицированными лабораториями с использованием тестов, одобренных FDA, где это возможно. Тестирование на инфекционные заболевания включали Анти-ВИЧ-1 / ВИЧ-2 (DHIV/1/2), Антитела к вирусу гепатита С (DHCVAB), Анти HTLV I / HTLVII (DHTLV I/II), Антиген гепатита В (DHBSAG), Основное антитело к гепатиту В (DHBCAB), Вирус Западного Нила-NAT тестирование (WNV с помощью тестирования на нуклеиновые кислоты), Серологический тест на сифилис (донорский ТР-НА или RPR), Анти-ЦМВ (донорское антитело к ЦМВ), Болезнь Шагаса, ВИЧ, тестирование на антиген HCV с помощью тестирования на нуклеиновые кислоты (NAT). Примечание: Тестирование NAT на ВИЧ/ВГС является комбинированным тестированием. Если результат являлся реактивным, то выполнялось дискриминационное тестирование.

Приемлемость донора не определена

Все клеточные препараты согласно одному варианту осуществления, полученные от доноров, пригодность которых не была определена, должны ×раниться в карантине до тех пор, пока не будет определена их пригодность. Клеточные препараты в карантине четко маркировали для предотвращения случая их использования. Если клеточные препараты должны были быть выпущены до определения приемлемости, необходимо было задокументировать неотложную медицинскую помощь. Эти клеточные препараты должны иметь маркировку «НЕ ПРОВЕРЕНО НА НАЛИЧИЕ ИНФЕКЦИОННЫХ ВЕЩЕСТВ» и «ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ: Сообщите пациенту о рисках инфекционных заболеваний».

Выпуск клеточных препаратов от неприемлемого донора

Выпуск клеточных препаратов одного варианта осуществления от неподходящего донора требует документации о неотложной медицинской помощи и согласия пациента. Клеточные препараты маркировали ярлыком «Биологическая опасность» с надписью «ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ: Информировать пациента о риске инфекционных заболеваний». Результаты скрининга и анализов должны сопровождать клеточные препараты и предоставляться врачу, проводящему инфузию.

Инфузия клеточных препаратов с положительными результатами IDM

Инфузия клеточного препарата по одному варианту осуществления с положительным результатом IDM требует документального подтверждения неотложной медицинской помощи и согласия пациента. Клеточные препараты маркировали этикеткой «Биологическая опасность», включая «ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ: информируйте пациента о рисках инфекционных заболеваний». Результаты скрининга и испытаний должны сопровождать клеточный препарат и быть предоставлены лечащему врачу. Может потребоваться профилактическое лечение и дополнительное наблюдение за пациентом.

Обработка клеток

Генерация противовирусных СР8⁺ клеток вето центральной памяти (Tcm клетки)

Обзор процедуры

Сбор непримированных мононуклеарных клеток периферической крови для производства противовирусных CD8⁺ Т-клеток вето центральной памяти собирали за 7 дней до запланированной даты инфузии (День 0). Клетки вето вводили на D+7 после введения мегадозы клеток, обедненной Т-клетками.

Как показано на фиг.1:

День 1: Выделение MNC и созревание дендритных клеток (DC)

Выделение РВМС и отмывка тромбоцитов:

Препарат немобилизованных клеток для лейкафереза согласно одному варианту осуществления разбавляли в соотношении 1:2 фосфатно-солевым буфером Дульбекко (DPBS) без кальция и магния, дополненным 0,5% человеческим сывороточным альбумином, 25% (HSA). Образцы для подсчета клеток, их жизнеспособности с помощью трипанового синего (ТВ) и стерильности получали до обработки фиколом. MNC выделяли разделением в градиенте плотности фикола. После фикола препарат клеток MNC, согласно одному варианту осуществления, дважды промывали от тромбоцитов (отмывка тромбоцитов) с помощью ручного центрифугирования перед выделением CD14⁺и ресуспендировали в промывочном буфере. Образцы для подсчета клеток и их жизнеспособности с помощью ТВ были отобраны для проверки контроля качества.

После пост-фикол-тромбоцитарной промывки клетки делили на две равные фракции и разбавляли каждую приблизительно до 500 мл. Одну половину обрабатывали для выделения дендритных клеток (DC) с помощью селекции CD14⁺, а другую половину (Фракция I) оставляли на ночь для процесса обогащения CD8⁺ Т-клеток памяти до следующего дня.

Фракцию I центрифугировали и ресуспендировали в среде для выращивания Т-клеток при концентрации 30×10⁶ клеток/мл (среда Клика с улучшенным RPMI 1640 с добавлением 1:100 глутамакса и 5% человеческой сывороткой АВ) вместе с IL-7 (30 МЕ/мл). Образцы для тестирования на стерильность были отобраны. Затем Фракцию I помещали в колбы для культур тканей и инкубировали в течение ночи при 37°С, 5% СО₂.

Выделение DC - выделение СР14⁺моноцитов

Выделенную фракцию DC центрифугировали и ресуспендировали в 50 мл буфера с магнитными шариками (фосфатно-солевой буфер Дульбекко (DPBS) без кальция и магния с добавлением 0,6% ACD-A и 0,5% 25% HAS). Образцы для подсчета клеток и их жизнеспособности с помощью ТВ были отобраны.

Фракцию MNC, выделенную из DC, инкубировали с реагентом CD14 (моноклональные антитела к CD14, конъюгированные с суперпарамагнитными частицами декстрана железа). Затем клетки промывали буфером с магнитными шариками для удаления избытка реагента. Образцы для подсчета клеток, определения их жизнеспособности с помощью ТВ и иммунофенотипирования были отобраны. После промывки клетки, меченные CD14, обрабатывали на SuperMACSTM II с использованием разделительной колонки XS в соответствии с установленной SOP. Клетки с магнитной меткой (CD14⁺) оставляли в колонке, а негативные" клетки удаляли. Затем клетки CD14⁺ вымывали из колонки и собирали. Фракцию CD14⁺ промывали и ресуспендировали в среде для DC (CellGro/1% HSA), тогда как фракцию CD14^- промывали и ресуспендировали в среде для роста Т-клеток. Образцы из каждой фракции отбирали для подсчета клеток, определения их жизнеспособности с помощью ТВ и иммунофенотипирования. Обогащенный CD14⁺ клеточный препарат, согласно одному варианту осуществления, затем продолжали получать до наступления стадии созревания DC, в то время как концентрацию негативных CD14^- клеток доводили до 30×10⁶ клеток/мл в среде для роста Т-клеток вместе с IL-7 (30 МЕ/мл). Образцы для тестирования на стерильность отбирали. Затем CD14^- негативную фракцию высевали в колбы для культур тканей и инкубировали в течение ночи при 37°С, 5% СО₂. Эти клетки объединяли на следующий день с Фракцией I для процесса обогащения CD8⁺ Т-клетками памяти.

Выделение DC - адгезия СР14⁺ моноцитов

Обогащенный CD14⁺ клеточный препарат согласно одному варианту осуществления ресуспендировали при концентрации клеток 3×10⁶ клеток/мл в среде для DC (CellGro/1% HSA), дополненной IL-4 (1000 МЕ/мл) и GM-CSF (2000 МЕ/мл). Образцы для тестирования на стерильность отбирали. Затем клеточную суспензию высевали в планшеты Cell Factory и инкубировали всю ночь в течение 16-24 часов при 37°С, 5% СО₂.

День 2: Выделение клеток памяти и индукция созревания DC Индукция созревания DC

После 24-часовой инкубации клеток, обогащенных CD14⁺, цитокины IL -4 (1000 МЕ/мл), GM-CSF (2000 МЕ/мл), LPS (40 нг/мл) и IFN -у (200 МЕ/мл) добавляли в планшеты Cell Factories, чтобы вызвать созревание DC. Затем клетки инкубировали с цитокинами при 37°С, 5% СО₂ в течение 16 часов (+/- 2 часа).

Выделение клеток памяти

После хранения в течение ночи клетки Фракции I и CD 14 Негативной Фракции собирали и объединяли. После объединения (TNC фракция - выделенные Т-клетки) клетки центрифугировали и ресуспендировали в буфере CliniMACS®/0,5% HSA до минимального соотношения 1:2. Удаление тромбоцитов (отмывка тромбоцитов) проводили центрифугированием и ресуспендированием осадка клеток в CliniMACS®/0,5% HSA. Образец для подсчета клеток и их жизнеспособности с помощью ТВ отбирали.

Клеточный препарат после удаления тромбоцитов, согласно одному варианту осуществления, инкубировали с IVIg в течение 10-15 минут. После первоначальной инкубации к клеточному препарату добавляли реагенты CD4⁺, CD56⁺ и CD45RA⁺ (антитела к CD4⁺, CD56⁺ и CD45RA^-, конъюгированные с суперпарамагнитными частицами) и инкубировали в течение 30 минут на ротационном шейкере. В конце инкубации клетки промывали центрифугированием и клеточный осадок ресуспендировали в буфере CliniMACS®/0,5% HSA для удаления избытка реагента. Образцы для подсчета клеток и иммунофенотипирования отбирали. Меченные CD4⁺/CD56⁺/CD45RA⁺ клетки затем обрабатывали на CliniMACS® с использованием набора трубок деплеции и программы деплеции. В этом случае меченные магнитами клетки (CD4⁺, CD56⁺ и CD45RA⁺) удерживались колонкой, a CD4, CD56 и CD45RA негативные клетки проходили через колонку и собирались как CD4^-CD56^-CD45RA^- обедненная фракция (Фракция II). Фракцию II промывали и ресуспендировали в среде для роста Т-клеток. Образцы из каждой фракции отбирали для подсчета клеток, определения их жизнеспособности с помощью ТВ и иммунофенотипирования. Как только объем и TNC каждой фракции были определены, положительную фракцию отбрасывали, а негативную фракцию (Фракция II) обрабатывали дальше.

Концентрацию клеток Фракции II доводили до 2×10⁶ клеток/мл в ростовой среде для Т-клеток вместе с IL-7 (30 МЕ/мл). Образцы для тестирования на стерильность отбирали. Фракцию II засевали в G-Rex®100 и инкубировали при 37°С, 5% с СО₂ в течение 24 часов (+/- 2 часа).

Ограничения:

Максимальное количество Т-лимфоцитов (TNC) для обработки с помощью одного набора реагентов и набора трубок составляло 200×10⁶ TNC/мл, если директор лаборатории или уполномоченное лицо не утвердили более высокое значение. Максимальный объем загрузки инструмента CliniMACS® составляет 300 мл.

День 3: Сбор зрелых DC, загрузка вирусных пептидов и совместное культивирование

Сбор зрелых DC (mDC)

После 16-часовой инкубации супернатант удаляли, а планшеты Cell Factories осторожно промывали теплым буфером с магнитными шариками. Буфер для промывки и любые неприлипшие клетки удаляли и добавляли к супернатанту mDC. Образцы супернатанта mDC и промывочного буфера были отобраны для подсчета клеток, определения их жизнеспособности с помощью ТВ и иммунофенотипирования.

Адгезивные mDC отделяли и собирали из планшетов Cell Factories, добавляя о×лажденный льдом буфер с магнитными шариками, и оставляли на 30 минут в пакетах с замороженным гелем. Через 30 минут mDC собирали и планшеты один раз промывали ледяным буфером с магнитными шариками. Планшеты исследовали под микроскопом, чтобы определить, все ли mDC были удалены. Если наблюдали, что не все mDC были удалены, процесс промывки повторяли. Собранную (адгезивную) суспензию mDC затем центрифугировали, промывали и ресуспендировали в буфере с магнитными шариками. Образцы из адгезивных mDC были отобраны для подсчета клеток, их жизнеспособности с помощью ТВ. После определения объема mDC и TNC концентрацию клеток доводили до 1×Ю7 клеток/мл для нагрузки пептидом. Образцы, находящиеся в процессе обработки, были взяты для иммунофенотипирования. После определения объема и TNC каждой фракции фракцию супернатанта mDC удаляли, а препарат клеток mDC, согласно одному варианту осуществления, подвергали дальнейшей обработке.

Загрузка вирусных пептидов

После сбора mDC к клеткам добавляли рассчитанные пептиваторы (AdV5 Нехоп, HCMV рр65, EBV select и BKV LT) и инкубировали в течение 1 часа при 37°С, 5% СО₂. После инкубации mDC, загруженные вирусным пептидом, промывали и центрифугировали с буфером, содержащим магнитные шарики. Затем mDC, загруженные вирусным пептидом, ресуспендировали в среде для роста Т-клеток и облучали с помощью источника рентгеновского излучения в дозе 30-25 Гр.

После завершения облучения mDC, загруженные вирусным пептидом, промывали, центрифугировали и ресуспендировали в среде для роста Т-клеток. Образцы отбирали для подсчета клеток, их жизнеспособности с помощью ТВ, иммунофенотипирования и стерильности.

Подготовка к совместному культивированию и фаза голодания После 24-часовой инкубации Фракции II (CD4^-CD56^-CD45RA^-) клетки извлекали из инкубатора, центрифугировали и ресуспендировали в среде для роста Т-клеток. Образцы для подсчета клеток, их жизнеспособности с помощью ТВ, иммунофенотипирования и стерильности были отобраны. Клетки из фракции II (CD4^-CD56^-CD45RA^-) затем промывали и высевали в G-Rex®100 при концентрации 1×10⁶ клеток/мл (100 мл/G-Rex®100) вместе с mDC, загруженными вирусным пептидом, в соотношении 5:1 (клетки Фракции II: дендритные клетки (DC)) в среде для роста Т-клеток вместе с IL-21 (100 МЕ/мл). Сокультивированные клетки инкубировали в течение 3 дней при 37°С, 5% СО₂ в течение фазы голодания.

День 6: Дифференцировка и размножение противовирусных клеток вето (Tcm)

После 72-часовой фазы голодания образец супернатанта из G-Rex®100 осторожно удаляли, не разрушая клеточный слой, для определения рН и уровня глюкозы в культуре. Уровень рН должен был быть в пределах физиологического диапазона (рН 7,2-7,6), а уровень глюкозы не менее 50 мг/дл. Свежую среду для роста Т-клеток с добавлением IL-7 (30 МЕ/мл), IL-15 (125 МЕ/мл) и IL-21 (100 МЕ/мл) добавляли в каждый G-Rex®100 в количестве 50% от объема культуры. Затем клетки инкубировали еще 48 часов при 37°С с 5% СО2. Этот процесс повторяли каждые 72 часа до окончания культивирования.

Клетки находились в культуральной среде до 12 дней. Свежие среды, содержащие цитокины или только цитокины, добавляли каждые 48 часов в зависимости от рН и уровня глюкозы. Если уровень глюкозы находился в пределах:

• Уровень глюкозы от 170 мг/дл до 130 мг/дл: к культуре добавляли только цитокины IL-7, IL-15, IL-21.

• Уровень глюкозы от 129 мг/дл до 100 мг/дл: в культуру добавляли 100 мл (25% от объема G-Rex®100) свежей среды для роста Т-клеток + цитокины IL-7, IL-15, IL-21.

• Уровень глюкозы от 99 мг/дл до 50 мг/дл: 200 мл (50% от объема G-Rex® 100) свежей среды для выращивания Т-клеток + цитокины IL-7, IL-15, IL-21 добавляли к культуре.

Примечание: максимальный объем в G-Rex® 100 составляет 400 мл. Объем культуры восполнялся, если был достигнут максимальный объем в G-Rex®100.

День 12:

На 12-й день образец проверяли на стерильность в рамках контроля качества для выпуска.

День 13: Оценка количества культуральных клеток

На 13-й день отбирали образец для подсчета клеток, проверки их жизнеспособности с помощью ТВ, иммунофенотипирования для определения TNC.

День 14:

На 14-й день добавляли свежую среду, содержащую цитокины или только цитокины, в зависимости от рН и уровня глюкозы, как описано выше. После добавления среды и/или цитокинов культуру клеток инкубировали в течение 24 часов (+/- 2 часа) при 37°С, 5% СО2 перед сбором.

Общее время культивирования: 12 дней (с 3 по 15 день).

День 15: Окончательный состав и инфузия противовирусных CD8 клеток центральной памяти (Tcm)

На 15-й день клетки Tcm, визуально проверенные на загрязнение, собирали и промывали средой для суспензии клеток (Plamalyte-A/0,5% 25% HSA). Отбирали образцы для тестирования без последующего выпуска на: количество клеток, их жизнеспособность с помощью ТВ, стерильность - и для тестирования с последующим выпуском: на эндотоксин и микоплазму перед промывкой клеток.

После промывания и ресуспендирования клеточного препарата, согласно одному варианту осуществления, образцы для последующего выпуска отбирали для подсчета клеток, проверки их жизнеспособности и иммунофенотипирования. После подсчета клеток и определения TNC препарат клеток, согласно одному варианту осуществления, ресуспендировали примерно в 50-100 мл среды для получения суспензии клеток с дозой клеток Tcm в соответствии с дозой, предписанной в клиническом протоколе. Образцы препарата для последующего выпуска были отобраны для проведения окрашивания по Граму и - стерильности, если не планировался дальнейший выпуск препарата. Окончательный препарат клеток Tcm соответствовал критериям выпуска.

Готовые Tcm клетки транспортировали из CTL на этаж, где находились пациента, персоналом CTL в пластиковом холодильнике, чтобы защитить препарат клеток от колебаний температуры и физического повреждения. Персонал CTL доставлял и выдавал препараты клеток персоналу, проводящему инфузию.

Получение СР34⁺обогащенных клеток

Обзор процедуры

Как показано на фиг.2, мобилизованные гемопоэтические клетки-предшественники (также называемые НРС-А) собирали через три дня. Резервную фракцию немодифицированных РВМС, содержащую 1×10⁶ клеток CD34⁺ на кг идеальной массы тела, отбирали и криоконсервировали. Оставшуюся коллекцию первого и второго дня объединяли, CD34⁺ отбирали и криоконсервировали. Коллекцию третьего дня обедняли клетками CD3⁺/CD19⁺ и криоконсервировали. Максимальная доза Т-клеток во всем трансплантате стволовых клеток, обедненном Т-клетками, собранном из всех фракций, составила 2×10⁵ CD3⁺ клеток на кг идеальной массы тела.

Обе процедуры проводили в лаборатории CTL Core Laboratory с применением устройства Miltenyi CliniMACS®. CTL разработала хорошо зарекомендовавшую себя SOP по использованию этого устройства и использовала его при производстве клеточных препаратов для многочисленных клинических испытаний. Отдельные препараты НРС-А могли быть разделены или объединены в зависимости от количества клеток и расписания. Препараты клеток, согласно одному варианту осуществления, подвергали криоконсервации по завершении соответствующей процедуры.

Процесс обогащения СР34⁺

Схема

В первый день сбора мобилизованных НРС-А перед обработкой готовили буферные пакеты CliniMACS® PBS/EDTA (1000 мл), содержащие 0,5% человеческого сывороточного альбумина (HSA), в соответствии с хорошо зарекомендовавшей себя лабораторной SOP. Определяли вес препарата НРС-А. Образцы НРС-А с 1-го и 2-го дня отбирали для следующих тестов: количество клеток, их жизнеспособность, стерильность, иммунофенотипирование. Каждый пакет с буфером и препаратом клеток помечали именем пациента, номером MDACC и датой приготовления. Резервную фракцию из 2×10⁶ клеток CD34⁺ на кг идеальной массы тела отбирали из коллекции первого дня и не использовали, пока на оставшемся препарате клеток РВРС не была выполнена процедура селекции CD34⁺. Оставшиеся клетки из коллекции первого дня оставляли на ночь и объединяли с коллекцией второго дня для процесса обогащения CD34⁺.

Выделение СР34⁺

Объединенные препараты клеток НРС-А, согласно одному варианту осуществления, инкубировали с реагентом CD34 (антитело к CD34, конъюгированное с суперпарамагнитными частицами). Клетки промывали для удаления избытка реагента. Были отобраны образцы для подсчета клеток и иммунофенотипирования. Клетки, меченные CD34, затем обрабатывали в CliniMACS® с использованием набора трубок CliniMACS® и программы селекции CD34⁺. В этом случае клетки с магнитной меткой (CD34⁺) остались в колонке, a CD34 негативные клетки удалялись. Затем клетки CD34⁺ вымывали из колонки и собирали. Образцы из каждой фракции отбирали для подсчета клеток, их жизнеспособности и иммунофенотипирования.

Обогащенный CD34⁺ клеточный препарат можно криоконсервировать для инфузии (как обсуждается ниже) или можно использовать в виде свежих клеток (как обсуждается выше).

Ограничения:

Максимальное количество TNC для обработки с одним набором реагентов и набором трубок составляет 6×10¹⁰, если директор лаборатории или назначенное им лицо не утвердит более высокое число. Максимальный объем загрузки инструмента CliniMACS® составляет 300 мл.

Процесс истощения CD3⁺/CD19^

Схема

Буферные пакеты CliniMACS® PBS/EDTA (1000 мл), содержащие 0,5% человеческого сывороточного альбумина (HS А), готовили перед обработкой в соответствии с хорошо зарекомендовавшей себя лабораторной SOP. Определяли массу препарата клеток НРС-А. Образцы из НРС-А были отобраны для следующих тестов: подсчет клеток, жизнеспособность, стерильность и иммунофенотипирование. Каждый пакет с буфером и препаратом клеток помечали именем пациента, номером медицинской карты (MRN) и датой приготовления.

Истощение тромбоцитов

Препарат клеток НРС-А, согласно одному варианту осуществления, подвергали истощению тромбоцитов до истощения CD3⁺/CD19⁺ с использованием СОВЕ 2991. После извлечения клеток из СОВЕ 2991 отбирали образцы для подсчета клеток. Затем препарат клеток инкубировали с реагентом CD3 и реагентом CD 19.

Истощение CD3/CD19⁺

Препарат клеток НРС-А после истощения тромбоцитов, согласно одному варианту осуществления, инкубировали с IVIg в течение 10-15 минут. После первоначальной инкубации реагенты CD3⁺ и CD19⁺ (антитела к CD3 и CD19, конъюгированные с суперпарамагнитными частицами) добавляли к клеточному препарату и инкубировали в течение 30 минут на орбитальном шейкере. В конце инкубации клетки промывали с помощью СОВЕ 2991 для удаления избытка реагента. Отбирали образцы для подсчета клеток и иммунофенотипирования. Клетки, меченные CD3⁺/CD19⁺, затем обрабатывали на CliniMACS® с использованием набора трубок для деплеции и программы деплеции. В этом случае клетки с магнитной меткой (CD3⁺/CD19⁺) удерживались колонкой, a CD3 и CD19 негативные клетки проходили через колонку и собирались в виде обедненной по CD3⁺/CD19⁺ фракции. Образцы из каждой фракции отбирали для подсчета клеток, определения жизнеспособности и иммунофенотипирования.

Обедненный CD3⁺/CD19⁺ препарат клеток, согласно одному варианту осуществления, подвергали криоконсервации для инфузии (как обсуждается ниже) или мог быть использован в качестве свежих клеток (как обсуждается выше).

Ограничения: Максимальное количество TNC для обработки одним набором реагентов и набором трубок составляет 8×10¹⁰, если директор лаборатории или назначенное им лицо не утвердит более высокое число.

2-ое истощение CD3⁺ (необязательная стадия, используется по мере необходимости)

Если присутствует более 2×10⁵ СЭЗ/кг идеальной массы тела, второй цикл истощения CD3 может быть выполнен на истощенных CD3⁺/CD19+для дальнейшего снижения популяции CD3 в препарате клеток. Из каждой фракции получали образцы для подсчета клеток и иммунофенотипирования, определения жизнеспособности и стерильности.

В качестве альтернативы используют инфузию только части обедненной Т-клетками фракции, чтобы избежать инфузии более чем 2×10⁵ клеток CD3/кг идеальной массы тела.

Окончательный состав и криоконсервация препаратов клеток, обогащенных CD34⁺ и обедненных CD3⁺/CD19⁺

После отбора или истощения клеток и отбора образцов клеточные препараты согласно одному варианту осуществления концентрировали и криоконсервировали в соответствии с процедурами, утвержденными в CTL. Окончательный подсчет клеток, жизнеспособность, иммунофенотипирование, окрашивание по Граму и приготовление стерильного образца проводили до криоконсервации клеточного препарата. После подсчета клеток и определения TNC препарат клеток, согласно одному варианту осуществления, подвергали криоконсервации в среде для замораживания (50% Plasma-Lyte А, 7,5% DMSO и 35% HSA 25%) в соответствии с SOP. Пакеты, содержащие CD34⁺ обогащенные клетки или CD3⁺/CD19⁺ обедненные клетки, замораживали в морозильной камере с регулируемой скоростью и хранили в морозильной камере с жидким азотом в газообразной фазе.

Примечание: окончательная подготовка клеток является подготовкой до криоконсервации, поскольку оттаивание клеток происходит у постели больного без дальнейших манипуляций.

Выпуск и инфузия клеточного препарата

В день инфузии препараты CD34⁺обогащенных клеток и/или CD3⁺/CD19⁺ обедненных клеток доставляли персоналом CTL на этаж для пациентов и выдавали персоналу, проводящему инфузию. Окончательные препараты клеток соответствовали критериям выпуска партии. Затем эти клетки вводили пациенту в соответствии с дозой, указанной в протоколе. Следует отметить, что при использовании криоконсервированных клеток клетки оттаивали на этаже и передавались персоналу, проводящему инфузию, в соответствии со стандартной операционной процедурой. Кроме того, когда использовали криоконсервированные препараты, готовые препараты клеток транспортировали из CTL на этаж персоналом CTL в утвержденном транспортировочном контейнере из пенополистирола LN2 с бесшовными металлическими вставками, которые заполнены жидким азотом примерно на 2 дюйма.

Все испытания клеточных препаратов зависят от протокола и проводятся в соответствии с SOP.

Реагенты

Таблица 3. Список реагентов, производителей, статус (лицензия, сертификат анализа (СоА) или мастер-файл (MF))

Подбор реагентов зависит от протокола, реагенты хранятся в соответствии с рекомендациями производителя. Все реагенты проходят проверку качества до начала производства клеточных препаратов. Инвентаризация реагентов включает в себя документирование поступления, просмотр документации реагентов, отслеживание менеджером по инвентаризации; а также проверку и выпуск Службой качества (QA) по мере необходимости. Документацию на все одобренные FDA реагенты можно получить в аптеке MDACC. Сертификаты анализа и письма с перекрестными ссылками для неутвержденных реагентов должны быть получены от поставщика. Управление паспортами безопасности (MSDS) осуществляется в рамках Политики безопасности лаборатории.

Квалификационная программа

Реагенты должны пройти квалификацию до начала производства клинических препаратов. Обычно это осуществляется во время валидации процедур, связанных с производством. Реагенты и поставщики могли быть ранее квалифицированы в рамках предыдущего клинического протокола.

Удаление реагента из окончательного препарата клеток

Реагенты удаляют из конечного клеточного препарата. Это достигается с помощью различных процедур промывки, концентрирования и ресуспендирования клеток.

Тестирование клеточных препаратов

Микробиологический контроль

Тест на стерильность:

BP ВАСТЕС: Отделение лабораторной медицины MDACC тестирует образцы неготовых и готовых клеточных препаратов с помощью этой автоматизированной системы обнаружения микробов. Все тесты проводят в течение 14 дней или до тех пор, пока не будет получен положительный результат в тесте на стерильность клеточного препарата. Результаты испытаний получают до выпуска клеточного препарата.

Образцы для тестирования:

Количество и время тестирования зависят от количества манипуляций, выполняемых с клетками, времени культивирования и требований к тесту. Исследуемые образцы должны быть оптимальными для данного типа испытаний. Условия тестирования образца проверяются до начала производства, чтобы гарантировать, что никакая часть питательной среды или других буферов не повлияет на анализ стерильности. Требуется минимальный объем образца 0,5 мл/тест.

Точки отбора проб на стерильность:

Противовирусные CD8⁺ Т-клетки вето центральной памяти

1. День 1: НРС-А - Перед обработкой фиколом

2. День 1: НРС-А - Фракция I после обработки фиколом

3. День 1: CD14⁺ выделение - Негативная фракция (после инкубации в течение ночи)

4. День 1: CD14⁺ выделение Позитивная фракция с цитокинами (после инкубации в течение ночи)

5. День 2: истощение CD4⁺CD56⁺CD45RA⁺ - Негативная фракция (Фракция II) (после инкубации в течение ночи)

6. День 3: DC с вирусной нагрузкой После облучения

7. День 3: Фракция II - Сбор клеток после инкубации в течение ночи

8. День 3: Совместное культивирование - Фракция II и DC с вирусной нагрузкой

9. День 12: Совместное культивирование - День 12

10. День 13: Совместное культивирование - День 13

11. День 15: Совместное культивирование После сбора клеток

12. День 15: Готовые Tcm

CD34⁺ Мегадоза

1. НРС-А - Сбор клеток

2. CD34⁺ обогащенные клетки Готовый клеточный препарат (прекрио) или использующийся свежим

3. CD3⁺CD19⁺ обедненные клетки - Готовый клеточный препарат (прекрио) или использующийся свежим

Тестирование на микоплазму

Криоконсервированный препарат клеток Tcm, согласно одному варианту осуществления, тестировали на наличие микоплазмы. Препарат клеток Tcm (криоконсервированный) тестировали с помощью ПЦР с оценкой выхода продуктов по конечной точке (методом разделения продуктов в геле). ПЦР-анализ проводили утвержденной лицензированной референс-лабораторией. В дополнение к анализу, основанному на ПЦР, конечные клетки Tcm также тестировали с использованием одобренного биохимического теста быстрого обнаружения микоплазмы (MycoAlert, Lonza Walkersville, Inc.). Образец отбирался во время сбора перед промывкой клеток и содержал как клетки, так и среду. Объем пробы был не менее 0,5 мл. Результат, полученный с помощью MycoAlert, использовали в качестве промежуточного, пока выполняли анализ ПЦР на микоплазму. Результат ПЦР на микоплазму не использовали в качестве критерия выдачи окончательного результата, но анализировали вместе с клиническими проявлениями, чтобы помочь определить критерии, связанные с положительными клиническими результатами. Результат на микоплазму должен быть отрицательным.

Положительные результаты теста на стерильность, полученные после инфузии препарата

В случае, если результаты 14-дневного теста на стерильность или на микоплазму в культивированном клеточном препарате окажутся положительными после инфузии клеточного препарата, директор лаборатории, технический директор, медицинский директор, отдел обеспечения качества лаборатории, главный исследователь, лечащий врач и офис по исследованию нового препарата (IND) Office - или институциональный спонсор/вице-президент по клиническим исследованиям уведомляется. Служба обеспечения качества проводит расследование для выявления любых корректирующих и/или предупреждающих действий. Исследование и предлагаемые корректирующие действия при получении положительного результата теста на стерильность включают: идентификацию микроорганизма (микроороганизмов) и тестирование на чувствительность к противомикробным агентам; оценку текущей процедуры сбора и обработки клеточного препарата для определения этапа, на котором могла произойти контаминация; разработка изменений в процедурах, способствующих предотвращению нарушения стерильности в будущем; и осуществление надлежащего тестирования, чтобы гарантировать, что такие изменения в процедурах приведут к получению стерильного клеточного препарата. Лечащий врач несет ответственность за уведомление, наблюдение и лечение пациента. Главный исследователь несет ответственность за уведомление соответствующих регуляторных органов (FDA, IRB) об отклонениях и нежелательных явлениях. Кроме того, сообщается о нарушении стерильности и результатах расследования причины этого нарушения, и любых корректирующих действиях (в исправленной версии, своевременно представленной в IND, например, в течение 30 календарных дней после первоначального получения положительного результата при тестировании культуры).

Окрашивание по Граму

В ситуациях, когда требуется экспресс-тест на микроорганизмы, отдел лабораторной медицины MDACC проводил окрашивание по Граму. Требуется минимум 0,5 мл образца. Tcm клеточный препарат, CD34⁺ обогащенный клеточный препарат, и CD3⁺CD19⁺ обедненный клеточный препарат тестировали, и результаты являлись частью критериев для выпуска свежей инфузии. В клеточных препаратах не должны быть видны организмы.

Идентификация

Все CTL клеточные препараты маркируются и ×ранятся для обеспечения точной идентификации и предотвращения путаницы. Всем препаратам клеток присваивается уникальный идентификационный номер. Критические шаги во время маркировки клеточных препаратов и забора клеток требуют проверки со стороны контролирующего персонала.

CD34⁺ обогащенные и CD3⁺/CD19⁺ обедненные клеточные препараты: проточная цитометрия также используется для идентификации различных клеточных популяций, которые вводятся обратно пациенту. В дополнение к определению CD34⁺ и CD3⁺/CD19⁺ оценивают следующие маркеры субпопуляций: CD3, CD4, CD8, CD16/CD56, CD19 CD14, CD45RO и CD37.

Tcm клеточные препараты: проточная цитометрия также используется для идентификации различных клеточных популяций, которые вводятся обратно пациенту. В дополнение к определению CD45, CD3, CD8, CD62L и CD45RO оценивают следующие маркеры субпопуляций: CD4, CD56, CD16, CD95 и CD45RA.

Чистота

Проточная цитометрия используется в нескольких точках для определения клеточного фенотипа. Маркер проточной цитометрии клеточного препарата Tcm для CD3⁺CD8⁺CD62L⁺CD45RO⁺7AAD^- клеток CD45⁺ должен составлять ≥ 30%.

Минимальная приемлемая доза клеток как CD34⁺ обогащенного препарата, так и CD3⁺CD19⁺ обедненного препарата должна составлять более 6×10⁶ клеток CD34⁺ на кг идеальной массы тела. Все другие данные иммунофенотипирования не используются в качестве критериев выпуска, но анализируются вместе с клиническими проявлениями, чтобы помочь определить соответствующее количество, которое может быть связано с положительными клиническими результатами.

Эффективность

Иммунофенотипирование с помощью проточной цитометрии используется для измерения нескольких потенциальных маркеров активности, включая маркеры, упомянутые выше в разделе «Чистота». Никакие другие данные иммунофенотипирования не используются в качестве критериев выпуска, но анализируются вместе с клиническими проявлениями, чтобы помочь определить критерии, связанные с положительными клиническими результатами.

Анализ эффективности разрабатывается на протяжении этой Фазы I и проводится до начала исследования Фазы III.

Эндотоксин

Уровни эндотоксина определяли в лаборатории контроля качества CTL с использованием анализа лизата амебоцитов Limulus (LAL). Этот метод валидирован для всех комбинаций клеток и сред, подлежащих тестированию перед клиническим применением. Готовые Tcm клеточные препараты тестировали, и результаты являлись частью критериев выпуска. Требовалось минимум 0,5 мл образца. Уровень эндотоксина должен быть менее 5 ЕЭ/кг идеальной массы тела реципиента.

Визуальная оценка

Все клеточные препараты перед инфузией проверяли визуально. Клеточные препараты не должны иметь признаков контаминации.

Жизнеспособность

Жизнеспособность можно определить с помощью CTL, используя анализ с трипановым синим (ТВ) или проточную цитометрию (7AAD). Готовый Tcm клеточный препарат, CD34⁺ обогащенный клеточный препарат и CD3⁺CD19⁺ обедненный клеточный препарат должны иметь жизнеспособность 7AAD ≥ 70%. Определение жизнеспособности клеток с помощью трипанового синего может быть использовано в качестве производственного тестирования во время процесса.

Клеточная доза

Дозу CTL клеток определяли с помощью подсчета клеток и иммунофенотипирования методом проточной цитометрии.

Финальную дозу Tcm клеточного препарата определяли уровнем дозы CD8⁺, при которой субъект включали в клиническое испытание. Избыточные клетки можно использовать для коррелятивных исследований клеточной функции, исследований фенотипа и криоконсервации. Данные не используются в качестве критериев выпуска, но анализируются вместе с клиническими проявлениями, чтобы помочь определить критерии, связанные с положительными клиническими результатами. Если доза CD8⁺ в Tcm клеточном препарате меньше запланированного уровня дозы один (1) 2,5×10⁶ клеток CD8⁺ на кг идеальной массы тела (уровень дозы 1) или если клетки CD8⁺ не соответствовали критериям выпуска, инфузию этих клеток не проводили. Вместо этого резервные РВРС плюс обедненные Т-клетками РВРС вводили для восстановления «стандартного трансплантата РВРС», и пациенту назначался стандартный подготовительный режим лечения в соответствии с протоколом. Если клетки Tcm соответствовали критериям выпуска, но доза клеток CD8⁺ меньше, чем доза клеток-мишеней уровня дозы 2, равного 5×10⁶ клеток CD8⁺ на кг идеальной массы тела, то от 2,6 до 5×10⁶ клеток CD8⁺ на кг идеальной массы тела считали адекватной и принимали за уровень дозы 2. Для уровня дозы 3 с целевой дозой 10×10⁶ клеток CD8⁺ на кг идеальной массы тела адекватным считали уровень дозы 3 от 5,1 до 10×10⁶ клеток CD8⁺ на кг идеальной массы тела.

Суммарное количество клеток как в CD34⁺ обогащенном клеточном препарате, так и в CD3⁺CD19⁺ обедненном клеточном препарате должно составлять минимально допустимую дозу клеток 6×10⁶ CD34⁺ на кг идеальной массы тела и не превышать пределов дозы Т-клеток, определенных критериями выпуска как 2×10⁵ CD3⁺ клеток на кг идеальной массы тела. Финальная доза CD34⁺ обогащенного клеточного препарата контролируется и анализируется вместе с клиническими проявлениями, чтобы помочь определить критерии, связанные с положительными клиническими результатами.

Хранение аликвот

Все пробирки для контроля качества хранили в течение одной недели; однако полезность этих образцов быстро снижалась после 48 часов для большинства образцов. Все замороженные клеточные препараты также имели эталонные флаконы, которые одновременно ×ранились во время криоконсервации

Тестирование критериев для выпуска клеточного препарата и дополнительное тестирование

Пример 3

Схема лечения при отсутствии ATG

МАТЕРИАЛЫ И УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА

Получение нереактивных антисторонних клеток донора-хозяина

Антисторонние Tcm клетки получали, как описано ранее [Ophir Е. et al., Blood. 2013, 121:1220]. Кратко, спленоциты мышей-доноров культивировали против облученных сторонних спленоцитов в течение 60 часов в условиях депривации цитокинов. Затем клетки CD8 были положительно отобраны с использованием магнитных частиц (BD Pharmingen) и культивированы в среде без Ag. rhIL-15 (20 нг/мл; R&D Systems) добавляли через день. Для получения очищенной популяции в конце культивирования (день 16) клетки Tcm положительно отбирали по экспрессии CD62L (сортировка клеток с магнитной активацией [MACS® Cell Separation, Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany]), и клетки отбирали для анализа FACS.

Получение гемопоэтических стволовых клеток

Длинные кости собирали у мышей Balb/c-Nude (возраст 10-12 недель). Костный мозг извлекали путем измельчения костей до получения одноклеточной суспензии. Клетки костного мозга подсчитывали и доводили до нужной концентрации, а затем вводили мышам внутривенно в хвостовую вену.

Анализ химеризма

Химеризм определяли с помощью проточной цитометрии. Периферическую кровь собирали путем ретроорбитального кровотечения, клетки фракционировали на Ficoll-Paque Plus (Amersham Pharmacia Biotech, AB) и выделенные мононукле арные клетки каждой мыши окрашивали с помощью прямой иммунофлуоресценции против поверхностных маркеров донора и хозяина.

Противовирусная активность Tcm клеток, определяемая внутриклеточным окрашиванием

Клетки вето Tcm совместно культивировали с соответствующей смесью вирусных пептидов (EBV, CMV, Adeno, BKV) в присутствии брефельдина A (eBioscience) при 37°С, 5% CO₂ в течение 6 часов. Клетки фиксировали, подвергали пермеабилизации (набор Invitrogen Fix & Perm) и иммуноокрашивали на CD45, CD3, CD8, IFN-γ и TNF-α (BD). Положительный контроль включал TCR-независимую стимуляцию РМА/иономицином. Клетки калибровали по лимфоцитарному гейту CD45⁺/FSC и CD3⁺CD8⁺.

Результаты

Авторы настоящего изобретения ранее продемонстрировали, что сочетание мегадозы гапло-НСТ, обедненной Т-клетками с посттрансплантационным CY после немиелоаблативного кондиционирования путем сокращения объема Т-клеток с помощью ATG, 3 GY TBI и флударабина (фиг.5) может обеспечить прочное приживление трансплантата в отсутствие GVHD (данные не показаны).

Учитывая, что сокращение количества Т-клеток с помощью антител против Т-клеток, таких как ATG, связана со значительной токсичностью, включая повышенный риск вирусных инфекций, была изучена возможность замены сокращения Т-клеток с помощью применения клеток вето центральной памяти, вводимых посредством инфузии на день 7.

Как показано на фиг.6, сочетание мегадозы гапло-НСТ, обедненной Т-клетками, с CY после трансплантации после сублетальной TBI (3,5 Гр) в отсутствие сокращения Т-клеток приводило к отторжению трансплантата и отсутствию признаков химеризма. Напротив, инфузия CD8⁺ клеток вето центральной памяти на день 7 приводила к заметному химеризму донорского типа.

Эти результаты служат доказательством концепции использования введения клеток вето на день 7 в качестве замены сокращения Т-клеток с помощью таких агентов, как ATG. Такой протокол включает сублетальную TBI (например, 3 Гр), флударабин, мегадозу гемопоэтических стволовых клеток, обедненных Т-клетками, и CY после трансплантации, как показано на фиг.7.

Кроме того, продукт клеток вето проявлял уникальную противовирусную активность, направленную против смеси вирусных пептидов, то есть EBV, CMV, Adeno, BKV, как показано окрашиванием INF-γ и TNF-α (фиг.8А-С).

Хотя настоящее изобретение было описано в связи с его конкретными вариантами осуществления, очевидно, что специалистам в данной области станут очевидными множество альтернатив, модификаций и вариаций. Соответственно, предполагается охват всех таких альтернатив, модификаций и вариаций, которые соответствуют сути и широте объема прилагаемой формулы изобретения.

Все публикации, патенты и патентные заявки, упомянутые в настоящем описании, полностью включены в настоящее описание в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация, патент или патентная заявка были специально и индивидуально указаны для включения в настоящее описание посредством ссылки. Кроме того, цитирование или идентификация какой-либо ссылки в настоящей заявке не должны рассматриваться как признание того, что такая ссылка доступна в качестве предшествующего уровня техники для настоящего изобретения. В той мере, в какой используются заголовки разделов, они не должны толковаться как обязательно ограничивающие. Кроме того, любой приоритетный (приоритетные) документ (документы) настоящей заявки включен (включены) в настоящий документ посредством ссылки во всей своей полноте.

Claims

1. Способ получения выделенной популяции клеток, не индуцирующих реакцию «трансплантат против хозяина» (GVHD), имеющих фенотип Т-лимфоцитов центральной памяти (Tcm), причем указанные клетки являются клетками, индуцирующими толерантность, и/или обладают активностью против заболевания и способны возвращаться в лимфатические узлы после трансплантации, причем способ предусматривает:

(a) контакт первой популяции мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) от субъекта-донора с антителом, способным связываться с клетками, экспрессирующими CD14⁺, и отбор клеток, экспрессирующих CD14⁺, способных созревать в дендритные клетки;

(b) культивирование указанных клеток, экспрессирующих CD14⁺, в присутствии факторов созревания для получения зрелых дендритных клеток;

(c) загрузку указанных зрелых дендритных клеток вирусными пептидами;

(d) обработку второй популяции PBMC того же субъекта-донора, как и для указанной первой популяции PBMC, одним или несколькими агентами, способными истощать клетки, экспрессирующие CD4⁺, CD56⁺ и CD45RA⁺, таким образом, чтобы получить популяцию клеток, содержащую Т-клетки памяти, экспрессирующие фенотип CD45RA^-CD8⁺;

(e) контакт указанной популяции клеток, содержащей указанные Т-клетки памяти, с указанными зрелыми дендритными клетками, загруженными указанными вирусными пептидами, со стадии (c) в присутствии IL-21, позволяя таким образом обогащение вирус-реактивных Т-клеток памяти; и

(f) культивирование указанных клеток, полученных на стадии (e), в присутствии IL-21, IL-15 и/или IL-7, позволяя таким образом пролиферацию клеток, имеющих указанный фенотип Tcm, получая посредством этого выделенную популяцию клеток, не индуцирующих GVHD, имеющих указанный фенотип Tcm.

2. Способ по п. 1, где указанная первая популяция указанных PBMC и указанная вторая популяция указанных PBMC происходят из одной и той же партии и/или где указанные Т-клетки памяти, экспрессирующие указанный фенотип CD45RA^-CD8⁺, составляют по меньшей мере 40% Т-клеток в указанной популяции клеток; и/или на указанный отбор клеток, экспрессирующих CD14⁺, не влияет адгезия к пластику.

3. Способ по п. 1, где указанный контакт в присутствии IL-21 проводят в течение от 12 часов до 6 дней и/или указанный контакт в присутствии любого из IL-21, IL-15 и/или IL-7 проводят в течение от 6 до 12 дней.

4. Способ по п. 1, где указанное культивирование дополнительно включает контроль уровня глюкозы и/или уровня pH в культуре.

5. Способ по п. 1, где указанное культивирование дополнительно предусматривает добавление глюкозы до концентрации по меньшей мере 50 мг/дл.

6. Способ по п. 1, где указанное культивирование включает регулирование уровня pH культуры в физиологическом диапазоне.

7. Способ по п. 1, где указанные дендритные клетки происходят от того же субъекта-донора, что и указанная популяция клеток, содержащая указанные Т-клетки памяти.

8. Способ по п. 1, где указанные вирусные пептиды происходят из 4-10 типов вирусов.

9. Способ по п. 1, где указанные вирусные пептиды содержат по меньшей мере один пептид из вируса BK.

10. Способ по п. 1, где указанные вирусные пептиды содержат пептид вируса Эпштейна-Барр (EBV), пептид цитомегаловируса (CMV), пептид вируса BK и пептид аденовируса (Adv).

11. Способ по п. 1, где указанные вирусные пептиды содержат по меньшей мере один из EBV-LMP2, EBV-BZLF1, EBV-EBNA1, EBV select, CMV-pp65, CMV-IE-1, Adv-пентона, Adv-гексона, BKV LT, BKV (капсид VP1), BKV (капсидный белок VP2), BKV (капсидный белок VP2, изоформа VP3) и BKV (малый T-антиген).

12. Способ по п. 1, где указанные вирусные пептиды содержат по меньшей мере один из AdV5 гексона, hCMV pp65, EBV select и BKV LT.

13. Способ лечения заболевания, выбранного из группы, состоящей из фолликулярной лимфомы (FL), мантийноклеточной лимфомы (MCL), хронического лимфолейкоза (CLL), множественной миеломы (MM), лимфомы Ходжкина (HL), неходжкинской лимфомы (NHL), хронического миелоидного лейкоза (CML), миелопролиферативных синдромов (MPD), острого миелоидного лейкоза (AML), острого лимфоцитарного лейкоза (ALL), апластической анемии, тяжелого иммунодефицита и доброкачественной недостаточности костного мозга у субъекта, нуждающегося в этом, причем способ предусматривает:

(a) получение изолированной популяции клеток, не индуцирующих GVHD, согласно способу по любому из пп. 1-12; и

(b) введение субъекту терапевтически эффективного количества упомянутой выделенной популяции клеток, не индуцирующих GVHD,

с лечением посредством этого заболевания у субъекта.

14. Способ по п. 13, дополнительно предусматривающий трансплантацию трансплантата клеток или ткани субъекту.

15. Способ по п. 13, дополнительно предусматривающий введение субъекту генетически модифицированных Т-клеток или незрелых гемопоэтических клеток.

16. Способ уменьшения отторжения трансплантата у субъекта, нуждающегося в этом, где указанный субъект нуждается в несингенном трансплантате клеток или ткани, причем способ предусматривает:

(b) введение субъекту терапевтически эффективного количества упомянутой выделенной популяции клеток, не индуцирующих GVHD, с уменьшением посредством этого отторжения трансплантата у субъекта.

17. Способ уменьшения реакции «трансплантат против хозяина» (GVHD) у субъекта, нуждающегося в этом, где указанный субъект нуждается в несингенном трансплантате клеток или тканей, причем способ предусматривает:

(b) введение субъекту терапевтически эффективного количества указанной выделенной популяции клеток, не вызывающих GVHD,

с уменьшением посредством этого реакции GVHD у субъекта.

18. Способ лечения субъекта, нуждающегося в несингенном трансплантате клеток или ткани, причем способ предусматривает:

(a) трансплантацию трансплантата клеток или ткани субъекту;

(b) получение изолированной популяции клеток, не индуцирующих GVHD, согласно способу по любому из пп. 1-12; и

(c) введение субъекту терапевтически эффективного количества выделенной популяции клеток, не индуцирующих GVHD,

с лечением посредством этого субъекта, нуждающегося в трансплантате клеток или ткани.

19. Способ по п. 18, где указанная выделенная популяция клеток, не индуцирующих GVHD, предназначена для введения после указанного трансплантата клеток или ткани и/или для введения при дозе по меньшей мере 2,5×10⁶ CD8⁺ клеток на 1 кг идеальной массы тела.

20. Способ по п. 18, дополнительно предусматривающий кондиционирование субъекта согласно протоколу немиелоаблативного кондиционирования перед указанной трансплантацией и/или введением и/или введение субъекту терапевтически эффективного количества циклофосфамида после указанной трансплантации и/или введения.

21. Способ по п. 18, дополнительно предусматривающий кондиционирование субъекта в соответствии с протоколом кондиционирования, включающим тотальное облучение тела (TBI) или тотальное облучение лимфоидной ткани (TLI) перед указанной трансплантацией и/или указанным введением.

22. Способ по п. 20, где указанное терапевтически эффективное количество указанного циклофосфамида содержит 25-200 мг циклофосфамида на 1 кг идеальной массы тела субъекта и/или подлежит введению субъекту в виде двух доз через 3 и 4 дня после трансплантата.

23. Способ лечения субъекта, нуждающегося в трансплантации незрелых гемопоэтических клеток, причем способ предусматривает:

(a) кондиционирование субъекта согласно протоколу немиелоаблативного кондиционирования перед трансплантацией, где указанное немиелоаблативное кондиционирование предусматривает тотальное облучение тела (TBI) и химиотерапевтическое средство, где указанное TBI и указанное химиотерапевтическое средство вводят на день от -7 до -1 перед трансплантацией;

(b) трансплантацию субъекту дозы незрелых гемопоэтических клеток, обедненных Т-клетками, где указанные незрелые гемопоэтические клетки, обедненные Т-клетками, содержат менее 5×10⁵ CD3⁺ T-клеток на 1 кг идеальной массы тела субъекта и где указанные незрелые гемопоэтические клетки, обедненные Т-клетками, содержат по меньшей мере 5×10⁶ CD34⁺ клеток на 1 кг идеальной массы тела субъекта;

(c) введение субъекту терапевтически эффективного количества циклофосфамида, где указанное терапевтически эффективное количество указанного циклофосфамида содержит 25-200 мг циклофосфамида на 1 кг идеальной массы тела субъекта и где указанное терапевтически эффективное количество указанного циклофосфамида подлежит введению субъекту в виде двух доз через 3 и 4 дня после указанной трансплантации указанных незрелых гемопоэтических клеток, обедненных Т-клетками;

(d) получение изолированной популяции клеток, не индуцирующих GVHD, согласно способу по любому из пп. 1-12; и

(e) введение субъекту терапевтически эффективного количества выделенной популяции клеток, не индуцирующих GVHD на день 6-9 после указанной трансплантации указанных незрелых гемопоэтических клеток, обедненных Т-клетками,

24. Способ по п. 20, где субъект не подвергается хроническому лечению с профилактикой GVHD после трансплантации и/или где кортикостероиды не вводят.