RU2833964C1 - Method for detecting rsr1 gene editing events in cereals using set of oligonucleotide sequences - Google Patents
Method for detecting rsr1 gene editing events in cereals using set of oligonucleotide sequences Download PDFInfo
- Publication number
- RU2833964C1 RU2833964C1 RU2023131566A RU2023131566A RU2833964C1 RU 2833964 C1 RU2833964 C1 RU 2833964C1 RU 2023131566 A RU2023131566 A RU 2023131566A RU 2023131566 A RU2023131566 A RU 2023131566A RU 2833964 C1 RU2833964 C1 RU 2833964C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- editing
- rsr1
- insdseq
- insdqualifier
- gene
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 title claims abstract description 9
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 title claims description 15
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 title abstract description 7
- 101150033582 RSR1 gene Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 15
- 241000228158 x Triticosecale Species 0.000 claims abstract description 11
- 235000019714 Triticale Nutrition 0.000 claims abstract description 8
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 claims abstract description 7
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 5
- 239000013068 control sample Substances 0.000 claims description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 4
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 3
- 241000209140 Triticum Species 0.000 claims description 3
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 3
- 238000012800 visualization Methods 0.000 claims 1
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 abstract description 15
- 241000209143 Triticum turgidum subsp. durum Species 0.000 abstract description 11
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 abstract description 11
- 235000007264 Triticum durum Nutrition 0.000 abstract description 10
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 abstract description 8
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 abstract description 8
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 abstract description 8
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 abstract description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 7
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 abstract description 6
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 13
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 10
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 10
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 7
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 229920000945 Amylopectin Polymers 0.000 description 1
- 229920000856 Amylose Polymers 0.000 description 1
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 description 1
- 101000848922 Homo sapiens Protein FAM72A Proteins 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 101100491257 Oryza sativa subsp. japonica AP2-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100034514 Protein FAM72A Human genes 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000012321 sodium triacetoxyborohydride Substances 0.000 description 1
- 238000009966 trimming Methods 0.000 description 1
- ABDKAPXRBAPSQN-UHFFFAOYSA-N veratrole Chemical compound COC1=CC=CC=C1OC ABDKAPXRBAPSQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000028604 virus induced gene silencing Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Abstract
Description
Область техники, к которой относится изобретениеField of technology to which the invention relates
Изобретение относится к области биотехнологии и генной инженерии растений, а именно к генетическим маркерам, выявляющим редактирование гена RSR1 в геноме твердой пшеницы {Triticum durum) и озимой и яровой тритикале (× Triticosecale).The invention relates to the field of biotechnology and genetic engineering of plants, namely to genetic markers that detect editing of the RSR1 gene in the genome of durum wheat (Triticum durum) and winter and spring triticale (× Triticosecale).
Предшествующий уровень техникиPrior art
Качество зерна в значительной степени зависит от качества крахмала, содержащегося в эндосперме. Внесение мутаций в гены пути биосинтеза крахмала может положительно повлиять на качество и количество крахмала, полисахарида, служащего важным источником энергии для растений (Chen et al., 2021). Ген RSR1 играет важную роль в процессе синтеза крахмала, так как он участвует в процессе регуляции активности других генов, ответственных за синтез.Grain quality largely depends on the quality of starch contained in the endosperm. Mutations in genes involved in the starch biosynthesis pathway can positively affect the quality and quantity of starch, a polysaccharide that serves as an important energy source for plants (Chen et al., 2021). The RSR1 gene plays an important role in the process of starch synthesis, as it is involved in regulating the activity of other genes responsible for synthesis.
Исследования показывают, что изменения в гене RSR1 могут привести к изменениям в структуре и свойствах крахмала в растениях (Borisjuk et al., 2019). Это может влиять на качество и количество крахмала, производимого растениями. Например, мутации в гене RSR1 могут привести к изменению содержания амилозы и амилопектина в крахмале, что изменит его функциональные характеристики (Liu et al., 2016). Кроме того, ген RSR1 вовлечен в регуляцию времени синтеза крахмала в растении. Это может быть важным фактором для адаптации растения к различным условиям роста и потребностям в энергии.Studies show that changes in the RSR1 gene can lead to changes in the structure and properties of starch in plants (Borisjuk et al., 2019). This can affect the quality and quantity of starch produced by plants. For example, mutations in the RSR1 gene can lead to changes in the amylose and amylopectin content of starch, which will change its functional characteristics (Liu et al., 2016). In addition, the RSR1 gene is involved in regulating the timing of starch synthesis in the plant. This may be an important factor for plant adaptation to different growth conditions and energy requirements.
Изучение гена RSR1 и его влияния на синтез крахмала имеет большое значение для сельского хозяйства и биотехнологии, так как понимание этой связи может помочь улучшить выращивание растений с оптимизированным содержанием крахмала, что в свою очередь может быть полезно для производства.Studying the RSR1 gene and its effect on starch synthesis is of great importance for agriculture and biotechnology, as understanding this relationship may help improve the cultivation of plants with optimized starch content, which in turn may be useful for production.
Для ускорения процесса селекции твердой пшеницы и тритикале, мы использовали систему редактирования генома с применением CRISPR/Cas9, направленную на изменение гена RSR1.To accelerate the breeding process of durum wheat and triticale, we used a CRISPR/Cas9-based genome editing system to modify the RSR1 gene.
Редактирование с помощью системы CRISPR/Cas9 - высокоточный молекулярный метод, способный внести точечный разрыв в необходимое место генома, меченное с помощью специально подобранной гидовой РНК, комплементарной затравки - мишени для Cas9. Впервые система редактирования с помощью CRISPR/Cas9 была использована для редактирования генома растений еще в 2013 году (Wenzhi J. at al., 2013). В ходе развития технологии редактирование гена RSR1 проводилось разными способами на таких культурах, как рис (Fiaz S. et al., 2019) и пшеница (Liu et al., 2016).Editing using the CRISPR/Cas9 system is a highly precise molecular method capable of introducing a point break into the desired site of the genome, marked with a specially selected guide RNA, a complementary primer - a target for Cas9. The CRISPR/Cas9 editing system was first used for plant genome editing back in 2013 (Wenzhi J. at al., 2013). During the development of the technology, editing of the RSR1 gene was carried out in different ways on crops such as rice (Fiaz S. et al., 2019) and wheat (Liu et al., 2016).
После проведения редактирования необходимо подтвердить наличие мутаций в каждом из сайтов редактирования для дальнейшей дифференциации растений на редактированные и нередактированные, во всех вышеперечисленных работах генетические модификации выявляли с помощью секвенирования следующего поколения (NGS).After editing, it is necessary to confirm the presence of mutations at each of the editing sites for further differentiation of plants into edited and unedited; in all the above-mentioned studies, genetic modifications were detected using next-generation sequencing (NGS).
Секвенирование следующего поколения (NGS) представляет собой мощный инструмент для исследования генетической информации, но оно также является трудоемким и дорогостоящим процессом по нескольким факторам. Во-первых, NGS генерирует огромные объемы данных, особенно при анализе целых геномов или больших наборов образцов, что требует значительных вычислительных ресурсов и времени для их обработки и анализа. Во-вторых, секвенирование требует использования дорогостоящего оборудования и химических реагентов, что увеличивает финансовые затраты на проведение исследований. В-третьих, эффективное использование NGS требует высокой квалификации и опыта в обработке данных и биоинформатике, что делает этот процесс трудоемким и зависящим от наличия опытного исполнителя. Наконец, анализ и интерпретация данных, полученных с помощью NGS, также являются сложными и времязатратными процессами.Next-generation sequencing (NGS) is a powerful tool for investigating genetic information, but it is also a labor-intensive and expensive process for several reasons. First, NGS generates huge amounts of data, especially when analyzing entire genomes or large sets of samples, which requires significant computing resources and time to process and analyze. Second, sequencing requires the use of expensive equipment and chemical reagents, which increases the financial costs of conducting research. Third, effective use of NGS requires high qualifications and experience in data processing and bioinformatics, making the process labor-intensive and dependent on the availability of an experienced performer. Finally, analysis and interpretation of the data obtained by NGS are also complex and time-consuming processes.
Проведение каждой новой модификации представляет собой индивидуальный процесс, который обусловлен необходимостью подбора новых сайтов и гидовых последовательностей для проведения редактирования. В связи с этим каждое новое редактирование требует создания уникальных олигонуклеотидных праймеров, которые фланкируют область редактирования и специфичны для данного эксперимента. Олигонуклеотиды, использованные ранее в аналогичных экспериментах, не подходят для выявления проведенного нами редактирования, так как в нашем случае использовались новые сайты редактирования, и их количество также отличалось от предыдущих работ.Carrying out each new modification is an individual process, which is caused by the need to select new sites and guide sequences for editing. In this regard, each new editing requires the creation of unique oligonucleotide primers that flank the editing region and are specific to this experiment. Oligonucleotides previously used in similar experiments are not suitable for identifying the editing we carried out, since in our case new editing sites were used, and their number also differed from previous works.
Таким образом, существует потребность более простом, способе обнаружения изменений нуклеотидных последовательностей целевых генов, в частности гена RSR1, возникающих в геноме в результате редактирования с помощью системы CRISPR/Cas9. Настоящее изобретение предлагает такой способ.Thus, there is a need for a simpler method for detecting changes in the nucleotide sequences of target genes, in particular the RSR1 gene, arising in the genome as a result of editing using the CRISPR/Cas9 system. The present invention provides such a method.
Сущность изобретенияThe essence of the invention
Задачей изобретения является разработка способа выявления событий редактирования гена RSR1 у зерновых культур, который был бы более простым в осуществлении и менее трудоемким и финансово затратным.The objective of the invention is to develop a method for detecting RSR1 gene editing events in grain crops that would be simpler to implement and less labor-intensive and costly.
Для решения этой задачи авторы предлагают использовать способ, основанный на проведении полимеразной цепной реакции (ПЦР) с олигонуклеотидными праймерами, фланкирующими сайт предполагаемого редактирования, с последующей детекцией результатов ПЦР с помощью капиллярного электрофореза.To solve this problem, the authors propose using a method based on polymerase chain reaction (PCR) with oligonucleotide primers flanking the site of the proposed editing, followed by detection of PCR results using capillary electrophoresis.
Заявленный способ предусматривает использование набора олигонуклеотидных праймеров (олигонуклеотидов), которые фланкируют два сайта редактирования гена RSR1 (Фигура 1). Нуклеотидные последовательности этих праймеров приведены ниже в Таблице 1 и в Перечне последовательностей.The claimed method involves the use of a set of oligonucleotide primers (oligonucleotides) that flank two editing sites of the RSR1 gene (Figure 1). The nucleotide sequences of these primers are given below in Table 1 and in the Sequence Listing.
Способ осуществляется путем проведения полимеразной цепной реакции с представленными в Таблице 1 олигонуклеотидами, визуализацией продукта с помощью капиллярного электрофореза и дальнейшем сравнении размера фрагментов контрольного образца (растение, которое не подвергалось редактированию) и редактированных растений. Благодаря точному определению длины амплифицированных фрагментов на капиллярном электрофорезе, сдвиг - разница в размере контрольного и исследуемых образцов показывает наличие редактирования у исследуемых растений и размер инсерций и делеций.The method is carried out by carrying out a polymerase chain reaction with the oligonucleotides presented in Table 1, visualizing the product using capillary electrophoresis and then comparing the size of the fragments of the control sample (a plant that was not edited) and the edited plants. Due to the precise determination of the length of the amplified fragments on capillary electrophoresis, the shift - the difference in the size of the control and test samples shows the presence of editing in the test plants and the size of the insertions and deletions.
Краткое описание чертежейBrief description of the drawings
Фигура 1. Расположение сайтов редактирования и олигонуклеотидов, используемых для выявления редактирования в этих сайтах на гене RSR1Figure 1. Location of editing sites and oligonucleotides used to detect editing at these sites on the RSR1 gene.
Фигура 2. Фореграммы образцов тритикале с парой олигонуклеотидов SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 2 для выявления генетических модификаций в сайте редактирования RSR10 гена RSR1Figure 2. Phoregrams of triticale samples with a pair of oligonucleotides SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 2 for detection of genetic modifications in the RSR10 editing site of the RSR1 gene
а) фореграмма контрольного (немодифицированного) образцаa) pherogram of the control (unmodified) sample
б) фореграмма исследуемого образца - редактирование не выявленоb) phoregram of the sample under study - no editing detected
в) картирование ридов исследуемого образца на референсную немодифицированную последовательность - редактирование не выявленоc) mapping of reads of the studied sample to the reference unmodified sequence - editing not detected
Фигура 3. Фореграммы образцов тритикале с парой олигонуклеотидов SEQ ID NO: 3 - SEQ ID NO: 4 для выявления генетических модификаций в сайте редактирования RSR11 гена RSR1Figure 3. Phoregrams of triticale samples with a pair of oligonucleotides SEQ ID NO: 3 - SEQ ID NO: 4 for detection of genetic modifications in the RSR11 editing site of the RSR1 gene
а) фореграмма контрольного (немодифицированного) образцаa) pherogram of the control (unmodified) sample
б) фореграмма исследуемого образца - выявлено редактирование: хромосома 1А - редактирования нет, 1В - инсерция 1 bp (50%) и редактирования нет (50%), 1R - редактирования нетb) pherogram of the studied sample - editing detected: chromosome 1A - no editing, 1B - 1 bp insertion (50%) and no editing (50%), 1R - no editing
в) картирование ридов исследуемого образца на референсную немодифицированную последовательность - выявлено редактирование: хромосома 1А - редактирования нет, 1В - инсерция 1 bp (50%) и редактирования нет (50%), 1R - редактирования нет.c) mapping of reads of the studied sample to the reference unmodified sequence - editing was detected: chromosome 1A - no editing, 1B - 1 bp insertion (50%) and no editing (50%), 1R - no editing.
Фигура 4. Фореграммы образцов твердой пшеницы с парой олигонуклеотидов SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 2 для выявления генетических модификаций в сайте редактирования RSR10 гена RSR1Figure 4. Phoregrams of durum wheat samples with a pair of oligonucleotides SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 2 for detection of genetic modifications in the RSR10 editing site of the RSR1 gene
а) фореграмма контрольного (немодифицированного) образцаa) pherogram of the control (unmodified) sample
б) фореграмма исследуемого образца - выявлено редактирование: хромосома 1А - инсерция 1 bp (50%) и редактирования нет (50%), 1В - редактирования нетb) pherogram of the studied sample - editing detected: chromosome 1A - insertion of 1 bp (50%) and no editing (50%), 1B - no editing
в) картирование ридов исследуемого образца на референсную немодифицированную последовательность - выявлено редактирование: хромосома 1А - инсерция 1 bp (50%) и редактирования нет (50%), 1В - редактирования нетc) mapping of reads of the studied sample to the reference unmodified sequence - editing was detected: chromosome 1A - insertion of 1 bp (50%) and no editing (50%), 1B - no editing
Фигура 5. Фореграммы образцов твердой пшеницы с парой олигонуклеотидов SEQ ID NO: 3 - SEQ ID NO: 4 для выявления генетических модификаций в сайте редактирования RSR11 гена RSR1Figure 5. Phoregrams of durum wheat samples with a pair of oligonucleotides SEQ ID NO: 3 - SEQ ID NO: 4 for detection of genetic modifications in the RSR11 editing site of the RSR1 gene
а) фореграмма контрольного (немодифицированного) образцаa) pherogram of the control (unmodified) sample
б) фореграмма исследуемого образца - выявлено редактирование: хромосома 1А - редактирования нет, 1В - инсерция 1 bp (50%) и редактирования нет (50%)b) pherogram of the studied sample - editing detected: chromosome 1A - no editing, 1B - 1 bp insertion (50%) and no editing (50%)
в) картирование ридов исследуемого образца на референсную немодифицированную последовательность - выявлено редактирование: хромосома 1А - редактирования нет, 1В - инсерция 1 bp (50%) и редактирования нет (50%).c) mapping of reads of the studied sample to the reference unmodified sequence - editing was detected: chromosome 1A - no editing, 1B - 1 bp insertion (50%) and no editing (50%).
Осуществление изобретения (Примеры)Implementation of the invention (Examples)
Настоящее изобретение было валидировано на растениях являющихся аллополиплоидами, а именно яровой и озимой тритикале и твердой пшеницы, имеющих генотип с различающимися субгеномами (ABR в случае тритикале и АВ в случае твердой пшеницы).The present invention was validated on allopolyploid plants, namely spring and winter triticale and durum wheat, having a genotype with different subgenomes (ABR in the case of triticale and AB in the case of durum wheat).
Пример 1Example 1
На первом этапе проводилось выделение ДНК из 78 растений-регенерантов озимой и яровой тритикале прошедших редактирование гена RSR1. Выделение проводили из сухих листьев СТАВ-методом (Springer et al., 2010) модифицированным для зерновых культур. Для дальнейшей постановки ПЦР олигонуклеотиды использовались в следующих комбинациях: SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3-SEQ ID NO: 4.At the first stage, DNA was isolated from 78 regenerated winter and spring triticale plants that had undergone RSR1 gene editing. The isolation was performed from dry leaves using the CTAB method (Springer et al., 2010) modified for grain crops. For further PCR, the oligonucleotides were used in the following combinations: SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3-SEQ ID NO: 4.
ПЦР-амплификацию проводили по единому режиму для всех пар олигонуклеотидов (95°С - 3 мин; 95°С - 20 сек, 60°С - 30 сек, 72°С - 20 сек - 35 циклов; 72°С - 10 мин), в стандартной ПЦР-смеси (Mg2+ 2.5 мМ, dNTP 0.25 мМ) с добавлением 1 мкл ДНК с концентрацией 5-10 нг/мкл. При постановке реакций в реакционную смесь так же добавляли 0.5 мкл ДМСО 100% для лучшей амплификации GC-богатых регионов. Продукты амплификации с ДМСО перед капиллярным форезом разводили дистиллированной водой в 20 раз с целью снижения концентрации солей для лучшего прохождения электрофореза.PCR amplification was performed using a single mode for all pairs of oligonucleotides (95°C - 3 min; 95°C - 20 sec, 60°C - 30 sec, 72°C - 20 sec - 35 cycles; 72°C - 10 min) in a standard PCR mixture (Mg2+ 2.5 mM, dNTP 0.25 mM) with the addition of 1 μl of DNA with a concentration of 5-10 ng/μl. When setting up reactions, 0.5 μl of 100% DMSO was also added to the reaction mixture for better amplification of GC-rich regions. The amplification products with DMSO were diluted with distilled water 20 times before capillary phoresis in order to reduce the concentration of salts for better electrophoresis.
Продукты амплификации визуализировали методом капиллярного электрофореза с помощью генетического анализатора Нанофор 05 в присутствии маркера молекулярного веса. Капиллярный электрофорез на генетическом анализаторе проводится в соответствии с руководством пользователя, предоставляемым производителем (Синтол, Россия). Параметры электрофореза зависели от длины капилляров и типа полимера, рекомендуемые параметры инжекции 1800 В, 5 секунд. Продукты амлификации, полученные в постановке ПЦР с олигонуклеотидами 1) SEQ ID NO: 1-2; 2) SEQ ID NO: 3-4 визуализировали на фрагментном анализе одновременно.The amplification products were visualized by capillary electrophoresis using a Nanofor 05 genetic analyzer in the presence of a molecular weight marker. Capillary electrophoresis on a genetic analyzer is carried out in accordance with the user manual provided by the manufacturer (Synthol, Russia). The electrophoresis parameters depended on the length of the capillaries and the type of polymer, the recommended injection parameters were 1800 V, 5 seconds. The amplification products obtained in the PCR with oligonucleotides 1) SEQ ID NO: 1-2; 2) SEQ ID NO: 3-4 were visualized in fragment analysis simultaneously.
Результаты постановок - получившиеся профили образцов, проходившие редактирование сравнивали с профилем контрольного образца, не проходившего редактирование и за счет изменения размера фрагментов выявляли редактирование и его тип.The results of the settings - the resulting profiles of the samples that underwent editing were compared with the profile of the control sample that did not undergo editing, and by changing the size of the fragments, the editing and its type were identified.
Далее все образцы были отправлены на NGS. Библиотеки для NGS были подготовлены по протоколу 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation (Preparing 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons for the Illumina MiSeq System). Секвенирование проводилось на приборе Illumina MiSeq.All samples were then sent for NGS. Libraries for NGS were prepared using the 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation protocol (Preparing 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons for the Illumina MiSeq System). Sequencing was performed on an Illumina MiSeq.
Для каждого секвенируемого образца длина прочтения, качество и количество ридов в полученных fastq-файлах оценивались с помощью программы FastQC 0.11.9. Первичная обработка ридов осуществлялась с помощью программы Trimmomatic-0.39. После тримминга fastq файлы конвертировались в fasta файлы, которые анализировались в программе Unipro UGENE 33.0.For each sequenced sample, the read length, quality, and number of reads in the resulting fastq files were assessed using FastQC 0.11.9. Primary read processing was performed using Trimmomatic-0.39. After trimming, fastq files were converted to fasta files, which were analyzed in Unipro UGENE 33.0.
Полученные результаты фрагментного анализа совпали с результатами NGS в 100% случаев (Фигуры 2-3), что демонстрирует высокую эффективность и надежность метода в выявлении генетических изменений, данные результаты также подчеркивают перспективность и потенциал данного метода и его дальнейшего использования.The obtained results of fragment analysis coincided with the NGS results in 100% of cases (Figures 2-3), which demonstrates the high efficiency and reliability of the method in identifying genetic changes; these results also emphasize the promise and potential of this method and its further use.
Пример 2Example 2
Данный набор олигонуклеотидов также был апробирован на 68 растениях твердой пшеницы, где продемонстрировал высокую эффективность и точность при выявлении редактирования. Выделение ДНК, ПЦР-амплификацию, постановку фрагментного анализа и NGS проводили аналогично Примеру 1. Полученные результаты фрагментного анализа совпали с результатами NGS в 100%) случаев, чем подтверждают возможность его использования для быстрого обнаружения генетических модификаций в твердой пшенице и, вероятно, в других ценных сельскохозяйственных культурах (Фигуры 4-5).This set of oligonucleotides was also tested on 68 durum wheat plants, where it demonstrated high efficiency and accuracy in detecting editing. DNA extraction, PCR amplification, fragment analysis and NGS were performed similarly to Example 1. The fragment analysis results coincided with the NGS results in 100% of cases, confirming the possibility of its use for rapid detection of genetic modifications in durum wheat and, probably, in other valuable agricultural crops (Figures 4-5).
Финансирование работ по созданию настоящего изобретения проводилось из средств Соглашения №075-15-2019-1667 от «31» октября 2019 г. о предоставлении из федерального бюджета грантов в форме субсидий в соответствии с пунктом 4 статьи 78.1 Бюджетного кодекса Российской Федерации на осуществление государственной поддержки создания и развития центра геномных исследований мирового уровня «Курчатовский геномный центр» в рамках реализации федерального проекта «Развитие научной и научно-производственной кооперации» национального проекта «Наука».The work on the creation of this invention was financed from the funds of Agreement No. 075-15-2019-1667 dated October 31, 2019 on the provision of grants from the federal budget in the form of subsidies in accordance with paragraph 4 of Article 78.1 of the Budget Code of the Russian Federation for the implementation of state support for the creation and development of a world-class genomic research center, the Kurchatov Genome Center, as part of the implementation of the federal project "Development of Scientific and Scientific-Industrial Cooperation" of the national project "Science".
Список литературыReferences
Borisjuk et al. (10 Mart 2019 г.). Genetic Modification for Wheat Improvement: From Transgenesis to Genome Editing. Biomed Res Int.Borisjuk et al. (March 10, 2019). Genetic Modification for Wheat Improvement: From Transgenesis to Genome Editing. Biomed Res Int.
Chen J. et al. (April 2021 г.). Towards targeted starch modification in plants. Current Opinion in Plant Biology.Chen J. et al. (April 2021). Towards targeted starch modification in plants. Current Opinion in Plant Biology.
Fiaz S. et al. (19 February 2019 г.). Applications of the CRISPR/Cas9 System for Rice Grain Quality Improvement: Perspectives and Opportunities. Int J Mol Sci.Fiaz S. et al. (19 February 2019). Applications of the CRISPR/Cas9 System for Rice Grain Quality Improvement: Perspectives and Opportunities. Int J Mol Sci.
Liu et al. (23 September 2016 г.). Virus-Induced Gene Silencing Identifies an Important Role of the TaRSR1Liu et al. (September 23, 2016). Virus-Induced Gene Silencing Identifies an Important Role of the TaRSR1
Springer et al. (November 2010 г.). Isolation of Plant DNA for PCR and Genotyping Using Organic Extraction and СТАВ. Cold Spring Harbor Protocols.Springer et al. (November 2010). Isolation of Plant DNA for PCR and Genotyping Using Organic Extraction and STAB. Cold Spring Harbor Protocols.
Wenzhi J. at al. (1 November 2013 г.). Demonstration of CRISPR/Cas9/sgRNA-mediated targeted gene modification in Arabidopsis, tobacco, sorghum and rice. Nucleic Acids Research, p.188.Wenzhi J. at al. (November 1, 2013). Demonstration of CRISPR/Cas9/sgRNA-mediated targeted gene modification in Arabidopsis, tobacco, sorghum and rice. Nucleic Acids Research, p.188.
--->--->
<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?><?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>
<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing <!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing
1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">
<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Перечень <ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="List
последовательностей RSR1-1.xml" softwareName="WIPO Sequence" sequences RSR1-1.xml" softwareName="WIPO Sequence"
softwareVersion="2.1.2" productionDate="2023-11-23">softwareVersion="2.1.2" productionDate="2023-11-23">
<ApplicationIdentification><ApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode> <IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText>RSR1-1</ApplicationNumberText> <ApplicationNumberText>RSR1-1</ApplicationNumberText>
<FilingDate></FilingDate><FilingDate></FilingDate>
</ApplicationIdentification></ApplicationIdentification>
<ApplicantFileReference>RSR1-1</ApplicantFileReference> <ApplicantFileReference>RSR1-1</ApplicantFileReference>
<ApplicantName languageCode="ru">ФГБНУ ВНИИСБ</ApplicantName> <ApplicantName languageCode="ru">FGBNU VNIISS</ApplicantName>
<ApplicantNameLatin>All-Russia Research Institute of Agricultural <ApplicantNameLatin>All-Russia Research Institute of Agricultural
Biotechnology</ApplicantNameLatin>Biotechnology</ApplicantNameLatin>
<InventionTitle languageCode="ru">СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ СОБЫТИЙ <InventionTitle languageCode="en">WAY TO DETECT EVENTS
РЕДАКТИРОВАНИЯ ГЕНА RSR1 У ЗЕРНОВЫХ КУЛЬТУР С ПОМОЩЬЮ НАБОРА EDITING THE RSR1 GENE IN CEREAL CROPS USING A KIT
ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ</InventionTitle>OLIGONUCLEOTIDE SEQUENCES</InventionTitle>
<SequenceTotalQuantity>4</SequenceTotalQuantity> <SequenceTotalQuantity>4</SequenceTotalQuantity>
<SequenceData sequenceIDNumber="1"> <SequenceData sequenceIDNumber="1">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q1"><INSDQualifier id="q1">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ggccgtaggaataggatcg</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>ggccgtaggaataggatcg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="2"> <SequenceData sequenceIDNumber="2">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q2"><INSDQualifier id="q2">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gataacgactccgacgtcccg</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>gataacgactccgacgtcccg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="3"> <SequenceData sequenceIDNumber="3">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q3"><INSDQualifier id="q3">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gatcagatgaagggcctgtcc</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>gatcagatgaagggcctgtcc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="4"> <SequenceData sequenceIDNumber="4">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>26</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>26</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..26</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..26</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q4"><INSDQualifier id="q4">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gatagcacaatcacatccagagatgc</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>gatagcacaatcacatccagagatgc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
</ST26SequenceListing></ST26SequenceListing>
<---<---
Claims (4)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2833964C1 true RU2833964C1 (en) | 2025-02-03 |
Family
ID=
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102206639A (en) * | 2010-03-30 | 2011-10-05 | 中国科学院上海生命科学研究院 | Gene adjusting starch anabolism of plant seeds and its application |
| RU2528748C1 (en) * | 2013-01-29 | 2014-09-20 | Рамиль Ришадович Вафин | METHOD OF CARRYING OUT PCR AND PCR-RFLP FOR IDENTIFICATION OF ALLELIC VERSIONS OF Waxy-GENES OF WHEAT |
| WO2015162567A1 (en) * | 2014-04-25 | 2015-10-29 | Basf Plant Science Company Gmbh | Plants having one or more enhanced yield-related traits and method for making the same |
| RU2758718C2 (en) * | 2015-12-16 | 2021-11-01 | Зингента Партисипейшнс Аг | Gene sections and genes associated with increased yield in plants |
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102206639A (en) * | 2010-03-30 | 2011-10-05 | 中国科学院上海生命科学研究院 | Gene adjusting starch anabolism of plant seeds and its application |
| RU2528748C1 (en) * | 2013-01-29 | 2014-09-20 | Рамиль Ришадович Вафин | METHOD OF CARRYING OUT PCR AND PCR-RFLP FOR IDENTIFICATION OF ALLELIC VERSIONS OF Waxy-GENES OF WHEAT |
| WO2015162567A1 (en) * | 2014-04-25 | 2015-10-29 | Basf Plant Science Company Gmbh | Plants having one or more enhanced yield-related traits and method for making the same |
| RU2758718C2 (en) * | 2015-12-16 | 2021-11-01 | Зингента Партисипейшнс Аг | Gene sections and genes associated with increased yield in plants |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Крупин П.Ю., Выбор генов синтеза крахмала пшеницы как мишеней для геномного редактирования / П. Ю. Крупин // Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и сельскохозяйственной микробиологии: Сборник тезисов докладов 20-й Всероссийской конференции молодых учёных, посвященной памяти академика РАСХН Георгия Сергеевича Муромцева, Москва, 27-29 октября 2020 года. - Москва: Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии", 2020, стр. 39-40. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Morgil et al. | Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) in Plant Genetics and | |
| Singh et al. | CAAT box-derived polymorphism (CBDP): a novel promoter-targeted molecular marker for plants | |
| EP2339025B1 (en) | Methods for determining the methylation profiles | |
| CN110628880B (en) | Method for detecting gene variation by synchronously using messenger RNA and genome DNA template | |
| WO2012142591A2 (en) | Compositions, methods and uses for multiplex protein sequence activity relationship mapping | |
| CN114736971B (en) | SNP molecular markers, test kits and their applications related to egg production of female pigeons | |
| KR20220130592A (en) | A high-sensitivity method for accurate parallel quantitation of nucleic acids | |
| KR20240032630A (en) | Methods for accurate parallel detection and quantification of nucleic acids | |
| JP2011120558A (en) | Method for designing probe in dna microarray, and dna microarray having probe designed by the method | |
| EP4215619A1 (en) | Methods for sensitive and accurate parallel quantification of nucleic acids | |
| CN108642201B (en) | SNP (Single nucleotide polymorphism) marker related to millet plant height character as well as detection primer and application thereof | |
| RU2833964C1 (en) | Method for detecting rsr1 gene editing events in cereals using set of oligonucleotide sequences | |
| RU2833967C1 (en) | Method for detecting rsr1 gene editing events in cereals using set of oligonucleotide sequences | |
| Singh et al. | Next-generation sequencing technologies: approaches and applications for crop improvement | |
| Edwards et al. | DNA sequencing methods contributing to new directions in cereal research | |
| CN117126962B (en) | Cotton leaf wrinkling control gene GhZY, linkage SNP locus and application thereof | |
| CN108642199B (en) | SNP (Single nucleotide polymorphism) marker related to growth of millet flag leaves as well as detection primer and application thereof | |
| RU2833965C1 (en) | Method for detecting sbeiia gene editing events in cereals using set of oligonucleotide sequences | |
| RU2817377C1 (en) | Method for detecting gbssi gene editing events in cereals using set of oligonucleotide sequences | |
| CN117265168B (en) | Molecular markers related to protein content in soybeans and their applications | |
| Llaca | Sequencing technologies and their use in plant biotechnology and breeding | |
| CN108707684B (en) | SNP (Single nucleotide polymorphism) marker related to millet flag leaf length and detection primer and application thereof | |
| CN109136351A (en) | A method of sgRNA activity and specificity are detected by amplicon high throughput sequencing technologies | |
| RU2834229C1 (en) | Method for detecting gbssi gene editing events in cereals using set of oligonucleotide sequences | |
| RU2833963C1 (en) | Method for detecting isa1 gene editing events in cereals using set of oligonucleotide sequences |