RU2833819C1 - Method for sequencing exons of hla-dqa1 gene and set of synthetic oligonucleotides for its implementation - Google Patents
Method for sequencing exons of hla-dqa1 gene and set of synthetic oligonucleotides for its implementation Download PDFInfo
- Publication number
- RU2833819C1 RU2833819C1 RU2024117820A RU2024117820A RU2833819C1 RU 2833819 C1 RU2833819 C1 RU 2833819C1 RU 2024117820 A RU2024117820 A RU 2024117820A RU 2024117820 A RU2024117820 A RU 2024117820A RU 2833819 C1 RU2833819 C1 RU 2833819C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- hla
- insdseq
- insdqualifier
- sequencing
- dna
- Prior art date
Links
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 title claims abstract description 33
- 101150038552 HLA-DQA1 gene Proteins 0.000 title claims abstract description 28
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 title claims abstract description 12
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 title description 24
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 title description 21
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 58
- 239000013615 primer Substances 0.000 claims abstract description 32
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 claims abstract description 27
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 27
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 27
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 claims abstract description 11
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims abstract description 11
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 claims abstract description 9
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 239000012620 biological material Substances 0.000 claims abstract description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims abstract 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 3
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 abstract description 31
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 26
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 abstract description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 21
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 17
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 16
- 102100036243 HLA class II histocompatibility antigen, DQ alpha 1 chain Human genes 0.000 description 9
- 108010086786 HLA-DQA1 antigen Proteins 0.000 description 9
- 239000012901 Milli-Q water Substances 0.000 description 8
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 8
- 239000005549 deoxyribonucleoside Substances 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 8
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 8
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 8
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 5
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 238000012165 high-throughput sequencing Methods 0.000 description 4
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000012070 whole genome sequencing analysis Methods 0.000 description 3
- 102210047410 DQA1*05:05 Human genes 0.000 description 2
- 102100028976 HLA class I histocompatibility antigen, B alpha chain Human genes 0.000 description 2
- 102100028971 HLA class I histocompatibility antigen, C alpha chain Human genes 0.000 description 2
- 102100036241 HLA class II histocompatibility antigen, DQ beta 1 chain Human genes 0.000 description 2
- 102100040485 HLA class II histocompatibility antigen, DRB1 beta chain Human genes 0.000 description 2
- 108010075704 HLA-A Antigens Proteins 0.000 description 2
- 108010058607 HLA-B Antigens Proteins 0.000 description 2
- 108010052199 HLA-C Antigens Proteins 0.000 description 2
- 108010045483 HLA-DPB1 antigen Proteins 0.000 description 2
- 108010065026 HLA-DQB1 antigen Proteins 0.000 description 2
- 108010039343 HLA-DRB1 Chains Proteins 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 238000007622 bioinformatic analysis Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 2
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 2
- 206010003827 Autoimmune hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 description 1
- 208000028964 Congenital reticular ichthyosiform erythroderma Diseases 0.000 description 1
- 102210047476 DQA1*02:01 Human genes 0.000 description 1
- 102210047284 DQA1*03:01 Human genes 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 1
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 102100028972 HLA class I histocompatibility antigen, A alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 102100029966 HLA class II histocompatibility antigen, DP alpha 1 chain Human genes 0.000 description 1
- 102100031618 HLA class II histocompatibility antigen, DP beta 1 chain Human genes 0.000 description 1
- -1 HLA- DPA1 Proteins 0.000 description 1
- 108010093061 HLA-DPA1 antigen Proteins 0.000 description 1
- 102220440888 HLA-DQA1*03:01 Human genes 0.000 description 1
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 238000003766 bioinformatics method Methods 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012568 clinical material Substances 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003917 human chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 238000005464 sample preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
Abstract
Description
Изобретение относится к биохимии и молекулярной биологии и позволяет секвенировать экзоны гена HLA-DQA1 методом NGS как для решения задач практической медицины, так и в научно-исследовательских целях.The invention relates to biochemistry and molecular biology and allows sequencing of the HLA-DQA1 gene exons using the NGS method both for solving practical medical problems and for scientific research purposes.
Гены HLA (Human Leukocyte Antigen), располагающиеся на 6 хромосоме человека, кодируют белки, которые входят в главный комплекс гистосовместимости (МНС) и играют важную роль в регуляции иммунной системы. Гены HLA отличаются огромным полиморфизмом. Например, для тепи HLA-DQA1 на сегодня в базе данных IPD-IMGT/HLA Database содержится 383 аллели.The HLA (Human Leukocyte Antigen) genes, located on human chromosome 6, encode proteins that are part of the major histocompatibility complex (MHC) and play an important role in regulating the immune system. HLA genes are characterized by enormous polymorphism. For example, for the HLA-DQA1 gene, the IPD-IMGT/HLA Database currently contains 383 alleles.
Типирование генов HLA (определение конкретных аллелей), учитывая их роль в регуляции иммунной системы, может иметь самое широкое применение как в практической медицине, так и для фундаментальной науки. Типирование генов HLA имеет широкое применение в трансплантологии для оценки совместимости донора и реципиента и снижения вероятности реакции отторжения органов и клеток. HLA gene typing (determination of specific alleles), given their role in regulating the immune system, can have the widest application both in practical medicine and in fundamental science. HLA gene typing is widely used in transplantology to assess the compatibility of the donor and recipient and reduce the likelihood of organ and cell rejection.
В настоящее время опубликованы работы, описывающие участие генов HLA в развитии многочисленных заболеваний, включая онкологические (меланома, лимфома) и аутоиммунные (ревматоидный артрит, аутоиммунный гепатит) заболевания. Показано влияние аллелей генов HLA на восприимчивость к многочисленным инфекциям, включая ВИЧ-инфекцию, вирус гепатита В, вирус гепатита С, SARS-CoV-2. Типирование HLA-DQA1 может дать врачам рекомендации по диагностике определенных заболеваний и определению направлений лечения.Currently, works have been published describing the involvement of HLA genes in the development of numerous diseases, including oncological (melanoma, lymphoma) and autoimmune (rheumatoid arthritis, autoimmune hepatitis) diseases. The influence of HLA gene alleles on susceptibility to numerous infections, including HIV infection, hepatitis B virus, hepatitis C virus, SARS-CoV-2, has been shown. HLA-DQA1 typing can provide doctors with recommendations for diagnosing certain diseases and determining treatment options.
В литературных источниках описана ассоциация аллелей генов HLA и индивидуальных реакций на введение иммунобиологических препаратов. Например, на китайской популяции Хань было показано, что аллель HLA-DQA1*03:02 связан с высоким риском хронизации вирусного гепатита В, в то время как аллели HLA-DQA1*01:02 и HLA-DQA1*03:01 с низким [Lu L.P, Liu Y., Li X.W., Sun G.C., Zhu X.L., Wu Y.Z., Hu Q.Y., Li H. (Association of polymorphisms of human leucocyte antigen -DRB1 and -DQA1 allele with outcomes of hepatitis В virus infection in Han population of north China). Zhongguo Yi Xue Ke Xue Yuan Xue Bao. 2006 Apr; 28 (2): 134-42. Chinese. PMID: 16733891].The literature describes an association of HLA gene alleles and individual reactions to the administration of immunobiological drugs. For example, in the Chinese Han population, it was shown that the HLA-DQA1*03:02 allele is associated with a high risk of chronic viral hepatitis B, while the HLA-DQA1*01:02 and HLA-DQA1*03:01 alleles with a low risk [Lu LP, Liu Y., Li XW, Sun GC, Zhu XL, Wu YZ, Hu QY, Li H. (Association of polymorphisms of human leucocyte antigen -DRB1 and -DQA1 allele with outcomes of hepatitis B virus infection in Han population of north China). Zhongguo Yi Xue Ke Xue Yuan Xue Bao. 2006 Apr; 28 (2): 134-42. Chinese. PMID: 16733891].
Расширение инструментария для типирования генов HLA позволяет более детально изучить молекулярные механизмы регуляции иммунной системы.The expansion of the toolkit for HLA gene typing allows for a more detailed study of the molecular mechanisms regulating the immune system.
В то время как в более ранних работах по типированию генов HLA использовалось преимущественно секвенирование по методу Сэнгера, в настоящее время все чаще используется метод высокопроизводительного секвенирования (NGS). Данный метод стал популярен благодаря одновременному прочтению протяженных участков генома и выявлению большого количества мутаций/полиморфизмов.While earlier work on HLA gene typing relied primarily on Sanger sequencing, high-throughput sequencing (NGS) is now increasingly being used. This method has become popular due to its ability to read large sections of the genome at once and to detect large numbers of mutations/polymorphisms.
Так как полногеномное секвенирование имеет высокую стоимость и прочтение всего генома для исследований, связанных с типированием генов HLA, не требуется, в качестве альтернативы полногеномному секвенированию, при решении ряда задач типирования генов HLA может быть применено так называемое таргетное (или целевое) секвенирование представляющих наибольший интерес участков данных генов. Целевая область фрагментов ДНК гена или области генома направленно амплифицируются, после чего подвергаются секвенированию NGS, таким образом, стоимость значительно снижается, время проведения исследования сокращается, а необходимость последующего анализа данных уменьшается. В настоящее время подобные подходы широко используются, например, для секвенирования экзома человека и отдельных генов.Since whole genome sequencing is expensive and reading the entire genome for studies related to HLA gene typing is not required, so-called targeted sequencing of the gene regions of greatest interest can be used as an alternative to whole genome sequencing when solving a number of HLA gene typing problems. The target region of gene DNA fragments or genomic regions are targeted amplified and then subjected to NGS sequencing, thus significantly reducing the cost, reducing the time of the study, and reducing the need for subsequent data analysis. Such approaches are currently widely used, for example, for sequencing the human exome and individual genes.
Для того, чтобы идентифицировать аллели гена HLA-DQA1, достаточно секвенировать 4 региона данного гена, включающие экзоны. При таргетном NGS секвенировании целевые регионы ДНК сначала амплифицируются с помощью специальных олигонуклеотидных праймеров, что позволяет изучать их затем избирательно. Далее, как правило, проводится этап лигирования служебных фрагментов олигонуклеотидов (адаптеров) с помощью особых дорогостоящих ферментов, и индексация с детекцией в режиме реального времени с помощью флуоресцентного интеркалирующего красителя.In order to identify alleles of the HLA-DQA1 gene, it is sufficient to sequence 4 regions of this gene, including exons. In targeted NGS sequencing, target DNA regions are first amplified using special oligonucleotide primers, which allows them to be studied selectively. Next, as a rule, a stage of ligation of service fragments of oligonucleotides (adapters) is carried out using special expensive enzymes, and indexing with detection in real time using a fluorescent intercalating dye.
Из уровня техники известны следующие протоколы и наборы реагентов для секвенирования генов HLA методом NGS:The following protocols and reagent kits for sequencing HLA genes using the NGS method are known from the state of the art:
Набор ScisGo™ HLA v6 Kits компании Scisco Genetics technology (США) [https://sciscogenetics.com/pages/kits.html] позволяет типировать гены HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1/3/4/5, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DPA1, HLA-DPB1. В нем используется технология мультиплексной ПЦР, позволяющая конструировать библиотеку из фрагментов генов HLA с использованием множества пар праймеров и без лигирования адаптеров. Секвенирование подготовленной библиотеки производится на платформе MiSeq Illumina. Пробоподготовка осуществляется при помощи четырех пулов праймеров.The ScisGo™ HLA v6 Kits from Scisco Genetics technology (USA) [https://sciscogenetics.com/pages/kits.html] allows typing the HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1/3/4/5, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA- DPA1, HLA-DPB1 genes. It uses multiplex PCR technology, which allows constructing a library from HLA gene fragments using multiple primer pairs and without adapter ligation. Sequencing of the prepared library is performed on the MiSeq Illumina platform. Sample preparation is carried out using four primer pools.
TruSight™ HLA Sequencing Panel компании Illumina (США) [https://www.illumina.com/clinical/hla-sequencing.html] позволяет типировать гены HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1/3/4/5, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DPA1, HLA-DPB1. Для данной панели фрагменты ДНК амплифицируются крупными фрагментами, длиной несколько т.п.н. (так называемая, long-range PCR). Далее полученные ампликоны фрагментируются набором Nextera® library preparation (Illumina), индексируются, и полученная библиотека секвенируется на платформе Illumina.TruSight™ HLA Sequencing Panel by Illumina (USA) [https://www.illumina.com/clinical/hla-sequencing.html] allows typing of genes HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1/3/4/5, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DPA1, HLA-DPB1 . For this panel, DNA fragments are amplified into large fragments, several kb long (so-called long-range PCR). The resulting amplicons are then fragmented using the Nextera® library preparation kit (Illumina), indexed, and the resulting library is sequenced on the Illumina platform.
Следует отметить сравнительно высокую цену данных коммерческих наборов, а также отсутствие информации об используемых праймерах.It should be noted that these commercial kits are relatively expensive and that there is no information about the primers used.
Также известна группа праймеров и набор для определения генетического типирования человеческого лейкоцитарного антигена HLA-DQA1 [патент CN 117265090, опубл. 22.12.2023, дата подачи заявки 20.10.2023], которая включает специфическую группу праймеров для амплификации ПЦР, а группа специфичных праймеров для амплификации ПЦР включает четыре пары праймеров, сконструированных в соответствии со специфической последовательностью подтипа гена HLA-DQA1. Также группа праймеров содержит пять праймеров для секвенирования универсального типа DQA1. Информация об используемых праймерах отсутствует.Also known is a group of primers and a kit for determining the genetic typing of the human leukocyte antigen HLA-DQA1 [patent CN 117265090, published 22.12.2023, application filing date 20.10.2023], which includes a specific group of primers for PCR amplification, and the group of specific primers for PCR amplification includes four pairs of primers designed in accordance with the specific sequence of the HLA-DQA1 gene subtype. The group of primers also contains five primers for sequencing the universal DQA1 type. There is no information on the primers used.
Из уровня техники известны праймеры для типирования гена HLA-DQA1 [патент JP 2000201685, опубл. 25.07.2000, дата подачи заявки 13.01.1999], где используются праймеры, амплифицирующие участки гена HLA-DQA1 длиной от 116 до 792 п.н., аллель определяется по форезу. Патент был зарегистрирован задолго до введения в практику технологии NGS, которая является предпочтительной при типировании аллелей HLA, и соответственно не адаптирован для данной технологии. Определение аллелей не отличается высокой точностью, набор позволяет различать 18 аллелей HLA-DQA1 в разрешении 2-х, в то время как на сегодня в базе данных IPD-IMGT/HLA Database содержится 383 аллели в разрешении 3-х.Primers for typing the HLA-DQA1 gene are known from the state of the art [patent JP 2000201685, published 25.07.2000, application date 13.01.1999], where primers are used that amplify sections of the HLA-DQA1 gene from 116 to 792 bp in length, the allele is determined by phoresis. The patent was registered long before the introduction of NGS technology, which is preferred for typing HLA alleles, and accordingly is not adapted for this technology. Determination of alleles is not very accurate, the kit allows distinguishing 18 HLA-DQA1 alleles at a resolution of 2, while today the IPD-IMGT/HLA Database contains 383 alleles at a resolution of 3.
Таким образом, существует потребность в расширении точного диагностического инструментария, позволяющего в короткие сроки и с наименьшими затратами типировать ген HLA-DQA1 для своевременного и адекватного назначения диагностических, терапевтических и профилактических мероприятий, а также для дальнейшего изучения регуляции иммунной системы.Thus, there is a need to expand the precise diagnostic toolkit that allows for the rapid and cost-effective typing of the HLA-DQA1 gene for the timely and adequate prescription of diagnostic, therapeutic and preventive measures, as well as for further study of the regulation of the immune system.
Технический результат заключается в разработке эффективного способа фрагментарного NGS-секвенирования экзонов гена HLA-DQA1 в целях точного определения аллелей данного гена.The technical result consists in developing an effective method for fragmentary NGS sequencing of exons of the HLA-DQA1 gene for the purpose of accurately determining the alleles of this gene.
Технический результат достигается за счет таргетного (целевого) секвенирования представляющих наибольший интерес гена HLA-DQA1, содержащих экзоны и позволяющих определить аллели данного гена в образце ДНК. За счет применения в заявляемом способе оригинальных синтезированных олигонуклеотидных праймеров, имеющих структуру SEQ ID NO: 1-8, возможна амплификация целевых участков генома, при этом не требуется проводить дорогостоящий этап лигирования адаптеров, используемый в ряде протоколов. Сложность выбора праймеров обусловлена необходимостью обеспечить амплификацию в формате мультиплекса всех аллелей гена HLA-DQA1, при этом требуется не допустить амплификации нецелевых регионов ДНК человека.The technical result is achieved by targeted sequencing of the HLA-DQA1 gene of greatest interest, containing exons and allowing to determine the alleles of this gene in the DNA sample. Due to the use of original synthesized oligonucleotide primers in the claimed method, having the structure of SEQ ID NO: 1-8, it is possible to amplify target regions of the genome, while not requiring the expensive stage of ligation of adapters used in a number of protocols. The complexity of the primer selection is due to the need to ensure amplification in the multiplex format of all alleles of the HLA-DQA1 gene, while it is necessary to prevent the amplification of non-target regions of human DNA.
Предложенные в изобретении синтетические олигонуклеотидные праймеры для секвенирования экзонов гена НLА-HLA-DQA1 методом NGS имеет следующую структуру: SEQ ID NO: 1-8. При этом олигонуклеотидные праймеры, имеющие структуры SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, выполняют функции прямых праймеров, а олигонуклеотидные праймеры, имеющие структуры SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 выполняют функции обратных праймеров.The synthetic oligonucleotide primers proposed in the invention for sequencing the exons of the HLA-HLA-DQA1 gene by the NGS method have the following structure: SEQ ID NO: 1-8. In this case, the oligonucleotide primers having the structures SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 perform the functions of forward primers, and the oligonucleotide primers having the structures SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 perform the functions of reverse primers.
При разработке применяемых в данном способе праймеров для таргетной амплификации фрагментов тепа, HLA-DQA1 олигонуклеотидные последовательности были подобраны вручную с учетом имеющейся информации об известных аллелях данного гена. Этот процесс включал в себя загрузку референсных последовательностей аллелей гена HLA-DQA1 из базы данных IPD-IMGT/HLA Database (https://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/) и выравнивание последовательностей с целью определения консервативных для данных аллелей фрагментов. Температуры плавления олигонуклеотидов и характер взаимодействий между ними определялись с помощью инструмента Multiple Primer Analyzer от Thermo Fisher Scientific (США). С помощью программы blastn оценивалась специфичность каждой полученной последовательности ко всем известным организмам, в частности Homo sapiens, что позволяет исключить неспецифическое взаимодействие между праймерами и участками ДНК человека и других организмов. Кроме того, синтезированные олигонуклеотиды содержат дополнительные последовательности, облегчающие и удешевляющие процесс индексации продуктов амплификации.When developing the primers used in this method for targeted amplification of TEPA fragments, HLA-DQA1 oligonucleotide sequences were selected manually taking into account the available information on the known alleles of this gene. This process included loading the reference sequences of the HLA-DQA1 gene alleles from the IPD-IMGT/HLA Database (https://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/) and aligning the sequences to determine the fragments conserved for these alleles. The melting temperatures of the oligonucleotides and the nature of the interactions between them were determined using the Multiple Primer Analyzer tool from Thermo Fisher Scientific (USA). Using the blastn program, the specificity of each obtained sequence to all known organisms, in particular Homo sapiens, was assessed, which allows excluding non-specific interactions between the primers and DNA regions of humans and other organisms. In addition, the synthesized oligonucleotides contain additional sequences that facilitate and reduce the cost of the process of indexing amplification products.
Расстояния между праймерами в парах были подобраны таким образом, чтобы длина исследуемого региона была в пределах 600 п.н., что совместимо с длиной прочтений при использовании наборов для секвенирования Illumina MiSeq v3.The distances between primers in pairs were chosen such that the length of the region of interest was within 600 bp, which is compatible with the length of reads when using Illumina MiSeq v3 sequencing kits.
Полученные олигонуклеотиды на одном конце содержат праймерную последовательность, комплементарную участкам генома, а на другом - адаптерные последовательности. Следовательно, полученные после амплификации целевые фрагменты сразу фланкированы такими адаптерными последовательностями. Олигонуклеотиды, используемые для индексации, в свою очередь, комплементарны адаптерным последовательностям с одного конца и соответствуют индексам с другого.The resulting oligonucleotides contain a primer sequence complementary to the genome regions at one end, and adapter sequences at the other. Consequently, the target fragments obtained after amplification are immediately flanked by such adapter sequences. The oligonucleotides used for indexing, in turn, are complementary to the adapter sequences at one end and correspond to the indices at the other.
В качестве индексных последовательностей используют олигонуклеотиды, несущие различные индексы, которые позволяют отличать данные секвенирования молекул из разных образцов. Примеры подобных индексных последовательностей доступны на сайтах производителей наборов реагентов для высокопроизводительного секвенирования. Таким образом, в процессе индексации происходят этапы отжига олигонуклеотидов на концах целевых фрагментов и амплификации. После этого продукты амплификации подвергаются секвенированию методом NGS. Данный подход является стандартом пробоподготовки библиотек для секвенирования и, например, использован в наборе ScisGo™ HLA v6 Kits.Oligonucleotides carrying different indices are used as index sequences, which allow distinguishing sequencing data of molecules from different samples. Examples of such index sequences are available on the websites of manufacturers of reagent kits for high-throughput sequencing. Thus, the indexing process involves the stages of annealing of oligonucleotides at the ends of target fragments and amplification. After that, the amplification products are subjected to sequencing by the NGS method. This approach is a standard for sample preparation of libraries for sequencing and, for example, is used in the ScisGo™ HLA v6 Kits.
По сравнению с известным протоколом пробоподготовки Illumina Nextera XT (https://www.illumina.com/products/by4ype/sequencing-kits/library-prep-kits/nextera-xt-dna.html), предлагаемый способ пробоподготовки позволяет избежать этапов тагментации и отбора фрагментов с необходимыми длинами, поскольку продукты амплификации изначально имеют длину до 600 пар нуклеотидов без учета адаптерных последовательностей, то есть совместимы с наборами реагентов компании Illumina для ее секвенирующих платформ, а также содержат адаптерные последовательности для дальнейшей индексации, что существенно упрощает и удешевляет анализ полученных при секвенировании данных.Compared with the well-known Illumina Nextera XT sample preparation protocol (https://www.illumina.com/products/by4ype/sequencing-kits/library-prep-kits/nextera-xt-dna.html), the proposed sample preparation method allows avoiding the stages of tagmentation and selection of fragments with the required lengths, since the amplification products initially have a length of up to 600 nucleotide pairs without taking into account the adapter sequences, that is, they are compatible with Illumina reagent kits for its sequencing platforms, and also contain adapter sequences for further indexing, which significantly simplifies and reduces the cost of analyzing the data obtained during sequencing.
Заявляемое изобретение является результатом работы в рамках исследования, выполненной в ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора (Москва, Россия). Представленный способ был отработан более чем на 300 образцах биологического материала, представляющих собой ДНК, выделенную из крови и буккальных клеток эпителия (соскобов носоглотки) при помощи набора «РИБО-преп» (AmpliSens, Россия) согласно рекомендациям производителя.The claimed invention is the result of work within the framework of a study carried out at the Federal Budgetary Scientific Institution Central Research Institute of Epidemiology of Rospotrebnadzor (Moscow, Russia). The presented method was tested on more than 300 samples of biological material, representing DNA isolated from blood and buccal epithelial cells (nasopharyngeal scrapings) using the RIBO-prep kit (AmpliSens, Russia) according to the manufacturer's recommendations.
Выделение ДНК из клинического материала производилось с помощью комплекта реагентов в соответствии с инструкцией производителя. Для выделения ДНК может быть использован комплект реагентов «РИБО-преп» (AmpliSens, Россия) или любой аналогичный коммерческий набор для выделения ДНК.DNA extraction from clinical material was performed using a reagent kit in accordance with the manufacturer's instructions. The RIBO-prep reagent kit (AmpliSens, Russia) or any similar commercial DNA extraction kit can be used for DNA extraction.
Материалом для исследования является геномная ДНК человека. Для анализа одного образца требуется 10 нг ДНК (1 мклДНК с концентрацией 10 нг/мкл). Реакцию амплификации проводят с использованием ДНК в качестве матрицы и набора заявляемых олигонуклеотидов с концентрацией в реакционной смеси, указанной в Таблице 1. The material for the study is human genomic DNA. For the analysis of one sample, 10 ng of DNA is required (1 μl of DNA with a concentration of 10 ng/μl). The amplification reaction is carried out using DNA as a matrix and a set of the claimed oligonucleotides with a concentration in the reaction mixture indicated in Table 1.
ПЦР-микс объемом 20 мкл на одну реакцию содержит 10 мкл ПЦР-смеси-2 blue (AmpliSens, Россия), 1,4 мкл эквимолярной смеси четырех дезоксирибонуклеозидтрифосфатов со стоковой концентрацией 4,4 мМ, олигонуклеотиды в указанных в Таблице 1 концентрациях и воду milli-Q. ДНК-матрицу добавляют в количестве 5 мкл (концентрация ДНК от 2 до 50 нг/мкл), итоговый объем реакции составляет 25 мкл. Продуктами амплификации являются целевые участки гена HLA-DQA1. Длины получаемых фрагментов составляют 341-540 п.н. без учета длин адаптерных и индексных последовательностей, что обеспечивает их полное покрытие при использовании набора реагентов для секвенирования MiSeq Reagent Kit v3 (600-cycle) Illumina (США).The PCR mix with a volume of 20 μl per reaction contains 10 μl of PCR mix-2 blue (AmpliSens, Russia), 1.4 μl of an equimolar mixture of four deoxyribonucleoside triphosphates with a stock concentration of 4.4 mM, oligonucleotides at the concentrations indicated in Table 1 and milli-Q water. The DNA template is added in an amount of 5 μl (DNA concentration from 2 to 50 ng/μl), the final reaction volume is 25 μl. The amplification products are the target regions of the HLA-DQA1 gene. The lengths of the resulting fragments are 341-540 bp excluding the lengths of adapter and index sequences, which ensures their complete coverage when using the MiSeq Reagent Kit v3 (600-cycle) Illumina (USA) sequencing reagent kit.
Затем проводят очистку ПЦР-продуктов от реакционной смеси с использованием магнитных частиц, например, AMPure ХР beads (Beckman Coulter, США) в объемном отношении 1:0,8.Then, the PCR products are purified from the reaction mixture using magnetic particles, for example, AMPure XP beads (Beckman Coulter, USA) in a volume ratio of 1:0.8.
После этого осуществляют индексацию полученных фрагментов. Синтезированные олигонуклеотиды на одном конце содержат праймерную последовательность, комплементарную целевым участкам генов, а на другом - адаптерные последовательности. Таким образом, полученные после амплификации целевые фрагменты сразу фланкируются адаптерными последовательностями, что существенно ускоряет и удешевляет пробоподготовку.After this, the obtained fragments are indexed. The synthesized oligonucleotides contain a primer sequence complementary to the target gene regions at one end, and adapter sequences at the other. Thus, the target fragments obtained after amplification are immediately flanked by adapter sequences, which significantly speeds up and reduces the cost of sample preparation.
Олигонуклеотидные праймеры, используемые для индексации, в свою очередь, на одном конце содержат последовательности, соответствующие индексам, а на другом -последовательности, соответствующие упомянутым ранее адаптерным последовательностям. Таким образом, в процессе индексации происходят этапы отжига олигонуклеотидов на концах целевых фрагментов и амплификации продукта.The oligonucleotide primers used for indexing, in turn, contain sequences corresponding to the indices at one end and sequences corresponding to the adapter sequences mentioned earlier at the other end. Thus, the indexing process involves stages of annealing of the oligonucleotides at the ends of the target fragments and amplification of the product.
ПЦР-микс объемом 15 мкл на одну реакцию содержит 10 мкл ПЦР-смеси-2 blue (AmpliSens, Россия), 1,4 мкл эквимолярной смеси четырех дезоксирибонуклеозидтрифосфатов со стоковой концентрацией 4,4 мМ, соответствующие олигонуклеотиды в концентрации 0,25 пмоль/мкл и воду milli-Q. ДНК-матрица добавляется в количестве 5 мкл, итоговый объем реакции составляет 20 мкл.The PCR mix with a volume of 15 μl per reaction contains 10 μl of PCR mix-2 blue (AmpliSens, Russia), 1.4 μl of an equimolar mixture of four deoxyribonucleoside triphosphates with a stock concentration of 4.4 mM, the corresponding oligonucleotides at a concentration of 0.25 pmol/μl and milli-Q water. The DNA matrix is added in an amount of 5 μl, the final reaction volume is 20 μl.
Длины полученных продуктов амплификации могут быть проанализированы с помощью электрофореза в 1% агарозном геле. Далее повторно проводят очистку от реакционной смеси с использованием магнитных частиц, например, AMPure ХР beads (Beckman Coulter, США) в объемном отношении 1:0,8.The lengths of the obtained amplification products can be analyzed by electrophoresis in 1% agarose gel. Then, the reaction mixture is purified again using magnetic particles, for example, AMPure XP beads (Beckman Coulter, USA) in a volume ratio of 1:0.8.
В результате получаются готовые для секвенирования олигонуклеотидные последовательности, содержащие целевые фрагменты гена HLA-DQAl, которые позволяют определить аллели данного гена в исходном образце ДНК.The result is sequencing-ready oligonucleotide sequences containing target fragments of the HLA-DQAI gene, which allow the alleles of this gene to be determined in the original DNA sample.
Реализация заявляемого изобретения поясняется следующими примерами:The implementation of the claimed invention is illustrated by the following examples:
Пример 1. Получение набора олигонуклеотидных праймеров, используемого для секвенирования экзонов гена HLA-DQA1 Example 1. Preparation of a set of oligonucleotide primers used for sequencing the exons of the HLA-DQA1 gene
При разработке заявляемых оригинальных синтезированных олигонуклеотидных праймеров для таргетной амплификации фрагментов генов HLA-DQA1 олигонуклеотидные последовательности были подобраны вручную с учетом имеющейся информации об известных аллелях данных генов.When developing the claimed original synthesized oligonucleotide primers for targeted amplification of HLA-DQA1 gene fragments, the oligonucleotide sequences were selected manually taking into account the available information about the known alleles of these genes.
Данный процесс включал в себя загрузку множества референсных последовательностей аллелей генов HLA-DQA1 из базы данных IPD-IMGT/HLA Database (https://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/) и выравнивание последовательностей с целью определения консервативных для указанных аллелей фрагментов.This process involved downloading multiple reference sequences of HLA-DQA1 gene alleles from the IPD-IMGT/HLA Database (https://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/) and aligning the sequences to identify conserved fragments for the specified alleles.
Температуры плавления олигонуклеотидов и характер взаимодействий между ними определялись с помощью инструмента Multiple Primer Analyzer от Thermo Fisher Scientific (США). С помощью программы blastn оценивалась специфичность каждой полученной последовательности ко всем известным организмам, в частности Homo sapiens, что позволило исключить неспецифическое взаимодействие между праймерами и участками ДНК человека и других организмов.The melting temperatures of the oligonucleotides and the nature of the interactions between them were determined using the Multiple Primer Analyzer tool from Thermo Fisher Scientific (USA). The blastn program was used to evaluate the specificity of each obtained sequence to all known organisms, in particular Homo sapiens, which made it possible to exclude non-specific interactions between the primers and DNA regions of humans and other organisms.
В результате были получены праймеры, имеющие структуры SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, которые выполняют функции прямых праймеров, и олигонуклеотидные праймеры, имеющие структуры SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 выполняющие функции обратных праймеров.As a result, primers were obtained having the structures SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, which perform the functions of forward primers, and oligonucleotide primers having the structures SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, which perform the functions of reverse primers.
Расстояния между праймерами в парах были подобраны таким образом, чтобы длина исследуемого региона была в пределах 600 п.н., что совместимо с длиной прочтений при использовании наборов для секвенирования Illumina MiSeq v3.The distances between primers in pairs were chosen such that the length of the region of interest was within 600 bp, which is compatible with the length of reads when using Illumina MiSeq v3 sequencing kits.
Поскольку полученные олигонуклеотидные праймеры на одном конце содержали праймерную последовательность, комплементарную участкам генома, а на другом - адаптерные последовательности, полученные после амплификации, целевые фрагменты сразу были фланкированы такими адаптерными последовательностями.Since the obtained oligonucleotide primers contained a primer sequence complementary to the genome regions at one end, and adapter sequences obtained after amplification at the other, the target fragments were immediately flanked by such adapter sequences.
В качестве индексных последовательностей использовали олигонуклеотиды, несущие различные индексы, которые позволяют отличать данные секвенирования молекул из разных образцов. В частности, использовалась информация об индексных последовательностях, опубликованная на сайтах производителей наборов реагентов для высокопроизводительного секвенирования.Oligonucleotides carrying different indices were used as index sequences, which allow distinguishing sequencing data of molecules from different samples. In particular, information on index sequences published on the websites of manufacturers of reagent kits for high-throughput sequencing was used.
Олигонуклеотидные праймеры, используемые для индексации, на одном конце содержали последовательности, соответствующие индексам, а на другом последовательности, соответствующие адаптерным последовательностям.The oligonucleotide primers used for indexing contained index sequences at one end and adapter sequences at the other.
Таким образом, в процессе индексации произошли этапы отжига олигонуклеотидов на концах целевых фрагментов и амплификации. После этого продукты амплификации подверглись высокопроизводительному секвенированию на платформе Illumina.Thus, the indexing process included stages of annealing of oligonucleotides at the ends of target fragments and amplification. After that, the amplification products were subjected to high-throughput sequencing on the Illumina platform.
Пример 2. Секвенирование гена HLA-DQA1 в образце ДНК, выделенной из буккальных клеток эпителияExample 2. Sequencing of the HLA-DQA1 gene in a DNA sample isolated from buccal epithelial cells
У сотрудника лаборатории взят соскоб из носоглотки, выделение ДНК осуществлялось при помощи набора реагентов «РИБО-преп» (AmpliSens, Россия) согласно рекомендациям производителя. Концентрация выделенной ДНК была измерена набором «Quantum-211» (Евроген, Россия) и составила 13,8 нг/мкл. Амплификация осуществлялась с применением набора оригинальных синтезированных олигонуклеотидных праймеров SEQ ID NO: 1-8.A nasopharyngeal swab was taken from a laboratory employee, DNA was isolated using the RIBO-prep reagent kit (AmpliSens, Russia) according to the manufacturer's recommendations. The concentration of the isolated DNA was measured using the Quantum-211 kit (Eurogen, Russia) and was 13.8 ng/μl. Amplification was performed using a set of original synthesized oligonucleotide primers SEQ ID NO: 1-8.
ПЦР-микс объемом 20 мкл на одну реакцию содержал 10 мкл ПЦР-смеси-2 blue (AmpliSens, Россия), 1,4 мкл эквимолярной смеси четырех дезоксирибонуклеозидтрифосфатов со стоковой концентрацией 4,4 мМ, олигонуклеотидные праймеры SEQ ID NO: 1-8 в концентрациях, указанных в Таблице 1, и воду milli-Q. ДНК-матрица добавлялась в количестве 5 мкл (концентрация ДНК 13,8 нг/мкл), итоговый объем реакции составлял 25 мкл.The PCR mix with a volume of 20 μl per reaction contained 10 μl of PCR mix-2 blue (AmpliSens, Russia), 1.4 μl of an equimolar mixture of four deoxyribonucleoside triphosphates with a stock concentration of 4.4 mM, oligonucleotide primers SEQ ID NO: 1-8 at the concentrations indicated in Table 1, and milli-Q water. The DNA template was added in an amount of 5 μl (DNA concentration 13.8 ng/μl), the final reaction volume was 25 μl.
Далее проводилась очистка ПЦР-продуктов от реакционной смеси с использованием магнитных частиц AMPure ХР beads (Beckman Coulter, США) в объемном отношении 1:0,8. После этого осуществлялась индексация полученных фрагментов.Next, the PCR products were purified from the reaction mixture using AMPure XP beads magnetic particles (Beckman Coulter, USA) in a volume ratio of 1:0.8. After this, the obtained fragments were indexed.
ПЦР-микс объемом 15 мкл на одну реакцию содержал 10 мкл ПЦР-смеси-2 blue (AmpliSens, Россия), 1,4 мкл эквимолярной смеси четырех дезоксирибонуклеозидтрифосфатов со стоковой концентрацией 4,4 мМ, соответствующие олигонуклеотиды в концентрации 0,25 пмоль/мкл и воду milli-Q. ДНК-матрица добавлялась в количестве 5 мкл, итоговый объем реакции составлял 20 мкл.The PCR mix with a volume of 15 μl per reaction contained 10 μl of PCR mix-2 blue (AmpliSens, Russia), 1.4 μl of an equimolar mixture of four deoxyribonucleoside triphosphates with a stock concentration of 4.4 mM, the corresponding oligonucleotides at a concentration of 0.25 pmol/μl and milli-Q water. The DNA template was added in an amount of 5 μl, the final reaction volume was 20 μl.
Длины полученных продуктов амплификации были проанализированы с помощью электрофореза в 1% агарозном геле. Далее повторно производилась очистка от реакционной смеси с использованием магнитных частиц AMPure ХР beads (Beckman Coulter, США) в объемном отношении 1:0,8. Концентрация полученной библиотеки измерялась при помощи набора QuDye dsDNA HS Assay Kit (Lumiprobe, Россия) и составила 11,4 нг/мкл. Индексированные последовательности были секвенированы на приборе Illumina MiSeq с использованием реагентов MiSeq Reagent Kit v3 (600-cycle). Результаты исследования были проанализированы биоинформатически с помощью утилит FastQC, bwa, samtools и SpecHLA. По результатам биоинформатического анализа в исходном образце были определены следующие аллели: DQA1*01:03:01, DQA1*03:01:01. Данные аллели совпали с результатами полногеномного секвенирования, которое ранее было выполнено для данного сотрудника.The lengths of the obtained amplification products were analyzed by electrophoresis in 1% agarose gel. Then, the reaction mixture was purified again using AMPure XP beads (Beckman Coulter, USA) in a volume ratio of 1:0.8. The concentration of the obtained library was measured using the QuDye dsDNA HS Assay Kit (Lumiprobe, Russia) and was 11.4 ng/μl. The indexed sequences were sequenced on an Illumina MiSeq instrument using the MiSeq Reagent Kit v3 (600-cycle) reagents. The results of the study were analyzed bioinformatically using the FastQC, bwa, samtools, and SpecHLA utilities. Based on the results of the bioinformatic analysis, the following alleles were identified in the original sample: DQA1*01:03:01, DQA1*03:01:01. These alleles matched the results of whole genome sequencing that had previously been performed for this employee.
Пример 3. Секвенирование гена HLA-DQA1 в образце ДНК, выделенной из кровиExample 3. Sequencing of the HLA-DQA1 gene in a DNA sample isolated from blood
У сотрудника лаборатории взят был взят клинический образец цельной крови в пробирке с ЭДТА, выделение ДНК осуществлялось при помощи набора реагентов «РИБО-преп» (AmpliSens, Россия) согласно рекомендациям производителя. Концентрация выделенной ДНК была измерена набором «Quantum-211» (Евроген, Россия) и составила 14,9 нг/мкл. Амплификация осуществлялась с применением набора оригинальных синтезированных олигонуклеотидных праймеров SEQ ID NO: 1-8.A clinical sample of whole blood was taken from a laboratory employee in a test tube with EDTA, DNA was isolated using the RIBO-prep reagent kit (AmpliSens, Russia) according to the manufacturer's recommendations. The concentration of the isolated DNA was measured using the Quantum-211 kit (Eurogen, Russia) and was 14.9 ng/μl. Amplification was carried out using a set of original synthesized oligonucleotide primers SEQ ID NO: 1-8.
ПЦР-микс объемом 20 мкл на одну реакцию содержал 10 мкл ПЦР-смеси-2 blue (AmpliSens, Россия), 1,4 мкл эквимолярной смеси четырех дезоксирибонуклеозидтрифосфатов со стоковой концентрацией 4,4 мМ, олигонуклеотидные праймеры SEQ ID NO: 1-8 в концентрациях, указанных в Таблице 1, и воду milli-Q. ДНК-матрица добавлялась в количестве 5 мкл (концентрация ДНК 14,9 нг/мкл), итоговый объем реакции составлял 25 мкл.The PCR mix with a volume of 20 μl per reaction contained 10 μl of PCR mix-2 blue (AmpliSens, Russia), 1.4 μl of an equimolar mixture of four deoxyribonucleoside triphosphates with a stock concentration of 4.4 mM, oligonucleotide primers SEQ ID NO: 1-8 at the concentrations indicated in Table 1, and milli-Q water. The DNA template was added in an amount of 5 μl (DNA concentration 14.9 ng/μl), the final reaction volume was 25 μl.
Далее проводилась очистка ПЦР-продуктов от реакционной смеси с использованием магнитных частиц AMPure ХР beads (Beckman Coulter, США) в объемном отношении 1:0,8. После этого осуществлялась индексация полученных фрагментов.Next, the PCR products were purified from the reaction mixture using AMPure XP beads magnetic particles (Beckman Coulter, USA) in a volume ratio of 1:0.8. After this, the obtained fragments were indexed.
ПЦР-микс объемом 15 мкл на одну реакцию содержал 10 мкл ПЦР-смеси-2 blue (AmpliSens, Россия), 1,4 мкл эквимолярной смеси четырех дезоксирибонуклеозидтрифосфатов со стоковой концентрацией 4,4 мМ, соответствующие олигонуклеотиды в концентрации 0,25 пмоль/мкл и воду milli-Q. ДНК-матрица добавлялась в количестве 5 мкл, итоговый объем акции составлял 20 мкл.The PCR mix with a volume of 15 μl per reaction contained 10 μl of PCR mix-2 blue (AmpliSens, Russia), 1.4 μl of an equimolar mixture of four deoxyribonucleoside triphosphates with a stock concentration of 4.4 mM, the corresponding oligonucleotides at a concentration of 0.25 pmol/μl and milli-Q water. The DNA matrix was added in an amount of 5 μl, the final stock volume was 20 μl.
Длины полученных продуктов амплификации были проанализированы с помощью электрофореза в 1% агарозном геле. Далее повторно производилась очистка от реакционной смеси с использованием магнитных частиц AMPure ХР beads (Beckman Coulter, США) в объемном отношении 1:0,8. Концентрация полученной библиотеки измерялась при помощи набора QuDye dsDNA HS Assay Kit (Lumiprobe, Россия) и составила 8,9 нг/мкл. Индексированные последовательности были секвенированы на приборе Illumina MiSeq с использованием реагентов MiSeq Reagent Kit v3 (600-cycle). Результаты исследования были проанализированы биоинформатически с помощью утилит FastQC, bwa, samtools и SpecHLA. По результатам биоинформатического анализа в исходном образце были определены следующие аллели: DQA1*05:05:01, DQA1*05:05:01 (гомозигота). Данные аллели совпали с результатами секвенирования гена HLA-DQA1 в данном образце при помощи набора Nextera XT DNA Library Preparation Kit (Illumina).The lengths of the obtained amplification products were analyzed by electrophoresis in 1% agarose gel. Then, the reaction mixture was purified again using AMPure XP beads (Beckman Coulter, USA) in a volume ratio of 1:0.8. The concentration of the obtained library was measured using the QuDye dsDNA HS Assay Kit (Lumiprobe, Russia) and was 8.9 ng/μl. The indexed sequences were sequenced on an Illumina MiSeq instrument using the MiSeq Reagent Kit v3 (600-cycle) reagents. The results of the study were analyzed bioinformatically using the FastQC, bwa, samtools and SpecHLA utilities. Based on the results of bioinformatics analysis, the following alleles were identified in the original sample: DQA1*05:05:01, DQA1*05:05:01 (homozygote). These alleles were consistent with the results of HLA-DQA1 gene sequencing in this sample using the Nextera XT DNA Library Preparation Kit (Illumina).
Пример 4. Секвенирование гена HLA-DQA1 в образце ДНК, выделенной из гомогената печениExample 4. Sequencing of the HLA-DQA1 gene in a DNA sample isolated from liver homogenate
Для выделения ДНК был взят клинический образец гомогената печени человека, выделение ДНК осуществлялось при помощи набора реагентов «РИБО-преп» (AmpliSens, Россия) согласно рекомендациям производителя. Концентрация выделенной ДНК была измерена набором «Quantum-211» (Евроген, Россия) и составила 11,9 нг/мкл. Амплификация осуществлялась с применением набора оригинальных синтезированных олигонуклеотидных праймеров SEQ ID NO: 1-8.A clinical sample of human liver homogenate was taken for DNA extraction; DNA extraction was performed using the RIBO-prep reagent kit (AmpliSens, Russia) according to the manufacturer's recommendations. The concentration of the extracted DNA was measured using the Quantum-211 kit (Eurogen, Russia) and was 11.9 ng/μl. Amplification was performed using a set of original synthesized oligonucleotide primers SEQ ID NO: 1-8.
ПЦР-микс объемом 20 мкл на одну реакцию содержал 10 мкл ПЦР-смеси-2 blue (AmpliSens, Россия), 1,4 мкл эквимолярной смеси четырех дезоксирибонуклеозидтрифосфатов со стоковой концентрацией 4,4 мМ, олигонуклеотидные праймеры SEQ ID NO: 1-8 в концентрациях, указанных в Таблице 1, и воду milli-Q. ДНК-матрица добавлялась в количестве 5 мкл (концентрация ДНК 11,9 нг/мкл), итоговый объем реакции составлял 25 мкл. The PCR mix with a volume of 20 μl per reaction contained 10 μl of PCR mix-2 blue (AmpliSens, Russia), 1.4 μl of an equimolar mixture of four deoxyribonucleoside triphosphates with a stock concentration of 4.4 mM, oligonucleotide primers SEQ ID NO: 1-8 at the concentrations indicated in Table 1, and milli-Q water. The DNA template was added in an amount of 5 μl (DNA concentration 11.9 ng/μl), the final reaction volume was 25 μl.
Далее проводилась очистка ПЦР-продуктов от реакционной смеси с использованием магнитных частиц AMPure ХР beads (Beckman Coulter, США) в объемном отношении 1:0,8. После этого осуществлялась индексация полученных фрагментов.Next, the PCR products were purified from the reaction mixture using AMPure XP beads magnetic particles (Beckman Coulter, USA) in a volume ratio of 1:0.8. After this, the obtained fragments were indexed.
ПЦР-микс объемом 15 мкл на одну реакцию содержал 10 мкл ПЦР-смеси-2 blue (AmpliSens, Россия), 1,4 мкл эквимолярной смеси четырех дезоксирибонуклеозидтрифосфатов со стоковой концентрацией 4,4 мМ, соответствующие олигонуклеотиды в концентрации 0,25 пмоль/мкл и воду milli-Q. ДНК-матрица добавлялась в количестве 5 мкл, итоговый объем реакции составлял 20 мкл.The PCR mix with a volume of 15 μl per reaction contained 10 μl of PCR mix-2 blue (AmpliSens, Russia), 1.4 μl of an equimolar mixture of four deoxyribonucleoside triphosphates with a stock concentration of 4.4 mM, the corresponding oligonucleotides at a concentration of 0.25 pmol/μl and milli-Q water. The DNA template was added in an amount of 5 μl, the final reaction volume was 20 μl.
Длины полученных продуктов амплификации были проанализированы с помощью электрофореза в 1% агарозном геле. Далее повторно производилась очистка от реакционной смеси с использованием магнитных частиц AMPure ХР beads (Beckman Coulter, США) в объемном отношении 1:0,8. Концентрация полученной библиотеки измерялась при помощи набора QuDye dsDNA HS Assay Kit (Lumiprobe, Россия) и составила 9,9 нг/мкл. Индексированные последовательности были секвенированы на приборе Illumina MiSeq с использованием реагентов MiSeq Reagent Kit v3 (600-cycle). Результаты исследования были проанализированы биоинформатически с помощью утилит FastQC, bwa, samtools и SpecHLA. По результатам биоинформатического анализа в исходном образце были определены следующие аллели: DQA1*02:01:01, DQA1*04:01:02. Данные аллели совпали с результатами секвенирования гена HLA-DQA1 в данном образце при помощи набора Nextera XT DNA Library Preparation Kit (Illumina).The lengths of the obtained amplification products were analyzed by electrophoresis in 1% agarose gel. Then, the reaction mixture was purified again using AMPure XP beads (Beckman Coulter, USA) in a volume ratio of 1:0.8. The concentration of the obtained library was measured using the QuDye dsDNA HS Assay Kit (Lumiprobe, Russia) and was 9.9 ng/μl. The indexed sequences were sequenced on an Illumina MiSeq instrument using the MiSeq Reagent Kit v3 (600-cycle) reagents. The results of the study were analyzed bioinformatically using the FastQC, bwa, samtools, and SpecHLA utilities. Based on the results of the bioinformatic analysis, the following alleles were identified in the original sample: DQA1*02:01:01, DQA1*04:01:02. These alleles were consistent with the results of HLA-DQA1 gene sequencing in this sample using the Nextera XT DNA Library Preparation Kit (Illumina).
Предложенное изобретение позволяет секвенировать экзоны гена HLA-DQA1 и по результатам секвенирования определить аллели данного гена, содержащиеся в исходном образце, а также исключает амплификацию нецелевых регионов ДНК человека.The proposed invention makes it possible to sequence the exons of the HLA-DQA1 gene and, based on the sequencing results, determine the alleles of this gene contained in the original sample, and also eliminates the amplification of non-target regions of human DNA.
--->--->
<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?><?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>
<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing <!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing
1.2//EN" "ST26SequenceListing_V1_2.dtd">1.2//EN" "ST26SequenceListing_V1_2.dtd">
<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_2" fileName="Nabor sinteticheskih <ST26SequenceListing dtdVersion="V1_2" fileName="Nabor sinteticheskih
oligonukleotidov dlya sekvenirovaniya ekzonov gena HLA-DQA1" oligonucleotides for sequencing of HLA-DQA1 gene expression"
softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="1.0.0" softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="1.0.0"
productionDate="2024-06-21">productionDate="2024-06-21">
<ApplicationIdentification><ApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode> <IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText>nn</ApplicationNumberText> <ApplicationNumberText>nn</ApplicationNumberText>
<FilingDate>2024-06-21</FilingDate> <FilingDate>2024-06-21</FilingDate>
</ApplicationIdentification></ApplicationIdentification>
<ApplicantFileReference>1</ApplicantFileReference> <ApplicantFileReference>1</ApplicantFileReference>
<EarliestPriorityApplicationIdentification> <EarliestPriorityApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode> <IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText>nn</ApplicationNumberText> <ApplicationNumberText>nn</ApplicationNumberText>
<FilingDate>2024-06-21</FilingDate> <FilingDate>2024-06-21</FilingDate>
</EarliestPriorityApplicationIdentification> </EarliestPriorityApplicationIdentification>
<ApplicantName languageCode="ru">ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии <ApplicantName languageCode="ru">Federal Budgetary Scientific Institution Central Research Institute of Epidemiology
Роспотребнадзора</ApplicantName>Rospotrebnadzor</ApplicantName>
<ApplicantNameLatin>FBUN CRIE</ApplicantNameLatin> <ApplicantNameLatin>FBUN CRIE</ApplicantNameLatin>
<InventionTitle languageCode="ru">Способ секвенирования экзонов гена <InventionTitle languageCode="en">Method for sequencing gene exons
HLA-DQA1 и набор синтетических олигонуклеотидов для его HLA-DQA1 and a set of synthetic oligonucleotides for its
реализации</InventionTitle>implementations</InventionTitle>
<SequenceTotalQuantity>8</SequenceTotalQuantity> <SequenceTotalQuantity>8</SequenceTotalQuantity>
<SequenceData sequenceIDNumber="1"> <SequenceData sequenceIDNumber="1">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>57</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>57</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..57</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..57</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tcgtcggcagcgtcagatgtgtataagagacagttggtttggtttgggt <INSDSeq_sequence>tcgtcggcagcgtcagatgtgtataagagacagttggtttggtttgggt
gtcttcag</INSDSeq_sequence>gtcttcag</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="2"> <SequenceData sequenceIDNumber="2">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>53</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>53</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..53</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..53</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gtctcgtgggctcggagatgtgtataagagacaggacatagagacctcc <INSDSeq_sequence>gtctcgtgggctcggagatgtgtataagagacaggacatagagacctcc
aggc</INSDSeq_sequence>aggc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="3"> <SequenceData sequenceIDNumber="3">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>56</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>56</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..56</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..56</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tcgtcggcagcgtcagatgtgtataagagacagcctgcttgtcatcttc <INSDSeq_sequence>tcgtcggcagcgtcagatgtgtataagagacagcctgcttgtcatcttc
actcatc</INSDSeq_sequence>actcatc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="4"> <SequenceData sequenceIDNumber="4">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>54</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>54</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..54</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..54</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gtctcgtgggctcggagatgtgtataagagacaggaagatctggggacc <INSDSeq_sequence>gtctcgtgggctcggagatgtgtataagagacaggaagatctggggacc
tcttg</INSDSeq_sequence>tcttg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="5"> <SequenceData sequenceIDNumber="5">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>53</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>53</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..53</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..53</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tcgtcggcagcgtcagatgtgtataagagacagatgcccacagagagaa <INSDSeq_sequence>tcgtcggcagcgtcagatgtgtataagagacagatgcccacagagagaa
gggc</INSDSeq_sequence>gggc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="6"> <SequenceData sequenceIDNumber="6">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>60</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>60</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..60</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..60</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gtctcgtgggctcggagatgtgtataagagacagttagtaaaaggcagg <INSDSeq_sequence>gtctcgtgggctcggagatgtgtataagagacagttagtaaaaggcagg
aagttctgaac</INSDSeq_sequence>aagttctgaac</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="7"> <SequenceData sequenceIDNumber="7">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>53</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>53</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..53</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..53</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tcgtcggcagcgtcagatgtgtataagagacagccacacacatgcacat <INSDSeq_sequence>tcgtcggcagcgtcagatgtgtataagagacagccacacacatgcacat
gagc</INSDSeq_sequence>gagc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="8"> <SequenceData sequenceIDNumber="8">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>56</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>56</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..56</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..56</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gtctcgtgggctcggagatgtgtataagagacagcacttcccaattccc <INSDSeq_sequence>gtctcgtgggctcggagatgtgtataagagacagcacttcccaattccc
ctacaac</INSDSeq_sequence>ctacaac</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
</ST26SequenceListing></ST26SequenceListing>
<---<---
Claims (9)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2833819C1 true RU2833819C1 (en) | 2025-01-28 |
Family
ID=
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7300755B1 (en) * | 2003-05-12 | 2007-11-27 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Methods for haplotyping genomic DNA |
| RU2587606C2 (en) * | 2010-06-30 | 2016-06-20 | БиДжиАй Дженомикс Ко., Лтд | Novel method for pcr-sequencing and use thereof for hla genotyping |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7300755B1 (en) * | 2003-05-12 | 2007-11-27 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Methods for haplotyping genomic DNA |
| RU2587606C2 (en) * | 2010-06-30 | 2016-06-20 | БиДжиАй Дженомикс Ко., Лтд | Novel method for pcr-sequencing and use thereof for hla genotyping |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| HOSOMICHI K. et al. Phase-defined complete sequencing of the HLA genes by next-generation sequencing, BMC Genomics volume 14, Article number: 355 (2013). BENTLEY G. et al. High-resolution, high-throughput HLA genotyping by next-generation sequencing, Tissue Antigens. 2009 Nov; 74 (5): 393-403. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Adams et al. | Ambiguous allele combinations in HLA Class I and Class II sequence-based typing: when precise nucleotide sequencing leads to imprecise allele identification | |
| CN106755329B (en) | Kit for detecting alpha and beta thalassemia point mutation based on second-generation sequencing technology | |
| Pater et al. | High throughput nanopore sequencing of SARS-CoV-2 viral genomes from patient samples | |
| CN110494562A (en) | PCR primer set for HLA gene and sequencing method using same | |
| CN110863056A (en) | Method, reagent and application for accurately typing human DNA | |
| Sturgill et al. | Protocol for base resolution mapping of ac4C using RedaC: T-seq | |
| CN110853708B (en) | Design method of nucleic acid capture probe for HLA typing | |
| Wu et al. | Revisiting the potential power of human leukocyte antigen (HLA) genes on relationship testing by massively parallel sequencing-based HLA typing in an extended family | |
| CN108441547B (en) | Primer group, kit and method for HLA gene amplification and genotyping | |
| Carracedo | Forensic genetics: history | |
| Daviaud et al. | Whole-genome bisulfite sequencing using the Ovation® ultralow methyl-seq protocol | |
| CN111394434B (en) | CHO host cell DNA residue detection kit adopting TaqMan probe method and application thereof | |
| Vajpayee et al. | Forensic DNA typing: inception, methodology, and technical advancements | |
| Tubbs et al. | Cell and Tissue Based Molecular Pathology E-Book: A Volume in the Foundations in Diagnostic Pathology Series | |
| Profaizer et al. | HLA genotyping using the Illumina HLA TruSight next‐generation sequencing kits: A comparison | |
| CN112266963B (en) | Detection kit for combined detection of chronic granulocytic leukemia | |
| Shiina et al. | Super high resolution for single molecule-sequence-based typing of classical HLA loci using Ion Torrent PGM | |
| RU2833819C1 (en) | Method for sequencing exons of hla-dqa1 gene and set of synthetic oligonucleotides for its implementation | |
| RU2837865C1 (en) | Method for sequencing exons of hla-dpa1 gene and set of synthetic oligonucleotides for its implementation | |
| Wei et al. | CRISPR/Cas13a-based single-nucleotide polymorphism detection for reliable determination of ABO blood group genotypes | |
| CN118726346A (en) | HLA gene amplification primers, kit and sequencing library construction method | |
| RU2829344C1 (en) | Sample preparation method for typing major histocompatibility complex genes hla-a, hla-b, hla-c, hla-dpb1, hla-dqb1, hla-drb1 and oligonucleotide primers for its implementation | |
| Alcaide et al. | Ultrasensitive detection of circulating tumor DNA in lymphoma via targeted hybridization capture and deep sequencing of barcoded libraries | |
| CN115976014A (en) | Primer group, detection kit, application thereof and corresponding detection method | |
| CN107904297B (en) | Primer group, joint group and sequencing method for microbial diversity research |