RU2831366C1 - Method for identification of snp-genotypes of plague agent of medieval biovar of phylogenetic branches 2.med1 and 2.med4 from centers of northern and north-western caspian region by method of sanger sequencing - Google Patents
Method for identification of snp-genotypes of plague agent of medieval biovar of phylogenetic branches 2.med1 and 2.med4 from centers of northern and north-western caspian region by method of sanger sequencing Download PDFInfo
- Publication number
- RU2831366C1 RU2831366C1 RU2024100269A RU2024100269A RU2831366C1 RU 2831366 C1 RU2831366 C1 RU 2831366C1 RU 2024100269 A RU2024100269 A RU 2024100269A RU 2024100269 A RU2024100269 A RU 2024100269A RU 2831366 C1 RU2831366 C1 RU 2831366C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- insdseq
- insdqualifier
- insdfeature
- name
- pricasp
- Prior art date
Links
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 title claims abstract description 166
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 74
- 206010035148 Plague Diseases 0.000 title claims abstract description 46
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 title claims description 28
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 44
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 44
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims abstract description 10
- 241000582786 Monoplex Species 0.000 claims description 13
- 101150019104 narP gene Proteins 0.000 claims description 13
- 101100194170 Escherichia coli (strain K12) recG gene Proteins 0.000 claims description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 8
- 101150074763 radC gene Proteins 0.000 claims description 8
- 101100380328 Dictyostelium discoideum asns gene Proteins 0.000 claims description 6
- 108091032917 Transfer-messenger RNA Proteins 0.000 claims description 6
- 101150062095 asnA gene Proteins 0.000 claims description 6
- 101150010879 flgK gene Proteins 0.000 claims description 6
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 6
- 101100192384 Escherichia coli (strain K12) manY gene Proteins 0.000 claims description 5
- 101100519915 Escherichia coli (strain K12) phnL gene Proteins 0.000 claims description 5
- 241000549435 Pria Species 0.000 claims description 5
- 241000623377 Terminalia elliptica Species 0.000 claims description 5
- 101150036205 cysJ gene Proteins 0.000 claims description 5
- 101150041871 gltB gene Proteins 0.000 claims description 5
- 101150069887 ptsP gene Proteins 0.000 claims description 5
- 150000003346 selenoethers Chemical class 0.000 claims description 5
- 101150023525 araH gene Proteins 0.000 claims description 4
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 2
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 claims description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 7
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 117
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 31
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 30
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 27
- 101150036080 at gene Proteins 0.000 description 22
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 19
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 14
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 13
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 13
- 241001584856 Yersinia pestis CO92 Species 0.000 description 10
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 10
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 6
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 3
- 101000955282 Homo sapiens Mediator of RNA polymerase II transcription subunit 27 Proteins 0.000 description 3
- 101001013272 Homo sapiens Mediator of RNA polymerase II transcription subunit 29 Proteins 0.000 description 3
- 102100039001 Mediator of RNA polymerase II transcription subunit 27 Human genes 0.000 description 3
- 102100029668 Mediator of RNA polymerase II transcription subunit 29 Human genes 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 3
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 3
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 102100026396 ADP/ATP translocase 2 Human genes 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101000718417 Homo sapiens ADP/ATP translocase 2 Proteins 0.000 description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 238000011841 epidemiological investigation Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 2
- 102100032533 ADP/ATP translocase 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100026397 ADP/ATP translocase 3 Human genes 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 101000768061 Escherichia phage P1 Antirepressor protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010007577 Exodeoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102100029075 Exonuclease 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000699694 Gerbillinae Species 0.000 description 1
- 102220483034 Glypican-2_H268Y_mutation Human genes 0.000 description 1
- 101000796932 Homo sapiens ADP/ATP translocase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000718437 Homo sapiens ADP/ATP translocase 3 Proteins 0.000 description 1
- 101000848922 Homo sapiens Protein FAM72A Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 102220469874 Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate 3-phosphatase and dual-specificity protein phosphatase PTEN_A34D_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102100034514 Protein FAM72A Human genes 0.000 description 1
- 241000555745 Sciuridae Species 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101100476574 Staphylococcus aureus (strain N315) ant5 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000607477 Yersinia pseudotuberculosis Species 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000007844 allele-specific PCR Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 101150112240 apaH gene Proteins 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 102220351211 c.544G>T Human genes 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 description 1
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- OSDXSOSJRPQCHJ-XVNBXDOJSA-N methyl 3-(3,4-dihydroxyphenyl)-3-[(E)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)prop-2-enoyl]oxypropanoate Chemical compound C=1C=C(O)C(O)=CC=1C(CC(=O)OC)OC(=O)\C=C\C1=CC=C(O)C(O)=C1 OSDXSOSJRPQCHJ-XVNBXDOJSA-N 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 102220204717 rs1057524803 Human genes 0.000 description 1
- 102220007340 rs111033656 Human genes 0.000 description 1
- 102200062292 rs1114167623 Human genes 0.000 description 1
- 102220250290 rs1554074673 Human genes 0.000 description 1
- 102220329805 rs199816697 Human genes 0.000 description 1
- 102200021539 rs267606949 Human genes 0.000 description 1
- 102200000969 rs28939680 Human genes 0.000 description 1
- 102200107879 rs74315432 Human genes 0.000 description 1
- 102220250209 rs750249799 Human genes 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 1
- 230000036642 wellbeing Effects 0.000 description 1
Abstract
Description
Изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности к молекулярному типированию средневекового биовара основного подвида штаммов Yersinia pestis из природных очагов Прикаспия и сопредельных очагов чумы, и может быть использовано в научно-исследовательских и практических учреждениях Роспотребнадзора.The invention relates to medical microbiology, in particular to the molecular typing of the medieval biovar of the main subspecies of Yersinia pestis strains from natural foci of the Caspian region and adjacent plague foci, and can be used in research and practical institutions of Rospotrebnadzor.
Бактерия Y. pestis является возбудителем зоонозной природно-очаговой особо опасной инфекционной болезни с трансмиссивным механизмом передачи возбудителя -чумы, до сих представляющей угрозу в области общественного здравоохранения. К основному подвиду Y. pestis, вирулентному для человека, относят четыре биовара: античный, средневековый, восточный и интермедиум. Масштабные молекулярно-генетические исследования показали, что на территории Российской Федерации и других стран СНГ наибольшее распространение имеет средневековый биовар основного подвида Y. pestis. Он циркулирует в 7 из 11 природных очагов чумы на территории РФ и в большинстве очагов стран СНГ, и занимает 93,3% от общей территории этих природных очагов. Также он встречается в природных очагах чумы Китая, Монголии, Ирана и Индии. Эти штаммы отличаются экологической пластичностью и существуют в очагах различного типа: пустынных, полупустынных, горных, высокогорных, равнинных, в том числе и с высокой степенью аридности, где не циркулируют другие биовары и подвиды Y. pestis. Штаммы средневекового биовара являются высоко вирулентными и эпидемически значимыми.The Y. pestis bacterium is the causative agent of a zoonotic natural focal especially dangerous infectious disease with a transmissible mechanism of transmission of the pathogen - plague, which still poses a threat to public health. The main subspecies of Y. pestis, virulent for humans, includes four biovars: ancient, medieval, eastern and intermedium. Large-scale molecular genetic studies have shown that the medieval biovar of the main subspecies of Y. pestis is most widespread in the Russian Federation and other CIS countries. It circulates in 7 out of 11 natural plague foci in the territory of the Russian Federation and in most foci of the CIS countries, and occupies 93.3% of the total territory of these natural foci. It is also found in natural plague foci in China, Mongolia, Iran and India. These strains are characterized by ecological plasticity and exist in foci of various types: desert, semi-desert, mountain, highland, plain, including those with a high degree of aridity, where other biovars and subspecies of Y. pestis do not circulate. Strains of the medieval biovar are highly virulent and epidemically significant.
Наибольший ареал распространения получила ветвь 2.MED1 средневекового биовара. Она циркулирует в 33 автономных природных очагах: площадь природных очагов чумы сусликового типа составляет 221347 км2; песчаночьего типа - 1728676 км2; сурочьего типа - 18442 км2. В начале XX века в очагах Северного и Северо-Западного Прикаспия ветвь 2.MED1 циркулировала совместно с генетически близкой ветвью средневекового биовара 2.MED4. Установлено, что штаммы этих двух филогенетических линий Y. pestis средневекового биовара - 2.MED1 и 2.MED4, являлись этиологическими агентами вспышек чумы в северной части Прикаспия.The largest area of distribution is received by the branch 2.MED1 of the medieval biovar. It circulates in 33 autonomous natural foci: the area of natural foci of the suslik type of plague is 221,347 km 2 ; gerbil type - 1,728,676 km 2 ; marmot type - 18,442 km 2 . At the beginning of the 20th century, in the foci of the Northern and North-Western Caspian region, the branch 2.MED1 circulated together with the genetically close branch of the medieval biovar 2.MED4. It was established that the strains of these two phylogenetic lines of Y. pestis of the medieval biovar - 2.MED1 and 2.MED4, were the etiological agents of plague outbreaks in the northern part of the Caspian region.
Высокая вирулентность и широкая распространенность средневекового биовара основного подвида возбудителя чумы требуют изучения геномного портрета его штаммов для разработки эффективных методов генотипирования и повышения эффективности молекулярно-эпидемиологического мониторинга очагов чумы. Также отмечено сохранение в текущем десятилетии разнонаправленной тенденции в динамике эпизоотической активности природных очагов стран СНГ с циркуляцией штаммов Y. pestis средневекового биовара филогенетической ветви 2.MED1. Решение проблемы дифференциации штаммов средневекового биовара от штаммов других биоваров и подвидов, а также внутрибиоварной дифференциации средневековых штаммов важно прежде всего с практической точки зрения. Разделение штаммов, отличающихся по вирулентности, по географическому региону и очагу происхождения, необходимо для проведения молекулярной экспертизы вспышек или отдельных случаев чумы. В отношении генетически мономорфного средневекового биовара эффективным методом является генотипирование по уникальным единичным полиморфным нуклеотидам (SNPs), которые являются распространенными генетическими маркерами в бактериальном геноме. Метод SNP-генотипирования позволяет выявлять однонуклеотидные полиморфизмы, характеризующиеся эволюционной стабильностью, что делает их кандидатными маркерами для молекулярного типирования и паспортизации природных очагов высоковирулентного средневекового биовара Y. pestis. Установление SNP-генотипов штаммов средневекового биовара Y. pestis, выделенных более чем за столетний период в очагах Прикаспийского региона, создает предпосылки для создания канонического SNP-профиля (canSNP) для молекулярно-генетической детализации паспортизации очагов, в которых циркулирует этот высоковирулентный биовар. Полученные результаты могут быть использованы при эпидемиологическом расследовании случаев чумы, а также возможных актов биотерроризма.High virulence and widespread prevalence of the medieval biovar of the main subspecies of the plague pathogen require studying the genomic portrait of its strains to develop effective genotyping methods and improve the efficiency of molecular epidemiological monitoring of plague foci. Also, the preservation of the multidirectional trend in the dynamics of epizootic activity of natural foci in the CIS countries with the circulation of Y. pestis strains of the medieval biovar of the phylogenetic branch 2.MED1 in the current decade has been noted. The solution to the problem of differentiating strains of the medieval biovar from strains of other biovars and subspecies, as well as intra-biovar differentiation of medieval strains, is important primarily from a practical point of view. Separation of strains that differ in virulence, by geographic region and focus of origin, is necessary for molecular examination of outbreaks or individual cases of plague. With regard to the genetically monomorphic medieval biovar, an effective method is genotyping by unique single polymorphic nucleotides (SNPs), which are common genetic markers in the bacterial genome. The SNP genotyping method allows identifying single nucleotide polymorphisms characterized by evolutionary stability, which makes them candidate markers for molecular typing and certification of natural foci of the highly virulent medieval biovar Y. pestis. Establishing the SNP genotypes of the strains of the medieval biovar Y. pestis, isolated over a period of more than a century in the foci of the Caspian region, creates the prerequisites for creating a canonical SNP profile (canSNP) for molecular genetic detailing of certification of foci in which this highly virulent biovar circulates. The results obtained can be used in epidemiological investigation of plague cases, as well as possible acts of bioterrorism.
Выявление маркерного SNP возможно с помощью проведения фрагментного секвенирования полиморфного участка генома. Данный метод обеспечивает глубокий уровень дифференциации исследуемых штаммов, позволяя различить штаммы близкородственных генетических популяций по филогеографическому принципу. Разработка способа идентификации SNP-генотипов возбудителя чумы средневекового биовара филогенетических ветвей 2.MED1 и 2.MED4 из очагов Северного и Северо-Западного Прикаспия методом секвенирования по Сэнгеру значительно повысит эффективность молекулярно-эпидемиологического мониторинга, эпидемиологического расследования вспышек и случаев заноса штаммов возбудителя чумы на территорию РФ. Также определение основных генотипов, характерных для территорий Северного и Северо-Западного Прикаспия, необходимо для установления источника и региона происхождения возбудителя, определения путей заноса инфекции, проведения молекулярной экспертизы случаев и вспышек чумы, а также для проведения молекулярно-генетической паспортизации природных очагов этого особо опасного заболевания.The marker SNP can be identified by fragment sequencing of the polymorphic region of the genome. This method provides a deep level of differentiation of the studied strains, allowing to distinguish strains of closely related genetic populations by the phylogeographic principle. The development of a method for identifying SNP genotypes of the plague agent of the medieval biovar of the phylogenetic branches 2.MED1 and 2.MED4 from the foci of the Northern and North-Western Caspian region by the Sanger sequencing method will significantly increase the efficiency of molecular epidemiological monitoring, epidemiological investigation of outbreaks and cases of importation of plague strains into the territory of the Russian Federation. Also, the determination of the main genotypes characteristic of the territories of the Northern and North-Western Caspian region is necessary to establish the source and region of origin of the pathogen, determine the routes of infection, conduct a molecular examination of cases and outbreaks of plague, as well as to conduct a molecular genetic certification of natural foci of this particularly dangerous disease.
К настоящему времени существуют много способов молекулярно-генетической индикации и идентификации штаммов возбудителя чумы методами ПЦР с электрофоретическим и гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов в режиме реального времени (ПЦР-РВ).At present, there are many methods of molecular genetic indication and identification of plague pathogen strains using PCR methods with electrophoretic and hybridization-fluorescence recording of results in real time (PCR-RT).
Для разделения штаммов Y. pestis средневекового и античного биоваров известен способ, описанный в патенте RU №2496882 (опубл. 27.10.2013, Бюл. №30). Он основан на использовании ПЦР с электрофоретическим учетом результатов. Однако, этот метод не предлагает способа внутрибиоварной дифференциации штаммов средневекового биовара на SNP-генотипы ветвей 2.MED1 и 2.MED4.A method for separating Y. pestis strains of the medieval and antique biovars is known, described in patent RU No. 2496882 (published 27.10.2013, Bulletin No. 30). It is based on the use of PCR with electrophoretic accounting of the results. However, this method does not offer a method for intra-biovar differentiation of strains of the medieval biovar into SNP genotypes of branches 2.MED1 and 2.MED4.
Опубликован способ дифференциации биоваров и геновариантов штаммов Y. pestis основного подвида с помощью полимеразной цепной реакции (патент RU №2565554, опубл. 20.10.2015 Бюл. №29). Этот способ предназначен для разделения биоваров основного подвида и отдельных популяций штаммов Y. pestis, но не для дифференциации филогеографических популяций средневекового биовара ветвей 2.MED1 и 2.MED4.A method for differentiating biovars and genovariants of Y. pestis strains of the main subspecies using polymerase chain reaction has been published (RU patent No. 2565554, published on 20.10.2015, Bulletin No. 29). This method is intended for separating biovars of the main subspecies and individual populations of Y. pestis strains, but not for differentiating phylogeographic populations of the medieval biovar of branches 2.MED1 and 2.MED4.
Известен способ проведения внутривидовой дифференциации типичных и атипичных штаммов Y. pestis средневекового биовара методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов (Патент RU №2550257, опубл. 10.05.2015 Бюл. №13). Способ предназначен для разделения штаммов основного подвида средневекового биовара, но не позволяет разделять штаммы по принадлежности к филогеографическим популяциям средневекового биовара 2.MED1 и 2.MED4 возбудителя чумы из очагов Прикаспия.A method for intraspecific differentiation of typical and atypical strains of Y. pestis of the medieval biovar by the PCR method with hybridization-fluorescence accounting of the results is known (Patent RU No. 2550257, published 10.05.2015 Bulletin No. 13). The method is intended for separating strains of the main subspecies of the medieval biovar, but does not allow separating strains by belonging to phylogeographic populations of the medieval biovar 2.MED1 and 2.MED4 of the plague pathogen from the Caspian foci.
Разработан способ подвидовой дифференциации штаммов возбудителя чумы методом полимеразной цепной реакции (патент RU №2552611, опубл. 10.06.2015 Бюл. №16), основанный на использовании метода ПЦР с электрофоретическим учетом результатов. Однако и этот способ не обеспечивает проведение внутривидовой дифференциацию штаммов возбудителя чумы средневекового биовара по их принадлежности к SNP-генотипам.A method for subspecies differentiation of plague pathogen strains by polymerase chain reaction has been developed (RU patent No. 2552611, published 10.06.2015 Bulletin No. 16), based on the use of the PCR method with electrophoretic accounting of the results. However, this method does not provide for intraspecies differentiation of plague pathogen strains of the medieval biovar according to their belonging to SNP genotypes.
Известен «Способ детекции чумного микроба и набор реагентов для его осуществления» (патент RU №2796820, опубл. 29.05.2023 Бюл. №16). В нем предложен способ детекции чумного микроба, основанный на магнитоуправляемой сепарации бактерий вида Y. pestis с использованием набора иммуномагнитных частиц magF19, с последующим определением бактерий вида Y. pestis методом петлевой изотермической амплификации. Этот способ не предназначен для проведения дифференциации штаммов Y. pestis средневекового биовара по принадлежности к филогеографическим популяциям очагов чумы Прикаспия.The "Method for detecting the plague microbe and a set of reagents for its implementation" is known (patent RU No. 2796820, published on 29.05.2023 Bulletin No. 16). It proposes a method for detecting the plague microbe based on magnetically controlled separation of Y. pestis bacteria using a set of magF19 immunomagnetic particles, followed by the determination of Y. pestis bacteria by loop isothermal amplification. This method is not intended for the differentiation of Y. pestis strains of the medieval biovar according to their belonging to phylogeographic populations of the Caspian plague foci.
В патенте RU №2621869 (Опубл. 07.06.2017 Бюл. №16) представлен способ подвидовой дифференциации штаммов возбудителя чумы методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов в режиме реального времени. Описанный способ позволяет проводить подвидовую дифференциацию штаммов Y. pestis, но не дает возможности разделять штаммы по их принадлежности к средневековому биовару и SNP-генотипам филогенетических ветвей 2.MED1 и 2.MED4.Patent RU No. 2621869 (Published 07.06.2017 Bulletin No. 16) presents a method for subspecies differentiation of plague pathogen strains using the polymerase chain reaction method with hybridization-fluorescence accounting of results in real time. The described method allows for subspecies differentiation of Y. pestis strains, but does not provide the ability to separate strains by their belonging to the medieval biovar and SNP genotypes of the phylogenetic branches 2.MED1 and 2.MED4.
Известен способ дифференциации штаммов Y. pestis основного и неосновных подвидов методом ПЦР в режиме реального времени (RU 2642273, опубл. 24.01.2018, Бюл. №3). Способ предусматривает выделение хромосомной ДНК из исследуемого материала, постановку ПЦР со специфическими праймерами и аллель-специфическими зондами. Способ обеспечивает разделение Y. pestis основного и неосновных подвидов, но не решает проблемы внутрибиоварной дифференциации чумного микроба и ветвей 2.MED1 и 2.MED4 по принадлежности к SNP-генотипам.A method for differentiating Y. pestis strains of the main and minor subspecies using real-time PCR is known (RU 2642273, published 24.01.2018, Bulletin No. 3). The method involves isolating chromosomal DNA from the material being studied, performing PCR with specific primers and allele-specific probes. The method ensures the separation of Y. pestis of the main and minor subspecies, but does not solve the problem of intra-biovar differentiation of the plague microbe and branches 2.MED1 and 2.MED4 according to their belonging to SNP genotypes.
Патентное изобретение RU №2684231 (Опубл. 04.04.2019 Бюл. №10) «Способ дифференциации штаммов Y. pestis средневекового биовара по филогенетической принадлежности методом ПЦР с электрофоретическим учетом результатов» и RU №2705813 (Опубл. 12.11.2019 Бюл. №32) с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов позволяет отнести штаммы средневекового биовара к конкретной филогенетической ветви средневекового биовара (2.MED0, 2.MED1, 2.MED2, 2.MED3), но не позволяет идентифицировать штаммы филогенетической ветви 2.MED4 и SNP-генотипы филогенетических ветвей 2.MED1 и 2.MED4.Patent invention RU No. 2684231 (Published 04.04.2019 Bulletin No. 10) "Method for differentiating Y. pestis strains of the medieval biovar by phylogenetic affiliation using the PCR method with electrophoretic accounting of the results" and RU No. 2705813 (Published 12.11.2019 Bulletin No. 32) with hybridization-fluorescence accounting of the results allows to assign strains of the medieval biovar to a specific phylogenetic branch of the medieval biovar (2.MED0, 2.MED1, 2.MED2, 2.MED3), but does not allow to identify strains of the phylogenetic branch 2.MED4 and SNP genotypes of the phylogenetic branches 2.MED1 and 2.MED4.
Способ внутривидовой дифференциации штаммов возбудителя чумы описан в патенте RU №2737775 (Опубл. 02.12.2020 Бюл. №34). При помощи указанного способа, возможно разделение штаммов Y. pestis и Y. pseudotuberculosis с дальнейшей дифференциацией штаммов Y. pestis по их принадлежности к основному и центральноазиатскому подвидам методом мультиплексной ПЦР. В тоже время этот способ не предусматривает определение принадлежности штаммов Y. pestis к конкретными филогенетическим ветвям и генотипам средневекового биовара.The method of intraspecific differentiation of plague pathogen strains is described in RU patent No. 2737775 (Published 02.12.2020 Bulletin No. 34). Using this method, it is possible to separate Y. pestis and Y. pseudotuberculosis strains with further differentiation of Y. pestis strains according to their belonging to the main and Central Asian subspecies using multiplex PCR. At the same time, this method does not provide for determining the belonging of Y. pestis strains to specific phylogenetic branches and genotypes of the medieval biovar.
Зарегистрирован способ индикации и идентификации штаммов возбудителя чумы по их принадлежности к виду Y. pestis, к подвидам, биоварам, филогенетическим ветвям (0.ANT, l.ANT, 2.ANT, 2.MED, 2.MED0, l.ORI, 0.РЕ5, 0.РЕ4) и по наличию генов основных факторов патогенности методом ДНК-чипа (RU №2734636 опубл. 21.10.2020 Бюл. №30). Однако этот способ не позволяет определять принадлежность штаммов к филогенетическим ветвям, таким как 2.MED1 и 2.MED4.A method for indicating and identifying plague pathogen strains by their belonging to the Y. pestis species, subspecies, biovars, phylogenetic branches (0.ANT, l.ANT, 2.ANT, 2.MED, 2.MED0, l.ORI, 0.PE5, 0.PE4) and by the presence of genes for the main pathogenicity factors using the DNA chip method has been registered (RU No. 2734636 published on 21.10.2020 Bulletin No. 30). However, this method does not allow determining the belonging of strains to phylogenetic branches, such as 2.MED1 and 2.MED4.
В патенте RU №2767371 (Опубл. 17.03.2022 Бюл. №8) описан способ дифференциации штаммов Y. pestis путем молекулярно-генетического типирования с использованием в качестве генетических маркеров IS-элементов. Данный метод обеспечивает дифференциацию штаммов Y. pestis по их генетическим группам на основные и неосновные подвиды, однако не предусматривает определение принадлежности штаммов к конкретным филогенетическим ветвям и генотипам средневекового биовара.Patent RU No. 2767371 (Published 17.03.2022 Bulletin No. 8) describes a method for differentiating Y. pestis strains by molecular genetic typing using IS elements as genetic markers. This method ensures differentiation of Y. pestis strains by their genetic groups into major and minor subspecies, but does not provide for determining the strains' belonging to specific phylogenetic branches and genotypes of the medieval biovar.
Разработан «Способ определения филогенетической принадлежности штаммов Yersinia pestis основного подвида методом аллель-специфической ПЦР в режиме реального времени» (RU №2799415 РФ, Опубл. 05.07.2023, Бюл. №19). Способ обеспечивает быструю и надежную идентификацию штаммов Y. pestis по их принадлежности к филогенетическим ветвям основного подвида 0.ANT1, 0.ANT2, 0.ANT3, 0.ANT5, 3.ANT, 4.ANT, 2.MED1, 2.MED2, 2.MED3, 2.MED4, l.ORI1, 1.ORI2, 1.ORI3 методом аллель-специфической ПЦР-РВ, который предусматривает проведение 28 моноплексных аллель-специфических ПЦР-РВ с двумя вариантами прямого праймера с последующей дифференциацией штаммов по наличию и отсутствию сигналов флуоресценции по маркерным SNPs. Но данный метод не предназначен для определения генотипов отдельных филогеографических популяций 2.MED1 и 2.MED4.A “Method for determining the phylogenetic affiliation of Yersinia pestis strains of the main subspecies using allele-specific PCR in real time” has been developed (RU No. 2799415 RF, Published 05.07.2023, Bulletin No. 19). The method ensures rapid and reliable identification of Y. pestis strains by their belonging to the phylogenetic branches of the main subspecies 0.ANT1, 0.ANT2, 0.ANT3, 0.ANT5, 3.ANT, 4.ANT, 2.MED1, 2.MED2, 2.MED3, 2.MED4, 1.ORI1, 1.ORI2, 1.ORI3 by the allele-specific RT-PCR method, which involves carrying out 28 monoplex allele-specific RT-PCR with two variants of the direct primer with subsequent differentiation of strains by the presence and absence of fluorescence signals by marker SNPs. However, this method is not intended to determine the genotypes of individual phylogeographic populations 2.MED1 and 2.MED4.
Технический результат заключается в обеспечении надежной идентификации SNP-генотипов филогенетических ветвей 2.MED1 и 2.MED4 средневекового биовара, распространенных на территории природных очагов чумы Северного и Северо-Западного Прикаспия.The technical result consists in ensuring reliable identification of SNP genotypes of phylogenetic branches 2.MED1 and 2.MED4 of the medieval biovar, common in the territory of natural plague foci of the Northern and Northwestern Caspian region.
Технический результат изобретения достигается способом идентификации SNP-генотипов, определяемых полиморфизмом единичных нуклеотидов 24 генов, характерных для штаммов средневекового биовара филогенетических ветвей 2.MED1 и 2.MED4 возбудителя чумы, которые выделялись в различные периоды эпизоотической активности природных очагов на территории Прикаспийского региона методом секвенирования по Сэнгеру, который предусматривает проведение моноплексных полимеразных цепных реакций (ПЦР) для каждой мишени с уникальными праймерами и последующим проведением секвенирования по Сэнгеру и установлением SNP-генотипа исследуемого штамма.The technical result of the invention is achieved by a method for identifying SNP genotypes determined by the polymorphism of single nucleotides of 24 genes characteristic of strains of the medieval biovar of the phylogenetic branches 2.MED1 and 2.MED4 of the plague pathogen, which were isolated in different periods of epizootic activity of natural foci in the territory of the Caspian region by the Sanger sequencing method, which involves conducting monoplex polymerase chain reactions (PCR) for each target with unique primers and subsequent Sanger sequencing and establishing the SNP genotype of the strain under study.
Координаты SNPs мишеней (названия и координаты даны по номенклатуре генома штамма Y. pestis CO92, номер доступа в NCBI GenBank NC_003143), использованных в разработанном способе идентификации SNP-генотипов возбудителя чумы средневекового биовара филогенетических ветвей 2.MED1 и 2.MED4 из очагов Северного и Северо-Западного Прикаспия методом секвенирования по Сэнгеру указаны в табл. 1. Заявляемый способ осуществляют следующим образом.The coordinates of the SNP targets (names and coordinates are given according to the nomenclature of the genome of the Y. pestis strain CO92, access number in NCBI GenBank NC_003143), used in the developed method for identifying SNP genotypes of the plague pathogen of the medieval biovar of the phylogenetic branches 2.MED1 and 2.MED4 from the foci of the Northern and Northwestern Caspian region by the Sanger sequencing method are shown in Table 1. The claimed method is carried out as follows.
Выделение ДНК исследуемого штамма чумного микроба проводят по стандартной методике в соответствии с МУ 1.3.2569-09 «Организация работ лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности».The DNA isolation of the studied strain of the plague microbe is carried out using a standard method in accordance with MU 1.3.2569-09 “Organization of work of laboratories using nucleic acid amplification methods when working with material containing microorganisms of pathogenicity groups I-IV”.
Полимеразную цепную реакцию проводят с использованием сконструированных праймеров (SEQ ID NO: 1-24) в 24 моноплексных ПЦР в отдельных пробирках. Олигонуклеотидные праймеры, применяемые для амплификации полиморфного участка в ПЦР, рассчитаны на основе нуклеотидных последовательностей штаммов Y. pestis CO92 (номер доступа в NCBI GenBank NC_003143.1) и KIM10 (номер доступа в NCBI GenBank NC_004088.1). С помощью указанных праймеров в ПЦР проводят амплификацию 24 ДНК-мишеней, по которым определяют принадлежность к девяти SNP-генотипам, характерным для штаммов средневекового биовара основного подвида Y. pestis из очагов Северного и Северо-Западного Прикаспия: «Pricasp-1» (араН, phnL, priA), «Pricasp-2» (narP, radC, ypo0842), «Pricasp-3» (asnA, ssrA), «Pricasp-4» (flgK, ypo1240, ypo1564), «Pricasp-4.1» (hns), «Pricasp-4.2» (tssG), «Pricasp-5» (sel, ypo4015), «Pricasp-6» (ypo0379, cysJ, gltB), «Pricasp-7» (YPO_RS18685, YPO_RS21620), «Pricasp-8» (уро0033, ptsP, selenide), «Pricasp-9» (YPO_RS09555).Polymerase chain reaction was performed using designed primers (SEQ ID NO: 1-24) in 24 monoplex PCRs in separate tubes. Oligonucleotide primers used to amplify the polymorphic region in PCR were designed based on the nucleotide sequences of Y. pestis strains CO92 (NCBI GenBank accession number NC_003143.1) and KIM10 (NCBI GenBank accession number NC_004088.1). Using the specified primers, 24 DNA targets are amplified in PCR, which determine their belonging to nine SNP genotypes characteristic of strains of the medieval biovar of the main subspecies of Y. pestis from the foci of the Northern and Northwestern Caspian region: "Pricasp-1" (apaH, phnL, priA), "Pricasp-2" (narP, radC, ypo0842), "Pricasp-3" (asnA, ssrA), "Pricasp-4" (flgK, ypo1240, ypo1564), "Pricasp-4.1" (hns), "Pricasp-4.2" (tssG), "Pricasp-5" (sel, ypo4015), "Pricasp-6" (ypo0379, cysJ, gltB), "Pricasp-7" (YPO_RS18685, YPO_RS21620), "Pricasp-8" (uro0033, ptsP, selenide), "Pricasp-9" (YPO_RS09555).
Для проведения ПЦР применяют следующие условия реакции:The following reaction conditions are used to perform PCR:
для мишеней генотипа «Pricasp-3», «Pricasp-4», «Pricasp-4.1», «Pricasp-4.2», «Pricasp-5» - денатурация - 95°C - 10 мин; циклирование (40 циклов) - 95°С - 20 с, 59°С - 40 с, 72°С - 25 с, финальная элонгация 1 мин.for targets of the genotypes "Pricasp-3", "Pricasp-4", "Pricasp-4.1", "Pricasp-4.2", "Pricasp-5" - denaturation - 95°C - 10 min; cycling (40 cycles) - 95°C - 20 sec, 59°C - 40 sec, 72°C - 25 sec, final elongation 1 min.
для мишеней «Pricasp-1», «Pricasp-2», «Pricasp-5», «Pricasp-6», «Pricasp-9»: денатурация - 95°C - 10 мин; циклирование (40 циклов) - 95°С - 20 с, 60°С - 30 с, 72°С - 20 с, финальная элонгация 1 мин.for targets "Pricasp-1", "Pricasp-2", "Pricasp-5", "Pricasp-6", "Pricasp-9": denaturation - 95°C - 10 min; cycling (40 cycles) - 95°C - 20 s, 60°C - 30 s, 72°C - 20 s, final elongation 1 min.
для мишеней «Pricasp-7», «Pricasp-8»: денатурация - 95°С - 10 мин; циклирование (40 циклов) - 95°С - 15 с, 58°С - 35 с, 72°С - 20 с, финальная элонгация 1 мин.for targets "Pricasp-7", "Pricasp-8": denaturation - 95°C - 10 min; cycling (40 cycles) - 95°C - 15 s, 58°C - 35 s, 72°C - 20 s, final elongation 1 min.
Продукты, полученные в ПЦР, визуализируют методом электрофореза в 1,5% агарозном геле, приготовленном на 1xTAE с добавлением 0,5 мкг/мл бромида этидия, и последующего просмотра в УФ-свете при длине волны 310 нм. К 5 мкл полученного амплификата добавляют 1 мкл красителя, вносят в лунки геля и задают напряжение 10-15 В/см. Электрофоретическое разделение продолжают до прохождения красителем около 4/5 длины геля. При просмотре в УФ-свете фрагменты анализируемой ДНК проявляются в виде оранжево-красных полос, размеры которых должны соответствовать фрагментам (100-300 пн.). Наличие этого этапа желательно для подтверждения качества ампликона, полученного на этапе ПЦР амплификации.The products obtained in PCR are visualized by electrophoresis in 1.5% agarose gel prepared on 1xTAE with the addition of 0.5 μg/ml ethidium bromide, followed by viewing in UV light at a wavelength of 310 nm. 1 μl of dye is added to 5 μl of the obtained amplification product, introduced into the wells of the gel and a voltage of 10-15 V/cm is set. Electrophoretic separation is continued until the dye has passed about 4/5 of the gel length. When viewed in UV light, fragments of the analyzed DNA appear as orange-red bands, the sizes of which should correspond to the fragments (100-300 bp). The presence of this stage is desirable to confirm the quality of the amplicon obtained at the PCR amplification stage.
Далее оставшуюся ПЦР-смесь с ампликонами подготавливают для проведения автоматического секвенирования. На первом этапе проводят очистку продуктов ПЦР с помощью ферментов - Exonuclease I (Escherichia coli) и щелочная фосфатаза SAP. Готовят смесь реагентов на один ПЦР-образец: 11,7 мкл деионизованной воды, 2 мкл буфера для ПЦР (10Х, рН 8-8,5), 1 мкл фосфотазы и 0,3 мкл экзонуклеазы. Полученную смесь перемешивают, центрифугируют для осаждения капель со стенок пробирок и инкубируют при 37°С в течение 30 мин, а затем - при 85°С в течение 10 мин. Очищенные таким образом амликоны готовы к проведению следующего этапа. Для получения меченых ампликонов с использованием реакционной смеси Brilliant Dye Terminator V 3.1 готовят реакционную смесь. Состав смеси зависит от длины ампликона. Если длина фрагмента от 100 до 300 н.п., то состав смеси будет таким: 0,3 мкл Brilliant Dye Terminator V 3.1, 2,0 мкл 5× буфера для секвенирования, праймер до концентрации 2-3 пкмоль/мкл, 1 мкл очищенного ампликона и деионизованной воды до конечного объема 10 мкл.Next, the remaining PCR mixture with amplicons is prepared for automatic sequencing. At the first stage, PCR products are purified using enzymes - Exonuclease I (Escherichia coli) and alkaline phosphatase SAP. A mixture of reagents is prepared for one PCR sample: 11.7 μl of deionized water, 2 μl of PCR buffer (10X, pH 8-8.5), 1 μl of phosphatase and 0.3 μl of exonuclease. The resulting mixture is mixed, centrifuged to precipitate drops from the walls of the tubes and incubated at 37°C for 30 min, and then at 85°C for 10 min. The amplicons purified in this way are ready for the next stage. To obtain labeled amplicons using the Brilliant Dye Terminator V 3.1 reaction mixture, prepare a reaction mixture. The composition of the mixture depends on the length of the amplicon. If the fragment length is from 100 to 300 bp, the composition of the mixture will be as follows: 0.3 μl Brilliant Dye Terminator V 3.1, 2.0 μl 5× sequencing buffer, primer to a concentration of 2-3 pmol/μl, 1 μl purified amplicon and deionized water to a final volume of 10 μl.
Амплификацию проводят в течение 35 циклов, каждый из которых состоит из трех этапов и одноразовой предварительной денатурации ампликонов:Amplification is carried out over 35 cycles, each of which consists of three stages and a one-time preliminary denaturation of amplicons:
3 мин при 96°С (одноразовая предварительная денатурация ампликонов),3 min at 96°C (one-time preliminary denaturation of amplicons),
Далее циклический процесс из трех этапов:Next comes a cyclical process of three stages:
30 с при 96°С (денатурация ампликонов),30 s at 96°C (denaturation of amplicons),
10 с при 45-58°С (отжиг праймеров),10 sec at 45-58°C (primer annealing),
2 мин при 60°С (синтез комплементарной цепи).2 min at 60°C (synthesis of complementary chain).
Для очистки к 10 мкл ПЦР-продукта добавляют 40 мкл смеси следующего состава: 1,5 мкл 3М ацетата натрия, 31,3 мкл 96% этанола и 7,2 мкл деионизованной воды. Смесь перемешивают и инкубируют при температуре +4°С в течение 40-60 мин.For purification, 40 µl of a mixture of the following composition are added to 10 µl of the PCR product: 1.5 µl of 3M sodium acetate, 31.3 µl of 96% ethanol and 7.2 µl of deionized water. The mixture is mixed and incubated at +4°C for 40-60 min.
Образцы центрифугируют с охлаждением (+4°С) в течение 15 мин при 4000 g. Супернатант удаляют. К осадку (он обычно не видим) добавляют 200 мкл 70% этанола, перемешивают и центрифугируют с охлаждением (+4°С) в течение 10 мин при 4000 g. Супернатант удаляют, осадок высушивают при температуре 50-55°С в течение 10-15 мин до полного испарения спирта. В пробирки с очищенными образцами добавляют по 14 мкл формамида, перемешивают, инкубируют 3-4 мин при 95-100°С, после чего сразу помещают на ледяную баню на 2-3 мин.The samples are centrifuged with cooling (+4°C) for 15 min at 4000 g. The supernatant is removed. 200 μl of 70% ethanol are added to the sediment (it is usually not visible), mixed and centrifuged with cooling (+4°C) for 10 min at 4000 g. The supernatant is removed, the sediment is dried at a temperature of 50-55°C for 10-15 min until complete evaporation of alcohol. 14 μl of formamide are added to the test tubes with purified samples, mixed, incubated for 3-4 min at 95-100°C, and then immediately placed in an ice bath for 2-3 min.
Далее подготовленные образцы секвенируют на платформе «ABI PRISM 3500XL» (Applied Biosystems, США), используя полимер РОР-7 для 3500 /3500xL и капилляры длиной 50 см. (или аналогичной платформе для секвенирования по Сэнгеру). Анализ полученных последовательностей проводят при помощи программы 3500 Series Data Collection Software, оценку гомологии можно проводить с помощью пакета программ Mega X (или UGENE, SeaView 5.0 и т.д.).The prepared samples are then sequenced on the ABI PRISM 3500XL platform (Applied Biosystems, USA) using the POP-7 polymer for 3500/3500xL and 50 cm long capillaries (or a similar platform for Sanger sequencing). The obtained sequences are analyzed using the 3500 Series Data Collection Software, and homology can be assessed using the Mega X software package (or UGENE, SeaView 5.0, etc.).
Принадлежность исследуемого штамма чумного микроба из Прикаспийского региона и сопредельных очагов чумы к конкретному геноварианту Pricasp устанавливают по результатам данных фрагментного секвенирования по наличию маркерных SNPs в указанной позиции гена (по эталонному геному CO92, AL590842.1) по табл. 3 учета результатов. Полученный фрагмент локуса анализируют с помощью программы MEGA X (или аналогичной программы, принимающей файлы формата fasta). По наличию маркерного SNP в указанной позиции локуса определяют принадлежность исследуемого штамма Y. pestis к конкретному геноварианту с одновременным определением его филогеографической принадлежности. На фигуре показаны результаты фрагментного секвенирования выборки штаммов Y. pestis филогенетических ветвей 2.MED1 и 2.MED4. Показана маркерная нуклеотидная замена С→Т в позиции 248 в гене flgK генотипа Pricasp-4 (координата по геному референсного штамма Y. pestis CO92 - 790023) филогенетической линии 2.MED1.The belonging of the studied plague microbe strain from the Caspian region and adjacent plague foci to a specific Pricasp genovariant is established based on the results of fragment sequencing data for the presence of marker SNPs in the specified gene position (according to the reference genome CO92, AL590842.1) according to Table 3 of the results accounting. The obtained locus fragment is analyzed using the MEGA X program (or a similar program that accepts fasta format files). Based on the presence of a marker SNP in the specified locus position, the belonging of the studied Y. pestis strain to a specific genovariant is determined with simultaneous determination of its phylogeographic affiliation. The figure shows the results of fragment sequencing of a sample of Y. pestis strains from phylogenetic branches 2.MED1 and 2.MED4. The marker nucleotide substitution C→T at position 248 in the flgK gene of the Pricasp-4 genotype (coordinate according to the genome of the reference strain Y. pestis CO92 is 790023) of the phylogenetic line 2.MED1 is shown.
Специфичность сконструированных праймеров проверена на выборке из 190 штаммов Y. pestis, выделенных в 1912-2015 гг. от носителей, переносчиков и человека на территории 17-ти природных очагов чумы Прикаспия, Кавказа и Центральной Азии (их филогенетическая принадлежность проверена методом полногеномного SNP-анализа). В качестве контроля также исследовали полногеномные последовательности 8 штаммов Y. pestis других филогенетических ветвей из базы данных NCBI Genbank: Pestoides А (0.РЕ4а, NZ_ACNT00000000), Pestoides F (0.PE2. NC_009381), 620024 (0.PE7, ADPM00000000), CO92 (1.ORI1, AL590842.1), 351001 (2.ANT2, ADPF00000000), 91 (2.MED2, ADPU00000000), CMCC125002 (2.MED3, ADQN00000000), KIM10 (2.MED1, AE009952.1). Специфичность праймеров и подобранных мишеней также оценивалась с помощью алгоритма BLAST по всем имеющимся геномам Y. pestis в базе данных NCBI GenBank.The specificity of the constructed primers was tested on a sample of 190 Y. pestis strains isolated in 1912-2015 from carriers, vectors and humans in the territory of 17 natural plague foci in the Caspian region, the Caucasus and Central Asia (their phylogenetic affiliation was tested using whole-genome SNP analysis). As a control, we also examined the whole genome sequences of 8 Y. pestis strains of other phylogenetic branches from the NCBI Genbank database: Pestoides A (0.PE4a, NZ_ACNT00000000), Pestoides F (0.PE2. NC_009381), 620024 (0.PE7, ADPM00000000), CO92 (1.ORI1, AL590842.1), 351001 (2.ANT2, ADPF00000000), 91 (2.MED2, ADPU00000000), CMCC125002 (2.MED3, ADQN00000000), KIM10 (2.MED1, AE009952.1). The specificity of the primers and selected targets was also assessed using the BLAST algorithm against all available Y. pestis genomes in the NCBI GenBank database.
С помощью предлагаемого способа идентификации SNP-генотипов штаммов средневекового биовара основного подвида Y. pestis из очагов Северного и Северо-Западного Прикаспия методом секвенирования по Сэнгеру установлена принадлежность 176 штаммов к SNP-генотипам: Pricasp-1 - 18 шт., Pricasp-2 - 20 шт., Pricasp-3 - 6 шт., Pricasp-4 (включая 4.1+4.2) - 41 шт., Pricasp-5 - 48 шт., Pricasp-6 - 14 шт., Pricasp-7 - 12 шт., Pricasp-8 - 9 шт., Pricasp-9 - 8 шт., и определено распространение филогеографических популяций SNP-генотипов штаммов Y. pestis средневекового биовара основного подвида, указанное в таблице 2 «SNP-профиль, установленный для штаммов Y. pestis средневекового биовара из очагов Северного и Северо-Западного Прикаспия периода 1912-2015 гг.».Using the proposed method for identifying SNP genotypes of strains of the medieval biovar of the main subspecies Y. pestis from the foci of the Northern and Northwestern Caspian region using the Sanger sequencing method, it was established that 176 strains belong to the SNP genotypes: Pricasp-1 - 18 pcs., Pricasp-2 - 20 pcs., Pricasp-3 - 6 pcs., Pricasp-4 (including 4.1 + 4.2) - 41 pcs., Pricasp-5 - 48 pcs., Pricasp-6 - 14 pcs., Pricasp-7 - 12 pcs., Pricasp-8 - 9 pcs., Pricasp-9 - 8 pcs., and the distribution of phylogeographic populations of SNP genotypes of Y. pestis strains of the medieval biovar of the main subspecies was determined, indicated in Table 2 "SNP profile established for strains Y. pestis medieval biovar from foci of the Northern and Northwestern Caspian region in the period 1912-2015."
Сущность изобретения подтверждается следующими примерами.The essence of the invention is confirmed by the following examples.
Пример 1. Идентификация SNP-генотипа «Pricasp-1» штаммов средневекового биовара филогенетической ветви 2.MED4 Y. pestis из очагов Северного и Северо-Западного Прикаспия методом секвенирования по СэнгеруExample 1. Identification of the SNP genotype "Pricasp-1" of strains of the medieval biovar of the phylogenetic branch 2.MED4 Y. pestis from foci of the Northern and Northwestern Caspian region by the Sanger sequencing method
Экстракцию ДНК исследуемого образца проводят с помощью коммерческих наборов для выделения ДНК. Моноплексные ПЦР осуществляют с праймерами (SEQ ID NO: 1-24), рассчитанными на ДНК мишени, которые составляют девять генотипов «Pricasp-1»-«Pricasp-9». При анализе ампликонов, полученных методом секвенирования по Сэнгеру, идентификация SNP-генотипа «Pricasp-1» (араН, phnL, priA) проводится следующим образом. В мишени «араН» при выравнивании полученного ампликона на референсную последовательность генома Y. pestis CO92 (номер доступа в NCBI GenBank NC_003143) в позиции гена 802 наблюдается замена нуклеотида С>А (замена аминокислоты His268Asn); в мишени «phnL» в позиции гена 247 наблюдается замена нуклеотида G>A (Ala83Thr); в мишени «priA» в позиции гена 164 наблюдается замена нуклеотида A>G, которая является синонимичной и не приводит к замене аминокислоты. В остальных ДНК мишенях полиморфные нуклеотиды не выявляются. Наличие всех трех мутаций указывает, что исследуемый штамм относится к генотипу «Pricasp-1» филогенетической ветви 2.MED4 основного подвида средневекового биовара Y. pestis. Этот генотип встречался на территории следующих очагов чумы: Прикаспийского Северо-Западного степного (№14), Волго-Уральского степного (№15), Волго-Уральского песчаного (№16), Зангезуро-Карабахского горного (№6) в период 1917-1950 гг.Extraction of DNA from the test sample is performed using commercial DNA extraction kits. Monoplex PCR is performed with primers (SEQ ID NO: 1-24) designed for target DNA, which constitute nine genotypes "Pricasp-1" - "Pricasp-9". When analyzing amplicons obtained by Sanger sequencing, identification of the SNP genotype "Pricasp-1" (araH, phnL, priA) is carried out as follows. In the target "araH", when aligning the obtained amplicon to the reference sequence of the Y. pestis CO92 genome (NCBI GenBank accession number NC_003143), a nucleotide substitution C>A (amino acid substitution His268Asn) is observed at gene position 802; In the target "phnL" at gene position 247, a nucleotide substitution G>A (Ala83Thr) is observed; in the target "priA" at gene position 164, a nucleotide substitution A>G is observed, which is synonymous and does not lead to an amino acid substitution. In the remaining DNA targets, polymorphic nucleotides are not detected. The presence of all three mutations indicates that the studied strain belongs to the genotype "Pricasp-1" of the phylogenetic branch 2.MED4 of the main subspecies of the medieval biovar Y. pestis. This genotype was encountered in the territory of the following plague foci: Caspian North-West steppe (No. 14), Volga-Ural steppe (No. 15), Volga-Ural sandy (No. 16), Zangezur-Karabakh mountain (No. 6) in the period 1917-1950.
Пример 2. Идентификация SNP-генотипа «Pricasp-2» штаммов Y. pestis средневекового биовара филогенетической ветви 2.MED1 из очагов Северного и Северо-Западного Прикаспия методом секвенирования по СэнгеруExample 2. Identification of the SNP genotype "Pricasp-2" of Y. pestis strains of the medieval biovar of the phylogenetic branch 2.MED1 from foci of the Northern and Northwestern Caspian region by the Sanger sequencing method
Исследование штамма Y. pestis проводят аналогично примеру №1. Моноплексные ПЦР осуществляют с праймерами (SEQ ID NO: 1-24), рассчитанными на ДНК мишени, которые составляют девять генотипов «Pricasp-1»-«Pricasp-9». При анализе ампликонов, полученных методом секвенирования по Сэнгеру, идентификация SNP-генотипа «Pricasp-2» (narP, radC, уро0842) осуществляется следующим образом. Этот генотип представлен несколькими вариантами комбинации мишеней: общая SNP (narP), вариант 1 (narP+radC), вариант 2 (narP+YPO0842). В общей мишени «narP» при выравнивании полученного ампликона на референсную последовательность генома Y. pestis С092 (номер доступа в NCBI GenBank NC_003143) в позиции гена 101 наблюдается замена нуклеотида С>А (Ala34Asp); в «radC» в позиции гена 456, присутствует синонимичная замена G>T; в мишени «YPO0842» в позиции гена 1358, наблюдается замена нуклеотида С>Т (Thr453Ile). Принадлежность к генотипу «Pricasp-2» определяется по наличию мутации в гене «narP». Далее проводится определение варианта генотипа «Pricasp-2». К варианту 1 относятся штаммы, у которых обнаружены специфические мутации в комбинации генов «narP»+«radC»; для варианта 2 характерны мутации в генах «narP»+«УРО0842». В остальных ДНК мишенях полиморфные нуклеотиды не выявляются. Штаммы этого генотипа встречались в период 1930-1954 гг. на территории следующих очагов чумы: Кобыстанском равнинно-предгорном (№9), Прикаспийском Северо-Западном степном (№14), Волго-Уральском степном (№15), Волго-Уральском песчаном (№16), Урало-Эмбенском пустынном (№18), Каракумском пустынном (№25), Прикаспийском песчаном (№43). Вариант 1 (narP+radC) распространен в указанных выше очагах: №16, №18, №25, №43; вариант 2 (narP+YPO0842): №9, №14, №15, №16, №43.The Y. pestis strain is studied similarly to Example No. 1. Monoplex PCR is performed with primers (SEQ ID NO: 1-24) designed for target DNA, which constitute nine genotypes "Pricasp-1" - "Pricasp-9". When analyzing amplicons obtained by the Sanger sequencing method, the SNP genotype "Pricasp-2" (narP, radC, uro0842) is identified as follows. This genotype is represented by several variants of target combinations: common SNP (narP), variant 1 (narP+radC), variant 2 (narP+YPO0842). In the general target "narP", when aligning the obtained amplicon to the reference sequence of the Y. pestis C092 genome (NCBI GenBank accession number NC_003143), a nucleotide substitution C>A (Ala34Asp) is observed at gene position 101; in "radC" at gene position 456, a synonymous substitution G>T is present; in the target "YPO0842" at gene position 1358, a nucleotide substitution C>T (Thr453Ile) is observed. Belonging to the "Pricasp-2" genotype is determined by the presence of a mutation in the "narP" gene. Then, the "Pricasp-2" genotype variant is determined. Variant 1 includes strains in which specific mutations were detected in the "narP" + "radC" gene combination; Variant 2 is characterized by mutations in the genes "narP" + "URO0842". In the other DNA targets, polymorphic nucleotides are not detected. Strains of this genotype were encountered in the period 1930-1954 in the territory of the following plague foci: Kobystan plain-foothill (No. 9), Caspian Northwestern steppe (No. 14), Volga-Ural steppe (No. 15), Volga-Ural sandy (No. 16), Ural-Emben desert (No. 18), Karakum desert (No. 25), Caspian sandy (No. 43). Variant 1 (narP + radC) is widespread in the above-mentioned foci: No. 16, No. 18, No. 25, No. 43; Option 2 (narP+YPO0842): No. 9, No. 14, No. 15, No. 16, No. 43.
Пример 3. Идентификация SNP-генотипа «Pricasp-3» штаммов Y. pestis средневекового биовара филогенетической ветви 2.MED1 из очагов Северного и Северо-Западного Прикаспия методом секвенирования по СэнгеруExample 3. Identification of the SNP genotype "Pricasp-3" of Y. pestis strains of the medieval biovar of the phylogenetic branch 2.MED1 from foci of the Northern and Northwestern Caspian region by the Sanger sequencing method
Исследование штамма Y. pestis проводят аналогично примеру №1. Моноплексные ПЦР осуществляют с праймерами (SEQ ID NO: 1-24), рассчитанными на ДНК мишени, которые составляют девять генотипов «Pricasp-1»-«Pricasp-9». При анализе ампликонов, полученных методом секвенирования по Сэнгеру, штаммы, относящиеся к SNP-генотипу «Pricasp-3» (asnA, ssrA) должны иметь следующие нуклеотидные замены. В мишени «asnA» при выравнивании полученного ампликона на референсную последовательность генома Y. pestis CO92 (номер доступа в NCBI GenBank NC_003143) в позиции гена 618, наблюдается замена нуклеотида А>Т (синонимичная, sSNP); в мишени «ssrA» в позиции гена 197 наблюдается замена нуклеотида С>Т (Pro66Leu). Наличие специфических SNPs в генах «asnA» и «ssrA» указывает, что исследуемый штамм относится к генотипу «Pricasp-3» филогенетической ветви 2.MED1 основного подвида средневекового биовара Y. pestis. В остальных ДНК мишенях полиморфные нуклеотиды не выявляются. В период 1990-2002 гг.штаммы данного генотипа были выделены на территории Волго-Уральского песчаного (№16) и Предустюртского пустынного (№19) очагов чумы.The Y. pestis strain is studied similarly to Example No. 1. Monoplex PCR is carried out with primers (SEQ ID NO: 1-24) designed for target DNA, which constitute nine genotypes "Pricasp-1" - "Pricasp-9". When analyzing amplicons obtained by Sanger sequencing, strains belonging to the SNP genotype "Pricasp-3" (asnA, ssrA) should have the following nucleotide substitutions. In the "asnA" target, when aligning the obtained amplicon to the reference sequence of the Y. pestis CO92 genome (NCBI GenBank accession number NC_003143) at gene position 618, a nucleotide substitution A>T (synonymous, sSNP) is observed; In the target "ssrA" at gene position 197, a nucleotide substitution C>T (Pro66Leu) is observed. The presence of specific SNPs in the genes "asnA" and "ssrA" indicates that the strain under study belongs to the genotype "Pricasp-3" of the phylogenetic branch 2.MED1 of the main subspecies of the medieval biovar Y. pestis. In the other DNA targets, polymorphic nucleotides are not detected. In the period 1990-2002, strains of this genotype were isolated in the Volga-Ural sandy (No. 16) and Predusturt desert (No. 19) plague foci.
Пример 4. Идентификация SNP-генотипов «Pricasp-4», «Pricasp-4.1» и «Pricasp-4.2» штаммов Y. pestis филогенетической ветви 2.MED1 из очагов Северного и Северо-Западного Прикаспия методом секвенирования по СэнгеруExample 4. Identification of SNP genotypes “Pricasp-4”, “Pricasp-4.1” and “Pricasp-4.2” of Y. pestis strains of the phylogenetic branch 2.MED1 from foci of the Northern and Northwestern Caspian region by the Sanger sequencing method
Исследование штамма Y. pestis проводят аналогично примеру №1. Внутри генотипа «Pricasp-4» выделено еще два геноварианта «Pricasp-4.1» (hns), «Pricasp-4.2» (tssG), которые характеризуют локальные популяции на территории Северо-Западного Прикаспия. Моноплексные ПЦР осуществляют с праймерами (SEQ ID NO: 1-24), рассчитанными на ДНК мишени, которые составляют девять генотипов «Pricasp-1»-«Pricasp-9». При анализе ампликонов, полученных методом секвенирования по Сэнгеру, штаммы, относящиеся к SNP-генотипам «Pricasp-4» (flgK, уро1240, уро1564), «Pricasp-4.1» (hns), «Pricasp-4.2» (tssG) демонстрируют следующие результаты. По мишени «flgK» при выравнивании полученного ампликона на референсную последовательность генома Y. pestis CO92 (номер доступа в NCBI GenBank NC_003143) в позиции гена 244 присутствует замена нуклеотида С>Т, приводящая к образованию стоп-кодона (Gln82Стоп-кодон); в мишени «уро1240» в позиции гена 127 наблюдается замена нуклеотида A>G (Thr43Ala); в мишени «уро1564» в позиции гена 265 наблюдается замена нуклеотида С>Т, которая приводит к образованию стоп-кодона (Gln89Стоп-кодон). Наличие всех трех мутаций указывает, что исследуемый штамм относится к генотипу «Pricasp-4» филогенетической ветви 2.MED1 основного подвида средневекового биовара Y. pestis. Далее проводят определение принадлежности к дополнительным геновариантам «Pricasp-4.1» и «Pricasp-4.2». По мишени «hns» в позиции гена 96 присутствует замена нуклеотида С>Т (sSNP), что характерно для штаммов, относящихся к генотипу «Pricasp-4.1». По мишени «tssG» в позиции гена 1023 наблюдается синонимичная замена T>G, характерная для штаммов генотипа «Pricasp-4.2». В остальных ДНК мишенях полиморфные нуклеотиды не выявляются. Генотип «Pricasp-4» выделялся в период 1979-2015 гг.в Дагестанском равнинно-предгорном (№3), Джейранчельском равнинно-предгорном (№11), Прикаспийском Северо-Западном (№14), Волго-Уральском песчаном (№16) и Прикаспийском песчаном (№43). Геновариант «Pricasp-4.1» выделялся в очагах №3, №14, №43 в период 1983-2006 гг.; геновариант «Pricasp-4.2» выделялся в очагах №3 и №43 в период 1980-2015 гг.The study of the Y. pestis strain is carried out similarly to example No. 1. Within the genotype "Pricasp-4" two more genovariants "Pricasp-4.1" (hns), "Pricasp-4.2" (tssG) were identified, which characterize local populations in the territory of the North-West Caspian region. Monoplex PCR is carried out with primers (SEQ ID NO: 1-24) designed for the target DNA, which make up nine genotypes "Pricasp-1" - "Pricasp-9". When analyzing the amplicons obtained by the Sanger sequencing method, the strains belonging to the SNP genotypes "Pricasp-4" (flgK, uro1240, uro1564), "Pricasp-4.1" (hns), "Pricasp-4.2" (tssG) demonstrate the following results. For the target "flgK", when aligning the obtained amplicon to the reference sequence of the Y. pestis CO92 genome (NCBI GenBank accession number NC_003143), there is a C>T nucleotide substitution at gene position 244, resulting in the formation of a stop codon (Gln82Stop codon); in the target "uro1240", a nucleotide substitution A>G (Thr43Ala) is observed at gene position 127; in the target "uro1564", a nucleotide substitution C>T is observed at gene position 265, which results in the formation of a stop codon (Gln89Stop codon). The presence of all three mutations indicates that the studied strain belongs to the "Pricasp-4" genotype of the phylogenetic branch 2.MED1 of the main subspecies of the medieval biovar Y. pestis. Next, the belonging to additional genovariants "Pricasp-4.1" and "Pricasp-4.2" is determined. According to the target "hns" in the gene position 96, there is a nucleotide substitution C>T (sSNP), which is typical for strains belonging to the genotype "Pricasp-4.1". According to the target "tssG" in the gene position 1023, there is a synonymous substitution T>G, which is typical for strains of the genotype "Pricasp-4.2". In the other DNA targets, polymorphic nucleotides are not detected. Genotype "Pricasp-4" was isolated in the period 1979-2015 in Dagestan plain-foothill (No. 3), Dzheyranchel plain-foothill (No. 11), Northwestern Caspian (No. 14), Volga-Ural sandy (No. 16) and Caspian sandy (No. 43). Genovariant "Pricasp-4.1" was isolated in foci No. 3, No. 14, No. 43 in the period 1983-2006; genovariant "Pricasp-4.2" was isolated in foci No. 3 and No. 43 in the period 1980-2015.
Пример 5. Идентификация SNP-генотипа «Pricasp-5» штаммов Y. pestis средневекового биовара филогенетической ветви 2.MED1 из очагов Северного и Северо-Западного Прикаспия методом секвенирования по СэнгеруExample 5. Identification of the SNP genotype "Pricasp-5" of Y. pestis strains of the medieval biovar of the phylogenetic branch 2.MED1 from foci of the Northern and Northwestern Caspian region by the Sanger sequencing method
Исследование штамма Y. pestis проводят аналогично примеру №1. Моноплексные ПЦР осуществляют с праймерами (SEQ ID NO: 1-24), рассчитанными на ДНК мишени, которые составляют девять генотипов «Pricasp-1»-«Pricasp-9». При анализе ампликонов, полученных методом секвенирования по Сэнгеру, штаммы, относящиеся к SNP-генотипу «Pricasp-5» (sel, уро4015) имеют следующие результаты. В мишени «sel» при выравнивании полученного ампликона на референсную последовательность генома Y. pestis CO92 (номер доступа в NCBI GenBank NC 003143) в позиции гена 404 наблюдается замена нуклеотида С>Т (Ser135Phe); в мишени «уро4015» в позиции гена 290 наблюдается замена нуклеотида А>С (His97Pro). Наличие этих мутаций указывает, что исследуемый штамм относится к генотипу «Pricasp-5» филогенетической ветви 2.MED1 основного подвида средневекового биовара Y. pestis. В остальных ДНК мишенях полиморфные нуклеотиды не выявляются. Генотип «Pricasp-5» встречался в период 1959-1992 в Волго-Уральском степном (№15), Волго-Уральском песчаном (№16), Урало-Уильском степном (№17), Урало-Эмбенском пустынном (№18) очагах чумы.The Y. pestis strain is studied similarly to Example No. 1. Monoplex PCR is carried out with primers (SEQ ID NO: 1-24) designed for the target DNA, which constitute nine genotypes "Pricasp-1" - "Pricasp-9". When analyzing the amplicons obtained by the Sanger sequencing method, the strains belonging to the SNP genotype "Pricasp-5" (sel, uro4015) have the following results. In the "sel" target, when aligning the obtained amplicon to the reference sequence of the Y. pestis CO92 genome (NCBI GenBank accession number NC 003143), a nucleotide substitution C>T (Ser135Phe) is observed at gene position 404; In the target "uro4015" at gene position 290, a nucleotide substitution A>C (His97Pro) is observed. The presence of these mutations indicates that the studied strain belongs to the genotype "Pricasp-5" of the phylogenetic branch 2.MED1 of the main subspecies of the medieval biovar Y. pestis. In the other DNA targets, polymorphic nucleotides are not detected. The genotype "Pricasp-5" was encountered in the period 1959-1992 in the Volga-Ural steppe (No. 15), Volga-Ural sandy (No. 16), Ural-Uilsky steppe (No. 17), Ural-Embensky desert (No. 18) plague foci.
Пример 6. Идентификация SNP-генотипа «Pricasp-6» штаммов Y. pestis средневекового биовара филогенетической ветви 2.MED1 из очагов Северного и Северо-Западного Прикаспия методом секвенирования по СэнгеруExample 6. Identification of the SNP genotype "Pricasp-6" of Y. pestis strains of the medieval biovar of the phylogenetic branch 2.MED1 from foci of the Northern and Northwestern Caspian region by the Sanger sequencing method
Исследование штамма Y. pestis проводят аналогично примеру №1. Моноплексные ПЦР осуществляют с праймерами (SEQ ID NO: 1-24), рассчитанными на ДНК мишени, которые составляют девять генотипов «Pricasp-1»-«Pricasp-9». При анализе ампликонов, полученных методом секвенирования по Сэнгеру, штаммы, относящиеся к SNP-генотипу «Pricasp-6» (уро0379, cysJ, gltB), показывают следующие результаты. В мишени «уро0379» при выравнивании полученного ампликона на референсную последовательность генома Y. pestis CO92 (номер доступа в NCBI GenBank NC_003143) в позиции гена 238 наблюдается замена нуклеотида G>A (Val80Met); в мишени «cysJ» в позиции гена 403 наблюдается замена нуклеотида С>Т (Arg135Trp); в мишени «gltB» в позиции гена 1431 наблюдается замена нуклеотида G>T (Lis477Asn). Наличие всех трех мутаций указывает, что исследуемый штамм относится к генотипу «Pricasp-6» филогенетической ветви 2.MED1 основного подвида средневекового биовара Y. pestis. В остальных ДНК мишенях полиморфные нуклеотиды не выявляются. Штаммы этого генотипа выделялись в период 1912-1938 гг. в Прикаспийском Северо-Западном степном (№14), Волго-Уральском песчаном (№16) и в Прикаспийском песчаном (№43).The Y. pestis strain is studied similarly to Example No. 1. Monoplex PCR is carried out with primers (SEQ ID NO: 1-24) designed for the target DNA, which constitute nine genotypes "Pricasp-1" - "Pricasp-9". When analyzing the amplicons obtained by the Sanger sequencing method, the strains belonging to the SNP genotype "Pricasp-6" (uro0379, cysJ, gltB) show the following results. In the target "uro0379", when aligning the obtained amplicon to the reference sequence of the Y. pestis CO92 genome (NCBI GenBank accession number NC_003143), a nucleotide substitution G>A (Val80Met) is observed at gene position 238; In the target "cysJ" at gene position 403, a nucleotide substitution C>T (Arg135Trp) is observed; in the target "gltB" at gene position 1431, a nucleotide substitution G>T (Lis477Asn) is observed. The presence of all three mutations indicates that the studied strain belongs to the genotype "Pricasp-6" of the phylogenetic branch 2.MED1 of the main subspecies of the medieval biovar Y. pestis. In the other DNA targets, polymorphic nucleotides are not detected. Strains of this genotype were isolated in the period 1912-1938 in the Caspian North-West Steppe (No. 14), Volga-Ural Sandy (No. 16) and Caspian Sandy (No. 43).
Пример 7. Идентификация SNP-генотипа «Pricasp-7» штаммов Y. pestis средневекового биовара филогенетической ветви 2.MED1 из очагов Северного и Северо-Западного Прикаспия методом секвенирования по СэнгеруExample 7. Identification of the SNP genotype "Pricasp-7" of Y. pestis strains of the medieval biovar of the phylogenetic branch 2.MED1 from foci of the Northern and Northwestern Caspian region by the Sanger sequencing method
Исследование штамма Y. pestis проводят аналогично примеру №1. Моноплексные ПЦР осуществляют с праймерами (SEQ ID NO: 1-24), рассчитанными на ДНК мишени, которые составляют девять генотипов «Pricasp-1»-«Pricasp-9». При анализе ампликонов, полученных методом секвенирования по Сэнгеру, у штаммов, относящихся к SNP-генотипу «Pricasp-7» (YPO_RS18685, YPO_RS21620), имеются следующие нуклеотидные замены. В мишени «YPO_RS18685» при выравнивании полученного ампликона на референсную последовательность генома Y. pestis CO92 (номер доступа в NCBI GenBank NC_003143) в позиции гена 544 наблюдается замена нуклеотида G>T (Ala182Ser); в мишени «YPO_RS21620» в позиции гена 95 наблюдается замена нуклеотида С>Т (Thr32Ile). Наличие этих мутаций указывает, что исследуемый штамм относится к генотипу «Pricasp-7» филогенетической ветви 2.MED1 основного подвида средневекового биовара Y. pestis. В остальных ДНК мишенях полиморфные нуклеотиды не выявляются. Штаммы этого генотипа выделялись в период 1968-2001 гг.в Центрально-Кавказском высокогорном (№1), Терско-Сунженском низкогорном (№2), Приараксинском низкогорном (№7), Прикаспийском Северо-Западном степном (№14) очагах чумы.The Y. pestis strain is studied similarly to Example No. 1. Monoplex PCR is carried out with primers (SEQ ID NO: 1-24) designed for the target DNA, which constitute nine genotypes "Pricasp-1" - "Pricasp-9". When analyzing the amplicons obtained by the Sanger sequencing method, the strains belonging to the SNP genotype "Pricasp-7" (YPO_RS18685, YPO_RS21620) have the following nucleotide substitutions. In the target "YPO_RS18685", when aligning the obtained amplicon to the reference sequence of the Y. pestis CO92 genome (NCBI GenBank accession number NC_003143), a nucleotide substitution G>T (Ala182Ser) is observed at gene position 544; In the target "YPO_RS21620" at gene position 95, a nucleotide substitution C>T (Thr32Ile) is observed. The presence of these mutations indicates that the studied strain belongs to the genotype "Pricasp-7" of the phylogenetic branch 2.MED1 of the main subspecies of the medieval biovar Y. pestis. In the other DNA targets, polymorphic nucleotides are not detected. Strains of this genotype were isolated in the period 1968-2001 in the Central Caucasus highland (No. 1), Terek-Sunzhensky lowland (No. 2), Priaraksinsky lowland (No. 7), and Caspian Northwestern steppe (No. 14) plague foci.
Пример 8. Идентификация SNP-генотипа «Pricasp-8» штаммов Y. pestis средневекового биовара филогенетической ветви 2.MED1 из очагов Северного и Северо-Западного Прикаспия методом секвенирования по СэнгеруExample 8. Identification of the SNP genotype "Pricasp-8" of Y. pestis strains of the medieval biovar of the phylogenetic branch 2.MED1 from foci of the Northern and Northwestern Caspian region by the Sanger sequencing method
Исследование штамма Y. pestis проводят аналогично примеру №1. Моноплексные ПЦР осуществляют с праймерами (SEQ ID NO: 1-24), рассчитанными на ДНК мишени, которые составляют девять генотипов «Pricasp-1»-«Pricasp-9». При анализе ампликонов, полученных методом секвенирования по Сэнгеру, у штаммов, относящихся к SNP-генотипу «Pricasp-8» (уро0033, ptsP, selenide), имеются следующие нуклеотидные замены. В мишени «уро0033» при выравнивании полученного ампликона на референсную последовательность генома Y. pestis CO92 (номер доступа в NCBI GenBank NC_003143) в позиции гена 496 наблюдается замена нуклеотида С>Т (Arg166Trp); в мишени «ptsP» в позиции гена 275 наблюдается замена нуклеотида А>С (Asp92Ala); в мишени «selenide» в позиции гена 449 наблюдается замена нуклеотида G>T (Gly150Val). Наличие всех трех мутаций указывает, что исследуемый штамм относится к генотипу «Pricasp-8» филогенетической ветви 2.MED1 основного подвида средневекового биовара Y. pestis. В остальных ДНК мишенях полиморфные нуклеотиды не выявляются. В период 1986-1992 гг. этот генотип встречался только у штаммов из Волго-Уральского степного очага чумы (№15).The Y. pestis strain is studied similarly to Example No. 1. Monoplex PCR is carried out with primers (SEQ ID NO: 1-24) designed for the target DNA, which constitute nine genotypes "Pricasp-1" - "Pricasp-9". When analyzing the amplicons obtained by the Sanger sequencing method, the strains belonging to the SNP genotype "Pricasp-8" (uro0033, ptsP, selenide) have the following nucleotide substitutions. In the target "uro0033", when aligning the obtained amplicon to the reference sequence of the Y. pestis CO92 genome (NCBI GenBank accession number NC_003143), a nucleotide substitution C>T (Arg166Trp) is observed at gene position 496; In the target "ptsP" at gene position 275, a nucleotide substitution A>C (Asp92Ala) is observed; in the target "selenide" at gene position 449, a nucleotide substitution G>T (Gly150Val) is observed. The presence of all three mutations indicates that the studied strain belongs to the genotype "Pricasp-8" of the phylogenetic branch 2.MED1 of the main subspecies of the medieval biovar Y. pestis. In the other DNA targets, polymorphic nucleotides are not detected. In the period 1986-1992, this genotype was found only in strains from the Volga-Ural steppe plague focus (No. 15).
Пример 9. Идентификация SNP-генотипа «Pricasp-9» штаммов Y. pestis средневекового биовара филогенетической ветви 2.MED1 из очагов Северного и Северо-Западного Прикаспия методом секвенирования по СэнгеруExample 9. Identification of the SNP genotype "Pricasp-9" of Y. pestis strains of the medieval biovar of the phylogenetic branch 2.MED1 from foci of the Northern and Northwestern Caspian region by the Sanger sequencing method
Исследование штамма Y. pestis проводят аналогично примеру №1. Моноплексные ПЦР осуществляют с праймерами (SEQ ID NO: 1-24), рассчитанными на ДНК мишени, которые составляют девять генотипов «Pricasp-1»-«Pricasp-9». При анализе ампликонов, полученных методом секвенирования по Сэнгеру, штаммы, относящиеся к SNP-генотипу «Pricasp-9» (YPO_RS09555), демонстрируют следующие результаты. В мишени «YPO_RS09555» при выравнивании полученного ампликона на референсную последовательность генома Y. pestis CO92 (номер доступа в NCBI GenBank NC_003143) в позиции гена 1387 наблюдается замена нуклеотида А>Т (Ile463Phe). Наличие данной мутации указывает, что исследуемый штамм относится к генотипу «Pricasp-9» филогенетической ветви 2.MED1 основного подвида средневекового биовара Y. pestis. В остальных ДНК мишенях полиморфные нуклеотиды не выявляются. Данный генотип характерен для штаммов возбудителя для Кобыстанского равнинно-предгорного (№9), Прикаспийского песчаного (№43), Урало-Эмбенского пустынного (№18), Устюртского пустынного (№20) и Мангышлакского пустынного (№23) очагов чумы и выделялся в период 1964-1978 гг.The Y. pestis strain is studied similarly to Example No. 1. Monoplex PCR is carried out with primers (SEQ ID NO: 1-24) designed for the target DNA, which constitute nine genotypes "Pricasp-1" - "Pricasp-9". When analyzing the amplicons obtained by the Sanger sequencing method, the strains belonging to the SNP genotype "Pricasp-9" (YPO_RS09555) demonstrate the following results. In the target "YPO_RS09555", when aligning the obtained amplicon to the reference sequence of the Y. pestis CO92 genome (NCBI GenBank accession number NC_003143), a nucleotide substitution A>T (Ile463Phe) is observed at gene position 1387. The presence of this mutation indicates that the studied strain belongs to the genotype "Pricasp-9" of the phylogenetic branch 2.MED1 of the main subspecies of the medieval biovar Y. pestis. In other DNA targets, polymorphic nucleotides are not detected. This genotype is characteristic of strains of the pathogen for the Kobystan plain-foothill (No. 9), Caspian sandy (No. 43), Ural-Embensky desert (No. 18), Ustyurt desert (No. 20) and Mangyshlak desert (No. 23) plague foci and was isolated in the period 1964-1978.
Таким образом, применение предлагаемого способа идентификации SNP-генотипов штаммов Yersinia pestis средневекового биовара филогенетических ветвей 2.MED1 и 2.MED4 из очагов Северного и Северо-Западного Прикаспия методом секвенирования по Сэнгеру с использованием мишеней «Pricasp-1» (араН, phnL, priA), «Pricasp-2» (narP, radC, ypo0842), «Pricasp-3» (asnA, ssrA), «Pricasp-4» (flgK, ypo1240, ypo1564), «Pricasp-4.1» (hns), «Pricasp-4.2» (tssG), «Pricasp-5» (sel, ypo4015), «Pricasp-6» (ypo0379, cysJ, gltB), «Pricasp-7» (YPO_RS18685, YPO_RS21620), «Pricasp-8» (уро0033, ptsP, selenide), «Pricasp-9» (YPO_RS09555) обеспечивает определение геновариантов штаммов Y. pestis средневекового биовара филогенетических ветвей 2.MED1 и 2.MED4, распространенных в природных очагах Северного и Северо-Западного Прикаспия, по маркерным полиморфным нуклеотидам SNPs, периоду выделения и географической принадлежности. Получение последовательностей генов с маркерными полиморфными нуклеотидами создает основу для создания канонического SNP-профиля (canSNP) для молекулярно-генетической детализации паспортизации очагов, в которых циркулирует этот высоковирулентный средневековый биовар основного подвида Y. pestis. Предлагаемый способ также может повысить эффективность эпидемиологического отслеживания происхождения геноварианта Y. pestis при проведении молекулярно-эпидемиологического мониторинга, а также будет полезен для создания баз данных генотипов штаммов Y. pestis природных очагов Прикаспия и сопредельных очагов чумы.Thus, the application of the proposed method for identifying SNP genotypes of Yersinia pestis strains of the medieval biovar of the phylogenetic branches 2.MED1 and 2.MED4 from the foci of the Northern and Northwestern Caspian region by the Sanger sequencing method using the targets "Pricasp-1" (araH, phnL, priA), "Pricasp-2" (narP, radC, ypo0842), "Pricasp-3" (asnA, ssrA), "Pricasp-4" (flgK, ypo1240, ypo1564), "Pricasp-4.1" (hns), "Pricasp-4.2" (tssG), "Pricasp-5" (sel, ypo4015), "Pricasp-6" (ypo0379, cysJ, gltB), "Pricasp-7" (YPO_RS18685, YPO_RS21620), "Pricasp-8" (uro0033, ptsP, selenide), "Pricasp-9" (YPO_RS09555) provide determination of genovariants of Y. pestis strains of medieval biovar of phylogenetic branches 2.MED1 and 2.MED4, common in natural foci of the Northern and Northwestern Caspian region, by marker polymorphic nucleotides SNPs, isolation period and geographic affiliation. Obtaining gene sequences with marker polymorphic nucleotides creates the basis for creating a canonical SNP profile (canSNP) for molecular genetic detailing of the certification of foci in which this highly virulent medieval biovar of the main subspecies of Y. pestis circulates. The proposed method can also improve the efficiency of epidemiological tracking of the origin of the Y. pestis genovariant during molecular epidemiological monitoring, and will also be useful for creating databases of genotypes of Y. pestis strains from natural foci of the Caspian region and adjacent plague foci.
--->--->
<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?><?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>
<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing <!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing
1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">
<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Primers.xml" <ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Primers.xml"
softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.3.0" softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.3.0"
productionDate="2023-12-25">productionDate="2023-12-25">
<ApplicationIdentification><ApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode> <IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText></ApplicationNumberText> <ApplicationNumberText></ApplicationNumberText>
<FilingDate>2023-12-25</FilingDate> <FilingDate>2023-12-25</FilingDate>
</ApplicationIdentification></ApplicationIdentification>
<ApplicantFileReference>1</ApplicantFileReference> <ApplicantFileReference>1</ApplicantFileReference>
<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное казенное учреждение <ApplicantName languageCode="ru">Federal state institution
науки «Российский научно-исследовательский противочумный институт science "Russian Anti-Plague Research Institute
«Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав "Microbe" of the Federal Service for Supervision of Human Rights Protection
потребителей и благополучия человека</ApplicantName>consumers and human well-being</ApplicantName>
<ApplicantNameLatin>Federal State Institution of Science <ApplicantNameLatin>Federal State Institution of Science
"Russian Research Anti-Plague Institute "Microbe" of "Russian Research Anti-Plague Institute "Microbe" of
the Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and the Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and
Human Welfare</ApplicantNameLatin>Human Welfare</ApplicantNameLatin>
<InventionTitle languageCode="ru">Способ идентификации SNP-генотипов <InventionTitle languageCode="en">Method for identifying SNP genotypes
возбудителя чумы средневекового биовара филогенетических ветвей Plague agent of the medieval biovar of phylogenetic branches
2.MED1 и 2.MED4 из очагов Северного и Северо-Западного Прикаспия 2.MED1 and 2.MED4 from foci of the Northern and Northwestern Caspian region
методом секвенирования по Сэнгеру</InventionTitle>by Sanger sequencing method</InventionTitle>
<SequenceTotalQuantity>48</SequenceTotalQuantity> <SequenceTotalQuantity>48</SequenceTotalQuantity>
<SequenceData sequenceIDNumber="1"> <SequenceData sequenceIDNumber="1">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q2"><INSDQualifier id="q2">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gggaccacgggcaactaaa</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>gggaccacgggcaactaaa</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="2"> <SequenceData sequenceIDNumber="2">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>17</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>17</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..17</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..17</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q4"><INSDQualifier id="q4">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tggctgcctcgatgaat</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>tggctgcctcgatgaat</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="3"> <SequenceData sequenceIDNumber="3">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q6"><INSDQualifier id="q6">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>acgctgctacgctccctcta</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>acgctgctacgctccctcta</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="4"> <SequenceData sequenceIDNumber="4">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q8"><INSDQualifier id="q8">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tgactgacccaaccgaca</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>tgactgacccaaccgaca</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="5"> <SequenceData sequenceIDNumber="5">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q10"> <INSDQualifier id="q10">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tcagccgttgcagcagtt</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>tcagccgttgcagcagtt</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="6"> <SequenceData sequenceIDNumber="6">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q12"> <INSDQualifier id="q12">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ggcgttatggattatggg</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>ggcgttatggattatggg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="7"> <SequenceData sequenceIDNumber="7">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q14"> <INSDQualifier id="q14">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tcgtgttattcgccatgaag</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>tcgtgttattcgccatgaag</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="8"> <SequenceData sequenceIDNumber="8">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q16"> <INSDQualifier id="q16">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tcacctgcgtcgttatcaaa</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>tcacctgcgtcgttatcaaa</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="9"> <SequenceData sequenceIDNumber="9">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q18"> <INSDQualifier id="q18">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>cgggggcaaagcattaca</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>cggggggcaaagcattaca</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="10"> <SequenceData sequenceIDNumber="10">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q20"> <INSDQualifier id="q20">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>cgtattggtgccgtcatcat</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>cgtattggtgccgtcatcat</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="11"> <SequenceData sequenceIDNumber="11">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q22"> <INSDQualifier id="q22">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>atcgttgacgaccatccg</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>atcgttgacgaccatccg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="12"> <SequenceData sequenceIDNumber="12">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q24"> <INSDQualifier id="q24">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ttttaacgtatccagcccg</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>ttttaacgtatccagcccg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="13"> <SequenceData sequenceIDNumber="13">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q26"> <INSDQualifier id="q26">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>agatgctaaaggccgtgaac</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>agatgctaaaggccgtgaac</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="14"> <SequenceData sequenceIDNumber="14">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q28"> <INSDQualifier id="q28">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>atgtcgccgtttaatccag</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>atgtcgccgtttaatccag</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="15"> <SequenceData sequenceIDNumber="15">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q30"> <INSDQualifier id="q30">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ggatggacacgctactgaca</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>ggatggacacgctactgaca</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="16"> <SequenceData sequenceIDNumber="16">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q32"> <INSDQualifier id="q32">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>caaacgacgaaaactacgcac</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>caaacgacgaaaactacgcac</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="17"> <SequenceData sequenceIDNumber="17">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q34"> <INSDQualifier id="q34">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ccggttactcacgccagc</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>ccggttactcacgccagc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="18"> <SequenceData sequenceIDNumber="18">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q36"> <INSDQualifier id="q36">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tcgcggcactgagagaggaa</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>tcgcggcactgagaggaa</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="19"> <SequenceData sequenceIDNumber="19">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q38"> <INSDQualifier id="q38">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tgtcaggcgtcgctcatt</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>tgtcaggcgtcgctcatt</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="20"> <SequenceData sequenceIDNumber="20">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q40"> <INSDQualifier id="q40">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tggcgggataggtggtta</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>tggcgggataggtggtta</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="21"> <SequenceData sequenceIDNumber="21">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q42"> <INSDQualifier id="q42">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ccgctccgctgccctatatca</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>ccgctccgctgccctatatca</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="22"> <SequenceData sequenceIDNumber="22">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q44"> <INSDQualifier id="q44">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>atcacgtaacggacgcggga</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>atcacgtaacggacgcggga</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="23"> <SequenceData sequenceIDNumber="23">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q46"> <INSDQualifier id="q46">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ggtcgttaatgaacgccgcga</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>ggtcgttaatgaacgccgcga</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="24"> <SequenceData sequenceIDNumber="24">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>23</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q48"> <INSDQualifier id="q48">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tcagcggctgtacagtggacatt</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>tcagcggctgtacagtggacatt</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="25"> <SequenceData sequenceIDNumber="25">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q50"> <INSDQualifier id="q50">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tctggtgctgttgcgggtct</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>tctggtgctgttgcgggtct</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="26"> <SequenceData sequenceIDNumber="26">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q52"> <INSDQualifier id="q52">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ccgcagccactgagcaacaa</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>ccgcagccactgagcaacaa</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="27"> <SequenceData sequenceIDNumber="27">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q54"> <INSDQualifier id="q54">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gctattgctattttggggtgg</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>gctattgctattttggggtgg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="28"> <SequenceData sequenceIDNumber="28">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q56"> <INSDQualifier id="q56">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gggttcaggggcatcaat</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>gggttcaggggcatcaat</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="29"> <SequenceData sequenceIDNumber="29">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q58"> <INSDQualifier id="q58">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gaatgccagccgagcgactt</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>gaatgccagccgagcgactt</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="30"> <SequenceData sequenceIDNumber="30">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q60"> <INSDQualifier id="q60">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gctgtgcggtgtggtattga</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>gctgtgcggtgtggtattga</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="31"> <SequenceData sequenceIDNumber="31">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q62"> <INSDQualifier id="q62">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tggtgtctctcgcaatca</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>tggtgtctctcgcaatca</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="32"> <SequenceData sequenceIDNumber="32">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q64"> <INSDQualifier id="q64">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>agacggcaagcaggtgtt</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>agacggcaagcaggtgtt</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="33"> <SequenceData sequenceIDNumber="33">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q66"> <INSDQualifier id="q66">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>cccatcaacttcacgctgt</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>cccatcaacttcacgctgt</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="34"> <SequenceData sequenceIDNumber="34">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q68"> <INSDQualifier id="q68">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tgggtgtggtgcgctatga</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>tgggtgtggtgcgctatga</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="35"> <SequenceData sequenceIDNumber="35">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q70"> <INSDQualifier id="q70">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gccgaaacagacaacgatct</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>gccgaaacagacaacgatct</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="36"> <SequenceData sequenceIDNumber="36">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q72"> <INSDQualifier id="q72">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>cgttgctgtaaccaaactgc</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>cgttgctgtaaccaaactgc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="37"> <SequenceData sequenceIDNumber="37">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q74"> <INSDQualifier id="q74">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>taacggtgtgtataaagcggg</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>taacggtgtgtataaagcggg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="38"> <SequenceData sequenceIDNumber="38">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q76"> <INSDQualifier id="q76">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gcgtagtccataaccgtaaatc</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>gcgtagtccataaccgtaaatc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="39"> <SequenceData sequenceIDNumber="39">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q78"> <INSDQualifier id="q78">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tacgcggctttatctgtgtg</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>tacgcggctttatctgtgtg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="40"> <SequenceData sequenceIDNumber="40">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q80"> <INSDQualifier id="q80">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>caaatgctgctgtgatccg</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>caaatgctgctgtgatccg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="41"> <SequenceData sequenceIDNumber="41">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q82"> <INSDQualifier id="q82">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>taccggcattcaacacca</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>taccggcattcaacacca</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="42"> <SequenceData sequenceIDNumber="42">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q84"> <INSDQualifier id="q84">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>cgaacgattggaaacagct</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>cgaacgattggaaacagct</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="43"> <SequenceData sequenceIDNumber="43">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q86"> <INSDQualifier id="q86">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gtgggagatggcaagagcgt</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>gtgggagatggcaagagcgt</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="44"> <SequenceData sequenceIDNumber="44">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q88"> <INSDQualifier id="q88">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tgcaagtgggctaacgaggc</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>tgcaagtgggctaacgaggc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="45"> <SequenceData sequenceIDNumber="45">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q90"> <INSDQualifier id="q90">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ctattgctattttggggtggc</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>ctattgctattttggggtggc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="46"> <SequenceData sequenceIDNumber="46">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q92"> <INSDQualifier id="q92">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>aagatgccaatgcccaat</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>aagatgccaatgcccaat</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="47"> <SequenceData sequenceIDNumber="47">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q94"> <INSDQualifier id="q94">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>acggctagctgtaccaccgtc</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>acggctagctgtaccaccgtc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="48"> <SequenceData sequenceIDNumber="48">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q96"> <INSDQualifier id="q96">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Yersinia pestis</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tgaggcgaataccagcggca</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>tgaggcgaataccagcggca</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
</ST26SequenceListing></ST26SequenceListing>
<---<---
Claims (4)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2831366C1 true RU2831366C1 (en) | 2024-12-04 |
Family
ID=
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2684231C1 (en) * | 2018-01-22 | 2019-04-04 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека ("РосНИПЧИ "Микроб") | Method of differentiation of yersinia pestis strains of medieval biovar according to phylogenetic affiliation with pcr method with electrophoretic accounting of results |
| CN110592245A (en) * | 2019-10-10 | 2019-12-20 | 中国检验检疫科学研究院 | A kit for rapid detection of Yersinia pestis |
| RU2799415C1 (en) * | 2022-07-22 | 2023-07-05 | Федеральное казенное учреждение науки "Российской научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФКУН Российский противочумный институт "Микроб" Роспотребнадзора) | Method of determining the phylogenetic affiliation of strains of yersinia pestis of the main subspecies by allele-specific pcr in real time |
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2684231C1 (en) * | 2018-01-22 | 2019-04-04 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека ("РосНИПЧИ "Микроб") | Method of differentiation of yersinia pestis strains of medieval biovar according to phylogenetic affiliation with pcr method with electrophoretic accounting of results |
| CN110592245A (en) * | 2019-10-10 | 2019-12-20 | 中国检验检疫科学研究院 | A kit for rapid detection of Yersinia pestis |
| RU2799415C1 (en) * | 2022-07-22 | 2023-07-05 | Федеральное казенное учреждение науки "Российской научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФКУН Российский противочумный институт "Микроб" Роспотребнадзора) | Method of determining the phylogenetic affiliation of strains of yersinia pestis of the main subspecies by allele-specific pcr in real time |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| VOGLER A.J. et al. A review of methods for subtyping Yersinia pestis: From phenotypes to whole genome sequencing, Infect Genet Evol, 2016, v. 37, pp. 21-36. * |
| БАЛЫКОВА А.Н. и др. SNP-профили штаммов Yersinia pestis средневекового биовара из очагов чумы Прикаспия, Проблемы особо опасных инфекций, 2022, Номер 4, стр. 41-49. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP3957753B1 (en) | Polymerase chain reaction primers and probes for mycobacterium tuberculosis | |
| AU2013353904B2 (en) | Method for detecting Helicobacter pylori DNA in a stool sample | |
| US20090263809A1 (en) | Methods for Identification of Bioagents | |
| WO2009049007A2 (en) | Compositions, methods and systems for rapid identification of pathogenic nucleic acids | |
| KR101777161B1 (en) | A Multiplex SNP marker composition and a method for diagnosis or prediction of canine hip dysplasia using same marker | |
| CN105695569A (en) | Multiplex amplification kit containing 33 loca of human genome and application of multiplex amplification kit | |
| Bottero et al. | Differentiation of five tuna species by a multiplex primer-extension assay | |
| Halkilahti et al. | Genotyping of outbreak-associated and sporadic Yersinia pseudotuberculosis strains by novel multilocus variable-number tandem repeat analysis (MLVA) | |
| CN110628920A (en) | Fluorescence labeling multiplex amplification kit for 35 STR loci of human Y chromosome and application thereof | |
| Debruyne et al. | Comparative performance of different PCR assays for the identification of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli | |
| KR101373756B1 (en) | Primers for molecular identification of Staphylococcus aureus and method for identifying Staphylococcus aureus using the same | |
| US20030113757A1 (en) | Rapid and specific detection of campylobacter | |
| Tamerat et al. | Application of molecular diagnostic techniques for the detection of E. coli O157: H7: a review | |
| EP2430185B1 (en) | E. coli o157:h7 specific assay | |
| RU2831366C1 (en) | Method for identification of snp-genotypes of plague agent of medieval biovar of phylogenetic branches 2.med1 and 2.med4 from centers of northern and north-western caspian region by method of sanger sequencing | |
| Moaddeb et al. | Genotyping of the Helicobacter pylori cagA gene isolated from gastric biopsies in Shiraz, Southern Iran: a PCR-RFLP and sequence analysis approach | |
| CN112592989B (en) | A kind of RPA primer and detection method for distinguishing Proteus mirabilis and Salmonella | |
| JP2007274934A (en) | Primer set and method for detecting food poisoning bacterium | |
| RU2736649C1 (en) | Method for genetic differentiation of yersinia pseudotuberculosis strains by molecular-genetic typing | |
| KR102494612B1 (en) | Improved Tm mapping method | |
| RU2644236C1 (en) | Method of genetic typing of yersinia pestis and yersinia pseudotuberculosis based on the analysis of 13 vntr locuses in multiplex pcr reaction | |
| Bae et al. | Molecular genetic analysis of wetland soils | |
| EP3234608B1 (en) | Method for detecting the presence of a hypervirulent clostridium difficile strain | |
| Afanas’ ev et al. | Comparative multilocus VNTR and SNP analysis of Bacillus anthracis vaccine strains | |
| JPH03112498A (en) | Oligonucleotide for Campylobacter detection and detection method using the same |