[go: up one dir, main page]

RU2829934C2 - Binding domain - Google Patents

Binding domain Download PDF

Info

Publication number
RU2829934C2
RU2829934C2 RU2021108917A RU2021108917A RU2829934C2 RU 2829934 C2 RU2829934 C2 RU 2829934C2 RU 2021108917 A RU2021108917 A RU 2021108917A RU 2021108917 A RU2021108917 A RU 2021108917A RU 2829934 C2 RU2829934 C2 RU 2829934C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
domain
gly
ser
cell
arg
Prior art date
Application number
RU2021108917A
Other languages
Russian (ru)
Other versions
RU2021108917A (en
Inventor
Анна БУЛЕК
Мартен Пюле
Шон КОРДОБА
Саймон ТОМАС
Симоби ОНУОХА
Матьё ФЕРРАРИ
Ваниа БАЛДАН
Original Assignee
Отолус Лимитед
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Отолус Лимитед filed Critical Отолус Лимитед
Publication of RU2021108917A publication Critical patent/RU2021108917A/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2829934C2 publication Critical patent/RU2829934C2/en

Links

Abstract

FIELD: biotechnology.
SUBSTANCE: disclosed is a variant antigen-binding domain which contains at least one mutation in the VH domain compared to a reference antibody and which exhibits increased affinity for TRBC2 compared to said reference antibody. Also disclosed is an antibody, a chimeric antigen receptor (CAR) and a bispecific T-cell activator (BiTE), a cell which contains said CAR, and conjugate, containing said variant antigen-binding domain or said antibody. In addition, there are presented versions of application in medicine, methods of diagnostics and methods of personalized medicine, in which the products according to the present invention are used.
EFFECT: group of inventions can be used to treat a T-cell malignant neoplasm selected from T-cell lymphoma or leukemia in a subject.
42 cl, 1 tbl, 9 dwg, 6 ex

Description

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИAREA OF TECHNOLOGY

Настоящее изобретение относится к вариантным антигенсвязывающим доменам, которые специфично связываются с TRBC2 (константной областью 2 бета-цепи Т-клеточного рецептора). Настоящее изобретение также относится к клеткам и агентам, которые можно применять при лечении и диагностике Т-клеточных злокачественных новообразований.The present invention relates to variant antigen-binding domains that specifically bind to TRBC2 (T-cell receptor beta chain constant region 2). The present invention also relates to cells and agents that can be used in the treatment and diagnosis of T-cell malignancies.

Уровень техникиState of the art

Лимфоидные злокачественные новообразования в большинстве случаев можно разделить на имеющие Т-клеточное и В-клеточное происхождение. Т-клеточные злокачественные новообразования представляют собой клинически и биологически гетерогенную группу расстройств, в совокупности составляющих 10-20% неходжкинских лимфом и 20% острых лейкозов. Наиболее часто выявляемыми гистологическими подтипами являются: периферическая Т-клеточная лимфома, неспецифицированная (ПТКЛн); ангиоиммунобластная Т-клеточная лимфома (АИТЛ) и анапластическая крупноклеточная лимфома (АККЛ). Из всех острых лимфобластных лейкозов (ОЛЛ) приблизительно 20% имеют Т-клеточный фенотип.Lymphoid malignancies can be divided in most cases into those of T-cell and B-cell origin. T-cell malignancies are a clinically and biologically heterogeneous group of disorders, collectively accounting for 10-20% of non-Hodgkin lymphomas and 20% of acute leukemias. The most commonly identified histologic subtypes are peripheral T-cell lymphoma, not otherwise specified (PTCLn); angioimmunoblastic T-cell lymphoma (AITL); and anaplastic large cell lymphoma (ALCL). Of all acute lymphoblastic leukemias (ALL), approximately 20% have a T-cell phenotype.

Эти заболевания, как правило, ведут себя агрессивно по сравнению, например, с B-клеточными злокачественными новообразованиями, при этом выживаемость в течение 5 лет составляет всего 30%. В случае Т-клеточной лимфомы, данные заболевания ассоциированы с высокой долей пациентов с диссеминированным заболеванием, неблагоприятным значением Международного прогностического индекса (IPI) и распространенностью экстранодальной формы заболевания. Химиотерапия сама по себе обычно неэффективна, и существующие терапевтические подходы приводят к исцелению менее 30% пациентов.These diseases tend to behave aggressively compared to, for example, B-cell malignancies, with a 5-year survival rate of only 30%. In the case of T-cell lymphoma, these diseases are associated with a high proportion of patients with disseminated disease, an unfavorable International Prognostic Index (IPI) value, and widespread extranodal disease. Chemotherapy alone is usually ineffective, and current therapeutic approaches result in a cure rate of less than 30% of patients.

Кроме того, в отличие от В-клеточных злокачественных новообразований, при которых иммунотерапевтические средства, такие как моноклональное антитело к CD20 ритуксимаб, значительно улучшают результаты, в настоящее время не существует равнозначно эффективного, минимально токсичного иммунотерапевтического средства для лечения Т-клеточных злокачественных новообразований. Серьезной проблемой в разработке иммунотерапевтических средств для Т-клеточных расстройств является значительное частичное совпадение экспрессии маркеров клональных и нормальных Т-клеток, при этом не существует единственного антигена, который позволял бы однозначно идентифицировать клональные (злокачественные) клетки.Furthermore, unlike B-cell malignancies, where immunotherapeutic agents such as the anti-CD20 monoclonal antibody rituximab have significantly improved outcomes, there is currently no equally effective, minimally toxic immunotherapeutic agent for the treatment of T-cell malignancies. A major challenge in developing immunotherapeutic agents for T-cell disorders is the significant overlap in marker expression between clonal and normal T cells, with no single antigen that can uniquely identify clonal (malignant) cells.

Т-клетки c химерными антигенными рецепторами (CAR) показали себя в качестве перспективного средства в лечении рефрактерных В-клеточных злокачественных новообразований. Нацеливание на Т-клеточные злокачественные новообразования, вероятно, будет столь же эффективным, однако применение CAR при таких заболеваниях, как Т-клеточная лимфома, проблематично в связи с недостаточным количеством целевых антигенов. В отличие от В-клеточных лимфом, в которых абляция В-клеточного компартмента представляет собой управляемую токсичность и может лечиться внутривенным введением иммуноглобулина, разрушение Т-клеточного компартмента будет плохо переноситься и приведет к осложнениям, связанным с супрессией клеточно-опосредованного иммунитета.Chimeric antigen receptor (CAR) T cells have shown promise in the treatment of refractory B-cell malignancies. Targeting T-cell malignancies is likely to be equally effective, but CAR use in diseases such as T-cell lymphoma is problematic due to the paucity of targetable antigens. Unlike B-cell lymphomas, where ablation of the B-cell compartment is a manageable toxicity and can be treated with intravenous immunoglobulin, disruption of the T-cell compartment will be poorly tolerated and will lead to complications related to suppression of cell-mediated immunity.

Способ лечения Т-клеточных лимфом и лейкозов, заключающийся в нацеливании на константную область бета-цепи Т-клеточного рецептора (TRBC), был ранее описан в WO2015/132598. Данный подход основан на уникальной особенности Т-клеточного рецептора, т.е. на том, что каждый TCR кодирует или TRBC1, или TRBC2 взаимоисключающим образом. Поскольку Т-клеточные лимфомы и лейкозы представляют собой клональную популяцию клеток, каждая лимфома будет экспрессировать один TCR, с TRBC1 или TRBC2 на поверхности.A method for treating T-cell lymphomas and leukemias by targeting the constant region of the T-cell receptor beta chain (TRBC) was previously described in WO2015/132598. This approach is based on a unique feature of the T-cell receptor, i.e., each TCR encodes either TRBC1 or TRBC2 in a mutually exclusive manner. Since T-cell lymphomas and leukemias are a clonal population of cells, each lymphoma will express one TCR, with either TRBC1 or TRBC2 on its surface.

Моноклональное антитело Jovi-1 специфично связывается с TRBC1 и используется в качестве связывающего домена CAR для лечения Т-клеточных лимфом (Maciocia et al., 2017, Nat Med 23:1416-23; WO2015/132598). Данная предлагаемая терапия позволяет осуществлять лечение субпопуляции пациентов, у которых экспрессируются TCR с константной областью TRBC1.The monoclonal antibody Jovi-1 specifically binds to TRBC1 and is used as a CAR binding domain for the treatment of T-cell lymphomas (Maciocia et al., 2017, Nat Med 23:1416-23; WO2015/132598). This proposed therapy allows for the treatment of a subset of patients expressing TCRs with a TRBC1 constant region.

Для лечения всей популяции пациентов необходимы связывающая молекула/CAR, нацеленные на TRBC2. Одним из способов получения антител, специфичных к TRBC2, является отбор фагов в фаговой библиотеке антител человека. Другой способ состоит в иммунизации животных пептидами, происходящими от TRBC2, с последующим отбором специфичных антител. Оба этих подхода были успешно реализованы, и были созданы различные связывающие молекулы, специфичные для TRBC2, как описано в WO2015/132598.To treat the entire patient population, a binding molecule/CAR targeting TRBC2 is needed. One way to generate antibodies specific to TRBC2 is to select phages from a human antibody phage library. Another way is to immunize animals with TRBC2-derived peptides and then select specific antibodies. Both of these approaches have been successfully implemented and various binding molecules specific to TRBC2 have been generated, as described in WO2015/132598.

В настоящем изобретении предложены альтернативные связывающие молекулы, специфичные для TRBC2, которые можно использовать в качестве терапевтических агентов для лечения TRBC2-положительных.лимфом или лейкозов.The present invention provides alternative binding molecules specific for TRBC2 that can be used as therapeutic agents for the treatment of TRBC2-positive lymphomas or leukemias.

Краткое изложение аспектов изобретенияSummary of aspects of the invention

Авторы настоящего изобретения определили кристаллическую структуру JOVI-1 (Viney et al., 1992, Hybridoma 11:701-13) - моноклонального антитела, специфичного к TRBC1, в комплексе с TRBC1-TCR с разрешением (Фиг. 3). На основании данных о кристаллической структуре, стало возможно модифицировать исходное антитело Jovi-1 так, чтобы оно связывалось с TRBC2. Данный способ является особенно привлекательным, так как ряд аминокислот в составе этого антитела образуют паратоп, который обеспечивает комплементарную форму для которая делает возможным взаимодействие с TCR, в то время как для специфичности к TRBC1 требуется лишь несколько аминокислот. С помощью способов вычислительной биологии и инженерии белков авторы настоящего изобретения, исходя из принципов рациональности, спроектировали мутантные версии связывающих молекул к TRBC1, которые специфичны к TRBC2 и имеют уменьшенную аффинность к TRBC1.The present inventors have determined the crystal structure of JOVI-1 (Viney et al., 1992, Hybridoma 11:701-13), a monoclonal antibody specific for TRBC1, in complex with the TRBC1-TCR at resolution (Fig. 3). Based on the crystal structure data, it was possible to modify the original Jovi-1 antibody to bind to TRBC2. This approach is particularly attractive because several amino acids in this antibody form a paratope that provides a complementary shape for binding to the TCR, whereas specificity for TRBC1 requires only a few amino acids. Using computational biology and protein engineering techniques, we rationally designed mutant versions of TRBC1 binding molecules that are specific for TRBC2 and have reduced affinity for TRBC1.

Таким образом, в первом аспекте настоящего изобретения предложен вариантный антигенсвязывающий домен, который содержит по меньшей мере одну мутацию в домене VH (вариабельный домен тяжелой цепи) по сравнению с эталонным антителом, имеющим домен VH с последовательностью с SEQ ID: 1, и домен VL (вариабельный домен легкой цепи) с последовательностью с SEQ ID: 2, в котором по меньшей мере одна мутация в домене VH выбрана из T28K, Y32K и A100N, причем указанный вариантный антигенсвязывающий домен демонстрирует увеличенную аффинность к TRBC2 по сравнению с указанным эталонным антителом.Thus, in a first aspect of the present invention there is provided a variant antigen-binding domain, which comprises at least one mutation in the VH domain (heavy chain variable domain) compared to a reference antibody having a VH domain with the sequence of SEQ ID: 1, and a VL domain (light chain variable domain) with the sequence of SEQ ID: 2, wherein at least one mutation in the VH domain is selected from T28K, Y32K and A100N, wherein said variant antigen-binding domain exhibits increased affinity for TRBC2 compared to said reference antibody.

Указанный вариантный антигенсвязывающий домен может содержать по меньшей мере две мутации в домене VH, выбранные из T28K, Y32K и A100N. Например, указанный домен может содержать мутации Y32K и A100N. Вариантный антигенсвязывающий домен может дополнительно содержать мутацию T28R в домене VH или, в качестве альтернативы - мутацию G31K в домене VH.Said variant antigen-binding domain may comprise at least two mutations in the VH domain selected from T28K, Y32K and A100N. For example, said domain may comprise the Y32K and A100N mutations. The variant antigen-binding domain may further comprise the T28R mutation in the VH domain or, alternatively, the G31K mutation in the VH domain.

Вариантный антигенсвязывающий домен может содержать мутации T28K, Y32K и A100N.The variant antigen-binding domain may contain the mutations T28K, Y32K and A100N.

Вариантный антигенсвязывающий домен может дополнительно содержать по меньшей мере одну мутацию в положении, выбранном из группы, состоящей из V2, Y27, G31, R98, Y102, N103 и A107 в домене VH, N35 в домене VL и R55 в домене VL.The variant antigen-binding domain may further comprise at least one mutation at a position selected from the group consisting of V2, Y27, G31, R98, Y102, N103 and A107 in the VH domain, N35 in the VL domain and R55 in the VL domain.

По меньшей мере одна дополнительная мутация может быть выбрана из:At least one additional mutation may be selected from:

a) в домене VH:a) in the VH domain:

- V2K, V2R,- V2K, V2R,

- Y27F, Y27M, Y27N, Y27W,- Y27F, Y27M, Y27N, Y27W,

- G31K, G31R, G31S,- G31K, G31R, G31S,

- R98K,- R98K,

- Y102F, Y102L,- Y102F, Y102L,

- N103A, N103E, N103F, N103H, N103L, N103M, N103Q, N103S, N103W, N103Y,- N103A, N103E, N103F, N103H, N103L, N103M, N103Q, N103S, N103W, N103Y,

- A107S,- A107S,

иAnd

b) в домене VL:b) in the VL domain:

- N35M, N35F, N35Y, N35K, N35R, и- N35M, N35F, N35Y, N35K, N35R, and

- R55K.- R55K.

Вариантный антигенсвязывающий домен может быть выбран из вариантных антигенсвязывающих доменов, содержащих следующие комбинации мутаций:The variant antigen-binding domain may be selected from variant antigen-binding domains containing the following combinations of mutations:

- T28K, Y32F, A100N в домене VH и N35K в домене VL,- T28K, Y32F, A100N in the VH domain and N35K in the VL domain,

- T28K, Y32F, A100N в домене VH,- T28K, Y32F, A100N in the VH domain,

- T28K, Y32F, A100N, Y27N в домене VH- T28K, Y32F, A100N, Y27N in the VH domain

- T28K, Y32F, A100N, G31K в домене VH- T28K, Y32F, A100N, G31K in the VH domain

- T28K, Y32F, A100N, Y27M в домене VH- T28K, Y32F, A100N, Y27M in the VH domain

- T28K, Y32F, A100N, Y27W в домене VH- T28K, Y32F, A100N, Y27W in the VH domain

- T28K, Y32F, A100N в домене VH и R55K в домене VL,- T28K, Y32F, A100N in the VH domain and R55K in the VL domain,

- T28K, Y32F, A100N, N103H в домене VH- T28K, Y32F, A100N, N103H in the VH domain

- T28K, Y32F, A100N, N103A в домене VH- T28K, Y32F, A100N, N103A in the VH domain

- T28K, Y32F, A100N, N103Y в домене VH- T28K, Y32F, A100N, N103Y in the VH domain

- T28K, Y32F, A100N в домене VH и N35R в домене VL, - T28K, Y32F, A100N in the VH domain and N35R in the VL domain,

- T28K, Y32F, A100N, N103S в домене VH и N35M в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, N103S in the VH domain and N35M in the VL domain,

- T28K, Y32F, A100N, N103M, в домене VH,- T28K, Y32F, A100N, N103M, in the VH domain,

- T28K, Y32F, A100N, N103W в домене VH и N35R в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, N103W in the VH domain and N35R in the VL domain,

- T28K, Y32F, A100N в домене VH и N35F в домене VL,- T28K, Y32F, A100N in the VH domain and N35F in the VL domain,

- T28K, Y32F, A100N, N103S в домене VH и N35K в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, N103S in the VH domain and N35K in the VL domain,

- T28K, Y32F, A100N, R98K в домене VH,- T28K, Y32F, A100N, R98K in the VH domain,

- T28K, Y32F, A100N, N103S в домене VH и N35R в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, N103S in the VH domain and N35R in the VL domain,

- T28K, Y32F, A100N, N103L в домене VH,- T28K, Y32F, A100N, N103L in the VH domain,

- T28K, Y32F, A100N, N103S в домене VH и N35F в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, N103S in the VH domain and N35F in the VL domain,

- T28K, Y32F, A100N, N103S в домене VH и N35Y в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, N103S in the VH domain and N35Y in the VL domain,

- T28K, Y32F, A100N, N103L в домене VH и N35M в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, N103L in the VH domain and N35M in the VL domain,

- T28K, Y32F, A100N, N103L в домене VH и N35R в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, N103L in the VH domain and N35R in the VL domain,

- T28K, Y32F, A100N, N103W в домене VH и N35K в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, N103W in the VH domain and N35K in the VL domain,

- T28K, Y32F, A100N, N103L в домене VH и N35Y в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, N103L in the VH domain and N35Y in the VL domain,

- T28K, Y32F, A100N, N103F в домене VH,- T28K, Y32F, A100N, N103F in the VH domain,

- T28K, Y32F, A100N, N103W в домене VH,- T28K, Y32F, A100N, N103W in the VH domain,

- T28K, Y32F, A100N, N103L в домене VH и N35K в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, N103L in the VH domain and N35K in the VL domain,

- T28K, Y32F, A100N, N103L в домене VH и N35F в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, N103L in the VH domain and N35F in the VL domain,

- T28K, Y32F, A100N, N103W в домене VH и N35M в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, N103W in the VH domain and N35M in the VL domain,

- T28K, Y32F, A100N, N103F в домене VH и N35Y в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, N103F in the VH domain and N35Y in the VL domain,

- T28K, Y32F, A100N, Y27F в домене VH,- T28K, Y32F, A100N, Y27F in the VH domain,

- T28K, Y32F, A100N, N103Q в домене VH,- T28K, Y32F, A100N, N103Q in the VH domain,

- T28K, Y32F, A100N, N103S в домене VH,- T28K, Y32F, A100N, N103S in the VH domain,

- T28K, Y32F, A100N, N103M в домене VH и N35F в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, N103M in the VH domain and N35F in the VL domain,

- T28K, Y32F, A100N, N103F в домене VH и N35M в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, N103F in the VH domain and N35M in the VL domain,

- T28K, Y32F, A100N, N103F в домене VH и N35F в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, N103F in the VH domain and N35F in the VL domain,

- T28K, Y32F, A100N, G31R в домене VH,- T28K, Y32F, A100N, G31R in the VH domain,

- T28K, Y32F, A100N, N103W в домене VH и N35F в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, N103W in the VH domain and N35F in the VL domain,

- T28K, Y32F, A100N, V2R в домене VH,- T28K, Y32F, A100N, V2R in the VH domain,

- T28K, Y32F, A100N, G31S в домене VH,- T28K, Y32F, A100N, G31S in the VH domain,

- T28K, Y32F, A100N, A107S в домене VH,- T28K, Y32F, A100N, A107S in the VH domain,

- T28K, Y32F, A100N, N103E в домене VH и N35M в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, N103E in the VH domain and N35M in the VL domain,

- T28K, Y32F, A100N, V2K в домене VH,- T28K, Y32F, A100N, V2K in the VH domain,

- T28K, Y32F, A100N, N103E в домене VH- T28K, Y32F, A100N, N103E in the VH domain

- T28K, Y32F, A100N, Y102F, N103M в домене VH и N35K в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, Y102F, N103M in the VH domain and N35K in the VL domain,

- T28K, Y32F, A100N, Y102F, N103M в домене VH и N35F в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, Y102F, N103M in the VH domain and N35F in the VL domain,

- T28K, Y32F, A100N, Y102F, N103M в домене VH и N35R в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, Y102F, N103M in the VH domain and N35R in the VL domain,

- T28K, Y32F, A100N, Y102F в домене VH и N35R в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, Y102F in the VH domain and N35R in the VL domain,

- T28K, Y32F, A100N, N103M в домене VH и N35M в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, N103M in the VH domain and N35M in the VL domain,

- T28K, Y32F, A100N, N103M в домене VH и N35Y в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, N103M in the VH domain and N35Y in the VL domain,

- T28K, Y32F, A100N, N103M в домене VH и N35R в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, N103M in the VH domain and N35R in the VL domain,

- T28K, Y32F, A100N, N103F в домене VH и N35K в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, N103F in the VH domain and N35K in the VL domain,

- T28K, Y32F, A100N, Y102L, N103W в домене VH и N35R в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, Y102L, N103W in the VH domain and N35R in the VL domain,

- T28K, Y32F, A100N, Y102L, N103W в домене VH и N35K в домене VL, - T28K, Y32F, A100N, Y102L, N103W in the VH domain and N35K in the VL domain,

- T28K, Y32F, A100N, Y102F в домене VH, и- T28K, Y32F, A100N, Y102F in the VH domain, and

- T28K, Y32F, A100N, Y102L, N103M в домене VH и N35R в домене VL.- T28K, Y32F, A100N, Y102L, N103M in the VH domain and N35R in the VL domain.

Вариантный антигенсвязывающий домен может содержать мутации T28K, Y32F, A100N в домене VH и мутацию N35K в домене VL.The variant antigen-binding domain may contain the T28K, Y32F, A100N mutations in the VH domain and the N35K mutation in the VL domain.

Вариантный антигенсвязывающий домен может содержать мутации T28K, Y32F и A100N в домене VH.The variant antigen-binding domain may contain the T28K, Y32F and A100N mutations in the VH domain.

Вариантный антигенсвязывающий домен может дополнительно демонстрировать уменьшенную аффинность к TRBC1 по сравнению с эталонным антителом.The variant antigen-binding domain may additionally exhibit reduced affinity for TRBC1 compared to the reference antibody.

Отношение аффинности вариантного антигенсвязывающего домена к TRBC2 и к TRBC1 должно быть не менее 2.The affinity ratio of the variant antigen-binding domain to TRBC2 and to TRBC1 must be at least 2.

Отношение аффинности вариантного антигенсвязывающего домена к TRBC2 и к TRBC1 должно быть не менее 5.The affinity ratio of the variant antigen-binding domain to TRBC2 and to TRBC1 should be at least 5.

Отношение аффинности вариантного антигенсвязывающего домена к TRBC2 и к TRBC1 должно быть не менее 10.The affinity ratio of the variant antigen-binding domain to TRBC2 and to TRBC1 should be at least 10.

Вариантный антигенсвязывающий домен может дополнительно содержать домен олигомеризации.The variant antigen-binding domain may further comprise an oligomerization domain.

Во втором аспекте настоящего изобретения предложено антитело, содержащее вариантный антигенсвязывающий домен в соответствии с первым аспектом настоящего изобретения.In a second aspect of the present invention there is provided an antibody comprising a variant antigen-binding domain according to the first aspect of the present invention.

В третьем аспекте настоящего изобретения предложен химерный антигенный рецептор (CAR), содержащий вариантный антигенсвязывающий домен по первому аспекту настоящего изобретения, спейсер, трансмембранный домен и эндодомен.In a third aspect of the present invention, there is provided a chimeric antigen receptor (CAR) comprising a variant antigen-binding domain according to the first aspect of the present invention, a spacer, a transmembrane domain and an endodomain.

Спейсер может быть выбран из следующих: «стебель» CD8 человека, представленный в SEQ ID: 7, и спейсер COMP (олигомерного матриксного белка хряща), представленный в SEQ ID: 19.The spacer may be selected from the following: the human CD8 stalk as shown in SEQ ID: 7 and the COMP (cartilage oligomeric matrix protein) spacer as shown in SEQ ID: 19.

В четвертом аспекте настоящего изобретения предложен биспецифичный активатор Т-клеток (BiTE), содержащий вариантный антигенсвязывающий домен по первому аспекту настоящего изобретения и домен активации Т-клеток.In a fourth aspect, the present invention provides a bispecific T cell activator (BiTE) comprising a variant antigen binding domain according to the first aspect of the present invention and a T cell activation domain.

В пятом аспекте настоящего изобретения предложена последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая вариантный антигенсвязывающий домен по первому аспекту настоящего изобретения, антитело по второму аспекту настоящего изобретения, CAR по третьему аспекту настоящего изобретения, или BiTE по четвертому аспекту настоящего изобретения. In a fifth aspect, the present invention provides a nucleic acid sequence encoding a variant antigen-binding domain of the first aspect of the present invention, an antibody of the second aspect of the present invention, a CAR of the third aspect of the present invention, or a BiTE of the fourth aspect of the present invention.

В шестом аспекте настоящего изобретения предложен вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты по пятому аспекту настоящего изобретения.In a sixth aspect of the present invention, there is provided a vector comprising a nucleic acid sequence according to the fifth aspect of the present invention.

В седьмом аспекте настоящего изобретения предложена клетка, которая содержит CAR по третьему аспекту настоящего изобретения.In a seventh aspect of the present invention, there is provided a cell that comprises a CAR according to the third aspect of the present invention.

В восьмом аспекте настоящего изобретения предложен способ получения клетки по седьмому аспекту настоящего изобретения, включающий этап трансдукции или трансфекции клетки вектором по шестому аспекту настоящего изобретения, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую CAR.In an eighth aspect of the present invention, there is provided a method for producing a cell according to the seventh aspect of the present invention, comprising the step of transducing or transfecting the cell with a vector according to the sixth aspect of the present invention, which comprises a nucleic acid sequence encoding a CAR.

В девятом аспекте настоящего изобретения предложен конъюгат, содержащий вариантный антигенсвязывающий домен по первому аспекту настоящего изобретения или антитело по второму аспекту настоящего изобретения, и детектируемый компонент или химиотерапевтический компонент.In a ninth aspect of the present invention there is provided a conjugate comprising a variant antigen-binding domain according to the first aspect of the present invention or an antibody according to the second aspect of the present invention, and a detectable component or a chemotherapeutic component.

Данный конъюгат может содержать химиотерапевтический компонент.This conjugate may contain a chemotherapeutic component.

В десятом аспекте настоящего изобретения предложен способ лечения Т-клеточных лимфомы или лейкоза у субъекта, включающий этап введения клетки по седьмому аспекту настоящего изобретения или антитела по второму аспекту настоящего изобретения, или BiTE по четвертому аспекту настоящего изобретения, или конъюгата по девятому аспекту настоящего изобретения субъекту, в организме которого злокачественные Т-клетки экспрессируют TRBC2.In a tenth aspect of the present invention, there is provided a method of treating T-cell lymphoma or leukemia in a subject, comprising the step of administering a cell of the seventh aspect of the present invention or an antibody of the second aspect of the present invention, or a BiTE of the fourth aspect of the present invention, or a conjugate of the ninth aspect of the present invention to a subject in whose body malignant T cells express TRBC2.

Т-клеточные лимфома или лейкоз могут быть выбраны из следующего: неспецифицированная периферическая Т-клеточная лимфома (ПТКЛн); ангиоиммунобластная Т-клеточная лимфома (АИТЛ), анапластическая крупноклеточная лимфома (АККЛ), Т-клеточная лимфома, ассоциированная с энтеропатией (EATL), гепатолиенальная Т-клеточная лимфома (ГЛТЛ), экстранодальная NK/T-клеточная лимфома назального типа, Т-клеточная лимфома кожи, первичная АККЛ кожи, Т-клеточный пролимфоцитарный лейкоз и Т-клеточный острый лимфобластный лейкоз.The T-cell lymphoma or leukemia may be selected from the following: peripheral T-cell lymphoma of unspecified type (PTCLn); angioimmunoblastic T-cell lymphoma (AITL), anaplastic large cell lymphoma (ALCL), enteropathy-associated T-cell lymphoma (EATL), hepatosplenic T-cell lymphoma (HTL), extranodal NK/T-cell lymphoma of nasal type, cutaneous T-cell lymphoma, primary cutaneous ALCL, T-cell prolymphocytic leukemia, and T-cell acute lymphoblastic leukemia.

В одиннадцатом аспекте настоящего изобретения предложена клетка по седьмому аспекту настоящего изобретения или антитело по второму аспекту настоящего изобретения, или BiTE по четвертому аспекту настоящего изобретения, или конъюгат по девятому аспекту настоящего изобретения для применения в медицине.In an eleventh aspect of the present invention there is provided a cell according to the seventh aspect of the present invention, or an antibody according to the second aspect of the present invention, or a BiTE according to the fourth aspect of the present invention, or a conjugate according to the ninth aspect of the present invention for use in medicine.

В двенадцатом аспекте настоящего изобретения предложена клетка по седьмому аспекту настоящего изобретения или антитело по второму аспекту настоящего изобретения, или BiTE по четвертому аспекту настоящего изобретения, или конъюгат по девятому аспекту настоящего изобретения для применения в лечении Т-клеточных лимфомы или лейкоза, при которой(ом) злокачественные Т-клетки экспрессируют TRBC2.In a twelfth aspect of the present invention, there is provided a cell according to the seventh aspect of the present invention, or an antibody according to the second aspect of the present invention, or a BiTE according to the fourth aspect of the present invention, or a conjugate according to the ninth aspect of the present invention for use in the treatment of T-cell lymphoma or leukemia, in which the malignant T-cells express TRBC2.

Т-клеточные лимфома или лейкоз могут быть выбраны из следующего: неспецифицированная периферическая Т-клеточная лимфома (ПТКЛн); ангиоиммунобластная Т-клеточная лимфома (АИТЛ), анапластическая крупноклеточная лимфома (АККЛ), Т-клеточная лимфома, ассоциированная с энтеропатией (EATL), гепатолиенальная Т-клеточная лимфома (ГЛТЛ), экстранодальная NK/T-клеточная лимфома назального типа, Т-клеточная лимфома кожи, первичная АККЛ кожи, Т-клеточный пролимфоцитарный лейкоз и Т-клеточный острый лимфобластный лейкоз.The T-cell lymphoma or leukemia may be selected from the following: peripheral T-cell lymphoma of unspecified type (PTCLn); angioimmunoblastic T-cell lymphoma (AITL), anaplastic large cell lymphoma (ALCL), enteropathy-associated T-cell lymphoma (EATL), hepatosplenic T-cell lymphoma (HTL), extranodal NK/T-cell lymphoma of nasal type, cutaneous T-cell lymphoma, primary cutaneous ALCL, T-cell prolymphocytic leukemia, and T-cell acute lymphoblastic leukemia.

В тринадцатом аспекте настоящего изобретения предложено применение клетки по седьмому аспекту настоящего изобретения или антитела по второму аспекту настоящего изобретения, или BiTE по четвертому аспекту настоящего изобретения, или конъюгата по девятому аспекту настоящего изобретения при изготовлении лекарственного средства для лечения Т-клеточных лимфомы или лейкоза, при которой(ом) злокачественные Т-клетки экспрессируют TRBC2.In a thirteenth aspect of the present invention, there is provided the use of a cell according to the seventh aspect of the present invention, or an antibody according to the second aspect of the present invention, or a BiTE according to the fourth aspect of the present invention, or a conjugate according to the ninth aspect of the present invention in the manufacture of a medicament for the treatment of T-cell lymphoma or leukemia, in which the malignant T-cells express TRBC2.

Т-клеточные лимфома или лейкоз могут быть выбраны из следующего: неспецифицированная периферическая Т-клеточная лимфома (ПТКЛн); ангиоиммунобластная Т-клеточная лимфома (АИТЛ), анапластическая крупноклеточная лимфома (АККЛ), Т-клеточная лимфома, ассоциированная с энтеропатией (EATL), гепатолиенальная Т-клеточная лимфома (ГЛТЛ), экстранодальная NK/T-клеточная лимфома назального типа, Т-клеточная лимфома кожи, первичная АККЛ кожи, Т-клеточный пролимфоцитарный лейкоз и Т-клеточный острый лимфобластный лейкоз.The T-cell lymphoma or leukemia may be selected from the following: peripheral T-cell lymphoma of unspecified type (PTCLn); angioimmunoblastic T-cell lymphoma (AITL), anaplastic large cell lymphoma (ALCL), enteropathy-associated T-cell lymphoma (EATL), hepatosplenic T-cell lymphoma (HTL), extranodal NK/T-cell lymphoma of nasal type, cutaneous T-cell lymphoma, primary cutaneous ALCL, T-cell prolymphocytic leukemia, and T-cell acute lymphoblastic leukemia.

В четырнадцатом аспекте настоящего изобретения предложен диагностический агент, который содержит вариантный антигенсвязывающий домен по первому аспекту настоящего изобретения или антитело по второму аспекту настоящего изобретения.In a fourteenth aspect of the present invention, there is provided a diagnostic agent which comprises a variant antigen-binding domain according to the first aspect of the present invention or an antibody according to the second aspect of the present invention.

Данный диагностический агент может быть предназначен для диагностики Т-клеточных лимфомы или лейкоза.This diagnostic agent may be used to diagnose T-cell lymphoma or leukemia.

Т-клеточные лимфома или лейкоз могут быть выбраны из следующего: неспецифицированная периферическая Т-клеточная лимфома (ПТКЛн); ангиоиммунобластная Т-клеточная лимфома (АИТЛ), анапластическая крупноклеточная лимфома (АККЛ), Т-клеточная лимфома, ассоциированная с энтеропатией (EATL), гепатолиенальная Т-клеточная лимфома (ГЛТЛ), экстранодальная NK/T-клеточная лимфома назального типа, Т-клеточная лимфома кожи, первичная АККЛ кожи, Т-клеточный пролимфоцитарный лейкоз и Т-клеточный острый лимфобластный лейкоз.The T-cell lymphoma or leukemia may be selected from the following: peripheral T-cell lymphoma of unspecified type (PTCLn); angioimmunoblastic T-cell lymphoma (AITL), anaplastic large cell lymphoma (ALCL), enteropathy-associated T-cell lymphoma (EATL), hepatosplenic T-cell lymphoma (HTL), extranodal NK/T-cell lymphoma of nasal type, cutaneous T-cell lymphoma, primary cutaneous ALCL, T-cell prolymphocytic leukemia, and T-cell acute lymphoblastic leukemia.

В пятнадцатом аспекте настоящего изобретения предложен способ диагностики Т-клеточной лимфомы или лейкоза у субъекта, включающий этап приведения в контакт вариантного антигенсвязывающего домена по первому аспекту настоящего изобретения или антитела по второму аспекту настоящего изобретения с содержащим Т-клетки образцом, полученным у данного субъекта.In a fifteenth aspect of the present invention, there is provided a method for diagnosing T-cell lymphoma or leukemia in a subject, comprising the step of contacting a variant antigen-binding domain of the first aspect of the present invention or an antibody of the second aspect of the present invention with a T-cell-containing sample obtained from the subject.

Способ диагностики Т-клеточных лимфомы или лейкоза у субъекта может дополнительно включать этап определения процентной доли TRBC2-положительных Т-клеток в образце.The method for diagnosing T-cell lymphoma or leukemia in a subject may further include the step of determining the percentage of TRBC2-positive T cells in the sample.

Процент, составляющий 70% или более TRBC2-положительных Т-клеток в образце может указывать на наличие Т-клеточных лимфомы или лейкоза.A percentage of 70% or more TRBC2-positive T cells in a sample may indicate the presence of T-cell lymphoma or leukemia.

Образец может представлять собой образец крови или может быть получен из него.The sample may be a blood sample or may be obtained from a blood sample.

Т-клеточные лимфома или лейкоз могут быть выбраны из следующего: неспецифицированная периферическая Т-клеточная лимфома (ПТКЛн); ангиоиммунобластная Т-клеточная лимфома (АИТЛ), анапластическая крупноклеточная лимфома (АККЛ), Т-клеточная лимфома, ассоциированная с энтеропатией (EATL), гепатолиенальная Т-клеточная лимфома (ГЛТЛ), экстранодальная NK/T-клеточная лимфома назального типа, Т-клеточная лимфома кожи, первичная АККЛ кожи, Т-клеточный пролимфоцитарный лейкоз и Т-клеточный острый лимфобластный лейкоз.The T-cell lymphoma or leukemia may be selected from the following: peripheral T-cell lymphoma of unspecified type (PTCLn); angioimmunoblastic T-cell lymphoma (AITL), anaplastic large cell lymphoma (ALCL), enteropathy-associated T-cell lymphoma (EATL), hepatosplenic T-cell lymphoma (HTL), extranodal NK/T-cell lymphoma of nasal type, cutaneous T-cell lymphoma, primary cutaneous ALCL, T-cell prolymphocytic leukemia, and T-cell acute lymphoblastic leukemia.

В шестнадцатом аспекте настоящего изобретения предложен способ идентификации субъектов с Т-клеточными лимфомой или лейкозом, соответствующих критериям для лечения с применением клетки по седьмому аспекту настоящего изобретения или антитела по второму аспекту настоящего изобретения, или BiTE по четвертому аспекту настоящего изобретения, или конъюгата по девятому аспекту настоящего изобретения, включающий определение процента TRBC2-положительных Т-клеток в полученном от субъекта образце, содержащем Т-клетки.In a sixteenth aspect of the present invention, there is provided a method for identifying subjects with T-cell lymphoma or leukemia who meet the criteria for treatment using a cell according to the seventh aspect of the present invention or an antibody according to the second aspect of the present invention, or a BiTE according to the fourth aspect of the present invention, or a conjugate according to the ninth aspect of the present invention, comprising determining the percentage of TRBC2-positive T-cells in a sample containing T-cells obtained from the subject.

Субъект может соответствовать критериям для вышеуказанного лечения с применением клетки по седьмому аспекту настоящего изобретения или антитела по второму аспекту настоящего изобретения, или BiTE по четвертому аспекту настоящего изобретения, или конъюгата по девятому аспекту настоящего изобретения, если процент TRBC2-положительных Т-клеток в образце составляет 70% или более. A subject may meet the criteria for the above treatment using a cell of the seventh aspect of the present invention or an antibody of the second aspect of the present invention, or a BiTE of the fourth aspect of the present invention, or a conjugate of the ninth aspect of the present invention, if the percentage of TRBC2-positive T cells in the sample is 70% or more.

Образец может представлять собой образец крови или может быть получен из него.The sample may be a blood sample or may be obtained from a blood sample.

Т-клеточные лимфома или лейкоз могут быть выбраны из следующего: неспецифицированная периферическая Т-клеточная лимфома (ПТКЛн); ангиоиммунобластная Т-клеточная лимфома (АИТЛ), анапластическая крупноклеточная лимфома (АККЛ), Т-клеточная лимфома, ассоциированная с энтеропатией (EATL), гепатолиенальная Т-клеточная лимфома (ГЛТЛ), экстранодальная NK/T-клеточная лимфома назального типа, Т-клеточная лимфома кожи, первичная АККЛ кожи, Т-клеточный пролимфоцитарный лейкоз и Т-клеточный острый лимфобластный лейкоз.The T-cell lymphoma or leukemia may be selected from the following: peripheral T-cell lymphoma of unspecified type (PTCLn); angioimmunoblastic T-cell lymphoma (AITL), anaplastic large cell lymphoma (ALCL), enteropathy-associated T-cell lymphoma (EATL), hepatosplenic T-cell lymphoma (HTL), extranodal NK/T-cell lymphoma of nasal type, cutaneous T-cell lymphoma, primary cutaneous ALCL, T-cell prolymphocytic leukemia, and T-cell acute lymphoblastic leukemia.

В семнадцатом аспекте настоящего изобретения предложен способ выбора терапии, включающей клетку по седьмому аспекту настоящего изобретения или антитело по второму аспекту настоящего изобретения, или BiTE по четвертому аспекту настоящего изобретения, или конъюгат по девятому аспекту настоящего изобретения для лечения субъекта, включающий определение процентной доли TRBC2-положительных Т-клеток в полученном от указанного субъекта образце, содержащем Т-клетки.In a seventeenth aspect of the present invention, there is provided a method for selecting a therapy comprising a cell of the seventh aspect of the present invention or an antibody of the second aspect of the present invention, or a BiTE of the fourth aspect of the present invention, or a conjugate of the ninth aspect of the present invention for treating a subject, comprising determining the percentage of TRBC2-positive T cells in a sample containing T cells obtained from said subject.

Указанная терапия может быть выбрана для лечения указанного субъекта, если процент TRBC2-положительных Т-клеток в образце составляет 70% или более.The indicated therapy may be selected for treatment of the indicated subject if the percentage of TRBC2-positive T cells in the sample is 70% or more.

Образец может представлять собой образец крови или может быть получен из него.The sample may be a blood sample or may be obtained from a blood sample.

Т-клеточные лимфома или лейкоз могут быть выбраны из следующего: неспецифицированная периферическая Т-клеточная лимфома (ПТКЛн); ангиоиммунобластная Т-клеточная лимфома (АИТЛ), анапластическая крупноклеточная лимфома (АККЛ), Т-клеточная лимфома, ассоциированная с энтеропатией (EATL), гепатолиенальная Т-клеточная лимфома (ГЛТЛ), экстранодальная NK/T-клеточная лимфома назального типа, Т-клеточная лимфома кожи, первичная АККЛ кожи, Т-клеточный пролимфоцитарный лейкоз и Т-клеточный острый лимфобластный лейкоз.The T-cell lymphoma or leukemia may be selected from the following: peripheral T-cell lymphoma of unspecified type (PTCLn); angioimmunoblastic T-cell lymphoma (AITL), anaplastic large cell lymphoma (ALCL), enteropathy-associated T-cell lymphoma (EATL), hepatosplenic T-cell lymphoma (HTL), extranodal NK/T-cell lymphoma of nasal type, cutaneous T-cell lymphoma, primary cutaneous ALCL, T-cell prolymphocytic leukemia, and T-cell acute lymphoblastic leukemia.

Описание ЧЕРТЕЖЕЙDescription of DRAWINGS

Фиг. 1. Схема комплекса Т-клеточный рецептор αβ/CD3.Fig. 1. Scheme of the T-cell receptor αβ/CD3 complex.

Т-клеточный рецептор формируется из 6 различных белковых цепей, сборка которых происходит в эндоплазматическом ретикулуме, чтобы они экспрессировались на поверхности клеток. Четыре белка комплекса CD3 (CD3ζ, CD3γ, CD3ε и CD3ε) формируют окружение Т-клеточного рецептора (TCR). Указанный TCR придает комплексу специфичность к определенному антигену и состоит из двух цепей: TCRα и TCRβ. Каждая цепь TCR имеет вариабельный участок, дистальный по отношению к мембране, и константный участок, проксимальный по отношению к мембране. Почти все Т-клеточные лимфомы и многие Т-клеточные лейкозы экспрессируют комплекс TCR/CD3.The T cell receptor is made up of six different protein chains that assemble in the endoplasmic reticulum to be expressed on the cell surface. The four proteins of the CD3 complex (CD3ζ, CD3γ, CD3ε, and CD3ε) form the T cell receptor (TCR) environment. The TCR confers specificity to a particular antigen on the complex and consists of two chains: TCRα and TCRβ. Each TCR chain has a variable region distal to the membrane and a constant region proximal to the membrane. Almost all T cell lymphomas and many T cell leukemias express the TCR/CD3 complex.

Фиг. 2: Сегрегация константной области β-цепи Т-клеточного рецептора (TRBC)-1 и TRBC2 во время реаранжировки Т-клеточного рецептора. Каждая бета-цепь TCR формируется в результате геномной рекомбинации конкретных вариабельной (variable; V), обеспечивающей разнообразие (diversity; D), соединительной (joining; J) и константной (TRBC) областей бета-цепи. Геном человека содержит два очень похожих и функционально эквивалентных локуса TRBC, известных как TRBC1 и TRBC2. Во время реаранжировки генов TCR происходит рекомбинация J-области с TRBC1 или TRBC2. Данная реаранжировка является постоянной. Т-клетки экспрессируют множество копий одного TCR на своей поверхности, следовательно, каждая Т-клетка будет экспрессировать TCR, константная область β-цепи которого кодируется или TRBC1, или TRBC2. Fig. 2: Segregation of the T cell receptor β-chain constant region (TRBC)-1 and TRBC2 during T cell receptor rearrangement. Each TCR β-chain is formed by genomic recombination of specific variable (V), diversity (D), joining (J), and constant (TRBC) regions of the β-chain. The human genome contains two highly similar and functionally equivalent TRBC loci, known as TRBC1 and TRBC2. During TCR gene rearrangement, the J region recombines with either TRBC1 or TRBC2. This rearrangement is permanent. T cells express multiple copies of a single TCR on their surface, so each T cell will express a TCR whose β-chain constant region is encoded by either TRBC1 or TRBC2.

Фиг. 3. Структурная область контакта между бета-цепью TCR и фрагментом Fab антитела Jovi-1, специфичного к TRBC1. Fig. 3. Structural region of contact between the TCR beta chain and the Fab fragment of the Jovi-1 antibody specific for TRBC1.

Фиг. 4. Схема структуры химерных антигенных рецепторов (CAR), специфичных к TRBC1 и TRBC2. Fig. 4. Schematic structure of chimeric antigen receptors (CARs) specific for TRBC1 and TRBC2.

Фиг. 5. Функциональная характеристика CAR к TRBC2. Fig. 5. Functional characteristics of CAR to TRBC2.

Продуцирование IFN-γ (A) содержащим три мутации CAR к TRBC2 и (B) CAR к TRBC1, инкубированным в присутствии TRBC1 или TRBC2.IFN-γ production by (A) a triple-mutant anti-TRBC2 CAR and (B) an anti-TRBC1 CAR incubated in the presence of TRBC1 or TRBC2.

Фиг. 6. Цитотоксическая активность (A) T-клеток с содержащим три мутации CAR к TRBC2 и (B) Т-клеток с CAR к TRBC1, совместно инкубированных с клетками Raji WT, Raji TRBC1+ или Raji TRBC2+. Fig. 6. Cytotoxic activity of (A) T cells bearing the triple-mutant anti-TRBC2 CAR and (B) T cells bearing the anti-TRBC1 CAR co-incubated with Raji WT, Raji TRBC1 +, or Raji TRBC2 + cells.

Фигура 7. Антиген-специфичная активация клеток Jurkat, трансдуцированных CAR против TRBC2, которые были совместно инкубированы с клетками HPB (периферической крови человека) с TRBC1 и HPB с TRBC2. Клетки Jurkat (TRBC1+) трансдуцировали конструкциями CAR против TRBC2 второго поколения и совместно инкубировали с клетками HPB с TRBC1 и HPB с TRBC2 при соотношении Э:М (эффектор:мишень) 1:1. Контрольные группы включали нетрансдуцированные клетки Jurkat (NT), клетки HPB-ALL (клетки периферической крови человека, полученные при остром лимфобластном лейкозе) с нокаутом TCR (обозначены: HPB KO) и трансдуцированные клетки Jurkat, посеянные в чистом виде в качестве отрицательного контроля, или с антителами αCD3/αCD28 - в качестве положительного контроля для анализа, соответственно. N35K: связывающая молекула, имеющая мутации T28K, Y32F, A100N в домене VH и N35K в домене VL антитела hJovi-1; N103L: связывающая молекула, имеющая мутации T28K, Y32F, A100N, N103L в домене VH антитела hJovi-1; N103M-N35Y: связывающая молекула, имеющая мутации T28K, Y32F, A100N, N103M в домене VH и N35Y в домене VL антитела hJovi-1; Y102F-N103M-N35R: связывающая молекула, имеющая мутации T28K, Y32F, A100N, Y102F, N103M в домене VH и N35R в домене VL антитела hJovi-1; и Y102L-N103M-N35R: связывающая молекула, имеющая мутации T28K, Y32F, A100N, Y102L, N103M в домене VH и N35R в домене VL антитела hJovi-1. Figure 7. Antigen-specific activation of Jurkat cells transduced with anti-TRBC2 CAR that were co-incubated with TRBC1-depleted HPB and TRBC2-depleted HPB cells. Jurkat cells (TRBC1 + ) were transduced with the second-generation anti-TRBC2 CAR constructs and co-incubated with TRBC1-depleted HPB and TRBC2-depleted HPB cells at an E:T (effector:target) ratio of 1:1. Control groups included untransduced Jurkat cells (NT), TCR knockout HPB-ALL (human peripheral blood acute lymphoblastic leukemia-derived cells) cells (denoted: HPB KO), and transduced Jurkat cells seeded alone as a negative control or with αCD3/αCD28- antibodies as a positive control for the assay, respectively. N35K: a binding molecule having the T28K, Y32F, A100N mutations in the VH domain and N35K in the VL domain of hJovi-1 antibody; N103L: a binding molecule having the T28K, Y32F, A100N, N103L mutations in the VH domain of hJovi-1 antibody; N103M-N35Y: a binding molecule having the T28K, Y32F, A100N, N103M mutations in the VH domain and N35Y in the VL domain of hJovi-1 antibody; Y102F-N103M-N35R: a binding molecule having the T28K, Y32F, A100N, Y102F, N103M mutations in the VH domain and N35R in the VL domain of hJovi-1 antibody; and Y102L-N103M-N35R: a binding molecule having the mutations T28K, Y32F, A100N, Y102L, N103M in the VH domain and N35R in the VL domain of the hJovi-1 antibody.

Фиг. 8. Цитотоксическая активность T-клеток с CAR к TRBC2, инкубированных совместно с клетками TRBC1+HPB-ALL и TRBC2+HPB-ALL. Мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) трансдуцировали конструкциями CAR против TRBC2 второго поколения. Трансдуцированные МКПК инкубировали совместно с клетками TRBC1+HPB-ALL и TRBC2+HPB-ALL при соотношении Э:М 1:2. Контрольные группы включали нетрансдуцированные клетки (NT), клетки, трансдуцированные CAR против TRBC1 hJovi-1 (JOVI), и клетки HPB-ALL с нокаутированным TCR (HPB-KO). N35K: связывающая молекула, имеющая мутации T28K, Y32F, A100N в домене VH и N35K в домене VL антитела hJovi-1; N103L: связывающая молекула, имеющая мутации T28K, Y32F, A100N, N103L в домене VH антитела hJovi-1; N103M-N35Y: связывающая молекула, имеющая мутации T28K, Y32F, A100N, N103M в домене VH и N35Y в домене VL антитела hJovi-1; Y102F-N103M-N35R: связывающая молекула, имеющая мутации T28K, Y32F, A100N, Y102F, N103M в домене VH и N35R в домене VL антитела hJovi-1; и Y102L-N103M-N35R: связывающая молекула, имеющая мутации T28K, Y32F, A100N, Y102L, N103M в домене VH и N35R в домене VL антитела hJovi-1. Fig. 8. Cytotoxic activity of anti-TRBC2 CAR T cells co-incubated with TRBC1+HPB-ALL and TRBC2+HPB-ALL cells. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were transduced with the second-generation anti-TRBC2 CAR constructs. Transduced PBMCs were co-incubated with TRBC1+HPB-ALL and TRBC2+HPB-ALL cells at an E:M ratio of 1:2. Control groups included non-transduced cells (NT), cells transduced with anti-TRBC1 hJovi-1 CAR (JOVI), and HPB-ALL cells with knocked-out TCR (HPB-KO). N35K: a binding molecule bearing the T28K, Y32F, A100N mutations in the VH domain and N35K in the VL domain of hJovi-1 antibody; N103L: a binding molecule having the T28K, Y32F, A100N, N103L mutations in the VH domain of the hJovi-1 antibody; N103M-N35Y: a binding molecule having the T28K, Y32F, A100N, N103M mutations in the VH domain and N35Y in the VL domain of the hJovi-1 antibody; Y102F-N103M-N35R: a binding molecule having the T28K, Y32F, A100N, Y102F, N103M mutations in the VH domain and N35R in the VL domain of the hJovi-1 antibody; and Y102L-N103M-N35R: a binding molecule having the mutations T28K, Y32F, A100N, Y102L, N103M in the VH domain and N35R in the VL domain of the hJovi-1 antibody.

Фиг. 9: Анализ влияния различных форматов антител на связывание антител к TRBC2 посредством поверхностного плазмонного резонанса (SPR). Fig. 9: Analysis of the effect of different antibody formats on the binding of anti-TRBC2 antibodies by surface plasmon resonance (SPR).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Авторы настоящего изобретения определили кристаллическую структуру моноклонального антитела Jovi-1, что помогло идентифицировать два ключевых остатка, необходимых для формирования специфичности к TRBC1 (Фиг. 1). Интересен тот факт, что данные остатки расположены в CDR (участок, определяющей комплементарность) 1, а не в CDR 3, который, как правило, определяет специфичность антитела. Кроме того, другие остатки, которые расположены в непосредственной близости от эпитопа TRBC1, вероятно, будут играть важную роль в конструировании специфичности области TRBC1 по отношению к TRBC2. В настоящей заявке приведено описание остатков, содержащихся в Jovi-1, которые участвуют в связывании TRBC1 или которые играют важную роль в формировании специфичности к TRBC2.The present inventors have determined the crystal structure of the monoclonal antibody Jovi-1, which has helped to identify two key residues required for specificity for TRBC1 (Fig. 1). Interestingly, these residues are located in CDR (complementarity determining region) 1, rather than in CDR 3, which typically determines antibody specificity. In addition, other residues that are located in close proximity to the TRBC1 epitope are likely to play an important role in engineering the specificity of the TRBC1 region for TRBC2. The present application provides a description of the residues contained in Jovi-1 that are involved in TRBC1 binding or that are important in generating specificity for TRBC2.

В настоящем изобретении предложены варианты антигенсвязывающего домена антитела JOVI-1, обладающие увеличенной аффинностью к константной области 2 бета-цепи TCR (TRBC2) по сравнению с JOVI-1.The present invention provides antigen-binding domain variants of the JOVI-1 antibody that have increased affinity for the TCR beta chain constant region 2 (TRBC2) compared to JOVI-1.

1. Константная область β-цепи TCR (TRBC)1. TCR β-chain constant region (TRBC)

Т-клеточный рецептор (TCR) экспрессируется на поверхности Т-лимфоцитов и отвечает за распознавание антигенов, связанных с молекулами главного комплекса гистосовместимости (ГКГС). При взаимодействии TCR с антигенным пептидом и ГКГС (пептид/ГКГС), T-лимфоцит активируется посредством ряда биохимических событий, опосредованных ассоциированными ферментами, корецепторами, специализированными адаптерными молекулами и активированными или высвобожденными транскрипционными факторами.The T cell receptor (TCR) is expressed on the surface of T lymphocytes and is responsible for recognizing antigens bound to molecules of the major histocompatibility complex (MHC). When the TCR interacts with an antigenic peptide and MHC (peptide/MHC), the T lymphocyte is activated through a series of biochemical events mediated by associated enzymes, co-receptors, specialized adaptor molecules, and activated or released transcription factors.

TCR представляет собой связанный дисульфидной связью, заякоренный на мембране гетеродимер, обычно состоящий из высоковариабельных альфа (α) и бета (β) цепей, экспрессируемых как часть комплекса с инвариантными молекулами цепи CD3. Т-клетки, экспрессирующие данный рецептор, называют α:β (или αβ) Т-клетками (~95% от общего количества Т-клеток). Меньшая часть Т-клеток экспрессирует альтернативный рецептор, образованный вариабельными гамма (γ) и дельта (δ) цепями, и эти клетки называются γδ Т-клетками (~5% от общего количества Т-клеток).The TCR is a disulfide-linked, membrane-anchored heterodimer typically composed of highly variable alpha (α) and beta (β) chains expressed as part of a complex with invariant CD3 chain molecules. T cells expressing this receptor are called α:β (or αβ) T cells (~95% of total T cells). A smaller proportion of T cells express an alternative receptor formed by variable gamma (γ) and delta (δ) chains, and these cells are called γδ T cells (~5% of total T cells).

Каждая α и β цепь состоит из двух внеклеточных доменов: вариабельной (V) и константной (C) областей, причем оба домена, принадлежащие к суперсемейству Иммуноглобулинов (IgSF), образуют антипараллельные β-листы. Константная область расположена проксимально к клеточной мембране, за ней расположена трансмембранная область и короткий цитоплазматический концевой сегмент, тогда как вариабельная область связывается с комплексом пептид/ГКГС. Константная область TCR состоит из коротких соединительных последовательностей, в которых остаток цистеина образует дисульфидные связи, которые образуют связь между двумя цепями две цепи. Each α and β chain consists of two extracellular domains: the variable (V) and constant (C) regions, both domains belonging to the immunoglobulin superfamily (IgSF) forming antiparallel β-sheets. The constant region is located proximal to the cell membrane, followed by a transmembrane region and a short cytoplasmic tail, while the variable region binds to the peptide/MHC complex. The constant region of TCR consists of short junctional sequences in which a cysteine residue forms disulfide bonds that link the two chains.

Вариабельные домены α-цепи и β-цепи TCR имеют три гипервариабельных или определяющих комплементарность участка (CDR). Вариабельная область β-цепи также имеет дополнительный участок гипервариабельности (HV4), однако обычно она не контактирует с антигеном и поэтому не считается CDR.The variable domains of the α-chain and β-chain of the TCR have three hypervariable or complementarity-determining regions (CDRs). The variable region of the β-chain also has an additional hypervariable region (HV4), but it does not usually contact antigen and is therefore not considered a CDR.

TCR также содержит до пяти инвариантных цепей γ, δ, ε (совместно именуемые CD3) и ζ. Субъединицы CD3 и ζ опосредуют передачу сигналов TCR через особые цитоплазматические домены, которые взаимодействуют с молекулами вторичного мессенджера и адаптерными молекулами после распознавания антигена клетками αβ или γδ. Экспрессии комплекса TCR на поверхности клеток предшествует попарная сборка субъединиц, в которой участвуют трансмембранные и внеклеточные домены цепей α и β TCR, и цепей γ и δ CD3.The TCR also contains up to five invariant chains, γ, δ, ε (collectively referred to as CD3), and ζ. The CD3 and ζ subunits mediate TCR signaling through distinct cytoplasmic domains that interact with second messenger and adaptor molecules following antigen recognition by αβ or γδ cells. Cell surface expression of the TCR complex is preceded by pairwise subunit assembly involving the transmembrane and extracellular domains of the α and β chains of TCR and the γ and δ chains of CD3.

Таким образом, TCR обычно состоят из комплекса CD3 и цепей α и β TCR, которые, в свою очередь, состоят из вариабельных и константных областей (Фиг. 1).Thus, TCRs typically consist of a CD3 complex and the α and β TCR chains, which in turn consist of variable and constant regions (Figure 1).

Локус (Chr7:q34), в котором расположена константная область β-цепи TCR (TRBC), в ходе эволюции удвоился с образованием двух почти идентичных и функционально равнозначных генов: TRBC1 и TRBC2 (Фиг. 2). Каждый TCR может содержать взаимоисключающим образом или TRBC1, или TRBC2, и, таким образом, каждая T-клетка из αβ будет экспрессировать или TRBC1, или TRBC2 взаимоисключающим образом.The locus (Chr7:q34) containing the constant region of the TCR β chain (TRBC) has evolved to duplicate two nearly identical and functionally equivalent genes: TRBC1 and TRBC2 (Fig. 2). Each TCR can express either TRBC1 or TRBC2 in a mutually exclusive manner, and thus each αβ T cell will express either TRBC1 or TRBC2 in a mutually exclusive manner.

Авторы настоящего изобретения ранее определили, что, несмотря на сходство между последовательностями TRBC1 и TRBC2, их можно отличить друг от друга. Авторы изобретения также ранее определили, что аминокислотные последовательности TRBC1 и TRBC2 могут быть распознаны in situ на поверхности клетки, например, Т-клетки (WO2015/132598).The inventors have previously determined that, despite the similarity between the sequences of TRBC1 and TRBC2, they can be distinguished from each other. The inventors have also previously determined that the amino acid sequences of TRBC1 and TRBC2 can be recognized in situ on the surface of a cell, such as a T cell (WO2015/132598).

2. Вариантный антигенсвязывающий домен2. Variant antigen-binding domain

В первом аспекте настоящего изобретения предложен вариантный антигенсвязывающий домен (далее - «вариантный антигенсвязывающий домен согласно настоящему изобретению»), который содержит по меньшей мере одну мутацию в домене VH по сравнению с эталонным антителом, имеющим домен VH с последовательностью с SEQ ID: 1, и домен VL с последовательностью с SEQ ID: 2, в котором по меньшей мере одна мутация в домене VH выбрана из T28K, Y32K и A100N, причем данный вариантный антигенсвязывающий домен демонстрирует увеличенную аффинность к TRBC2 по сравнению с эталонным антителом.In a first aspect of the present invention, there is provided a variant antigen-binding domain (hereinafter referred to as the " variant antigen-binding domain according to the present invention "), which comprises at least one mutation in the VH domain compared to a reference antibody having a VH domain of the sequence of SEQ ID: 1 and a VL domain of the sequence of SEQ ID: 2, wherein at least one mutation in the VH domain is selected from T28K, Y32K and A100N, wherein this variant antigen-binding domain exhibits increased affinity for TRBC2 compared to the reference antibody.

Термин «вариантный» или «мутантный» в контексте настоящей заявки относится к полипептиду, отличающемуся от конкретно указанного полипептида, т.е. эталонного или родительского полипептида аминокислотными вставками, делециями и/или заменами, сделанными с помощью, например, способов рекомбинантной ДНК или синтеза de novo. Понятия «вариантный» или «мутантный» в контексте настоящего изобретения используют без ограничения их смысла. Вариантные антигенсвязывающие домены по настоящему изобретению включают антигенсвязывающие молекулы, в которых один или несколько аминокислотных остатков модифицированы заменой, вставкой и/или делецией таким образом, что это оказывает существенное влияние на аффинность эталонного или родительского антигенсвязывающего домена по связыванию антигена.The term " variant " or " mutant " as used herein refers to a polypeptide that differs from a specified polypeptide, i.e. a reference or parent polypeptide, by amino acid insertions, deletions and/or substitutions made using, for example, recombinant DNA techniques or de novo synthesis. The terms "variant" or "mutant" are used without limiting their meaning in the context of the present invention. Variant antigen-binding domains according to the present invention include antigen-binding molecules in which one or more amino acid residues are modified by substitution, insertion and/or deletion in such a way that this significantly affects the affinity of the reference or parent antigen-binding domain for antigen binding.

Термин «антигенсвязывающий домен» в контексте настоящей заявки относится к вариабельным областям каждой пары легкой и тяжелой цепей антитела, то есть к доменам VL и VH соответственно, которые формируют его участок связывания. Они характеризуются одинаковой общей структурой, состоящей из относительно сохранившихся участков, называемых каркасными (FR), соединенных тремя гипервариабельными участками, называемыми участками, определяющими комплементарность (CDR) (Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., NIH Publication No. 91-3242, Bethesda, MD.; Chothia & Lesk, 1987, J Mol Biol 196:901-17). Термин «определяющий комплементарность участок» или «CDR» в контексте настоящей заявки относится к области антитела, которая является комплементарной форме антигена. Таким образом, CDR определяют аффинность белка (проще говоря, силу связывания) и специфичность к конкретным антигенам. CDR двух цепей каждой пары выравниваются за счет каркасных областей, приобретая функцию связывания с конкретным эпитопом.The term " antigen-binding domain " as used herein refers to the variable regions of each pair of light and heavy chains of an antibody, i.e., the VL and VH domains, respectively, which form its binding site. They are characterized by the same general structure, consisting of relatively conserved regions called framework regions (FRs), connected by three hypervariable regions called complementarity determining regions (CDRs) (Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., NIH Publication No. 91-3242, Bethesda, MD.; Chothia & Lesk, 1987, J Mol Biol 196:901-17). The term "complementarity determining region" or "CDR" as used herein refers to the region of an antibody that is complementary to the form of an antigen. Thus, CDRs determine the protein's affinity (simply put, the strength of binding) and specificity to specific antigens. The CDRs of the two chains of each pair are aligned by the framework regions, acquiring the function of binding to a specific epitope.

Вариантный антигенсвязывающий домен согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере одну мутацию в домене VH по сравнению с эталонным антителом. Термин «эталонное антитело» в контексте настоящей заявки относится к гуманизированному антителу JOVI-1, т.е. hJOVI-1, которое содержит домен VH с последовательностью согласно SEQ ID: 1, и домен VL с последовательностью согласно SEQ ID: 2. Антитело мыши JOVI-1 было ранее описано Viney et al. (1992; как было приведено выше) и является доступным на рынке (Abcam, ab5465). Ранее было определено, что JOVI-1 способно различать клетки исходя из специфичной экспрессии TRBC1 или TRBC2 посредством специфичного связывания исключительно с TRBC1 (WO 2015/132598).The variant antigen-binding domain of the present invention comprises at least one mutation in the VH domain compared to a reference antibody. The term " reference antibody " in the context of the present application refers to the humanized antibody JOVI-1, i.e. hJOVI-1, which comprises a VH domain with the sequence according to SEQ ID: 1 and a VL domain with the sequence according to SEQ ID: 2. The murine antibody JOVI-1 has been previously described by Viney et al. (1992; as cited above) and is commercially available (Abcam, ab5465). It has previously been determined that JOVI-1 is able to discriminate cells based on the specific expression of TRBC1 or TRBC2 by specifically binding exclusively to TRBC1 (WO 2015/132598).

SEQ ID: 1 (домен VH антитела hJOVI-1):SEQ ID: 1 (VH domain of hJOVI-1 antibody):

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYVMHWVRQAPGQGLEWMGFINPYNDDIQSNERFRGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGAGYNFDGAYRFFDFWGQGTMVTVSSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYVMHWVRQAPGQGLEWMGFINPYNDDIQSNERFRGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGAGYNFDGAYRFFDFWGQGTMVTVSS

SEQ ID: 2 (домен VL антитела hJOVI-1):SEQ ID: 2 (VL domain of hJOVI-1 antibody):

DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQRLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPRLLIYRVSNRFPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPYTFGQGTKLEIKDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQRLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPRLLIYRVSNRFPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPYTFGQGTKLEIK

Далее любое упоминание домена VH означает домен VH антитела hJOVI-1 согласно SEQ ID: 1, если не указано иное, и любое упоминание домена VL означает домен VL антитела hJOVI-1 согласно SEQ ID: 2., если не указано иное.Hereinafter, any reference to a VH domain means the VH domain of the hJOVI-1 antibody according to SEQ ID: 1, unless otherwise indicated, and any reference to a VL domain means the VL domain of the hJOVI-1 antibody according to SEQ ID: 2, unless otherwise indicated.

Авторы настоящего изобретения определили, что наличие по меньшей мере одной мутации, выбранной из T28K, Y32F и A100N, в домене VH эталонного антитела, вызывает увеличение аффинности вариантного антигенсвязывающего домена согласно настоящему изобретению к TRBC2 по сравнению с эталонным антителом (Пример 1).The present inventors have determined that the presence of at least one mutation selected from T28K, Y32F and A100N in the VH domain of a reference antibody results in an increase in the affinity of the variant antigen-binding domain of the present invention for TRBC2 compared to the reference antibody (Example 1).

Термин «аффинность» в контексте настоящей заявки относится к силе взаимодействия между участком связывания антигена антитела и эпитопом. Антитела с высокой аффинностью будут связывать большее количество антигена за более короткий период времени, чем антитела с низкой аффинностью. Аффинность обычно количественно определяется в качестве равновесной константы диссоциации (KD), которая равна отношению kконеч/kначал между антителом и антигеном. Аффинность антигенсвязывающего домена к какому-либо определенному антигену может быть количественно определена с помощью какого-либо общепринятого способа, включая, без ограничения, способы, основанные на меченных клетках, такие как прямой и непрямой иммуноферментный анализ (ELISA) и радиоиммуноанализ, и способы без применения меток, которые позволяют осуществлять непосредственное обнаружение и количественное определение взаимодействий в реальном времени, такие как поверхностный плазмонный резонанс и интерференция биослоя.The term " affinity " as used herein refers to the strength of the interaction between the antigen binding site of an antibody and an epitope. Antibodies with high affinity will bind more antigen in a shorter period of time than antibodies with low affinity. Affinity is typically quantified as the equilibrium dissociation constant (K D ), which is equal to the ratio of k end /k beginning between the antibody and the antigen. The affinity of an antigen binding domain for a particular antigen can be quantified by any conventional method, including, but not limited to, labeled cell-based methods such as direct and indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and radioimmunoassay, and label-free methods that allow direct detection and quantification of interactions in real time, such as surface plasmon resonance and biolayer interference.

Аффинность вариантного антигенсвязывающего домена согласно настоящему изобретению к TRBC2 увеличена по сравнению с аффинностью эталонного антитела. Аффинность вариантного антигенсвязывающего домена к TRBC2 может быть увеличена по меньшей мере на 1%, по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 15%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 35%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 45%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 55%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 100%, по меньшей мере на 150%, по меньшей мере на 200%, по меньшей мере на 300%, по меньшей мере на 400%, по меньшей мере на 500%, по меньшей мере на 600%, по меньшей мере на 700%, по меньшей мере на 800%, по меньшей мере на 900%, по меньшей мере на 1000%, по меньшей мере на 5000% или по меньшей мере на 10000% по сравнению с аффинностью эталонного антитела к TRBC2. The affinity of the variant antigen-binding domain of the present invention for TRBC2 is increased compared to the affinity of the reference antibody. The affinity of the variant antigen-binding domain for TRBC2 may be increased by at least 1%, at least 5%, at least 10%, at least 15%, at least 20%, at least 25%, at least 30%, at least 35%, at least 40%, at least 45%, at least 50%, at least 55%, at least 60%, at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 100%, at least 150%, at least 200%, at least 300%, at least 400%, at least 500%, at least 600%, at least 700%, at least 800%, at least 900%, at least 1000%, at least 5000%, or at least 10000% compared to the affinity of the reference antibody to TRBC2.

Вариантный антигенсвязывающий домен согласно настоящему изобретению может содержать мутацию T28K в домене VH. Вариантный антигенсвязывающий домен согласно настоящему изобретению может содержать мутацию Y32F в домене VH. Вариантный антигенсвязывающий домен согласно настоящему изобретению может содержать мутацию A100N в домене VH.The variant antigen-binding domain of the present invention may comprise a T28K mutation in the VH domain. The variant antigen-binding domain of the present invention may comprise a Y32F mutation in the VH domain. The variant antigen-binding domain of the present invention may comprise an A100N mutation in the VH domain.

Вариантный антигенсвязывающий домен согласно настоящему изобретению может содержать по меньшей мере две мутации в домене VH, выбранные из T28K, Y32F и A100N. По меньшей мере две мутации могут быть мутациями Y32F и A100N. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения вариантный антигенсвязывающий домен согласно настоящему изобретению может содержать мутации Y32F и A100N, и дополнительно содержать мутацию T28R в домене VH. В другом варианте реализации вариантный антигенсвязывающий домен согласно настоящему изобретению может содержать мутации Y32F и A100N, и дополнительно содержать мутацию G31R в домене VH.A variant antigen-binding domain according to the present invention may comprise at least two mutations in the VH domain selected from T28K, Y32F and A100N. The at least two mutations may be Y32F and A100N mutations. In one embodiment of the present invention, a variant antigen-binding domain according to the present invention may comprise Y32F and A100N mutations, and further comprises a T28R mutation in the VH domain. In another embodiment, a variant antigen-binding domain according to the present invention may comprise Y32F and A100N mutations, and further comprises a G31R mutation in the VH domain.

Вариантный антигенсвязывающий домен согласно настоящему изобретению может содержать мутации T28K, Y32F и A100N в домене VH.The variant antigen binding domain of the present invention may comprise the mutations T28K, Y32F and A100N in the VH domain.

В другом варианте реализации вариантный антигенсвязывающий домен согласно настоящему изобретению содержит мутации T28K, Y32F и A100N в домене VH, и дополнительно содержит по меньшей мере одну мутацию в положении, выбранном из группы, состоящей из V2, Y27, G31, R98, Y102, N103 и A107 в домене VH, и N35 и R55 в домене VL. Вариантный антигенсвязывающий домен согласно настоящему изобретению может содержать одну, две, три, четыре, пять, шесть или семь мутаций в положении, выбранном из группы, состоящей из V2, Y27, G31, R98, Y102, N103 и A107 в домене VH, и N35 и R55 в домене VL.In another embodiment, a variant antigen-binding domain according to the present invention comprises the mutations T28K, Y32F and A100N in the VH domain, and further comprises at least one mutation at a position selected from the group consisting of V2, Y27, G31, R98, Y102, N103 and A107 in the VH domain, and N35 and R55 in the VL domain. A variant antigen-binding domain according to the present invention may comprise one, two, three, four, five, six or seven mutations at a position selected from the group consisting of V2, Y27, G31, R98, Y102, N103 and A107 in the VH domain, and N35 and R55 in the VL domain.

Вариантный антигенсвязывающий домен согласно настоящему изобретению может содержать мутации T28K, Y32F и A100N в домене VH, и может дополнительно содержать мутацию в положении V2 в домене VH, мутацию в положении Y27 в домене VH, мутацию в положении G31 в домене VH, мутацию в положении R98 в домене VH, мутацию в положении Y102 в домене VH, мутацию в положении N103 в домене VH, мутацию в положении A107 в домене VH, мутацию в положении N35 в домене VL и мутацию в положении R55 в домене VL.The variant antigen-binding domain according to the present invention may comprise the mutations T28K, Y32F and A100N in the VH domain, and may further comprise a mutation at position V2 in the VH domain, a mutation at position Y27 in the VH domain, a mutation at position G31 in the VH domain, a mutation at position R98 in the VH domain, a mutation at position Y102 in the VH domain, a mutation at position N103 in the VH domain, a mutation at position A107 in the VH domain, a mutation at position N35 in the VL domain and a mutation at position R55 in the VL domain.

Вариантный антигенсвязывающий домен по настоящему изобретению может содержать мутации T28K, Y32F и A100N в домене VH, и дополнительно содержать по меньшей мере одну мутацию, выбранную из:The variant antigen binding domain of the present invention may comprise the mutations T28K, Y32F and A100N in the VH domain, and further comprise at least one mutation selected from:

a) в домене VH:a) in the VH domain:

- V2K, V2R,- V2K, V2R,

- Y27F, Y27M, Y27N, Y27W,- Y27F, Y27M, Y27N, Y27W,

- G31K, G31R, G31S,- G31K, G31R, G31S,

- R98K,- R98K,

- Y102F, Y102L,- Y102F, Y102L,

- N103A, N103E, N103F, N103H, N103L, N103M, N103Q, N103S, N103W, N103Y и- N103A, N103E, N103F, N103H, N103L, N103M, N103Q, N103S, N103W, N103Y and

- A107S,- A107S,

иAnd

b) в домене VL:b) in the VL domain:

- N35M, N35F, N35Y, N35K, N35R и- N35M, N35F, N35Y, N35K, N35R and

- R55K.- R55K.

Вариантный антигенсвязывающий домен согласно настоящему изобретению может быть выбран из вариантных антигенсвязывающих доменов, содержащих следующие комбинации мутаций:A variant antigen-binding domain according to the present invention may be selected from variant antigen-binding domains comprising the following combinations of mutations:

- T28K, Y32F, A100N, Y27N в домене VH,- T28K, Y32F, A100N, Y27N in the VH domain,

- T28K, Y32F, A100N, G31K в домене VH,- T28K, Y32F, A100N, G31K in the VH domain,

- T28K, Y32F, A100N, Y27M в домене VH,- T28K, Y32F, A100N, Y27M in the VH domain,

- T28K, Y32F, A100N, Y27W в домене VH,- T28K, Y32F, A100N, Y27W in the VH domain,

- T28K, Y32F, A100N в домене VH,- T28K, Y32F, A100N in the VH domain,

- T28K, Y32F, A100N в домене VH и R55K в домене VL,- T28K, Y32F, A100N in the VH domain and R55K in the VL domain,

- T28K, Y32F, A100N в домене VH и N35K в домене VL,- T28K, Y32F, A100N in the VH domain and N35K in the VL domain,

- T28K, Y32F, A100N, N103H в домене VH,- T28K, Y32F, A100N, N103H in the VH domain,

- T28K, Y32F, A100N, N103A в домене VH,- T28K, Y32F, A100N, N103A in the VH domain,

- T28K, Y32F, A100N, N103Y в домене VH,- T28K, Y32F, A100N, N103Y in the VH domain,

- T28K, Y32F, A100N в домене VH и N35R в домене VL, - T28K, Y32F, A100N in the VH domain and N35R in the VL domain,

- T28K, Y32F, A100N, N103S в домене VH и N35M в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, N103S in the VH domain and N35M in the VL domain,

- T28K, Y32F, A100N, N103M, в домене VH,- T28K, Y32F, A100N, N103M, in the VH domain,

- T28K, Y32F, A100N, N103W в домене VH и N35R в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, N103W in the VH domain and N35R in the VL domain,

- T28K, Y32F, A100N в домене VH и N35F в домене VL,- T28K, Y32F, A100N in the VH domain and N35F in the VL domain,

- T28K, Y32F, A100N, N103S в домене VH и N35K в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, N103S in the VH domain and N35K in the VL domain,

- T28K, Y32F, A100N, R98K в домене VH,- T28K, Y32F, A100N, R98K in the VH domain,

- T28K, Y32F, A100N, N103S в домене VH и N35R в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, N103S in the VH domain and N35R in the VL domain,

- T28K, Y32F, A100N, N103L в домене VH,- T28K, Y32F, A100N, N103L in the VH domain,

- T28K, Y32F, A100N, N103S в домене VH и N35F в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, N103S in the VH domain and N35F in the VL domain,

- T28K, Y32F, A100N, N103S в домене VH и N35Y в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, N103S in the VH domain and N35Y in the VL domain,

- T28K, Y32F, A100N, N103L в домене VH и N35M в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, N103L in the VH domain and N35M in the VL domain,

- T28K, Y32F, A100N, N103L в домене VH и N35R в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, N103L in the VH domain and N35R in the VL domain,

- T28K, Y32F, A100N, N103W в домене VH и N35K в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, N103W in the VH domain and N35K in the VL domain,

- T28K, Y32F, A100N, N103L в домене VH и N35Y в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, N103L in the VH domain and N35Y in the VL domain,

- T28K, Y32F, A100N, N103F в домене VH,- T28K, Y32F, A100N, N103F in the VH domain,

- T28K, Y32F, A100N, N103W в домене VH,- T28K, Y32F, A100N, N103W in the VH domain,

- T28K, Y32F, A100N, N103L в домене VH и N35K в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, N103L in the VH domain and N35K in the VL domain,

- T28K, Y32F, A100N, N103L в домене VH и N35F в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, N103L in the VH domain and N35F in the VL domain,

- T28K, Y32F, A100N, N103W в домене VH и N35M в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, N103W in the VH domain and N35M in the VL domain,

- T28K, Y32F, A100N, N103F в домене VH и N35Y в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, N103F in the VH domain and N35Y in the VL domain,

- T28K, Y32F, A100N, Y27F в домене VH,- T28K, Y32F, A100N, Y27F in the VH domain,

- T28K, Y32F, A100N, N103Q в домене VH,- T28K, Y32F, A100N, N103Q in the VH domain,

- T28K, Y32F, A100N, N103S в домене VH,- T28K, Y32F, A100N, N103S in the VH domain,

- T28K, Y32F, A100N, N103M в домене VH и N35F в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, N103M in the VH domain and N35F in the VL domain,

- T28K, Y32F, A100N, N103F в домене VH и N35M в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, N103F in the VH domain and N35M in the VL domain,

- T28K, Y32F, A100N, N103F в домене VH и N35F в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, N103F in the VH domain and N35F in the VL domain,

- T28K, Y32F, A100N, G31R в домене VH,- T28K, Y32F, A100N, G31R in the VH domain,

- T28K, Y32F, A100N, N103W в домене VH и N35F в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, N103W in the VH domain and N35F in the VL domain,

- T28K, Y32F, A100N, V2R в домене VH,- T28K, Y32F, A100N, V2R in the VH domain,

- T28K, Y32F, A100N, G31S в домене VH,- T28K, Y32F, A100N, G31S in the VH domain,

- T28K, Y32F, A100N, A107S в домене VH,- T28K, Y32F, A100N, A107S in the VH domain,

- T28K, Y32F, A100N, N103E в домене VH и N35M в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, N103E in the VH domain and N35M in the VL domain,

- T28K, Y32F, A100N, V2K в домене VH,- T28K, Y32F, A100N, V2K in the VH domain,

- T28K, Y32F, A100N, N103E в домене VH,- T28K, Y32F, A100N, N103E in the VH domain,

- T28K, Y32F, A100N, Y102F, N103M в домене VH и N35K в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, Y102F, N103M in the VH domain and N35K in the VL domain,

- T28K, Y32F, A100N, Y102F, N103M в домене VH и N35F в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, Y102F, N103M in the VH domain and N35F in the VL domain,

- T28K, Y32F, A100N, Y102F, N103M в домене VH и N35R в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, Y102F, N103M in the VH domain and N35R in the VL domain,

- T28K, Y32F, A100N, Y102F в домене VH и N35R в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, Y102F in the VH domain and N35R in the VL domain,

- T28K, Y32F, A100N, N103M в домене VH и N35M в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, N103M in the VH domain and N35M in the VL domain,

- T28K, Y32F, A100N, N103M в домене VH и N35Y в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, N103M in the VH domain and N35Y in the VL domain,

- T28K, Y32F, A100N, N103M в домене VH и N35R в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, N103M in the VH domain and N35R in the VL domain,

- T28K, Y32F, A100N, N103F в домене VH и N35K в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, N103F in the VH domain and N35K in the VL domain,

- T28K, Y32F, A100N, Y102L, N103W в домене VH и N35R в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, Y102L, N103W in the VH domain and N35R in the VL domain,

- T28K, Y32F, A100N, Y102L, N103W в домене VH и N35K в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, Y102L, N103W in the VH domain and N35K in the VL domain,

- T28K, Y32F, A100N, Y102F в домене VH и- T28K, Y32F, A100N, Y102F in the VH domain and

- T28K, Y32F, A100N, Y102L, N103M в домене VH и N35R в домене VL. - T28K, Y32F, A100N, Y102L, N103M in the VH domain and N35R in the VL domain.

Было продемонстрировано, что эти конкретные комбинированные мутации изменяют связывание с TRBC2 и TRBC1 таким образом, что оно может быть эффективно применено для нацеливания на TRBC2 (см. Таблицу 1).These specific combination mutations were demonstrated to alter binding to TRBC2 and TRBC1 in a manner that could be effectively used to target TRBC2 (see Table 1).

Таблица 1: Аффинность вариантных антигенсвязывающих доменов согласно настоящему изобретению к TRBC2 и TRBC1.Table 1: Affinity of variant antigen-binding domains of the present invention for TRBC2 and TRBC1. КД TRBC1 (M)CD TRBC1 (M) Отношение КД TRBC2:
КД TRBC1TRBC2 CD ratio:
CD TRBC1 КД TRBC2
(M)CD TRBC2
(M) Мутации в домене VHMutations in the VH domain Мутации в домене VLMutations in the VL domain Н/ДN/A -- 2.61E-062.61E-06 T28K, Y32F, A100N, Y102FT28K, Y32F, A100N, Y102F -- Н/ДN/A -- 1.90E-061.90E-06 T28K, Y32F, A100N, Y102L, N103MT28K, Y32F, A100N, Y102L, N103M N35RN35R Н/ДN/A -- 1.72E-061.72E-06 T28K, Y32F, A100N, Y102L, N103WT28K, Y32F, A100N, Y102L, N103W N35KN35K Н/ДN/A -- 1.51E-061.51E-06 T28K, Y32F, A100N, Y102L, N103WT28K, Y32F, A100N, Y102L, N103W N35RN35R 2.93E-062.93E-06 2.2557782.255778 1.30E-061.30E-06 T28K, Y32F, A100N, N103ET28K, Y32F, A100N, N103E -- 3.14E-063.14E-06 2.3100662.310066 1.36E-061.36E-06 G31R, Y32F, A100NG31R, Y32F, A100N -- 1.44E-061.44E-06 2.4832332.483233 5.82E-075.82E-07 T28R, Y32F, A100NT28R, Y32F, A100N -- 2.40E-062.40E-06 2.7188312.718831 8.83E-078.83E-07 V2K, T28K, Y32F, A100NV2K, T28K, Y32F, A100N -- 5.83E-065.83E-06 2.7353362.735336 2.13E-062.13E-06 N103E, T28K, Y32F, A100NN103E, T28K, Y32F, A100N N35MN35M 8.81E-078.81E-07 2.9942222.994222 2.94E-072.94E-07 T28K, Y32F, A100N, N103FT28K, Y32F, A100N, N103F N35KN35K 3.59E-063.59E-06 3.0940473.094047 1.16E-061.16E-06 T28K, Y32F, A100N, A107ST28K, Y32F, A100N, A107S -- 3.68E-063.68E-06 3.1491003.149100 1.17E-061.17E-06 G31S, T28K, Y32F, A100NG31S, T28K, Y32F, A100N -- 5.11E-065.11E-06 3.1931253.193125 1.60E-061.60E-06 V2R, T28K, Y32F, A100NV2R, T28K, Y32F, A100N -- 2.902E-072.902E-07 3.2133763.213376 9.031E-089.031E-08 T28K, Y32F, A100N, N103MT28K, Y32F, A100N, N103M N35RN35R 1.68E-061.68E-06 3.3019423.301942 5.10E-075.10E-07 N103W, T28K, Y32F, A100NN103W, T28K, Y32F, A100N N35FN35F 1.74E-051.74E-05 3.5064673.506467 4.95E-064.95E-06 T28K, G31R, Y32F, A100NT28K, G31R, Y32F, A100N -- 1.61E-061.61E-06 3.5133963.513396 4.59E-074.59E-07 N103F, T28K, Y32F, A100NN103F, T28K, Y32F, A100N N35FN35F 4.59E-074.59E-07 3.5249423.524942 1.30E-071.30E-07 N103F, T28K, Y32F, A100NN103F, T28K, Y32F, A100N N35MN35M 4.59E-074.59E-07 3.5249423.524942 1.30E-071.30E-07 N103M, T28K, Y32F, A100NN103M, T28K, Y32F, A100N N35FN35F 3.54E-063.54E-06 3.5960543.596054 9.83E-079.83E-07 T28K, Y32F, A100N, N103ST28K, Y32F, A100N, N103S -- 1.77E-061.77E-06 3.6647373.664737 4.84E-074.84E-07 T28K, Y32F, A100N, N103QT28K, Y32F, A100N, N103Q -- 4.48E-064.48E-06 3.6900253.690025 1.21E-061.21E-06 Y27F, T28K, Y32F, A100NY27F, T28K, Y32F, A100N -- 1.86E-061.86E-06 3.7158253.715825 5.01E-075.01E-07 N103F, T28K, Y32F, A100NN103F, T28K, Y32F, A100N N35YN35Y 2.28E-062.28E-06 3.7334213.733421 6.11E-076.11E-07 N103W, T28K, Y32F, A100NN103W, T28K, Y32F, A100N N35MN35M 1.38E-061.38E-06 3.7432293.743229 3.69E-073.69E-07 N103L, T28K, Y32F, A100NN103L, T28K, Y32F, A100N N35FN35F 7.07E-077.07E-07 3.7751073.775107 1.87E-071.87E-07 N103L, T28K, Y32F, A100NN103L, T28K, Y32F, A100N N35KN35K 1.65E-061.65E-06 3.8847063.884706 4.25E-074.25E-07 T28K, Y32F, A100N, N103WT28K, Y32F, A100N, N103W -- 1.06E-061.06E-06 3.9207703.920770 2.70E-072.70E-07 T28K, Y32F, A100N, N103FT28K, Y32F, A100N, N103F -- 1.93E-061.93E-06 4.0129254.012925 4.80E-074.80E-07 N103L, T28K, Y32F, A100NN103L, T28K, Y32F, A100N N35YN35Y 1.68E-061.68E-06 4.0311754.031175 4.17E-074.17E-07 N103W, T28K, Y32F, A100NN103W, T28K, Y32F, A100N N35KN35K 8.10E-078.10E-07 4.0384044.038404 2.01E-072.01E-07 N103L, T28K, Y32F, A100NN103L, T28K, Y32F, A100N N35RN35R 1.50E-061.50E-06 4.1148984.114898 3.64E-073.64E-07 N103L, T28K, Y32F, A100NN103L, T28K, Y32F, A100N N35MN35M 7.83E-067.83E-06 4.1676424.167642 1.88E-061.88E-06 N103S, T28K, Y32F, A100NN103S, T28K, Y32F, A100N N35YN35Y 6.58E-066.58E-06 4.2275064.227506 1.56E-061.56E-06 N103S, T28K, Y32F, A100NN103S, T28K, Y32F, A100N N35FN35F 1.28E-061.28E-06 4.2279664.227966 3.02E-073.02E-07 T28K, Y32F, A100N, N103LT28K, Y32F, A100N, N103L -- 7.328E-077.328E-07 4.2481164.248116 1.725E-071.725E-07 T28K, Y32F, A100N, N103MT28K, Y32F, A100N, N103M N35YN35Y 3.93E-063.93E-06 4.2892994.289299 9.17E-079.17E-07 N103S, T28K, Y32F, A100NN103S, T28K, Y32F, A100N N35RN35R 4.66E-064.66E-06 4.3175934.317593 1.08E-061.08E-06 T28K, Y32F, R98K, A100NT28K, Y32F, R98K, A100N -- 3.68E-063.68E-06 4.3211474.321147 8.51E-078.51E-07 N103S, T28K, Y32F, A100NN103S, T28K, Y32F, A100N N35KN35K 2.81E-062.81E-06 4.3556384.355638 6.46E-076.46E-07 T28K, Y32F, A100NT28K, Y32F, A100N N35FN35F 1.73E-061.73E-06 4.4282054.428205 3.90E-073.90E-07 N103W, T28K, Y32F, A100NN103W, T28K, Y32F, A100N N35RN35R 3.76E-073.76E-07 4.4989244.498924 8.36E-088.36E-08 T28K, Y32F, A100N, N103MT28K, Y32F, A100N, N103M -- 8.22E-068.22E-06 4.5038344.503834 1.83E-061.83E-06 N103S, T28K, Y32F, A100NN103S, T28K, Y32F, A100N N35MN35M 9.29E-079.29E-07 4.5962394.596239 2.02E-072.02E-07 T28K, Y32F, A100NT28K, Y32F, A100N N35RN35R 1.58E-061.58E-06 4.6558354.655835 3.39E-073.39E-07 T28K, Y32F, A100N, N103YT28K, Y32F, A100N, N103Y -- 3.39E-063.39E-06 4.7464994.746499 7.14E-077.14E-07 T28K, Y32F, A100N, N103AT28K, Y32F, A100N, N103A -- 2.02E-062.02E-06 4.8472464.847246 4.16E-074.16E-07 T28K, Y32F, A100N, N103HT28K, Y32F, A100N, N103H -- 6.48E-076.48E-07 4.9632474.963247 1.31E-071.31E-07 T28K, Y32F, A100N, N103MT28K, Y32F, A100N, N103M N35MN35M 1.00E-061.00E-06 5.2318925.231892 1.92E-071.92E-07 T28K, Y32F, A100NT28K, Y32F, A100N N35KN35K 9.62E-079.62E-07 5.8355585.835558 1.65E-071.65E-07 T28K Y32F A100NT28K Y32F A100N R55KR55K 2.73E-062.73E-06 6.3177406.317740 4.32E-074.32E-07 T28K, Y32F, A100NT28K, Y32F, A100N -- 2.10E-052.10E-05 6.8507026.850702 3.06E-063.06E-06 Y27W, T28K, Y32F, A100NY27W, T28K, Y32F, A100N -- 1.89E-051.89E-05 6.9737336.973733 2.70E-062.70E-06 T28K, Y32F, A100N, Y102FT28K, Y32F, A100N, Y102F N35RN35R 7.91E-067.91E-06 8.1712108.171210 9.68E-079.68E-07 T28K, Y32F, A100N, Y102F, N103MT28K, Y32F, A100N, Y102F, N103M N35RN35R 1.13E-051.13E-05 8.5801068.580106 1.32E-061.32E-06 T28K, Y32F, A100N, Y102F, N103MT28K, Y32F, A100N, Y102F, N103M N35FN35F 1.81E-051.81E-05 8.6721008.672100 2.09E-062.09E-06 Y27M, T28K, Y32F, A100NY27M, T28K, Y32F, A100N -- 3.11E-053.11E-05 9.6200199.620019 3.24E-063.24E-06 T28K, G31K, Y32F, A100NT28K, G31K, Y32F, A100N -- 9.31E-069.31E-06 10.24417110.244171 9.09E-079.09E-07 T28K, Y32F, A100N, Y102F, N103MT28K, Y32F, A100N, Y102F, N103M N35KN35K 7.43E-057.43E-05 10.70266410.702664 6.95E-066.95E-06 Y27N, T28K, Y32F, A100NY27N, T28K, Y32F, A100N --

Н/Д - нет данных; связывание с TRBC1 практически равно нулю и находится за пределами обнаружения прибора.N/A - no data available; binding to TRBC1 is essentially zero and beyond the detection limit of the instrument.

В конкретном варианте реализации настоящего изобретения вариантный антигенсвязывающий домен согласно настоящему изобретению содержит мутации T28K, Y32F, A100N в домене VH.In a specific embodiment of the present invention, the variant antigen-binding domain of the present invention comprises the mutations T28K, Y32F, A100N in the VH domain.

В другом конкретном варианте реализации вариантный антигенсвязывающий домен согласно настоящему изобретению содержит мутации T28K, Y32F, A100N и Y27N в домене VH.In another specific embodiment, a variant antigen binding domain of the present invention comprises the mutations T28K, Y32F, A100N and Y27N in the VH domain.

В еще одном конкретном варианте реализации вариантный антигенсвязывающий домен согласно настоящему изобретению содержит мутации T28K, Y32F, A100N и N103M в домене VH.In another specific embodiment, a variant antigen binding domain of the present invention comprises the mutations T28K, Y32F, A100N and N103M in the VH domain.

В еще одном конкретном варианте реализации вариантный антигенсвязывающий домен согласно настоящему изобретению содержит мутации T28K, Y32F, A100N в домене VH и N35K в домене VL.In another specific embodiment, a variant antigen binding domain of the present invention comprises the mutations T28K, Y32F, A100N in the VH domain and N35K in the VL domain.

В еще одном конкретном варианте реализации вариантный антигенсвязывающий домен согласно настоящему изобретению содержит мутации T28K, Y32F, A100N, N103L в домене VH.In another specific embodiment, the variant antigen binding domain of the present invention comprises the mutations T28K, Y32F, A100N, N103L in the VH domain.

В еще одном конкретном варианте реализации вариантный антигенсвязывающий домен согласно настоящему изобретению содержит мутации T28K, Y32F, A100N, N103M в домене VH и мутацию N35Y в домене VL.In another specific embodiment, the variant antigen binding domain of the present invention comprises the mutations T28K, Y32F, A100N, N103M in the VH domain and the mutation N35Y in the VL domain.

В еще одном конкретном варианте реализации вариантный антигенсвязывающий домен согласно настоящему изобретению содержит мутации T28K, Y32F, A100N, Y102F, N103M в домене VH и мутацию N35R в домене VL.In another specific embodiment, the variant antigen binding domain of the present invention comprises the mutations T28K, Y32F, A100N, Y102F, N103M in the VH domain and the mutation N35R in the VL domain.

В еще одном конкретном варианте реализации вариантный антигенсвязывающий домен согласно настоящему изобретению содержит мутации T28K, Y32F, A100N, Y102L, N103M в домене VH и мутацию N35R в домене VL.In another specific embodiment, the variant antigen binding domain of the present invention comprises the mutations T28K, Y32F, A100N, Y102L, N103M in the VH domain and the mutation N35R in the VL domain.

Особое преимущество обеспечил бы вариант реализации, в котором вариантный антигенсвязывающий домен согласно настоящему изобретению не только демонстрирует увеличенную аффинность к TRBC2 по сравнению с эталонным антителом, но также его аффинность к TRBC1 уменьшается по сравнению с аффинностью эталонного антитела. Такое изменение специфичности к антигену позволило бы вариантному антигенсвязывающему домену отличать TRBC2 и TRBC1 друг от друга посредством предпочтения к связыванию с TRBC2. Таким образом, в еще одном варианте реализации вариантный антигенсвязывающий домен дополнительно демонстрирует уменьшенную аффинность к TRBC1 по сравнению с эталонным антителом.A particular advantage would be provided by an embodiment in which the variant antigen-binding domain according to the present invention not only exhibits an increased affinity for TRBC2 compared to a reference antibody, but also its affinity for TRBC1 is reduced compared to the affinity of the reference antibody. Such a change in antigen specificity would allow the variant antigen-binding domain to distinguish TRBC2 and TRBC1 from each other by preferentially binding to TRBC2. Thus, in a further embodiment, the variant antigen-binding domain additionally exhibits a reduced affinity for TRBC1 compared to a reference antibody.

Аффинность вариантного антигенсвязывающего домена согласно настоящему изобретению к TRBC1 уменьшена по сравнению с аффинностью эталонного антитела. Аффинность вариантного антигенсвязывающего домена к TRBC2 может быть увеличена по меньшей мере на 1%, по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 15%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 35%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 45%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 55%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 100%, по меньшей мере на 150%, по меньшей мере на 200%, по меньшей мере на 300%, по меньшей мере на 400%, по меньшей мере на 500%, по меньшей мере на 600%, по меньшей мере на 700%, по меньшей мере на 800%, по меньшей мере на 900%, по меньшей мере на 1000%, по меньшей мере на 5000% или по меньшей мере на 10000% по сравнению с аффинностью эталонного антитела к TRBC1.The affinity of the variant antigen-binding domain of the present invention for TRBC1 is reduced compared to the affinity of the reference antibody. The affinity of the variant antigen-binding domain for TRBC2 may be increased by at least 1%, at least 5%, at least 10%, at least 15%, at least 20%, at least 25%, at least 30%, at least 35%, at least 40%, at least 45%, at least 50%, at least 55%, at least 60%, at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 100%, at least 150%, at least 200%, at least 300%, at least 400%, at least 500%, at least 600%, at least 700%, at least 800%, at least 900%, at least 1000%, at least 5000%, or at least 10000% compared to the affinity of the reference antibody to TRBC1.

Отношения аффинности вариантного антигенсвязывающего домена по настоящему изобретению к TRBC2 к его аффинности к TRBC1 может составлять по меньшей мере 2, или по меньшей мере 3, или по меньшей мере 4, или по меньшей мере 5, или по меньшей мере 6, или по меньшей мере 7, или по меньшей мере 8, или по меньшей мере 9, или по меньшей мере 10, или по меньшей мере 15, или по меньшей мере 20, или по меньшей мере 25, или по меньшей мере 50, или по меньшей мере 100, или по меньшей мере 500, или по меньшей мере 1000 или более.The ratio of the affinity of the variant antigen-binding domain of the present invention for TRBC2 to its affinity for TRBC1 may be at least 2, or at least 3, or at least 4, or at least 5, or at least 6, or at least 7, or at least 8, or at least 9, or at least 10, or at least 15, or at least 20, or at least 25, or at least 50, or at least 100, or at least 500, or at least 1000 or more.

При увеличении авидности вариантного антигенсвязывающего домена согласно настоящему изобретению в Примере 6, авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что не только повышалась авидность вариантного антигенсвязывающего домена согласно настоящему изобретению в отношении TRBC2, но также сохранялась его низкая аффинность к TRBC1, и, следовательно, значительно улучшилась специфичность вариантного антигенсвязывающего домена согласно настоящему изобретению к TRBC2.By increasing the avidity of the variant antigen-binding domain of the present invention in Example 6, the inventors of the present invention unexpectedly found that not only the avidity of the variant antigen-binding domain of the present invention for TRBC2 was increased, but also its low affinity for TRBC1 was maintained, and therefore the specificity of the variant antigen-binding domain of the present invention for TRBC2 was significantly improved.

Авидность вариантного антигенсвязывающего домена согласно настоящему изобретению к TRBC2 может быть увеличена при помощи домена, обладающего способностью образовывать олигомеры или мультимеры. Таким образом, вариантный антигенсвязывающий домен согласно настоящему изобретению может дополнительно содержать домен олигомеризации. Термин «домен олигомеризации» в контексте настоящей заявки относится к домену, который самоассоцируется с образованием олигомера, такого как димер или тример, или мультимера. Таким образом, в контексте настоящей заявки термин «домен олигомеризации» также относится к домену мультимеризации. Домены олигомеризации хорошо известны специалистам в этой области, и применение какого-либо домена олигомеризации совместно с вариантным антигенсвязывающим доменом согласно настоящему изобретению возможно при условии, что полученный олигомер поддерживает или улучшает аффинность мономерного вариантного антигенсвязывающего домена к TRBC2. Примеры доменов олигомеризации включают, без ограничения, область Fc, спейсер COMP (олигомерный матриксный белок хряща) согласно SEQ ID: 18 или укороченный COMP, как описано ниже в контексте информации о химерном антигенном рецепторе (CAR) согласно настоящему изобретению.The avidity of the variant antigen-binding domain of the present invention for TRBC2 may be increased by a domain having the ability to form oligomers or multimers. Thus, the variant antigen-binding domain of the present invention may further comprise an oligomerization domain. The term "oligomerization domain" in the context of the present application refers to a domain that self-associates to form an oligomer, such as a dimer or trimer, or a multimer. Thus, in the context of the present application, the term "oligomerization domain" also refers to a multimerization domain. Oligomerization domains are well known to those skilled in the art, and the use of any oligomerization domain together with the variant antigen-binding domain of the present invention is possible, provided that the resulting oligomer maintains or improves the affinity of the monomeric variant antigen-binding domain for TRBC2. Examples of oligomerization domains include, but are not limited to, an Fc region, a COMP (cartilage oligomeric matrix protein) spacer according to SEQ ID: 18, or a truncated COMP as described below in the context of the chimeric antigen receptor (CAR) information of the present invention.

В настоящем изобретении также рассматриваются различные форматы вариантного антигенсвязывающего домена согласно настоящему изобретению, включая, без ограничения, scFv, диатело, тримерное тело, минитело, фрагменты F(ab) and F(ab')2, и полноразмерное антитело, т.е. IgG, IgM, IgA, IgD, IgE. The present invention also contemplates various formats of the variant antigen binding domain of the present invention, including, but not limited to, scFv, diabody, trimeric body, minibody, F(ab) and F(ab') 2 fragments, and full length antibody, i.e., IgG, IgM, IgA, IgD, IgE.

Таким образом, еще один аспект настоящего изобретения относится к антителу, именуемому далее «антитело согласно настоящему изобретению», которое содержит вариантный антигенсвязывающий домен согласно настоящему изобретению.Thus, another aspect of the present invention relates to an antibody, hereinafter referred to as " the antibody of the present invention ", which comprises a variant antigen-binding domain of the present invention.

3. Химерные антигенные рецепторы3. Chimeric antigen receptors

В еще одном аспекте настоящего изобретения предложен химерный антигенный рецептор (CAR) (далее - «CAR согласно настоящему изобретению»), содержащий вариантный антигенсвязывающий домен согласно настоящему изобретению, трансмембранный домен и эндодомен.In another aspect, the present invention provides a chimeric antigen receptor (CAR) (hereinafter referred to as the " CAR of the present invention ") comprising a variant antigen-binding domain of the present invention, a transmembrane domain and an endodomain.

Термин «вариантный антигенсвязывающий домен согласно настоящему изобретению» был подробно раскрыт в контексте первого аспекта настоящего изобретения, и его признаки и варианты реализации в равной степени применимы к данному аспекту настоящего изобретения.The term "variant antigen binding domain according to the present invention" has been described in detail in the context of the first aspect of the present invention, and its features and embodiments are equally applicable to this aspect of the present invention.

Термин «химерный антигенный рецептор» или «CAR», или «химерный Т-клеточный рецептор», или «искусственные Т-клеточные рецепторы», или «химерные иммунорецепторы» в контексте настоящей заявки относится к химерному трансмембранному белку I типа, который соединяет распознающий антиген внеклеточный домен (связывающая молекула) с внутриклеточным сигнальным доменом (эндодомен). Связывающая молекула обычно представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), происходящий из моноклонального антитела (mAb), однако его основой могут быть другие форматы, которые содержат участок связывания антигена. Спейсерный домен обычно необходим для того, чтобы отделять связывающую молекулу от мембраны и позволять ему занимать подходящее положение в пространстве. Обычно используют спейсерный домен Fc иммуноглобулина IgG1. В зависимости от антигена могут быть достаточны более компактные спейсеры, например, «стебель» CD8α и даже один только шарнир IgG1. Трансмембранный домен заякоривает белок в клеточной мембране и соединяет спейсер с эндодоменом.The term " chimeric antigen receptor " or " CAR " or " chimeric T-cell receptor " or " artificial T-cell receptors " or " chimeric immunoreceptors " in the context of the present application refers to a chimeric type I transmembrane protein that combines an extracellular antigen recognition domain (binding molecule) with an intracellular signaling domain (endodomain). The binding molecule is typically a single-chain variable fragment (scFv) derived from a monoclonal antibody (mAb), but may be based on other formats that contain an antigen binding site. A spacer domain is typically needed to separate the binding molecule from the membrane and allow it to occupy a suitable position in space. The spacer domain of the Fc immunoglobulin IgG1 is typically used. Depending on the antigen, more compact spacers, such as the CD8α stalk and even the IgG1 hinge alone, may be sufficient. The transmembrane domain anchors the protein in the cell membrane and connects the spacer to the endodomain.

Ранние конструкции CAR имели эндодомены, происходящие из внутриклеточных фрагментов γ-цепи молекул FcεR1 или CD3ζ. Следовательно, эти рецепторы первого поколения передавали иммунологический сигнал 1, которого было достаточно, чтобы запустить уничтожение Т-клетками когнатных клеток-мишеней, но не могли полностью активировать Т-клетки для пролиферации и выживания. Чтобы преодолеть это ограничение, были сконструированы составные эндодомены: слияние внутриклеточного фрагмента костимулирующей молекулы Т-клетки с фрагментом CD3ζ привело к созданию рецепторов второго поколения, которые могут передавать активирующий и костимулирующий сигналы одновременно после распознавания антигена. Наиболее часто используемым костимулирующим доменом является CD28. Это обеспечивает наиболее мощный костимулирующий сигнал, а именно иммунологический сигнал 2, который запускает пролиферацию Т-клеток. Также были описаны некоторые рецепторы, которые включают эндодомены семейства рецепторов TNF (ФНО - фактор некроза опухоли), такие как близкородственные OX40 и 4-1BB, которые передают сигналы выживания. На сегодняшний день описаны еще более эффективные CAR третьего поколения, которые имеют эндодомены, способные передавать сигналы активации, пролиферации и выживания.Early CAR designs had endodomains derived from intracellular fragments of the γ chain of FcεR1 or CD3ζ molecules. Consequently, these first-generation receptors transduced immune signal 1, which was sufficient to trigger T cell killing of cognate target cells, but could not fully activate T cells for proliferation and survival. To overcome this limitation, composite endodomains were engineered: fusing an intracellular fragment of a T cell costimulatory molecule with a fragment of CD3ζ resulted in the creation of second-generation receptors that can transduce activating and costimulatory signals simultaneously upon antigen recognition. The most commonly used costimulatory domain is CD28. It provides the most potent costimulatory signal, namely immune signal 2, which triggers T cell proliferation. Several receptors have also been described that include endodomains of the TNF receptor family, such as the closely related OX40 and 4-1BB, which transmit survival signals. Even more effective third-generation CARs have now been described that have endodomains capable of transmitting activation, proliferation, and survival signals.

При связывании CAR с целевым антигеном происходит передача активирующего сигнала Т-клетке, на которой он экспрессируется. Таким образом, CAR направляет специфичность и цитотоксичность Т-клетки на опухолевые клетки, экспрессирующие целевой антиген.When CAR binds to a target antigen, it transmits an activating signal to the T cell on which it is expressed. In this way, CAR directs T cell specificity and cytotoxicity to tumor cells expressing the target antigen.

Таким образом CAR обычно содержат: (i) антигенсвязывающий домен; (ii) спейсер; (iii) трансмембранный домен; и (iii) внутриклеточный домен, который включает сигнальный домен или ассоциирован с ним (см. Фиг. 4).Thus, CARs typically contain: (i) an antigen-binding domain; (ii) a spacer; (iii) a transmembrane domain; and (iii) an intracellular domain that includes or is associated with a signaling domain (see Fig. 4).

CAR может иметь следующую общую структуру:A CAR may have the following general structure:

Антигенсвязывающий домен - спейсерный домен - трансмембранный домен - внутриклеточный сигнальный домен (эндодомен).Antigen-binding domain - spacer domain - transmembrane domain - intracellular signaling domain (endodomain).

3.1. Сигнальный пептид3.1. Signal peptide

CAR по настоящему изобретению может содержать сигнальный пептид, таким образом, когда CAR экспрессируется внутри клетки, такой как Т-клетка, образующийся белок направляется в эндоплазматический ретикулум, а затем на поверхность клетки, где он экспрессируется.The CAR of the present invention may comprise a signal peptide such that when the CAR is expressed within a cell, such as a T cell, the resulting protein is directed to the endoplasmic reticulum and then to the cell surface where it is expressed.

Кор сигнального пептида может содержать длинный участок гидрофобных аминокислот, который имеет тенденцию образовывать единую альфа-спираль. Сигнальный пептид может начинаться с короткого положительно заряженного участка аминокислот, который помогает обеспечить правильную топологию полипептида во время транслокации. На конце сигнального пептида обычно находится участок из аминокислот, который распознается и расщепляется сигнальной пептидазой. Сигнальная пептидаза может расщепляться во время или после завершения транслокации с образованием свободного сигнального пептида и зрелого белка. Затем свободные сигнальные пептиды расщепляются специфичными протеазами.The core of a signal peptide may contain a long stretch of hydrophobic amino acids that tend to form a single alpha helix. The signal peptide may begin with a short, positively charged stretch of amino acids that helps ensure the correct topology of the polypeptide during translocation. The end of the signal peptide usually contains a stretch of amino acids that is recognized and cleaved by a signal peptidase. The signal peptidase may cleave during or after translocation to yield free signal peptide and mature protein. Free signal peptides are then cleaved by specific proteases.

Сигнальный пептид может быть расположен на аминоконце молекулы.The signal peptide can be located at the amino terminus of the molecule.

Сигнальный пептид может содержать последовательность с SEQ ID от 3 до 5 или ее вариант, имеющий 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотных мутаций (вставки, замены или добавления), при условии, что данный сигнальный пептид продолжает выполнять свою функцию, вызывая экспрессию белка на поверхности клеток.The signal peptide may comprise a sequence of SEQ ID 3 to 5 or a variant thereof having 5, 4, 3, 2 or 1 amino acid mutations (insertions, substitutions or additions), provided that the signal peptide continues to perform its function by causing expression of the protein on the cell surface.

SEQ ID: 3: MGTSLLCWMALCLLGADHADGSEQ ID: 3:MGTSLLCWMALCLLGADHADG

Сигнальный пептид с SEQ ID: 3 является компактным и высокоэффективным. Предполагается, что после концевого глицина будет происходить расщепление примерно на 95%, что обеспечит эффективное удаление сигнальной пептидазой.The signal peptide of SEQ ID: 3 is compact and highly efficient. It is predicted that approximately 95% of the cleavage will occur after the terminal glycine, which will ensure efficient removal by signal peptidase.

SEQ ID: 4: MSLPVTALLLPLALLLHAARPSEQ ID: 4: MSLPVTALLLPLALLLHAARP

Сигнальный пептид с SEQ ID: 4 происходит из IgG1.The signal peptide with SEQ ID: 4 is derived from IgG1.

SEQ ID: 5: MAVPTQVLGLLLLWLTDARCSEQ ID: 5: MAVPTQVLGLLLLWLTDARC

Сигнальный пептид с SEQ ID : 5 происходит из CD8.The signal peptide with SEQ ID: 5 is derived from CD8.

3.2. Спейсерный домен3.2. Spacer domain

CAR содержат спейсерную последовательность для соединения антигенсвязывающего домена с трансмембранным доменом и пространственного отделения антигенсвязывающего домена от эндодомена. Гибкий спейсер позволяет антигенсвязывающему домену располагаться в разных направлениях для облегчения связывания.CARs contain a spacer sequence to connect the antigen-binding domain to the transmembrane domain and spatially separate the antigen-binding domain from the endodomain. The flexible spacer allows the antigen-binding domain to orient itself in different directions to facilitate binding.

В CAR по настоящему изобретению спейсерная последовательность может содержать, например, область Fc IgG1, шарнир IgG1, «стебель» CD8 человека или «стебель» CD8 мыши. В альтернативном варианте спейсер может содержать альтернативную линкерную последовательность, которая имеет сходную длину и/или способность располагать домен в пространстве, что и область Fc IgG1, шарнир IgG1 или «стебель» CD8. Спейсер IgG1 человека может быть изменен для удаления мотивов, связывающих Fc. Спейсер может содержать суперспиральный домен, например, как описано в WO2016/151315.In the CAR of the present invention, the spacer sequence may comprise, for example, an IgG1 Fc region, an IgG1 hinge, a human CD8 stalk, or a mouse CD8 stalk. Alternatively, the spacer may comprise an alternative linker sequence that has a similar length and/or spatial domain positioning ability as the IgG1 Fc region, the IgG1 hinge, or the CD8 stalk. The human IgG1 spacer may be altered to remove Fc binding motifs. The spacer may comprise a coiled-coil domain, for example as described in WO2016/151315.

CAR по настоящему изобретению может содержать последовательность, выбранную из последовательностей с SEQ ID: от 6 до 10 или ее вариант, имеющий по меньшей мере 80%-ную идентичность последовательности.The CAR of the present invention may comprise a sequence selected from the sequences of SEQ ID: 6 to 10 or a variant thereof having at least 80% sequence identity.

SEQ ID: 6 (шарнир-CH2CH3 IgG1 человека)SEQ ID: 6 (Human IgG1 Hinge-CH2CH3)

AEPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIARTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDAEPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIARTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKD

SEQ ID: 7 («стебель» CD8 человека):SEQ ID: 7 (human CD8 stem):

TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDITTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDI

SEQ ID: 8 (шарнир IgG1 человека):SEQ ID: 8 (human IgG1 hinge):

AEPKSPDKTHTCPPCPKDPKAEPKSPDKTHTCPPCPKDPK

SEQ ID: 9 (эктодомен CD2)SEQ ID: 9 (CD2 ectodomain)

KEITNALETWGALGQDINLDIPSFQMSDDIDDIKWEKTSDKKKIAQFRKEKETFKEKDTYKLFKNGTLKIKHLKTDDQDIYKVSIYDTKGKNVLEKIFDLKIQERVSKPKISWTCLLKTGTGTLKERVSKPKISWTCLKNVLKTGTGTGTKVSKPKISWTCMINTTGTGKEITNALETWGALGQDINLDIPSFQMSDDIDDIKWEKTSDKKKIAQFRKEKETFKEKDTYKLFKNGTLKIKHLKTDDQDIYKVSIYDTKGKNVLEKIFDLKIQERVSKPKISWTCLLKTGTGTLKERVSKPKISWTCLKNVLKTGTGTGTKVSKPKISWTCMINTTGTG

EKGLDEKGLD

SEQ ID: 10 (эктодомен CD34)SEQ ID: 10 (CD34 ectodomain)

SLDNNGTATPELPTQGTFSNVSTNVSYQETTTPSTLGSTSLHPVSQHGNEATTNITETTVKFTSTSVITSVYGNTNSSVQSQTSVISTVFTTPANVSTPETTLKPSLSPGNVSDLSTTSTSLATSPTKPYTSSSPILSDIKAEIKCSGIREVKLTQGICLEQNKTSSCAEFKKDRGEGLARVLCGEEQADADAGAQVCSLLLAQSEVRPQCLLLVLANRTEISSKLQLMKKHQSDLKKLGILDFTEQDVASHQSYSQKTSLDNNGTATPELPTQGTFSNVSTNVSYQETTTPSTLGSTSLHPVSQHGNEATTNITETTVKFTSTSVITSVYGNTNSSVQSQTSVISTVFTTPANVSTPETTLKPSLSPGNVSDLSTTSTSLATSPTKP YTSSSPILSDIKAEIKCSGIREVKLTQGICLEQNKTSSCAEFKKDRGEGLARVLCGEEQADADAGAQVCSLLLAQSEVRPQCLLLVLANRTEISSKLQLMKKHQSDLKKLGILDFTEQDVASHQSYSQKT

SEQ ID: 19 (COMP)SEQ ID: 19 (COMP)

DLGPQMLRELQETNAALQDVRELLRQQVREITFLKNTVMECDACGDLGPQMLRELQETNAALQDVRELLRQQVREITFLKNTVMECDACG

Возможно укорочение домена из суперспирального COMP (олигомерный матриксный белок хряща) на N-конце и сохранение экспрессии на поверхности клеток. Таким образом, спейсер из суперспирального COMP может содержать или состоять из укороченного варианта последовательности с SEQ ID: 18, укороченного на N-конце. Укороченный COMP может содержать 5 C-концевых аминокислот с SEQ ID: 19, т.е. последовательность CDACG (SEQ ID: 20). Укороченный COMP может содержать от 5 до 44 аминокислот, например, по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 или 40 аминокислот. Укороченный COMP может соответствовать C-концу последовательности с SEQ ID: 19. Например, укороченный COMP, состоящий из 20 аминокислот, может содержать последовательность QQVREITFLKNTVMECDACG (SEQ ID: 21). Укороченный COMP может сохранять остатки цистеина, участвующие в мультимеризации. Укороченный COMP может сохранять способность образовывать мультимеры.It is possible to shorten the coiled-coil COMP (cartilage oligomeric matrix protein) domain at the N-terminus and retain cell surface expression. Thus, the coiled-coil COMP spacer may comprise or consist of a truncated version of the sequence of SEQ ID: 18, truncated at the N-terminus. The truncated COMP may comprise the C-terminal 5 amino acids of SEQ ID: 19, i.e. the sequence CDACG (SEQ ID: 20). The truncated COMP may comprise 5 to 44 amino acids, such as at least 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 or 40 amino acids. The truncated COMP may correspond to the C-terminus of the sequence of SEQ ID: 19. For example, a truncated COMP consisting of 20 amino acids may comprise the sequence QQVREITFLKNTVMECDACG (SEQ ID: 21). Truncated COMP may retain cysteine residues involved in multimerization. Truncated COMP may retain the ability to form multimers.

3.3. Трансмембранный домен3.3 Transmembrane domain

Трансмембранный домен представляет собой последовательность CAR, которая проходит через мембрану.The transmembrane domain is the sequence of CAR that spans the membrane.

Трансмембранный домен может представлять собой любую белковую структуру, термодинамически стабильную в мембране. Как правило, это альфа-спираль, состоящая из нескольких гидрофобных остатков. Трансмембранный домен любого трансмембранного белка может быть применен для обеспечения трансмембранного участка согласно настоящему изобретению. Наличие и протяженность трансмембранного домена белка могут быть определены специалистами в данной области при помощи алгоритма TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/). Кроме того, с учетом того, что трансмембранный домен белка представляет собой сравнительно простую структуру, то есть предполагается, что полипептидная последовательность образует гидрофобную альфа-спираль достаточной длины, чтобы проходить через мембрану, искусственно созданный TM домен также может быть применен (в US 7052906 B1 описываются компоненты искусственного трансмембранного домена).The transmembrane domain may be any protein structure that is thermodynamically stable in the membrane. Typically, it is an alpha-helix consisting of several hydrophobic residues. The transmembrane domain of any transmembrane protein can be used to provide the transmembrane region according to the present invention. The presence and extent of the transmembrane domain of a protein can be determined by those skilled in the art using the TMHMM algorithm (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/). In addition, given that the transmembrane domain of a protein is a relatively simple structure, i.e., it is assumed that the polypeptide sequence forms a hydrophobic alpha-helix of sufficient length to pass through the membrane, an artificially created TM domain can also be used (US 7,052,906 B1 describes components of an artificial transmembrane domain).

Трансмембранный домен может быть получен из CD28, CD8a или TYRP-1, что обеспечивает хорошую стабильность рецептора.The transmembrane domain can be derived from CD28, CD8a or TYRP-1, which provides good stability to the receptor.

В одном из вариантов реализации трансмембранный домен получен из CD8a.In one embodiment, the transmembrane domain is derived from CD8a.

SEQ ID: 11: трансмембранный домен из CD8a.SEQ ID: 11: Transmembrane domain of CD8a.

IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITIYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT

В другом варианте реализации трансмембранный домен получен из TYRP-1.In another embodiment, the transmembrane domain is derived from TYRP-1.

SEQ ID: 12: трансмембранный домен из TYRP-1.SEQ ID: 12: Transmembrane domain of TYRP-1.

IIAIAVVGALLLVALIFGTASYLIIIAIAVVGALLLVALIFGTASYLI

3.4. Эндодомен3.4. Endodomain

Эндодомен является участком CAR, передающим сигнал. После распознавания антигена кластер рецепторов, нативные CD45 и CD148 исключаются из синапса, и сигнал передается в клетку. Наиболее часто используемым компонентом эндодомена является CD3ζ, который содержит 3 ITAM (активирующий мотив иммунорецептора на основе тирозина). Он передает сигнал активации Т-клетке после связывания антигена. CD3ζ может не обеспечивать полностью компетентный сигнал активации, и может потребоваться дополнительная передача костимулирующего сигнала. Примеры костимулирующих доменов включают эндодомены из CD28, OX40, 4-1BB, CD27 и ICOS, которые можно использовать вместе с CD3ζ для передачи сигнала пролиферации/выживания.The endodomain is the signal transducing region of the CAR. Upon antigen recognition, the receptor cluster, native CD45 and CD148 are excluded from the synapse and the signal is transmitted to the cell. The most commonly used endodomain component is CD3ζ, which contains 3 ITAMs (immunoreceptor tyrosine-based activation motifs). It transmits an activation signal to the T cell upon antigen binding. CD3ζ may not provide a fully competent activation signal and additional costimulatory signaling may be required. Examples of costimulatory domains include endodomains from CD28, OX40, 4-1BB, CD27 and ICOS, which can be used in conjunction with CD3ζ to transmit a proliferation/survival signal.

В одном из вариантов реализации по меньшей мере один костимулирующий эндодомен используют вместе с CD3ζ. В конкретном варианте реализации костимулирующий эндодомен выбран из группы, включающей эндодомены из CD28, OX40, 4-1BB, CD27 и ICOS. In one embodiment, at least one costimulatory endodomain is used together with CD3ζ. In a particular embodiment, the costimulatory endodomain is selected from the group consisting of endodomains from CD28, OX40, 4-1BB, CD27, and ICOS.

В другом варианте реализации по меньшей мере два костимулирующих эндодомена используют вместе с CD3ζ. В конкретном варианте реализации два костимулирующих эндодомена выбраны из группы, состоящей из эндодоменов из CD28, OX40, 4-1BB, CD27 и ICOS в любой комбинации и порядке. Особенно подходящие комбинации включают эндодомены из CD28 и CD3ζ, эндодомены из OX40 и CD3ζ, эндодомены из 4-1BB и CD3ζ, эндодомены из CD28, OX40 и CD3ζ, и эндодомены из CD28, 4-1BB и CD3ζ.In another embodiment, at least two costimulatory endodomains are used together with CD3ζ. In a particular embodiment, the two costimulatory endodomains are selected from the group consisting of endodomains of CD28, OX40, 4-1BB, CD27, and ICOS in any combination and order. Particularly suitable combinations include endodomains of CD28 and CD3ζ, endodomains of OX40 and CD3ζ, endodomains of 4-1BB and CD3ζ, endodomains of CD28, OX40, and CD3ζ, and endodomains of CD28, 4-1BB, and CD3ζ.

Трансмембранный и внутриклеточный сигнальный домен Т-клеток (эндодомен) CAR с активирующим эндодоменом может содержать последовательность с SEQ ID: от 13 до 18 или ее вариант, имеющий не менее 80% идентичности с ней.The transmembrane and intracellular T-cell signaling domain (endodomain) of a CAR with an activating endodomain may comprise a sequence with SEQ ID: 13 to 18 or a variant thereof having at least 80% identity thereto.

SEQ ID: 13, содержащая трансмембранный домен CD28 и эндодомен CD3ζ.SEQ ID: 13, containing the transmembrane domain of CD28 and the endodomain of CD3ζ.

FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLDALSTATKDFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLDALSTATKD

SEQ ID: 14, содержащая трансмембранный домен CD28 и эндодомены CD28 и CD3ζ.SEQ ID: 14, containing the transmembrane domain of CD28 and the endodomains of CD28 and CD3ζ.

FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNGLGMMAKPRRKNLGPRGLGMAKGKPRRKNGLGMAXMMAKPRRKNLGMAFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNGLGMMAKPRRKNLGPRGLGMAKGKPRRKNGLGMAXMMAKPRRKNLGMA

SEQ ID: 15, содержащая трансмембранный домен CD28 и эндодомены CD28, OX40 и CD3ζ.SEQ ID: 15, containing the transmembrane domain of CD28 and the endodomains of CD28, OX40 and CD3ζ.

FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKIRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKIRVKF SRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

SEQ ID: 16, содержащая трансмембранный домен CD8a и эндодомен CD3ζ.SEQ ID: 16, containing the transmembrane domain of CD8a and the endodomain of CD3ζ.

IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITRVLYCKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYPPRHIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITRVLYCKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYPPRH

SEQ ID: 17, содержащая трансмембранный домен CD8a и эндодомены 4-1BB и CD3ζ.SEQ ID: 17, containing the transmembrane domain of CD8a and the 4-1BB and CD3ζ endodomains.

IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYN

SEQ ID: 18, содержащая трансмембранный домен TYRP-1 и эндодомены 4-1BB и CD3ζ.SEQ ID: 18, containing the TYRP-1 transmembrane domain and the 4-1BB and CD3ζ endodomains.

IIAIAVVGALLLVALIFGTASYLIKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGGKPRRKAYDVLDKRRGRDPEMGGGKPRRKAYPQEGLYNELQIIAIAVVGALLLVALIFGTASYLIKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGGKPRRKAYDVLDKRRGRDPEMGGGKPRRKAYPQEGLYNELQ

Вариант последовательности может иметь по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичности последовательности с SEQ ID: с 13 по 18, при условии, что данная последовательность обеспечивает эффективный трансмембранный домен и эффективный внутриклеточный Т-клеточный сигнальный домен.The sequence variant may have at least 80%, 85%, 90%, 95%, 98% or 99% sequence identity to SEQ ID: 13 to 18, provided that the sequence provides an effective transmembrane domain and an effective intracellular T cell signaling domain.

CAR согласно настоящему изобретению может содержать последовательность из группы последовательностей с SEQ ID: с 25 по 36.The CAR of the present invention may comprise a sequence from the group of sequences with SEQ ID: 25 to 36.

SEQ ID: 25: CAR, содержащий мутации T28K, Y32F, A100N в домене VH, мутацию N35K в домене VL, шарнирный спейсер IgG1, трансмембранный домен TYRP-1, эндодомены 4-1BB и CD3ζ.SEQ ID: 25: CAR containing T28K, Y32F, A100N mutations in the VH domain, N35K mutation in the VL domain, IgG1 hinge spacer, TYRP-1 transmembrane domain, 4-1BB and CD3ζ endodomains.

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTGFVMHWVRQAPGQGLEWMGFINPYNDDIQSNERFRGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGNGYNFDGAYRFFDFWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQRLVHSNGKTYLHWYLQKPGQSPRLLIYRVSNRFPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPYTFGQGTKLEIKRSDPAEPKSPDKTHTCPPCPKDPKIIAIAVVGALLLVALIFGTASYLIKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTGFVMHWVRQAPGQGLEWMGFINPYNDDIQSNERFRGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGNGYNFDGAYRFFDF WGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQRLVHSNGKTYLHWYLQKPGQSPRLLIYRVSNRFPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDV GVYYCSQSTHVPYTFGQGTKLEIKRSDPAEPKSPDKTHTCPPCPKDPKIIAIAVVGALLLVALIFGTASYLIKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCE LRRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

SEQ ID: 26: CAR, содержащий мутации T28K, Y32F, A100N в домене VH, шарнирный спейсер IgG1, трансмембранный домен TYRP-1, эндодомены 4-1BB и CD3ζ.SEQ ID: 26: CAR containing T28K, Y32F, A100N mutations in the VH domain, IgG1 hinge spacer, TYRP-1 transmembrane domain, 4-1BB and CD3ζ endodomains.

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTGFVMHWVRQAPGQGLEWMGFINPYNDDIQSNERFRGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGNGYNFDGAYRFFDFWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQRLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPRLLIYRVSNRFPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPYTFGQGTKLEIKRSDPAEPKSPDKTHTCPPCPKDPKIIAIAVVGALLLVALIFGTASYLIKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTGFVMHWVRQAPGQGLEWMGFINPYNDDIQSNERFRGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGNGYNFDGAYRFFDF WGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQRLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPRLLIYRVSNRFPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDV GVYYCSQSTHVPYTFGQGTKLEIKRSDPAEPKSPDKTHTCPPCPKDPKIIAIAVVGALLLVALIFGTASYLIKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCE LRRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

SEQ ID: 27: CAR, содержащий мутации T28K, Y32F, A100N, N103L в домене VH, шарнирный спейсер IgG1, трансмембранный домен TYRP-1 и эндодомены 4-1BB и CD3ζ.SEQ ID: 27: CAR containing T28K, Y32F, A100N, N103L mutations in the VH domain, IgG1 hinge spacer, TYRP-1 transmembrane domain and 4-1BB and CD3ζ endodomains.

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTGFVMHWVRQAPGQGLEWMGFINPYNDDIQSNERFRGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGNGYLFDGAYRFFDFWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQRLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPRLLIYRVSNRFPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPYTFGQGTKLEIKRSDPAEPKSPDKTHTCPPCPKDPKIIAIAVVGALLLVALIFGTASYLIKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTGFVMHWVRQAPGQGLEWMGFINPYNDDIQSNERFRGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGNGYLFDGAYRFFDF WGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQRLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPRLLIYRVSNRFPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDV GVYYCSQSTHVPYTFGQGTKLEIKRSDPAEPKSPDKTHTCPPCPKDPKIIAIAVVGALLLVALIFGTASYLIKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCE LRRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

SEQ ID: 28: CAR, содержащий мутации T28K, Y32F, A100N, N103M в домене VH, мутацию N35Y в домене VL, шарнирный спейсер IgG1, трансмембранный домен TYRP-1, эндодомены 4-1BB и CD3ζ.SEQ ID: 28: CAR containing T28K, Y32F, A100N, N103M mutations in the VH domain, N35Y mutation in the VL domain, IgG1 hinge spacer, TYRP-1 transmembrane domain, 4-1BB and CD3ζ endodomains.

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTGFVMHWVRQAPGQGLEWMGFINPYNDDIQSNERFRGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGNGYMFDGAYRFFDFWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQRLVHSNGYTYLHWYLQKPGQSPRLLIYRVSNRFPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPYTFGQGTKLEIKRSDPAEPKSPDKTHTCPPCPKDPKIIAIAVVGALLLVALIFGTASYLIKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTGFVMHWVRQAPGQGLEWMGFINPYNDDIQSNERFRGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGNGYMFDGAYRFFDF WGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQRLVHSNGYTYLHWYLQKPGQSPRLLIYRVSNRFPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDV GVYYCSQSTHVPYTFGQGTKLEIKRSDPAEPKSPDKTHTCPPCPKDPKIIAIAVVGALLLVALIFGTASYLIKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCE LRRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

SEQ ID: 29: CAR, содержащий мутации T28K, Y32F, A100N, N103M в домене VH, мутацию N35R в домене VL, шарнирный спейсер IgG1, трансмембранный домен TYRP-1, эндодомены 4-1BB и CD3ζ.SEQ ID: 29: CAR containing T28K, Y32F, A100N, N103M mutations in the VH domain, N35R mutation in the VL domain, IgG1 hinge spacer, TYRP-1 transmembrane domain, 4-1BB and CD3ζ endodomains.

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTGFVMHWVRQAPGQGLEWMGFINPYNDDIQSNERFRGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGNGFMFDGAYRFFDFWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQRLVHSNGRTYLHWYLQKPGQSPRLLIYRVSNRFPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPYTFGQGTKLEIKRSDPAEPKSPDKTHTCPPCPKDPKIIAIAVVGALLLVALIFGTASYLIKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTGFVMHWVRQAPGQGLEWMGFINPYNDDIQSNERFRGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGNGFMFDGAYRFFDF WGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQRLVHSNGRTYLHWYLQKPGQSPRLLIYRVSNRFPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDV GVYYCSQSTHVPYTFGQGTKLEIKRSDPAEPKSPDKTHTCPPCPKDPKIIAIAVVGALLLVALIFGTASYLIKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCE LRRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

SEQ ID: 30: CAR, содержащий мутации T28K, Y32F, A100N, Y102L, N103M в домене VH, мутации N35R в домене VL, шарнирный спейсер IgG1, трансмембранный домен TYRP-1, эндодомены 4-1BB и CD3ζ.SEQ ID: 30: CAR containing T28K, Y32F, A100N, Y102L, N103M mutations in the VH domain, N35R mutations in the VL domain, IgG1 hinge spacer, TYRP-1 transmembrane domain, 4-1BB and CD3ζ endodomains.

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTGFVMHWVRQAPGQGLEWMGFINPYNDDIQSNERFRGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGNGLMFDGAYRFFDFWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQRLVHSNGRTYLHWYLQKPGQSPRLLIYRVSNRFPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPYTFGQGTKLEIKRSDPAEPKSPDKTHTCPPCPKDPKIIAIAVVGALLLVALIFGTASYLIKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTGFVMHWVRQAPGQGLEWMGFINPYNDDIQSNERFRGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGNGLMFDGAYRFFDF WGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQRLVHSNGRTYLHWYLQKPGQSPRLLIYRVSNRFPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDV GVYYCSQSTHVPYTFGQGTKLEIKRSDPAEPKSPDKTHTCPPCPKDPKIIAIAVVGALLLVALIFGTASYLIKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCE LRRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

SEQ ID: 31: CAR, содержащий мутации T28K, Y32F, A100N в домене VH, спейсер-«стебель» CD8, трансмембраный домен TYRP-1 и эндодомены 4-1BB и CD3ζ.SEQ ID: 31: CAR containing T28K, Y32F, A100N mutations in the VH domain, CD8 stem spacer, TYRP-1 transmembrane domain and 4-1BB and CD3ζ endodomains.

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTGFVMHWVRQAPGQGLEWMGFINPYNDDIQSNERFRGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGNGYNFDGAYRFFDFWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQRLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPRLLIYRVSNRFPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPYTFGQGTKLEIKRSDPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIIIAIAVVGALLLVALIFGTASYLIKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTGFVMHWVRQAPGQGLEWMGFINPYNDDIQSNERFRGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGNGYNFDGAYRFFDFWGQGTMV TVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQRLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPRLLIYRVSNRFPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPY TFGQGTKLEIKRSDPTTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIIIAIAVVGALLLVALIFGTASYLIKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEE EEGGCELRRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

SEQ ID: 32: CAR, содержащий мутации T28K, Y32F, A100N в домене VH, спейсер-«стебель» CD8, трансмембранный домен TYRP-1 и эндодомены CD28 и CD3ζ.SEQ ID: 32: CAR containing T28K, Y32F, A100N mutations in the VH domain, CD8 stem spacer, TYRP-1 transmembrane domain and CD28 and CD3ζ endodomains.

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTGFVMHWVRQAPGQGLEWMGFINPYNDDIQSNERFRGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGNGYNFDGAYRFFDFWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQRLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPRLLIYRVSNRFPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPYTFGQGTKLEIKRSDPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIIIAIAVVGALLLVALIFGTASYLIRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTGFVMHWVRQAPGQGLEWMGFINPYNDDIQSNERFRGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGNGYNFDGAYRFFDFWGQGTM VTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQRLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPRLLIYRVSNRFPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVP YTFGQGTKLEIKRSDPTTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIIIAIAVVGALLLVALIFGTASYLIRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPR DFAAYRSRRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

SEQ ID: 33: CAR, содержащий мутации T28K, Y32F, A100N в домене VH, шарнирный спейсер IgG1, трансмембранный домен TYRP-1, эндодомены CD28 и CD3ζ.SEQ ID: 33: CAR containing T28K, Y32F, A100N mutations in the VH domain, IgG1 hinge spacer, TYRP-1 transmembrane domain, CD28 and CD3ζ endodomains.

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTGFVMHWVRQAPGQGLEWMGFINPYNDDIQSNERFRGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGNGYNFDGAYRFFDFWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQRLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPRLLIYRVSNRFPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPYTFGQGTKLEIKRSDPAEPKSPDKTHTCPPCPKDPKIIAIAVVGALLLVALIFGTASYLIRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTGFVMHWVRQAPGQGLEWMGFINPYNDDIQSNERFRGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGNGYNFDGAYRFFDF WGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQRLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPRLLIYRVSNRFPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAED VGVYYCSQSTHVPYTFGQGTKLEIKRSDPAEPKSPDKTHTCPPCPKDPKIIAIAVVGALLLVALIFGTASYLIRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYR SRRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

SEQ ID: 34: CAR, содержащий мутации T28K, Y32F, A100N в домене VH, мутацию N35K в домене VL, шарнирный спейсер IgG1, трансмембранный домен TYRP-1, эндодомены CD28 и CD3ζ.SEQ ID: 34: CAR containing T28K, Y32F, A100N mutations in the VH domain, N35K mutation in the VL domain, IgG1 hinge spacer, TYRP-1 transmembrane domain, CD28 and CD3ζ endodomains.

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTGFVMHWVRQAPGQGLEWMGFINPYNDDIQSNERFRGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGNGYNFDGAYRFFDFWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQRLVHSNGKTYLHWYLQKPGQSPRLLIYRVSNRFPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPYTFGQGTKLEIKRSDPAEPKSPDKTHTCPPCPKDPKIIAIAVVGALLLVALIFGTASYLIRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTGFVMHWVRQAPGQGLEWMGFINPYNDDIQSNERFRGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGNGYNFDGAYRFFDF WGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQRLVHSNGKTYLHWYLQKPGQSPRLLIYRVSNRFPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAED VGVYYCSQSTHVPYTFGQGTKLEIKRSDPAEPKSPDKTHTCPPCPKDPKIIAIAVVGALLLVALIFGTASYLIRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYR SRRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

SEQ ID: 35: CAR, содержащий мутации T28K, Y32F, A100N в домене VH, мутацию N35K в домене VL, спейсер-«стебель» CD8, трансмембранный домен TYRP-1 и эндодомены 4-1BB и CD3ζ.SEQ ID: 35: CAR containing T28K, Y32F, A100N mutations in the VH domain, N35K mutation in the VL domain, CD8 stem spacer, TYRP-1 transmembrane domain and 4-1BB and CD3ζ endodomains.

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTGFVMHWVRQAPGQGLEWMGFINPYNDDIQSNERFRGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGNGYNFDGAYRFFDFWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQRLVHSNGKTYLHWYLQKPGQSPRLLIYRVSNRFPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPYTFGQGTKLEIKRSDPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIIIAIAVVGALLLVALIFGTASYLIKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTGFVMHWVRQAPGQGLEWMGFINPYNDDIQSNERFRGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGNGYNFDGAYRFFDFWGQGTMV TVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQRLVHSNGKTYLHWYLQKPGQSPRLLIYRVSNRFPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPY TFGQGTKLEIKRSDPTTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIIIAIAVVGALLLVALIFGTASYLIKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEE EEGGCELRRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

SEQ ID: 36: CAR, содержащий мутации T28K, Y32F, A100N в домене VH, мутацию N35K в домене VL, спейсер-«стебель» CD8, трансмембранный домен TYRP-1, эндодомены CD28 и CD3ζ.SEQ ID: 36: CAR containing T28K, Y32F, A100N mutations in the VH domain, N35K mutation in the VL domain, CD8 stem spacer, TYRP-1 transmembrane domain, CD28 and CD3ζ endodomains.

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTGFVMHWVRQAPGQGLEWMGFINPYNDDIQSNERFRGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGNGYNFDGAYRFFDFWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQRLVHSNGKTYLHWYLQKPGQSPRLLIYRVSNRFPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPYTFGQGTKLEIKRSDPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIIIAIAVVGALLLVALIFGTASYLIRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTGFVMHWVRQAPGQGLEWMGFINPYNDDIQSNERFRGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGNGYNFDGAYRFFDFWGQGTM VTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQRLVHSNGKTYLHWYLQKPGQSPRLLIYRVSNRFPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVP YTFGQGTKLEIKRSDPTTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIIIAIAVVGALLLVALIFGTASYLIRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPR DFAAYRSRRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

4. Биспецифичный активатор Т-клеток4. Bispecific T cell activator

Был разработан широкий спектр молекул, которые основаны на базовой концепции наличия двух антителоподобных связывающих доменов.A wide range of molecules have been developed that are based on the basic concept of having two antibody-like binding domains.

Биспецифичные молекулы, рекрутирующие Т-клетки, представляют собой класс биспецифичных антителоподобных молекул, которые были разработаны прежде всего для применения в качестве противораковых лекарственных средств. Они направляют иммунную систему хозяина, точнее цитотоксическую активность Т-клеток, против клетки-мишени, такой как раковая клетка. В этих молекулах один связывающий домен связывается с Т-клеткой через рецептор CD3, а другой - с клетками-мишенями, такими как опухолевая клетка (через специфичную для опухоли молекулу). Поскольку биспецифичная молекула связывает как клетку-мишень, так и Т-клетку, она сближает клетку-мишень с Т-клеткой, таким образом, чтобы Т-клетка могла оказывать свое воздействие, например, цитотоксическое действие на раковую клетку. Образование комплекса «Т-клетка:биспецифичное Ат:раковая клетка» индуцирует передачу сигналов в Т-клетке, приводя, например, к высвобождению цитотоксических медиаторов. В идеале агент индуцирует желаемую передачу сигналов только в присутствии клетки-мишени, что приводит к избирательному уничтожению.Bispecific T cell recruiting molecules are a class of bispecific antibody-like molecules that have been developed primarily for use as anticancer drugs. They direct the host immune system, more specifically the cytotoxic activity of T cells, against a target cell, such as a cancer cell. In these molecules, one binding domain binds to the T cell via the CD3 receptor and the other binds to target cells, such as a tumor cell (via a tumor-specific molecule). Since the bispecific molecule binds both the target cell and the T cell, it brings the target cell into close proximity to the T cell so that the T cell can exert its effects, such as cytotoxic effects on the cancer cell. The formation of the T cell:bispecific Ab:cancer cell complex induces signaling in the T cell, leading to, for example, the release of cytotoxic mediators. Ideally, the agent induces the desired signaling only in the presence of the target cell, resulting in selective killing.

Биспецифичные молекулы, рекрутирующие Т-клетки, были разработаны в нескольких различных форматах, но одним из наиболее распространенных является слитая молекула, состоящая из двух тандемно расположенных одноцепочечных вариабельных фрагментов (scFv) различных антител. Иногда их называют BiTE (биспецифичные активаторы Т-клеток).Bispecific T cell recruitment molecules have been developed in several different formats, but one of the most common is a fusion molecule consisting of two single chain variable fragments (scFv) of different antibodies in tandem. These are sometimes referred to as BiTEs (bispecific T cell activators).

В настоящем изобретении также рассматривается биспецифичная молекула, которая избирательно распознает TRBC2 и способна активировать Т-клетки. Например, данная молекула может представлять собой BiTE.The present invention also provides a bispecific molecule that selectively recognizes TRBC2 and is capable of activating T cells. For example, this molecule may be a BiTE.

Таким образом, в еще одном аспекте настоящего изобретения предложен биспецифичный активатор Т-клеток (BiTE) (далее - «BiTE согласно настоящему изобретению»), содержащий вариантный антигенсвязывающий домен согласно настоящему изобретению и домен активации Т-клеток.Thus, in another aspect, the present invention provides a bispecific T cell activator (BiTE) (hereinafter referred to as the " BiTE of the present invention ") comprising a variant antigen binding domain of the present invention and a T cell activation domain.

Термин «вариантный антигенсвязывающий домен согласно настоящему изобретению» был подробно раскрыт в контексте первого аспекта настоящего изобретения, и его признаки и варианты реализации в равной степени применимы к данному аспекту настоящего изобретения.The term "variant antigen binding domain according to the present invention" has been described in detail in the context of the first aspect of the present invention, and its features and embodiments are equally applicable to this aspect of the present invention.

Термин «домен активации Т-клеток» в контексте настоящей заявки относится ко второму домену, способному активировать Т-клетки. Домен активации Т-клеток может представлять собой scFv, который специфично связывается с CD3. Примеры scFv к CD3, которые подходят для целей настоящего изобретения, хорошо известны в данной области и включают, без ограничения, scFv, полученный из OKT3.The term " T cell activation domain " in the context of the present application refers to a second domain capable of activating T cells. The T cell activation domain may be an scFv that specifically binds to CD3. Examples of anti-CD3 scFvs that are suitable for the purposes of the present invention are well known in the art and include, but are not limited to, an OKT3-derived scFv.

Биспецифичная молекула может содержать сигнальный пептид, способствующий ее продуцированию. Сигнальный пептид может вызывать секрецию биспецифичной молекулы клеткой-хозяином, таким образом, биспецифичная молекула может быть собрана из супернатанта клетки-хозяина.The bispecific molecule may contain a signal peptide that promotes its production. The signal peptide may cause secretion of the bispecific molecule by the host cell, so that the bispecific molecule can be collected from the supernatant of the host cell.

Сигнальный пептид может быть расположен на аминоконце молекулы. Биспецифичная молекула может иметь следующую общую формулу: сигнальный пептид - вариантный антигенсвязывающий домен согласно настоящему изобретению - домен активации Т-клеток.The signal peptide may be located at the amino terminus of the molecule. The bispecific molecule may have the following general formula: signal peptide - variant antigen-binding domain according to the present invention - T-cell activation domain.

Биспецифичная молекула может содержать спейсерную последовательность для соединения вариантного антигенсвязывающего домена согласно настоящему изобретению и домена активации Т-клеток, и для пространственного разделения двух доменов.The bispecific molecule may comprise a spacer sequence for connecting the variant antigen-binding domain of the present invention and the T-cell activation domain, and for spatially separating the two domains.

Спейсерная последовательность может, например, содержать шарнир IgG1 или «стебель» CD8. В альтернативном варианте линкер может содержать альтернативную линкерную последовательность, которая имеет такие же характеристики длины и/или расстояния между доменами, что и шарнир IgG1 или «стебель» CD8.The spacer sequence may, for example, comprise an IgG1 hinge or a CD8 stalk. Alternatively, the linker may comprise an alternative linker sequence that has the same length and/or interdomain spacing characteristics as the IgG1 hinge or CD8 stalk.

5. Нуклеиновая кислота5. Nucleic acid

В еще одном аспекте настоящего изобретения также предложена последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая вариантный антигенсвязывающий домен согласно настоящему изобретению (далее «первая нуклеиновая кислота согласно настоящему изобретению»).In another aspect, the present invention also provides a nucleic acid sequence encoding a variant antigen-binding domain according to the present invention (hereinafter referred to as the " first nucleic acid according to the present invention ").

В другом аспекте настоящего изобретения также предложена последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело согласно настоящему изобретению, (далее - «вторая нуклеиновая кислота согласно настоящему изобретению»).In another aspect, the present invention also provides a nucleic acid sequence encoding an antibody of the present invention (hereinafter referred to as the " second nucleic acid of the present invention ").

В еще одном аспекте настоящего изобретения также предложена последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая CAR согласно настоящему изобретению (далее - «третья нуклеиновая кислота согласно настоящему изобретению»).In another aspect, the present invention also provides a nucleic acid sequence encoding a CAR according to the present invention (hereinafter referred to as the “ third nucleic acid according to the present invention ”).

В еще одном аспекте настоящего изобретения также предложена последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая BiTE согласно настоящему изобретению (далее - «четвертая нуклеиновая кислота согласно настоящему изобретению»).In another aspect, the present invention also provides a nucleic acid sequence encoding a BiTE according to the present invention (hereinafter referred to as the “ fourth nucleic acid according to the present invention ”).

Термины «вариантный антигенсвязывающий домен согласно настоящему изобретению», «антитело согласно настоящему изобретению» и «BiTE согласно настоящему изобретению» были подробно раскрыты в контексте предыдущих аспектов изобретения, и их признаки и варианты реализации в равной степени применимы к данным аспектам изобретения.The terms “variant antigen-binding domain of the present invention”, “antibody of the present invention” and “BiTE of the present invention” have been described in detail in the context of previous aspects of the invention, and their features and embodiments apply equally to these aspects of the invention.

В контексте настоящей заявки термины «полинуклеотид», «нуклеотид» и «нуклеиновая кислота» предназначены для применения в качестве синонимов друг друга.In the context of the present application, the terms " polynucleotide ", " nucleotide " and " nucleic acid " are intended to be used as synonyms for each other.

Специалисту в данной области будет понятно, что многочисленные различные полинуклеотиды и нуклеиновые кислоты могут кодировать один и тот же полипептид вследствие вырожденности генетического кода. Кроме того, следует понимать, что квалифицированные специалисты могут, используя обычные способы, делать замены нуклеотидов, которые не влияют на полипептидную последовательность, кодируемую полинуклеотидами, описанными в настоящей заявке, чтобы отразить применение кодонов в любом конкретном организме-хозяине, в котором должны быть экспрессированы полипептиды.It will be appreciated by those skilled in the art that multiple different polynucleotides and nucleic acids may encode the same polypeptide due to the degeneracy of the genetic code. It will also be appreciated that skilled artisans may, using routine methods, make nucleotide substitutions that do not affect the polypeptide sequence encoded by the polynucleotides described herein to reflect codon usage in any particular host organism in which the polypeptides are to be expressed.

Последовательности нуклеиновых кислот и конструкции по настоящему изобретению могут содержать альтернативные кодоны в областях последовательностей, кодирующих идентичные или схожие аминокислотные последовательности для того, чтобы избежать гомологичной рекомбинации.The nucleic acid sequences and constructs of the present invention may contain alternative codons in regions of sequences encoding identical or similar amino acid sequences in order to avoid homologous recombination.

В соответствии с настоящим изобретением нуклеиновые кислоты могут содержать ДНК или РНК. Они могут быть одноцепочечными или двухцепочечными. Они также могут представлять собой полинуклеотиды, которые включают синтетические или модифицированные нуклеотиды. В данной области известен ряд различных типов модификации олигонуклеотидов. Они включают метилфосфонатные и фосфоротиоатные остовы, добавление акридиновых или полилизиновых цепей на 3' и/или 5' концах молекулы. Для целей применения в соответствии с настоящей заявкой, следует понимать, что полинуклеотиды могут быть модифицированы любым способом, доступным в данной области техники. Такие модификации могут быть выполнены с целью увеличения активности in vivo или продолжительности жизни представляющих интерес полинуклеотидов.According to the present invention, nucleic acids may comprise DNA or RNA. They may be single-stranded or double-stranded. They may also be polynucleotides that include synthetic or modified nucleotides. A number of different types of modification of oligonucleotides are known in the art. These include methylphosphonate and phosphorothioate backbones, the addition of acridine or polylysine chains at the 3' and/or 5' ends of the molecule. For the purposes of use according to the present application, it is understood that polynucleotides may be modified by any method available in the art. Such modifications may be made to increase the in vivo activity or life span of the polynucleotides of interest.

Термины «вариант», «гомолог» или «производное» в отношении нуклеотидной последовательности включают какую-либо замену, видоизменение, модификацию, перестановку, делецию или добавление одной или нескольких нуклеиновых кислот в последовательность или из нее.The terms " variant ", " homolog " or " derivative " in relation to a nucleotide sequence include any substitution, alteration, modification, rearrangement, deletion or addition of one or more nucleic acids into or from the sequence.

6. Вектор6. Vector

В настоящем изобретении также предложен вектор или набор векторов, который содержит одну или несколько последовательностей нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению. Такой вектор может быть применен для введения последовательности нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина для того, чтобы она экспрессировала вариантную антигенсвязывающую молекулу или антитело, или CAR, или BiTE согласно настоящему изобретению.The present invention also provides a vector or a set of vectors that contains one or more nucleic acid sequences according to the present invention. Such a vector can be used to introduce a nucleic acid sequence into a host cell so that it expresses a variant antigen-binding molecule or antibody, or CAR, or BiTE according to the present invention.

Термины «вариантный антигенсвязывающий домен согласно настоящему изобретению», «антитело согласно настоящему изобретению» и «BiTE согласно настоящему изобретению» были подробно раскрыты в контексте предыдущих аспектов изобретения, и их признаки и варианты реализации в равной степени применимы к данным аспектам изобретения.The terms “variant antigen-binding domain of the present invention”, “antibody of the present invention” and “BiTE of the present invention” have been described in detail in the context of previous aspects of the invention, and their features and embodiments apply equally to these aspects of the invention.

Вектор может, например, представлять собой плазмиду или вирусный вектор, такой как ретровирусный или лентивирусный вектор, или вектор на основе транспозона, или или синтетическую мРНК. The vector may, for example, be a plasmid or a viral vector, such as a retroviral or lentiviral vector, or a transposon-based vector, or a synthetic mRNA.

Вектор может быть способен к трансфекции или трансдукции цитолитической иммунной клетки, такой как Т-клетка или NK-клетка.The vector may be capable of transfecting or transducing a cytolytic immune cell, such as a T cell or NK cell.

7. Клетка 7. Cage

Еще один аспект настоящего изобретения относится к клетке (далее - «клетка согласно настоящему изобретению»), которая содержит CAR согласно настоящему изобретению.Another aspect of the present invention relates to a cell (hereinafter referred to as the “ cell of the present invention ”) that comprises a CAR of the present invention.

Клетка может содержать нуклеиновую кислоту или вектор по настоящему изобретению.The cell may comprise a nucleic acid or vector of the present invention.

Термины «CAR согласно настоящему изобретению», «нуклеиновая кислота согласно настоящему изобретению», «вектор согласно настоящему изобретению» были подробно раскрыты в контексте предыдущих аспектов изобретения, и их признаки и варианты реализации в равной степени применимы к данным аспектам изобретения.The terms “CAR according to the present invention”, “nucleic acid according to the present invention”, “vector according to the present invention” have been described in detail in the context of previous aspects of the invention, and their features and embodiments are equally applicable to these aspects of the invention.

Клетка может представлять собой цитолитическую иммунную клетку, такую как Т-клетка или NK-клетка.The cell may be a cytolytic immune cell such as a T cell or an NK cell.

Т-клетки или Т-лимфоциты представляют собой вид лимфоцитов, которые играют центральную роль в клеточном иммунитете. Их можно отличить от других лимфоцитов, таких как В-клетки и естественные клетки-киллеры (NK-клетки), по наличию Т-клеточного рецептора (TCR) на поверхности клетки. Ниже приведен краткий обзор различных типов Т-клеток.T cells, or T lymphocytes, are a type of lymphocyte that play a central role in cellular immunity. They can be distinguished from other lymphocytes, such as B cells and natural killer (NK) cells, by the presence of a T cell receptor (TCR) on the cell surface. Below is a brief overview of the different types of T cells.

Хелперные Т-клетки (Th-клетки) помогают другим лейкоцитам в иммунологических процессах, включая созревание В-клеток в плазматические клетки и В-клетки памяти, и в активации цитотоксических Т-клеток и макрофагов. Th-клетки экспрессируют CD4 на своей поверхности. Th-клетки активируются, когда молекулы ГКГС II класса презентируют им пептидные антигены на поверхности антигенпрезентирующих клеток (АПК). Эти клетки могут дифференцироваться в один из нескольких подтипов, включая TH1, TH2, TH3, TH17, Th9 или TFH, которые секретируют различные цитокины для облегчения различных типов иммунных ответов.Helper T cells (Th cells) assist other white blood cells in immunologic processes, including the maturation of B cells into plasma cells and memory B cells and the activation of cytotoxic T cells and macrophages. Th cells express CD4 on their surface. Th cells are activated when MHC class II molecules present them with peptide antigens on the surface of antigen-presenting cells (APCs). These cells can differentiate into one of several subtypes, including TH1, TH2, TH3, TH17, Th9, or TFH, which secrete different cytokines to facilitate different types of immune responses.

Цитолитические Т-клетки (клетки TC или CTL) разрушают инфицированные вирусом клетки и опухолевые клетки, и участвуют в отторжении трансплантата. CTL экспрессируют CD8 на своей поверхности. Эти клетки распознают свои мишени путем связывания с антигеном, ассоциированным с ГКГС I класса, который присутствует на поверхности всех содержащих ядро клеток. Через IL-10, аденозин и другие молекулы, секретируемые регуляторными Т-клетками, клетки CD8+ могут быть инактивированы до состояния анергии, что предотвращает аутоиммунные заболевания, такие как экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит.Cytolytic T cells (TC or CTL cells) destroy virus-infected cells and tumor cells and participate in transplant rejection. CTLs express CD8 on their surface. These cells recognize their targets by binding to MHC class I-associated antigen, which is present on the surface of all nucleated cells. Through IL-10, adenosine, and other molecules secreted by regulatory T cells, CD8+ cells can be inactivated into anergy, preventing autoimmune diseases such as experimental autoimmune encephalomyelitis.

Т-клетки памяти представляют собой подгруппу антиген-специфичных Т-клеток, которые сохраняются в течение длительного времени после устранения инфекции. Они быстро размножаются с образованием большого количества эффекторных Т-клеток при повторном контакте с родственным им антигеном, таким образом обеспечивая иммунную систему «памятью» против прошлых инфекций. Т-клетки памяти включают три подтипа: Т-клетки центральной памяти (клетки TCM) и два типа T-клеток эффекторной памяти (клетки TEM и клетки TEMRA). Клетки памяти могут представлять собой CD4+ или CD8+. Т-клетки памяти обычно экспрессируют белок клеточной поверхности CD45RO.Memory T cells are a subset of antigen-specific T cells that persist long after infection has been cleared. They proliferate rapidly to produce large numbers of effector T cells upon re-exposure to their cognate antigen, thus providing the immune system with a “memory” against past infections. Memory T cells include three subtypes: central memory T cells (TCM cells) and two types of effector memory T cells (TEM cells and TEMRA cells). Memory cells can be CD4+ or CD8+. Memory T cells typically express the cell surface protein CD45RO.

Регуляторные Т-клетки (T-reg-клетки), ранее известные как супрессорные Т-клетки, имеют решающее значение для поддержания иммунологической толерантности. Их основная роль заключается в отключении опосредованного Т-клетками иммунитета к концу иммунной реакции и в подавлении аутореактивных Т-клеток, которые избежали процесса негативного отбора в тимусе.Regulatory T cells (Treg cells), previously known as suppressor T cells, are critical for maintaining immune tolerance. Their primary role is to turn off T cell-mediated immunity toward the end of an immune response and to suppress autoreactive T cells that have escaped the negative selection process in the thymus.

Были описаны два основных типа CD4+ Treg клеток -Treg естественного происхождения и адаптивные Treg.Two main types of CD4+ Treg cells have been described: naturally occurring Tregs and adaptive Tregs.

T-reg-клетки естественного происхождения (также известные как T-reg-клетки CD4+CD25+FoxP3+) образуются в тимусе и связаны с взаимодействиями между развивающимися Т-клетками как с миелоидными (CD11c+), так и с плазмацитоидными (CD123+) дендритными клетками, которые были активированы с помощью TSLP (тимусный стромальный лимфопоэтин). T-reg-клетки естественного происхождения можно отличить от других Т-клеток по наличию внутриклеточной молекулы, называемой FoxP3. Мутации гена FOXP3 могут предотвращать развитие регуляторных Т-клеток, вызывая смертельное аутоиммунное заболевание IPEX (Х-сцепленный синдром иммунной дисрегуляции, полиэндокринопатии и энтеропатии).Naturally occurring Tregs (also known as CD4+CD25+FoxP3+ Tregs) are generated in the thymus and are associated with interactions between developing T cells and both myeloid (CD11c+) and plasmacytoid (CD123+) dendritic cells that have been activated by TSLP (thymic stromal lymphopoietin). Naturally occurring Tregs can be distinguished from other T cells by the presence of an intracellular molecule called FoxP3. Mutations in the FOXP3 gene can prevent regulatory T cells from developing, causing the fatal autoimmune disease IPEX (X-linked immune dysregulation, polyendocrinopathy and enteropathy syndrome).

Адаптивные клетки Treg (также известные как клетки Tr1 или клетки Th3) могут образовываться во время нормального иммунного ответа.Adaptive Treg cells (also known as Tr1 cells or Th3 cells) can be produced during a normal immune response.

Клетка может представлять собой естественную клетку-киллер (или NK-клетку). NK-клетки являются частью врожденной иммунной системы. NK-клетки обеспечивают быстрые ответы на рефлекторные сигналы от инфицированных вирусом клеток независимо от ГКГС.The cell may be a natural killer (or NK) cell. NK cells are part of the innate immune system. NK cells provide rapid responses to reflex signals from virus-infected cells independent of MHC.

NK-клетки, принадлежащие к группе врожденных лимфоидных клеток, характеризуются как крупные гранулярные лимфоциты (LGL) и представляют собой третий тип клеток, дифференцированных от общего лимфоидного предшественника, генерирующего В- и Т-лимфоциты. Известно, что NK-клетки дифференцируются и созревают в костном мозге, лимфатическом узле, селезенке, миндалинах и тимусе, откуда они затем попадают в кровоток.NK cells, a member of the innate lymphoid cell group, are characterized as large granular lymphocytes (LGLs) and are the third cell type differentiated from the common lymphoid progenitor that generates B and T lymphocytes. NK cells are known to differentiate and mature in the bone marrow, lymph node, spleen, tonsils, and thymus, from where they then enter the bloodstream.

Клетка согласно настоящему изобретению может представлять собой клетку любого из вышеупомянутых типов. В одном из вариантов реализации клетка согласно настоящему изобретению представляет собой Т-клетку. В другом варианте реализации клетка согласно настоящему изобретению представляет собой NK-клетку.The cell of the present invention may be any of the above-mentioned cell types. In one embodiment, the cell of the present invention is a T cell. In another embodiment, the cell of the present invention is an NK cell.

Клетки по данному аспекту настоящего изобретения могут быть получены ex vivo или из собственной периферической крови пациента (1-я сторона), или (в условиях трансплантации гемопоэтических стволовых клеток) - из периферической крови донора (2-я сторона), или из периферической крови неподключенного донора (3-я сторона). The cells according to this aspect of the present invention can be obtained ex vivo either from the patient's own peripheral blood (1st side), or (in the context of hematopoietic stem cell transplantation) from the peripheral blood of a donor (2nd side), or from the peripheral blood of an unconnected donor (3rd side).

В альтернативном варианте реализации клетки по данному аспекту настоящего изобретения могут быть получены в результате дифференциации ex vivo индуцибельных клеток-предшественников или эмбриональных клеток-предшественников в цитолитические клетки. В качестве альтернативы можно использовать линию иммортализованных цитолитических клеток, таких как Т- или NK-клетки, которые сохраняют свою литическую функцию и могут действовать как терапевтическое средство.In an alternative embodiment, the cells of this aspect of the invention may be obtained by ex vivo differentiation of inducible progenitor cells or embryonic progenitor cells into cytolytic cells. Alternatively, an immortalized cytolytic cell line may be used, such as T or NK cells, which retain their lytic function and can act as a therapeutic agent.

Во всех этих вариантах реализации экспрессирующие CAR клетки получают путем введения ДНК или РНК, кодирующей химерный полипептид, одним из многих способов, включая трансдукцию вирусным вектором, трансфекцию ДНК или РНК.In all of these embodiments, CAR expressing cells are produced by introducing DNA or RNA encoding the chimeric polypeptide by one of many methods, including transduction with a viral vector, transfection of DNA or RNA.

Клетка согласно настоящему изобретению может представлять собой клетку ex vivo, полученную у субъекта. Клетка может быть из образца мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК). Клетка, в частности цитолитическая клетка, такая как Т- или NK-клетка, может быть активирована и/или размножена перед трансдукцией нуклеиновой кислотой, кодирующей молекулы, обеспечивающие CAR согласно настоящему изобретению, например, обработкой моноклональным антителом к анти-CD3. The cell of the present invention may be an ex vivo cell obtained from a subject. The cell may be from a peripheral blood mononuclear cell (PBMC) sample. The cell, in particular a cytolytic cell such as a T or NK cell, may be activated and/or expanded prior to transduction with a nucleic acid encoding molecules providing a CAR of the present invention, such as by treatment with an anti-CD3 monoclonal antibody.

Клетка согласно настоящему изобретению может быть получена способом, включающим этап трансдукции или трансфекции клетки вектором согласно настоящему изобретению, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую CAR.The cell according to the present invention can be obtained by a method comprising the step of transducing or transfecting the cell with a vector according to the present invention that contains a nucleic acid sequence encoding a CAR.

Способ получения клетки согласно настоящему изобретению может дополнительно включать этап выделения клетки из содержащего клетки образца, полученного у субъекта или из других источников, перечисленных выше, перед этапом трансдукции или трансфекции. В случае если клетка является цитолитической клеткой, образец представляет собой полученный у субъекта образец, содержащий цитолитические клетки.The method for producing a cell according to the present invention may further comprise a step of isolating a cell from a cell-containing sample obtained from a subject or from other sources listed above, prior to the transduction or transfection step. In case the cell is a cytolytic cell, the sample is a sample obtained from a subject containing cytolytic cells.

Термин «субъект» или «индивидуум», используемый в контексте настоящего изобретения, относится к представителям видов млекопитающих, предпочтительно к человеку мужского или женского пола любого возраста или расы.The term " subject " or " individual " as used in the context of the present invention refers to a member of a mammalian species, preferably a human male or female of any age or race.

Затем клетка согласно настоящему изобретению может быть очищена, например, путем отбора на основе экспрессии антигенсвязывающего домена CAR.The cell of the present invention can then be purified, for example, by selection based on expression of the CAR antigen-binding domain.

8. Конъюгат8. Conjugate

Вариантный антигенсвязывающий домен или антитело согласно настоящему изобретению может представлять собой конъюгат вариантного антигенсвязывающего домена или антитела, например, конъюгат может быть детектируемым компонентом или химиотерапевтическим компонентом.A variant antigen-binding domain or antibody of the present invention may be a conjugate of a variant antigen-binding domain or antibody, for example, the conjugate may be a detectable component or a chemotherapeutic component.

Термины «вариантный антигенсвязывающий домен согласно настоящему изобретению» и «антитело согласно настоящему изобретению» были подробно раскрыты в контексте предыдущих аспектов настоящего изобретения, и их признаки и варианты реализации в равной степени применимы к данным аспектам изобретения.The terms “variant antigen-binding domain according to the present invention” and “antibody according to the present invention” have been described in detail in the context of previous aspects of the present invention, and their features and embodiments apply equally to these aspects of the invention.

Детектируемый компонент может представлять собой флуоресцентную группу, например флуоресцентный пептид. Термин «флуоресцентный пептид» в контексте настоящей заявки относится к полипептиду, который при возбуждении излучает свет с детектируемой длиной волны. Примеры флуоресцентных белков включают, но не ограничиваются ими: изотиоцианат флуоресцеина (FITC), фикоэритрин (PE), аллофикоцианин (APC), зеленый флуоресцентный белок (GFP), усиленный GFP, красный флуоресцентный белок (RFP), синий флуоресцентный белок (BFP) и белок mCherry.The detectable component may be a fluorescent group, such as a fluorescent peptide. The term " fluorescent peptide " in the context of the present application refers to a polypeptide that, when excited, emits light at a detectable wavelength. Examples of fluorescent proteins include, but are not limited to: fluorescein isothiocyanate (FITC), phycoerythrin (PE), allophycocyanin (APC), green fluorescent protein (GFP), enhanced GFP, red fluorescent protein (RFP), blue fluorescent protein (BFP), and mCherry protein.

Вариантный антигенсвязывающий домен или антитело согласно настоящему изобретению, конъюгированные с детектируемым компонентом, могут быть применены для определения TRBC злокачественной Т-клетки.A variant antigen-binding domain or antibody of the present invention conjugated to a detectable component can be used to detect TRBC of a malignant T cell.

Термин «химиотерапевтический компонент» в контексте настоящей заявки относится к компоненту, который является разрушительным для клетки, то есть такой компонент уменьшает жизнеспособность клетки. Полученные конъюгаты в дальнейшем названы «химиотерапевтический конъюгат согласно настоящему изобретению». Химиотерапевтический компонент может представлять собой цитотоксический лекарственный препарат. Предполагаемый химиотерапевтический компонент включает, без ограничения: алкилирующие агенты, нитрозомочевины, этиленимины/метилмеламин, алкилсульфонаты, антиметаболиты, аналоги пиримидина, эпиподофилотоксины, ферменты, такие как L-аспарагиназа; модификаторы биологического ответа, такие как IFNα, IL-2, G-CSF и GM-CSF; координационные комплексы платины, такие как цисплатин и карбоплатин, антрацендионы, замещенная мочевина, такая как гидроксимочевина, производные метилгидразина, включая N-метилгидразин (MIH) и прокарбазин, адренокортикальные супрессоры, такие как митотан (o,p'-DDD) и аминоглутетимид; гормоны и антагонисты, в том числе антагонисты адренокортикостероидов, такие как преднизон и его эквиваленты, дексаметазон и аминоглютетимид; прогестин, в частности, гидроксипрогестерона капроат, медроксипрогестерона ацетат и мегестрола ацетат; эстроген, в частности, эквиваленты диэтилстильбэстрола и этинилэстрадиола; антиэстроген, в частности, тамоксифен; андрогены, включая пропионат тестостерона и флуоксиместерон/эквиваленты; антиандрогены, в частности, флутамид, аналоги гонадотропин-рилизинг гормона и лейпролид; и нестероидные антиандрогены, в частности, флутамид.The term " chemotherapeutic moiety " as used herein refers to a moiety that is destructive to a cell, i.e., such moiety reduces the viability of the cell. The resulting conjugates are hereinafter referred to as " chemotherapeutic conjugate of the present invention ". The chemotherapeutic moiety may be a cytotoxic drug. Contemplated chemotherapeutic moiety includes, but is not limited to: alkylating agents, nitrosoureas, ethyleneimines/methylmelamine, alkyl sulfonates, antimetabolites, pyrimidine analogs, epipodophyllotoxins, enzymes such as L-asparaginase; biological response modifiers such as IFNα, IL-2, G-CSF and GM-CSF; platinum coordination complexes such as cisplatin and carboplatin, anthracenediones, substituted ureas such as hydroxyurea, methylhydrazine derivatives including N-methylhydrazine (MIH) and procarbazine, adrenocortical suppressants such as mitotane (o,p'-DDD) and aminoglutethimide; hormones and antagonists including adrenocorticosteroid antagonists such as prednisone and its equivalents, dexamethasone and aminoglutethimide; progestins, in particular hydroxyprogesterone caproate, medroxyprogesterone acetate and megestrol acetate; estrogen, in particular diethylstilbestrol and ethinylestradiol equivalents; antiestrogen, in particular tamoxifen; androgens, including testosterone propionate and fluoxymesterone/equivalents; antiandrogens, in particular flutamide, gonadotropin-releasing hormone analogues and leuprolide; and nonsteroidal antiandrogens, in particular flutamide.

Вариантный антигенсвязывающий домен или антитело согласно настоящему изобретению, конъюгированные с химиотерапевтическим компонентом, обеспечивают направленную доставку химиотерапевтического компонента в клетки, экспрессирующие TRBC2.A variant antigen-binding domain or antibody of the present invention conjugated to a chemotherapeutic component provides targeted delivery of the chemotherapeutic component to cells expressing TRBC2.

9. Фармацевтическая композиция9. Pharmaceutical composition

Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей клетку или множество клеток, или антитело, или BiTE (биспецифичный активатор Т-клеток), или химиотерапевтический конъюгат согласно настоящему изобретению, далее - «фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению».The present invention also relates to a pharmaceutical composition comprising a cell or a plurality of cells, or an antibody, or a BiTE (bispecific T cell activator), or a chemotherapeutic conjugate according to the present invention, hereinafter referred to as the " pharmaceutical composition according to the present invention ".

Фармацевтическая композиция может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или вспомогательное вещество. Фармацевтическая композиция может необязательно содержать один или несколько дополнительных фармацевтически активных полипептидов и/или соединений. Такой состав может, например, быть в форме, подходящей для внутривенной инфузии.The pharmaceutical composition may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier, diluent or excipient. The pharmaceutical composition may optionally comprise one or more additional pharmaceutically active polypeptides and/or compounds. Such a formulation may, for example, be in a form suitable for intravenous infusion.

Термины «клетка согласно настоящему изобретению», «антитело согласно настоящему изобретению», «BiTE согласно настоящему изобретению» и «химиотерапевтический конъюгат согласно настоящему изобретению» были подробно описаны в контексте предыдущих аспектов изобретения, и их характеристики и варианты реализации в равной степени применимы к данным аспектам настоящего изобретения.The terms “a cell according to the present invention”, “an antibody according to the present invention”, “a BiTE according to the present invention” and “a chemotherapeutic conjugate according to the present invention” have been described in detail in the context of previous aspects of the invention, and their characteristics and embodiments are equally applicable to these aspects of the present invention.

Введение препаратаAdministration of the drug

Введение клетки или группы клеток, или антитела, или BiTE, или химиотерапевтического конъюгата согласно настоящему изобретению может осуществляться каким-либо из нескольких путей, которые делают активный ингредиент биодоступным. Например, агент можно вводить пероральным и парентеральным путем, внутрибрюшинно, внутривенно, подкожно, чрескожно, внутримышечно, местной доставкой, например, с помощью катетера или стента.The administration of a cell or group of cells, or an antibody, or a BiTE, or a chemotherapeutic conjugate according to the present invention can be carried out by any of several routes that make the active ingredient bioavailable. For example, the agent can be administered orally and parenterally, intraperitoneally, intravenously, subcutaneously, transdermally, intramuscularly, by local delivery, for example, using a catheter or stent.

Как правило, фактическая дозировка, которая будет наиболее подходящей для конкретного субъекта, определяется врачом, и она будет зависеть от возраста, веса и ответа конкретного пациента. Дозировка должна быть такой, чтобы ее было достаточно для сокращения количества или деплеции клональных Т-клеток, экспрессирующих TRBC1 или TRBC2.Typically, the actual dosage that will be most appropriate for a particular subject will be determined by the physician and will depend on the age, weight, and response of the individual patient. The dosage should be sufficient to reduce or deplete clonal T cells expressing TRBC1 or TRBC2.

10. Способ лечения10. Method of treatment

В еще одном аспекте настоящего изобретения предложена клетка или антитело, или BiTE, или химиотерапевтический конъюгат согласно настоящему изобретению для применения в медицине.In another aspect, the present invention provides a cell or antibody, or BiTE, or chemotherapeutic conjugate according to the present invention for use in medicine.

В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ лечения Т-клеточных лимфомы или лейкоза у субъекта (далее - «способ лечения согласно настоящему изобретению»), который включает этап введения клетки или антитела, или BiTE, или химиотерапевтичесого конъюгата согласно настоящему изобретению субъекту, в организме которого злокачественные Т-клетки экспрессируют TRBC2. Препарат можно вводить в форме фармацевтической композиции, как указано выше.In another aspect, the present invention provides a method of treating T-cell lymphoma or leukemia in a subject (hereinafter referred to as the " treatment method of the present invention "), which comprises the step of administering a cell or antibody, or a BiTE, or a chemotherapeutic conjugate according to the present invention to a subject in whose body malignant T-cells express TRBC2. The preparation can be administered in the form of a pharmaceutical composition as described above.

Альтернативная формулировка данного аспекта изобретения может быть следующей: клетка или антитело, или BiTE, или химиотерапевтический конъюгат согласно настоящему изобретению для применения в лечении Т-клеточных лимфомы или лейкоза, далее - «клетка, антитело, BiTE или химиотерапевтический конъюгат для применения согласно настоящему изобретению» при экспрессировании TRBC2 злокачественными Т-клетками.An alternative formulation of this aspect of the invention may be as follows: a cell or antibody, or BiTE, or chemotherapeutic conjugate according to the present invention for use in the treatment of T-cell lymphoma or leukemia, hereinafter referred to as " a cell, antibody, BiTE or chemotherapeutic conjugate for use according to the present invention " when TRBC2 is expressed by malignant T cells.

Альтернативная формулировка данного аспекта изобретения может быть следующей: клетка или антитело, или BiTE, или химиотерапевтический конъюгат согласно настоящему изобретению для применения в изготовлении лекарственного средства для лечения Т-клеточных лимфомы или лейкоза, при котором злокачественные Т-клетки экспрессируют TRBC2.An alternative formulation of this aspect of the invention may be as follows: a cell or antibody, or BiTE, or chemotherapeutic conjugate according to the present invention for use in the manufacture of a medicament for the treatment of T-cell lymphoma or leukemia, in which the malignant T cells express TRBC2.

Термины «клетка согласно настоящему изобретению», «антитело согласно настоящему изобретению», «BiTE согласно настоящему изобретению» и «химиотерапевтический конъюгат согласно настоящему изобретению» были подробно раскрыты в контексте предыдущих аспектов настоящего изобретения, и их характеристики и варианты реализации в равной степени применимы к данным аспектам настоящего изобретения.The terms “a cell according to the present invention”, “an antibody according to the present invention”, “a BiTE according to the present invention” and “a chemotherapeutic conjugate according to the present invention” have been described in detail in the context of previous aspects of the present invention, and their characteristics and embodiments apply equally to these aspects of the present invention.

Способ лечения Т-клеточных лимфомы и/или лейкоза относится к терапевтическому применению клетки, антитела, BiTE или химиотерапевтического конъюгата согласно настоящему изобретению. Согласно указанному способу, клетку, антитело, BiTE или химиотерапевтический конъюгат согласно настоящему изобретению можно вводить субъекту, больному Т-клеточными лимфомой и/или лейкозом с целью ослабления, уменьшения, облегчения по меньшей мере одного симптома, связанного с данным заболеванием и/или для замедления, уменьшения или остановки прогрессирования заболевания.The method of treating T-cell lymphoma and/or leukemia relates to the therapeutic use of a cell, antibody, BiTE or chemotherapeutic conjugate according to the present invention. According to said method, a cell, antibody, BiTE or chemotherapeutic conjugate according to the present invention can be administered to a subject suffering from T-cell lymphoma and/or leukemia for the purpose of weakening, reducing, alleviating at least one symptom associated with this disease and/or for slowing down, reducing or stopping the progression of the disease.

Способ предотвращения Т-клеточных лимфомы и/или лейкоза относится к профилактическому применению клетки, антитела, BiTE или химиотерапевтического конъюгата согласно настоящему изобретению. Согласно указанному способу, такую клетку, антитело, BiTE или химиотерапевтический конъюгат можно вводить субъекту, у которого еще не проявились Т-клеточные лимфома и/или лейкоз, и/или у которого не проявляются какие-либо симптомы Т-клеточных лимфомы и/или лейкоза, с целью предотвратить или ослабить факторы, вызывающие данное заболевание, или уменьшить или предотвратить развитие по крайней мере одного симптома, связанного с заболеванием. Субъект может иметь предрасположенность или считаться подверженным риску развития Т-клеточных лимфомы и/или лейкоза.The method for preventing T-cell lymphoma and/or leukemia refers to the prophylactic use of a cell, antibody, BiTE or chemotherapeutic conjugate according to the present invention. According to said method, such a cell, antibody, BiTE or chemotherapeutic conjugate can be administered to a subject who has not yet manifested T-cell lymphoma and/or leukemia and/or who does not manifest any symptoms of T-cell lymphoma and/or leukemia, in order to prevent or reduce the factors causing this disease, or reduce or prevent the development of at least one symptom associated with the disease. The subject may be predisposed to or considered at risk for developing T-cell lymphoma and/or leukemia.

Данный способ может включать следующие этапы:This method may include the following steps:

(i) выделение образца, содержащего цитотоксические клетки;(i) isolation of a sample containing cytotoxic cells;

(ii) трансдукция или трансфекция такой клетки последовательностью нуклеиновой кислоты или вектором по настоящему изобретению; и(ii) transducing or transfecting such cell with a nucleic acid sequence or vector of the present invention; and

(iii) введение субъекту клетки по п. (ii).(iii) administering to the subject a cell according to paragraph (ii).

Образец, содержащий цитотоксические клетки, может быть выделен у субъекта или из других источников, например, как было сказано выше. Цитотоксическая клетка, такая как T- или NK-клетка, может быть выделена из собственной периферической крови субъекта (1-я сторона), или в условиях трансплантации гемопоэтических стволовых клеток - из периферической крови донора (2-я сторона), или из периферической крови несвязанного донора (3-я сторона).The sample containing the cytotoxic cells may be isolated from the subject or from other sources, such as those discussed above. The cytotoxic cell, such as a T or NK cell, may be isolated from the subject's own peripheral blood (Part 1), or in the setting of hematopoietic stem cell transplantation, from the peripheral blood of a donor (Part 2), or from the peripheral blood of an unrelated donor (Part 3).

Способ лечения Т-клеточных лимфомы и/или лейкоза относится к терапевтическому применению агента. Согласно указанному способу, агент можно вводить субъекту, имеющему Т-клеточные лимфому и/или лейкоз, с целью уменьшить, снизить или облегчить по меньшей мере один симптом, связанный с данным заболеванием, и/или замедлить, снизить или остановить прогрессирование заболевания.A method for treating T-cell lymphoma and/or leukemia refers to the therapeutic use of an agent. According to said method, the agent can be administered to a subject having T-cell lymphoma and/or leukemia in order to reduce, decrease or alleviate at least one symptom associated with this disease and/or slow down, decrease or stop the progression of the disease.

Данные виды терапевтического применения будут включать введение терапевтически эффективного количества клетки, антитела, BiTE или химиотерапевтического конъюгата по настоящему изобретению.These therapeutic uses will include administration of a therapeutically effective amount of a cell, antibody, BiTE, or chemotherapeutic conjugate of the present invention.

Термин «терапевтически эффективное количество» в контексте настоящей заявки относится к количеству клетки, антитела, BiTE или химиотерапевтического конъюгата по настоящему изобретению, которое требуется для достижения заметного прогресса в плане профилактики, лечения, отсрочки проявления, уменьшения тяжести или облегчения одного или нескольких симптомов TRBC2-положительных Т-клеточных лимфомы и/или лейкоза.The term " therapeutically effective amount " as used herein refers to the amount of a cell, antibody, BiTE or chemotherapeutic conjugate of the present invention that is required to achieve a significant progress in preventing, treating, delaying the onset of, reducing the severity of or alleviating one or more symptoms of TRBC2-positive T-cell lymphoma and/or leukemia.

Способ по настоящему изобретению может быть применен для лечения любого вида лимфомы и/или лейкоза, ассоциированных с клональной экспансией клеток, экспрессирующих Т-клеточные рецепторы (TCR), содержащие TRBC2. Таким образом, настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания, в котором задействованы злокачественные Т-клетки, которые экспрессируют TCR, содержащие TRBC2.The method of the present invention can be used to treat any type of lymphoma and/or leukemia associated with clonal expansion of cells expressing T-cell receptors (TCR) containing TRBC2. Thus, the present invention relates to a method for treating a disease involving malignant T-cells that express TCR containing TRBC2.

Способ по настоящему изобретению может быть применен для лечения Т-клеточной лимфомы, при которой злокачественные Т-клетки экспрессируют TCR, содержащие TRBC2. Термин «лимфома» используют в настоящей заявке в соответствии с общепринятым значением для обозначения рака, который обычно развивается в лимфатических узлах, но также может поражать селезенку, костный мозг, кровь и другие органы. Лимфома обычно представляет собой солидную опухоль из лимфоидных клеток. Первичным симптомом, ассоциированным с лимфомой, является лимфаденопатия, хотя вторичные (B) симптомы могут включать увеличение температуры, ночную потливость, потерю веса, потерю аппетита, увеличенную утомляемость, респираторный дистресс и зуд.The method of the present invention can be used to treat T-cell lymphoma, in which malignant T-cells express TCRs containing TRBC2. The term " lymphoma " is used in the present application in accordance with the generally accepted meaning to denote a cancer that usually develops in the lymph nodes, but can also affect the spleen, bone marrow, blood and other organs. Lymphoma is usually a solid tumor of lymphoid cells. The primary symptom associated with lymphoma is lymphadenopathy, although secondary (B) symptoms can include increased temperature, night sweats, weight loss, loss of appetite, increased fatigue, respiratory distress and itching.

Способ по настоящему изобретению может быть применен для лечения Т-клеточного лейкоза, при котором злокачественные Т-клетки экспрессируют TCR, содержащие TRBC2. Термин «лейкоз» используют в настоящей заявке в соответствии с общепринятым значением для обозначения рака крови или костного мозга.The method of the present invention can be used to treat T-cell leukemia, in which malignant T-cells express TCRs containing TRBC2. The term " leukemia " is used in the present application in accordance with the generally accepted meaning to denote cancer of the blood or bone marrow.

Ниже приведен иллюстративный неисчерпывающий перечень заболеваний, которые можно лечить способом по настоящему изобретению.The following is an illustrative, non-exhaustive list of diseases that can be treated by the method of the present invention.

ПЕРИФЕРИЧЕСКАЯ Т-КЛЕТОЧНАЯ ЛИМФОМАPERIPHERAL T-CELL LYMPHOMA

Периферические Т-клеточные лимфомы являются сравнительно редкими лимфомами и составляют менее 10% всех неходжкинских лимфом (НХЛ). Однако они связаны с агрессивным клиническим течением, а причины и точное клеточное происхождение большинства Т-клеточных лимфом до сих пор не определены.Peripheral T-cell lymphomas are relatively rare lymphomas, accounting for less than 10% of all non-Hodgkin lymphomas (NHL). However, they are associated with an aggressive clinical course, and the cause and exact cellular origin of most T-cell lymphomas remain unknown.

Лимфома обычно сначала проявляется в виде припухлости в области шеи, подмышек или паха. Последующее вздутие может появиться там, где расположены другие лимфатические узлы, например, в селезенке. Как правило, увеличенные лимфатические узлы могут вторгаться в пространство кровеносных сосудов, нервов или желудка, вызывая отеки рук и ног, покалывание и онемение или распирающее чувство соответственно. Симптомы лимфомы также включают неспецифические симптомы, такие как увеличение температуры, озноб, необъяснимая потеря веса, ночная потливость, сонливость и зуд.Lymphoma usually first appears as a swelling in the neck, armpits, or groin. Subsequent swelling may occur where other lymph nodes are located, such as the spleen. Typically, enlarged lymph nodes may invade blood vessels, nerves, or the stomach, causing swelling of the arms and legs, tingling, and numbness or a feeling of fullness, respectively. Symptoms of lymphoma also include nonspecific symptoms such as fever, chills, unexplained weight loss, night sweats, drowsiness, and itching.

Для установления прогностически и терапевтически значимой категоризации периферических Т-клеточных лимфом в классификации ВОЗ используют морфологические и иммунофенотипические особенности в сочетании с клиническими аспектами и в некоторых случаях с генетикой (Swerdlow et al.; WHO classification of tumours of haematopoietic and lymphoid tissues. 4th ed.; Lyon: IARC Press; 2008). Анатомическая локализация неопластических Т-клеток частично соответствует их предполагаемым нормальным клеточным аналогам и функциям, и, как таковые, Т-клеточные лимфомы связаны с лимфатическими узлами и периферической кровью. Данный подход позволяет лучше понять некоторые проявления Т-клеточных лимфом, включая их распределение в клетках, некоторые аспекты морфологии и даже связанные с ними клинические данные.The WHO classification uses morphologic and immunophenotypic features in combination with clinical aspects and, in some cases, genetics to establish a prognostically and therapeutically meaningful categorization of peripheral T-cell lymphomas (Swerdlow et al. ; WHO classification of tumors of haematopoietic and lymphoid tissues. 4th ed.; Lyon: IARC Press; 2008). The anatomical locations of neoplastic T cells partly correspond to their putative normal cellular counterparts and functions, and as such T-cell lymphomas are associated with lymph nodes and peripheral blood. This approach allows for a better understanding of some of the manifestations of T-cell lymphomas, including their cellular distribution, some aspects of morphology, and even associated clinical findings.

Наиболее распространенной из Т-клеточных лимфом является неспецифицированная периферическая Т-клеточная лимфома (ПТКЛн), на которую приходится 25% от общего количества случаев, на втором месте ангиоиммунобластная Т-клеточная лимфома (АИТЛ) (18,5%).The most common T-cell lymphoma is peripheral T-cell lymphoma not otherwise specified (PTCLn), which accounts for 25% of the total number of cases, followed by angioimmunoblastic T-cell lymphoma (AITL) (18.5%).

ПЕРИФЕРИЧЕСКАЯ Т-КЛЕТОЧНАЯ ЛИМФОМА, НЕСПЕЦИФИЦИРОВАННАЯ (ПТКЛН)PERIPHERAL T-CELL LYMPHOMA, UNSPECIFIED (PTCLN)

На ПТКЛн приходится более 25% от всех периферических Т-клеточных и NK/Т-клеточных лимфом, и она является наиболее распространенным подтипом. Ее определяют диагностикой способом исключения, когда заболевание не соответствует ни одному из известных случаев зрелых Т-клеточных лимфом, перечисленных в действующем перечне ВОЗ за 2008 год. В этом она схожа с неспецифицированной диффузной В-крупноклеточной лимфомой (ДВККЛн).PTCLn accounts for more than 25% of all peripheral T-cell and NK/T-cell lymphomas and is the most common subtype. It is diagnosed by exclusion when the disease does not match any of the known cases of mature T-cell lymphomas listed in the current 2008 WHO list. In this, it is similar to diffuse large B-cell lymphoma not otherwise specified (DLBCLn).

Большинство пациентов - взрослые, средний возраст которых составляет 60 лет, а соотношение мужчин и женщин составляет 2:1. Большинство случаев имеют узловое происхождение, однако экстранодальные проявления встречаются примерно у 13% пациентов и чаще всего затрагивают кожу и желудочно-кишечный тракт.Most patients are adults, with a mean age of 60 years and a male to female ratio of 2:1. Most cases are nodal in origin, but extranodal manifestations occur in approximately 13% of patients and most commonly involve the skin and gastrointestinal tract.

Цитологический спектр очень широк - от полиморфных до мономорфных видов. Описаны три морфологически определенные разновидности, включая лимфоэпителиоидную (Lennert), Т-зональную и фолликулярную лимфомы. Лимфоэпителиоидная разновидность ПТКЛ характеризуется содержанием большого количества фоновых эпителиоидных гистиоцитов и как правило является положительной по CD8. Это связывают с благоприятным прогнозом. Фолликулярная разновидность ПТКЛн проявляет себя как потенциально отдельный клиникопатологический компонент.The cytological spectrum is very broad, from polymorphic to monomorphic types. Three morphologically distinct varieties have been described, including lymphoepithelioid (Lennert), T-zone, and follicular lymphomas. The lymphoepithelioid variety of PTCL is characterized by a large number of background epithelioid histiocytes and is usually CD8 positive. This is associated with a favorable prognosis. The follicular variety of PTCLn manifests itself as a potentially distinct clinicopathological component.

Большинство ПТКЛн имеют фенотип зрелых Т-клеток и в большинстве случаев являются CD4-положительными. В 75% случаев наблюдаются переменные потери по меньшей мере одного Т-клеточного маркера (CD3, CD2, CD5 или CD7), причем чаще всего сокращается количество CD7 и CD5. Могут экспрессироваться CD30 и редко CD15, причем экспрессия CD15 является неблагоприятным прогностическим признаком. Экспрессия CD56, хотя и встречается редко, также оказывает негативное влияние на прогноз. Прочие неблагоприятные патологические прогностические факторы включают степень пролиферации более 25% по экспрессии KI-67 и наличие более 70% трансформированных клеток. Иммунофенотипический анализ данных лимфом дал мало сведений об их биологии.Most PTCLn have a mature T-cell phenotype and are CD4 positive in most cases. Variable losses of at least one T-cell marker (CD3, CD2, CD5, or CD7) are observed in 75% of cases, with CD7 and CD5 being most commonly reduced. CD30 and rarely CD15 may be expressed, with CD15 expression being an unfavorable prognostic feature. CD56 expression, although rare, also has a negative impact on prognosis. Other unfavorable pathological prognostic factors include a proliferation ratio greater than 25% as measured by KI-67 expression and the presence of greater than 70% transformed cells. Immunophenotypic analysis of these lymphomas has yielded little insight into their biology.

АНГИОИММУНОБЛАСТНАЯ Т-КЛЕТОЧНАЯ ЛИМФОМА (АИТЛ)ANGIOIMMUNOBLASTIC T-CELL LYMPHOMA (AITL)

АИТЛ является системным заболеванием, которое характеризуется полиморфным инфильтратом, затрагивающим лимфатические узлы, выступающими наружными эндотелиальными венулами (НЭВ) и периваскулярной экспансией сетей фолликулярных дендритных клеток (ФДК). АИТЛ считается новым видом T-клеточной лимфомы, происходящим из фолликулярных хелперных T-клеток (TFH) αβ, обычно встречающихся в зародышевых центрах.AITL is a systemic disease characterized by a polymorphic infiltrate involving lymph nodes, prominent external endothelial venules (PEVs), and perivascular expansion of follicular dendritic cell (FDC) networks. AITL is considered a novel type of T-cell lymphoma originating from follicular helper T cells (TFH) αβ, which are normally found in germinal centers.

АИТЛ является вторым по распространенности заболеванием среди периферических T-клеточных и NK/T-клеточных лимфом, на которое приходится около 18,5% случаев. Она встречается у людей среднего и пожилого возраста, средний возраст заболевших составляет 65 лет, причем заболеваемость у мужчин и женщин примерно одинакова. По данным клинических исследований пациенты обычно имеют запущенную стадию заболевания с генерализованной лимфаденопатией, гепатоспленомегалией и выраженными конституциональными симптомами. Обычно имеет место кожная сыпь с сопутствующим зудом. Часто встречается поликлональная гипергаммаглобулинемия, связанная с аутоиммунными явлениями.AITL is the second most common disease among peripheral T-cell and NK/T-cell lymphomas, accounting for about 18.5% of cases. It occurs in middle-aged and elderly people, the average age of patients is 65 years, and the incidence in men and women is approximately equal. According to clinical studies, patients usually have an advanced stage of the disease with generalized lymphadenopathy, hepatosplenomegaly, and pronounced constitutional symptoms. Skin rash with associated itching is common. Polyclonal hypergammaglobulinemia associated with autoimmune phenomena is common.

Описаны три различных морфологических паттерна АИТЛ. На ранних стадиях поражения АИТЛ (Паттерн I) обычно наблюдается ненарушенная архитектура с характерными гиперпластическими фолликулами. Неопластическая пролиферация локализована на периферии фолликулов. У Паттерна II архитектура узлов частично смазана с сохранением нескольких регрессированных фолликулов. Субкапсулярные синусы сохранены и даже расширены. Паракортикальная область содержит разветвляющиеся НЭВ, и имеет место пролиферация ФДК за пределы B-клеточного фолликула. Неопластические клетки имеют размер от малого до среднего с минимальной цитологической атипией. Они часто имеют прозрачную или бледную цитоплазму и могут иметь хорошо различимые Т-клеточные мембраны. Как правило, очевидно наличие полиморфного воспалительного фона.Three distinct morphologic patterns of AITL have been described. Early AITL lesions (Pattern I) typically show an intact architecture with characteristic hyperplastic follicles. The neoplastic proliferation is localized to the periphery of the follicles. In Pattern II, the nodular architecture is partially blurred with the preservation of a few regressed follicles. The subcapsular sinuses are preserved and even dilated. The paracortical area contains arborizing NEVs, and there is proliferation of FDCs beyond the B-cell follicle. The neoplastic cells are small to medium in size with minimal cytologic atypia. They often have clear or pale cytoplasm and may have prominent T-cell membranes. A polymorphic inflammatory background is usually evident.

Хотя АИТЛ является злокачественным Т-клеточным новообразованием, имеет место характерная экспансия В-клеток и плазматических клеток, что, по-видимому, отражает функцию неопластических клеток в качестве клеток TFH. Присутствуют как EBV-положительные, так и EBV-отрицательные B-клетки. Иногда атипичные B-клетки имеют морфологическую и иммунофенотипическую схожесть с клетками Ходжкина/Рида-Штернберга, что в некоторых случаях приводит к путанице при диагностике данного заболевания. Пролиферация B-клеток при АИТЛ может быть обширной, и у некоторых пациентов развивают вторичные EBV-положительные диффузные В-крупноклеточные лимфомы (ДВККЛ) или (реже) EBV-отрицательные B-клеточные опухоли, часто с плазмоцитарной дифференциацией.Although AITL is a T-cell malignancy, there is a characteristic expansion of B cells and plasma cells, presumably reflecting the function of the neoplastic cells as TFH cells. Both EBV-positive and EBV-negative B cells are present. Occasionally, the atypical B cells have morphologic and immunophenotypic similarities to Hodgkin/Reed-Sternberg cells, leading to diagnostic confusion in some cases. B-cell proliferation in AITL can be extensive, and some patients develop secondary EBV-positive diffuse large B-cell lymphomas (DLBCL) or (less commonly) EBV-negative B-cell tumors, often with plasmacytic differentiation.

Неопластические CD4-положительные Т-клетки АИТЛ демонстрируют сильную экспрессию CD10 и CD279 (PD-1) и являются положительными по CXCL13. Наличие CXCL13 приводит к увеличению рекрутирования B-клеток в лимфатические узлы за счет адгезии к НЭВ, активации B-клеток, плазмоцитарной дифференциации и экспансии сетей ФДК, что составляет морфологические и клинические особенности АИТЛ. Интенсивная экспрессия PD-1 в перифолликулярных опухолевых клетках особенно полезна для того, чтобы отличать Паттерн I АИТЛ от реактивной фолликулярной и паракортикальной гиперплазии.Neoplastic CD4-positive T cells of AITL show strong expression of CD10 and CD279 (PD-1) and are positive for CXCL13. The presence of CXCL13 results in increased B-cell recruitment to lymph nodes via adhesion to NEVs, B-cell activation, plasmacytic differentiation, and expansion of FDC networks, which constitute the morphologic and clinical features of AITL. Intense PD-1 expression in perifollicular tumor cells is particularly useful to distinguish Pattern I AITL from reactive follicular and paracortical hyperplasia.

Фолликулярная разновидность ПТКЛн представляет собой еще одно заболевание с фенотипом TFH. В отличие от АИТЛ, при нем не наблюдают выступающие НЭВ или внефолликулярная экспансия сетей ФДК. Неопластические клетки могут образовывать внутрифолликулярные агрегаты, имитирующие В-клеточную фолликулярную лимфому, но также могут иметь межфолликулярный паттерн роста или затрагивать расширенные мантийные зоны. Клинически фолликулярная разновидность ПТКЛн отличается от АИТЛ, поскольку чаще у пациентов наблюдается ранняя стадия заболевания с частичным поражением лимфатических узлов и могут отсутствовать конституциональные симптомы, связанные с АИТЛ.Follicular PTCLn is another disorder with the TFH phenotype. Unlike AITL, it does not exhibit prominent NEVs or extrafollicular expansion of FDC networks. Neoplastic cells may form intrafollicular aggregates mimicking B-cell follicular lymphoma but may also have an interfollicular growth pattern or involve dilated mantle zones. Clinically, follicular PTCLn differs from AITL because patients more often present with early-stage disease with partial lymph node involvement and may lack the constitutional symptoms associated with AITL.

АНАПЛАСТИЧЕСКАЯ КРУПНОКЛЕТОЧНАЯ ЛИМФОМА (АККЛ)ANAPLASTIC LARGE CELL LYMPHOMA (ALCL)

АККЛ можно разделить на АККЛ-«киназа анапластической лимфомы» (КАЛ)+ и АККЛ-КАЛ-.ALCL can be divided into ALCL-anaplastic lymphoma kinase (ALK)+ and ALCL-ALK-.

АККЛ-КАЛ+ является одним из наиболее четко определенных заболеваний среди периферических Т-клеточных лимфом с характерными «отличительными клетками», несущими подковообразные ядра и экспрессирующими КАЛ и CD30. На его долю приходится около 7% всех периферических Т-клеточных и NK-клеточных лимфом, и оно наиболее распространено в первые три десятилетия жизни. Пациенты часто страдают лимфаденопатией, но поражение экстранодальных участков (кожи, костей, мягких тканей, легких, печени) и В-симптомы являются распространенным явлением.ALCL-KAL+ is one of the best-defined diseases among the peripheral T-cell lymphomas, with characteristic “hallmark cells” bearing horseshoe-shaped nuclei and expressing KAL and CD30. It accounts for about 7% of all peripheral T-cell and NK-cell lymphomas and is most common in the first three decades of life. Patients often present with lymphadenopathy, but extranodal involvement (skin, bone, soft tissue, lung, liver) and B-symptoms are common.

АККЛ-КАЛ+ демонстрирует широкий морфологический спектр с 5 различными описанными паттернами, но все варианты содержат некоторые отличительные клетки. Клетки с характерными признаками имеют эксцентричные подковообразные или почковидные ядра и заметную перинуклеарную эозинофильную область Гольджи. Рост опухолевых клеток имеет когезионный характер с предрасположенностью к вовлечению синуса. Меньшие опухолевые клетки преобладают в мелкоклеточном варианте, а в лимфогистиоцитарном варианте обильные гистиоциты маскируют присутствие опухолевых клеток, многие из которых являются небольшими.ALCL-CAL+ displays a broad morphologic spectrum with 5 distinct patterns described, but all variants contain some distinctive cells. Cells with characteristic features have eccentric horseshoe- or kidney-shaped nuclei and a prominent perinuclear eosinophilic Golgi region. Tumor cell growth is cohesive with a predilection for sinus involvement. Smaller tumor cells predominate in the small cell variant, and in the lymphohistiocytic variant, abundant histiocytes mask the presence of tumor cells, many of which are small.

По определению, во всех случаях наблюдается КАЛ и CD30-положительность, причем их экспрессия обычно слабее в более мелких опухолевых клетках. Часто наблюдают потерю пан-Т-клеточных маркеров, в 75% случаев отсутствует экспрессия CD3 на поверхности. By definition, all cases are AL and CD30 positive, with their expression usually being weaker in smaller tumor cells. Loss of pan-T-cell markers is common, and 75% of cases lack surface CD3 expression.

Экспрессия ALK является результатом характерного рекуррентного генетического изменения, заключающегося в перестройке гена ALK на хромосоме 2p23 в один из множества партнерских генов, что приводит к экспрессии химерного белка.ALK expression results from a characteristic recurrent genetic change involving the rearrangement of the ALK gene on chromosome 2p23 into one of multiple partner genes, resulting in the expression of a chimeric protein.

Наиболее распространенным партнерским геном, встречающимся в 75% случаев, является ген Нуклеофозмина (NPM1) на хромосоме 5q35, что приводит к t(2;5)(p23;q35). Клеточное распределение КАЛ в разных вариантах транслокации может варьироваться в зависимости от гена-партнера.The most common partner gene, occurring in 75% of cases, is the Nucleophosmin gene (NPM1) on chromosome 5q35, resulting in t(2;5)(p23;q35). The cellular distribution of AL in different translocation variants may vary depending on the partner gene.

АККЛ-КАЛ- включена в классификацию ВОЗ 2008 года в качестве предварительной категории. Ее определяют как CD30-положительную Т-клеточную лимфому, которая морфологически неотличима от АККЛ-КАЛ+ с когезионным характером роста и наличием отличительных клеток, но лишенная экспрессии белка КАЛ.ALCL-KAL- is included in the 2008 WHO classification as a provisional category. It is defined as a CD30-positive T-cell lymphoma that is morphologically indistinguishable from ALCL-KAL+ with a cohesive growth pattern and the presence of distinctive cells, but lacks expression of the KAL protein.

Пациенты, как правило, представляют собой взрослых в возрасте от 40 до 65 лет, в отличие от АККЛ-КАЛ +, которая чаще встречается у детей и молодых взрослых. АККЛ-КАЛ- может поражать как лимфатические узлы, так и экстранодальные ткани, хотя последнее наблюдается реже, чем в АККЛ-КАЛ+. Большинство случаев АККЛ-КАЛ- демонстрируют сглаживание архитектуры лимфатических узлов листами когезионных неопластических клеток с типичными «отличительными» чертами. В отличие от АККЛ-КАЛ+, мелкоклеточный морфологический вариант не выявляют.Patients are typically adults between 40 and 65 years of age, in contrast to ALCL-AL+, which is more common in children and young adults. ALCL-AL- can involve both lymph nodes and extranodal tissues, although the latter is less common than in ALCL-AL+. Most cases of ALCL-AL- demonstrate effacement of the lymph node architecture by sheets of cohesive neoplastic cells with typical "hallmark" features. Unlike ALCL-AL+, the small cell morphologic variant is not seen.

В отличие от своего аналога КАЛ+, АККЛ-КАЛ- демонстрирует большее сохранение экспрессии поверхностного Т-клеточного маркера, в то время как экспрессия цитотоксических маркеров и эпителиального мембранного антигена (ЭМА) менее вероятна. Сигнатуры экспрессии генов и рекуррентный хромосомный дисбаланс различны в АККЛ-КАЛ- и АККЛ-КАЛ+, подтверждая, что они являются различными заболеваниями на молекулярном и генетическом уровне. In contrast to its KAL+ counterpart, ALCL-KAL- shows greater retention of T-cell surface marker expression, while cytotoxic markers and epithelial membrane antigen (EMA) expression are less likely. Gene expression signatures and recurrent chromosomal imbalances are distinct in ALCL-KAL- and ALCL-KAL+, suggesting that they are distinct diseases at the molecular and genetic level.

АККЛ-КАЛ- клинически отличается от АККЛ-КАЛ+ и ПТКЛН со значительными различиями в прогнозе между этими тремя различными заболеваниями. Общая 5-летняя выживаемость у АККЛ-КАЛ- составляет 49%, что не так хорошо, как у АККЛ-КАЛ+ (при 70%), но в то же время значительно лучше, чем у ПТКЛН (32%).ALCL-AL- is clinically distinct from ALCL-AL+ and PTCLD, with significant differences in prognosis between these three distinct diseases. The overall 5-year survival rate of ALCL-AL- is 49%, which is not as good as ALCL-AL+ (at 70%), but at the same time significantly better than PTCLD (32%).

Т-КЛЕТОЧНАЯ ЛИМФОМА, АССОЦИИРОВАННАЯ С ЭНТЕРОПАТИЕЙ (ТКЛЭ)ENTEROPATHY ASSOCIATED T-CELL LYMPHOMA (TCL)

ТКЛЭ - это агрессивное новообразование, которое, как считается, происходит от интраэпителиальных Т-клеток кишечника. В классификации ВОЗ 2008 года признаны два морфологически, иммуногистохимически и генетически различных типа ТКЛЭ: тип I (представляющий большинство ТКЛЭ) и тип II (составляющий 10-20% случаев).TLE is an aggressive neoplasm thought to originate from intestinal intraepithelial T cells. The 2008 WHO classification recognizes two morphologically, immunohistochemically, and genetically distinct types of TLE: type I (representing the majority of TLE) and type II (accounting for 10–20% of cases).

ТКЛЭ типа I обычно ассоциируют с явной или бессимптомной глютен-чувствительной энтеропатией и чаще встречается у пациентов из Северной Европы в связи с высокой распространенностью целиакии в этой популяции. Type I TCLE is usually associated with overt or asymptomatic gluten-sensitive enteropathy and is more common in patients from Northern Europe due to the high prevalence of celiac disease in this population.

Чаще всего поражения ТКЛЭ обнаруживаю в тощей кишке или подвздошной кишке (90% случаев) с редкими проявлениями в двенадцатиперстной кишке, толстой кишке, желудке или в областях за пределами желудочно-кишечного тракта. Кишечные поражения обычно многоочаговые с изъязвлением слизистой оболочки. Клиническое течение ТКЛЭ является агрессивным, большинство пациентов умирает от заболевания или осложнений заболевания в течение 1 года.Most often, TCLE lesions are found in the jejunum or ileum (90% of cases), with rare manifestations in the duodenum, colon, stomach, or in areas outside the gastrointestinal tract. Intestinal lesions are usually multifocal with ulceration of the mucosa. The clinical course of TCLE is aggressive, with most patients dying of the disease or complications of the disease within 1 year.

Цитологический спектр ТКЛЭ типа I широк, и в некоторых случаях может содержать анапластические клетки. Существует полиморфный воспалительный фон, который в некоторых случаях может скрывать неопластический компонент. Слизистая оболочка кишечника в участках, прилегающих к опухоли, часто демонстрирует признаки целиакии с притуплением ворсинок и увеличением числа интраэпителиальных лимфоцитов (IEL), которые могут представлять собой пораженные клетки-предшественники.The cytologic spectrum of type I TCLE is broad and may contain anaplastic cells in some cases. There is a polymorphic inflammatory background that may mask the neoplastic component in some cases. The intestinal mucosa in areas adjacent to the tumor often shows features of celiac disease with blunting of the villi and an increase in intraepithelial lymphocytes (IEL), which may represent diseased progenitor cells.

По данным иммуногистохимии, неопластические клетки часто являются CD3+CD4-CD8-CD7+CD5-CD56-βF1+ и содержат цитотоксические белки, связанные с гранулами (TIA-1, гранзим B, перфорин). CD30 частично экспрессирован почти во всех случаях. CD103, который является рецептором хоминга слизистой оболочки, может быть экспрессирован в ТКЛЭ. According to immunohistochemistry, neoplastic cells are often CD3+CD4-CD8-CD7+CD5-CD56-βF1+ and contain granule-associated cytotoxic proteins (TIA-1, granzyme B, perforin). CD30 is partially expressed in almost all cases. CD103, which is a mucosal homing receptor, can be expressed in TLE.

ТКЛЭ типа II, также называемая CD56+ мономорфной эпителиотропной Т-клеточной лимфомой кишечника, определяют как опухоль кишечника, состоящую из мономорфных T-клеток малого и среднего размера, которые экспрессируют CD8 и CD56. Часто наблюдают латеральное распространение опухоли в слизистой оболочке и отсутствие воспалительного фона. В большинстве случаев экспрессируется γδ TCR, однако есть случаи, связанные с αβ TCR.Type II TCL, also called CD56+ monomorphic intestinal epitheliotropic T-cell lymphoma, is defined as an intestinal tumor composed of small-to-medium sized monomorphic T cells that express CD8 and CD56. Lateral extension of the tumor in the mucosa and the absence of an inflammatory background are often observed. Most cases express γδ TCR, but there are cases associated with αβ TCR.

ТКЛЭ типа II имеет более широкое распространение во всем мире, чем ТКЛЭ типа I, и его часто наблюдают в азиатских или испаноязычных популяциях, в которых целиакия встречается редко. У лиц европейского происхождения ТКЛЭ II составляет около 20% Т-клеточных лимфом кишечника, с историей целиакии, по крайней мере, в ряде случаев. Клиническое течение является агрессивным.Type II TCL has a wider worldwide distribution than type I TCL and is often seen in Asian or Hispanic populations where celiac disease is rare. In individuals of European descent, type II TCL accounts for about 20% of intestinal T-cell lymphomas with a history of celiac disease in at least some cases. The clinical course is aggressive.

ГЕПАТОЛИЕНАЛЬНАЯ Т-КЛЕТОЧНАЯ ЛИМФОМА (ГЛТЛ)HEPATOLYENAL T-CELL LYMPHOMA (HTCL)

ГЛТЛ является агрессивным системным новообразованием, обычно возникающим из цитотоксических γδ Т-клеток врожденной иммунной системы, однако в редких случаях оно также может возникнуть из αβ Т-клеток. Это одна из самых редких Т-клеточных лимфом, которая обычно поражает подростков и молодых взрослых (средний возраст 35 лет) с сильным преобладанием мужчин.GLTL is an aggressive systemic neoplasm that usually arises from cytotoxic γδ T cells of the innate immune system, but in rare cases it can also arise from αβ T cells. It is one of the rarest T-cell lymphomas, typically affecting adolescents and young adults (mean age 35 years) with a strong male predominance.

ЭКСТРАНОДАЛЬНАЯ NK/T-КЛЕТОЧНАЯ ЛИМФОМА, НАЗАЛЬНЫЙ ТИПEXTRANODAL NK/T-CELL LYMPHOMA, NASAL TYPE

Экстранодальная NK/T-клеточная лимфома, назальный тип, является агрессивным заболеванием, часто с деструктивными поражениями средней линии и некрозом. Большинство случаев имеют NK-клеточное происхождение, но некоторые случаи происходят от цитотоксических T-клеток. Общепризнано, что данное заболевание ассоциировано с вирусом Эпштейна-Барра (EBV).Extranodal NK/T-cell lymphoma, nasal type, is an aggressive disease, often with destructive midline lesions and necrosis. Most cases are of NK cell origin, but some cases are cytotoxic T cell derived. The disease is generally recognized to be associated with Epstein-Barr virus (EBV).

Т-КЛЕТОЧНАЯ ЛИМФОМА КОЖИT-CELL LYMPHOMA OF THE SKIN

Способ согласно настоящему изобретению также может быть применен для лечения Т-клеточной лимфомы кожи.The method according to the present invention can also be used for the treatment of cutaneous T-cell lymphoma.

Т-клеточная лимфома кожи (ТКЛК) характеризуется миграцией злокачественных Т-клеток в кожу, что вызывает появление различных поражений. Эти поражения меняют форму по мере прогрессирования заболевания, обычно начиная с того, что кажется сыпью, и, в конечном итоге, образуя бляшки и опухоли перед метастазированием в другие части тела.Cutaneous T-cell lymphoma (CTCL) is characterized by the migration of malignant T cells into the skin, causing a variety of lesions. These lesions change shape as the disease progresses, typically starting with what appears to be a rash and eventually forming plaques and tumors before metastasizing to other parts of the body.

Т-клеточные лимфомы кожи включают те, которые упомянуты в следующем иллюстративном, неисчерпывающем списке; грибовидный микоз, педжетоидный ретикулез, синдром Сезари, гранулематозная вялая кожа, лимфоматоидный папулез, парапсориаз лихеноидный хронический, CD30+ кожная Т-клеточная лимфома, вторичная кожная CD30+ крупноклеточная лимфома, CD30- кожная крупноклеточная Т-клеточная лимфома не грибовидный микоз, плеоморфная Т-клеточная лимфома, лимфома Леннерта, подкожная Т-клеточная лимфома и ангиоцентрическая лимфома.Cutaneous T-cell lymphomas include those mentioned in the following illustrative, non-exhaustive list: mycosis fungoides, pagetoid reticulosis, Sezary syndrome, granulomatous flaccid cutis, lymphomatoid papulosis, parapsoriasis lichenoides chronica, CD30+ cutaneous T-cell lymphoma, secondary cutaneous CD30+ large cell lymphoma, CD30- cutaneous large T-cell lymphoma non-mycosis fungoides, pleomorphic T-cell lymphoma, Lennert lymphoma, subcutaneous T-cell lymphoma, and angiocentric lymphoma.

Признаки и симптомы ТКЛК варьируют в зависимости от конкретного заболевания, из которых два наиболее распространенных типа - грибовидный микоз и синдром Сезари. Классический грибовидный микоз делится на три стадии:The signs and symptoms of CTCL vary depending on the specific disorder, with the two most common types being mycosis fungoides and Sezary syndrome. Classic mycosis fungoides is divided into three stages:

- Пятна (атрофические или неатрофические): неспецифический дерматит, пятна на нижней части туловища и ягодицах; минимальный/отсутствующий кожный зуд;- Patches (atrophic or non-atrophic): non-specific dermatitis, patches on the lower trunk and buttocks; minimal/no pruritus;

- Зубной налет: бляшки с сильным зудом, лимфаденопатия; и- Dental plaque: plaques with intense itching, lymphadenopathy; and

- Опухоль: тенденция к образованию язв- Tumor: tendency to ulcerate

Синдром Сезари определяется эритродермией и лейкозом. Признаки и симптомы включают отечную кожу, лимфаденопатию, ладонный и/или подошвенный гиперкератоз, алопецию, дистрофию ногтей, эктропион и гепатоспленомегалию.Sézary syndrome is characterized by erythroderma and leukemia. Signs and symptoms include edematous skin, lymphadenopathy, palmar and/or plantar hyperkeratosis, alopecia, nail dystrophy, ectropion, and hepatosplenomegaly.

Из всех первичных кожных лимфом 65% относятся к Т-клеточному типу. Наиболее распространенным иммунофенотипом является CD4-положительный. Общей патофизиологии для этих заболеваний не существует, так как термин Т-клеточная лимфома кожи охватывает широкий спектр нарушений.Of all primary cutaneous lymphomas, 65% are of the T-cell type. The most common immunophenotype is CD4-positive. There is no common pathophysiology for these diseases, as the term cutaneous T-cell lymphoma covers a broad spectrum of disorders.

Первичные этиологические механизмы развития Т-клеточной лимфомы кожи (то есть грибовидного микоза) не выяснены. Грибовидному микозу может предшествовать опосредованная Т-клетками хроническая воспалительная болезнь кожи, которая может иногда прогрессировать до фатальной лимфомы.The primary etiologic mechanisms of cutaneous T-cell lymphoma (i.e., mycosis fungoides) are unclear. Mycosis fungoides may be preceded by a T-cell-mediated chronic inflammatory skin disease that may occasionally progress to fatal lymphoma.

ПЕРВИЧНАЯ АККЛ КОЖИ (АКЛК)PRIMARY ACCL OF THE SKIN (ACCL)

АККЛК часто неотличима от АККЛ-КАЛ- по морфологии. Ее определяют как кожную опухоль из крупных клеток с анапластической, плеоморфной или иммунобластной морфологией с более чем 75% клеток, экспрессирующих CD30. Вместе с лимфоматоидным папулезом (LyP) АКЛК относится к спектру первичных CD30-положительных Т-клеточных лимфопролиферативных нарушений, которые как группа составляют вторую наиболее распространенную после грибовидного микоза группу Т-клеточных лимфопролифераций.ALCL is often indistinguishable from ALCL-CAL- in morphology. It is defined as a cutaneous neoplasm of large cells with anaplastic, pleomorphic, or immunoblastic morphology with >75% of cells expressing CD30. Together with lymphomatoid papulosis (LyP), ALCL belongs to a spectrum of primary CD30-positive T-cell lymphoproliferative disorders that as a group constitute the second most common group of T-cell lymphoproliferations after mycosis fungoides.

Профиль иммуногистохимического окрашивания достаточно схож с АККЛ-КАЛ- с большей долей случаев, окрашивающих положительно на цитотоксические маркеры. По крайней мере 75% опухолевых клеток должны быть положительными по CD30. CD15 также может быть экспрессирован, и когда происходит вовлечение лимфатического узла, дифференциация с классической лимфомой Ходжкина может быть затруднена. Редкие случаи АККЛ-КАЛ+ могут иметь локализованные кожные повреждения и напоминать C-ALCL.The immunohistochemical staining profile is quite similar to ALCL-AL- with a higher proportion of cases staining positive for cytotoxic markers. At least 75% of tumor cells should be positive for CD30. CD15 may also be expressed and when lymph node involvement occurs, differentiation from classical Hodgkin lymphoma may be difficult. Rare cases of ALCL-AL+ may have localized cutaneous lesions and resemble C-ALCL.

Т-КЛЕТОЧНЫЙ ОСТРЫЙ ЛИМФОБЛАСТНЫЙ ЛЕЙКОЗT-CELL ACUTE LYMPHOBLASTIC LEUKEMIA

Т-клеточный острый лимфобластный лейкоз (Т-ОЛЛ) составляет около 15% и 25% от общего количества ОЛЛ в педиатрической и взрослой когортах соответственно. Пациенты обычно имеют высокое количество лейкоцитов и могут иметь органомегалию, особенно увеличение средостения и вовлечение ЦНС.T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) accounts for approximately 15% and 25% of total ALL in pediatric and adult cohorts, respectively. Patients typically have high white blood cell counts and may have organomegaly, particularly mediastinal enlargement and CNS involvement.

Способ согласно настоящему изобретению может быть применен для лечения Т-ОЛЛ, который связан со злокачественной Т-клеткой, которая экспрессирует TCR, включающий TRBC1.The method according to the present invention can be used to treat T-ALL, which is associated with a malignant T cell that expresses a TCR including TRBC1.

Т-КЛЕТОЧНЫЙ ПРОЛИМФОЦИТАРНЫЙ ЛЕЙКОЗ (Т-ПЛЛ)T-CELL PROLYMPHOCYTIC LEUKEMIA (T-PLL)

Т-клеточный пролимфоцитарный лейкоз (Т-ПЛЛ) представляет собой зрелый Т-клеточный лейкоз с агрессивным поведением и склонностью к поражению крови, костного мозга, лимфатических узлов, печени, селезенки и кожи. Т-ПЛЛ поражает, главным образом, взрослых в возрасте старше 30 лет. Другие названия включают Т-клеточный хронический лимфоцитарный лейкоз, «холмистый» тип Т-клеточного лейкоза и Т-пролимфоцитарный лейкоз/Т-клеточный лимфоцитарный лейкоз.T-cell prolymphocytic leukemia (T-PLL) is a mature T-cell leukemia with aggressive behavior and a predilection for invading the blood, bone marrow, lymph nodes, liver, spleen, and skin. T-PLL primarily affects adults over the age of 30. Other names include T-cell chronic lymphocytic leukemia, "hillock" type T-cell leukemia, and T-prolymphocytic leukemia/T-cell lymphocytic leukemia.

В периферической крови Т-ПЛЛ состоит из лимфоцитов среднего размера с одиночными ядрышками и базофильной цитоплазмой со случайными пузырьками или выступами. Ядра, как правило, имеют округлую или овальную форму, причем у отдельных пациентов имеются клетки с более нерегулярным ядерным контуром, сходным с церебриформной ядерной формой, наблюдаемой при синдроме Сезари. Мелкоклеточный вариант составляет 20% всех случаев Т-ПЛЛ, а вариант, подобный клеткам Сезари (церебриформный), наблюдается в 5% случаев.In peripheral blood, T-PLL consists of medium-sized lymphocytes with single nucleoli and basophilic cytoplasm with occasional vesicles or projections. The nuclei are typically round or oval, with some patients having cells with a more irregular nuclear outline similar to the cerebriform nuclear form seen in Sézary syndrome. The small cell variant accounts for 20% of all T-PLL cases, and the Sézary cell-like (cerebriform) variant is seen in 5%.

Т-ПЛЛ обладает иммунофенотипом зрелого (посттимического) T-лимфоцита, и неопластические клетки, как правило, положительны по пан-Т-антигенам CD2, CD3 и CD7 и негативны по TdT и CD1a. Иммунофенотип CD4+/CD8- присутствует в 60% случаев, иммунофенотип CD4+/CD8+ присутствует в 25%, а иммунофенотип CD4-/CD8+ присутствует в 15% случаев.T-PLL has the immunophenotype of a mature (postthymic) T lymphocyte, and neoplastic cells are typically positive for the pan-T antigens CD2, CD3, and CD7 and negative for TdT and CD1a. The CD4+/CD8- immunophenotype is present in 60% of cases, the CD4+/CD8+ immunophenotype is present in 25%, and the CD4-/CD8+ immunophenotype is present in 15% of cases.

Диагностирумые Т-клеточные лимфома или лейкоз могут быть выбраны из следующего: неспецифицированная периферическая Т-клеточная лимфома (ПТКЛн); ангиоиммунобластная Т-клеточная лимфома (АИТЛ), анапластическая крупноклеточная лимфома (АККЛ), Т-клеточная лимфома, ассоциированная с энтеропатией (EATL), гепатолиенальная Т-клеточная лимфома (ГЛТЛ), экстранодальная NK/T-клеточная лимфома назального типа, Т-клеточная лимфома кожи, первичная АККЛ кожи, Т-клеточный пролимфоцитарный лейкоз и Т-клеточный острый лимфобластный лейкоз.The T-cell lymphoma or leukemia to be diagnosed may be selected from the following: peripheral T-cell lymphoma of no particular type (PTCLn); angioimmunoblastic T-cell lymphoma (AITL), anaplastic large cell lymphoma (ALCL), enteropathy-associated T-cell lymphoma (EATL), hepatosplenic T-cell lymphoma (HTL), extranodal NK/T-cell lymphoma of the nasal type, cutaneous T-cell lymphoma, primary cutaneous ALCL, T-cell prolymphocytic leukemia, and T-cell acute lymphoblastic leukemia.

Способ лечения может включать этап введения терапевтического количества клетки или группы клеток, или антитела, или BiTE, или химиотерапевтического конъюгата согласно настоящему изобретению. Специалист сможет определить количество клетки или группы клеток, или антитела, или BiTE, или химиотерапевтического конъюгата согласно настоящему изобретению, которое способно оказать терапевтическое действие на пациента, общепринятыми способами.The method of treatment may include the step of administering a therapeutic amount of a cell or group of cells, or an antibody, or a BiTE, or a chemotherapeutic conjugate according to the present invention. A person skilled in the art will be able to determine the amount of a cell or group of cells, or an antibody, or a BiTE, or a chemotherapeutic conjugate according to the present invention, which is capable of exerting a therapeutic effect on a patient, using conventional methods.

11. Диагностический агент11. Diagnostic agent

Ранее было определено, что доля Т-клеток TRBC2+ от здоровых доноров составляет 35%, а Т-клеток TRBC1+ - 65%, то есть средняя процентная доля от общего количества Т-клеток, экспрессирующих TRBC1, составляла 35% (диапазон 25-47%) (Maciocia et al., 2017, Nat Med 23:1416-23). Поскольку Т-клеточные лимфомы или лейкозы являются клональными раковыми образованиями (Maciocia et al., 2017; как было сказано выше), нерегулируемая пролиферация злокачественных Т-клеток, характерная для Т-клеточных лимфомы или лейкоза, будет приводить к тому, что доля T-клеток TRBC1+ или TRBC2+ (например, Т-клетки TRBC2- или TRBC1-) будет значительно отличаться от первоначальной. Соответственно, за счет способности различать TRBC1 и TRBC2 благодаря специфичному связыванию с TRBC2, вариантный антигенсвязывающий домен и антитело согласно настоящему изобретению представляют собой агенты, которые можно применять для диагностики Т-клеточных лимфом или лейкозов.Previously, it was determined that the proportion of TRBC2 + T cells from healthy donors was 35% and that of TRBC1 + T cells was 65%, meaning that the median percentage of total T cells expressing TRBC1 was 35% (range 25–47%) (Maciocia et al., 2017, Nat Med 23:1416–23). Because T cell lymphomas or leukemias are clonal cancers (Maciocia et al., 2017; as discussed above), the unregulated proliferation of malignant T cells characteristic of T cell lymphomas or leukemias would result in the proportion of TRBC1 + or TRBC2 + T cells (e.g., TRBC2− or TRBC1− T cells) being significantly different from the baseline. Accordingly, due to the ability to distinguish between TRBC1 and TRBC2 by specifically binding to TRBC2, the variant antigen-binding domain and antibody of the present invention are agents that can be used to diagnose T-cell lymphomas or leukemias.

Таким образом, в еще одном аспекте настоящего изобретения предложен диагностический агент (далее - «первый диагностический агент согласно настоящему изобретению»), котороый содержит вариантный антигенсвязывающий домен согласно настоящему изобретению.Thus, in another aspect of the present invention, there is provided a diagnostic agent (hereinafter referred to as the " first diagnostic agent according to the present invention "), which comprises a variant antigen-binding domain according to the present invention.

В другом аспекте настоящего изобретения предложен диагностический агент, (далее - «второй диагностический агент согласно настоящему изобретению», который содержит антитело согласно настоящему изобретению.In another aspect of the present invention, there is provided a diagnostic agent (hereinafter referred to as the “ second diagnostic agent according to the present invention ”), which comprises an antibody according to the present invention.

Термины «вариантный антигенсвязывающий домен согласно настоящему изобретению» и «антитело согласно настоящему изобретению» были подробно раскрыты в контексте предыдущих аспектов настоящего изобретения, и их признаки и варианты реализации в равной степени применимы к данным аспектам изобретения.The terms “variant antigen-binding domain according to the present invention” and “antibody according to the present invention” have been described in detail in the context of previous aspects of the present invention, and their features and embodiments apply equally to these aspects of the invention.

Вариантный антигенсвязывающий домен или антитело согласно настоящему изобретению, предназначенные для применения в этих анализах, могут быть мечеными или немечеными. Термин «детектируемая метка» или «агент для мечения» в контексте настоящей заявки относится к молекулярной метке, которая позволяет обнаруживать, определять местоположение и/или идентифицировать молекулу, к которой она присоединена с помощью соответствующих способов и оборудования для обнаружения, например, с помощью спектроскопических, фотохимических, биохимических, иммунохимических или химических средств. Агенты для мечения, пригодные для мечения антител, включают радионуклиды, энзимы, флуорофоры, хемилюминесцентные реагенты, ферментные субстраты или кофакторы, ингибиторы ферментов, частицы, красители и их производные, и т. п. Для специалиста в данной области очевидно, что обнаружение немеченых вариантных антигенсвязывающих доменов и антител должно производиться с помощью дополнительного реагента, например, меченого вторичного антитела. Это особенно полезно для увеличения чувствительности способа обнаружения, поскольку позволяет усилить сигнал. Существует широкий спектр стандартных анализов, которые могут быть применены в настоящем изобретении, в которых используются немеченые антитела согласно настоящему изобретению (первичное антитело) и меченые антитела согласно настоящему изобретению (вторичные антитела). Данные способы включают вестерн-блоттинг или иммуноблотирование, ELISA (иммуноферментный анализ), RIA (радиоиммуноанализ), конкурентный EIA (конкурентный иммуноферментный анализ), DAS-ELISA (сэндвич-ELISA с двумя антителами), иммуноцитохимические и иммуногистохимические способы, проточную цитометрию или мультиплексные способы обнаружения, основанные на применении белковых микросфер, биочипов или микрочипов, которые включают антитела согласно настоящему изобретению. Другие способы обнаружения и количественной оценки TRBC2 с применением вариантного антигенсвязывающего домена или антитела согласно настоящему изобретению включают способы аффинной хроматографии или анализы связывания лиганда.The variant antigen-binding domain or antibody of the present invention for use in these assays may be labeled or unlabeled. The term " detectable label " or " labeling agent " as used herein refers to a molecular label that allows the molecule to which it is attached to be detected, located and/or identified by appropriate detection methods and equipment, such as spectroscopic, photochemical, biochemical, immunochemical or chemical means. Labeling agents suitable for labeling antibodies include radionuclides, enzymes, fluorophores, chemiluminescent reagents, enzyme substrates or cofactors, enzyme inhibitors, particles, dyes and derivatives thereof, and the like. It will be apparent to one skilled in the art that detection of unlabeled variant antigen-binding domains and antibodies should be accomplished with an additional reagent, such as a labeled secondary antibody. This is particularly useful for increasing the sensitivity of the detection method, since it allows for amplification of the signal. There is a wide range of standard assays that can be used in the present invention, which use unlabeled antibodies of the present invention (primary antibody) and labeled antibodies of the present invention (secondary antibodies). These methods include Western blotting or immunoblotting, ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), RIA (radioimmunoassay), competitive EIA (competitive enzyme-linked immunosorbent assay), DAS-ELISA (dual-antibody sandwich ELISA), immunocytochemical and immunohistochemical methods, flow cytometry or multiplex detection methods based on the use of protein beads, biochips or microarrays that include the antibodies of the present invention. Other methods for detecting and quantifying TRBC2 using a variant antigen-binding domain or an antibody of the present invention include affinity chromatography methods or ligand binding assays.

Данный диагностический агент может быть применен для диагностики Т-клеточных лимфомы или лейкоза.This diagnostic agent can be used to diagnose T-cell lymphoma or leukemia.

Т-клеточные лимфома или лейкоз могут быть выбраны из следующего: неспецифицированная периферическая Т-клеточная лимфома (ПТКЛн); ангиоиммунобластная Т-клеточная лимфома (АИТЛ), анапластическая крупноклеточная лимфома (АККЛ), Т-клеточная лимфома, ассоциированная с энтеропатией (EATL), гепатолиенальная Т-клеточная лимфома (ГЛТЛ), экстранодальная NK/T-клеточная лимфома назального типа, Т-клеточная лимфома кожи, первичная АККЛ кожи, Т-клеточный пролимфоцитарный лейкоз и Т-клеточный острый лимфобластный лейкоз.The T-cell lymphoma or leukemia may be selected from the following: peripheral T-cell lymphoma of unspecified type (PTCLn); angioimmunoblastic T-cell lymphoma (AITL), anaplastic large cell lymphoma (ALCL), enteropathy-associated T-cell lymphoma (EATL), hepatosplenic T-cell lymphoma (HTL), extranodal NK/T-cell lymphoma of nasal type, cutaneous T-cell lymphoma, primary cutaneous ALCL, T-cell prolymphocytic leukemia, and T-cell acute lymphoblastic leukemia.

12. Способ диагностики12. Method of diagnostics

В еще одном аспекте настоящего изобретения предложен способ диагностики Т-клеточных лимфомы или лейкоза у субъекта, (далее - «способ диагностики согласно настоящему изобретению», который включает этап приведения в контакт вариантного антигенсвязывающего домена или антитела согласно настоящему изобретению с образцом, содержащим Т-клетки, полученные у субъекта.In another aspect of the present invention, there is provided a method for diagnosing T-cell lymphoma or leukemia in a subject (hereinafter referred to as the " diagnostic method according to the present invention "), which comprises the step of contacting a variant antigen-binding domain or antibody according to the present invention with a sample containing T cells obtained from the subject.

Термины «вариантный антигенсвязывающий домен согласно настоящему изобретению», «антитело согласно настоящему изобретению» и «субъект» были подробно раскрыты в контексте предыдущих аспектов изобретения, и их признаки и варианты реализации в равной степени применимы к данному аспекту настоящего изобретения.The terms “variant antigen-binding domain according to the present invention”, “antibody according to the present invention” and “subject” have been described in detail in the context of previous aspects of the invention, and their features and embodiments are equally applicable to this aspect of the present invention.

Способ диагностики согласно настоящему изобретению может дополнительно включать этап определения процентной доли TRBC2-положительных Т-клеток в образце.The diagnostic method according to the present invention may further include the step of determining the percentage of TRBC2-positive T cells in the sample.

Для применения первого способа согласно настоящему изобретению на практике, у исследуемого субъекта получают образец, содержащий Т-клетки, такой как биологический образец. Термин «образец» или «биологический образец» в контексте настоящей заявки означает различные виды биологических жидкостей или участков тканей пораженных органов, которые содержат Т-клетки. Иллюстративные неограничивающие примеры образцов, используемых в данном способе диагностики согласно настоящему изобретению, включают различные виды биологических жидкостей, содержащих Т-клетки, такие как кровь, лимфатическая и спинномозговая жидкости. Такие образцы биологической жидкости можно получить любым стандартным способом, известным специалистам. В альтернативном варианте указанный образец также может представлять собой фрагмент образца ткани пораженного органа, например, из лимфатической железы, селезенки, миндалин или тимуса, который может быть получен любым общепринятым способом, например, с помощью биопсии или хирургической резекции, и из замороженных фрагментов, взятых для гистологических целей.In order to practice the first method according to the present invention, a sample containing T cells, such as a biological sample, is obtained from the subject to be tested. The term "sample" or "biological sample" in the context of the present application means various types of biological fluids or tissue sections of affected organs that contain T cells. Illustrative non-limiting examples of samples used in this diagnostic method according to the present invention include various types of biological fluids containing T cells, such as blood, lymphatic and cerebrospinal fluids. Such biological fluid samples can be obtained by any standard method known to those skilled in the art. Alternatively, said sample can also be a fragment of a tissue sample of the affected organ, for example, from a lymph gland, spleen, tonsils or thymus, which can be obtained by any conventional method, for example, by biopsy or surgical resection, and from frozen sections taken for histological purposes.

В соответствии с первым этапом способа диагностики согласно настоящему изобретению вариантный антигенсвязывающий домен или антитело согласно настоящему изобретению контактирует с образцом, полученным у исследуемого субъекта, в соответствующих условиях, известных специалистам в данной области.According to the first step of the diagnostic method according to the present invention, the variant antigen-binding domain or antibody according to the present invention is contacted with a sample obtained from a test subject under appropriate conditions known to those skilled in the art.

Специалист в данной области может использовать ряд стандартных способов для обнаружения TRBC2 в образце, которые подходят для выполнения второго этапа способа диагностики согласно настоящему изобретению. Особенно полезны иммунологические способы. Таким образом, применение первого или второго диагностического агента согласно настоящему изобретению может быть особенно полезным для применения способа диагностики согласно настоящему изобретению. Признаки и конкретные варианты реализации, касающиеся диагностических агентов согласно настоящему изобретению были определены ранее и в равной степени применимы к способу диагностики согласно настоящему изобретению.A person skilled in the art can use a number of standard methods for detecting TRBC2 in a sample, which are suitable for performing the second step of the diagnostic method according to the present invention. Immunological methods are particularly useful. Thus, the use of the first or second diagnostic agent according to the present invention can be particularly useful for applying the diagnostic method according to the present invention. The features and specific embodiments concerning the diagnostic agents according to the present invention have been previously defined and are equally applicable to the diagnostic method according to the present invention.

В способе диагностики согласно настоящему изобретению процентное содержание TRBC2-положительных Т-клеток в образце, составляющее 70%, или 75%, или 80%, или 85%, или 90%, или 95%, или 96%, или 97%, или 98%, или 99%, или более может указывать на наличие Т-клеточных лимфомы или лейкоза.In the diagnostic method according to the present invention, a percentage of TRBC2-positive T cells in a sample of 70%, or 75%, or 80%, or 85%, or 90%, or 95%, or 96%, or 97%, or 98%, or 99% or more may indicate the presence of T-cell lymphoma or leukemia.

Специалистам в данной области техники будет понятно, что несмотря на то, что прогноз отражает наиболее вероятный вариант, он не обязательно должен быть правильным для 100% субъектов, подлежащих диагностике или обследованию. Однако данный термин подразумевает, что статистически значимая доля субъектов может быть определена как имеющие увеличенную вероятность получения данного результата. Специалист в данной области может достаточно быстро определить, являются ли полученные у субъекта данные статистически значимыми, при помощи различных хорошо известных средств статистической оценки, например, способом определения доверительных интервалов, определением значения p, способом классификационных норм с перекрестной валидацией и т. п. Подробную информацию можно найти в Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York, 1983. Предпочтительные доверительные интервалы составляют по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95%. В предпочтительном варианте реализации значения p составляют 0,01 или 0,005 или меньше.It will be appreciated by those skilled in the art that although a prediction represents the most likely outcome, it need not be correct for 100% of the subjects being diagnosed or tested. However, the term does imply that a statistically significant proportion of subjects can be determined to have an increased probability of obtaining a given outcome. One skilled in the art can determine fairly quickly whether the data obtained for a subject are statistically significant by using various well-known statistical evaluation tools, such as the confidence interval method, the p-value method, the cross-validated classification norm method, and the like. Detailed information can be found in Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York, 1983. Preferred confidence intervals are at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, or at least 95%. In a preferred embodiment, the p values are 0.01 or 0.005 or less.

Кроме того, вариантный антигенсвязывающий домен или антитело согласно настоящему изобретению ввиду их способности специфично связывать TRBC2-положительные Т-клетки также могут быть применены для диагностики Т-клеточных лимфомы или лейкоза in vivo. Например, они могут быть применены в медицинской визуализации, то есть в комплексе способов и технологий, используемых для создания изображений тела (или его частей и функций), например, тела человека, для клинических целей, таких как медицинские процедуры, направленные на выявление, диагностику или исследование заболеваний.In addition, the variant antigen-binding domain or antibody according to the present invention, due to their ability to specifically bind TRBC2-positive T cells, can also be used for the diagnosis of T-cell lymphoma or leukemia in vivo . For example, they can be used in medical imaging, i.e. in a set of methods and technologies used to create images of the body (or its parts and functions), for example, the human body, for clinical purposes, such as medical procedures aimed at detecting, diagnosing or studying diseases.

Для этой цели вариантный антигенсвязывающий домен или антитело согласно настоящему изобретению маркируют подходящими способами, известными в данной области, и применяют в качестве агентов для способов диагностической визуализации, таких как радиоиммунодиагностика, позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ), иммунофлуоресцентная эндоскопия и т. п., например, посредством связывания и/или загрузки соответствующими молекулами, например радиоактивными изотопами или флуоресцентными красителями. Вариантный антигенсвязывающий домен и антитело согласно настоящему изобретению могут быть ассоциированы с изотопами, излучающими гамма-лучи, и применяться в радиоиммуноцинтиграфии с применением гамма-камер или однофотонной эмиссионной компьютерной томографии. Вариантный антигенсвязывающий домен и антитело согласно настоящему изобретению могут быть ассоциированы с излучателями позитронов и использоваться в ПЭТ. Вариантный антигенсвязывающий домен и антитело согласно настоящему изобретению могут быть ассоциированы с флуоресцентными красителями, такими как Cy3, Cy2, Cy5 или FITC (флуоресцеин изотиоцианат), и использоваться в иммунофлуоресцентной эндоскопии. Вариантный антигенсвязывающий домен и антитело согласно настоящему изобретению, модифицированные вышеописанным образом, вводятся любым подходящим путем, например внутривенно, в дозе, подходящей для индивидуума, и обнаружение, определение местоположения или количественные измерения TRBC2-положительных Т-клеток осуществляются способами, хорошо известными в данной области. Используемые здесь способы и технологии, включая диагностическую визуализацию, известны квалифицированным специалистам, которые также могут предоставить подходящие лекарственные формы.For this purpose, the variant antigen-binding domain or the antibody according to the present invention are labeled by suitable methods known in the art and used as agents for diagnostic imaging methods such as radioimmunodiagnostics, positron emission tomography (PET), immunofluorescence endoscopy, etc., for example, by binding and/or loading with appropriate molecules, such as radioactive isotopes or fluorescent dyes. The variant antigen-binding domain and the antibody according to the present invention can be associated with gamma-emitting isotopes and used in radioimmunoscintigraphy using gamma cameras or single-photon emission computed tomography. The variant antigen-binding domain and the antibody according to the present invention can be associated with positron emitters and used in PET. The variant antigen binding domain and antibody of the present invention can be associated with fluorescent dyes such as Cy3, Cy2, Cy5 or FITC (fluorescein isothiocyanate) and used in immunofluorescence endoscopy. The variant antigen binding domain and antibody of the present invention, modified as described above, are administered by any suitable route, such as intravenously, at a dose suitable for the individual, and the detection, localization or quantitative measurement of TRBC2-positive T cells is carried out by methods well known in the art. The methods and technologies used herein, including diagnostic imaging, are known to those skilled in the art, who can also provide suitable dosage forms.

Диагностируемые Т-клеточные лимфома или лейкоз могут быть выбраны из следующего: неспецифицированная периферическая Т-клеточная лимфома (ПТКЛн); ангиоиммунобластная Т-клеточная лимфома (АИТЛ), анапластическая крупноклеточная лимфома (АККЛ), Т-клеточная лимфома, ассоциированная с энтеропатией (EATL), гепатолиенальная Т-клеточная лимфома (ГЛТЛ), экстранодальная NK/T-клеточная лимфома назального типа, Т-клеточная лимфома кожи, первичная АККЛ кожи, Т-клеточный пролимфоцитарный лейкоз и Т-клеточный острый лимфобластный лейкоз.The T-cell lymphoma or leukemia diagnosed may be selected from the following: peripheral T-cell lymphoma of no particular type (PTCLn); angioimmunoblastic T-cell lymphoma (AITL), anaplastic large cell lymphoma (ALCL), enteropathy-associated T-cell lymphoma (EATL), hepatosplenic T-cell lymphoma (HTL), extranodal NK/T-cell lymphoma of the nasal type, cutaneous T-cell lymphoma, primary cutaneous ALCL, T-cell prolymphocytic leukemia, and T-cell acute lymphoblastic leukemia.

Образец может представлять собой образец крови или может быть получен из него.The sample may be a blood sample or may be obtained from a blood sample.

13. Способы персонализированной медицины13. Methods of personalized medicine

В еще одном аспекте настоящего изобретения предложен способ выявления субъектов с Т-клеточными лимфомой или лейкозом, соответствующих критериям для лечения на основе клеток, антител, BiTE или химиотерапевтического конъюгата согласно настоящему изобретению (далее - «первый способ персонализированной медицины согласно настоящему изобретению»), включающий определение процентной доли TRBC2-положительных Т-клеток в образце, содержащем Т-клетки, полученные у субъекта. In another aspect of the present invention, there is provided a method for identifying subjects with T-cell lymphoma or leukemia who meet the criteria for treatment based on cells, antibodies, BiTE or a chemotherapeutic conjugate according to the present invention (hereinafter referred to as the " first method of personalized medicine according to the present invention "), comprising determining the percentage of TRBC2-positive T cells in a sample containing T cells obtained from the subject.

Термины «клетка согласно настоящему изобретению», «антитело согласно настоящему изобретению», «BiTE согласно настоящему изобретению», «химиотерапевтический агент согласно настоящему изобретению», «субъект» и «образец, содержащий Т-клетки» были подробно раскрыты в контексте предыдущих аспектов настоящего изобретения, и их признаки и варианты реализации в равной степени применимы к данному аспекту настоящего изобретения.The terms “cell of the present invention”, “antibody of the present invention”, “BiTE of the present invention”, “chemotherapeutic agent of the present invention”, “subject” and “sample comprising T cells” have been described in detail in the context of previous aspects of the present invention, and their features and embodiments are equally applicable to this aspect of the present invention.

В первом способе персонализированной медицины согласно настоящему изобретению субъект соответствует критериям для вышеупомянутого лечения на основе клеток, антител, BiTE или химиотерапевтического конъюгата согласно настоящему изобретению, если процент TRBC2-положительных Т-клеток в образце составляет 70% или 75%, или 80%, или 85%, или 90%, или 95%, или 96%, или 97%, или 98%, или 99% или более.In the first method of personalized medicine according to the present invention, the subject meets the criteria for the above-mentioned cell-based, antibody-based, BiTE-based or chemotherapeutic conjugate-based treatment according to the present invention if the percentage of TRBC2-positive T cells in the sample is 70% or 75% or 80% or 85% or 90% or 95% or 96% or 97% or 98% or 99% or more.

В еще одном аспекте настоящего изобретения предложен способ выбора терапии, включающей клетку, антитело, BiTE или химиотерапевтический конъюгат согласно настоящему изобретению, для лечения субъекта (далее - «второй способ персонализированной медицины согласно настоящему изобретению»), включающий определение процентной доли TRBC2-положительных Т-клеток в образце, содержащем Т-клетки, полученные у субъекта.In another aspect of the present invention, there is provided a method for selecting a therapy comprising a cell, antibody, BiTE or chemotherapeutic conjugate according to the present invention for treating a subject (hereinafter referred to as the " second method of personalized medicine according to the present invention "), comprising determining the percentage of TRBC2-positive T cells in a sample containing T cells obtained from the subject.

Термины «клетка согласно настоящему изобретению», «антитело согласно настоящему изобретению», «BiTE согласно настоящему изобретению», «химиотерапевтический агент согласно настоящему изобретению», «субъект» и «образец, содержащий Т-клетки» были подробно раскрыты в контексте предыдущих аспектов настоящего изобретения, и их признаки и варианты реализации в равной степени применимы к данному аспекту настоящего изобретения.The terms “cell of the present invention”, “antibody of the present invention”, “BiTE of the present invention”, “chemotherapeutic agent of the present invention”, “subject” and “sample comprising T cells” have been described in detail in the context of previous aspects of the present invention, and their features and embodiments are equally applicable to this aspect of the present invention.

Во втором способе персонализированной медицины согласно настоящему изобретению терапия, включающая клетку, антитело, BiTE или химиотерапевтический конъюгат согласно настоящему изобретению, выбирается для лечения указанного субъекта, если процент TRBC2-положительных Т-клеток в образце составляет 70%, или 75%, или 80%, или 85%, или 90%, или 95%, или 96%, или 97%, или 98%, или 99% или более.In a second method of personalized medicine according to the present invention, a therapy comprising a cell, antibody, BiTE or chemotherapeutic conjugate according to the present invention is selected for treatment of said subject if the percentage of TRBC2-positive T cells in the sample is 70%, or 75%, or 80%, or 85%, or 90%, or 95%, or 96%, or 97%, or 98%, or 99% or more.

Образец может представлять собой образец крови или может быть получен из него.The sample may be a blood sample or may be obtained from a blood sample.

Т-клеточные лимфома или лейкоз могут быть выбраны из следующего: неспецифицированная периферическая Т-клеточная лимфома (ПТКЛн); ангиоиммунобластная Т-клеточная лимфома (АИТЛ), анапластическая крупноклеточная лимфома (АККЛ), Т-клеточная лимфома, ассоциированная с энтеропатией (EATL), гепатолиенальная Т-клеточная лимфома (ГЛТЛ), экстранодальная NK/T-клеточная лимфома назального типа, Т-клеточная лимфома кожи, первичная АККЛ кожи, Т-клеточный пролимфоцитарный лейкоз и Т-клеточный острый лимфобластный лейкоз.The T-cell lymphoma or leukemia may be selected from the following: peripheral T-cell lymphoma of unspecified type (PTCLn); angioimmunoblastic T-cell lymphoma (AITL), anaplastic large cell lymphoma (ALCL), enteropathy-associated T-cell lymphoma (EATL), hepatosplenic T-cell lymphoma (HTL), extranodal NK/T-cell lymphoma of nasal type, cutaneous T-cell lymphoma, primary cutaneous ALCL, T-cell prolymphocytic leukemia, and T-cell acute lymphoblastic leukemia.

Далее настоящее изобретение будет описано с помощью Примеров, которые предназначены для помощи среднему специалисту в данной области техники в реализации изобретения, и никоим образом не предназначены для ограничения объема данного изобретения.The present invention will now be described by way of Examples, which are intended to assist one of ordinary skill in the art in implementing the invention and are not intended in any way to limit the scope of the invention.

ПРИМЕРЫEXAMPLES

Пример 1: Анализ связывания антител к TRBC2 способом поверхностного плазмонного резонанса (SPR)Example 1: Surface Plasmon Resonance (SPR) Analysis of TRBC2 Antibody Binding

Кристаллическая структура моноклонального антитела hJovi-1, специфичного к TRBC1, была определена в комплексе с TRBC1-TCR в разрешении 2,4 (Фиг. 3). С помощью вычислительной биологии и белковой инженерии, основываясь на принципах рациональности, было сконструировано несколько мутантных версий связывающей молекулы к TRBC1 для того, чтобы перенаправить специфичность с TRBC1 на TRBC2. Было создано некоторое количество связывающих молекул к TRBC2 в формате IgG. В Таблице 1 показаны данные по мутациям, содержащимся в доменах VH и VL антитела hJovi-1.The crystal structure of the TRBC1-specific monoclonal antibody hJovi-1 was determined in complex with TRBC1-TCR at 2.4 resolution (Fig. 3). Using computational biology and protein engineering, several mutant versions of the TRBC1 binding molecule were designed based on rationality principles to redirect specificity from TRBC1 to TRBC2. A number of TRBC2 binding molecules were generated in IgG format. Table 1 shows the mutation data contained in the VH and VL domains of the hJovi-1 antibody.

Сенсорный чип CM5 серии S иммобилизовали посредством аминового связывания с антителом к Fc человека до плотности 9000-10000 ЕО при помощи прибора Biacore T200. В качестве рабочего буфера во всех условиях эксперимента использовали буфер HBS-P+. Тестируемые антитела к TRBC2 (Таблица 1) улавливали в проточных кюветах 2, 3 и 4 до плотности 100-300 ЕО. Рекомбинантный очищенный TRBC1 или TRBC2 в известных концентрациях использовали в качестве «исследуемого вещества» и вводили через соответствующие проточные кюветы при времени контакта 150 с и диссоциации в течение 300 с при скорости потока 30 мкл/мин. В каждом эксперименте проточную кювету 1 не подвергали модификации и использовали для вычитания эталонных значений. Сенсограмму «0 концентраций» только буфера использовали в качестве двойного вычитания эталонных значений к коэффициенту отклонения. Данные соответствовали модели связывания Ленгмюра 1:1. Поскольку использовали захватывающее устройство, для подбора данных в каждом случае использовали локальный параметр Rmax.The CM5 S-Series Sensor Chip was immobilized by amine coupling with anti-human Fc antibody to a density of 9,000-10,000 EU using a Biacore T200. HBS-P+ buffer was used as the running buffer under all experimental conditions. Anti-TRBC2 antibodies to be tested (Table 1) were captured in flow cells 2, 3, and 4 to a density of 100-300 EU. Recombinant purified TRBC1 or TRBC2 at known concentrations were used as the “test substance” and were injected through the respective flow cells with a contact time of 150 s and a dissociation time of 300 s at a flow rate of 30 μL/min. Flow cell 1 was unmodified in each experiment and was used for reference subtraction. The '0 concentration' sensorgram of buffer only was used as a double subtraction of the reference values to the coefficient of variation. The data were fitted to a 1:1 Langmuir binding model. Since a capture device was used, the local parameter R max was used to fit the data in each case.

Результаты определения аффинности к TRBC1 и TRBC2, полученные для каждого из антител к TRBC2, показаны в Таблице 1. Тестируемые антитела к TRBC2 продемонстрировали предпочтение к связыванию с TRBC2 в большинстве случаев в диапазоне нМ, с различными кинетическими свойствами ka и kd. В большинстве случаев оценка связывания с TRBC1 составила >1 мкМ со значениями, приближающимися к пределу чувствительности прибора. The TRBC1 and TRBC2 affinity results obtained for each of the TRBC2 antibodies are shown in Table 1. The tested TRBC2 antibodies showed a preference for binding to TRBC2 in most cases in the nM range, with variable ka and kd kinetic properties. In most cases, binding to TRBC1 was estimated to be >1 μM, with values approaching the detection limit of the instrument.

Пример 2: Создание CAR к TRBC2 на основе связывающей молекулы KFNExample 2: Generation of a TRBC2 CAR based on the KFN binding molecule

Конструкции CAR второго поколения были созданы на основе антитела к TRBC2, полученного в результате тройной мутации (мутации T28K, Y32F, A100N в домене VH антитела hJovi-1, последовательность с SEQ ID: 26), и гуманизированного антитела Jovi-1 (hJovi-1) (Фиг. 4). Эти конструкции CAR клонировали в ретровирусный вектор и использовали для трансдукции активированных МКПК, полученных от здоровых доноров.Second-generation CAR constructs were generated based on a triple-mutated TRBC2 antibody (T28K, Y32F, A100N mutations in the VH domain of hJovi-1, SEQ ID: 26) and a humanized Jovi-1 antibody (hJovi-1) (Fig. 4). These CAR constructs were cloned into a retroviral vector and used to transduce activated PBMCs from healthy donors.

Пример 3: Функциональная характеристика CAR к TRBC2: Продукция цитокиновExample 3: Functional characterization of CAR to TRBC2: Cytokine production

Для оценки функциональной способности T-клеток с CAR к TRBC2 с тройной мутацией по отношению к TRBC2 использовали анализ связывания, проводимый на планшете (plate bound assay), в котором TRBC1 или TRBC2 иммобилизовали перед добавлением CAR-T-клеток. Через 72 часа культуральные супернатанты собирали и продукцию IFN-γ определяли с помощью ИФА (ELISA). На Фиг. 5A T-клетки с CAR к TRBC2 с тройной мутацией продемонстрировали более интенсивное высвобождение IFN-γ в присутствии лиганда TRBC2 по сравнению с TRBC1. Напротив, Т-клетки с CAR на основе антитела hJovi-1 показали высокий уровень продукции IFN-γ только при культивировании с лигандом TRBC1 (Фиг. 5B). Данные результаты демонстрируют, что Т-клетки с CAR, трансдуцированные мутантом с тройной мутацией, нацеленным на TRBC2, обладают большей активацией и высвобождением цитокинов по отношению TRBC2, чем при взаимодействии с TRBC1.To assess the functional capacity of the triple mutant TRBC2 CAR T cells toward TRBC2, a plate bound assay was used in which TRBC1 or TRBC2 was immobilized prior to addition of the CAR T cells. After 72 h, culture supernatants were collected and IFN-γ production was determined by ELISA. In Fig. 5A, the triple mutant TRBC2 CAR T cells showed enhanced IFN-γ release in the presence of TRBC2 ligand compared to TRBC1. In contrast, hJovi-1 CAR T cells showed high levels of IFN-γ production only when cultured with TRBC1 ligand (Fig. 5B). These results demonstrate that CAR T cells transduced with a triple mutant targeting TRBC2 have greater activation and cytokine release toward TRBC2 than toward TRBC1.

Пример 4: Функциональная характеристика CAR к TRBC2: Анализ цитотоксичностиExample 4: Functional characterization of CAR to TRBC2: Cytotoxicity assay

Для определения способности анти-TRBC2 Т-клеток с CAR с тройной мутацией нацеливаться на TRBC2, были проведены анализы цитотоксичности с применением клеток Raji, трансдуцированных для экспрессии TRBC1 или TRBC2 в качестве клеток-мишеней и совместно культивируемых с Т-клетками с CAR. T-клетки с CAR на основе антитела hJovi-1 или анти-TRBC2 Т-клетки CAR с тройной мутацией культивировали в соотношении Э:М 1:1 с клетками Raji WT, Raji TRBC1+ или Raji TRBC2+. Выделение клеток-мишеней количественно определяли через 72 часа после культивирования с помощью проточной цитометрии и использовали для определения цитотоксической способности T-клеток с CAR. Культуры, содержащие анти-TRBC2 Т-клетки с CAR с тройной мутацией продемонстрировали ограниченную выживаемость клеток-мишеней Raji TRBC2+ (Фиг. 6). Напротив, анти-TRBC2 Т-клетки с CAR с тройной мутацией не устраняли клетки-мишени Raji TRBC1+, что указывает на их увеличенную способность нацеливаться на клетки TRBC2+.To determine the ability of anti-TRBC2 triple mutant CAR T cells to target TRBC2, cytotoxicity assays were performed using Raji cells transduced to express TRBC1 or TRBC2 as target cells and co-cultured with CAR T cells. hJovi-1 antibody-based CAR T cells or anti-TRBC2 triple mutant CAR T cells were cultured at a 1:1 E:M ratio with Raji WT, Raji TRBC1 +, or Raji TRBC2 + cells. Target cell recovery was quantified 72 hours after culture by flow cytometry and used to determine the cytotoxic capacity of CAR T cells. Cultures containing anti-TRBC2 triple mutant CAR T cells demonstrated limited survival of Raji TRBC2 + target cells (Fig. 6). In contrast, triple-mutated anti-TRBC2 CAR T cells did not eliminate Raji TRBC1 + target cells, indicating their increased ability to target TRBC2 + cells.

Авторы настоящего изобретения использовали сконструированное моноклональное антитело для создания анти-TRBC2 CAR 2-го поколения. Созданные авторами настоящего изобретения анти-TRBC2 CAR продемонстрировали специфичность, высвобождение цитокинов и цитотоксичность на культурах, совместно культивируемых в течение 72-часов, в отношении линий клеток TRBC2+, в противоположность результатам у линий клеток TRBC1+ или линий клеток, которые не экспрессировали TCR на поверхности. Т-клетки с анти-TRBC2 CAR также продемонстрировали пролиферативную способность в продолжительных по времени анализах при совместном культивировании.The inventors used the engineered monoclonal antibody to generate a 2nd generation anti-TRBC2 CAR. The inventors' anti-TRBC2 CARs demonstrated specificity, cytokine release, and cytotoxicity in 72-hour co-cultures for TRBC2+ cell lines, in contrast to the results for TRBC1+ cell lines or cell lines that do not express the TCR on the surface. The anti-TRBC2 CAR T cells also demonstrated proliferative capacity in long-term co-culture assays.

Пример 5: Функциональная характеристика CAR к TRBC2: Анализ киллингаExample 5: Functional characterization of CAR to TRBC2: Killing assay

Дополнительные конструкции CAR второго поколения были созданы на основе связывающих молекул TRBC2, приведенных в Таблице 1, которые имеют следующие мутации:Additional second-generation CAR constructs were created based on the TRBC2 binding molecules listed in Table 1 that have the following mutations:

- Мутации T28K, Y32F, A100N в домене VH и N35K в домене VL антитела hJovi-1 (обозначены как N35K, SEQ ID: 25),- Mutations T28K, Y32F, A100N in the VH domain and N35K in the VL domain of the hJovi-1 antibody (designated as N35K, SEQ ID: 25),

- Мутации T28K, Y32F, A100N, N103L в домене VH антитела hJovi-1 (обозначены как N103L, SEQ ID: 27),- T28K, Y32F, A100N, N103L mutations in the VH domain of the hJovi-1 antibody (designated as N103L, SEQ ID: 27),

- Мутации T28K, Y32F, A100N, N103M в домене VH и N35Y в домене VL антитела hJovi-1 (обозначены как N103M-N35Y, SEQ ID: 28),- Mutations T28K, Y32F, A100N, N103M in the VH domain and N35Y in the VL domain of the hJovi-1 antibody (designated as N103M-N35Y, SEQ ID: 28),

- Мутации T28K, Y32F, A100N, Y102F, N103M в домене VH и N35R в домене VL антитела hJovi-1 (обозначены как Y102F-N103M-N35R, SEQ ID: 29),- Mutations T28K, Y32F, A100N, Y102F, N103M in the VH domain and N35R in the VL domain of the hJovi-1 antibody (designated as Y102F-N103M-N35R, SEQ ID: 29),

- Мутации T28K, Y32F, A100N, Y102L, N103M в домене VH и N35R в домене VL антитела hJovi-1 (обозначены как Y102L-N103M-N35R, SEQ ID: 30).- Mutations T28K, Y32F, A100N, Y102L, N103M in the VH domain and N35R in the VL domain of the hJovi-1 antibody (designated as Y102L-N103M-N35R, SEQ ID: 30).

Эти конструкции CAR и молекулы анти-TRBC2 с тройной мутацией (мутации T28K, Y32F, A100N в домене VH антитела hJovi-1, обозначены как KFN, SEQ ID: 26) клонировали в ретровирусный вектор и использовали для трансдукции (a) клеток Jurkat или (b) активированных МКПК, полученных от здоровых доноров. Контрольный CAR к TRBC1, то есть конструкцию CAR на основе антитела hJovi-1 использовали в качестве контроля в анализе киллинга с применением активированных МКПК.These CAR constructs and triple-mutated anti-TRBC2 molecules (T28K, Y32F, A100N mutations in the VH domain of hJovi-1 antibody, designated as KFN, SEQ ID: 26) were cloned into a retroviral vector and used to transduce (a) Jurkat cells or (b) activated PBMCs derived from healthy donors. The control anti-TRBC1 CAR, i.e., the hJovi-1 antibody-based CAR construct, was used as a control in the killing assay using activated PBMCs.

а) клетки Jurkata) Jurkat cells

Чтобы определить, были ли созданные связывающие молекулы специфичными к антигену TRBC2, клетки Jurkat, которые представляют собой TRBC1+, трансдуцировали вышеуказанными конструкциями CAR к TRBC2. Со-культуры трансдуцированных клеток Jurkat получали при соотношении эффектора к мишени (Э:М) 1:1 с применением клеток HPB-ALL, трансдуцированных для экспрессии только TRBC1 или TRBC2 (обозначены как HPB TRBC1 и HPB TRBC2 соответственно) в качестве клеток-мишеней с клетками HPB-ALL, имеющими нокаутированный TCR (обозначены как HPB KO) в качестве отрицательного контроля. Трансдуцированные клетки Jurkat высевали отдельно или с антителами αCD3/αCD28 для применения в качестве соответственно отрицательного или положительного контроля для анализа. Антиген-специфичную активацию оценивали по окрашиванию CD69 способом проточной цитометрии через 24 часа.To determine whether the generated binding molecules were specific for the TRBC2 antigen, TRBC1+ Jurkat cells were transduced with the above anti-TRBC2 CAR constructs. Co-cultures of transduced Jurkat cells were performed at an effector to target (E:T) ratio of 1:1 using HPB-ALL cells transduced to express TRBC1 or TRBC2 alone (designated HPB TRBC1 and HPB TRBC2, respectively) as target cells with HPB-ALL cells having a knocked-out TCR (designated HPB KO) as a negative control. Transduced Jurkat cells were plated alone or with αCD3/αCD28 antibodies for use as negative or positive controls, respectively, for the assay. Antigen-specific activation was assessed by CD69 staining by flow cytometry after 24 h.

Результаты, показанные на Фиг. 7, продемонстрировали, что все трансдуцированные клетки Jurkat были избирательно активированы после совместной инкубации с клетками HPB TRBC2. Данные результаты демонстрируют, что все протестированные CAR проявляли специфичность к мишеням TRBC2, поскольку не наблюдали увеличение количества CD69 при совместном культивировании Jurkat с мишенями TRBC1+ или HPB KO.The results shown in Fig. 7 demonstrated that all transduced Jurkat cells were selectively activated after co-incubation with HPB TRBC2 cells. These results demonstrate that all CARs tested exhibited specificity for TRBC2 targets, as no increase in CD69 was observed when Jurkat was co-cultured with TRBC1+ or HPB KO targets.

b) МКПКb) ICPC

Вначале МКПК (мононуклеарные клетки периферической крови) были разделены на клетки TRBC1+ и TRBC2+ при помощи магнитных гранул с покрытием анти-биотин после окрашивания 10 мкг/мл биотинилированным антителом мыши JOVI-1, которое связывается только с TRBC1. Популяцию TRBC2+ трансдуцировали CAR на основе антитела hJovi-1 (JOVI), а популяцию TRBC1+ - вышеуказанным CAR к TRBC2. Данная дифференциальная трансдукция обеспечила, чтобы активация антигенов и уничтожение мишеней запускались только при добавлении мишеней в контролируемых условиях культивирования (таких как, например, отношение эффекторов к мишеням и временные точки), а не в смешанной популяции, где условия различны для каждого донора МКПК.First, PBMCs (peripheral blood mononuclear cells) were separated into TRBC1+ and TRBC2+ cells using anti-biotin coated magnetic beads after staining with 10 μg/ml biotinylated murine antibody JOVI-1, which binds only to TRBC1. The TRBC2+ population was transduced with the hJovi-1 antibody-based CAR (JOVI) and the TRBC1+ population with the above-mentioned anti-TRBC2 CAR. This differential transduction ensured that antigen activation and target killing were triggered only upon addition of targets under controlled culture conditions (such as effector to target ratio and time points) rather than in a mixed population where conditions are different for each PBMC donor.

Затем анализы киллинга были организированы c применением клеток HPB-ALL, трансдуцированных для экспрессии только TRBC1 или TRBC2 (обозначены как TRBC1+HPB-ALL and TRBC2+HPB-ALL соответственно) в качестве клеток-мишеней с клетками HPB-ALL, имеющими деактивированный TCR (обозначены как HPB-KO) в качестве контроля. Через 10 дней после трансдукции клетки культивировали совместно при соотношении Э:М 1:2. Киллинг клеток оценивали способом проточной цитометрии через 72 часа после настройки параметров анализа.Killing assays were then set up using HPB-ALL cells transduced to express TRBC1 or TRBC2 alone (designated TRBC1+HPB-ALL and TRBC2+HPB-ALL, respectively) as target cells with HPB-ALL cells having a deactivated TCR (designated HPB-KO) as a control. Ten days after transduction, cells were co-cultured at an E:M ratio of 1:2. Cell killing was assessed by flow cytometry 72 hours after assay parameter setting.

Результаты продемонстрировали, что Т-клетки с CAR на основе hJovi-1 обеспечивали киллинг только клеток TRBC1+ HPB-ALL, а все T-клетки с CAR к TRBC2 обеспечивали киллинг только клеток TRBC2+ HPB-ALL (Фиг. 8). Сходные уровни фонового киллинга наблюдали у всех TRBC1- и TRBC2-специфичных T-клеток с CAR в отношении контрольных клеток HPB-KO, что указывает на то, что все протестированные CAR были специфичны к когнатному им антигену.The results demonstrated that hJovi-1-bearing CAR T cells killed only TRBC1+ HPB-ALL cells, while all anti-TRBC2-bearing CAR T cells killed only TRBC2+ HPB-ALL cells (Fig. 8). Similar levels of background killing were observed for all TRBC1- and TRBC2-specific CAR T cells relative to control HPB-KO cells, indicating that all CARs tested were specific for their cognate antigen.

Пример 6: Анализ влияния различных форматов строения антител на связывание антител к TRBC2 посредством поверхностного плазмонного резонанса (SPR).Example 6: Analysis of the effect of different antibody structure formats on the binding of antibodies to TRBC2 using surface plasmon resonance (SPR).

Эффект мультимеризации связывающих молекул к TRBC2 анализировали способом SPR. Для этого использовали антитела к TRBC2 с мутациями T28K, Y32F, A100N, Y102L и N103M в домене VH и мутацией N35R в домене VL антитела hJovi-1, имеющие три различных формата, а именно scFv (SEQ ID: 22), scFv-Fc (SEQ ID: 23) и scFv-COMP (SEQ ID: 24).The multimerization effect of TRBC2 binding molecules was analyzed by the SPR method. For this purpose, anti-TRBC2 antibodies with T28K, Y32F, A100N, Y102L, and N103M mutations in the VH domain and N35R mutation in the VL domain of the hJovi-1 antibody were used, which had three different formats, namely scFv (SEQ ID: 22), scFv-Fc (SEQ ID: 23), and scFv-COMP (SEQ ID: 24).

SEQ ID: 22SEQ ID: 22

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTGFVMHWVRQAPGQGLEWMGFINPYNDDIQSNERFRGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGNGLMFDGAYRFFDFWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQRLVHSNGRTYLHWYLQKPGQSPRLLIYRVSNRFPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPYTFGQGTKLEIKRQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTGFVMHWVRQAPGQGLEWMGFINPYNDDIQSNERFRGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGNGLMFDGAYRFFDFWGQGTMVTVSSGG GGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQRLVHSNGRTYLHWYLQKPGQSPRLLIYRVSNRFPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPYTFGQGTKLEIKR

SEQ ID: 23SEQ ID: 23

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTGFVMHWVRQAPGQGLEWMGFINPYNDDIQSNERFRGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGNGLMFDGAYRFFDFWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQRLVHSNGRTYLHWYLQKPGQSPRLLIYRVSNRFPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPYTFGQGTKLEIKRSDPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGKQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTGFVMHWVRQAPGQGLEWMGFINPYNDDIQSNERFRGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGNGLMFDGAYRFFDFWGQGTMVT VSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQRLVHSNGRTYLHWYLQKPGQSPRLLIYRVSNRFPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPYTFG QGTKLEIKRSDPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNN KDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK

SEQ ID: 24SEQ ID: 24

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTGFVMHWVRQAPGQGLEWMGFINPYNDDIQSNERFRGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGNGLMFDGAYRFFDFWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQRLVHSNGRTYLHWYLQKPGQSPRLLIYRVSNRFPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPYTFGQGTKLEIKRSGGGGSGGGGSGGGGSAGSDLGPQMLRELQETNAALQDVRELLRQQVREITFLKNTVMECDACGSGKKDPKSGGGGSYPYDVPDYAQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTGFVMHWVRQAPGQGLEWMGFINPYNDDIQSNERFRGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGNGLMFDGAYRFFDFWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQRLV HSNGRTYLHWYLQKPGQSPRLLIYRVSNRFPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPYTFGQGTKLEIKRSGGGGSGGGGSGGGGSAGSDLGPQMLRELQETNAALQDVRELLRQQVREITFLKNTVMECDACGSGKKDPKSGGGGSYPYDVPDYA

Для изучения взаимодействия связывания 1:1 scFv к TRBC2, сенсорный чип серии S CM5 иммобилизовали посредством аминового связывания с антителом для захвата к Fc человека до плотности 9000-10000 ЕО при помощи прибора Biacore T200. В качестве рабочего буфера во всех условиях эксперимента использовали буфер HBS-P+. Исследуемое антитело к TRBC2 было захвачено в потоке 4 до плотности 200-250 ЕО. Рекомбинантный очищенный TRBC1 или TRBC2 в известных концентрациях использовали в качестве «исследуемого вещества» и вводили через соответствующие проточные кюветы при времени контакта 150 с и диссоциации в течение 300 с при скорости потока 30 мкл/мин. Проточную кювету 1 не подвергали модификации и использовали для вычитания эталонных значений. Сенсограмму «0 концентраций» только буфера использовали в качестве двойного вычитания эталонных значений к коэффициенту отклонения. Данные соответствовали модели связывания Ленгмюра 1:1. Поскольку использовали захватывающее устройство, для подбора данных в каждом случае использовали локальный параметр Rmax. Определяли скорость диссоциации и рассчитывали период полужизни по формуле: t½=ln2/kd. To study the 1:1 binding interaction of scFv to TRBC2, the S-series CM5 sensor chip was immobilized via amine coupling with anti-human Fc capture antibody to a density of 9000-10000 EU using a Biacore T200 instrument. HBS-P+ buffer was used as the running buffer under all experimental conditions. The anti-TRBC2 antibody of interest was captured in flow 4 to a density of 200-250 EU. Recombinant purified TRBC1 or TRBC2 at known concentrations was used as the “test substance” and was injected through the respective flow cells with a contact time of 150 s and a dissociation time of 300 s at a flow rate of 30 μL/min. Flow cell 1 was unmodified and was used for subtraction of reference values. The 0 concentration sensogram of buffer only was used as a double subtraction of the reference values to the coefficient of deviation. The data were fit to the 1:1 Langmuir binding model. Since a capture device was used, the local parameter R max was used to fit the data in each case. The dissociation rate was determined and the half-life was calculated using the formula: t½=ln2/kd.

Результаты, показанные на Фиг. 9A, продемонстрировали, что данная связывающая молекула scFv к TRBC2 имеет период полужизни 8 с. Аффинность связывания данной связывающей молекулы приведена в Таблице 1. The results shown in Fig. 9A demonstrated that this scFv binding molecule to TRBC2 has a half-life of 8 s. The binding affinity of this binding molecule is shown in Table 1.

Для изучения поливалентного взаимодействия форматов антител scFv-Fc и scFv-COMP чип серии S CAP иммобилизовали захватывающим биотин реагентом до плотности 2500-5000 ЕО. Растворимые рекомбинантные биотинилированные TRBC1 и TRBC2 улавливали на проточных кюветах 3 в независимых экспериментальных циклах до плотности 90-110 ЕО. Очищенные антитела scFv-Fc или scFv-COMP к TRBC2 вводили в проточную кювету со временем контакта 150 с и диссоциацией в течение 300 с при скорости потока 30 мкл/мин. Биотинилированный белок в проточной кювете 1 не учитывали и использовали для вычитания эталонных значений. Сенсограмму «0 концентраций» только буфера использовалаи в качестве двойного вычитания эталонных значений к коэффициенту отклонения. Данные соответствовали модели связывания Ленгмюра 1:1. Поскольку использовалои захватывающее устройство, для подбора данных в каждом случае использовали локальный параметр Rmax. Определяли скорость диссоциации и рассчитывали период полужизни по формуле: t½=ln2/kd.To study the polyvalent interactions of the scFv-Fc and scFv-COMP antibody formats, the S-series CAP chip was immobilized with biotin capture reagent to a density of 2500-5000 EU. Soluble recombinant biotinylated TRBC1 and TRBC2 were captured on flow cells 3 in independent experimental runs to a density of 90-110 EU. Purified scFv-Fc or scFv-COMP anti-TRBC2 antibodies were injected into the flow cell with a contact time of 150 s and dissociation for 300 s at a flow rate of 30 μl/min. Biotinylated protein in flow cell 1 was discarded and used for subtraction of reference values. The “0 concentration” sensogram of buffer only was used as a double subtraction of reference values to the bias coefficient. The data were fit to a 1:1 Langmuir binding model. Since a capture device was used, the local parameter R max was used to fit the data in each case. The dissociation rate was determined and the half-life was calculated using the formula: t½=ln2/kd.

Результаты, показанные на Фиг. 9B и 9C, продемонстрировали, что периоды полужизни антител формата scFv-Fc и scFv-COMP составляют 16,2 с и 7,3 мин соответственно.The results shown in Fig. 9B and 9C demonstrated that the half-lives of the scFv-Fc and scFv-COMP antibodies were 16.2 s and 7.3 min, respectively.

Таким образом, данные результаты демонстрируют, что мультимеризация улучшает связывание антител к TRBC2 с низкой аффинностью/высокой специфичностью.Thus, these results demonstrate that multimerization improves the binding of low affinity/high specificity TRBC2 antibodies.

Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании заявки Соединенного Королевства № 1817822.8, поданной 31 октября 2018 г. Данная заявка полностью включена в настоящую заявку посредством ссылки.This application claims priority from United Kingdom Application No. 1817822.8, filed October 31, 2018. This application is incorporated herein by reference in its entirety.

Все публикации, процитированные в приведенном выше описании, включены в настоящую заявку посредством ссылки. Различные модификации и варианты описанных способов и систем согласно настоящему изобретению будут понятны специалистам в данной области без отклонения от объема и сущности настоящего изобретения. Несмотря на то, что настоящее изобретение было описано в связи с конкретными предпочтительными вариантами реализации, следует понимать, что заявленное изобретение не должно быть чрезмерно ограничено данными конкретными вариантами реализации. Безусловно, предполагается, что различные модификации описанных вариантов реализации настоящего изобретения, которые являются понятными для специалистов в области молекулярной биологии или близких к ней областях, должны входить в объем нижеприведенной формулы изобретения.All publications cited in the above description are incorporated herein by reference. Various modifications and variations of the described methods and systems according to the present invention will be apparent to those skilled in the art without departing from the scope and spirit of the present invention. Although the present invention has been described in connection with specific preferred embodiments, it should be understood that the claimed invention should not be unduly limited to these specific embodiments. It is, of course, intended that various modifications of the described embodiments of the present invention that are apparent to those skilled in the art of molecular biology or related fields be included within the scope of the following claims.

--->--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙSEQUENCE LIST

<110> Autolus Limited<110> Autolus Limited

<120> Связывающий домен<120> Binding domain

<130> P116251PCT<130> P116251PCT

<150> GB 1817822.8<150>GB 1817822.8

<151> 2018-10-31<151> 2018-10-31

<160> 36 <160> 36

<170> PatentIn версии 3.5<170> PatentIn version 3.5

<210> 1<210> 1

<211> 124<211> 124

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> VH (тяжелой цепи) домен hJOVI-1, гуманизированного<223> VH (heavy chain) domain of hJOVI-1, humanized

антитела JOVI-1 JOVI-1 antibodies

<400> 1<400> 1

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15 1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr

20 25 30 20 25 30

Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45 35 40 45

Gly Phe Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Asp Ile Gln Ser Asn Glu Arg Phe Gly Phe Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Asp Ile Gln Ser Asn Glu Arg Phe

50 55 60 50 55 60

Arg Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Arg Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95 85 90 95

Ala Arg Gly Ala Gly Tyr Asn Phe Asp Gly Ala Tyr Arg Phe Phe Asp Ala Arg Gly Ala Gly Tyr Asn Phe Asp Gly Ala Tyr Arg Phe Phe Asp

100 105 110 100 105 110

Phe Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Phe Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120 115 120

<210> 2<210> 2

<211> 112<211> 112

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> VL (легкой цепи) домен hJOVI-1, гуманизированного антитела JOVI-1 <223> VL (light chain) domain of hJOVI-1, humanized antibody JOVI-1

<400> 2<400> 2

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15 1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Arg Leu Val His Ser Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Arg Leu Val His Ser

20 25 30 20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45 35 40 45

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Pro Gly Val Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Pro Gly Val Pro

50 55 60 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80 65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser

85 90 95 85 90 95

Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110 100 105 110

<210> 3<210> 3

<211> 21<211> 21

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> сигнальный пептид<223> signal peptide

<400> 3<400> 3

Met Gly Thr Ser Leu Leu Cys Trp Met Ala Leu Cys Leu Leu Gly Ala Met Gly Thr Ser Leu Leu Cys Trp Met Ala Leu Cys Leu Leu Gly Ala

1 5 10 15 1 5 10 15

Asp His Ala Asp Gly Asp His Ala Asp Gly

20 20

<210> 4<210> 4

<211> 21<211> 21

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> сигнальный пептид, происходящий из IgG1<223> signal peptide derived from IgG1

<400> 4<400> 4

Met Ser Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu Met Ser Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15 1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro His Ala Ala Arg Pro

20 20

<210> 5<210> 5

<211> 20<211> 20

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> сигнальный пептид, происходящий из CD8<223> CD8-derived signal peptide

<400> 5<400> 5

Met Ala Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr Met Ala Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr

1 5 10 15 1 5 10 15

Asp Ala Arg Cys Asp Ala Arg Cys

20 20

<210> 6<210> 6

<211> 234<211> 234

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> последовательность спейсера, шарнир-CH2CH3 IgG1 человека<223> spacer sequence, hinge-CH2CH3 of human IgG1

<400> 6<400> 6

Ala Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10 15 1 5 10 15

Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30 20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Lys Asp Thr Leu Met Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35 40 45 35 40 45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

50 55 60 50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

65 70 75 80 65 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

85 90 95 85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

100 105 110 100 105 110

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

115 120 125 115 120 125

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

130 135 140 130 135 140

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145 150 155 160 145 150 155 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

165 170 175 165 170 175

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

180 185 190 180 185 190

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

195 200 205 195 200 205

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

210 215 220 210 215 220

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Lys Asp Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Lys Asp

225 230 225 230

<210> 7<210> 7

<211> 46<211> 46

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> последовательность спейсера, стебель CD8 человека<223> spacer sequence, human CD8 stalk

<400> 7<400> 7

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15 1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30 20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile

35 40 45 35 40 45

<210> 8<210> 8

<211> 20<211> 20

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> последовательность спейсера, шарнир IgG1 человека<223> spacer sequence, hinge of human IgG1

<400> 8<400> 8

Ala Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10 15 1 5 10 15

Lys Asp Pro Lys Lys Asp Pro Lys

20 20

<210> 9<210> 9

<211> 185<211> 185

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> последовательность спейсера, эктодомен CD2 <223> spacer sequence, CD2 ectodomain

<400> 9<400> 9

Lys Glu Ile Thr Asn Ala Leu Glu Thr Trp Gly Ala Leu Gly Gln Asp Lys Glu Ile Thr Asn Ala Leu Glu Thr Trp Gly Ala Leu Gly Gln Asp

1 5 10 15 1 5 10 15

Ile Asn Leu Asp Ile Pro Ser Phe Gln Met Ser Asp Asp Ile Asp Asp Ile Asn Leu Asp Ile Pro Ser Phe Gln Met Ser Asp Asp Ile Asp Asp

20 25 30 20 25 30

Ile Lys Trp Glu Lys Thr Ser Asp Lys Lys Lys Ile Ala Gln Phe Arg Ile Lys Trp Glu Lys Thr Ser Asp Lys Lys Lys Ile Ala Gln Phe Arg

35 40 45 35 40 45

Lys Glu Lys Glu Thr Phe Lys Glu Lys Asp Thr Tyr Lys Leu Phe Lys Lys Glu Lys Glu Thr Phe Lys Glu Lys Asp Thr Tyr Lys Leu Phe Lys

50 55 60 50 55 60

Asn Gly Thr Leu Lys Ile Lys His Leu Lys Thr Asp Asp Gln Asp Ile Asn Gly Thr Leu Lys Ile Lys His Leu Lys Thr Asp Asp Gln Asp Ile

65 70 75 80 65 70 75 80

Tyr Lys Val Ser Ile Tyr Asp Thr Lys Gly Lys Asn Val Leu Glu Lys Tyr Lys Val Ser Ile Tyr Asp Thr Lys Gly Lys Asn Val Leu Glu Lys

85 90 95 85 90 95

Ile Phe Asp Leu Lys Ile Gln Glu Arg Val Ser Lys Pro Lys Ile Ser Ile Phe Asp Leu Lys Ile Gln Glu Arg Val Ser Lys Pro Lys Ile Ser

100 105 110 100 105 110

Trp Thr Cys Ile Asn Thr Thr Leu Thr Cys Glu Val Met Asn Gly Thr Trp Thr Cys Ile Asn Thr Thr Leu Thr Cys Glu Val Met Asn Gly Thr

115 120 125 115 120 125

Asp Pro Glu Leu Asn Leu Tyr Gln Asp Gly Lys His Leu Lys Leu Ser Asp Pro Glu Leu Asn Leu Tyr Gln Asp Gly Lys His Leu Lys Leu Ser

130 135 140 130 135 140

Gln Arg Val Ile Thr His Lys Trp Thr Thr Ser Leu Ser Ala Lys Phe Gln Arg Val Ile Thr His Lys Trp Thr Thr Ser Leu Ser Ala Lys Phe

145 150 155 160 145 150 155 160

Lys Cys Thr Ala Gly Asn Lys Val Ser Lys Glu Ser Ser Val Glu Pro Lys Cys Thr Ala Gly Asn Lys Val Ser Lys Glu Ser Ser Val Glu Pro

165 170 175 165 170 175

Val Ser Cys Pro Glu Lys Gly Leu Asp Val Ser Cys Pro Glu Lys Gly Leu Asp

180 185 180 185

<210> 10<210> 10

<211> 259<211> 259

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> последовательность спейсера, эктодомен CD34<223> spacer sequence, ectodomain of CD34

<400> 10<400> 10

Ser Leu Asp Asn Asn Gly Thr Ala Thr Pro Glu Leu Pro Thr Gln Gly Ser Leu Asp Asn Asn Gly Thr Ala Thr Pro Glu Leu Pro Thr Gln Gly

1 5 10 15 1 5 10 15

Thr Phe Ser Asn Val Ser Thr Asn Val Ser Tyr Gln Glu Thr Thr Thr Thr Phe Ser Asn Val Ser Thr Asn Val Ser Tyr Gln Glu Thr Thr Thr

20 25 30 20 25 30

Pro Ser Thr Leu Gly Ser Thr Ser Leu His Pro Val Ser Gln His Gly Pro Ser Thr Leu Gly Ser Thr Ser Leu His Pro Val Ser Gln His Gly

35 40 45 35 40 45

Asn Glu Ala Thr Thr Asn Ile Thr Glu Thr Thr Val Lys Phe Thr Ser Asn Glu Ala Thr Thr Asn Ile Thr Glu Thr Thr Val Lys Phe Thr Ser

50 55 60 50 55 60

Thr Ser Val Ile Thr Ser Val Tyr Gly Asn Thr Asn Ser Ser Val Gln Thr Ser Val Ile Thr Ser Val Tyr Gly Asn Thr Asn Ser Ser Val Gln

65 70 75 80 65 70 75 80

Ser Gln Thr Ser Val Ile Ser Thr Val Phe Thr Thr Pro Ala Asn Val Ser Gln Thr Ser Val Ile Ser Thr Val Phe Thr Thr Pro Ala Asn Val

85 90 95 85 90 95

Ser Thr Pro Glu Thr Thr Leu Lys Pro Ser Leu Ser Pro Gly Asn Val Ser Thr Pro Glu Thr Thr Leu Lys Pro Ser Leu Ser Pro Gly Asn Val

100 105 110 100 105 110

Ser Asp Leu Ser Thr Thr Ser Thr Ser Leu Ala Thr Ser Pro Thr Lys Ser Asp Leu Ser Thr Thr Ser Thr Ser Leu Ala Thr Ser Pro Thr Lys

115 120 125 115 120 125

Pro Tyr Thr Ser Ser Ser Pro Ile Leu Ser Asp Ile Lys Ala Glu Ile Pro Tyr Thr Ser Ser Ser Pro Ile Leu Ser Asp Ile Lys Ala Glu Ile

130 135 140 130 135 140

Lys Cys Ser Gly Ile Arg Glu Val Lys Leu Thr Gln Gly Ile Cys Leu Lys Cys Ser Gly Ile Arg Glu Val Lys Leu Thr Gln Gly Ile Cys Leu

145 150 155 160 145 150 155 160

Glu Gln Asn Lys Thr Ser Ser Cys Ala Glu Phe Lys Lys Asp Arg Gly Glu Gln Asn Lys Thr Ser Ser Cys Ala Glu Phe Lys Lys Asp Arg Gly

165 170 175 165 170 175

Glu Gly Leu Ala Arg Val Leu Cys Gly Glu Glu Gln Ala Asp Ala Asp Glu Gly Leu Ala Arg Val Leu Cys Gly Glu Glu Gln Ala Asp Ala Asp

180 185 190 180 185 190

Ala Gly Ala Gln Val Cys Ser Leu Leu Leu Ala Gln Ser Glu Val Arg Ala Gly Ala Gln Val Cys Ser Leu Leu Leu Ala Gln Ser Glu Val Arg

195 200 205 195 200 205

Pro Gln Cys Leu Leu Leu Val Leu Ala Asn Arg Thr Glu Ile Ser Ser Pro Gln Cys Leu Leu Leu Val Leu Ala Asn Arg Thr Glu Ile Ser Ser

210 215 220 210 215 220

Lys Leu Gln Leu Met Lys Lys His Gln Ser Asp Leu Lys Lys Leu Gly Lys Leu Gln Leu Met Lys Lys His Gln Ser Asp Leu Lys Lys Leu Gly

225 230 235 240 225 230 235 240

Ile Leu Asp Phe Thr Glu Gln Asp Val Ala Ser His Gln Ser Tyr Ser Ile Leu Asp Phe Thr Glu Gln Asp Val Ala Ser His Gln Ser Tyr Ser

245 250 255 245 250 255

Gln Lys Thr Glyc Lys Thr

<210> 11<210> 11

<211> 21<211> 21

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> трансмембранный домен CD8a <223> CD8a transmembrane domain

<400> 11<400> 11

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

1 5 10 15 1 5 10 15

Ser Leu Val Ile Thr Ser Leu Val Ile Thr

20 20

<210> 12<210> 12

<211> 24<211> 24

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> трансмембранный домен TYRP-1 <223> TYRP-1 transmembrane domain

<400> 12<400> 12

Ile Ile Ala Ile Ala Val Val Gly Ala Leu Leu Leu Val Ala Leu Ile Ile Ile Ala Ile Ala Val Val Gly Ala Leu Leu Leu Val Ala Leu Ile

1 5 10 15 1 5 10 15

Phe Gly Thr Ala Ser Tyr Leu Ile Phe Gly Thr Ala Ser Tyr Leu Ile

20 20

<210> 13<210> 13

<211> 140<211> 140

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> последовательность, содержащая трансмембранный домен CD28<223> sequence containing the transmembrane domain of CD28

и эндодомен CD3zeta and endodomain CD3zeta

<400> 13<400> 13

Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu

1 5 10 15 1 5 10 15

Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Arg Val Lys Phe Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Arg Val Lys Phe

20 25 30 20 25 30

Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu

35 40 45 35 40 45

Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp

50 55 60 50 55 60

Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys

65 70 75 80 65 70 75 80

Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala

85 90 95 85 90 95

Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys

100 105 110 100 105 110

Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr

115 120 125 115 120 125

Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

130 135 140 130 135 140

<210> 14<210> 14

<211> 180<211> 180

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> последовательность, содержащая трансмембранный домен<223> transmembrane domain containing sequence

CD28 и эндодомены CD28 и CD3zeta CD28 and CD28 and CD3zeta endodomains

<400> 14<400> 14

Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu

1 5 10 15 1 5 10 15

Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser

20 25 30 20 25 30

Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly

35 40 45 35 40 45

Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala

50 55 60 50 55 60

Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala

65 70 75 80 65 70 75 80

Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg

85 90 95 85 90 95

Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu

100 105 110 100 105 110

Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn

115 120 125 115 120 125

Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met

130 135 140 130 135 140

Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly

145 150 155 160 145 150 155 160

Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala

165 170 175 165 170 175

Leu Pro Pro Arg Leu Pro Pro Arg

180 180

<210> 15<210> 15

<211> 216<211> 216

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> последовательность, содержащая трансмембранный домен CD28<223> sequence containing the transmembrane domain of CD28

и эндодомены CD28, OX40 и CD3zeta and endodomains of CD28, OX40 and CD3zeta

<400> 15<400> 15

Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu

1 5 10 15 1 5 10 15

Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser

20 25 30 20 25 30

Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly

35 40 45 35 40 45

Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala

50 55 60 50 55 60

Ala Tyr Arg Ser Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Ala Tyr Arg Ser Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro

65 70 75 80 65 70 75 80

Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp

85 90 95 85 90 95

Ala His Ser Thr Leu Ala Lys Ile Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Ala His Ser Thr Leu Ala Lys Ile Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala

100 105 110 100 105 110

Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu

115 120 125 115 120 125

Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly

130 135 140 130 135 140

Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu

145 150 155 160 145 150 155 160

Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser

165 170 175 165 170 175

Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly

180 185 190 180 185 190

Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu

195 200 205 195 200 205

His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

210 215 210 215

<210> 16<210> 16

<211> 136<211> 136

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> последовательность, содержащая трансмембранный домен CD8a<223> CD8a transmembrane domain containing sequence

и эндодомен CD3zeta and endodomain CD3zeta

<400> 16<400> 16

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

1 5 10 15 1 5 10 15

Ser Leu Val Ile Thr Arg Val Leu Tyr Cys Lys Phe Ser Arg Ser Ala Ser Leu Val Ile Thr Arg Val Leu Tyr Cys Lys Phe Ser Arg Ser Ala

20 25 30 20 25 30

Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu

35 40 45 35 40 45

Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly

50 55 60 50 55 60

Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu

65 70 75 80 65 70 75 80

Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser

85 90 95 85 90 95

Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly

100 105 110 100 105 110

Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu

115 120 125 115 120 125

His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

130 135 130 135

<210> 17<210> 17

<211> 178<211> 178

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> последовательность, содержащая трансмембранный домен CD8a<223> CD8a transmembrane domain containing sequence

и эндодомен 4-1BB и CD3zetaand endodomain 4-1BB and CD3zeta

<400> 17<400> 17

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

1 5 10 15 1 5 10 15

Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu

20 25 30 20 25 30

Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu

35 40 45 35 40 45

Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys

50 55 60 50 55 60

Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln

65 70 75 80 65 70 75 80

Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu

85 90 95 85 90 95

Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly

100 105 110 100 105 110

Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu

115 120 125 115 120 125

Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly

130 135 140 130 135 140

Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser

145 150 155 160 145 150 155 160

Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro

165 170 175 165 170 175

Pro Arg Pro Arg

<210> 18<210> 18

<211> 178<211> 178

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> последовательность, содержащая трансмембранный<223> sequence containing transmembrane

домен TYRP-1 и эндодомены 4-1BB и CD3zeta TYRP-1 domain and 4-1BB and CD3zeta endodomains

<400> 18<400> 18

Ile Ile Ala Ile Ala Val Val Gly Ala Leu Leu Leu Val Ala Leu Ile Ile Ile Ala Ile Ala Val Val Gly Ala Leu Leu Leu Val Ala Leu Ile

1 5 10 15 1 5 10 15

Phe Gly Thr Ala Ser Tyr Leu Ile Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Phe Gly Thr Ala Ser Tyr Leu Ile Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu

20 25 30 20 25 30

Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu

35 40 45 35 40 45

Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys

50 55 60 50 55 60

Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln

65 70 75 80 65 70 75 80

Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu

85 90 95 85 90 95

Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly

100 105 110 100 105 110

Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu

115 120 125 115 120 125

Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly

130 135 140 130 135 140

Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser

145 150 155 160 145 150 155 160

Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro

165 170 175 165 170 175

Pro Arg Pro Arg

<210> 19<210> 19

<211> 45<211> 45

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> последовательность спейсера, COMP<223> spacer sequence, COMP

<400> 19<400> 19

Asp Leu Gly Pro Gln Met Leu Arg Glu Leu Gln Glu Thr Asn Ala Ala Asp Leu Gly Pro Gln Met Leu Arg Glu Leu Gln Glu Thr Asn Ala Ala

1 5 10 15 1 5 10 15

Leu Gln Asp Val Arg Glu Leu Leu Arg Gln Gln Val Arg Glu Ile Thr Leu Gln Asp Val Arg Glu Leu Leu Arg Gln Gln Val Arg Glu Ile Thr

20 25 30 20 25 30

Phe Leu Lys Asn Thr Val Met Glu Cys Asp Ala Cys Gly Phe Leu Lys Asn Thr Val Met Glu Cys Asp Ala Cys Gly

35 40 45 35 40 45

<210> 20<210> 20

<211> 5<211> 5

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> укороченный COMP, 5 C-концевых ак<223> truncated COMP, 5 C-terminal aa

<400> 20<400> 20

Cys Asp Ala Cys Gly Cys Asp Ala Cys Gly

1 5 1 5

<210> 21<210> 21

<211> 20<211> 20

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> укороченный COMP, 20 C-концевых ак<223> truncated COMP, 20 C-terminal aa

<400> 21<400> 21

Gln Gln Val Arg Glu Ile Thr Phe Leu Lys Asn Thr Val Met Glu Cys Gln Gln Val Arg Glu Ile Thr Phe Leu Lys Asn Thr Val Met Glu Cys

1 5 10 15 1 5 10 15

Asp Ala Cys Gly Asp Ala Cys Gly

20 20

<210> 22<210> 22

<211> 252<211> 252

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> одноцепочечный вариабельный фрагмент, scFv<223> single chain variable fragment, scFv

<400> 22<400> 22

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15 1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Gly Phe Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Gly Phe

20 25 30 20 25 30

Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45 35 40 45

Gly Phe Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Asp Ile Gln Ser Asn Glu Arg Phe Gly Phe Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Asp Ile Gln Ser Asn Glu Arg Phe

50 55 60 50 55 60

Arg Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Arg Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95 85 90 95

Ala Arg Gly Asn Gly Leu Met Phe Asp Gly Ala Tyr Arg Phe Phe Asp Ala Arg Gly Asn Gly Leu Met Phe Asp Gly Ala Tyr Arg Phe Phe Asp

100 105 110 100 105 110

Phe Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Phe Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125 115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr

130 135 140 130 135 140

Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile

145 150 155 160 145 150 155 160

Ser Cys Arg Ser Ser Gln Arg Leu Val His Ser Asn Gly Arg Thr Tyr Ser Cys Arg Ser Ser Gln Arg Leu Val His Ser Asn Gly Arg Thr Tyr

165 170 175 165 170 175

Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile

180 185 190 180 185 190

Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Pro Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Pro Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

195 200 205 195 200 205

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala

210 215 220 210 215 220

Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr

225 230 235 240 225 230 235 240

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

245 250 245 250

<210> 23<210> 23

<211> 486<211> 486

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> scFv-Fc<223> scFv-Fc

<400> 23<400> 23

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15 1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Gly Phe Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Gly Phe

20 25 30 20 25 30

Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45 35 40 45

Gly Phe Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Asp Ile Gln Ser Asn Glu Arg Phe Gly Phe Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Asp Ile Gln Ser Asn Glu Arg Phe

50 55 60 50 55 60

Arg Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Arg Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95 85 90 95

Ala Arg Gly Asn Gly Leu Met Phe Asp Gly Ala Tyr Arg Phe Phe Asp Ala Arg Gly Asn Gly Leu Met Phe Asp Gly Ala Tyr Arg Phe Phe Asp

100 105 110 100 105 110

Phe Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Phe Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125 115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr

130 135 140 130 135 140

Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile

145 150 155 160 145 150 155 160

Ser Cys Arg Ser Ser Gln Arg Leu Val His Ser Asn Gly Arg Thr Tyr Ser Cys Arg Ser Ser Gln Arg Leu Val His Ser Asn Gly Arg Thr Tyr

165 170 175 165 170 175

Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile

180 185 190 180 185 190

Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Pro Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Pro Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

195 200 205 195 200 205

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala

210 215 220 210 215 220

Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr

225 230 235 240 225 230 235 240

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ser Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ser Asp Pro Arg

245 250 255 245 250 255

Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn

260 265 270 260 265 270

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp

275 280 285 275 280 285

Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp

290 295 300 290 295 300

Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn

305 310 315 320 305 310 315 320

Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn

325 330 335 325 330 335

Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp

340 345 350 340 345 350

Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro

355 360 365 355 360 365

Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala

370 375 380 370 375 380

Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys

385 390 395 400 385 390 395 400

Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile

405 410 415 405 410 415

Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn

420 425 430 420 425 430

Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys

435 440 445 435 440 445

Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys

450 455 460 450 455 460

Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe

465 470 475 480 465 470 475 480

Ser Arg Thr Pro Gly Lys Ser Arg Thr Pro Gly Lys

485 485

<210> 24<210> 24

<211> 338<211> 338

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> scFv-COMP<223> scFv-COMP

<400> 24<400> 24

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15 1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Gly Phe Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Gly Phe

20 25 30 20 25 30

Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45 35 40 45

Gly Phe Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Asp Ile Gln Ser Asn Glu Arg Phe Gly Phe Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Asp Ile Gln Ser Asn Glu Arg Phe

50 55 60 50 55 60

Arg Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Arg Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95 85 90 95

Ala Arg Gly Asn Gly Leu Met Phe Asp Gly Ala Tyr Arg Phe Phe Asp Ala Arg Gly Asn Gly Leu Met Phe Asp Gly Ala Tyr Arg Phe Phe Asp

100 105 110 100 105 110

Phe Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Phe Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125 115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr

130 135 140 130 135 140

Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile

145 150 155 160 145 150 155 160

Ser Cys Arg Ser Ser Gln Arg Leu Val His Ser Asn Gly Arg Thr Tyr Ser Cys Arg Ser Ser Gln Arg Leu Val His Ser Asn Gly Arg Thr Tyr

165 170 175 165 170 175

Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile

180 185 190 180 185 190

Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Pro Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Pro Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

195 200 205 195 200 205

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala

210 215 220 210 215 220

Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr

225 230 235 240 225 230 235 240

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ser Gly Gly Gly Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ser Gly Gly Gly

245 250 255 245 250 255

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Gly Ser Asp Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Gly Ser Asp

260 265 270 260 265 270

Leu Gly Pro Gln Met Leu Arg Glu Leu Gln Glu Thr Asn Ala Ala Leu Leu Gly Pro Gln Met Leu Arg Glu Leu Gln Glu Thr Asn Ala Ala Leu

275 280 285 275 280 285

Gln Asp Val Arg Glu Leu Leu Arg Gln Gln Val Arg Glu Ile Thr Phe Gln Asp Val Arg Glu Leu Leu Arg Gln Gln Val Arg Glu Ile Thr Phe

290 295 300 290 295 300

Leu Lys Asn Thr Val Met Glu Cys Asp Ala Cys Gly Ser Gly Lys Lys Leu Lys Asn Thr Val Met Glu Cys Asp Ala Cys Gly Ser Gly Lys Lys

305 310 315 320 305 310 315 320

Asp Pro Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Asp Pro Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp

325 330 335 325 330 335

Tyr Ala Tyr Ala

<210> 25<210> 25

<211> 454<211> 454

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> CAR, содержащий мутации T28K, Y32F, A100N в домене VH,<223> CAR containing the T28K, Y32F, A100N mutations in the VH domain,

мутацию N35K в VL domain, спейсер-шарнир IgG1, трансмембранныйN35K mutation in VL domain, IgG1 spacer-hinge, transmembrane

домен TYRP-1 , и эндодомены 4-1BB и CD3zetaTYRP-1 domain, and 4-1BB and CD3zeta endodomains

<400> 25<400> 25

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15 1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Gly Phe Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Gly Phe

20 25 30 20 25 30

Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45 35 40 45

Gly Phe Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Asp Ile Gln Ser Asn Glu Arg Phe Gly Phe Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Asp Ile Gln Ser Asn Glu Arg Phe

50 55 60 50 55 60

Arg Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Arg Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95 85 90 95

Ala Arg Gly Asn Gly Tyr Asn Phe Asp Gly Ala Tyr Arg Phe Phe Asp Ala Arg Gly Asn Gly Tyr Asn Phe Asp Gly Ala Tyr Arg Phe Phe Asp

100 105 110 100 105 110

Phe Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Phe Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125 115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr

130 135 140 130 135 140

Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile

145 150 155 160 145 150 155 160

Ser Cys Arg Ser Ser Gln Arg Leu Val His Ser Asn Gly Lys Thr Tyr Ser Cys Arg Ser Ser Gln Arg Leu Val His Ser Asn Gly Lys Thr Tyr

165 170 175 165 170 175

Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile

180 185 190 180 185 190

Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Pro Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Pro Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

195 200 205 195 200 205

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala

210 215 220 210 215 220

Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr

225 230 235 240 225 230 235 240

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ser Asp Pro Ala Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ser Asp Pro Ala

245 250 255 245 250 255

Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Lys Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Lys

260 265 270 260 265 270

Asp Pro Lys Ile Ile Ala Ile Ala Val Val Gly Ala Leu Leu Leu Val Asp Pro Lys Ile Ile Ala Ile Ala Val Val Gly Ala Leu Leu Leu Val

275 280 285 275 280 285

Ala Leu Ile Phe Gly Thr Ala Ser Tyr Leu Ile Lys Arg Gly Arg Lys Ala Leu Ile Phe Gly Thr Ala Ser Tyr Leu Ile Lys Arg Gly Arg Lys

290 295 300 290 295 300

Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr

305 310 315 320 305 310 315 320

Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu

325 330 335 325 330 335

Gly Gly Cys Glu Leu Arg Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Gly Gly Cys Glu Leu Arg Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala

340 345 350 340 345 350

Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu

355 360 365 355 360 365

Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp

370 375 380 370 375 380

Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu

385 390 395 400 385 390 395 400

Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile

405 410 415 405 410 415

Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr

420 425 430 420 425 430

Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met

435 440 445 435 440 445

Gln Ala Leu Pro Pro Arg Gln Ala Leu Pro Pro Arg

450 450

<210> 26<210> 26

<211> 454<211> 454

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> CAR, содержащий мутации T28K, Y32F, A100N в домене VH,<223> CAR containing the T28K, Y32F, A100N mutations in the VH domain,

спейсер-шарнир IgG1, трансмембранный домен TYRP-1, и IgG1 hinge spacer, TYRP-1 transmembrane domain, and

эндодомены 4-1BB и CD3zeta endodomains 4-1BB and CD3zeta

<400> 26<400> 26

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15 1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Gly Phe Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Gly Phe

20 25 30 20 25 30

Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45 35 40 45

Gly Phe Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Asp Ile Gln Ser Asn Glu Arg Phe Gly Phe Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Asp Ile Gln Ser Asn Glu Arg Phe

50 55 60 50 55 60

Arg Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Arg Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95 85 90 95

Ala Arg Gly Asn Gly Tyr Asn Phe Asp Gly Ala Tyr Arg Phe Phe Asp Ala Arg Gly Asn Gly Tyr Asn Phe Asp Gly Ala Tyr Arg Phe Phe Asp

100 105 110 100 105 110

Phe Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Phe Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125 115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr

130 135 140 130 135 140

Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile

145 150 155 160 145 150 155 160

Ser Cys Arg Ser Ser Gln Arg Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Ser Cys Arg Ser Ser Gln Arg Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr

165 170 175 165 170 175

Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile

180 185 190 180 185 190

Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Pro Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Pro Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

195 200 205 195 200 205

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala

210 215 220 210 215 220

Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr

225 230 235 240 225 230 235 240

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ser Asp Pro Ala Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ser Asp Pro Ala

245 250 255 245 250 255

Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Lys Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Lys

260 265 270 260 265 270

Asp Pro Lys Ile Ile Ala Ile Ala Val Val Gly Ala Leu Leu Leu Val Asp Pro Lys Ile Ile Ala Ile Ala Val Val Gly Ala Leu Leu Leu Val

275 280 285 275 280 285

Ala Leu Ile Phe Gly Thr Ala Ser Tyr Leu Ile Lys Arg Gly Arg Lys Ala Leu Ile Phe Gly Thr Ala Ser Tyr Leu Ile Lys Arg Gly Arg Lys

290 295 300 290 295 300

Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr

305 310 315 320 305 310 315 320

Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu

325 330 335 325 330 335

Gly Gly Cys Glu Leu Arg Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Gly Gly Cys Glu Leu Arg Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala

340 345 350 340 345 350

Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu

355 360 365 355 360 365

Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp

370 375 380 370 375 380

Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu

385 390 395 400 385 390 395 400

Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile

405 410 415 405 410 415

Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr

420 425 430 420 425 430

Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met

435 440 445 435 440 445

Gln Ala Leu Pro Pro Arg Gln Ala Leu Pro Pro Arg

450 450

<210> 27<210> 27

<211> 454<211> 454

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> CAR, содержащий мутации T28K, Y32F, A100N, N103L в<223> CAR containing the mutations T28K, Y32F, A100N, N103L in

домене VH, спейсер-шарнир IgG1, трансмембранный домен TYRP-1,VH domain, IgG1 spacer-hinge, TYRP-1 transmembrane domain,

и эндодомены 4-1BB и CD3zetaand endodomains 4-1BB and CD3zeta

<400> 27<400> 27

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15 1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Gly Phe Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Gly Phe

20 25 30 20 25 30

Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45 35 40 45

Gly Phe Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Asp Ile Gln Ser Asn Glu Arg Phe Gly Phe Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Asp Ile Gln Ser Asn Glu Arg Phe

50 55 60 50 55 60

Arg Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Arg Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95 85 90 95

Ala Arg Gly Asn Gly Tyr Leu Phe Asp Gly Ala Tyr Arg Phe Phe Asp Ala Arg Gly Asn Gly Tyr Leu Phe Asp Gly Ala Tyr Arg Phe Phe Asp

100 105 110 100 105 110

Phe Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Phe Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125 115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr

130 135 140 130 135 140

Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile

145 150 155 160 145 150 155 160

Ser Cys Arg Ser Ser Gln Arg Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Ser Cys Arg Ser Ser Gln Arg Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr

165 170 175 165 170 175

Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile

180 185 190 180 185 190

Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Pro Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Pro Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

195 200 205 195 200 205

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala

210 215 220 210 215 220

Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr

225 230 235 240 225 230 235 240

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ser Asp Pro Ala Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ser Asp Pro Ala

245 250 255 245 250 255

Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Lys Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Lys

260 265 270 260 265 270

Asp Pro Lys Ile Ile Ala Ile Ala Val Val Gly Ala Leu Leu Leu Val Asp Pro Lys Ile Ile Ala Ile Ala Val Val Gly Ala Leu Leu Leu Val

275 280 285 275 280 285

Ala Leu Ile Phe Gly Thr Ala Ser Tyr Leu Ile Lys Arg Gly Arg Lys Ala Leu Ile Phe Gly Thr Ala Ser Tyr Leu Ile Lys Arg Gly Arg Lys

290 295 300 290 295 300

Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr

305 310 315 320 305 310 315 320

Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu

325 330 335 325 330 335

Gly Gly Cys Glu Leu Arg Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Gly Gly Cys Glu Leu Arg Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala

340 345 350 340 345 350

Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu

355 360 365 355 360 365

Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp

370 375 380 370 375 380

Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu

385 390 395 400 385 390 395 400

Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile

405 410 415 405 410 415

Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr

420 425 430 420 425 430

Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met

435 440 445 435 440 445

Gln Ala Leu Pro Pro Arg Gln Ala Leu Pro Pro Arg

450 450

<210> 28<210> 28

<211> 454<211> 454

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> CAR, содержащий мутации T28K, Y32F, A100N, N103M в домене<223> CAR containing mutations T28K, Y32F, A100N, N103M in the domain

VH,мутацию N35Y в домене VL, спейсер-шарнир IgG1, трансмембранныйVH, N35Y mutation in VL domain, IgG1 spacer-hinge, transmembrane

домен TYRP-1, и эндодомены 4-1BB и CD3zeta TYRP-1 domain, and 4-1BB and CD3zeta endodomains

<400> 28<400> 28

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15 1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Gly Phe Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Gly Phe

20 25 30 20 25 30

Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45 35 40 45

Gly Phe Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Asp Ile Gln Ser Asn Glu Arg Phe Gly Phe Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Asp Ile Gln Ser Asn Glu Arg Phe

50 55 60 50 55 60

Arg Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Arg Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95 85 90 95

Ala Arg Gly Asn Gly Tyr Met Phe Asp Gly Ala Tyr Arg Phe Phe Asp Ala Arg Gly Asn Gly Tyr Met Phe Asp Gly Ala Tyr Arg Phe Phe Asp

100 105 110 100 105 110

Phe Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Phe Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125 115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr

130 135 140 130 135 140

Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile

145 150 155 160 145 150 155 160

Ser Cys Arg Ser Ser Gln Arg Leu Val His Ser Asn Gly Tyr Thr Tyr Ser Cys Arg Ser Ser Gln Arg Leu Val His Ser Asn Gly Tyr Thr Tyr

165 170 175 165 170 175

Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile

180 185 190 180 185 190

Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Pro Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Pro Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

195 200 205 195 200 205

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala

210 215 220 210 215 220

Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr

225 230 235 240 225 230 235 240

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ser Asp Pro Ala Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ser Asp Pro Ala

245 250 255 245 250 255

Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Lys Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Lys

260 265 270 260 265 270

Asp Pro Lys Ile Ile Ala Ile Ala Val Val Gly Ala Leu Leu Leu Val Asp Pro Lys Ile Ile Ala Ile Ala Val Val Gly Ala Leu Leu Leu Val

275 280 285 275 280 285

Ala Leu Ile Phe Gly Thr Ala Ser Tyr Leu Ile Lys Arg Gly Arg Lys Ala Leu Ile Phe Gly Thr Ala Ser Tyr Leu Ile Lys Arg Gly Arg Lys

290 295 300 290 295 300

Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr

305 310 315 320 305 310 315 320

Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu

325 330 335 325 330 335

Gly Gly Cys Glu Leu Arg Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Gly Gly Cys Glu Leu Arg Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala

340 345 350 340 345 350

Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu

355 360 365 355 360 365

Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp

370 375 380 370 375 380

Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu

385 390 395 400 385 390 395 400

Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile

405 410 415 405 410 415

Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr

420 425 430 420 425 430

Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met

435 440 445 435 440 445

Gln Ala Leu Pro Pro Arg Gln Ala Leu Pro Pro Arg

450 450

<210> 29<210> 29

<211> 454<211> 454

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> CAR, содержащий мутации T28K, Y32F, A100N, N103M в домене VH,<223> CAR containing the T28K, Y32F, A100N, N103M mutations in the VH domain,

мутацию N35R в домене VL, спейсер-шарнир IgG1, трансмембранныйN35R mutation in the VL domain, spacer-hinge IgG1, transmembrane

домен TYRP-1, и эндодомены 4-1BB и CD3zeta TYRP-1 domain, and 4-1BB and CD3zeta endodomains

<400> 29<400> 29

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15 1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Gly Phe Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Gly Phe

20 25 30 20 25 30

Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45 35 40 45

Gly Phe Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Asp Ile Gln Ser Asn Glu Arg Phe Gly Phe Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Asp Ile Gln Ser Asn Glu Arg Phe

50 55 60 50 55 60

Arg Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Arg Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95 85 90 95

Ala Arg Gly Asn Gly Phe Met Phe Asp Gly Ala Tyr Arg Phe Phe Asp Ala Arg Gly Asn Gly Phe Met Phe Asp Gly Ala Tyr Arg Phe Phe Asp

100 105 110 100 105 110

Phe Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Phe Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125 115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr

130 135 140 130 135 140

Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile

145 150 155 160 145 150 155 160

Ser Cys Arg Ser Ser Gln Arg Leu Val His Ser Asn Gly Arg Thr Tyr Ser Cys Arg Ser Ser Gln Arg Leu Val His Ser Asn Gly Arg Thr Tyr

165 170 175 165 170 175

Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile

180 185 190 180 185 190

Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Pro Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Pro Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

195 200 205 195 200 205

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala

210 215 220 210 215 220

Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr

225 230 235 240 225 230 235 240

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ser Asp Pro Ala Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ser Asp Pro Ala

245 250 255 245 250 255

Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Lys Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Lys

260 265 270 260 265 270

Asp Pro Lys Ile Ile Ala Ile Ala Val Val Gly Ala Leu Leu Leu Val Asp Pro Lys Ile Ile Ala Ile Ala Val Val Gly Ala Leu Leu Leu Val

275 280 285 275 280 285

Ala Leu Ile Phe Gly Thr Ala Ser Tyr Leu Ile Lys Arg Gly Arg Lys Ala Leu Ile Phe Gly Thr Ala Ser Tyr Leu Ile Lys Arg Gly Arg Lys

290 295 300 290 295 300

Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr

305 310 315 320 305 310 315 320

Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu

325 330 335 325 330 335

Gly Gly Cys Glu Leu Arg Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Gly Gly Cys Glu Leu Arg Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala

340 345 350 340 345 350

Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu

355 360 365 355 360 365

Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp

370 375 380 370 375 380

Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu

385 390 395 400 385 390 395 400

Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile

405 410 415 405 410 415

Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr

420 425 430 420 425 430

Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met

435 440 445 435 440 445

Gln Ala Leu Pro Pro Arg Gln Ala Leu Pro Pro Arg

450 450

<210> 30<210> 30

<211> 454<211> 454

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> CAR, содержащий мутации T28K, Y32F, A100N, Y102L, N103M<223> CAR containing mutations T28K, Y32F, A100N, Y102L, N103M

в домене VH, мутацию N35R в домене VL, спейсер-шарнирin the VH domain, the N35R mutation in the VL domain, the spacer-hinge

IgG1, трансмембранный домен TYRP-1, и эндодомены 4-1BB и CD3zeta IgG1, TYRP-1 transmembrane domain, and 4-1BB and CD3zeta endodomains

<400> 30<400> 30

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15 1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Gly Phe Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Gly Phe

20 25 30 20 25 30

Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45 35 40 45

Gly Phe Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Asp Ile Gln Ser Asn Glu Arg Phe Gly Phe Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Asp Ile Gln Ser Asn Glu Arg Phe

50 55 60 50 55 60

Arg Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Arg Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95 85 90 95

Ala Arg Gly Asn Gly Leu Met Phe Asp Gly Ala Tyr Arg Phe Phe Asp Ala Arg Gly Asn Gly Leu Met Phe Asp Gly Ala Tyr Arg Phe Phe Asp

100 105 110 100 105 110

Phe Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Phe Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125 115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr

130 135 140 130 135 140

Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile

145 150 155 160 145 150 155 160

Ser Cys Arg Ser Ser Gln Arg Leu Val His Ser Asn Gly Arg Thr Tyr Ser Cys Arg Ser Ser Gln Arg Leu Val His Ser Asn Gly Arg Thr Tyr

165 170 175 165 170 175

Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile

180 185 190 180 185 190

Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Pro Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Pro Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

195 200 205 195 200 205

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala

210 215 220 210 215 220

Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr

225 230 235 240 225 230 235 240

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ser Asp Pro Ala Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ser Asp Pro Ala

245 250 255 245 250 255

Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Lys Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Lys

260 265 270 260 265 270

Asp Pro Lys Ile Ile Ala Ile Ala Val Val Gly Ala Leu Leu Leu Val Asp Pro Lys Ile Ile Ala Ile Ala Val Val Gly Ala Leu Leu Leu Val

275 280 285 275 280 285

Ala Leu Ile Phe Gly Thr Ala Ser Tyr Leu Ile Lys Arg Gly Arg Lys Ala Leu Ile Phe Gly Thr Ala Ser Tyr Leu Ile Lys Arg Gly Arg Lys

290 295 300 290 295 300

Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr

305 310 315 320 305 310 315 320

Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu

325 330 335 325 330 335

Gly Gly Cys Glu Leu Arg Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Gly Gly Cys Glu Leu Arg Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala

340 345 350 340 345 350

Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu

355 360 365 355 360 365

Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp

370 375 380 370 375 380

Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu

385 390 395 400 385 390 395 400

Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile

405 410 415 405 410 415

Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr

420 425 430 420 425 430

Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met

435 440 445 435 440 445

Gln Ala Leu Pro Pro Arg Gln Ala Leu Pro Pro Arg

450 450

<210> 31<210> 31

<211> 480<211> 480

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> CAR, содержащий мутации T28K, Y32F, A100N в домене VH,<223> CAR containing the T28K, Y32F, A100N mutations in the VH domain,

спейсер-стебель CD8, трансмембранный домен TYRP-1, иCD8 stem spacer, TYRP-1 transmembrane domain, and

эндодомены 4-1BB и CD3zeta endodomains 4-1BB and CD3zeta

<400> 31<400> 31

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15 1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Gly Phe Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Gly Phe

20 25 30 20 25 30

Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45 35 40 45

Gly Phe Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Asp Ile Gln Ser Asn Glu Arg Phe Gly Phe Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Asp Ile Gln Ser Asn Glu Arg Phe

50 55 60 50 55 60

Arg Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Arg Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95 85 90 95

Ala Arg Gly Asn Gly Tyr Asn Phe Asp Gly Ala Tyr Arg Phe Phe Asp Ala Arg Gly Asn Gly Tyr Asn Phe Asp Gly Ala Tyr Arg Phe Phe Asp

100 105 110 100 105 110

Phe Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Phe Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125 115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr

130 135 140 130 135 140

Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile

145 150 155 160 145 150 155 160

Ser Cys Arg Ser Ser Gln Arg Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Ser Cys Arg Ser Ser Gln Arg Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr

165 170 175 165 170 175

Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile

180 185 190 180 185 190

Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Pro Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Pro Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

195 200 205 195 200 205

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala

210 215 220 210 215 220

Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr

225 230 235 240 225 230 235 240

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ser Asp Pro Thr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ser Asp Pro Thr

245 250 255 245 250 255

Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser

260 265 270 260 265 270

Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly

275 280 285 275 280 285

Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Ile Ile Ala Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Ile Ile Ala

290 295 300 290 295 300

Ile Ala Val Val Gly Ala Leu Leu Leu Val Ala Leu Ile Phe Gly Thr Ile Ala Val Val Gly Ala Leu Leu Leu Val Ala Leu Ile Phe Gly Thr

305 310 315 320 305 310 315 320

Ala Ser Tyr Leu Ile Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Ala Ser Tyr Leu Ile Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe

325 330 335 325 330 335

Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly

340 345 350 340 345 350

Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg

355 360 365 355 360 365

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

370 375 380 370 375 380

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

385 390 395 400 385 390 395 400

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

405 410 415 405 410 415

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

420 425 430 420 425 430

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

435 440 445 435 440 445

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

450 455 460 450 455 460

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

465 470 475 480 465 470 475 480

<210> 32<210> 32

<211> 479<211> 479

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> CAR, содержащий мутации T28K, Y32F, A100N в домене VH, <223> CAR containing the T28K, Y32F, A100N mutations in the VH domain,

спейсер-стебель CD8, трансмембранный домен TYRP-1, и эндодоменыCD8 stem spacer, TYRP-1 transmembrane domain, and endodomains

CD28 и CD3zeta CD28 and CD3zeta

<400> 32<400> 32

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15 1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Gly Phe Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Gly Phe

20 25 30 20 25 30

Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45 35 40 45

Gly Phe Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Asp Ile Gln Ser Asn Glu Arg Phe Gly Phe Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Asp Ile Gln Ser Asn Glu Arg Phe

50 55 60 50 55 60

Arg Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Arg Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95 85 90 95

Ala Arg Gly Asn Gly Tyr Asn Phe Asp Gly Ala Tyr Arg Phe Phe Asp Ala Arg Gly Asn Gly Tyr Asn Phe Asp Gly Ala Tyr Arg Phe Phe Asp

100 105 110 100 105 110

Phe Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Phe Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125 115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr

130 135 140 130 135 140

Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile

145 150 155 160 145 150 155 160

Ser Cys Arg Ser Ser Gln Arg Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Ser Cys Arg Ser Ser Gln Arg Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr

165 170 175 165 170 175

Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile

180 185 190 180 185 190

Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Pro Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Pro Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

195 200 205 195 200 205

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala

210 215 220 210 215 220

Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr

225 230 235 240 225 230 235 240

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ser Asp Pro Thr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ser Asp Pro Thr

245 250 255 245 250 255

Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser

260 265 270 260 265 270

Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly

275 280 285 275 280 285

Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Ile Ile Ala Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Ile Ile Ala

290 295 300 290 295 300

Ile Ala Val Val Gly Ala Leu Leu Leu Val Ala Leu Ile Phe Gly Thr Ile Ala Val Val Gly Ala Leu Leu Leu Val Ala Leu Ile Phe Gly Thr

305 310 315 320 305 310 315 320

Ala Ser Tyr Leu Ile Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Ala Ser Tyr Leu Ile Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp

325 330 335 325 330 335

Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr

340 345 350 340 345 350

Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Arg Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Arg

355 360 365 355 360 365

Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln

370 375 380 370 375 380

Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp

385 390 395 400 385 390 395 400

Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro

405 410 415 405 410 415

Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp

420 425 430 420 425 430

Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg

435 440 445 435 440 445

Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr

450 455 460 450 455 460

Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

465 470 475 465 470 475

<210> 33<210> 33

<211> 453<211> 453

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> CAR, содержащий мутации T28K, Y32F, A100N в домене VH, <223> CAR containing the T28K, Y32F, A100N mutations in the VH domain,

спейсер-шарнир IgG1, трансмембранный домен TYRP-1, и IgG1 hinge spacer, TYRP-1 transmembrane domain, and

эндодомены CD28 и CD3zeta endodomains of CD28 and CD3zeta

<400> 33<400> 33

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15 1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Gly Phe Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Gly Phe

20 25 30 20 25 30

Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45 35 40 45

Gly Phe Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Asp Ile Gln Ser Asn Glu Arg Phe Gly Phe Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Asp Ile Gln Ser Asn Glu Arg Phe

50 55 60 50 55 60

Arg Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Arg Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95 85 90 95

Ala Arg Gly Asn Gly Tyr Asn Phe Asp Gly Ala Tyr Arg Phe Phe Asp Ala Arg Gly Asn Gly Tyr Asn Phe Asp Gly Ala Tyr Arg Phe Phe Asp

100 105 110 100 105 110

Phe Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Phe Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125 115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr

130 135 140 130 135 140

Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile

145 150 155 160 145 150 155 160

Ser Cys Arg Ser Ser Gln Arg Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Ser Cys Arg Ser Ser Gln Arg Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr

165 170 175 165 170 175

Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile

180 185 190 180 185 190

Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Pro Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Pro Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

195 200 205 195 200 205

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala

210 215 220 210 215 220

Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr

225 230 235 240 225 230 235 240

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ser Asp Pro Ala Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ser Asp Pro Ala

245 250 255 245 250 255

Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Lys Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Lys

260 265 270 260 265 270

Asp Pro Lys Ile Ile Ala Ile Ala Val Val Gly Ala Leu Leu Leu Val Asp Pro Lys Ile Ile Ala Ile Ala Val Val Gly Ala Leu Leu Leu Val

275 280 285 275 280 285

Ala Leu Ile Phe Gly Thr Ala Ser Tyr Leu Ile Arg Ser Lys Arg Ser Ala Leu Ile Phe Gly Thr Ala Ser Tyr Leu Ile Arg Ser Lys Arg Ser

290 295 300 290 295 300

Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly

305 310 315 320 305 310 315 320

Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala

325 330 335 325 330 335

Ala Tyr Arg Ser Arg Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Arg Ser Arg Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro

340 345 350 340 345 350

Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly

355 360 365 355 360 365

Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro

370 375 380 370 375 380

Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr

385 390 395 400 385 390 395 400

Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly

405 410 415 405 410 415

Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln

420 425 430 420 425 430

Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln

435 440 445 435 440 445

Ala Leu Pro Pro Arg Ala Leu Pro Pro Arg

450 450

<210> 34<210> 34

<211> 453<211> 453

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> CAR, содержащий мутации T28K, Y32F, A100N в домене VH, мутацию N35K<223> CAR containing T28K, Y32F, A100N mutations in the VH domain, N35K mutation

в домене VL, спейсер-шарнир IgG1, трансмембранный доменin the VL domain, IgG1 spacer-hinge, transmembrane domain

TYRP-1, и эндодомены CD28 и CD3zeta TYRP-1, and CD28 and CD3zeta endodomains

<400> 34<400> 34

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15 1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Gly Phe Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Gly Phe

20 25 30 20 25 30

Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45 35 40 45

Gly Phe Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Asp Ile Gln Ser Asn Glu Arg Phe Gly Phe Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Asp Ile Gln Ser Asn Glu Arg Phe

50 55 60 50 55 60

Arg Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Arg Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95 85 90 95

Ala Arg Gly Asn Gly Tyr Asn Phe Asp Gly Ala Tyr Arg Phe Phe Asp Ala Arg Gly Asn Gly Tyr Asn Phe Asp Gly Ala Tyr Arg Phe Phe Asp

100 105 110 100 105 110

Phe Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Phe Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125 115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr

130 135 140 130 135 140

Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile

145 150 155 160 145 150 155 160

Ser Cys Arg Ser Ser Gln Arg Leu Val His Ser Asn Gly Lys Thr Tyr Ser Cys Arg Ser Ser Gln Arg Leu Val His Ser Asn Gly Lys Thr Tyr

165 170 175 165 170 175

Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile

180 185 190 180 185 190

Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Pro Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Pro Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

195 200 205 195 200 205

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala

210 215 220 210 215 220

Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr

225 230 235 240 225 230 235 240

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ser Asp Pro Ala Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ser Asp Pro Ala

245 250 255 245 250 255

Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Lys Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Lys

260 265 270 260 265 270

Asp Pro Lys Ile Ile Ala Ile Ala Val Val Gly Ala Leu Leu Leu Val Asp Pro Lys Ile Ile Ala Ile Ala Val Val Gly Ala Leu Leu Leu Val

275 280 285 275 280 285

Ala Leu Ile Phe Gly Thr Ala Ser Tyr Leu Ile Arg Ser Lys Arg Ser Ala Leu Ile Phe Gly Thr Ala Ser Tyr Leu Ile Arg Ser Lys Arg Ser

290 295 300 290 295 300

Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly

305 310 315 320 305 310 315 320

Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala

325 330 335 325 330 335

Ala Tyr Arg Ser Arg Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Arg Ser Arg Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro

340 345 350 340 345 350

Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly

355 360 365 355 360 365

Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro

370 375 380 370 375 380

Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr

385 390 395 400 385 390 395 400

Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly

405 410 415 405 410 415

Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln

420 425 430 420 425 430

Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln

435 440 445 435 440 445

Ala Leu Pro Pro Arg Ala Leu Pro Pro Arg

450 450

<210> 35<210> 35

<211> 480<211> 480

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> CAR, содержащий мутации T28K, Y32F, A100N в домене VH, <223> CAR containing the T28K, Y32F, A100N mutations in the VH domain,

мутацию N35K в домене VL, спейсер-стебель CD8, трансмембранный mutation N35K in the VL domain, CD8 stem spacer, transmembrane

домен TYRP-1, и эндодомены 4-1BB и CD3zetaTYRP-1 domain, and 4-1BB and CD3zeta endodomains

<400> 35<400> 35

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15 1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Gly Phe Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Gly Phe

20 25 30 20 25 30

Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45 35 40 45

Gly Phe Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Asp Ile Gln Ser Asn Glu Arg Phe Gly Phe Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Asp Ile Gln Ser Asn Glu Arg Phe

50 55 60 50 55 60

Arg Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Arg Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95 85 90 95

Ala Arg Gly Asn Gly Tyr Asn Phe Asp Gly Ala Tyr Arg Phe Phe Asp Ala Arg Gly Asn Gly Tyr Asn Phe Asp Gly Ala Tyr Arg Phe Phe Asp

100 105 110 100 105 110

Phe Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Phe Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125 115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr

130 135 140 130 135 140

Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile

145 150 155 160 145 150 155 160

Ser Cys Arg Ser Ser Gln Arg Leu Val His Ser Asn Gly Lys Thr Tyr Ser Cys Arg Ser Ser Gln Arg Leu Val His Ser Asn Gly Lys Thr Tyr

165 170 175 165 170 175

Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile

180 185 190 180 185 190

Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Pro Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Pro Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

195 200 205 195 200 205

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala

210 215 220 210 215 220

Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr

225 230 235 240 225 230 235 240

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ser Asp Pro Thr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ser Asp Pro Thr

245 250 255 245 250 255

Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser

260 265 270 260 265 270

Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly

275 280 285 275 280 285

Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Ile Ile Ala Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Ile Ile Ala

290 295 300 290 295 300

Ile Ala Val Val Gly Ala Leu Leu Leu Val Ala Leu Ile Phe Gly Thr Ile Ala Val Val Gly Ala Leu Leu Leu Val Ala Leu Ile Phe Gly Thr

305 310 315 320 305 310 315 320

Ala Ser Tyr Leu Ile Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Ala Ser Tyr Leu Ile Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe

325 330 335 325 330 335

Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly

340 345 350 340 345 350

Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg

355 360 365 355 360 365

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

370 375 380 370 375 380

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

385 390 395 400 385 390 395 400

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

405 410 415 405 410 415

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

420 425 430 420 425 430

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

435 440 445 435 440 445

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

450 455 460 450 455 460

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

465 470 475 480 465 470 475 480

<210> 36<210> 36

<211> 479<211> 479

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> CAR, содержащий мутации T28K, Y32F, A100N в домене VH, мутацию<223> CAR containing the T28K, Y32F, A100N mutations in the VH domain, a mutation

N35K в домене VL, спейсер-стебель CD8, трансмембранный домен TYRP-1,N35K in the VL domain, CD8 stem spacer, TYRP-1 transmembrane domain,

и эндодомены CD28 и CD3zeta and endodomains of CD28 and CD3zeta

<400> 36<400> 36

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15 1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Gly Phe Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Gly Phe

20 25 30 20 25 30

Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45 35 40 45

Gly Phe Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Asp Ile Gln Ser Asn Glu Arg Phe Gly Phe Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Asp Ile Gln Ser Asn Glu Arg Phe

50 55 60 50 55 60

Arg Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Arg Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95 85 90 95

Ala Arg Gly Asn Gly Tyr Asn Phe Asp Gly Ala Tyr Arg Phe Phe Asp Ala Arg Gly Asn Gly Tyr Asn Phe Asp Gly Ala Tyr Arg Phe Phe Asp

100 105 110 100 105 110

Phe Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Phe Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125 115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr

130 135 140 130 135 140

Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile

145 150 155 160 145 150 155 160

Ser Cys Arg Ser Ser Gln Arg Leu Val His Ser Asn Gly Lys Thr Tyr Ser Cys Arg Ser Ser Gln Arg Leu Val His Ser Asn Gly Lys Thr Tyr

165 170 175 165 170 175

Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile

180 185 190 180 185 190

Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Pro Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Pro Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

195 200 205 195 200 205

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala

210 215 220 210 215 220

Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr

225 230 235 240 225 230 235 240

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ser Asp Pro Thr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ser Asp Pro Thr

245 250 255 245 250 255

Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser

260 265 270 260 265 270

Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly

275 280 285 275 280 285

Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Ile Ile Ala Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Ile Ile Ala

290 295 300 290 295 300

Ile Ala Val Val Gly Ala Leu Leu Leu Val Ala Leu Ile Phe Gly Thr Ile Ala Val Val Gly Ala Leu Leu Leu Val Ala Leu Ile Phe Gly Thr

305 310 315 320 305 310 315 320

Ala Ser Tyr Leu Ile Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Ala Ser Tyr Leu Ile Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp

325 330 335 325 330 335

Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr

340 345 350 340 345 350

Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Arg Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Arg

355 360 365 355 360 365

Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln

370 375 380 370 375 380

Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp

385 390 395 400 385 390 395 400

Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro

405 410 415 405 410 415

Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp

420 425 430 420 425 430

Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg

435 440 445 435 440 445

Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr

450 455 460 450 455 460

Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

465 470 475 465 470 475

<---<---

Claims (111)

1. Вариантный антигенсвязывающий домен, который содержит домен VH с последовательностью согласно SEQ ID NO: 1 с мутациями Y32F и A100N и одной дополнительной мутацией, выбранной из T28K, T28R или G31R, в указанном домене VH, и домен VL с последовательностью согласно SEQ ID NO: 2, и при этом указанный вариантный антигенсвязывающий домен содержит по меньшей мере три мутации в домене VH и/или VL и демонстрирует увеличенную аффинность к TRBC2 по сравнению с эталонным антителом, которое имеет домен VH с последовательностью согласно SEQ ID NO: 1 и домен VL с последовательностью согласно SEQ ID NO: 2.1. A variant antigen-binding domain that comprises a VH domain with a sequence according to SEQ ID NO: 1 with the mutations Y32F and A100N and one additional mutation selected from T28K, T28R or G31R in said VH domain, and a VL domain with a sequence according to SEQ ID NO: 2, and wherein said variant antigen-binding domain comprises at least three mutations in the VH and/or VL domain and exhibits increased affinity for TRBC2 compared to a reference antibody that has a VH domain with a sequence according to SEQ ID NO: 1 and a VL domain with a sequence according to SEQ ID NO: 2. 2. Вариантный антигенсвязывающий домен по п. 1, который содержит мутации T28K, Y32F и A100N, дополнительно содержащий по меньшей мере одну мутацию в положении, выбранном из группы, состоящей из V2, Y27, G31, R98, Y102, N103 и A107 в домене VH, N35 в домене VL и R55 в домене VL.2. A variant antigen-binding domain according to claim 1, which comprises the mutations T28K, Y32F and A100N, further comprising at least one mutation at a position selected from the group consisting of V2, Y27, G31, R98, Y102, N103 and A107 in the VH domain, N35 in the VL domain and R55 in the VL domain. 3. Вариантный антигенсвязывающий домен по п. 2, в котором указанная по меньшей мере одна дополнительная мутация выбрана из следующих:3. A variant antigen-binding domain according to claim 2, wherein said at least one additional mutation is selected from the following: а) в домене VH:a) in the VH domain: - V2К, V2R,- V2K, V2R, - Y27F, Y27M, Y27N, Y27W,- Y27F, Y27M, Y27N, Y27W, - G31К, G31R, G31S,- G31K, G31R, G31S, - R98K,- R98K, - Y102F, Y102L,- Y102F, Y102L, - N103A, N103E, N103F, N103H, N103L, N103M, N103Q, N103S, N103W, N103Y,- N103A, N103E, N103F, N103H, N103L, N103M, N103Q, N103S, N103W, N103Y, - А107S,- A107S, иAnd b) в домене VL:b) in the VL domain: - N35M, N35F, N35Y, N35K, N35R и- N35M, N35F, N35Y, N35K, N35R and - R55K.- R55K. 4. Вариантный антигенсвязывающий домен по п. 3, который выбран из вариантных антигенсвязывающих доменов, содержащих следующие комбинации мутаций: 4. A variant antigen-binding domain according to claim 3, which is selected from variant antigen-binding domains containing the following combinations of mutations: - T28K, Y32F, A100N в домене VH и N35K в домене VL,- T28K, Y32F, A100N in the VH domain and N35K in the VL domain, - T28K, Y32F, A100N в домене VH,- T28K, Y32F, A100N in the VH domain, - T28K, Y32F, A100N, Y27N в домене VH,- T28K, Y32F, A100N, Y27N in the VH domain, - T28K, Y32F, A100N, G31K в домене VH,- T28K, Y32F, A100N, G31K in the VH domain, - T28K, Y32F, A100N, Y27M в домене VH,- T28K, Y32F, A100N, Y27M in the VH domain, - T28K, Y32F, A100N, Y27W в домене VH,- T28K, Y32F, A100N, Y27W in the VH domain, - T28K, Y32F, A100N в домене VH и R55K в домене VL,- T28K, Y32F, A100N in the VH domain and R55K in the VL domain, - T28K, Y32F, A100N, N103H в домене VH,- T28K, Y32F, A100N, N103H in the VH domain, - T28K, Y32F, A100N, N103A в домене VH,- T28K, Y32F, A100N, N103A in the VH domain, - T28K, Y32F, A100N, N103Y в домене VH,- T28K, Y32F, A100N, N103Y in the VH domain, - T28K, Y32F, A100N в домене VH и N35R в домене VL,- T28K, Y32F, A100N in the VH domain and N35R in the VL domain, - T28K, Y32F, A100N, N103S в домене VH и N35M в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, N103S in the VH domain and N35M in the VL domain, - T28K, Y32F, A100N, N103M в домене VH,- T28K, Y32F, A100N, N103M in the VH domain, - T28K, Y32F, A100N, N103W в домене VH и N35R в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, N103W in the VH domain and N35R in the VL domain, - T28K, Y32F, A100N в домене VH и N35F в домене VL,- T28K, Y32F, A100N in the VH domain and N35F in the VL domain, - T28K, Y32F, A100N, N103S в домене VH и N35K в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, N103S in the VH domain and N35K in the VL domain, - T28K, Y32F, A100N, R98K в домене VH,- T28K, Y32F, A100N, R98K in the VH domain, - T28K, Y32F, A100N, N103S в домене VH и N35R в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, N103S in the VH domain and N35R in the VL domain, - T28K, Y32F, A100N, N103L в домене VH,- T28K, Y32F, A100N, N103L in the VH domain, - T28K, Y32F, A100N, N103S в домене VH и N35F в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, N103S in the VH domain and N35F in the VL domain, - T28K, Y32F, A100N, N103S в домене VH и N35Y в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, N103S in the VH domain and N35Y in the VL domain, - T28K, Y32F, A100N, N103L в домене VH и N35M в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, N103L in the VH domain and N35M in the VL domain, - T28K, Y32F, A100N, N103L в домене VH и N35R в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, N103L in the VH domain and N35R in the VL domain, - T28K, Y32F, A100N, N103W в домене VH и N35K в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, N103W in the VH domain and N35K in the VL domain, - T28K, Y32F, A100N, N103L в домене VH и N35Y в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, N103L in the VH domain and N35Y in the VL domain, - T28K, Y32F, A100N, N103F в домене VH,- T28K, Y32F, A100N, N103F in the VH domain, - T28K, Y32F, A100N, N103W в домене VH,- T28K, Y32F, A100N, N103W in the VH domain, - T28K, Y32F, A100N, N103L в домене VH и N35K в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, N103L in the VH domain and N35K in the VL domain, - T28K, Y32F, A100N, N103L в домене VH и N35F в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, N103L in the VH domain and N35F in the VL domain, - T28K, Y32F, A100N, N103W в домене VH и N35M в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, N103W in the VH domain and N35M in the VL domain, - T28K, Y32F, A100N, N103F в домене VH и N35Y в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, N103F in the VH domain and N35Y in the VL domain, - T28K, Y32F, A100N, Y27F в домене VH,- T28K, Y32F, A100N, Y27F in the VH domain, - T28K, Y32F, A100N, N103Q в домене VH,- T28K, Y32F, A100N, N103Q in the VH domain, - T28K, Y32F, A100N, N103S в домене VH,- T28K, Y32F, A100N, N103S in the VH domain, - T28K, Y32F, A100N, N103M в домене VH и N35F в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, N103M in the VH domain and N35F in the VL domain, - T28K, Y32F, A100N, N103F в домене VH и N35M в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, N103F in the VH domain and N35M in the VL domain, - T28K, Y32F, A100N, N103F в домене VH и N35F в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, N103F in the VH domain and N35F in the VL domain, - T28K, Y32F, A100N, G31R в домене VH,- T28K, Y32F, A100N, G31R in the VH domain, - T28K, Y32F, A100N, N103W в домене VH и N35F в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, N103W in the VH domain and N35F in the VL domain, - T28K, Y32F, A100N, V2R в домене VH,- T28K, Y32F, A100N, V2R in the VH domain, - T28K, Y32F, A100N, G31S в домене VH,- T28K, Y32F, A100N, G31S in the VH domain, - T28K, Y32F, A100N, A107S в домене VH,- T28K, Y32F, A100N, A107S in the VH domain, - T28K, Y32F, A100N, N103E в домене VH и N35M в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, N103E in the VH domain and N35M in the VL domain, - T28K, Y32F, A100N, V2K в домене VH,- T28K, Y32F, A100N, V2K in the VH domain, - T28K, Y32F, A100N, N103E в домене VH,- T28K, Y32F, A100N, N103E in the VH domain, - T28K, Y32F, A100N, Y102F, N103M в домене VH и N35K в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, Y102F, N103M in the VH domain and N35K in the VL domain, - T28K, Y32F, A100N, Y102F, N103M в домене VH и N35F в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, Y102F, N103M in the VH domain and N35F in the VL domain, - T28K, Y32F, A100N, Y102F, N103M в домене VH и N35R в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, Y102F, N103M in the VH domain and N35R in the VL domain, - T28K, Y32F, A100N, Y102F в домене VH и N35R в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, Y102F in the VH domain and N35R in the VL domain, - T28K, Y32F, A100N, N103M в домене VH и N35M в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, N103M in the VH domain and N35M in the VL domain, - T28K, Y32F, A100N, N103M в домене VH и N35Y в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, N103M in the VH domain and N35Y in the VL domain, - T28K, Y32F, A100N, N103M в домене VH и N35R в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, N103M in the VH domain and N35R in the VL domain, - T28K, Y32F, A100N, N103F в домене VH и N35K в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, N103F in the VH domain and N35K in the VL domain, - T28K, Y32F, A100N, Y102L, N103W в домене VH и N35R в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, Y102L, N103W in the VH domain and N35R in the VL domain, - T28K, Y32F, A100N, Y102L, N103W в домене VH и N35K в домене VL,- T28K, Y32F, A100N, Y102L, N103W in the VH domain and N35K in the VL domain, - T28K, Y32F, A100N, Y102F в домене VH и- T28K, Y32F, A100N, Y102F in the VH domain and - T28K, Y32F, A100N, Y102L, N103M в домене VH и N35R в домене VL.- T28K, Y32F, A100N, Y102L, N103M in the VH domain and N35R in the VL domain. 5. Вариантный антигенсвязывающий домен по п. 4, который содержит мутации T28K, Y32F и A100N в домене VH и мутацию N35K в домене VL.5. A variant antigen-binding domain according to claim 4, which comprises the mutations T28K, Y32F and A100N in the VH domain and the mutation N35K in the VL domain. 6. Вариантный антигенсвязывающий домен по п. 4, который содержит мутации T28K, Y32F и A100N в домене VH.6. A variant antigen-binding domain according to claim 4, which comprises the mutations T28K, Y32F and A100N in the VH domain. 7. Вариантный антигенсвязывающий домен по любому из пп. 1-6, который дополнительно содержит домен олигомеризации.7. A variant antigen-binding domain according to any one of claims 1-6, which further comprises an oligomerization domain. 8. Антитело, которое специфично связывается с TRBC2, содержащее вариантный антигенсвязывающий домен по любому из пп. 1-6.8. An antibody that specifically binds to TRBC2, comprising a variant antigen-binding domain according to any one of claims 1-6. 9. Химерный антигенный рецептор (CAR), который специфично связывается с TRBC2, содержащий вариантный антигенсвязывающий домен по любому из пп. 1-7, спейсер, трансмембранный домен и эндодомен.9. A chimeric antigen receptor (CAR) that specifically binds to TRBC2, comprising a variant antigen-binding domain according to any one of claims 1-7, a spacer, a transmembrane domain and an endodomain. 10. Биспецифичный активатор Т-клеток (BiTE), который специфично связывается с TRBC2, содержащий вариантный антигенсвязывающий домен по любому из пп. 1-7 и домен активации Т-клеток.10. A bispecific T cell activator (BiTE) that specifically binds to TRBC2, comprising a variant antigen binding domain according to any one of claims 1-7 and a T cell activation domain. 11. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая вариантный антигенсвязывающий домен по любому из пп. 1-7.11. A nucleic acid molecule encoding a variant antigen-binding domain according to any one of claims 1-7. 12. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая CAR по п. 9.12. A nucleic acid molecule encoding a CAR according to claim 9. 13. Вектор, который обеспечивает экспрессию молекулы нуклеиновой кислоты по п. 12, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п. 12.13. A vector that provides expression of the nucleic acid molecule according to claim 12, containing the nucleic acid molecule according to claim 12. 14. Цитолитическая клетка для устранения клеток, которые экспрессируют TRBC2, которая содержит CAR по п. 9.14. A cytolytic cell for eliminating cells that express TRBC2, which comprises the CAR of claim 9. 15. Способ получения клетки по п. 14, который включает этап трансдукции или трансфекции клетки вектором по п. 13, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую CAR.15. A method for producing a cell according to claim 14, which comprises the step of transducing or transfecting the cell with a vector according to claim 13, which contains a nucleic acid sequence encoding a CAR. 16. Конъюгат для применения при лечении Т-клеточного злокачественного новообразования, выбранного из Т-клеточных лимфомы или лейкоза, содержащий вариантный антигенсвязывающий домен по любому из пп. 1-7 или антитело по п. 8 и детектируемый компонент или химиотерапевтический компонент.16. A conjugate for use in the treatment of a T-cell malignancy selected from T-cell lymphoma or leukemia, comprising a variant antigen-binding domain according to any one of claims 1-7 or an antibody according to claim 8 and a detectable component or a chemotherapeutic component. 17. Конъюгат по п. 16, который содержит химиотерапевтический компонент.17. The conjugate according to claim 16, which contains a chemotherapeutic component. 18. Способ лечения Т-клеточного злокачественного новообразования, выбранного из Т-клеточных лимфомы или лейкоза у субъекта, включающий этап введения субъекту клетки по п. 14, или антитела по п. 8, или BiTE по п. 10, или конъюгата по п. 16 или 17, при этом злокачественные Т-клетки экспрессируют TRBC2.18. A method for treating a T-cell malignancy selected from T-cell lymphoma or leukemia in a subject, comprising the step of administering to the subject a cell according to claim 14, or an antibody according to claim 8, or a BiTE according to claim 10, or a conjugate according to claim 16 or 17, wherein the malignant T cells express TRBC2. 19. Способ по п. 18, отличающийся тем, что указанные Т-клеточные лимфома или лейкоз выбраны из неспецифицированной периферической Т-клеточной лимфомы (ПТКЛн), ангиоиммунобластной Т-клеточной лимфомы (АИТЛ), анапластической крупноклеточной лимфомы (АККЛ), Т-клеточной лимфомы, ассоциированной с энтеропатией (EATL), гепатолиенальной Т-клеточной лимфомы (ГЛТЛ), экстранодальной NK/T-клеточной лимфомы назального типа, Т-клеточной лимфомы кожи, первичной АККЛ кожи, Т-клеточного пролимфоцитарного лейкоза и Т-клеточного острого лимфобластного лейкоза.19. The method according to claim 18, characterized in that said T-cell lymphoma or leukemia is selected from peripheral T-cell lymphoma of unspecified type (PTCLn), angioimmunoblastic T-cell lymphoma (AITL), anaplastic large cell lymphoma (ALCL), enteropathy-associated T-cell lymphoma (EATL), hepatosplenic T-cell lymphoma (HTL), extranodal NK/T-cell lymphoma of nasal type, cutaneous T-cell lymphoma, primary cutaneous ALCL, T-cell prolymphocytic leukemia, and T-cell acute lymphoblastic leukemia. 20. Применение клетки по п. 14 для устранения клеток, которые экспрессируют TRBC2.20. Use of a cell according to claim 14 for eliminating cells that express TRBC2. 21. Применение по п. 20, отличающееся тем, что клетку по п. 14 применяют для лечения Т-клеточных лимфомы или лейкоза, при этом злокачественные Т-клетки экспрессируют TRBC2.21. The use according to claim 20, characterized in that the cell according to claim 14 is used for the treatment of T-cell lymphoma or leukemia, wherein the malignant T-cells express TRBC2. 22. Применение по п. 20, отличающееся тем, что клетку по п. 14 применяют для изготовления лекарственного средства для лечения Т-клеточных лимфомы или лейкоза, при этом злокачественные Т-клетки экспрессируют TRBC2.22. The use according to claim 20, characterized in that the cell according to claim 14 is used for the manufacture of a medicinal product for the treatment of T-cell lymphoma or leukemia, wherein the malignant T-cells express TRBC2. 23. Применение по п. 21 или 22, отличающееся тем, что указанные Т-клеточные лимфома или лейкоз выбраны из неспецифицированной периферической Т-клеточной лимфомы (ПТКЛн), ангиоиммунобластной Т-клеточной лимфомы (АИТЛ), анапластической крупноклеточной лимфомы (АККЛ), Т-клеточной лимфомы, ассоциированной с энтеропатией (EATL), гепатолиенальной Т-клеточной лимфомы (ГЛТЛ), экстранодальной NK/T-клеточной лимфомы назального типа, Т-клеточной лимфомы кожи, первичной АККЛ кожи, Т-клеточного пролимфоцитарного лейкоза и Т-клеточного острого лимфобластного лейкоза.23. The use according to claim 21 or 22, characterized in that said T-cell lymphoma or leukemia is selected from peripheral T-cell lymphoma of unspecified type (PTCLn), angioimmunoblastic T-cell lymphoma (AITL), anaplastic large cell lymphoma (ALCL), enteropathy-associated T-cell lymphoma (EATL), hepatosplenic T-cell lymphoma (HTL), extranodal NK/T-cell lymphoma of nasal type, cutaneous T-cell lymphoma, primary cutaneous ALCL, T-cell prolymphocytic leukemia, and T-cell acute lymphoblastic leukemia. 24. Применение антитела по п. 8 для специфичного связывания TRBC2. 24. Use of the antibody according to claim 8 for specific binding of TRBC2. 25. Применение по п. 24, отличающееся тем, что антитело по п. 8 применяют для лечения Т-клеточных лимфомы или лейкоза, при этом злокачественные Т-клетки экспрессируют TRBC2.25. The use according to claim 24, characterized in that the antibody according to claim 8 is used for the treatment of T-cell lymphoma or leukemia, wherein the malignant T-cells express TRBC2. 26. Применение по п. 24, отличающееся тем, что антитело по п. 8 применяют для изготовления лекарственного средства для лечения Т-клеточных лимфомы или лейкоза, при этом злокачественные Т-клетки экспрессируют TRBC2.26. The use according to claim 24, characterized in that the antibody according to claim 8 is used for the manufacture of a medicinal product for the treatment of T-cell lymphoma or leukemia, wherein the malignant T-cells express TRBC2. 27. Применение по п. 25 или 26, отличающееся тем, что указанные Т-клеточные лимфома или лейкоз выбраны из неспецифицированной периферической Т-клеточной лимфомы (ПТКЛн), ангиоиммунобластной Т-клеточной лимфомы (АИТЛ), анапластической крупноклеточной лимфомы (АККЛ), Т-клеточной лимфомы, ассоциированной с энтеропатией (EATL), гепатолиенальной Т-клеточной лимфомы (ГЛТЛ), экстранодальной NK/T-клеточной лимфомы назального типа, Т-клеточной лимфомы кожи, первичной АККЛ кожи, Т-клеточного пролимфоцитарного лейкоза и Т-клеточного острого лимфобластного лейкоза.27. The use according to claim 25 or 26, characterized in that said T-cell lymphoma or leukemia is selected from peripheral T-cell lymphoma of unspecified type (PTCLn), angioimmunoblastic T-cell lymphoma (AITL), anaplastic large cell lymphoma (ALCL), enteropathy-associated T-cell lymphoma (EATL), hepatosplenic T-cell lymphoma (HTL), extranodal NK/T-cell lymphoma of nasal type, cutaneous T-cell lymphoma, primary cutaneous ALCL, T-cell prolymphocytic leukemia, and T-cell acute lymphoblastic leukemia. 28. Применение BiTE по п. 10 для специфичного связывания TRBC2.28. Use of BiTE according to claim 10 for specific binding of TRBC2. 29. Применение по п. 28, отличающееся тем, что BiTE по п. 10 применяют для лечения Т-клеточных лимфомы или лейкоза, при этом злокачественные Т-клетки экспрессируют TRBC2.29. The use according to claim 28, characterized in that BiTE according to claim 10 is used for the treatment of T-cell lymphoma or leukemia, wherein the malignant T-cells express TRBC2. 30. Применение по п. 28, отличающееся тем, что BiTE по п. 10 применяют для изготовления лекарственного средства для лечения Т-клеточных лимфомы или лейкоза, при этом злокачественные Т-клетки экспрессируют TRBC2.30. The use according to claim 28, characterized in that BiTE according to claim 10 is used for the manufacture of a medicinal product for the treatment of T-cell lymphoma or leukemia, wherein the malignant T-cells express TRBC2. 31. Применение по п. 29 или 30, отличающееся тем, что указанные Т-клеточные лимфома или лейкоз выбраны из неспецифицированной периферической Т-клеточной лимфомы (ПТКЛн), ангиоиммунобластной Т-клеточной лимфомы (АИТЛ), анапластической крупноклеточной лимфомы (АККЛ), Т-клеточной лимфомы, ассоциированной с энтеропатией (EATL), гепатолиенальной Т-клеточной лимфомы (ГЛТЛ), экстранодальной NK/T-клеточной лимфомы назального типа, Т-клеточной лимфомы кожи, первичной АККЛ кожи, Т-клеточного пролимфоцитарного лейкоза и Т-клеточного острого лимфобластного лейкоза.31. The use according to claim 29 or 30, characterized in that said T-cell lymphoma or leukemia is selected from peripheral T-cell lymphoma of unspecified type (PTCLn), angioimmunoblastic T-cell lymphoma (AITL), anaplastic large cell lymphoma (ALCL), enteropathy-associated T-cell lymphoma (EATL), hepatosplenic T-cell lymphoma (HTL), extranodal NK/T-cell lymphoma of nasal type, cutaneous T-cell lymphoma, primary cutaneous ALCL, T-cell prolymphocytic leukemia, and T-cell acute lymphoblastic leukemia. 32. Применение конъюгата по п. 16 или 17 при лечении Т-клеточного злокачественного новообразования, клетки которого экспрессируют TRBC2. 32. Use of a conjugate according to claim 16 or 17 in the treatment of a T-cell malignancy whose cells express TRBC2. 33. Применение по п. 32, отличающееся тем, что конъюгат по п. 16 или 17 применяют для лечения Т-клеточных лимфомы или лейкоза, при этом злокачественные Т-клетки экспрессируют TRBC2.33. The use according to claim 32, characterized in that the conjugate according to claim 16 or 17 is used for the treatment of T-cell lymphoma or leukemia, wherein the malignant T-cells express TRBC2. 34. Применение по п. 32, отличающееся тем, что конъюгат по п. 16 или 17 применяют для изготовления лекарственного средства для лечения Т-клеточных лимфомы или лейкоза, при этом злокачественные Т-клетки экспрессируют TRBC2.34. The use according to claim 32, characterized in that the conjugate according to claim 16 or 17 is used for the manufacture of a medicinal product for the treatment of T-cell lymphoma or leukemia, wherein the malignant T-cells express TRBC2. 35. Применение по п. 33 или 34, отличающееся тем, что указанные Т-клеточные лимфома или лейкоз выбраны из неспецифицированной периферической Т-клеточной лимфомы (ПТКЛн), ангиоиммунобластной Т-клеточной лимфомы (АИТЛ), анапластической крупноклеточной лимфомы (АККЛ), Т-клеточной лимфомы, ассоциированной с энтеропатией (EATL), гепатолиенальной Т-клеточной лимфомы (ГЛТЛ), экстранодальной NK/T-клеточной лимфомы назального типа, Т-клеточной лимфомы кожи, первичной АККЛ кожи, Т-клеточного пролимфоцитарного лейкоза и Т-клеточного острого лимфобластного лейкоза.35. The use according to claim 33 or 34, characterized in that said T-cell lymphoma or leukemia is selected from peripheral T-cell lymphoma of unspecified type (PTCLn), angioimmunoblastic T-cell lymphoma (AITL), anaplastic large cell lymphoma (ALCL), enteropathy-associated T-cell lymphoma (EATL), hepatosplenic T-cell lymphoma (HTL), extranodal NK/T-cell lymphoma of nasal type, cutaneous T-cell lymphoma, primary cutaneous ALCL, T-cell prolymphocytic leukemia, and T-cell acute lymphoblastic leukemia. 36. Агент для диагностики Т-клеточного злокачественного новообразования, который содержит вариантный антигенсвязывающий домен по любому из пп. 1-7 или антитело по п. 8.36. An agent for diagnosing a T-cell malignancy that comprises a variant antigen-binding domain according to any one of claims 1-7 or an antibody according to claim 8. 37. Aгент по п. 36, причём Т-клеточное злокачественное новообразование выбрано из Т-клеточных лимфомы или лейкоза.37. The agent of claim 36, wherein the T-cell malignancy is selected from T-cell lymphoma or leukemia. 38. Способ диагностики Т-клеточного злокачественного новообразования, выбранного из Т-клеточных лимфомы или лейкоза у субъекта, включающий этап приведения в контакт вариантного антигенсвязывающего домена по любому из пп. 1-7 или антитела по п. 8 с содержащим T-клетки образцом, полученным от указанного субъекта.38. A method for diagnosing a T-cell malignancy selected from T-cell lymphoma or leukemia in a subject, comprising the step of contacting a variant antigen-binding domain according to any one of claims 1-7 or an antibody according to claim 8 with a sample containing T-cells obtained from said subject. 39. Способ по п. 38, дополнительно включающий этап определения процента TRBC2-положительных Т-клеток в образце.39. The method of claim 38, further comprising the step of determining the percentage of TRBC2-positive T cells in the sample. 40. Способ по п. 39, отличающийся тем, что процент, составляющий 70% или более TRBC2-положительных Т-клеток в образце, указывает на наличие Т-клеточных лимфомы или лейкоза.40. The method of claim 39, wherein a percentage of 70% or more TRBC2-positive T cells in the sample indicates the presence of T-cell lymphoma or leukemia. 41. Способ идентификации субъекта с Т-клеточным злокачественным новообразованием, выбранным из Т-клеточных лимфомы или лейкоза, соответствующих критериям для лечения клеткой по п. 14, или антителом по п. 8, или BiTE по п. 10, или конъюгатом по п. 16 или 17, включающий определение процента TRBC2-положительных Т-клеток в содержащем Т-клетки образце, полученном от указанного субъекта, причём определение процента TRBC2-положительных Т-клеток в содержащем Т-клетки образце, полученном от указанного субъекта, включает этап приведения в контакт вариантного антигенсвязывающего домена по любому из пп. 1-7 или антитела по п. 8 с указанным содержащим T-клетки образцом, при этом указанного субъекта идентифицируют как соответствующего критериям для указанного лечения, если процент TRBC2-положительных Т-клеток в указанном образце составляет 70% или более.41. A method for identifying a subject with a T-cell malignancy selected from T-cell lymphoma or leukemia that meets the criteria for treatment with the cell of claim 14, or the antibody of claim 8, or the BiTE of claim 10, or the conjugate of claim 16 or 17, comprising determining the percentage of TRBC2-positive T cells in a T-cell-containing sample obtained from said subject, wherein determining the percentage of TRBC2-positive T cells in a T-cell-containing sample obtained from said subject comprises the step of contacting a variant antigen-binding domain of any one of claims 1-7 or the antibodies of claim 8 with said T-cell-containing sample, wherein said subject is identified as meeting the criteria for said treatment if the percentage of TRBC2-positive T-cells in said sample is 70% or more. 42. Способ выбора терапии при лечении Т-клеточного злокачественного новообразования, включающей клетку по п. 14, или антитело по п. 8, или BiTE по п. 10, или конъюгат по п. 16 или 17, для лечения субъекта, включающий определение процента TRBC2-положительных Т-клеток в содержащем Т-клетки образце, полученном от указанного субъекта, причём определение процента TRBC2-положительных Т-клеток в содержащем Т-клетки образце, полученном от указанного субъекта, включает этап приведения в контакт вариантного антигенсвязывающего домена по любому из пп. 1-7 или антитела по п. 8 с указанным содержащим T-клетки образцом, при этом указанную терапию выбирают для лечения указанного субъекта, если процент TRBC2-положительных Т-клеток в указанном образце составляет 70% или более.42. A method for selecting a therapy for treating a T-cell malignancy comprising a cell according to claim 14, or an antibody according to claim 8, or a BiTE according to claim 10, or a conjugate according to claim 16 or 17, for treating a subject, comprising determining the percentage of TRBC2-positive T cells in a T-cell-containing sample obtained from said subject, wherein determining the percentage of TRBC2-positive T cells in a T-cell-containing sample obtained from said subject comprises the step of contacting a variant antigen-binding domain according to any one of claims 1-7 or an antibody according to claim 8 with said T-cell-containing sample, wherein said therapy is selected for treating said subject if the percentage of TRBC2-positive T cells in said sample is 70% or more.
RU2021108917A 2018-10-31 2019-10-31 Binding domain RU2829934C2 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB1817822.8 2018-10-31

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2021108917A RU2021108917A (en) 2022-11-30
RU2829934C2 true RU2829934C2 (en) 2024-11-11

Family

ID=

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015132598A1 (en) * 2014-03-05 2015-09-11 Ucl Business Plc Chimeric antigen receptor (car) with antigen binding domains to the t cell receptor beta constant region
RU2014120629A (en) * 2011-11-03 2015-12-10 Пьер Фабр Медикамент ANTIGEN-BINDING PROTEIN AND ITS APPLICATION AS A PRODUCT FOR ADDRESSED DELIVERY IN TREATMENT OF CANCER

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2014120629A (en) * 2011-11-03 2015-12-10 Пьер Фабр Медикамент ANTIGEN-BINDING PROTEIN AND ITS APPLICATION AS A PRODUCT FOR ADDRESSED DELIVERY IN TREATMENT OF CANCER
WO2015132598A1 (en) * 2014-03-05 2015-09-11 Ucl Business Plc Chimeric antigen receptor (car) with antigen binding domains to the t cell receptor beta constant region

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PAUL M MACIOCIA ET AL: "Targeting the T cell receptor [beta]-chain constant region for immunotherapy of T cell malignancies: Supplemental Figures", NATURE MEDICINE vol. 23, no. 12, 13 November 2017, pages 1416-1423. *
VINEY J L ET AL: "GENERATION OF 1-41 MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST A HUMAN T CELL RECEPT0RBETA CHAIN EXPRESSED IN TRANSGENIC MICE", HYBRIDOMA, LIEBERT, NEW YORK, NY, US, vol. 11, no. 6,1 December 1992, pages 701-713. *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12325733B2 (en) Binding domain
US11434293B2 (en) Anti TRBC1 antigen binding domains
JP7149304B2 (en) Chimeric antigen-antibody (CAR) having an antigen-binding domain against the T-cell receptor beta constant region
US11885806B2 (en) Method for depleting malignant T-cells
RU2829934C2 (en) Binding domain
JP7792249B2 (en) Binding domain
RU2791327C2 (en) Anti-trbc1 antigen-binding domain
NZ761844B2 (en) Conjugated antibody with antigen binding domains to the t cell receptor beta constant region
NZ761848B2 (en) Bispecific t-cell engager with antigen binding domains to the t cell receptor beta constant domain
NZ723307B2 (en) Chimeric antigen receptor (car) with antigen binding domains to the t cell receptor beta constant region