RU2829344C1 - Способ пробоподготовки образцов для типирования генов главного комплекса гистосовместимости HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DPB1, HLA-DQB1, HLA-DRB1 и олигонуклеотидные праймеры для его реализации - Google Patents
Способ пробоподготовки образцов для типирования генов главного комплекса гистосовместимости HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DPB1, HLA-DQB1, HLA-DRB1 и олигонуклеотидные праймеры для его реализации Download PDFInfo
- Publication number
- RU2829344C1 RU2829344C1 RU2023117163A RU2023117163A RU2829344C1 RU 2829344 C1 RU2829344 C1 RU 2829344C1 RU 2023117163 A RU2023117163 A RU 2023117163A RU 2023117163 A RU2023117163 A RU 2023117163A RU 2829344 C1 RU2829344 C1 RU 2829344C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- insdseq
- insdqualifier
- insdfeature
- hla
- name
- Prior art date
Links
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 title claims abstract description 40
- 108010065026 HLA-DQB1 antigen Proteins 0.000 title claims abstract description 12
- 108010039343 HLA-DRB1 Chains Proteins 0.000 title claims abstract description 12
- 108010045483 HLA-DPB1 antigen Proteins 0.000 title claims abstract description 11
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 title claims abstract description 10
- 238000005464 sample preparation method Methods 0.000 title abstract description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 37
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 29
- 108010075704 HLA-A Antigens Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 102100028972 HLA class I histocompatibility antigen, A alpha chain Human genes 0.000 claims abstract description 27
- 101100284398 Bos taurus BoLA-DQB gene Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 17
- 101001100327 Homo sapiens RNA-binding protein 45 Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 102100028976 HLA class I histocompatibility antigen, B alpha chain Human genes 0.000 claims abstract description 12
- 102100028971 HLA class I histocompatibility antigen, C alpha chain Human genes 0.000 claims abstract description 12
- 108010058607 HLA-B Antigens Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 108010052199 HLA-C Antigens Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 102100036241 HLA class II histocompatibility antigen, DQ beta 1 chain Human genes 0.000 claims abstract description 11
- 102100040485 HLA class II histocompatibility antigen, DRB1 beta chain Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 102100031618 HLA class II histocompatibility antigen, DP beta 1 chain Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 200
- 239000013615 primer Substances 0.000 claims description 34
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 14
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 claims description 8
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 claims description 6
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 5
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 claims description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 claims description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 abstract description 24
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 abstract description 11
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 6
- 102100038823 RNA-binding protein 45 Human genes 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 44
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 43
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 34
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 32
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 32
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 29
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 28
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 21
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 17
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 9
- 239000012901 Milli-Q water Substances 0.000 description 8
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 8
- 239000005549 deoxyribonucleoside Substances 0.000 description 8
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 8
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 8
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 8
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 7
- 238000012165 high-throughput sequencing Methods 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 5
- 101150044325 DRB1 gene Proteins 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- 238000003766 bioinformatics method Methods 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000012070 whole genome sequencing analysis Methods 0.000 description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 206010003827 Autoimmune hepatitis Diseases 0.000 description 2
- 102210047595 B*52:01 Human genes 0.000 description 2
- 102210047211 DPB1*04:01 Human genes 0.000 description 2
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 2
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 2
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 102100029966 HLA class II histocompatibility antigen, DP alpha 1 chain Human genes 0.000 description 2
- 102100036242 HLA class II histocompatibility antigen, DQ alpha 2 chain Human genes 0.000 description 2
- 101150118346 HLA-A gene Proteins 0.000 description 2
- 108010093061 HLA-DPA1 antigen Proteins 0.000 description 2
- 108010086786 HLA-DQA1 antigen Proteins 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 2
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- 102210047469 A*02:01 Human genes 0.000 description 1
- 102210042961 A*03:01 Human genes 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 102210043140 C*04:01 Human genes 0.000 description 1
- 102210047598 C*12:02 Human genes 0.000 description 1
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 208000028964 Congenital reticular ichthyosiform erythroderma Diseases 0.000 description 1
- 102210043252 DPB1*03:01 Human genes 0.000 description 1
- 102210047212 DQB1*02:02 Human genes 0.000 description 1
- 102210010092 DQB1*03:01 Human genes 0.000 description 1
- 102210048109 DRB1*01:01 Human genes 0.000 description 1
- 102210048120 DRB1*13:01 Human genes 0.000 description 1
- 102210012675 DRB1*15 Human genes 0.000 description 1
- 101150034979 DRB3 gene Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 102210024051 HLA-B*15:01 Human genes 0.000 description 1
- 101150030998 HLA-H gene Proteins 0.000 description 1
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 208000015914 Non-Hodgkin lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 101100278514 Oryza sativa subsp. japonica DRB2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100035593 POU domain, class 2, transcription factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710084414 POU domain, class 2, transcription factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100026459 POU domain, class 3, transcription factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710133394 POU domain, class 3, transcription factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 208000037847 SARS-CoV-2-infection Diseases 0.000 description 1
- 208000000453 Skin Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012568 clinical material Substances 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 102000054767 gene variant Human genes 0.000 description 1
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 1
- 238000011134 hematopoietic stem cell transplantation Methods 0.000 description 1
- 208000010710 hepatitis C virus infection Diseases 0.000 description 1
- 210000003917 human chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000011897 real-time detection Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 201000000849 skin cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000010648 susceptibility to HIV infection Diseases 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии. Описан способ пробоподготовки образцов для типирования генов главного комплекса гистосовместимости HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DPB1, HLA-DQB1, HLA-DRB1. Также описаны пулы олигонуклеотидных праймеров для реализации данного способа. Техническим результатом данного изобретения является разработка эффективного способа пробоподготовки для фрагментарного NGS-секвенирования ряда регионов генов HLA-A/B/C/DPB1/DQB1/DRB1, позволяющих определить аллели данных генов. 3 н. и 7 з.п. ф-лы, 9 табл., 4 пр.
Description
Изобретение относится к биотехнологии, медицине, молекулярной биологии и позволяет произвести пробоподготовку библиотек, содержащих целевые фрагменты генов главного комплекса гистосовместимости -HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DPB1, HLA-DQB1, HLA-DRB1 методом высокопроизводительного секвенирования, как при решении задач практической медицины, так и в научно-исследовательских целях.
Гены HLA (Human Leukocyte Antigen), располагающиеся на 6 хромосоме человека, кодируют белки, входящие в главный комплекс гистосовместимости (МНС) и ответственные за регуляцию иммунной системы. Гены HLA отличаются значительным полиморфизмом. Например, для гена HLA-A на сегодняшний день в базе данных IPD-IMGT/HLA Database содержится 4101 аллель.
Типирование генов HLA (определение конкретных аллелей), учитывая их роль в регуляции иммунной системы, может иметь самое широкое применение, как в практической медицине, так и для фундаментальной науки. Типирование генов HLA необходимо при трансплантации, так как несовместимость генов HLA донора и реципиента является основной причиной отторжения органов и клеток [Mahdi ВМ. A glow of HLA typing in organ transplantation. Clin Transl Med. 2013 Feb 23; 2(1): 6. doi: 10.1186/2001-1326-2-6. PMID: 23432791; PMCID: PMC3598844; Хамаганова Е.Г., Кузьмина Л.А. ОЦЕНКА HLA-СОВМЕСТИМОСТИ И ТРЕБОВАНИЯ К HLA-ТИПИРОВАНИЮ БОЛЬНОГО И ДОНОРА ПРИ ТРАНСПЛАНТАЦИИ АЛЛОГЕННЫХ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК. Гематология и трансфузиология. 2019; 64(2): 175-187. https://doi.org/10.35754/0234-5730-2019-64-2-175-187.]. В настоящее время опубликованы работы, описывающих участие генов HLA в развитии многочисленных заболеваний, включая онкологические (меланома [Bonamigo RR, Carvalho AV, Sebastiani VR, Silva CM, Pinto AC. HLA and skin cancer. An Bras Dermatol. 2012 Jan-Feb; 87(1): 9-16; quiz 17-8. doi: 10.1590/s0365-05962012000100001. PMID: 22481646.], лимфома [Zhong C, Gragert L, Maiers M, Hill ВТ, Garcia-Gomez J, Gendzekhadze K, Senitzer D, Song J, Weisenburger D, Goldstein L, Wang SS. The association between HLA and non-Hodgkin lymphoma subtypes, among a transplant-indicated population. Leuk Lymphoma. 2019 Dec; 60(12): 2899-2908. doi: 10.1080/10428194.2019.1617858. Epub 2019 Jun 19. PMID: 31215275; PMCID: PMC6858537.]) и аутоиммунные (ревматоидный артрит [Oliveira LC, Porta G, Marin ML, Bittencourt PL, Kalil J, Goldberg AC. Autoimmune hepatitis, HLA and extended haplotypes. Autoimmun Rev. 2011 Feb;10(4): 189-93. doi: 10.1016/j.autrev.2010.09.024. Epub 2010 Oct 7. PMID: 20933106.], аутоиммунный гепатит [Kurkó J, Besenyei T, Laki J, Giant TT, Mikecz K, Szekanecz Z. Genetics of rheumatoid arthritis - a comprehensive review. Clin Rev Allergy Immunol. 2013 Oct; 45(2): 170-9. doi: 10.1007/s 12016-012-8346-7. PMID: 23288628; PMCID: PMC3655138.]) заболевания. Показано влияние генов HLA на развитии многочисленных инфекционных заболеваний, включая инфицирование ВИЧ [Hardie RA, Knight Е, Bruneau В, Semeniuk С, Gill K, Nagelkerke N, Kimani J, Wachihi C, Ngugi E, Luo M, Plummer FA. A common human leucocyte antigen-DP genotype is associated with resistance to HIV-1 infection in Kenyan sex workers. AIDS. 2008 Oct 1; 22(15): 2038-42. doi: 10.1097/QAD.0b013e328311dla0. PMID: 18784467; PMCID: PMC2683274.], вирусом гепатита В [Wang L, Zou ZQ, Wang K. Clinical Relevance of HLA Gene Variants in HBV Infection. J Immunol Res. 2016; 2016: 9069375. doi: 10.1155/2016/9069375. Epub 2016 May 8. PMID: 27243039; PMCID: PMC4875979], вирусом гепатита С [Vejbaesya S, Songsivilai S, Tanwandee T, Rachaibun S, Chantangpol R, Dharakul T. HLA association with hepatitis С virus infection. Hum Immunol. 2000 Mar; 61(3): 348-53. doi: 10.1016/s0198-8859(99)00131-7. PMID: 10689128], SARS-CoV-2 [Augusto DG, Yusufali T, Peyser ND, Butcher X, Marcus GM, Olgin JE, Pletcher MJ, Maiers M, Hollenbach JA. HLA-B*15:01 is associated with asymptomatic SARS-CoV-2 infection. medRxiv [Preprint]. 2021 Sep 10:2021.05.13.21257065. doi: 10.1101/2021.05.13.21257065. PMID: 34031661; PMCID: РМС8142661]. В некоторых работах авторы исследуют механизмы, лежащие в основе того, как определенные аллели HLA связаны с заболеваниями, например, механизмы, лежащие в основе защитного влияния аллеля HLA-B*53:01 при инфекции ВИЧ [Bisrat J Debebe, Lies Boelen, James С Lee, IAVI Protocol С Investigators, Chloe L Thio, Jacquie Astemborski, Gregory Kirk, Salim I Khakoo, Sharyne M Donfield, James J Goedert, Becca Asquith (2020) Identifying the immune interactions underlying HLA class I disease associations eLife 9: e54558 https://doi.org/10.7554/eLife.54558]. Подобные работы несомненно вносят вклад в развитие фундаментальной науки и позволяют понять молекулярные механизмы регуляции иммунной системы.
При решении задач молекулярной диагностики нуклеиновых кислот, помимо методов полимеразной цепной реакции (ПЦР) и секвенирования первого поколения по методу Сэнгера, широко используется секвенирование следующего поколения (NGS, Next Generation Sequencing).
В то время как в более ранних работах по типированию генов HLA использовалось преимущественно секвенирование по методу Сэнгера, в настоящее время все чаще используется метод NGS, благодаря одновременному прочтению протяженных участков генома и выявлению сразу большого количества мутаций/полиморфизмов. Так как полногеномное секвенирование имеет высокую стоимость и прочтение всего генома для исследований, связанных с типированием генов HLA, не требуется, в качестве альтернативы полногеномному секвенированию, при решении ряда задач типирования генов HLA может быть применено так называемое «таргетное» (целевое) секвенирование представляющих наибольший интерес участков данных генов. Целевая область фрагментов ДНК целевого гена или области генома направленно амплифицируются, а затем подвергаются высокопроизводительному секвенированию, так что стоимость значительно снижается, а необходимость последующего анализа данных также уменьшается. По сравнению с обычным методом NGS, таргетное секвенирование выполняется после целевой амплификации фрагментов генома. Таким образом стоимость секвенирования и анализа данных значительно снижаются. В настоящее время подобные подходы широко используются, например, для секвенирования экзома человека и отдельных генов.
Для того, чтобы идентифицировать ДНК исследуемого образца как содержащую определенные аллели генов HLA, достаточно секвенировать несколько регионов данных генов, включающих экзоны. При таргетном NGS секвенировании целевые регионы ДНК сначала амплифицируются с помощью специальных олигонуклеотидных праймеров, что позволяет изучать их затем избирательно. Далее, как правило, проводится этап лигирования служебных фрагментов олигонуклеотидов (адаптеров) с помощью особых дорогостоящих ферментов, и индексация с детекцией в режиме реального времени с помощью флуоресцентного интеркалирующего красителя.
Из уровня техники известны следующие протоколы и наборы реагентов для секвенирования генов HLA методом NGS:
Система «HLA-Эксперт» для типирования генов HLA методом высокопроизводительного секвенирования компании ДНК-технология (Россия). «HLA-Эксперт» включает набор реагентов для подготовки библиотек и программное обеспечение для биоинформатического анализа, позволяет типировать 9 генов на уровне высокого разрешения: HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DQB1, HLA-DPB1, DRB3/4/5 [Янкевич Т.Э., Трофимов Ю.Д., Болдырева М.Н., Шубина Е.С., Гольцов А.Ю., Алтухова О.С, Суслова Т.А. Разработка системы «HLA-Эксперт» для типирования генов HLA с высоким разрешением методом NGS. Опыт использования. Вестник гематологии, №2, том 14, стр. 56, 2018]. Пробоподготовка осуществляется при помощи двух пулов праймеров.
Набор ScisG™ HLA v6 Kits компании Scisco Genetics technology (США) [https://sciscogenetics.com/pages/kits.html] позволяет типировать гены HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1/3/4/5, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DPA1, HLA-DPB1. В нем используется технология мультиплексной ПЦР, позволяющая конструировать библиотеку из фрагментов генов HLA с использованием множества пар праймеров и без лигирования адаптеров. Секвенирование подготовленной библиотеки производится на платформе MiSeq Illumina. Пробоподготовка осуществляется при помощи четырех пулов праймеров.
TruSight™ HLA Sequencing Panel компании Illumina (США) [https://www.illumina.com/clinical/hla-sequencing.html] позволяет типировать гены HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1/3/4/5, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DPA1, HLA-DPB1. Для данной панели используется технология, отличная от вышеперечисленных наборов. Фрагменты ДНК амплифицируются крупными фрагментами, длиной несколько т.п.н. (так называемая, long-range PCR). Далее полученные ампликоны фрагментируются набором Nextera® library preparation (Illumina), индексируются и полученная библиотека секвенируется на платформе Illumina.
Следует отметить сравнительно высокую цену всех вышеперечисленных наборов и отсутствие информации об используемых праймерах.
Также из уровня техники известен набор синтетических олигонуклеотидов для определения последовательности генов HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQB1, HLA-DRB1 главного комплекса гистосовместимости [патент RTJ 2703545, дата приоритета 03.06.2019, опубл. 21.10.2019].
Известен способ ПЦР-секвенирования и его применение в генотипировании HLA по патенту RU 2587606 (дата приоритета 30.06.2011, опубл. 20.06.2016). Описан способ ПЦР-секвенирования, включающий следующие стадии: получение образца; амплификация; смешивание; фрагментация; секвенирование и сплайсинг. Данное изобретение также относится к праймерным меткам, используемым в указанном способе, а также к способу генотипирования, в частности, в анализе HLA, а также к ПЦР-праймерам для HLA-A/B, HLA-C и HLA-DQB1.
Упомянутые решения реализуется посредством метода полимеразной цепной реакции (ПЦР). Решения, основанные на ПЦР, имеют такой недостаток, как выявление лишь конкретной аллели, без возможности исследования соседних участков. Кроме того, выявление каждой аллели требует отдельной постановки ПЦР реакции, что увеличивает время исследования и количество требуемой ДНК.
В настоящее время существует необходимость в получении эффективных и простых способов приготовления библиотек для целевого секвенирования важных фрагментов генов HLA с возможностью кастомизации, т.е. изменения праймеров в панели для задач конкретного исследования.
Технической задачей, на решение которой направлено заявляемое решение, является разработка эффективного способа пробоподготовки для фрагментарного NGS-секвенирования ряда регионов генов HLA-A/B/C/DPB1/DQB1/DRB1, позволяющих определить аллели данных генов.
Заявляемое изобретение позволяет преодолеть недостатки предшествующего уровня техники и в значительной мере уменьшает трудо- и финансовые затраты при пробоподготовке к NGS.
Технический результат достигается за счет таргетного (целевого) секвенирования представляющих наибольший интерес участков генов HLA-A/B/C/DPB1/DQB1/DRB1, содержащих экзоны и позволяющих определить аллели данных генов в образце ДНК. Посредством применения оригинальных синтезированных олигонуклеотидных праймеров, имеющих адаптерные подпоследовательности в своем составе, возможна амплификация целевых участков генома, при этом не требуется проводить дорогостоящий этап лигирования адаптеров, используемый в ряде протоколов. При этом амплификацию проводят с использованием двух пулов олигонуклеотидных праймеров, где для первого пула применяют олигонуклеотидные праймеры, имеющие структуру SEQ ID NO: 1-38, а для второго пула применяют олигонуклеотидные праймеры, имеющие структуру SEQ ID NO: 39-77. Амплифицированные фрагменты ДНК, после проведения секвенирования, позволяют определить специфические аллели генов HLA-A/B/C/DPB1/DQB1/DRB1 в исследуемом образце.
Сложность выбора праймеров обусловлена необходимостью обеспечить амплификацию в формате мультиплекса всех аллелей указанных генов, при этом требуется не допустить амплификации нецелевых регионов ДНК человека. Например, в канонической сборке генома человека GRCh38 четвертый экзон гена HLA-A совпадает с соответствующим экзоном гена. HLA-H на 99,28%.
Предложенные в изобретении синтетические олигонуклеотидные праймеры для пробоподготовки образцов для типирования генов главного комплекса гистосовместимости HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DPB1, HLA-DQB1, HLA-DRB1 методом NGS секвенирования имеет следующую структуру: SEQ ID NO: 1-77. При этом олигонуклеотидные праймеры, имеющие структуры SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6, 8, 11, 13, 15, 17, 19, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 35, 37, 39, 41, 43, 44, 46, 48, 50, 52, 53, 56, 58, 60, 63, 64, 66, 67, 69, 70, 72, 73, 75 выполняют функции прямых праймеров, а олигонуклеотидные праймеры, имеющие структуры SEQ ID NO: 2, 5, 7, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 36, 38, 40, 42, 45, 47, 49, 51, 54, 55, 57, 59, 61, 62, 65, 68, 71, 74, 76, 77 выполняют функции обратных праймеров.
Кроме того, олигонуклеотидные праймеры содержат в своем составе универсальные адаптерные последовательности, представленные в перечне последовательностей как SEQ ID NO: 78 и 79, позволяющие в дальнейшем облегчить индексацию продуктов амплификации. Адаптерные последовательности SEQ ID NO: 78, расположены на концах олигонуклеотидов SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6, 8, 11, 13, 15, 17, 19, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 35, 37, 39, 41, 43, 44, 46, 48, 50, 52, 53, 56, 58, 60, 63, 64, 66, 67, 69, 70, 72, 73, 75. Адаптерные последовательности SEQ ID NO: 79, расположены на концах олигонуклеотидов SEQ ID NO: 2, 5, 7, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 36, 38, 40, 42, 45, 47, 49, 51, 54, 55, 57, 59, 61, 62, 65, 68, 71, 74, 76, 77.
По сравнению с известным протоколом пробоподготовки Illumina Nextera XT (https://www.illumina.com/products/by4ype/sequencing-kits/library-prep-kits/nextera-xt-dna.html), предлагаемый способ пробоподготовки позволяет избежать этапов тагментации и отбора фрагментов с необходимыми длинами, поскольку продукты амплификации изначально имеют длину до 600 пар нуклеотидов без учета адаптерных последовательностей (то есть совместимы с наборами реагентов компании Illumina для ее секвенирующих платформ), а также содержат адаптерные последовательности для дальнейшей индексации, что существенно упрощает и удешевляет анализ полученных при секвенировании данных.
При разработке применяемых в данном способе праймеров для таргетной амплификации фрагментов генов HLA-A/B/C/DPB1/DQB1/DRB1 олигонуклеотидные праймеры были подобраны вручную с учетом имеющейся информации об известных аллелях указанных генов. Этот процесс включал в себя загрузку множества референсных последовательностей аллелей генов HLA-A/B/C/DPB1/DQB1/DRB1 из базы данных IPD-IMGT/HLA Database (https://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/) и выравнивание последовательностей с целью определения консервативных для данных аллелей фрагментов. Температуры плавления олигонуклеотидов и характер взаимодействий между ними определялись с помощью инструмента Multiple Primer Analyzer от Thermo Fisher Scientific (США). С помощью программы blastn оценивалась специфичность каждой полученной последовательности ко всем известным организмам, в частности, Homo sapiens, что позволяет исключить неспецифическое взаимодействие между праймерами и участками ДНК человека и других организмов. Кроме того, синтезированные олигонуклеотиды содержат дополнительные последовательности, облегчающие и удешевляющие процесс индексации продуктов амплификации. Расстояния между праймерами в парах были подобраны таким образом, чтобы длина исследуемого региона была в пределах 600 п.н., что позволяет избежать этапа отбора фрагментов с заданной длиной, и совместимо с длиной прочтений большинства наборов реагентов для секвенирования от компании Illumina.
Полученные олигонуклеотиды на одном конце содержат праймерную последовательность, комплементарную участкам генома, а на другом - адаптерные последовательности, следовательно, полученные после амплификации целевые фрагменты сразу фланкированы такими адаптерными последовательностями. Олигонуклеотиды, используемые для индексации, в свою очередь, комплементарны адаптерным последовательностям с одного конца и соответствуют индексам с другого.
В качестве индексных последовательностей используют олигонуклеотиды, несущие различные индексы, которые позволяют отличать данные секвенирования молекул из разных образцов. Примеры подобных индексных последовательностей доступны на сайтах производителей наборов реагентов для высокопроизводительного секвенирования.
Таким образом, в процессе индексации происходят этапы отжига олигонуклеотидов на концах целевых фрагментов и амплификации. После этого продукты амплификации подвергаются высокопроизводительному секвенированию на платформе Illumina. Данный подход является стандартом пробоподготовки библиотек для секвенирования и, например, использован в наборах HLA-Эксперт и ScisGo™ HLA v6 Kits.
Заявляемое изобретение является результатом работы в рамках исследования, выполненной в ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора (Москва, Россия). Представленный способ был отработан более чем на 300 образцах биологического материала, представляющих собой ДНК, выделенную из крови и буккальных клеток эпителия (соскобов носоглотки) при помощи набора «РИБО-преп» (AmpliSens, Россия) согласно рекомендациям производителя.
Выделение ДНК из клинического материала производилось с помощью комплекта реагентов в соответствии с инструкцией производителя. Для выделения ДНК может быть использован комплект реагентов «РИБО-преп» (AmpliSens, Россия) или любой аналогичный коммерческий набор для выделения ДНК.
Материалом для исследования является геномная ДНК человека. Для анализа одного образца требуется 20 нг ДНК (2 мкл ДНК с концентрацией 10 нг/мкл). Две реакции амплификации проводят с использованием ДНК в качестве матрицы и двух пулов специфических олигонуклеотидов. Первый пул олигонуклеотидов содержит олигонуклеотиды SEQ ID NO: 1-38, второй пул олигонуклеотидов содержит олигонуклеотиды SEQ ID NO: 39-77 с концентрацией в реакционной смеси, указанной в Таблице 1.
ПЦР-микс объемом 20 мкл на одну реакцию содержит 10 мкл ПЦР-смеси-2 blue (AmpliSens, Россия), 1,4 мкл эквимолярной смеси четырех дезоксирибонуклеозидтрифосфатов со стоковой концентрацией 4,4 мМ, олигонуклеотиды в указанных в Таблице 1 концентрациях и воду milli-Q. ДНК-матрицу добавляют в количестве 5 мкл (концентрация ДНК от 2 до 50 нг/мкл), итоговый объем реакции составляет 25 мкл. Продуктами амплификации являются целевые участки генов HLA-A/B/C/DPB1/DQB1/DRB1. Длины получаемых фрагментов составляют 270-596 п.н. без учета длин адаптерных и индексных последовательностей, что обеспечивает их полное покрытие при использовании набора реагентов для секвенирования MiSeq Reagent Kit v3 (600-cycle) Illumina (США).
Температурный профиль амплификации для получения ПЦР-продукта:
Затем проводят очистку ПЦР-продуктов от реакционной смеси с использованием магнитных частиц, например, AMPure ХР beads (Beckman Coulter, США) в объемном отношении 1:0,8.
После этого осуществляют индексацию полученных фрагментов. Синтезированные олигонуклеотиды на одном конце содержат праймерную последовательность, комплементарную целевым участкам генов, а на другом - адаптерные последовательности двух типов: для прямых праймеров - SEQ ID NO: 78; для обратных праймеров - SEQ ID NO: 79, соответственно. Таким образом, полученные после амплификации целевые фрагменты сразу фланкируются адаптерными последовательностями, что существенно ускоряет и удешевляет пробоподготовку. Олигонуклеотидные праймеры, используемые для индексации, в свою очередь, на одном конце содержат последовательности, соответствующие индексам, а на другом - последовательности, соответствующие упомянутым ранее адаптерным последовательностям. Таким образом, в процессе индексации происходят этапы отжига олигонуклеотидов на концах целевых фрагментов и амплификации продукта.
ПЦР-микс объемом 15 мкл на одну реакцию содержит 10 мкл ПЦР-смеси-2 blue (AmpliSens, Россия), 1,4 мкл эквимолярной смеси четырех дезоксирибонуклеозидтрифосфатов со стоковой концентрацией 4,4 мМ, соответствующие олигонуклеотиды в концентрации 0,25 пмоль/мкл и воду milli-Q. ДНК-матрица добавляется в количестве 5 мкл, итоговый объем реакции составляет 20 мкл.
Температурный профиль индексации:
Длины полученных продуктов амплификации могут быть проанализированы с помощью электрофореза в 1% агарозном геле. Далее повторно проводят очистку от реакционной смеси с использованием магнитных частиц, например, AMPure ХР beads (Beckman Coulter, США) в объемном отношении 1:0,8.
В результате получаются готовые для секвенирования библиотеки, содержащие целевые фрагменты генов HLA-A/B/C/DPB1/DQB1/DRB1, которые позволяют определить аллели данных генов в исходном образце ДНК.
Реализация заявляемого изобретения поясняется следующими примерами:
Пример 1. Получение набора олигонуклеотидных праймеров, используемого в способе пробоподготовки образцов для типирования генов главного комплекса гистосовместимости HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DPB1, HLA-DQB1, HLA-DRB1.
При разработке применяемых в заявляемом способе оригинальных синтезированных олигонуклеотидных праймеров для таргетной амплификации фрагментов генов HLA-A/B/C/DPB1/DQB1/DRB1 олигонуклеотидные последовательности были подобраны вручную с учетом имеющейся информации об известных аллелях данных генов.
Данный процесс включал в себя загрузку множества референсных последовательностей аллелей генов HLA-A/B/C/DPB1/DQB1/DRB1 из базы данных IPD-IMGT/HLA Database (https://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/) и выравнивание последовательностей с целью определения консервативных для указанных аллелей фрагментов.
Температуры плавления олигонуклеотидов и характер взаимодействий между ними определялись с помощью инструмента Multiple Primer Analyzer от Thermo Fisher Scientific (США). С помощью программы blastn оценивалась специфичность каждой полученной последовательности ко всем известным организмам, в частности, Homo sapiens, что позволило исключить неспецифическое взаимодействие между праймерами и участками ДНК человека и других организмов.
В результате были получены праймеры, имеющие структуры SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6, 8, 11, 13, 15, 17, 19, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 35, 37, 39, 41, 43, 44, 46, 48, 50, 52, 53, 56, 58, 60, 63, 64, 66, 67, 69, 70, 72, 73, 75, которые выполняют функции прямых праймеров, и олигонуклеотидные праймеры, имеющие структуры SEQ ID NO: 2, 5, 7, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 36, 38, 40, 42, 45, 47, 49, 51, 54, 55, 57, 59, 61, 62, 65, 68, 71, 74, 76, 77, выполняющие функции обратных праймеров.
Расстояния между праймерами в парах были подобраны таким образом, чтобы длина исследуемого региона была в пределах 600 п.н., что позволяет избежать этапа отбора фрагментов с заданной длиной, и совместимо с длиной прочтений большинства наборов реагентов для секвенирования от компании Illumina.
Кроме того, синтезированные олигонуклеотидные праймеры содержали дополнительные адаптерные последовательности SEQ ID NO: 78, 79, облегчающие и удешевляющие процесс индексации продуктов амплификации. При этом адаптерные последовательности SEQ ID NO: 78 расположили на концах прямых праймеров, а адаптерные последовательности SEQ ID NO: 79 расположили на концах обратных праймеров.
Поскольку полученные олигонуклеотидные праймеры на одном конце содержат праймерную последовательность, комплементарную участкам генома, а на другом -адаптерные последовательности, полученные после амплификации целевые фрагменты сразу были фланкированы такими адаптерными последовательностями.
Олигонуклеотидные праймеры, используемые для индексации, на одном конце содержат последовательности, соответствующие индексам, а на другом последовательности, соответствующие адаптерным последовательностям SEQ ID NO: 78, 79.
В качестве индексных последовательностей используют олигонуклеотиды, несущие различные индексы, которые позволяют отличать данные секвенирования молекул из разных образцов.
Использовалась информация об индексных последовательностях, опубликованная на сайтах производителей наборов реагентов для высокопроизводительного секвенирования.
Таким образом, в процессе индексации происходят этапы отжига олигонуклеотидов на концах целевых фрагментов и амплификации. После этого продукты амплификации подвергаются высокопроизводительному секвенированию на платформе Illumina.
Пример 2. Секвенирование генов HLA-A, В, С, DPB1, DQB1, DRB1 в образце ДНК, выделенной из буккальных клеток эпителия.
У сотрудника лаборатории взят соскоб из носоглотки, выделение ДНК осуществлялось при помощи набора реагентов «РИБО-преп» (AmpliSens, Россия) согласно рекомендациям производителя. Концентрация выделенной ДНК была измерена набором «Quantum-211» (Евроген, Россия) и составила 13,8 нг/мкл.
Амплификация осуществлялась с применением оригинального синтезированного набора олигонуклеотидных праймеров в двух реакциях, в каждой использовался отдельный пул олигонуклеотидов и выделенная ДНК в качестве матрицы.
Первый пул олигонуклеотидов содержал олигонуклеотиды SEQ ID NO: 1-38, второй пул олигонуклеотидов содержит олигонуклеотиды SEQ ID NO: 39-77 с концентрацией в реакционной смеси, указанной в Таблице 1.
ПЦР-микс объемом 20 мкл на одну реакцию содержал 10 мкл ПЦР-смеси-2 blue (AmpliSens, Россия), 1,4 мкл эквимолярной смеси четырех дезоксирибонуклеозидтрифосфатов со стоковой концентрацией 4,4 мМ, олигонуклеотиды в указанных в Таблице 1 концентрациях и воду milli-Q. ДНК-матрица добавлялась в количестве 5 мкл (концентрация ДНК 13,8 нг/мкл), итоговый объем реакции составлял 25 мкл.
Температурный профиль амплификации для получения ПЦР-продукта:
Далее проводилась очистка ПЦР-продуктов от реакционной смеси с использованием магнитных частиц AMPure ХР beads (Beckman Coulter, США) в объемном отношении 1:0,8. После этого осуществлялась индексация полученных фрагментов с применением адаптерных последовательностей SEQ ID NO: 78, 79.
ПЦР-микс объемом 15 мкл на одну реакцию содержал 10 мкл ПЦР-смеси-2 blue (AmpliSens, Россия), 1,4 мкл эквимолярной смеси четырех дезоксирибонуклеозидтрифосфатов со стоковой концентрацией 4,4 мМ, соответствующие олигонуклеотиды в концентрации 0,25 пмоль/мкл и воду milli-Q. ДНК-матрица добавлялась в количестве 5 мкл, итоговый объем реакции составлял 20 мкл.
Температурный профиль индексации:
Длины полученных продуктов амплификации были проанализированы с помощью электрофореза в 1% агарозном геле. Далее повторно производилась очистка от реакционной смеси с использованием магнитных частиц AMPure ХР beads (Beckman Coulter, США) в объемном отношении 1:0,8. Концентрация полученной библиотеки измерялась при помощи набора QuDye dsDNA HS Assay Kit (Lumiprobe, Россия) и составила 40,8 нг/мкл для каждого пула. Индексированные последовательности были секвенированы на приборе Illumina MiSeq с использованием реагентов MiSeq Reagent Kit v3 (600-cycle). Результаты исследования были проанализированы биоинформатически с помощью утилит FastQC, bwa и samtools. По результатам биоинформатического анализа в исходном образце были определены следующие аллели гена HLA: А*02:01, А*03:01, В*40:02, В*52:01, С*02:02, С*12:16, DPB1*02:01, DPB1*04:01, DQB1*05:02, DQB1*06:01, DRB1*15:02, DRB1*16:01. Найденные аллели совпали с результатами полногеномного секвенирования, которое ранее было выполнено для данного сотрудника.
Пример 3. Секвенирование генов HLA-A, В, С, DPB1, DQB1, DRB1 в образце ДНК, выделенной из образца гомогената печени.
Для выделения ДНК был взят клинический образец гомогената печени человека, выделение ДНК осуществлялось при помощи набора реагентов «РИБО-преп» (AmpliSens, Россия) согласно рекомендациям производителя. Концентрация выделенной ДНК была измерена набором «Quantum-211» (Евроген, Россия) и составила 11,9 нг/мкл.
Амплификация осуществлялась с применением оригинального синтезированного набора олигонуклеотидных праймеров в двух реакциях, в каждой использовался отдельный пул олигонуклеотидов и выделенная ДНК в качестве матрицы.
Первый пул олигонуклеотидов содержал олигонуклеотиды SEQ ID NO: 1-38, второй пул олигонуклеотидов содержит олигонуклеотиды SEQ ID NO: 39-77 с концентрацией в реакционной смеси, указанной в Таблице 1.
ПЦР-микс объемом 20 мкл на одну реакцию содержал 10 мкл ПЦР-смеси-2 blue (AmpliSens, Россия), 1,4 мкл эквимолярной смеси четырех дезоксирибонуклеозидтрифосфатов со стоковой концентрацией 4,4 мМ, олигонуклеотиды в указанных в таблице концентрациях и воду milli-Q. ДНК-матрица добавлялась в количестве 5 мкл (концентрация ДНК 11,9 нг/мкл), итоговый объем реакции составлял 25 мкл.
Температурный профиль амплификации для получения ПЦР-продукта:
Далее проводилась очистка ПЦР-продуктов от реакционной смеси с использованием магнитных частиц AMPure ХР beads (Beckman Coulter, США) в объемном отношении 1:0,8.
После этого осуществлялась индексация полученных фрагментов с применением адаптерных последовательностей SEQ ID NO: 78, 79.
ПЦР-микс объемом 15 мкл на одну реакцию содержал 10 мкл ПЦР-смеси-2 blue (AmpliSens, Россия), 1,4 мкл эквимолярной смеси четырех дезоксирибонуклеозидтрифосфатов со стоковой концентрацией 4,4 мМ, соответствующие олигонуклеотиды в концентрации 0,25 пмоль/мкл и воду milli-Q. ДНК-матрица добавлялась в количестве 5 мкл, итоговый объем реакции составлял 20 мкл.
Температурный профиль индексации:
Длины полученных продуктов амплификации были проанализированы с помощью электрофореза в 1% агарозном геле. Далее повторно производилась очистка от реакционной смеси с использованием магнитных частиц AMPure ХР beads (Beckman Coulter, США) в объемном отношении 1:0,8. Концентрация полученной библиотеки измерялась при помощи набора QuDye dsDNA HS Assay Kit (Lumiprobe, Россия) и составила 29,9 нг/мкл для 1 пула и 23,7 нг/мкл для 2 пула. Индексированные последовательности были секвенированы на приборе Illumina MiSeq с использованием реагентов MiSeq Reagent Kit v3 (600-cycle). Результаты исследования были проанализированы биоинформатически с помощью утилит FastQC, bwa и samtools. По результатам биоинформатического анализа в исходном образце были определены следующие аллели гена HLA: А*11:01, А*23:01, В*44:03, В*52:01, С*04:01, С*12:02, DPB1*03:01, DPB1*30:01, DQB1*02:02, DQB1*05:01, DRB1*01:01, DRB1*13:01.
Пример 4. Секвенирование генов HLA-A, В, С, DPB1, DQB1, DRB1 в образце ДНК, выделенной из цельной крови.
Для выделения ДНК был взят клинический образец цельной крови в пробирке с ЭДТА, выделение ДНК осуществлялось при помощи набора реагентов «РИБО-преп» (AmpliSens, Россия) согласно рекомендациям производителя. Концентрация выделенной ДНК была измерена набором «Quantum-211» (Евроген, Россия) и составила 14,9 нг/мкл.
Амплификация осуществлялась с применением оригинального синтезированного набора олигонуклеотидных праймеров в двух реакциях, в каждой использовался отдельный пул олигонуклеотидов и выделенная ДНК в качестве матрицы.
Первый пул олигонуклеотидов содержал олигонуклеотиды SEQ ID NO: 1-38, второй пул олигонуклеотидов содержит олигонуклеотиды SEQ ID NO: 39-77 с концентрацией в реакционной смеси, указанной в Таблице 1.
ПЦР-микс объемом 20 мкл на одну реакцию содержал 10 мкл ПЦР-смеси-2 blue (AmpliSens, Россия), 1,4 мкл эквимолярной смеси четырех дезоксирибонуклеозидтрифосфатов со стоковой концентрацией 4,4 мМ, олигонуклеотиды в указанных в таблице концентрациях и воду milli-Q. ДНК-матрица добавлялась в количестве 5 мкл (концентрация ДНК 14,9 нг/мкл), итоговый объем реакции составлял 25 мкл.
Температурный профиль амплификации для получения ПЦР-продукта:
Далее проводилась очистка ПЦР-продуктов от реакционной смеси с использованием магнитных частиц AMPure ХР beads (Beckman Coulter, США) в объемном отношении 1:0,8.
После этого осуществлялась индексация полученных фрагментов с применением адаптерных последовательностей SEQ ID NO: 78, 79.
ПЦР-микс объемом 15 мкл на одну реакцию содержал 10 мкл ПЦР-смеси-2 blue (AmpliSens, Россия), 1,4 мкл эквимолярной смеси четырех дезоксирибонуклеозидтрифосфатов со стоковой концентрацией 4,4 мМ, соответствующие олигонуклеотиды в концентрации 0,25 пмоль/мкл и воду milli-Q. ДНК-матрица добавлялась в количестве 5 мкл, итоговый объем реакции составлял 20 мкл.
Температурный профиль индексации:
Длины полученных продуктов амплификации были проанализированы с помощью электрофореза в 1% агарозном геле. Далее повторно производилась очистка от реакционной смеси с использованием магнитных частиц AMPure ХР beads (Beckman Coulter, США) в объемном отношении 1:0,8. Концентрация полученной библиотеки измерялась при помощи набора QuDye dsDNA HS Assay Kit (Lumiprobe, Россия) и составила 37,2 нг/мкл для 1 пула и 41,0 нг/мкл для 2 пула. Индексированные последовательности были секвенированы на приборе Illumina MiSeq с использованием реагентов MiSeq Reagent Kit v3 (600-cycle). Результаты исследования были проанализированы биоинформатически с помощью утилит FastQC, bwa и samtools. По результатам биоинформатического анализа в исходном образце были определены следующие аллели гена HLA: А*03:02 (гомозигота), В*07:05, В*51:01, С*15:05 (гомозигота), DPB1*02:01, DPB1*04:01, DQB1*03:01, DQB1*04:02, DRB1*08:01, DRB1* 11:04.
Заявленное решение позволяет произвести пробоподготовку библиотек, содержащие целевые фрагменты генов HLA-A/B/C/DPB1/DQB1/DRB1 и по результатам секвенирования определить аллели данных генов, содержащиеся в исходном образце.
--->
<?xml version="1.0" encoding="ISO-8859-1"?>
<!DOCTYPE ST26SequenceListing SYSTEM "ST26SequenceListing_V1_2.dtd" PUBLIC "-
//WIPO//DTD Sequence Listing 1.2//EN">
<ST26SequenceListing productionDate="2023-06-28" softwareVersion="1.0.0"
softwareName="WIPO Sequence" fileName="HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DPB1, HLA-
DQB1, HLA-DRB1" dtdVersion="V1_2">
<ApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText>No</ApplicationNumberText>
<FilingDate>2023-06-28</FilingDate>
</ApplicationIdentification>
<ApplicantFileReference>1</ApplicantFileReference>
<EarliestPriorityApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText>No</ApplicationNumberText>
<FilingDate>2023-06-27</FilingDate>
</EarliestPriorityApplicationIdentification>
<ApplicantName languageCode="ru">ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии
Роспотребнадзора</ApplicantName>
<ApplicantNameLatin>FBUN CRIE</ApplicantNameLatin>
<InventionTitle languageCode="ru">Способ пробоподготовки образцов
для типирования
генов главного комплекса гистосовместимости HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DPB1,
HLA-DQB1, HLA-DRB1 и олигонуклеотидные праймеры для его
реализации</InventionTitle>
<SequenceTotalQuantity>79</SequenceTotalQuantity>
<SequenceData sequenceIDNumber="1">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>17</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..17</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>agcagaggggtcagggc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="2">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>17</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..17</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>agggccccttgcttctc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="3">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tcgggcaggtctcagcca</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="4">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tcgggcgggtctcagcca</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="5">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>17</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..17</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>cgtccgtgggggatgag</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="6">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>cagtttaggccaaaaatccccc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="7">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gtcactctctggtacaggatct</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="8">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>agtgtcccatgacagatgcaaaa</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="9">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ggtctccagagaggctcct</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="10">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ctaaaggtcagagaggctcct</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="11">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>cccctcaccttcccctct</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="12">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>24</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..24</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gtttccagaaatgtgtgactgcag</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="13">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>agttctaaagtccccacgcac</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="14">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tttcgctgtcgaacctcacgaac</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="15">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ctactacaaccagagcgag</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="16">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>cggcgacctataggagatgg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="17">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ttctactacaaccagagcgagg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="18">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tccccactgcccctggta</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="19">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>aacccacaactgctttcccc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="20">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>aacccacagctgctttcccc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="21">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gtcacaaaggagaggtgtgaag</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="22">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>cccgcttaggaccacagaac</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="23">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>cccatgaatccccaacccaa</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="24">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>cattccagacttggcaacagag</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="25">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>acatggccccagggtatagat</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="26">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ctgggtctgtccttcccag</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="27">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gagattcccttcctggaggag</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="28">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>cctttccagatgctagggaaatt</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="29">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>cagcccatcttccccttttcc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="30">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>cttcctccattaagagggtcag</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="31">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>aggcttggttctggggaaca</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="32">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tctctgtctgaagctgcagg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="33">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gtggggatgaaaggagatgac</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="34">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ttctgccccattttcaaagctct</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="35">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ttctgtctcattttcaaagctct</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="36">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ccatgcactgatgatttctgga</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="37">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ggtgataaggcatgagacagaa</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="38">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>aaccagtagcaaccaggtcc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="39">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ctcctttctggtatctcacag</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="40">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>acgaacacagacacatgcagg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="41">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>cggagggaaatggcctctg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="42">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>atggggagtcgtgacctgc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="43">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>catgaaagatgcaaagcgcctg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="44">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>atgagagatgcaaagcgcctg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="45">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>acccctcaccccttccct</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="46">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>26</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..26</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gtcatacttctggaaattccttttgg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="47">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>cccactctagaccccaagaatc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="48">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>17</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..17</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ctccaagggccgtgtct</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="49">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tcctctccgcagaggccg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="50">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>17</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..17</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tagggcgcaggacccgg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="51">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gcggggattttggcctaaac</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="52">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ctggagtgtcccaagagagat</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="53">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ttggagtgtcgcaagagagat</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="54">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gctcttcaccccttcccta</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="55">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>actcctcaccccttcccta</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="56">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>cagactctgtccaatcccag</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="57">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tataggggatgaacctctttctc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="58">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ggtacatcagatccatcaggtc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="59">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ccccatgctcactttgtcct</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="60">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>17</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..17</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ggcggttccacagctcc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="61">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ctgctctgccctaggtccc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="62">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tgctctgcccctaggtccc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="63">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>cttttcctgtctgttactgccct</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="64">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ctttccctgtctgttactgccct</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="65">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>catcagggataagagatgggaag</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="66">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>24</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..24</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>caggagcaaggaaatcagtaactt</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="67">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>24</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..24</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>cacaagcaaggaaatcagtaactt</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="68">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>25</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..25</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>catgtgatgcaaaggttttattggt</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="69">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>cagtgtcttctcaggaggc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="70">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>17</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..17</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gtgtcttccccggaggc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="71">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>attctaaatgctcacagatggcg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="72">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>cagagcctgggtttgcaga</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="73">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ccagagcctaggtttacaga</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="74">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gaagtcagaaagctgctcac</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="75">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>saaagcataatagcttgtggcct</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="76">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>cttcacctctcactagggaaac</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="77">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>24</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..24</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ggcctccaaatctgtttcttaaag</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="78">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>33</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..33</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tcgtcggcagcgtcagatgtgtataagagacag</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="79">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>34</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..34</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>HLA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gtctcgtgggctcggagatgtgtataagagacag</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
</ST26SequenceListing>
<---
Claims (15)
1. Способ пробоподготовки образцов для типирования генов главного комплекса гистосовместимости HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DPB1, HLA-DQB1, HLA-DRB1, включающий стадии:
(a) выделение ДНК из биологического материала;
(b) проведение ПЦР с применением двух пулов олигонуклеотидных праймеров, где для первого пула применяют олигонуклеотидные праймеры, имеющие структуру SEQ ID NO: 1-38, а для второго пула применяют олигонуклеотидные праймеры, имеющие структуру SEQ ID NO: 39-77;
(c) очистку продуктов ПЦР при помощи магнитных частиц;
(d) индексацию полученных ампликонов при помощи праймеров, содержащих адаптерные последовательности SEQ ID NO: 78, 79;
(e) повторную очистку продуктов ПЦР при помощи магнитных частиц.
2. Способ по п. 1, где реакционная смесь для первого пула содержит олигонуклеотидные праймеры в следующей концентрации: SEQ ID NO: 1, 2, 6, 7, 28, 29, 34-38 - по 0,2 пмоль/мкл каждый; SEQ ID NO: 3-5, 8-14, 17-21, 24-27, 30, 31 - по 0,1 пмоль/мкл каждый; SEQ ID NO: 15, 16, 22, 23 - по 0,4 пмоль/мкл каждый; SEQ ID NO: 32, 33 - по 0,05 пмоль/мкл каждый.
3. Способ по п. 1, где реакционная смесь для второго пула содержит олигонуклеотидные праймеры в следующей концентрации: SEQ ID NO: 39, 40 - по 0,4 пмоль/мкл каждый; SEQ ID NO: 41, 42, 60-62, 69-77 - по 0,2 пмоль/мкл каждый; SEQ ID NO: 43-59, 63-68 - по 0,1 пмоль/мкл каждый.
4. Способ по п. 1, в котором адаптерные последовательности SEQ ID NO: 78 расположены на концах олигонуклеотидных праймеров, имеющих структуру SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6, 8, 11, 13, 15, 17, 19, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 35, 37, 39, 41, 43, 44, 46, 48, 50, 52, 53, 56, 58, 60, 63, 64, 66, 67, 69, 70, 72, 73, 75, а адаптерные последовательности SEQ ID NO: 79 расположены на концах олигонуклеотидных праймеров, имеющих структуру SEQ ID NO: 2, 5, 7, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 36, 38, 40, 42, 45, 47, 49, 51, 54, 55, 57, 59, 61, 62, 65, 68, 71, 74, 76, 77.
5. Пул олигонуклеотидных праймеров для реализации способа по п. 1, имеющих структуру SEQ ID NO: 1-38, для выполнения функции праймеров, комплементарных участкам генов HLA-A/B/C/DPB1/DQB1/DRB1.
6. Пул олигонуклеотидных праймеров по п. 5, где функции прямых праймеров выполняют олигонуклеотидные праймеры, имеющие структуру SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6, 8, 11, 13, 15, 17, 19, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 35, 37.
7. Пул олигонуклеотидных праймеров по п. 5, где функции обратных праймеров выполняют олигонуклеотидные праймеры, имеющие структуру SEQ ID NO: 2, 5, 7, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 36, 38.
8. Пул олигонуклеотидных праймеров для реализации способа по п. 1, имеющих структуру SEQ ID NO: 39-77, для выполнения функции праймеров, комплементарных участкам генов HLA-A/B/C/DPB1/DQB1/DRB1.
9. Пул олигонуклеотидных праймеров по п. 8, где функции прямых праймеров выполняют олигонуклеотидные праймеры, имеющие структуру SEQ ID NO: 39, 41, 43, 44, 46, 48, 50, 52, 53, 56, 58, 60, 63, 64, 66, 67, 69, 70, 72, 73, 75.
10. Пул олигонуклеотидных праймеров по п. 8, где функции обратных праймеров выполняют олигонуклеотидные праймеры, имеющие структуру SEQ ID NO: 40, 42, 45, 47, 49, 51, 54, 55, 57, 59, 61, 62, 65, 68, 71, 74, 76, 77.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2829344C1 true RU2829344C1 (ru) | 2024-10-30 |
Family
ID=
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2587606C2 (ru) * | 2010-06-30 | 2016-06-20 | БиДжиАй Дженомикс Ко., Лтд | Новый способ пцр-секвенирования и его применение в генотипировании hla |
| US10704095B2 (en) * | 2011-07-21 | 2020-07-07 | Genodive Pharma Inc. | Method and kit for DNA typing of HLA gene |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2587606C2 (ru) * | 2010-06-30 | 2016-06-20 | БиДжиАй Дженомикс Ко., Лтд | Новый способ пцр-секвенирования и его применение в генотипировании hla |
| US10704095B2 (en) * | 2011-07-21 | 2020-07-07 | Genodive Pharma Inc. | Method and kit for DNA typing of HLA gene |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Янкевич Т.Э., Трофимов Ю.Д. и др. Разработка системы "HLA-Эксперт" для типирования генов HLA с высоким разрешением методом NGS. Опыт использования. Вестник гематологии, 2018, 14(2), с.56-56. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11952623B2 (en) | Simultaneous determination of aneuploidy and fetal fraction | |
| Yin et al. | Challenges in the application of NGS in the clinical laboratory | |
| Ardui et al. | Single molecule real-time (SMRT) sequencing comes of age: applications and utilities for medical diagnostics | |
| KR101709826B1 (ko) | 신규 ｐｃｒ 서열화 방법 및 ｈｌａ 제노타이핑에서의 상기 방법의 사용 | |
| Carapito et al. | Next-generation sequencing of the HLA locus: methods and impacts on HLA typing, population genetics and disease association studies | |
| US9562269B2 (en) | Haplotying of HLA loci with ultra-deep shotgun sequencing | |
| Bravo-Egana et al. | New challenges, new opportunities: Next generation sequencing and its place in the advancement of HLA typing | |
| Gabriel et al. | Rapid high-throughput human leukocyte antigen typing by massively parallel pyrosequencing for high-resolution allele identification | |
| Adams et al. | Ambiguous allele combinations in HLA Class I and Class II sequence-based typing: when precise nucleotide sequencing leads to imprecise allele identification | |
| US20150379195A1 (en) | Software haplotying of hla loci | |
| Pater et al. | High throughput nanopore sequencing of SARS-CoV-2 viral genomes from patient samples | |
| Liu et al. | Accurate typing of human leukocyte antigen class I genes by Oxford nanopore sequencing | |
| Lazaro et al. | Human leukocyte antigen (HLA) typing by DNA sequencing | |
| CN110494562A (zh) | 用于hla基因的pcr引物组和使用其的测序方法 | |
| Steiert et al. | High-throughput method for the hybridisation-based targeted enrichment of long genomic fragments for PacBio third-generation sequencing | |
| Ton et al. | Multiplexed nanopore sequencing of HLA-B locus in Māori and Pacific Island samples | |
| Wu et al. | Revisiting the potential power of human leukocyte antigen (HLA) genes on relationship testing by massively parallel sequencing-based HLA typing in an extended family | |
| CN108441547B (zh) | 一种hla基因扩增、基因分型的引物组、试剂盒和方法 | |
| Dunn | Novel approaches and technologies in molecular HLA typing | |
| Shiina et al. | Super high resolution for single molecule-sequence-based typing of classical HLA loci using Ion Torrent PGM | |
| Nowak et al. | Genetic methods of HLA typing | |
| RU2829344C1 (ru) | Способ пробоподготовки образцов для типирования генов главного комплекса гистосовместимости HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DPB1, HLA-DQB1, HLA-DRB1 и олигонуклеотидные праймеры для его реализации | |
| Kulski et al. | In phase HLA genotyping by next generation sequencing—a comparison between two massively parallel sequencing bench-top Systems, the Roche GS Junior and Ion Torrent PGM | |
| RU2833819C1 (ru) | Способ секвенирования экзонов гена HLA-DQA1 и набор синтетических олигонуклеотидов для его реализации | |
| RU2837865C1 (ru) | Способ секвенирования экзонов гена HLA-DPA1 и набор синтетических олигонуклеотидов для его реализации |