RU2828676C2 - African swine fever virus vaccine - Google Patents
African swine fever virus vaccine Download PDFInfo
- Publication number
- RU2828676C2 RU2828676C2 RU2021109764A RU2021109764A RU2828676C2 RU 2828676 C2 RU2828676 C2 RU 2828676C2 RU 2021109764 A RU2021109764 A RU 2021109764A RU 2021109764 A RU2021109764 A RU 2021109764A RU 2828676 C2 RU2828676 C2 RU 2828676C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- fever virus
- swine fever
- african swine
- cell antigens
- vaccine
- Prior art date
Links
- 241000701386 African swine fever virus Species 0.000 title claims abstract description 100
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 50
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 95
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 95
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 95
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 90
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims abstract description 83
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 77
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 56
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 44
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 44
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 claims abstract description 41
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 41
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 39
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 38
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 38
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 35
- 241000282887 Suidae Species 0.000 claims abstract description 29
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 23
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 claims abstract description 19
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims abstract description 16
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims abstract description 8
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims abstract description 8
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims abstract description 6
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims abstract description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 37
- 101100166610 African swine fever virus (strain Badajoz 1971 Vero-adapted) Ba71V-058 gene Proteins 0.000 claims description 29
- 101100484717 African swine fever virus (strain Badajoz 1971 Vero-adapted) BA71V-033 gene Proteins 0.000 claims description 28
- 101100428461 African swine fever virus (strain Badajoz 1971 Vero-adapted) Ba71V-079 gene Proteins 0.000 claims description 28
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 28
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 22
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 15
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 15
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 claims description 13
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 claims description 13
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 8
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 4
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 abstract description 27
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 102000004245 Proteasome Endopeptidase Complex Human genes 0.000 abstract description 3
- 108090000708 Proteasome Endopeptidase Complex Proteins 0.000 abstract description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 30
- 101710204015 Protein C-ets-1 Proteins 0.000 description 26
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 25
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 24
- 101710121996 Hexon protein p72 Proteins 0.000 description 24
- 101710151911 Phosphoprotein p30 Proteins 0.000 description 24
- 101710189818 Non-structural protein 2a Proteins 0.000 description 23
- 241001183012 Modified Vaccinia Ankara virus Species 0.000 description 20
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 16
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 15
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 14
- 208000007407 African swine fever Diseases 0.000 description 11
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 9
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 9
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 9
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 9
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 8
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 8
- 101710185515 Major outer membrane lipoprotein Lpp Proteins 0.000 description 8
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 8
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 8
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 8
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 7
- 102400001302 Gasdermin-B, N-terminal Human genes 0.000 description 6
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 6
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 6
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 6
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 6
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 6
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 6
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 5
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 5
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 4
- 229940124590 live attenuated vaccine Drugs 0.000 description 4
- 229940023012 live-attenuated vaccine Drugs 0.000 description 4
- 101100038174 African swine fever virus (strain Badajoz 1971 Vero-adapted) Ba71V-99 gene Proteins 0.000 description 3
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 3
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 3
- 244000057717 Streptococcus lactis Species 0.000 description 3
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 3
- 238000003114 enzyme-linked immunosorbent spot assay Methods 0.000 description 3
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 3
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- LDGWQMRUWMSZIU-LQDDAWAPSA-M 2,3-bis[(z)-octadec-9-enoxy]propyl-trimethylazanium;chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCOCC(C[N+](C)(C)C)OCCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC LDGWQMRUWMSZIU-LQDDAWAPSA-M 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 2
- 238000011238 DNA vaccination Methods 0.000 description 2
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000710831 Flavivirus Species 0.000 description 2
- HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N HA peptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 2
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 description 2
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 2
- 101710175625 Maltose/maltodextrin-binding periplasmic protein Proteins 0.000 description 2
- 241000712079 Measles morbillivirus Species 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 235000014897 Streptococcus lactis Nutrition 0.000 description 2
- 241000134401 Sus barbatus Species 0.000 description 2
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 2
- 101150003725 TK gene Proteins 0.000 description 2
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 description 2
- 101710129917 Viral histone-like protein Proteins 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 210000004436 artificial bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000013528 artificial neural network Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 2
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 2
- 229940001442 combination vaccine Drugs 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 2
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 2
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 239000000346 nonvolatile oil Substances 0.000 description 2
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 235000015277 pork Nutrition 0.000 description 2
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 208000000995 spontaneous abortion Diseases 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 2
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 2
- CWGBFIRHYJNILV-UHFFFAOYSA-N (1,4-diphenyl-1,2,4-triazol-4-ium-3-yl)-phenylazanide Chemical compound C=1C=CC=CC=1[N-]C1=NN(C=2C=CC=CC=2)C=[N+]1C1=CC=CC=C1 CWGBFIRHYJNILV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FJLUATLTXUNBOT-UHFFFAOYSA-N 1-Hexadecylamine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCN FJLUATLTXUNBOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MGADZUXDNSDTHW-UHFFFAOYSA-N 2H-pyran Chemical compound C1OC=CC=C1 MGADZUXDNSDTHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 6-aminohexanoic acid Chemical compound NCCCCCC(O)=O SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000238876 Acari Species 0.000 description 1
- 241000256173 Aedes albopictus Species 0.000 description 1
- 101100087820 African swine fever virus (strain Badajoz 1971 Vero-adapted) Ba71V-045 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100209810 African swine fever virus (strain Badajoz 1971 Vero-adapted) Ba71V-055 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100316926 African swine fever virus (strain Badajoz 1971 Vero-adapted) Ba71V-064 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100464192 African swine fever virus (strain Badajoz 1971 Vero-adapted) Ba71V-121 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100316916 African swine fever virus (strain Badajoz 1971 Vero-adapted) Ba71V-128 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100298267 African swine fever virus (strain Badajoz 1971 Vero-adapted) Ba71V-92 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100298305 African swine fever virus (strain Badajoz 1971 Vero-adapted) Ba71V-94 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241000710929 Alphavirus Species 0.000 description 1
- 241000712891 Arenavirus Species 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 241000711404 Avian avulavirus 1 Species 0.000 description 1
- 101150020569 B3R gene Proteins 0.000 description 1
- 241000134396 Babyrousa babyrussa Species 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 101800001415 Bri23 peptide Proteins 0.000 description 1
- 102400000107 C-terminal peptide Human genes 0.000 description 1
- 101800000655 C-terminal peptide Proteins 0.000 description 1
- 108010041952 Calmodulin Proteins 0.000 description 1
- 102000000584 Calmodulin Human genes 0.000 description 1
- 241000178270 Canarypox virus Species 0.000 description 1
- 241000282994 Cervidae Species 0.000 description 1
- 241000306001 Cetartiodactyla Species 0.000 description 1
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 1
- 208000001726 Classical Swine Fever Diseases 0.000 description 1
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 206010012741 Diarrhoea haemorrhagic Diseases 0.000 description 1
- 241000255925 Diptera Species 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- 238000011510 Elispot assay Methods 0.000 description 1
- 102100027723 Endogenous retrovirus group K member 6 Rec protein Human genes 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108010020195 FLAG peptide Proteins 0.000 description 1
- XZWYTXMRWQJBGX-VXBMVYAYSA-N FLAG peptide Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XZWYTXMRWQJBGX-VXBMVYAYSA-N 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 241001663880 Gammaretrovirus Species 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 1
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- -1 MGF_5059R Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 1
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 1
- 241000713883 Myeloproliferative sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 1
- 241000238890 Ornithodoros moubata Species 0.000 description 1
- 241000713112 Orthobunyavirus Species 0.000 description 1
- 241000132157 Phacochoerus africanus Species 0.000 description 1
- 108010089430 Phosphoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007982 Phosphoproteins Human genes 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 1
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 238000004617 QSAR study Methods 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- 108020005067 RNA Splice Sites Proteins 0.000 description 1
- 108010052090 Renilla Luciferases Proteins 0.000 description 1
- 241000713124 Rift Valley fever virus Species 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000713880 Spleen focus-forming virus Species 0.000 description 1
- 241000713896 Spleen necrosis virus Species 0.000 description 1
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 206010042434 Sudden death Diseases 0.000 description 1
- 241001291321 Sus cebifrons Species 0.000 description 1
- 241000434293 Sus celebensis Species 0.000 description 1
- 241001291315 Sus philippensis Species 0.000 description 1
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 1
- 240000003864 Ulex europaeus Species 0.000 description 1
- 101100540425 Vaccinia virus (strain Copenhagen) VGF gene Proteins 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010047700 Vomiting Diseases 0.000 description 1
- 238000005299 abrasion Methods 0.000 description 1
- 238000010306 acid treatment Methods 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 210000001132 alveolar macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 229960002684 aminocaproic acid Drugs 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004596 appetite loss Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 239000004359 castor oil Substances 0.000 description 1
- 235000019438 castor oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 1
- 210000000080 chela (arthropods) Anatomy 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000010794 food waste Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 125000005456 glyceride group Chemical group 0.000 description 1
- ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N glycerol triricinoleate Natural products CCCCCC[C@@H](O)CC=CCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](COC(=O)CCCCCCCC=CC[C@@H](O)CCCCCC)OC(=O)CCCCCCCC=CC[C@H](O)CCCCCC ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002998 immunogenetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007919 intrasynovial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 1
- 235000021266 loss of appetite Nutrition 0.000 description 1
- 208000019017 loss of appetite Diseases 0.000 description 1
- 230000007347 lysosomal proteolysis Effects 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000003032 molecular docking Methods 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 208000013435 necrotic lesion Diseases 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 1
- 239000004006 olive oil Substances 0.000 description 1
- 235000008390 olive oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 101150049619 p30 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150057545 p72 gene Proteins 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920000447 polyanionic polymer Polymers 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 235000021489 probiotic drink Nutrition 0.000 description 1
- 230000026938 proteasomal ubiquitin-dependent protein catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000004063 proteosomal degradation Effects 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 108010018381 streptavidin-binding peptide Proteins 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000012706 support-vector machine Methods 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 230000008673 vomiting Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
- ORQXBVXKBGUSBA-QMMMGPOBSA-N β-cyclohexyl-alanine Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CC1CCCCC1 ORQXBVXKBGUSBA-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
Abstract
Description
Область изобретения: данное изобретение относится к области вирусов, более конкретно - к области вируса африканской чумы свиней (ВАЧС, англ. «ASFV»). Данное изобретение относится к способам создания вакцины, которая защищает от инфицирования вирусом АЧС, и к применению такой вакцины для профилактики или ослабления инфекции и (или) распространения у свиней вируса африканской чумы свиней.Field of the invention: The present invention relates to the field of viruses, more specifically to the field of African swine fever virus (ASFV). The present invention relates to methods for creating a vaccine that protects against infection with the ASFV virus and to the use of such a vaccine for the prevention or attenuation of infection and/or spread of the African swine fever virus in pigs.
Уровень техникиState of the art
Африканская чума свиней (АЧС) представляет собой вирусное заболевание, которому подвержены только домашние и дикие свиньи. После первоначального заражения симптомы могут проявиться через 2-10 суток. В зависимости от патогенности вируса умирают от 30% до 100% зараженных животных. Общие симптомы включают в себя: потерю аппетита, слабость, покраснение кожи, воспаление слизистых оболочек глаз, рвоту, кровавый понос и лихорадку. В дополнение к этому, кожа может посинеть, участки кожи - отмирать (черные пятна) и могут возникать кровотечения. Более того, данное заболевание может вызывать самопроизвольные выкидыши у беременных свиноматок. Также может наступить внезапная смерть без каких-либо предшествующих заметных симптомов. Симптомы АЧС напоминают симптомы классической чумы свиней.African swine fever (ASF) is a viral disease that only affects domestic and wild pigs. After initial infection, symptoms may appear within 2-10 days. Depending on the pathogenicity of the virus, 30% to 100% of infected animals die. Common symptoms include: loss of appetite, weakness, reddened skin, inflammation of the mucous membranes of the eyes, vomiting, bloody diarrhea and fever. In addition, the skin may turn blue, areas of skin may die (black spots) and bleeding may occur. Moreover, this disease can cause spontaneous abortions in pregnant sows. Sudden death may also occur without any previous noticeable symptoms. Symptoms of ASF resemble those of classical swine fever.
Свиньи могут пережить острую фазу и, по-видимому, выздороветь, только чтобы стать долгосрочными носителями вируса (от нескольких месяцев до всей продолжительности жизни) и, таким образом, снова выделять вирус и заражать других животных.Pigs may survive the acute phase and appear to recover, only to become long-term carriers of the virus (from several months to their entire lifespan) and thus shed the virus again and infect other animals.
Данный вирус распространяется напрямую - от животного к животному, и непрямым образом - посредством зараженных материалов, таких как фекалии, свинина и другие продукты из свинины, кусающие мухи и клещи, особенно посредством разновидности мягкого клеща Ornithodoros moubata, в котором данный вирус размножается. Пищевые отходы или субпродукты от инфицированных свиней также могут содержать АЧС, что способствует распространению вируса. Предпринимаются такие попытки, как международные меры и поддержание бдительности на свинофермах, чтобы предотвратить дальнейшее распространение данного заболевания. С 2007 г. произошло несколько вспышек АЧС в Восточной Европе, Китае и России. АЧС недавно была диагностирована у популяции дикого кабана в Бельгии.The virus is spread directly from animal to animal and indirectly through contaminated materials such as faeces, pork and other pork products, biting flies and ticks, especially the soft tick Ornithodoros moubata, in which the virus multiplies. Food waste or offal from infected pigs may also contain ASF, which helps spread the virus. Efforts such as international measures and vigilance on pig farms are being made to prevent further spread of the disease. Since 2007, there have been several outbreaks of ASF in Eastern Europe, China and Russia. ASF has recently been diagnosed in a wild boar population in Belgium.
АЧС вызывается большим вирусом с двухцепочечной ДНК, относящимся к семейству Asfaruiridae. Его ДНК-геном имеет значительные вариации в длине - от 160 до 210 т.п.о., в зависимости от изолята. Данный геном включает в себя от 150 до 167 открытых рамок считывания, определяющих 54 структурных белка частицы вируса АЧС и более 100 инфекционных белков [Dixon et al., 2013. Virus Res 173: 3 - 14]. К настоящему времени идентифицировано восемь серологических групп, названных серогруппами 1-8, но, по всей вероятности, будет выявлено еще больше серогрупп. Сложность и изменчивость вируса усложнили создание вакцины, защищающей от инфекций АЧС. Было использовано несколько различных подходов, включая и активированные вакцины, субъединичные вакцины, аттенуированные живые вакцины и рекомбинантные живые аттенуированные вакцины [Arias et al., 2017. Vaccines 5, 35; doi: 10.3390/vaccines5040035].ASF is caused by a large double-stranded DNA virus belonging to the Asfaruiridae family. Its DNA genome varies considerably in length, from 160 to 210 kb, depending on the isolate. This genome contains 150 to 167 open reading frames defining 54 structural proteins of the ASF virus particle and more than 100 infectious proteins [Dixon et al., 2013. Virus Res 173: 3 - 14]. Eight serogroups, termed serogroups 1-8, have been identified to date, but more serogroups are likely to be identified. The complexity and variability of the virus have made it difficult to develop a vaccine to protect against ASF infections. Several different approaches have been used, including activated vaccines, subunit vaccines, attenuated live vaccines, and recombinant live attenuated vaccines [Arias et al., 2017. Vaccines 5, 35; doi: 10.3390/vaccines5040035].
Было обнаружено, что инактивированные вакцины не обеспечивают защиту даже в присутствии адъювантов [Stone et al., 1967. Am J Vet Res 28: 475-481; Blome et al., 2014. Vaccine 32: 3879-3882].Inactivated vaccines have been found to be ineffective even in the presence of adjuvants [Stone et al., 1967. Am J Vet Res 28: 475–481; Blome et al., 2014. Vaccine 32: 3879–3882].
Субъединичные вакцины не обеспечивают защиту или обеспечивают лишь частичную защиту. В некоторой степени это может быть связано с большим количеством кодируемых белков (~160) и сложностью выбора соответствующих белков. Кроме того, последовательность большого количества белков ВАЧС не похожа на известные белки [Dunigan et al., 2006. Virus Research 117: 119-132], что затрудняет прогнозирование функции этих белков.Subunit vaccines provide no protection or only partial protection. This may be partly due to the large number of encoded proteins (~160) and the difficulty in selecting the appropriate proteins. In addition, the sequence of many ASFV proteins is not similar to known proteins [Dunigan et al., 2006. Virus Research 117: 119-132], making it difficult to predict the function of these proteins.
Живые аттенуированные вакцины получают либо из вирулентных штаммов, либо из естественно низковирулентных штаммов, таких как OURT88/3 [Boinas et al., 2004. J Gen Virol 85: 2177-2187] и NH/68 [Gil et al., 2008. Arch Virol 153: 1845-1854]. Эти живые аттенуированные вакцины часто обеспечивают до 100% защиты от гомологичных штаммов, но только частичную перекрестную защиту от гетерологичных штаммов. В дополнение к этому, они часто вызывают неприемлемые побочные эффекты, такие как пневмония, двигательные нарушения, очаги некроза, выкидыши и даже смерть et al., 2018. Vet J 233: 41-48; Arias et al., 2017. Vaccines 5, 35; doi: 10.3390/vaccines5040035].Live attenuated vaccines are derived from either virulent strains or naturally low-virulence strains such as OURT88/3 [Boinas et al., 2004. J Gen Virol 85: 2177–2187] and NH/68 [Gil et al., 2008. Arch Virol 153: 1845–1854]. These live attenuated vaccines often provide up to 100% protection against homologous strains but only partial cross-protection against heterologous strains. In addition, they often cause unacceptable side effects such as pneumonia, motor impairment, necrotic lesions, miscarriages, and even death. et al., 2018. Vet J 233: 41-48; Arias et al., 2017. Vaccines 5, 35; doi:10.3390/vaccines5040035].
Наиболее многообещающие результаты были недавно получены с рекомбинантными живыми аттенуированными вакцинами, в которые были введены делеции генов или комбинации делеций генов для достижения приемлемых уровней безопасности и эффективности. Наблюдалась защита от определенных изолятов, хотя и в сочетании с различными уровнями остаточной вирулентности, что, по всей видимости, зависит от конкретного использованного штамма [Sanchez-Cordon et al., 2018. Vet J 233: 41-48; Arias et al., 2017. Vaccines 5, 35; doi: 10.3390/vaccines5040035]. Долгосрочная генетическая стабильность этих делеционных мутантов неизвестна, как и результаты более крупного испытания в полевых условиях.The most promising results have recently been obtained with recombinant live attenuated vaccines in which gene deletions or combinations of gene deletions have been introduced to achieve acceptable levels of safety and efficacy. Protection against certain isolates has been observed, albeit with varying levels of residual virulence, apparently dependent on the specific strain used [Sanchez-Cordon et al., 2018. Vet J 233: 41–48; Arias et al., 2017. Vaccines 5, 35; doi: 10.3390/vaccines5040035]. The long-term genetic stability of these deletion mutants is unknown, as are the results of a larger field trial.
Таким образом, существует потребность в вакцине, которая была бы эффективной и безопасной, и обеспечивала бы защиту от инфицирования большим количеством различных штаммов вируса АЧС.There is therefore a need for a vaccine that is effective and safe and provides protection against infection with a wide range of different ASFV strains.
2 Краткое описание сущности изобретения2 Brief description of the essence of the invention
В данном изобретении, таким образом, представлена рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты, предпочтительно - рекомбинантная молекула ДНК, содержащая экспрессионную кассету, кодирующую полиэпитоп, содержащий Т-клеточные антигены из белков вируса африканской чумы свиней, при этом указанные Т-клеточные антигены разделены спейсерами, предпочтительно - спейсерами из 1-10 аминокислотных остатков, которые содержат сигналы для протеасомного расщепления. Указанный полиэпитоп предпочтительно содержит 2-50 пептидов в качестве Т-клеточных антигенов. Указанный полиэпитоп предпочтительно содержит 2-50 нонапептидов в качестве Т-клеточных антигенов, предпочтительно - нонапептиды 1-13 и 15-20, как показано в Таблице 1, которые разделены спейсерами из около 1-5 аминокислотных остатков, предпочтительно - спейсерными последовательностями 1-11, как показано в Таблице 2.The present invention thus provides a recombinant nucleic acid molecule, preferably a recombinant DNA molecule, comprising an expression cassette encoding a polyepitope comprising T-cell antigens from African swine fever virus proteins, said T-cell antigens being separated by spacers, preferably by spacers of 1-10 amino acid residues which contain signals for proteasomal cleavage. Said polyepitope preferably comprises 2-50 peptides as T-cell antigens. Said polyepitope preferably comprises 2-50 nonapeptides as T-cell antigens, preferably nonapeptides 1-13 and 15-20 as shown in Table 1, which are separated by spacers of about 1-5 amino acid residues, preferably by spacer sequences 1-11 as shown in Table 2.
Рекомбинантная молекула согласно данному изобретению может дополнительно кодировать универсальный Т-клеточный эпитоп. Указанная рекомбинантная молекула согласно данному изобретению может дополнительно содержать нуклеотидную последовательность убиквитина, предпочтительно - на 5'-конце полиэпитопа.The recombinant molecule according to the invention may further encode a universal T-cell epitope. Said recombinant molecule according to the invention may further comprise a nucleotide sequence of ubiquitin, preferably at the 5'-end of the polyepitope.
Данное изобретение также относится к вирусной частице, содержащей рекомбинантную молекулу согласно данному изобретению. Указанная вирусная частица может дополнительно содержать маркерный белок.The present invention also relates to a viral particle comprising a recombinant molecule according to the present invention. Said viral particle may additionally comprise a marker protein.
В данном изобретении также представлен способ стимуляции иммунного ответа у свиньи, включающий в себя введение рекомбинантной молекулы согласно данному изобретению и (или) вирусной частицы согласно данному изобретению. Указанное введение предпочтительно осуществляется в комбинации с вирусной частицей, содержащей В-клеточные антигены вируса африканской чумы свиней, предпочтительно - выбранные из белков р30, р54, р72, EP402R, A104R и (или) B602L из вируса африканской чумы свиней, свинье в количестве, эффективном для индукции иммунного ответа. Указанная рекомбинантная молекула предпочтительно вводится парентерально, предпочтительно - внутримышечно и (или) внутрикожно, предпочтительно - путем иммуноэлектроперации. Указанная рекомбинантная молекула и (или) вирусная частица предпочтительно вводится 2-4 раза, предпочтительно с интервалами около 2 недель. Предпочтительно, чтобы по меньшей мере одно из введений рекомбинантной молекулы нуклеиновой кислоты и (или) вирусной частицы сочеталось с введением синтетических Т-клеточных антигенов из белков вируса африканской чумы свиней. По меньшей мере одно из повторных введений рекомбинантной молекулы и (или) вирусной частицы комбинируется с введением вирусной частицы, содержащей В-клеточные антигены вируса африканской чумы свиней, предпочтительно - выбранные из белков р30, р54, р72, EP402R, A104R и (или) B602L из вируса африканской чумы свиней.The present invention also provides a method for stimulating an immune response in a pig, comprising administering a recombinant molecule according to the present invention and/or a viral particle according to the present invention. Said administration is preferably carried out in combination with a viral particle comprising B-cell antigens of African swine fever virus, preferably selected from the proteins p30, p54, p72, EP402R, A104R and/or B602L from African swine fever virus, to the pig in an amount effective to induce an immune response. Said recombinant molecule is preferably administered parenterally, preferably intramuscularly and/or intradermally, preferably by immunoelectrosurgery. Said recombinant molecule and/or viral particle is preferably administered 2-4 times, preferably at intervals of about 2 weeks. Preferably, at least one of the administrations of the recombinant nucleic acid molecule and/or the viral particle is combined with the administration of synthetic T-cell antigens from African swine fever virus proteins. At least one of the repeated administrations of the recombinant molecule and/or the viral particle is combined with the administration of a viral particle containing B-cell antigens of African swine fever virus, preferably selected from proteins p30, p54, p72, EP402R, A104R and/or B602L from African swine fever virus.
В данном изобретении также представлена композиция, содержащая рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты согласно данному изобретению и (или) вирусную частицу согласно данному изобретению, и ветеринарно приемлемый эксципиент.The present invention also provides a composition comprising a recombinant nucleic acid molecule according to the present invention and/or a viral particle according to the present invention and a veterinarily acceptable excipient.
В данном изобретении также представлена вакцина, содержащая эффективное иммунизирующее количество композиции, содержащей рекомбинантную молекулу согласно данному изобретению и (или) вирусную частицу согласно данному изобретению, и ветеринарно приемлемый эксципиент.The present invention also provides a vaccine comprising an effective immunizing amount of a composition comprising a recombinant molecule according to the present invention and/or a viral particle according to the present invention, and a veterinarily acceptable excipient.
В данном изобретении также представлен способ профилактики или ослабления инфекции и (или) распространения у свиней вируса африканской чумы свиней, включающий в себя введение рекомбинантной молекулы согласно данному изобретению и (или) вирусной частицы согласно данному изобретению по меньшей мере одной свинье. Указанное введение рекомбинантной молекулы и (или) вирусной частицы предпочтительно комбинируется с введением вирусной частицы, содержащей В-клеточные антигены вируса африканской чумы свиней, предпочтительно - выбранные из белков р30, р54, р72, EP402R, A104R и (или) B602L из вируса африканской чумы свиней.The present invention also provides a method for preventing or reducing infection and/or spread of African swine fever virus in pigs, comprising administering a recombinant molecule according to the present invention and/or a viral particle according to the present invention to at least one pig. Said administration of the recombinant molecule and/or viral particle is preferably combined with the administration of a viral particle comprising B-cell antigens of African swine fever virus, preferably selected from the proteins p30, p54, p72, EP402R, A104R and/or B602L from African swine fever virus.
В данном изобретении также представлена вирусная частица, содержащая В-клеточные антигены вируса африканской чумы свиней, предпочтительно - выбранные из белков р30, р54, р72, EP402R, A104R и (или) B602L из вируса африканской чумы свиней.The present invention also provides a viral particle comprising B-cell antigens of African swine fever virus, preferably selected from the proteins p30, p54, p72, EP402R, A104R and/or B602L from African swine fever virus.
В данном изобретении также представлен набор вирусных частиц и набор компонентов, содержащих В-клеточные антигены вируса африканской чумы свиней, предпочтительно выбранные из белков р30, р54, р72, EP402R, A104R и (или) B602L из вируса африканской чумы свиней.The present invention also provides a set of viral particles and a set of components comprising B-cell antigens of African swine fever virus, preferably selected from the proteins p30, p54, p72, EP402R, A104R and/or B602L from African swine fever virus.
В данном изобретении также представлен набор вирусных частиц, включающий в себя вирусную частицу, содержащую рекомбинантную молекулу по любому из пп. 1-5, и одну или несколько вирусных частиц, содержащих В-клеточные антигены вируса африканской чумы свиней, предпочтительно - выбранные из белков р30, р54, р72, EP402R, A104R и (или) B602L из вируса африканской чумы свиней.The present invention also provides a set of viral particles comprising a viral particle comprising a recombinant molecule according to any one of claims 1-5 and one or more viral particles comprising B-cell antigens of African swine fever virus, preferably selected from proteins p30, p54, p72, EP402R, A104R and/or B602L from African swine fever virus.
В данном изобретении также представлен набор компонентов, включающий в себя вирусную частицу, содержащую рекомбинантную молекулу согласно данному изобретению и одну или несколько вирусных частиц, содержащих В-клеточные антигены вируса африканской чумы свиней, предпочтительно - выбранные из белков р30, р54, р72, EP402R, A104R и (или) B602L из вируса африканской чумы свиней.The present invention also provides a set of components comprising a viral particle comprising a recombinant molecule according to the present invention and one or more viral particles comprising B-cell antigens of the African swine fever virus, preferably selected from the proteins p30, p54, p72, EP402R, A104R and/or B602L from the African swine fever virus.
В данном изобретении также представлен набор компонентов, включающий в себя вирусную частицу, содержащую рекомбинантную молекулу согласно данному изобретению и синтетические Т-клеточные антигены из белков вируса африканской чумы свиней.The present invention also provides a set of components comprising a viral particle comprising a recombinant molecule according to the present invention and synthetic T-cell antigens from African swine fever virus proteins.
В данном изобретении также представлена вирусная частица, содержащая В-клеточные антигены вируса африканской чумы свиней, или набор вирусных частиц, содержащих В-клеточные антигены вируса африканской чумы свиней, для применения в способе защиты свиньи от последующего инфицирования вирусом африканской чумы свиней.The present invention also provides a viral particle comprising B-cell antigens of African swine fever virus, or a set of viral particles comprising B-cell antigens of African swine fever virus, for use in a method for protecting a pig from subsequent infection with African swine fever virus.
3 Краткое описание графических материалов 3 Brief description of graphic materials
Фиг. 1. ПоследовательностиFig. 1. Sequences
IA. Вставка рекомбинантной молекулы нуклеиновой кислоты с указанием убиквитина и Т-клеточных эпитопов.IA. Insertion of a recombinant nucleic acid molecule indicating ubiquitin and T-cell epitopes.
IB. Вставка ASFDVAC2. Жирным шрифтом выделены аминокислотная последовательность убиквитина и Т-клеточные антигены 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 19, 20, 11 и 18, как указано в Таблице 1. Курсивом обозначены аминокислотная последовательность PADRE и нуклеотидная последовательность CpG.IB. ASFDVAC2 insert. The amino acid sequence of ubiquitin and T cell antigens 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 19, 20, 11, and 18 are shown in Table 1. The amino acid sequence of PADRE and the nucleotide sequence of CpG are shown in italics.
IC. Нуклеотидная последовательность MVA-p30+B602L (3106 п.о.). В направлении от 5'-конца указаны сайт SwaI - заглавными буквами, левый фланг ТК, промотор MVA 13.5L - жирным и подчеркнутым шрифтом, последовательность Козака, жирным шрифтом - кодирующая последовательность гена р30 из штамма Е75, подчеркнутым шрифтом - последовательность метки FLAG, стоп-кодон - курсивом, заглавными буквами - терминирующая последовательность из mH5, ранняя/ поздняя промоторыая последовательность mH5 - жирным и подчеркнутым шрифтом, последовательность Козака, кодирующая последовательность для BA71V-B602L (9RL) - жирным шрифтом, последовательность тройной метки FLAG - подчеркнутым шрифтом, стоп-кодон - курсивом, заглавными буквами - терминирующая последовательность из CT1R, правый фланг ТК, и сайт SwaI - заглавными буквами.IC. Nucleotide sequence of MVA-p30+B602L (3106 bp). In the direction from the 5' end are the SwaI site in capital letters, the left flank of TK, the MVA 13.5L promoter in bold and underlined, the Kozak sequence, the coding sequence of the p30 gene from the E75 strain in bold, the FLAG tag sequence in underlined, the stop codon in italics, the termination sequence from mH5 in capital letters, the early/late promoter sequence of mH5 in bold and underlined, the Kozak sequence, the coding sequence for BA71V-B602L (9RL) in bold, the triple FLAG tag sequence in underlined, the stop codon in italics, the termination sequence from CT1R in capital letters, the right flank of TK, and the SwaI site in capital letters.
ID. Нуклеотидная последовательность MVA-p54+EP402R+K205R (3309 п.о.). В направлении от 5'-конца указаны сайт SwaI - заглавными буквами, левый фланг ТК, промотор MVA 13.5L - жирным и подчеркнутым шрифтом, последовательность Козака, жирным шрифтом - кодирующая последовательность гена р54, подчеркнутым шрифтом - последовательность метки FLAG, стоп-кодон - курсивом, заглавными буквами - терминирующая последовательность из mH5, ранняя/ поздняя промоторная последовательность mH5, кодирующая последовательность для BA71V-B602L (9RL) - жирным шрифтом, последовательность тройной метки FLAG - подчеркнутым шрифтом, стоп-кодон - курсивом, заглавными буквами - терминирующая последовательность из CT1R, промоторная последовательность LEO - жирным и подчеркнутым шрифтом, последовательность Козака, жирным шрифтом - кодирующая последовательность гена BA71V-K205R, подчеркнутым шрифтом - последовательность метки FLAG, стоп-кодон - курсивом, заглавными буквами - терминирующая последовательность из M2L, правый фланг ТК, и сайт SwaI - заглавными буквами.ID. Nucleotide sequence MVA-p54+EP402R+K205R (3309 bp). In the direction from the 5' end the following are indicated: SwaI site in capital letters, left flank of TK, MVA 13.5L promoter in bold and underlined font, Kozak sequence, p54 gene coding sequence in bold font, FLAG tag sequence in underlined font, stop codon in italics, termination sequence from mH5 in capital letters, mH5 early/late promoter sequence, BA71V-B602L (9RL) coding sequence in bold font, triple FLAG tag sequence in underlined font, stop codon in italics, termination sequence from CT1R in capital letters, LEO promoter sequence in bold and underlined font, Kozak sequence, BA71V-K205R gene coding sequence in bold font, in underlined font - FLAG tag sequence, stop codon - in italics, in capital letters - termination sequence from M2L, right flank of TK, and SwaI site - in capital letters.
IE. Нуклеотидная последовательность MVA-p72+A104R (2992 п.о.). В направлении от 5'-конца указаны сайт SwaI - заглавными буквами, левый фланг ТК, промотор MVA 13.5L - жирным и подчеркнутым шрифтом, последовательность Козака, жирным шрифтом - кодирующая последовательность гена р72, подчеркнутым шрифтом - последовательность метки FLAG, стоп-кодон - курсивом, заглавными буквами - терминирующая последовательность из mH5, ранняя/ поздняя промоторная последовательность mH5 - жирным и подчеркнутым шрифтом, последовательность Козака, кодирующая последовательность для BA71V-A140R - жирным шрифтом, подчеркнутым шрифтом - последовательность метки FLAG, стоп-кодон - курсивом, заглавными буквами - терминирующая последовательность из C11R, правый фланг ТК, и сайт SwaI - заглавными буквами.IE. Nucleotide sequence of MVA-p72+A104R (2992 bp). In the direction from the 5' end are the SwaI site in capital letters, the left flank of the TK, the MVA 13.5L promoter in bold and underlined, the Kozak sequence, the coding sequence of the p72 gene in bold, the FLAG tag sequence in underlined, the stop codon in italics, the termination sequence from mH5 in capital letters, the early/late promoter sequence of mH5 in bold and underlined, the Kozak sequence, the coding sequence for BA71V-A140R in bold, the FLAG tag sequence in underlined, the stop codon in italics, the termination sequence from C11R in capital letters, the right flank of the TK, and the SwaI site in capital letters.
Фиг. 2. Результаты вакцинации рекомбинантной конструкцией нуклеиновой кислотыFig. 2. Results of vaccination with a recombinant nucleic acid construct
2А. Кривые выживания. 2В. Клинические показатели для каждой группы в указанные сутки после заражения (СПЗ). Белые столбцы обозначают умерших животных. 2С. Результаты анализа ELISPOT мононуклеарных клеток периферической крови, которые были выделены из свиней в указанные СПЗ. Клетки стимулировали средой, вирусом и пептидами (вакциной), как указано.2A. Survival curves. 2B. Clinical indices for each group at the indicated days post-challenge (DPC). White bars represent deceased animals. 2C. Results of ELISPOT assay of peripheral blood mononuclear cells that were isolated from pigs at the indicated DPC. Cells were stimulated with medium, virus, and peptides (vaccine) as indicated.
Фиг. 3. Результаты вакцинации вирусными конструкциямиFig. 3. Results of vaccination with viral constructs
3А. Кривые выживания. 3В. Средние показатели тяжести заболевания свиней в разных группах. 3С. Клеточно-опосредованный иммунный ответ в трех группах лечения. Мононуклеарные клетки периферической крови выделяли из свиней в указанные сутки после заражения (ось X: СПЗ). Ось Y: продукция гамма-интерферона, определенная с помощью ELISPOT. Клетки стимулировали средой (отрицательный контроль), вирусом (ПВБ) и пептидами, как указано.3A. Survival curves. 3B. Mean disease severity scores of pigs in different groups. 3C. Cell-mediated immune response in the three treatment groups. Peripheral blood mononuclear cells were isolated from pigs at the indicated days post-challenge (X-axis: SPV). Y-axis: gamma interferon production determined by ELISPOT. Cells were stimulated with medium (negative control), virus (PVB), and peptides as indicated.
4 Подробное описание сущности изобретения4 Detailed description of the essence of the invention
4.1 Определения4.1 Definitions
При употреблении в данном документе термин «Т-клеточный эпитоп» или «Т-клеточный антиген» относится к эпитопу, который может распознаваться иммунной системой после внутриклеточного процессинга антигена. После процессинга Т-клеточный эпитоп связывается с по меньшей мере одной молекулой ГКГ и экспрессируется на поверхности антигенпрезентирующей клетки в виде комплекса ГКГ - пептид. Т-клеточные эпитопы, презентируемые молекулами ГКГ класса I, обычно имеют длину от 8 до 11 аминокислот, тогда как молекулы ГКГ класса II могут презентировать пептиды длиной около 12-25 аминокислот, предпочтительно - около 13-17 аминокислот. Доступны компьютерные программы, которые могут прогнозировать потенциальные Т-клеточные эпитопы в белках на основе, например, профилей амфипатичности белков, мотивов последовательностей, количественных матриц, искусственных нейронных сетей, машин опорных векторов, количественной взаимосвязи структуры и активности, и моделирований молекулярной стыковки [Desai and Kulkarni-Kale, 2014. Methods Mol Biol 1184: 333-64]. Эти программы включают в себя IEDB Analysis Resource, ELISpot (PepScan, Лелистад, Нидерланды), RANKPEP [Reche et al., 2004. Immunogenetics 56: 405 - 19], nHLAPred [Bhasin and Raghava, 2007. J Biosci 32: 31 42] и NetMHC [Lundegaard et al., 2008. Nucleic Acids Res 36: W509-12].As used herein, the term "T-cell epitope" or "T-cell antigen" refers to an epitope that can be recognized by the immune system following intracellular processing of the antigen. Following processing, the T-cell epitope binds to at least one MHC molecule and is expressed on the surface of the antigen-presenting cell as an MHC-peptide complex. T-cell epitopes presented by MHC class I molecules are typically 8 to 11 amino acids in length, while MHC class II molecules can present peptides of about 12 to 25 amino acids in length, preferably about 13 to 17 amino acids in length. Computer programs are available that can predict potential T-cell epitopes in proteins based on, for example, protein amphipathicity profiles, sequence motifs, quantitative matrices, artificial neural networks, support vector machines, quantitative structure-activity relationships, and molecular docking simulations [Desai and Kulkarni-Kale, 2014. Methods Mol Biol 1184: 333–64]. These programs include IEDB Analysis Resource, ELISpot (PepScan, Lelystad, The Netherlands), RANKPEP [Reche et al., 2004. Immunogenetics 56: 405–19], nHLAPred [Bhasin and Raghava, 2007. J Biosci 32: 31–42], and NetMHC [Lundegaard et al., 2008. Nucleic Acids Res 36: W509–12].
Предпочтительный Т-клеточный эпитоп или Т-клеточный антиген, как этот термин используется в данной заявке, представляет собой эпитоп ГКГ класса I, также называемый цитотоксическим Т-клеточным эпитопом, содержащий 8-11 аминокислотных остатков, предпочтительно - около 9 аминокислотных остатков.A preferred T-cell epitope or T-cell antigen, as that term is used herein, is an MHC class I epitope, also called a cytotoxic T-cell epitope, comprising 8-11 amino acid residues, preferably about 9 amino acid residues.
При употреблении в данном документе термин «полиэпитоп» относится к биомолекуле, предпочтительно - пептиду или белку, которая имеет множество эпитопов, таких как Т-клеточные эпитопы, предпочтительно - эпитопы ГКГ класса I.As used herein, the term "polyepitope" refers to a biomolecule, preferably a peptide or protein, that has multiple epitopes, such as T-cell epitopes, preferably MHC class I epitopes.
Указанные отдельные эпитопы предпочтительно разделены линкерными последовательностями. Указанные линкерные последовательности обеспечивают гибкость и могут участвовать в процессинге полиэпитопа в отдельные эпитопы.Said individual epitopes are preferably separated by linker sequences. Said linker sequences provide flexibility and can participate in the processing of the polyepitope into individual epitopes.
При употреблении в данном документе термин «экспресснойная кассета» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая обеспечивает экспрессию одной или нескольких открытых рамок считывания, присутствующих в указанной кассете. Экспрессионная кассета предпочтительно содержит промоторную последовательность, по меньшей мере одну открытую рамку считывания и З'-нетранслируемую область, которая предпочтительно содержит сигнал полиаденилирования. Экспрессионная кассета может дополнительно содержать энхансерные последовательности, один или несколько посттранскрипционных регуляторных элементов и (или) одну или несколько интронных последовательностей. Для экспрессии в эукариотических клетках указанные посттранскрипционные регуляторные элементы и (или) одна или несколько интронных последовательностей могут усиливать транспорт из ядра клетки продуктов транскрипции, то есть матричной РНК, экспрессионной кассеты, чтобы обеспечить трансляцию РНК в цитоплазме клетки. Указанная экспрессионная кассета предпочтительно оптимизирована для экспрессии у свиней.As used herein, the term "expression cassette" refers to a nucleic acid molecule that provides for the expression of one or more open reading frames present in said cassette. The expression cassette preferably comprises a promoter sequence, at least one open reading frame and a 3'-untranslated region, which preferably comprises a polyadenylation signal. The expression cassette may further comprise enhancer sequences, one or more post-transcriptional regulatory elements and/or one or more intronic sequences. For expression in eukaryotic cells, said post-transcriptional regulatory elements and/or one or more intronic sequences may enhance the transport of transcription products, i.e., messenger RNA, of the expression cassette from the cell nucleus to provide for translation of the RNA in the cytoplasm of the cell. Said expression cassette is preferably optimized for expression in pigs.
При употреблении в данном документе термин «пептид» относится к белковой молекуле, которая содержит 2-50 аминокислотных остатков. Пептид может присутствовать в более крупном белке до процессинга этого белка в отдельные пептиды.As used herein, the term "peptide" refers to a protein molecule that contains 2-50 amino acid residues. A peptide may be present in a larger protein before that protein is processed into individual peptides.
При употреблении в данном документе термин «белок» относится к белковой молекуле, которая содержит более 50 аминокислотных остатков.As used in this document, the term "protein" refers to a protein molecule that contains more than 50 amino acid residues.
При употреблении в данном документе термин «нонапептид» относится к пептиду, который содержит девять аминокислотных остатков.As used herein, the term "nonapeptide" refers to a peptide that contains nine amino acid residues.
При употреблении в данном документе термин «спейсер» относится к небольшим пептидам, предпочтительно из 1-10 аминокислотных остатков, более предпочтительно - из 1-5 аминокислотных остатков, которые присутствуют между отдельными эпитопами полиэпитопа и обеспечивают гибкость и процессинг эпитопов протеасомой, и представление отдельных эпитопов посредством ГКГ. Аминокислотные последовательности подходящих спейсеров представлены, например, в US 20130011424 и в Toes et al., 2001. J Exp Med 194: 1-12, которые включены в данный документ посредством ссылки.As used herein, the term "spacer" refers to small peptides, preferably 1-10 amino acid residues, more preferably 1-5 amino acid residues, that are present between individual epitopes of a polyepitope and provide flexibility and processing of the epitopes by the proteasome and presentation of the individual epitopes by the MHC. Amino acid sequences of suitable spacers are provided, for example, in US 20130011424 and in Toes et al., 2001. J Exp Med 194: 1-12, which are incorporated herein by reference.
При употреблении в данном документе термин «универсальный Т-клеточный эпитоп» относится к пептидной последовательности, которая связывается и представляется многими различными молекулами ГКГ, и поэтому предполагается, что она активирует иммунную систему многих особей. Указанный универсальный Т-клеточный эпитоп предпочтительно представляет собой эпитоп ГКГ класса II, также называемый Т-хелперным клеточным эпитопом.As used herein, the term "universal T-cell epitope" refers to a peptide sequence that binds to and is presented by many different MHC molecules and is therefore expected to activate the immune system of many individuals. Said universal T-cell epitope is preferably an MHC class II epitope, also called a T-helper cell epitope.
При употреблении в данном документе термин «нуклеотидная последовательность убиквитина» относится к нуклеотидной молекуле, которая кодирует убиквитин. Убиквитин представляет собой белок из 76 аминокислот, последовательность которого высоко консервативно сохраняется на протяжении всей эволюции от беспозвоночных до млекопитающих. Убиквитин участвует в АТФ-зависимом нелизосомном протеолизе. Указанная нуклеотидная последовательность предпочтительно экспрессирует аминокислотную последовательность N- As used herein, the term "ubiquitin nucleotide sequence" refers to the nucleotide molecule that encodes ubiquitin. Ubiquitin is a 76-amino acid protein whose sequence is highly conserved throughout evolution from invertebrates to mammals. Ubiquitin is involved in ATP-dependent non-lysosomal proteolysis. The nucleotide sequence preferentially expresses the amino acid sequence N-
При употреблении в данном документе термин «вирусная частица» относится к инфекционной частице вируса или вирусоподобной частице, которая аттенуирована и не способна к автономному распространению. Геном вирусной частицы предпочтительно содержит делеции в генах, которые важны для отделения указанной частицы от инфицированной клетки. Делеция указанных генов обеспечивает пространство для вставки чужеродных генов, кодирующих, например, рекомбинантную молекулу ДНК, которая содержит экспрессионную кассету, кодирующую В-клеточные эпитопы и (или) Т-клеточные эпитопы согласно данному изобретению.As used herein, the term "viral particle" refers to an infectious virus particle or a virus-like particle that is attenuated and incapable of autonomous propagation. The genome of the viral particle preferably contains deletions in genes that are important for separating said particle from the infected cell. The deletion of said genes provides space for the insertion of foreign genes encoding, for example, a recombinant DNA molecule that contains an expression cassette encoding B-cell epitopes and/or T-cell epitopes according to the present invention.
При употреблении в данном документе термин «свинья» относится к животному из семейства парнокопытных животных Suidae. Термин «свинья» включает в себя домашнюю свинью и ее предка - обыкновенного евразийского дикого кабана (Sus scrofa), палаванскую бородатую свинью, борнейскую бородатую свинью, свинью Хьюда или вьетнамскую бородавчатую свинью, висайскую бородавчатую свинью, Целебесскую бородавчатую свинью, флоресскую бородавчатую свинью, миндорскую бородавчатую свинью, филиппинскую бородавчатую свинью, яванскую бородавчатую свинью, бабируссу и бородавочника.As used in this document, the term "pig" refers to an animal of the even-toed ungulate family Suidae. The term "pig" includes the domestic pig and its ancestor, the common Eurasian wild boar (Sus scrofa), the Palawan bearded pig, the Bornean bearded pig, the Hude's or Vietnamese warty pig, the Visayan warty pig, the Celebes warty pig, the Flores warty pig, the Mindoro warty pig, the Philippine warty pig, the Javan warty pig, the babirusa, and the warthog.
При употреблении в данном документе термин «эффективное количество» относится к значению количества рекомбинантной молекулы согласно данному изобретению и (или) к значению количества одной или нескольких вирусных частиц согласно данному изобретению, которое оказывает влияние на последующее инфицирование свиньи вирусом африканской чумы свиней.As used herein, the term "effective amount" refers to the amount of a recombinant molecule of the present invention and/or the amount of one or more viral particles of the present invention that has an effect on subsequent infection of a pig with African swine fever virus.
4.2 Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты4.2 Recombinant nucleic acid molecule
В данном изобретении представлена рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты, содержащей экспресснойную кассету, которая кодирует полиэпитоп, содержащий Т-клеточные антигены из белков вируса африканской чумы свиней, при этом указанные Т-клеточные антигены разделены спейсерами, предпочтительно - спейсерами из 1-10 аминокислотных остатков, которые содержат сигналы протеасомного расщепления.The present invention provides a recombinant nucleic acid molecule containing an expression cassette that encodes a polyepitope containing T-cell antigens from African swine fever virus proteins, wherein said T-cell antigens are separated by spacers, preferably spacers of 1-10 amino acid residues that contain proteasomal cleavage signals.
Указанную молекулу нуклеиновой кислоты, предпочтительно - РНК или ДНК, предпочтительно получают с помощью рекомбинантных технологий, включая использование полимераз, рестрикционных ферментов и лигаз, как известно специалисту в данной области. В качестве альтернативы, указанная нуклеиновая кислота получается с помощью синтеза искусственных генов, например, с помощью синтеза частично или полностью перекрывающихся олигонуклеотидов, или сочетанием органической химии и рекомбинантных технологий, как известно специалисту в данной области. Указанная нуклеиновая кислота предпочтительно является кодон-оптимизированной для усиления экспрессии экспрессионной кассеты, кодирующей полиэпитоп, у вакцинированной свиньи. Дальнейшая оптимизация может включать в себя удаление скрытых сайтов сплайсинга, удаление скрытых поли(А)-хвостов и (или) удаление последовательностей, которые приводят к неблагоприятному фолдингу мРНК. Присутствие нитрона, фланкированного сайтами сплайсинга, может стимулировать экспорт из ядра инфицированных клеток.Said nucleic acid molecule, preferably RNA or DNA, is preferably produced by recombinant technologies, including the use of polymerases, restriction enzymes and ligases, as known to the person skilled in the art. Alternatively, said nucleic acid is produced by artificial gene synthesis, for example by synthesis of partially or completely overlapping oligonucleotides, or by a combination of organic chemistry and recombinant technologies, as known to the person skilled in the art. Said nucleic acid is preferably codon-optimized to enhance expression of the expression cassette encoding the polyepitope in the vaccinated pig. Further optimization may include the removal of cryptic splice sites, the removal of cryptic poly(A) tails and/or the removal of sequences that lead to unfavorable folding of the mRNA. The presence of a nitron flanked by splice sites may stimulate export from the nucleus of infected cells.
В одном варианте реализации данного изобретения указанная молекула нуклеиновой кислоты представляет собой РНК, включая немодифицированную РНК, модифицированную РНК и, предпочтительно, самореплицирующуюся РНК. Указанная самореплицирующаяся РНК может быть основана на вирусных системах для амплификации молекулы РНК, например, полученных из альфавирусов, флавивирусов, рабдовирусов, вирусов кори и (или) флавивирусов. Указанная РНК может образовывать комплекс или конденсироваться с молекулами, такими как наночастицы, полиэтиленимин, катионные липиды, включая синтетические катионные липиды, такие как N-[1-(2,3-диолеилокси)пропил]-N,N,N-триметиламмоний хлорид (DOTMA), липофектамин и SAINT®, и (или) хитозаны.In one embodiment of the invention, said nucleic acid molecule is RNA, including unmodified RNA, modified RNA and, preferably, self-replicating RNA. Said self-replicating RNA can be based on viral systems for amplifying an RNA molecule, for example, those derived from alphaviruses, flaviviruses, rhabdoviruses, measles viruses and/or flaviviruses. Said RNA can form a complex or condense with molecules such as nanoparticles, polyethyleneimine, cationic lipids, including synthetic cationic lipids such as N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium chloride (DOTMA), lipofectamine and SAINT®, and/or chitosans.
Экспрессионная кассета предпочтительно содержит средства для обеспечения высоких уровней экспрессии, такие как сильные промоторы, например, вирусного происхождения (например, цитомегаловирус человека) или промоторы, полученные из генов, которые экспрессируются на высоком уровне в клетке, такой как клетка свиньи (Running Deer and Allison, 2004. Biotechnol Prog 20: 880-889; Патент США №5888809).The expression cassette preferably contains means for providing high levels of expression, such as strong promoters, for example, of viral origin (e.g., human cytomegalovirus) or promoters derived from genes that are expressed at high levels in a cell, such as a porcine cell (Running Deer and Allison, 2004. Biotechnol Prog 20: 880-889; U.S. Patent No. 5,888,809).
Кроме того, представлена клетка-хозяин, которая содержит рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую экспрессионную кассету в соответствии с данным изобретением. Указанная клетка-хозяин может быть выращена или сохранена для получения в будущем молекулы рекомбинантной нуклеиновой кислоты в соответствии с данным изобретением. Указанная клетка предпочтительно представляет собой бактериальную клетку, например, клетку Escherichia coli.Furthermore, a host cell is provided which comprises a recombinant nucleic acid molecule comprising an expression cassette according to the invention. Said host cell can be grown or maintained for the future production of a recombinant nucleic acid molecule according to the invention. Said cell is preferably a bacterial cell, for example an Escherichia coli cell.
Нуклеиновая кислота предпочтительно солюбилизируется, например, в буферном растворе, таком как ФСБ, перед введением свинье. Вводимое количество предпочтительно содержит от 1 мкг до 1 мг нуклеиновой кислоты в целом на одно животное.The nucleic acid is preferably solubilized, for example in a buffer solution such as PBS, before administration to the pig. The amount administered preferably comprises from 1 μg to 1 mg of nucleic acid in total per animal.
Указанная рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты, которая содержит экспрессионную кассету, кодирующую полиэпитоп, экспрессирует от 2 до 50 Т-клеточных антигенов, предпочтительно - от 5 до 30 Т-клеточных антигенов, более предпочтительно - около 20 Т-клеточных антигенов, например, 18 Т-клеточных антигенов, 19 Т-клеточных антигенов, 20 Т-клеточных антигенов и 21 Т-клеточный антиген, из белков вируса африканской чумы свиней. Подходящие Т-клеточные антигены предпочтительно предсказывают с помощью доступных компьютерных программ. Предпочтительные Т-клеточные антигены обладают аффинностью связывания с главным комплексом гистосовместимости (ГКГ) класса I. Предпочтительная компьютерная программа, которая включается в анализ подходящих Т-клеточных антигенов, имеет название NetMHC [Andreatta and Nielsen, 2016. Bioinformatics 32: 511-7], и основана на искусственных нейронных сетях, которые допускают вставки и делеции при выравнивании. Данная программа может узнать профиль длины различных молекул ГКГ. Предпочтительно, чтобы аутологичные пептиды не выбирались в качестве подходящих Т-клеточных антигенов, поскольку они могут вызывать аутоиммунное заболевание.Said recombinant nucleic acid molecule, which comprises an expression cassette encoding a polyepitope, expresses from 2 to 50 T-cell antigens, preferably from 5 to 30 T-cell antigens, more preferably about 20 T-cell antigens, such as 18 T-cell antigens, 19 T-cell antigens, 20 T-cell antigens and 21 T-cell antigens, from African swine fever virus proteins. Suitable T-cell antigens are preferably predicted using available computer programs. Preferred T-cell antigens have binding affinity for major histocompatibility complex (MHC) class I. A preferred computer program that is included in the analysis of suitable T-cell antigens is called NetMHC [Andreatta and Nielsen, 2016. Bioinformatics 32: 511-7], and is based on artificial neural networks that allow insertions and deletions in the alignment. This program can learn the length profile of different MHC molecules. Preferably, autologous peptides are not selected as suitable T-cell antigens, since they can cause autoimmune disease.
Указанные 2-50 Т-клеточных антигенов представляют собой пептиды из 6-15 аминокислотных остатков, предпочтительно - от 8 до 11 аминокислотных остатков, более предпочтительно - около 9 аминокислотных остатков, которые разделены спейсерами, предпочтительно - спейсерами из 1-10 аминокислотных остатков, которые содержат сигналы для протеасомного расщепления. Предпочтительные Т-клеточные антигены получены из белков вируса африканской чумы свиней MGF_505-7R, NP1450L, G1340L, B385R, G1211R, E423R, NP1450L, MGF_5059R, E301R, C717R, EP424R, F778R, CP530R, R298L, CP2475L, 0174L, MGF_360-2L, NP1450L, M1249L и (или) MGF_360-11.The said 2-50 T-cell antigens are peptides of 6-15 amino acid residues, preferably 8 to 11 amino acid residues, more preferably about 9 amino acid residues, which are separated by spacers, preferably spacers of 1-10 amino acid residues, which contain signals for proteasomal cleavage. Preferred T-cell antigens are derived from African swine fever virus proteins MGF_505-7R, NP1450L, G1340L, B385R, G1211R, E423R, NP1450L, MGF_5059R, E301R, C717R, EP424R, F778R, CP530R, R298L, CP2475L, 0174L, MGF_360-2L, NP1450L, M1249L and/or MGF_360-11.
Предпочтительные Т-клеточные антигены выбраны из пептидов, указанных в Таблице 1.Preferred T-cell antigens are selected from the peptides listed in Table 1.
Предпочтительная рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая экспрессионную кассету согласно данному изобретению, предпочтительно кодирует пептиды 1- 20 из Таблицы 1, более предпочтительно - пептиды 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, более предпочтительно, в направлении от N-конца, в этом порядке, пептиды 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 19, 20, 11, 18.A preferred recombinant nucleic acid molecule comprising an expression cassette according to the invention preferably encodes peptides 1-20 from Table 1, more preferably peptides 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, more preferably, from the N-terminus, in this order, peptides 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 19, 20, 11, 18.
Указанные спейсеры предпочтительно представляют собой примерно 1-5 аминокислотных остатков, включая 2 аминокислотных остатка, 3 аминокислотных остатка и 4 аминокислотных остатка. Предпочтительные спейсеры включают в себя пептиды, указанные в Таблице 2.Said spacers are preferably about 1-5 amino acid residues, including 2 amino acid residues, 3 amino acid residues and 4 amino acid residues. Preferred spacers include the peptides indicated in Table 2.
Предпочтительная рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая экспрессионную кассету согласно данному изобретению, предпочтительно кодирует универсальный Т-клеточный эпитоп. Указанный универсальный Т-клеточный эпитоп предпочтительно расположен перед Т-клеточными эпитопами вируса африканской чумы свиней, следовательно, с N-конца по отношению к этим Т-клеточным эпитопам. Примеры таких универсальных Т-клеточных эпитопов представлены в Khatun et al., 2017. Chemistry 23: 4233 - 4254. Предпочтительный универсальный Т-клеточный эпитоп обеспечивается не встречающимся в природе эпитопом пан-DR, называемым PADRE, имеющим аминокислотную последовательность AKXVAAWTLKAAAZC, где X обозначает L-циклогексилаланин, a Z обозначает аминокапроновую кислоту ((Alexander et al., 2000. J Immunol 164: 1625-1633). Для целей экспрессии предпочтительно используется производное, имеющее последовательность AKFVAAWTLKAAAARY.A preferred recombinant nucleic acid molecule comprising an expression cassette according to the invention preferably encodes a universal T-cell epitope. Said universal T-cell epitope is preferably located before the T-cell epitopes of the African swine fever virus, hence at the N-terminus with respect to these T-cell epitopes. Examples of such universal T-cell epitopes are presented in Khatun et al., 2017. Chemistry 23: 4233–4254. A preferred universal T-cell epitope is provided by a non-naturally occurring pan-DR epitope called PADRE, having the amino acid sequence AKXVAAWTLKAAAZC, where X is L-cyclohexylalanine and Z is aminocaproic acid ((Alexander et al., 2000. J Immunol 164: 1625–1633). For expression purposes, a derivative having the sequence AKFVAAWTLKAAAARY is preferably used.
Предпочтительная рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая экспрессионную кассету согласно данному изобретению, предпочтительно дополнительно содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую убиквитин, предпочтительно - на 5'-конце полиэпитопа. Слияние убиквитина с полиэпитопом, содержащим Т-клеточные антигены, усиливает нацеливание на протеасомы, что приводит к улучшенному процессингу полиэпитопа и усилению Т-клеточных ответов.A preferred recombinant nucleic acid molecule comprising an expression cassette according to the invention preferably further comprises a nucleotide sequence encoding ubiquitin, preferably at the 5' end of the polyepitope. Fusion of ubiquitin to a polyepitope comprising T-cell antigens enhances targeting to proteasomes, resulting in improved processing of the polyepitope and enhanced T-cell responses.
Предпочтительная рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, представленную на Фиг. 1В.A preferred recombinant nucleic acid molecule comprises the nucleotide sequence shown in Fig. 1B.
4.3 Вирусные частицы4.3 Viral particles
В данном изобретении также представлена вирусная частица, которая содержит рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую экспрессионную кассету, кодирующую полиэпитоп, который содержит Т-клеточные антигены из белков вируса африканской чумы свиней согласно данному изобретению.The present invention also provides a viral particle that comprises a recombinant nucleic acid molecule comprising an expression cassette encoding a polyepitope that comprises T-cell antigens from African swine fever virus proteins according to the present invention.
В данном изобретении также представлена вирусная частица, содержащая рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, которая экспрессирует В-клеточные антигены вируса африканской чумы свиней. Указанные В-клеточные антигены предпочтительно выбраны из белков р30, р54, р72, EP402R (pEP402R), A104R (pA104R) и (или) B602L (pB602L) из вируса африканской чумы свиней. Специалист в данной области понимает, что термин «белок EP402R» относится к pEP402R; термин «белок A104R» относится к pA104R; и термин «белок B602L» относится к pB602L. Указанные В-клеточные антигены предпочтительно содержат аминокислотную последовательность белков р30, р54, р72, EP402R, A104R и (или) B602L из вируса африканской чумы свиней, предпочтительно содержат по существу полные аминокислотные последовательности белков р30, р54, р72, EP402R, A104R и (или) B602L из вируса африканской чумы свиней. Примеры таких аминокислотных последовательностей предоставлены под номером доступа UniProt Р34204 (P30_ASFB7) для фосфопротеина р30 из штамма Badajoz 1971; под номером доступа UniProt Q65194 для белка оболочки р54 из штамма Badajoz 1971; под номером доступа UniProt Р22776 для основного капсидного белка р70 из штамма Badajoz 1971; под номером доступа UniProt Q89501 для СП2-гомолога EP402R из штамма Badajoz 1971; под номером доступа UniProt Р68742 для вирусного гистоноподобного белка A104R из штамма Badajoz 1971; и под номером доступа UniProt Q65169 для белка B602L из штамма Badajoz 1971.The present invention also provides a viral particle comprising a recombinant nucleic acid molecule that expresses B-cell antigens of African swine fever virus. Said B-cell antigens are preferably selected from the proteins p30, p54, p72, EP402R (pEP402R), A104R (pA104R) and/or B602L (pB602L) of African swine fever virus. One skilled in the art will understand that the term "EP402R protein" refers to pEP402R; the term "A104R protein" refers to pA104R; and the term "B602L protein" refers to pB602L. Said B-cell antigens preferably comprise the amino acid sequence of the p30, p54, p72, EP402R, A104R and/or B602L proteins from African swine fever virus, preferably comprise substantially the complete amino acid sequences of the p30, p54, p72, EP402R, A104R and/or B602L proteins from African swine fever virus. Examples of such amino acid sequences are provided under UniProt accession number P34204 (P30_ASFB7) for the p30 phosphoprotein from the Badajoz 1971 strain; under UniProt accession number Q65194 for the p54 envelope protein from the Badajoz 1971 strain; under UniProt accession number P22776 for the p70 major capsid protein from the Badajoz 1971 strain; under UniProt accession number Q89501 for the SP2 homologue EP402R from the Badajoz 1971 strain; under UniProt accession number P68742 for the viral histone-like protein A104R from the Badajoz 1971 strain; and under UniProt accession number Q65169 for the B602L protein from the Badajoz 1971 strain.
Указанные В-клеточные антигены предпочтительно экспрессируются с использованием тандемных экспрессионных кассет, например, для экспрессии р30 и B602L; р72 и A104R) и (или) р54 и EP402R, или тройных экспрессионных кассет, например, для экспрессии экспрессионных кассет р54 и EP402R, и K205R). Конструкции ДНК, кодирующие В-клеточные антигены, могут быть получены синтетическим способом, например, получены из GenScript, как известно специалисту в данной области. Области, кодирующие В-клеточные антигены, предпочтительно клонируются с различными промоторами MVA и последовательностями терминации транскрипции для управления экспрессией данных генов. Кроме того, указанные В-клеточные антигены предпочтительно снабжены последовательностью метки, позволяющей обнаруживать экспрессию белка. Подходящие метки включают в себя метку 6xHis, домен c-myc (EQKLISEEDL), гемагглютининовую метку (YPYDVPDYA), мальтозосвязывающий белок, глутатион-D-трансферазу, мальтозосвязывающий белок, пептидную метку FLAG, пептид-акцептор биотина, стрептавидин-связывающий пептид и кальмодулин-связывающий пептид, как представлено в Chatterjee, 2006. Cur Opin Biotech 17, 353 - 358. Метка FLAG представляет собой предпочтительную метку. Указанная метка предпочтительно присутствует на С-конце В-клеточного антигена.Said B-cell antigens are preferably expressed using tandem expression cassettes, for example for the expression of p30 and B602L; p72 and A104R) and/or p54 and EP402R, or triple expression cassettes, for example for the expression of the p54 and EP402R, and K205R) expression cassettes. DNA constructs encoding B-cell antigens can be obtained synthetically, for example obtained from GenScript, as known to those skilled in the art. The regions encoding B-cell antigens are preferably cloned with different MVA promoters and transcription termination sequences to drive the expression of these genes. In addition, said B-cell antigens are preferably provided with a tag sequence allowing detection of protein expression. Suitable tags include 6xHis tag, c-myc domain (EQKLISEEDL), hemagglutinin tag (YPYDVPDYA), maltose binding protein, glutathione D-transferase, maltose binding protein, FLAG peptide tag, biotin acceptor peptide, streptavidin binding peptide and calmodulin binding peptide as described in Chatterjee, 2006. Cur Opin Biotech 17, 353-358. FLAG tag is a preferred tag. Said tag is preferably present at the C-terminus of the B cell antigen.
Вирусные частицы, которые могут быть использованы в качестве векторов для переноса указанных рекомбинантных молекул нуклеиновой кислоты, предпочтительно - молекул ДНК, включают в себя частицы на основе аденоассоциированного вируса, лентивируса, например, вектор на основе ретровируса, такой как вектор на основе вируса мышиного лейкоза Молони, вируса некроза селезенки SFFV, вируса миелопролиферативной саркомы, вируса стволовых клеток мыши или гаммаретровируса SFG (Riviere et al., 1995. PNAS 92: 6733 - 6737), аденовируса, вируса простого герпеса, поксвируса, такого как модифицированный вирус осповакцины Анкара (MVA; Mackowiak et al., 1999. Adv Vet Med 41: 571-583; Cottingham et al., 2008. PLoS One 20: el638) или поксвируса канареек, аренавируса, вируса кори, вируса болезни Ньюкасла [Kortekaas et al., 2010. Vaccine 28: 2271-2276) и (или) буньявируса, такого как вирус лихорадки Рифт-Валли (Wichgers Schreur et al., 2014. J Virol 88: 10883 - 10893).Viral particles that can be used as vectors for the transfer of said recombinant nucleic acid molecules, preferably DNA molecules, include those based on an adeno-associated virus, a lentivirus, for example a retrovirus vector such as a vector based on Moloney murine leukemia virus, spleen necrosis virus SFFV, myeloproliferative sarcoma virus, mouse stem cell virus or gammaretrovirus SFG (Riviere et al., 1995. PNAS 92: 6733 - 6737), adenovirus, herpes simplex virus, poxvirus such as modified vaccinia virus Ankara (MVA; Mackowiak et al., 1999. Adv Vet Med 41: 571-583; Cottingham et al., 2008. PLoS One 20: el638) or canary poxvirus, arenavirus, measles virus, Newcastle disease virus [Kortekaas et al., 2010. Vaccine 28: 2271-2276) and/or bunyavirus such as Rift Valley fever virus (Wichgers Schreur et al., 2014. J Virol 88: 10883 - 10893).
Предпочтительная вирусная частица основана на поксвирусе. Указанная вирусная частица предпочтительно представляет собой частицу на основе модифицированного вируса осповакцины Анкара (MVA), такую как описано в Cottingham et al., 2008. PLoS One 20: e1638). Предпочтительная экспрессионная кассета в MVA содержит последовательность промотора MVA 13.5, как описано, например, в US20150299267. Экспрессионная кассета предпочтительно вставлена в ген ТК вакцинного вектора MVA (аттенуированная натуральная оспа) с помощью рекомбинации с искусственной бактериальной хромосомой (ИБХ, англ. «ВАС») в соответствии с процедурами, известными специалисту в данной области.A preferred viral particle is based on a poxvirus. Said viral particle is preferably a particle based on a modified vaccinia virus Ankara (MVA), such as described in Cottingham et al., 2008. PLoS One 20: e1638). A preferred expression cassette in MVA comprises the MVA 13.5 promoter sequence, as described, for example, in US20150299267. The expression cassette is preferably inserted into the TK gene of the MVA (attenuated smallpox) vaccine vector by recombination with a bacterial artificial chromosome (BAC) according to procedures known to those skilled in the art.
Указанная вирусная частица предпочтительно продуцируется в эукариотической клетке. Указанная эукариотическая клетка предпочтительно представляет собой клетку, которую можно легко инфицировать и (или) трансфицировать с использованием стандартных способов, известных специалисту в данной области, такие как, например, клетки дрожжей и клетки фибробластов курицы. Указанная эукариотическая клетка предпочтительно представляет собой клетку насекомого или клетку млекопитающего. Подходящие клетки насекомых включают в себя, например, клетки яичников Spodoptera frugiperda, такие как Sf9 и Sr21, клетки Drosophila Schneider 2 и клетки Aedes albopictus С6/36. Подходящие клетки млекопитающих включают в себя, например, клетки почки новорожденного хомяка, клетки эмбриональной почки человека, такие как НЕК293 и клетки FreeStyle HEK293F™ (ThermoFisher Scientific), клетки Vero, клетки MDCK, клетки СНО, клетки HeLa и клетки PER.C6 (Fallaux, F. J. et al. 1998. Hum Gene Ther 9: 1909 - 1917). Предпочтительные клетки представляют собой клетки эмбриональной почки человека, такие как клетки НЕК293 и клетки FreeStyle HEK293F™.Said virus particle is preferably produced in a eukaryotic cell. Said eukaryotic cell is preferably a cell that can be easily infected and/or transfected using standard methods known to a person skilled in the art, such as, for example, yeast cells and chicken fibroblast cells. Said eukaryotic cell is preferably an insect cell or a mammalian cell. Suitable insect cells include, for example, Spodoptera frugiperda ovary cells such as Sf9 and Sr21, Drosophila Schneider 2 cells and Aedes albopictus C6/36 cells. Suitable mammalian cells include, for example, baby hamster kidney cells, human embryonic kidney cells such as HEK293 and FreeStyle HEK293F™ cells (ThermoFisher Scientific), Vero cells, MDCK cells, CHO cells, HeLa cells, and PER.C6 cells (Fallaux, F. J. et al. 1998. Hum Gene Ther 9: 1909 - 1917). Preferred cells are human embryonic kidney cells such as HEK293 cells and FreeStyle HEK293F™ cells.
В одном варианте реализации данного изобретения указанная вирусная частица дополнительно содержит маркерный белок. Указанный маркерный белок позволяет идентифицировать свиней, которые получили вирусную частицу в соответствии с данным изобретением. Указанный маркерный белок позволяет отличить вакцинированную свинью от свиньи, инфицированной вирусом АЧС дикого типа. Указанный маркерный белок предпочтительно представляет собой флуоресцентный белок, бета-глюкуронидазу, бета-галактозидазу, люциферазу гауссии, люциферазу рениллы и (или) секретируемую щелочную фосфатазу. Специалисту в данной области будет понятно, что кодирующая последовательность для указанного маркерного белка присутствует в геноме вирусной частицы согласно данному изобретению, таким образом, что маркерный белок экспрессируется в клетке, которая получила вирусную частицу согласно данному изобретению.In one embodiment of the present invention, said viral particle further comprises a marker protein. Said marker protein allows identifying pigs that have received a viral particle according to the present invention. Said marker protein allows distinguishing a vaccinated pig from a pig infected with the wild-type ASF virus. Said marker protein is preferably a fluorescent protein, beta-glucuronidase, beta-galactosidase, Gaussian luciferase, Renilla luciferase and/or secreted alkaline phosphatase. A person skilled in the art will understand that the coding sequence for said marker protein is present in the genome of the viral particle according to the present invention, such that the marker protein is expressed in a cell that has received the viral particle according to the present invention.
В данном изобретении также представлен набор вирусных частиц, содержащих В-клеточные антигены вируса африканской чумы свиней.The present invention also provides a set of viral particles comprising B-cell antigens of African swine fever virus.
В данном изобретении также представлен набор вирусных частиц, включающий в себя вирусную частицу, содержащую рекомбинантную молекулу по любому из пп. 1-5, и одну или несколько вирусных частиц, содержащих В-клеточные антигены вируса африканской чумы свиней, предпочтительно - выбранные из белков р30, р54, р72, EP402R, A104R и (или) B602L из вируса африканской чумы свиней.The present invention also provides a set of viral particles comprising a viral particle comprising a recombinant molecule according to any one of claims 1-5 and one or more viral particles comprising B-cell antigens of African swine fever virus, preferably selected from proteins p30, p54, p72, EP402R, A104R and/or B602L from African swine fever virus.
В данном изобретении также представлен набор компонентов, включающий в себя вирусные частицы, содержащие В-клеточные антигены вируса африканской чумы свиней.The present invention also provides a set of components comprising viral particles containing B-cell antigens of the African swine fever virus.
Указанные В-клеточные антигены предпочтительно выбраны из белков р30, р54, р72, EP402R, A104R и (или) B602L из вируса африканской чумы свиней. Указанные В-клеточные антигены предпочтительно содержат аминокислотную последовательность белков р30, р54, р72, EP402R, A104R и (или) B602L из вируса африканской чумы свиней, предпочтительно содержат по существу полные аминокислотные последовательности белков р30, р54, р72, EP402R, A104R и (или) B602L из вируса африканской чумы свиней. Примеры таких аминокислотных последовательностей предоставлены под номером доступа UniProt Р34204 (P30_ASFB7) для фосфопротеина р30 из штамма Badajoz 1971; под номером доступа UniProt Q65194 для белка оболочки р54 из штамма Badajoz 1971; под номером доступа UniProt Р22776 для основного капсидного белка р70 из штамма Badajoz 1971; под номером доступа UniProt Q89501 для СП2-гомолога EP402R из штамма Badajoz 1971; под номером доступа UniProt Р68742 для вирусного гистоноподобного белка A104R из штамма Badajoz 1971; и под номером доступа UniProt Q65169 для белка B602L из штамма Badajoz 1971.Said B-cell antigens are preferably selected from the proteins p30, p54, p72, EP402R, A104R and/or B602L from African swine fever virus. Said B-cell antigens preferably comprise the amino acid sequence of the proteins p30, p54, p72, EP402R, A104R and/or B602L from African swine fever virus, preferably comprise substantially the complete amino acid sequences of the proteins p30, p54, p72, EP402R, A104R and/or B602L from African swine fever virus. Examples of such amino acid sequences are provided under UniProt accession number P34204 (P30_ASFB7) for the phosphoprotein p30 from the Badajoz 1971 strain; under UniProt accession number Q65194 for the p54 coat protein from the Badajoz 1971 strain; under UniProt accession number P22776 for the p70 major capsid protein from the Badajoz 1971 strain; under UniProt accession number Q89501 for the SP2 homologue EP402R from the Badajoz 1971 strain; under UniProt accession number P68742 for the viral histone-like protein A104R from the Badajoz 1971 strain; and under UniProt accession number Q65169 for the B602L protein from the Badajoz 1971 strain.
В данном изобретении также представлен набор компонентов, включающий в себя вирусную частицу, которая содержит рекомбинантную молекулу, содержащую экспрессионную кассету, которая кодирует полиэпитоп, содержащий Т-клеточные антигены из белков вируса африканской чумы свиней согласно данному изобретению, и одну или несколько вирусных частиц, содержащих В-клеточные антигены вируса африканской чумы свиней, предпочтительно - выбранные из белков р30, р54, р72, EP402R, A104R и (или) B602L из вируса африканской чумы свиней согласно данному изобретению.The present invention also provides a set of components comprising a viral particle that comprises a recombinant molecule comprising an expression cassette that encodes a polyepitope comprising T-cell antigens from African swine fever virus proteins according to the present invention, and one or more viral particles comprising B-cell antigens of African swine fever virus, preferably selected from proteins p30, p54, p72, EP402R, A104R and/or B602L from African swine fever virus according to the present invention.
В данном изобретении также представлен набор компонентов, включающий в себя вирусную частицу, которая содержит рекомбинантную молекулу, содержащую экспрессионную кассету, которая кодирует полиэпитоп, содержащий Т-клеточные антигены из белков вируса африканской чумы свиней согласно данному изобретению и синтетические Т-клеточные антигены из белков вируса африканской чумы свиней.The present invention also provides a set of components comprising a viral particle that contains a recombinant molecule containing an expression cassette that encodes a polyepitope comprising T-cell antigens from African swine fever virus proteins according to the present invention and synthetic T-cell antigens from African swine fever virus proteins.
4.4 Способы стимуляции иммунного ответа у свиньи4.4 Methods of stimulating the immune response in pigs
В данном изобретении представлен способ стимуляции иммунного ответа у свиньи, включающий в себя введение рекомбинантной молекулы согласно данному изобретению и (или) вирусной частицы согласно данному изобретению свинье в количестве, эффективном для индукции иммунного ответа.The present invention provides a method for stimulating an immune response in a pig, comprising administering a recombinant molecule according to the present invention and/or a viral particle according to the present invention to a pig in an amount effective to induce an immune response.
В данном изобретении представлен способ стимуляции иммунного ответа у свиньи, включающий в себя введение рекомбинантной молекулы по любому из пп. 1-5 и (или) вирусной частицы по п. 6 или п. 7 в комбинации с вирусной частицей, содержащей В-клеточные антигены вируса африканской чумы свиней, предпочтительно - выбранные из белков р30, р54, р72, EP402R, A104R и (или) B602L из вируса африканской чумы свиней, свинье в количестве, эффективном для индукции иммунного ответа.The present invention provides a method for stimulating an immune response in a pig, comprising administering a recombinant molecule according to any one of claims 1-5 and/or a viral particle according to claim 6 or claim 7 in combination with a viral particle containing B-cell antigens of African swine fever virus, preferably selected from proteins p30, p54, p72, EP402R, A104R and/or B602L from African swine fever virus, to a pig in an amount effective for inducing an immune response.
Рекомбинантная молекула согласно данному изобретению и (или) вирусная частица согласно данному изобретению предпочтительно содержатся в композиции, предпочтительно - в фармацевтической композиции.The recombinant molecule according to the present invention and/or the viral particle according to the present invention are preferably contained in a composition, preferably in a pharmaceutical composition.
Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты и (или) вирусная частица могут быть введены свинье любым способом, известным специалисту в данной области, включая инъекцию, пластыри для местной пассивной диффузии или ионтофореза, электропорацию, термическую микропорацию, назальные распылители, аэрозольную верхне-респираторную и легочную ингаляцию, сонопорацию, химические вещества и механическую абразию, а также кинетическую/ баллистическую доставку [Weniger et al., 2018. Vaccine 36: 427-437].The recombinant nucleic acid molecule and/or viral particle may be administered to the pig by any method known to one of skill in the art, including injection, topical passive diffusion or iontophoresis patches, electroporation, thermal microporation, nasal nebulizers, aerosol upper respiratory and pulmonary inhalation, sonoporation, chemicals and mechanical abrasion, and kinetic/ballistic delivery [Weniger et al., 2018. Vaccine 36: 427-437].
Предпочтительно, рекомбинантную молекула нуклеиновой кислоты и (или) вирусная частицу вводится/ вводятся парентерально, например, путем инъекции. Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты и (или) вирусная частица согласно данному изобретению предпочтительно формулируются с обычными нетоксичными фармацевтически приемлемыми переносчиками, адъювантами или носителями. Термин «парентерально», при употреблении в контексте данного документа, включает в себя подкожные, внутрикожные или интрадермальные, внутривенные, внутримышечные, интраартикулярные, интрасиновиальные, внутригрудинные, интратекальные, внутриочаговые и внутричерепные инъекции или методики инфузии.Preferably, the recombinant nucleic acid molecule and/or the viral particle is/are administered parenterally, such as by injection. The recombinant nucleic acid molecule and/or the viral particle according to the invention are preferably formulated with conventional non-toxic pharmaceutically acceptable carriers, adjuvants or vehicles. The term "parenterally", as used herein, includes subcutaneous, intradermal or intradermal, intravenous, intramuscular, intra-articular, intrasynovial, intrasternal, intrathecal, intralesional and intracranial injections or infusion techniques.
Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты согласно данному изобретению более предпочтительно вводится свиньям путем электропорации, более предпочтительно - путем внутримышечной/ внутрикожной электропорации. Электропорация может быть выполнена с использованием, например, набора электродов, состоящего из набора позолоченных троакарных игл диаметром 0,43 мм с расстоянием 1,5 мм между ними (Inovio Pharmaceuticals, Плимут Митинг, Пенсильвания, США), который прижимается к кожному пузырьку, образованному по методу Манту путем введения 50 мкл плазмидного состава, с воздействием импульсами по 25 В длительностью по 100 мс; портативного генератора импульсов (CUY21 EDIT; Nepa Gene, Итикава, Япония) и пинцетных электродов (6 импульсов по 10 мс с выходным током 300-600 мА); генератора импульсов ВТХ ЕСМ 830 с безыгольным микропатчевым круглым электродом, установленным на ручке (модель MP 35) (Genetronics, Сан-Диего, Калифорния, США), и с воздействием шестью прямоугольными импульсами в 60, 70 или 80 В, соответственно, с длительность импульса в 60 мс, интервалом между импульсами в 200 мс и обращением полярности после трех импульсов.The recombinant nucleic acid molecule of the present invention is more preferably administered to pigs by electroporation, more preferably by intramuscular/intradermal electroporation. Electroporation can be performed using, for example, an electrode set consisting of a set of gold-plated trocar needles of 0.43 mm diameter with a distance of 1.5 mm between them (Inovio Pharmaceuticals, Plymouth Meeting, PA, USA), which is pressed against the skin vesicle formed by the Mantoux method by introducing 50 μl of the plasmid composition, with an effect of 25 V pulses of 100 ms duration; a portable pulse generator (CUY21 EDIT; Nepa Gene, Ichikawa, Japan) and pincer electrodes (6 pulses of 10 ms with an output current of 300-600 mA); pulse generator BTX ECM 830 with a needle-free micropatch round electrode mounted on a handle (model MP 35) (Genetronics, San Diego, California, USA), and with exposure to six rectangular pulses of 60, 70 or 80 V, respectively, with a pulse duration of 60 ms, an interval between pulses of 200 ms and polarity reversal after three pulses.
В другом предпочтительном способе используется внутримышечное введение в правое бедро в два участка на расстоянии примерно трех сантиметров друг от друга в объеме 0,25 мл на одно место инъекции. Сразу после инъекции может быть применена процедура электропорации in vivo с использованием клинипоратора (IGEA) с линейными/ гексагональными игольчатыми электродами в месте инъекции. Расстояние между иглами предпочтительно составляет около 2 см, а электропоратор предпочтительно установлен на 100 В. Электрический ток в 50 В/см используется для поддержания средней силы тока в 0,6 А. Производят воздействие импульсами, применяя от двух до двадцати импульсов, предпочтительно - от пяти до десяти импульсов, предпочтительно - около восьми импульсов, длительностью около 5-50 миллисекунд, предпочтительно - около 20 миллисекунд, с интервалами в 50-500 миллисекунд, предпочтительно - около 200 миллисекунд.Another preferred method uses intramuscular injection into the right thigh at two sites approximately three centimeters apart in a volume of 0.25 ml per injection site. Immediately after the injection, an in vivo electroporation procedure can be applied using a cliniporator (IGEA) with linear/hexagonal needle electrodes at the injection site. The distance between the needles is preferably about 2 cm, and the electroporator is preferably set to 100 V. An electric current of 50 V/cm is used to maintain an average current of 0.6 A. The effect is produced in pulses, applying from two to twenty pulses, preferably from five to ten pulses, preferably about eight pulses, of about 5-50 milliseconds, preferably about 20 milliseconds, at intervals of 50-500 milliseconds, preferably about 200 milliseconds.
Указанное введение предпочтительно повторяют, предпочтительно 1-3 раза, таким образом, чтобы рекомбинантная молекула и (или) вирусная частица вводилась в общей сложности 2-4 раза. Повторное введение предпочтительно проводить с интервалами около 2 недель.Said administration is preferably repeated, preferably 1-3 times, so that the recombinant molecule and/or viral particle is administered a total of 2-4 times. Repeated administration is preferably carried out at intervals of about 2 weeks.
Защитный иммунный ответ может потребовать как клеточного, так и серологического иммунитета. Следовательно, в предпочтительном способе стимуляции иммунного ответа у свиньи по меньшей мере одно из введений рекомбинантной молекулы и (или) вирусной частицы комбинируется с введением синтетических пептидов, содержащих Т-клеточные антигены из белков вируса африканской чумы свиней, предпочтительно - 2-50 пептидов, более предпочтительно - около 10-30 пептидов, например, около 20 пептидов, например, 18 пептидов, 19 пептидов, 20 пептидов и 21 пептид.A protective immune response may require both cellular and serological immunity. Therefore, in a preferred method for stimulating an immune response in a pig, at least one of the administration of a recombinant molecule and/or a viral particle is combined with the administration of synthetic peptides comprising T-cell antigens from African swine fever virus proteins, preferably 2-50 peptides, more preferably about 10-30 peptides, such as about 20 peptides, such as 18 peptides, 19 peptides, 20 peptides and 21 peptides.
Указанные пептиды, содержащие Т-клеточные антигены, предпочтительно представляют собой пептиды из 6-15 аминокислотных остатков, предпочтительно - из 8-11 аминокислотных остатков, более предпочтительно - из около 9 аминокислотных остатков. Предпочтительные пептиды выбраны из пептидов, представленных в Таблице 1.Said peptides containing T-cell antigens are preferably peptides of 6-15 amino acid residues, preferably of 8-11 amino acid residues, more preferably of about 9 amino acid residues. Preferred peptides are selected from the peptides presented in Table 1.
Указанные пептиды предпочтительно вводят парентерально, например, путем инъекции, более предпочтительно - путем внутримышечной инъекции.The said peptides are preferably administered parenterally, for example by injection, more preferably by intramuscular injection.
В предпочтительном способе стимуляции иммунного ответа у свиньи по меньшей мере одно из введений рекомбинантной молекулы и (или) вирусной частицы комбинируется с введением вирусной частицы, содержащей В-клеточные антигены вируса африканской чумы свиней, предпочтительно - выбранные из белков р30, р54, р72, EP402R, A104R и (или) B602L из вируса африканской чумы свиней.In a preferred method for stimulating an immune response in a pig, at least one of the administrations of a recombinant molecule and/or a viral particle is combined with the administration of a viral particle containing B-cell antigens of the African swine fever virus, preferably selected from the proteins p30, p54, p72, EP402R, A104R and/or B602L from the African swine fever virus.
Количество вирусной частицы согласно данному изобретению, которое вводится свинье, обычно находится в диапазоне от 1000 до 1000000000 инфекционных вирусных частиц на одно животное. Количество инфекционных частиц может быть определено с использованием стандартных методик, известных специалисту в данной области, таких как, например, кривая доза - эффект.The amount of the viral particle according to the invention that is administered to a pig is typically in the range of 1,000 to 1,000,000,000 infectious viral particles per animal. The amount of infectious particles can be determined using standard techniques known to those skilled in the art, such as, for example, a dose-response curve.
В данном изобретении также представлена композиция, предпочтительно - ветеринарно приемлемая композиция, содержащая рекомбинантную молекулу и (или) вирусную частицу согласно данному изобретению, и ветеринарно приемлемый эксципиент.The present invention also provides a composition, preferably a veterinarily acceptable composition, comprising a recombinant molecule and/or a viral particle according to the present invention and a veterinarily acceptable excipient.
Указанная композиция предпочтительно представляет собой водную или масляную суспензию. Эта суспензия может быть составлена в соответствии с методиками, известными в данной области, с использованием подходящих диспергирующих или смачивающих агентов (таких как, например, Tween 80) и суспендирующих агентов. Среди приемлемых носителей и растворителей, которые могут быть использованы, следует указать маннит, воду, раствор Рингера и изотонический раствор хлорида натрия. Кроме того, стерильные нелетучие масла традиционно используются в качестве растворителя или суспендирующей среды. Для этой цели можно использовать любое мягкое нелетучее масло, включая синтетические моно- или диглицериды. Жирные кислоты, такие как олеиновая кислота и ее глицеридные производные, являются полезными для приготовления подходящей композиции, так же как и натуральные фармацевтически приемлемые масла, такие как оливковое масло или касторовое масло, особенно в их полиоксиэтилированных формах. Эти масляные растворы или суспензии могут также содержать длинноцепочечный спирт в качестве разбавителя или диспергатора, или аналогичный спирт, как описано в Pharmacopoea Helvetica.Said composition is preferably an aqueous or oily suspension. This suspension can be formulated according to techniques known in the art using suitable dispersing or wetting agents (such as, for example, Tween 80) and suspending agents. Among the acceptable carriers and solvents that can be used are mannitol, water, Ringer's solution and isotonic sodium chloride solution. In addition, sterile fixed oils are conventionally used as a solvent or suspending medium. Any bland fixed oil can be used for this purpose, including synthetic mono- or diglycerides. Fatty acids such as oleic acid and its glyceride derivatives are useful for the preparation of a suitable composition, as are natural pharmaceutically acceptable oils such as olive oil or castor oil, especially in their polyoxyethylated forms. These oily solutions or suspensions may also contain a long-chain alcohol as a diluent or dispersing agent, or a similar alcohol as described in Pharmacopoea Helvetica.
В данном изобретении также представлена вакцина, содержащая эффективное иммунизирующее количество композиции, содержащей рекомбинантную молекулу и (или) вирусную частицу согласно данному изобретению, и ветеринарно приемлемый эксципиент. Указанная вакцина предпочтительно дополнительно содержит вирусную частицу, содержащую В-клеточные антигены вируса африканской чумы свиней, предпочтительно - выбранные из белков р30, р54, р72, EP402R, A104R и (или) B602L из вируса африканской чумы свиней.The present invention also provides a vaccine comprising an effective immunizing amount of a composition comprising a recombinant molecule and/or a viral particle according to the present invention and a veterinarily acceptable excipient. Said vaccine preferably further comprises a viral particle comprising B-cell antigens of the African swine fever virus, preferably selected from the proteins p30, p54, p72, EP402R, A104R and/or B602L from the African swine fever virus.
Композиция, содержащая вирусную частицу согласно данному изобретению, предпочтительно дополнительно содержит адъюванты, включая цитокины, такие как интерферон-гамма, иммуностимулирующие последовательности нуклеиновых кислот, такие как олигонуклеотиды CpG, липосомы, вирусоподобные частицы, поверхностно-активные вещества, такие как гексадециламин, полианионы, такие как пиран и сульфат декстрана.The composition comprising the viral particle according to the present invention preferably further comprises adjuvants, including cytokines such as interferon-gamma, immunostimulatory nucleic acid sequences such as CpG oligonucleotides, liposomes, virus-like particles, surfactants such as hexadecylamine, polyanions such as pyran and dextran sulfate.
Предпочтительный адъювант представляет собой ISCOM, как описано в международной заявке на патент WO2002026255A1. Технология ISCOM имеет ряд преимуществ перед другими адъювантами. ISCOM стимулируют как гуморальный, так и клеточно-опосредованный иммунный ответ.ISCOM представляет собой высокоэффективный адъювант, позволяющий дополнительно снизить количества и и активированного компонента или его части в соответствии с данным изобретением. Предпочтительный ISCOM представляет собой ISCOM Matrix-M.A preferred adjuvant is ISCOM as described in international patent application WO2002026255A1. ISCOM technology has a number of advantages over other adjuvants. ISCOM stimulates both humoral and cell-mediated immune response. ISCOM is a highly effective adjuvant that allows further reduction of the amounts of and and the activated component or part thereof according to the invention. A preferred ISCOM is ISCOM Matrix-M.
Другой предпочтительный адъювант представляет собой BLP. BLP представляют собой самоадъювантные носители для доставки вакцины, полученные из инактивированных бактерий Lactococcus lactis. L. lactis - это безопасная бактерия, обычно используемая в пищевой промышленности, например, для производства сыра и пробиотических напитков. BLP производятся простой обработкой горячей кислотой, в результате чего получается прочный матрикс клеточной формы, который преимущественно состоит из пептидогликановой поверхности. Указанный пептидогликан предпочтительно содержит С-концевой пептидогликан-связывающий домен LysM гидролазы АстА из клеточной стенки Lactococcus lactis, как описано в WO 2010/033031. Данная поверхность вызывает длительный иммунитет, необходимый для защиты от болезнетворных патогенов. Неживая природа частиц BLP обеспечивает их точную дозировку без риска распространения.Another preferred adjuvant is a BLP. BLPs are self-adjuvanted vaccine delivery vehicles derived from inactivated Lactococcus lactis bacteria. L. lactis is a safe bacterium commonly used in the food industry, such as for the production of cheese and probiotic drinks. BLPs are produced by a simple hot acid treatment, resulting in a robust cell-shaped matrix that predominantly consists of a peptide glycan surface. Said peptide glycan preferably comprises the C-terminal peptide glycan-binding domain of LysM hydrolase ActA from the cell wall of Lactococcus lactis, as described in WO 2010/033031. This surface induces long-lasting immunity necessary for protection against disease-causing pathogens. The non-living nature of the BLP particles allows for their precise dosing without the risk of dissemination.
BLP также обеспечивают безопасную и универсальную основу, которая может быть эффективно загружена конкретными выбранными антигенами, например, одной или несколькими вирусными частицами согласно данному изобретению, содержащими Т-клеточные антигены и (или) В-клеточные антигены вируса африканской чумы свиней. Полная загрузка BLP антигенами достигается с помощью технологии нековалентного связывания, как описано в WO 2010/033031. Данная технология позволяет просто смешивать слитый антиген с BLP, что приводит к надежному и немедленному связыванию антигена с поверхностью этих частиц. Полученные в результате BLP, покрытые антигеном, предпочтительно доставляют свинье через слои слизистой оболочки носа (спрей) или рта (капсула) без необходимости инъекции.BLPs also provide a safe and versatile base that can be efficiently loaded with specific selected antigens, such as one or more viral particles according to the invention comprising T-cell antigens and/or B-cell antigens of African swine fever virus. Full loading of BLPs with antigens is achieved using non-covalent binding technology as described in WO 2010/033031. This technology allows for simple mixing of the fusion antigen with BLPs, resulting in reliable and immediate binding of the antigen to the surface of these particles. The resulting antigen-coated BLPs are preferably delivered to the pig via the mucosal layers of the nose (spray) or mouth (capsule) without the need for injection.
В данном изобретении также представлен способ профилактики или ослабления инфекции и (или) распространения у свиней вируса африканской чумы свиней, включающий в себя введение рекомбинантной молекулы, содержащей экспрессионную кассету, кодирующую полиэпитоп, который содержит Т-клеточные антигены из белков вируса африканской чумы свиней, и (или) вирусной частицы, содержащей указанную рекомбинантную молекулу, по меньшей мере, одной свинье. Указанное введение рекомбинантной молекулы и (или) вирусной частицы предпочтительно комбинируется с введением вирусной частицы, содержащей В-клеточные антигены вируса африканской чумы свиней, предпочтительно - выбранные из белков р30, р54, р72, EP402R, A104R и (или) B602L из вируса африканской чумы свиней.The present invention also provides a method for preventing or reducing infection and/or spread of African swine fever virus in pigs, comprising administering a recombinant molecule comprising an expression cassette encoding a polyepitope that comprises T-cell antigens from African swine fever virus proteins and/or a viral particle comprising said recombinant molecule to at least one pig. Said administration of the recombinant molecule and/or viral particle is preferably combined with administration of a viral particle comprising B-cell antigens of African swine fever virus, preferably selected from proteins p30, p54, p72, EP402R, A104R and/or B602L from African swine fever virus.
Указанный способ обеспечивает защиту от последующего инфицирования вирулентным вирусом дикого типа африканской чумы свиней. Защита определяется как выживание и отсутствие клинических проявлений заболевания, а также сокращение дальнейшего распространения вируса дикого типа любым путем, включая горизонтальное и вертикальное распространение. Время до наступления защиты и длительная защита являются частью эффективности вакцины. Кроме того, широкая защита от различных видов или серотипов вируса также является частью эффективности вакцины в соответствии с данным изобретением.The method provides protection against subsequent infection with a virulent wild-type African swine fever virus. Protection is defined as survival and absence of clinical manifestations of the disease, as well as reduction of further spread of the wild-type virus by any means, including horizontal and vertical spread. The time to onset of protection and long-term protection are part of the efficacy of the vaccine. In addition, broad protection against different species or serotypes of the virus is also part of the efficacy of the vaccine according to the invention.
В данном изобретении также представлена вирусная частица, содержащая Т-клеточные антигены, предпочтительно содержащая экспрессионную кассету, которая кодирует полиэпитоп, содержащий Т-клеточные антигены из белков вируса африканской чумы свиней, или В-клеточные антигены вируса африканской чумы свиней, или набор вирусных частиц, содержащих Т-клеточные антигены и В-клеточные антигены вируса африканской чумы свиней, для применения в способе защиты свиньи от последующего инфицирования вирусом африканской чумы свиней.The present invention also provides a viral particle comprising T-cell antigens, preferably comprising an expression cassette that encodes a polyepitope comprising T-cell antigens from African swine fever virus proteins, or B-cell antigens of African swine fever virus, or a set of viral particles comprising T-cell antigens and B-cell antigens of African swine fever virus, for use in a method for protecting a pig from subsequent infection with African swine fever virus.
В данном изобретении также представлен набор компонентов, включающий в себя вирусные частицы, содержащие Т-клеточные антигены, предпочтительно содержащие экспрессионную кассету, которая кодирует полиэпитоп, содержащий Т-клеточные антигены из белков вируса африканской чумы свиней, и В-клеточные антигены вируса африканской чумы свиней, для применения в способе защиты свиньи от последующего заражения вирусом африканской чумы свиней.The present invention also provides a set of components comprising viral particles containing T-cell antigens, preferably containing an expression cassette that encodes a polyepitope comprising T-cell antigens from African swine fever virus proteins and B-cell antigens of African swine fever virus, for use in a method for protecting a pig from subsequent infection with African swine fever virus.
В целях ясности и для краткого описания отличительные признаки данного изобретения описаны в данном документе как часть тех же или отдельных вариантов его реализации, однако следует понимать, что объем данного изобретения может включать в себя варианты реализации, имеющие комбинации всех или некоторых описанных признаков.For purposes of clarity and conciseness, the distinguishing features of the present invention are described herein as part of the same or separate embodiments thereof, but it should be understood that the scope of the present invention may include embodiments having combinations of all or some of the described features.
5 Примеры5 Examples
Пример 1: ДНК-вакцинация на основе экспрессии Т-клеточных эпитопов ВАЧСExample 1: DNA vaccination based on expression of ASFV T-cell epitopes
Способ:Way:
На основе полных последовательностей геномов известных изолятов АЧС и последовательности генома свиньи использовалась программа прогнозирования эпитопов NetMHCpan для получения списка Т-клеточных эпитопов, которые не зависят от штамма вируса или породы свиньи (см. Таблицу 1). Девятнадцать Т-клеточных эпитопов наивысшего уровня использовались для создания полиэпитопной синтетической ДНК-вакцины. Последовательность ДНК кодировала 19 нонапептидных эпитопов, разделенных спейсерами длиной от 3 до 5 аминокислот, которые содержат сигналы для протеасомного расщепления и дальнейшего процессинга (см. Фиг. 1А). Эпитоп 14 не использовался, поскольку он, вероятно, помешал бы правильному процессингу. Также для этой цели была включена последовательность универсального Т-клеточного эпитопа под названием PADRE (см. Фиг. 1 В). Для усиления протеасомной деградации была добавлена нуклеотидная последовательность убиквитина на 5'-конце синтетического гена. Это приводит к более эффективной деградации протеасомой и улучшенному представлению эпитопов Т-клеткам-хозяевам. Наконец, была добавлена адъювантная последовательность CpG к 3''-НТО синтетического гена. Кодон-оптимизированная версия синтетического гена была химически синтезирована GenScript Corporation и клонирована за промотором CMVb плазмиде pCVI (производное pCI-neo [Promega], полученное путем удаления фрагмента рестрикции ClaIl) с использованием сайтов рестрикции NheI и NotI. Полученная плазмида была названа pCVI-ASFDVAC2.Based on the complete genome sequences of known ASFV isolates and the pig genome sequence, the NetMHCpan epitope prediction program was used to generate a list of T-cell epitopes that are independent of virus strain or pig breed (see Table 1). Nineteen top-ranked T-cell epitopes were used to design a polyepitope synthetic DNA vaccine. The DNA sequence encoded 19 nonapeptide epitopes separated by 3- to 5-amino acid spacers that contain signals for proteasomal cleavage and further processing (see Fig. 1A). Epitope 14 was not used because it would likely interfere with proper processing. A universal T-cell epitope sequence called PADRE was also included for this purpose (see Fig. 1B). To enhance proteasomal degradation, a ubiquitin nucleotide sequence was added to the 5' end of the synthetic gene. This results in more efficient degradation by the proteasomal pathway and improved presentation of epitopes to host T cells. Finally, an adjuvant CpG sequence was added to the 3' UTR of the synthetic gene. A codon-optimized version of the synthetic gene was chemically synthesized by GenScript Corporation and cloned behind the CMVb promoter in pCVI (a derivative of pCI-neo [Promega] made by removing the ClaIl restriction fragment) using NheI and NotI restriction sites. The resulting plasmid was named pCVI-ASFDVAC2.
Для испытания контрольной вакцины использовали три группы свиней по 6 особей в каждой. Животных из группы 1 трижды вакцинировали pCVI-ASFDVAC2. Животных из группы 2 также вакцинировали трижды, но одновременно с 3-ей ДНК-вакцинацией они также получали бустер смесью синтетических нонапептидов, соответствующих Т-клеточным эпитопам синтетического гена. Животных из контрольной группы (группа 3) трижды вакцинировали пустой плазмидой pCVI. Свиней вакцинировали с интервалами в 2 недели. Вакцину вводили внутримышечно/ внутрикожно с помощью иммуноэлектроперации с использованием клинипораторного устройства (IGEA Clinical Biophysics, Карпи, Италия). Электрические импульсы, генерируемые устройством электропорации, улучшают поглощение ДНК окружающей тканью. Пептиды применялись путем внутримышечной вакцинации. Через две недели после последней вакцинации свиней заражали штаммом ВАЧС Netherlands '86 (Wageningen Bioveterinary Research, Нидерланды; см. Terpstra and Wensvoort, 1986. Tijdschrift voor diergeneeskunde 111: 389-392). Данный штамм выращивали в альвеолярных макрофагах свиньи. За инфицированными свиньями наблюдали более 2 недель на предмет выявления клинических симптомов. Уровни вируса в крови определяли с помощью ПЦР. Гуморальные иммунные ответы исследовали с помощью твердофазного ИФА с использованием целого вируса в качестве антигена. Уровни клеток, секретирующих ИФН-γ, определяли с помощью ELISPOT после стимуляции in vitro вирусом или смесью из двадцати нонапептидов. Результаты:Three groups of 6 pigs each were used to test the control vaccine. Animals from group 1 were vaccinated three times with pCVI-ASFDVAC2. Animals from group 2 were also vaccinated three times, but simultaneously with the 3rd DNA vaccination they also received a booster mixture of synthetic nonapeptides corresponding to the T-cell epitopes of the synthetic gene. Animals from the control group (group 3) were vaccinated three times with the empty pCVI plasmid. Pigs were vaccinated at 2-week intervals. The vaccine was administered intramuscularly/intradermally by immunoelectrosurgery using a cliniporator device (IGEA Clinical Biophysics, Carpi, Italy). Electrical pulses generated by the electroporation device improve the uptake of DNA by the surrounding tissue. The peptides were applied by intramuscular vaccination. Two weeks after the last vaccination, pigs were challenged with the ASFV strain Netherlands '86 (Wageningen Bioveterinary Research, The Netherlands; see Terpstra and Wensvoort, 1986. Tijdschrift voor diergeneeskunde 111: 389-392). This strain was grown in porcine alveolar macrophages. Infected pigs were observed for clinical symptoms for over 2 weeks. Virus levels in blood were determined by PCR. Humoral immune responses were examined by ELISA using whole virus as antigen. Levels of IFN-γ-secreting cells were determined by ELISPOT after in vitro stimulation with virus or a cocktail of twenty nonapeptides. Results:
Контрольное заражение невакцинированной контрольной группы (группа 3) привела к 40% выживаемости. Вакцинация привела к выживаемости около 83% в группах 1 и 2 (см. Фиг. 2А). Свиньи в группе 2 имели значительно более низкие общие клинические показатели, чем свиньи в других группах (Фиг. 2В). Свиньи в этой группе также имели значительный ответ клеток, секретирующих ИФН-γ, против смеси из нонапептидов с 42-х суток после первой вакцинации (п.в.) (0-е сутки после контрольного заражения [п.з.]) до конца данного эксперимента (см. Фиг. 2С). Свиньи в группе 2 имели значительный ответ клеток, секретирующих ИФН-γ, против смеси из нонапептидов с 49-х суток п. в. (7-е сутки п. з.). В контрольной группе не наблюдалось ответа клеток, секретирующих ИФН-γ, на смесь из нонапептидов. Все группы продемонстрировали значительный ответ клеток, секретирующих ИФН-γ, против вируса на 56-е сутки п. в. (14-е сутки п.з.). Значительных различий в уровнях вирусной ДНК в крови между группами выявлено не было. Значительных различий в процентных показателях блокирования антител к АЧС в твердофазном ИФА не наблюдалось.Challenge of the unvaccinated control group (Group 3) resulted in 40% survival. Vaccination resulted in about 83% survival in Groups 1 and 2 (see Fig. 2A). Pigs in Group 2 had significantly lower overall clinical scores than pigs in the other groups (Fig. 2B). Pigs in this group also had a significant IFN-γ-secreting cell response to the nonapeptide mixture from 42 days post-first vaccination (p.i.) (day 0 post-challenge [p.c.]) until the end of the experiment (see Fig. 2C). Pigs in Group 2 had a significant IFN-γ-secreting cell response to the nonapeptide mixture from 49 days p.i. (day 7 p.c.). In the control group, no response of IFN-γ-secreting cells to the nonapeptide mixture was observed. All groups demonstrated a significant response of IFN-γ-secreting cells against the virus on day 56 p.i. (day 14 p.z.). No significant differences in the levels of viral DNA in the blood were found between the groups. No significant differences were observed in the percentage of blocking antibodies to ASF in the solid-phase ELISA.
Пример 2: Вакцинация с использованием векторов MVA, экспрессирующих Т- и В-клеточные эпитопы ВАЧСExample 2: Vaccination using MVA vectors expressing T- and B-cell epitopes of ASFV
Способ:Way:
Основываясь на многообещающих результатах испытания вакцины на основе полиэпитопной ДНК, синтетический ген ASFDVAC2 был снабжен промоторной последовательностью MVA 13.5 и вставлен в ген ТК вакцинного вектора MVA (аттенуированная натуральная оспа) посредством ИБХ-рекомбинирования в соответствии с опубликованными процедурами (Cottingham, 2012. Methods Mol Biol 890: 37-57). Полученный вирус был назван MVA-VAC2. Вставка MVA-VAC2 включает в себя, в направлении от 5'-конца, левый фланг ТК, промотор MVA 13.5L, последовательность Козака, синтетический ген ASFDVAC2, терминирующие последовательности из mH5 и правый фланг ТК.Based on the promising results of the polyepitope DNA vaccine trial, the synthetic ASFDVAC2 gene was equipped with the MVA 13.5 promoter sequence and inserted into the TK gene of the MVA (attenuated smallpox) vaccine vector by IBH recombination according to published procedures (Cottingham, 2012. Methods Mol Biol 890: 37-57). The resulting virus was named MVA-VAC2. The MVA-VAC2 insert includes, from the 5' end, the left flank of the TK, the MVA 13.5L promoter, the Kozak sequence, the synthetic ASFDVAC2 gene, the termination sequences from mH5 and the right flank of the TK.
Кроме того, ИБХ-рекомбинирование использовалось для вставки генов, кодирующих шесть хорошо известных основных В-клеточных антигенов вируса АЧС (р30, р54, р72, EP402R, A104R и B602L), в вектор MVA с использованием тандемной (р30+B602L; р72+A104R) или тройной кассеты экспрессии (р54+EP402R+K205R) гена (MVA-p30/B602L, MVA-p72/A104R и MVA-p54/EP402R/K205R, соответственно). С этой целью были созданы синтетические конструкции ДНК (GenScript), и области, кодирующие белки, были снабжены различными промоторами MVA и последовательностями терминации транскрипции для управления экспрессией этих генов. Кроме того, чтобы способствовать обнаружению экспрессии белка, каждая из областей, кодирующих белок, была снабжена С-концевой последовательностью метки FLAG.Furthermore, IBH recombination was used to insert genes encoding six well-known major ASFV B-cell antigens (p30, p54, p72, EP402R, A104R, and B602L) into the MVA vector using a tandem (p30+B602L; p72+A104R) or triple (p54+EP402R+K205R) gene expression cassette (MVA-p30/B602L, MVA-p72/A104R, and MVA-p54/EP402R/K205R, respectively). For this purpose, synthetic DNA constructs (GenScript) were generated and the protein coding regions were equipped with different MVA promoters and transcription termination sequences to drive the expression of these genes. In addition, to facilitate detection of protein expression, each of the protein coding regions was provided with a C-terminal FLAG tag sequence.
Для эксперимента с контрольной вакцинацией использовали три группы свиней по 10 особей в каждой. Животных из группы 1 вакцинировали дважды внутримышечно с использованием 108 TCID50 MVA-VAC2. Животных из группы 2 дважды вакцинировали комбинацией всех 4-х MVA-рекомбинантов, экспрессирующих Т-клеточные эпитопы и В-клеточные эпитопы (108 TCID50 каждого). Невакцинированные животные из группы 3 служили контролем. Через две недели после второй вакцинации животных заражали штаммом ВАЧС Netherlands '86.For the challenge vaccination experiment, three groups of 10 pigs each were used. Group 1 was vaccinated twice intramuscularly with 10 8 TCID50 MVA-VAC2. Group 2 was vaccinated twice with a combination of all 4 MVA recombinants expressing T-cell epitopes and B-cell epitopes (10 8 TCID50 each). Unvaccinated animals from Group 3 served as controls. Two weeks after the second vaccination, animals were challenged with the Netherlands '86 strain of ASFV.
Результаты:Results:
Контрольное заражение невакцинированных животных (группа 3) привело к 0% выживаемости (см. Фиг. 3А). Примечательно, что 9 из 10 свиней, вакцинированных комбинацией всех 4-х MVA-рекомбинантов (группа 2), выжили и демонстрировали лишь низкую тяжесть заболевания на протяжении всего нескольких суток. В группе 1 из животных, вакцинированных только MVA-VAC2, выжили 4 свиньи. Животные из этой группы демонстрировали более высокую тяжесть заболевания и на протяжении более длительного периода времени по сравнению с животными из группы 2 (см. Фиг. 3В). Эти результаты хорошо соответствуют клеточно-опосредованному иммунитету (КОИ), измеренному на основании ответа клеток, секретирующих ИФН-γ, против смеси из Т-клеточных нонапептидных эпитопов или целого антигена ВАЧС (Фиг. 3С).Challenge of unvaccinated animals (group 3) resulted in 0% survival (see Fig. 3A). Notably, 9 of 10 pigs vaccinated with the combination of all 4 MVA recombinants (group 2) survived and showed only low disease severity for only a few days. In group 1, 4 pigs vaccinated with MVA-VAC2 alone survived. Animals in this group showed higher disease severity and for a longer period of time compared to animals in group 2 (see Fig. 3B). These results are in good agreement with cell-mediated immunity (CMI) measured by the response of IFN-γ-secreting cells against a mixture of T-cell nonapeptide epitopes or the whole ASFV antigen (Fig. 3C).
ВыводConclusion
В данном исследовании были получены многообещающие результаты для разработки вакцины против ВАЧС с использованием комбинированной вакцины, состоящей из векторных вирусов MVA, которые экспрессируют Т-клеточные, а также В-клеточные, эпитопы ВАЧС. Комбинированная вакцина обеспечивала защиту от смертности и клинического проявления заболевания после заражения.This study showed promising results for the development of an ASFV vaccine using a combination vaccine consisting of vectored MVA viruses expressing T-cell as well as B-cell epitopes of ASFV. The combination vaccine provided protection against mortality and clinical disease after challenge.
Claims (20)
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP18195280.5 | 2018-09-18 | ||
| CN201910239547.X | 2019-03-27 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2021109764A RU2021109764A (en) | 2022-10-19 |
| RU2828676C2 true RU2828676C2 (en) | 2024-10-16 |
Family
ID=
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2017096341A2 (en) * | 2015-12-04 | 2017-06-08 | The Texas A&M University System | Adenovirus-vectored multivalent vaccine |
| RU2647573C1 (en) * | 2017-03-14 | 2018-03-16 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный исследовательский центр вирусологии и микробиологии" (ФГБНУ ФИЦВиМ) | BACTERIAL STRAIN OF ESCHERICHIA COLI KRX pET32b/ASFV/p30-PRODUCER OF CHIMERICAL RECOMBINANT PROTEIN p30 OF AFRICAN SWINE FEVER VIRUS |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2017096341A2 (en) * | 2015-12-04 | 2017-06-08 | The Texas A&M University System | Adenovirus-vectored multivalent vaccine |
| RU2647573C1 (en) * | 2017-03-14 | 2018-03-16 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный исследовательский центр вирусологии и микробиологии" (ФГБНУ ФИЦВиМ) | BACTERIAL STRAIN OF ESCHERICHIA COLI KRX pET32b/ASFV/p30-PRODUCER OF CHIMERICAL RECOMBINANT PROTEIN p30 OF AFRICAN SWINE FEVER VIRUS |
Non-Patent Citations (1)
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US12458690B2 (en) | African swine fever virus vaccine | |
| JP5872755B2 (en) | Compositions and methods for anti-HSV-2 vaccination | |
| CN113666990B (en) | A T cell vaccine immunogen inducing broad-spectrum anti-coronavirus and its application | |
| US10059747B2 (en) | Crimean-congo haemorrhagic fever virus antigenic composition | |
| González Armas et al. | DNA immunization confers protection against murine cytomegalovirus infection | |
| ES2685124T3 (en) | Poxvirus expression system | |
| RS61993B1 (en) | Cmv vaccines | |
| JP2022538673A (en) | African swine fever vaccine | |
| JP6802813B2 (en) | Duck plague virus and its use | |
| EP3432922B1 (en) | Orf virus-based platform for vaccine delivery | |
| WO2023023940A1 (en) | Immunogen for inducing broad-spectrum anti-coronavirus t cell vaccine and use thereof | |
| US20240374711A1 (en) | RECOMBINANT NEWCASTLE DISEASE VIRUS (rNDV) VECTORS AND METHODS OF USING THE SAME | |
| JP2024505274A (en) | Viral constructs used in enhancing T cell priming during vaccination | |
| US20090053256A1 (en) | Poxvirus Methods And Compositions | |
| WO2015102936A1 (en) | Poxvirus-plasmodium recombinants, compositions containing such recombinants, uses thereof, and methods of making and using same | |
| KR20230022206A (en) | Recombinant Modified Vaccinia Virus Ankara (MVA) Vaccine Against Coronavirus Disease | |
| JP2024512103A (en) | Highly attenuated replication-competent recombinant poxvirus as a vaccine platform and its use | |
| RU2828676C2 (en) | African swine fever virus vaccine | |
| CN110382518B (en) | Chimeric vaccine for serotype A foot and mouth disease virus | |
| US8465748B2 (en) | Vaccine compositions and methods containing an immunogen derived from equine arteritis virus | |
| WO2025044920A2 (en) | New dev vectors for avian vaccines | |
| WO2023213990A1 (en) | Multi-epitope construct | |
| Bordin et al. | Types of Vaccines 29 |