RU2828654C1 - Method for forming immune surveillance system for tumour cells in mammal body - Google Patents
Method for forming immune surveillance system for tumour cells in mammal body Download PDFInfo
- Publication number
- RU2828654C1 RU2828654C1 RU2024118082A RU2024118082A RU2828654C1 RU 2828654 C1 RU2828654 C1 RU 2828654C1 RU 2024118082 A RU2024118082 A RU 2024118082A RU 2024118082 A RU2024118082 A RU 2024118082A RU 2828654 C1 RU2828654 C1 RU 2828654C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- seq
- insdqualifier
- insdseq
- reading frame
- open reading
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 title claims description 13
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 title abstract description 59
- 230000037451 immune surveillance Effects 0.000 title description 11
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 claims abstract description 162
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims abstract description 140
- 230000004547 gene signature Effects 0.000 claims abstract description 87
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 56
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 49
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims abstract description 23
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims abstract description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 9
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims abstract description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 238000012913 prioritisation Methods 0.000 claims abstract description 3
- 230000032832 immune response to tumor cell Effects 0.000 claims description 4
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 16
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 abstract description 11
- 230000028993 immune response Effects 0.000 abstract description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 abstract description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 3
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 54
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 26
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 24
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 22
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 20
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 20
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 16
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 15
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 15
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 15
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 14
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 13
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 12
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 11
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 11
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 11
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 9
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 8
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 8
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 8
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 238000012181 QIAquick gel extraction kit Methods 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 230000036541 health Effects 0.000 description 6
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N Isoflurane Chemical compound FC(F)OC(Cl)C(F)(F)F PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 5
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 5
- 229960002725 isoflurane Drugs 0.000 description 5
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 5
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 4
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 4
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 4
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 4
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 4
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 4
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 4
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 4
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 229940022399 cancer vaccine Drugs 0.000 description 3
- 238000009566 cancer vaccine Methods 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 3
- 229960002743 glutamine Drugs 0.000 description 3
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 3
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 3
- NRJAVPSFFCBXDT-HUESYALOSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC NRJAVPSFFCBXDT-HUESYALOSA-N 0.000 description 2
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N Adenosine triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001266 CD8-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- PCDQPRRSZKQHHS-UHFFFAOYSA-N Cytidine 5'-triphosphate Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 PCDQPRRSZKQHHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 2
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 2
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 229940032072 GVAX vaccine Drugs 0.000 description 2
- XKMLYUALXHKNFT-UUOKFMHZSA-N Guanosine-5'-triphosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XKMLYUALXHKNFT-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 2
- 108091008036 Immune checkpoint proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037982 Immune checkpoint proteins Human genes 0.000 description 2
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 2
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 2
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical group O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- OLRONOIBERDKRE-XUTVFYLZSA-N [[(2r,3s,4r,5s)-3,4-dihydroxy-5-(1-methyl-2,4-dioxopyrimidin-5-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] phosphono hydrogen phosphate Chemical compound O=C1NC(=O)N(C)C=C1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 OLRONOIBERDKRE-XUTVFYLZSA-N 0.000 description 2
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 2
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- PCDQPRRSZKQHHS-ZAKLUEHWSA-N cytidine-5'-triphosphate Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO[P@](O)(=O)O[P@@](O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 PCDQPRRSZKQHHS-ZAKLUEHWSA-N 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 2
- 229940029030 dendritic cell vaccine Drugs 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 2
- XKMLYUALXHKNFT-UHFFFAOYSA-N rGTP Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O XKMLYUALXHKNFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 230000004565 tumor cell growth Effects 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoserine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 0.000 description 1
- 101150072531 10 gene Proteins 0.000 description 1
- QGWBEETXHOVFQS-UHFFFAOYSA-N 6-[6-(2-hexyldecanoyloxy)hexyl-(4-hydroxybutyl)amino]hexyl 2-hexyldecanoate Chemical compound CCCCCCCCC(CCCCCC)C(=O)OCCCCCCN(CCCCO)CCCCCCOC(=O)C(CCCCCC)CCCCCCCC QGWBEETXHOVFQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010069754 Acquired gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 1
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 1
- 101150077194 CAP1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091028732 Concatemer Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 206010011968 Decreased immune responsiveness Diseases 0.000 description 1
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylserin Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(=O)OCC(O)CO ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 1
- 229940076838 Immune checkpoint inhibitor Drugs 0.000 description 1
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 1
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 1
- 206010061309 Neoplasm progression Diseases 0.000 description 1
- 101100438378 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) fac-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 229930185560 Pseudouridine Natural products 0.000 description 1
- PTJWIQPHWPFNBW-UHFFFAOYSA-N Pseudouridine C Natural products OC1C(O)C(CO)OC1C1=CNC(=O)NC1=O PTJWIQPHWPFNBW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000009609 Pyrophosphatases Human genes 0.000 description 1
- 108010009413 Pyrophosphatases Proteins 0.000 description 1
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101000956368 Trittame loki CRISP/Allergen/PR-1 Proteins 0.000 description 1
- 229960001456 adenosine triphosphate Drugs 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 229940030664 allogeneic tumor cell vaccine Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 230000005975 antitumor immune response Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 229960003852 atezolizumab Drugs 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- WGDUUQDYDIIBKT-UHFFFAOYSA-N beta-Pseudouridine Natural products OC1OC(CN2C=CC(=O)NC2=O)C(O)C1O WGDUUQDYDIIBKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 description 1
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000002619 cancer immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 229940030156 cell vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000008260 defense mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 230000008995 epigenetic change Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940126533 immune checkpoint blocker Drugs 0.000 description 1
- 230000008073 immune recognition Effects 0.000 description 1
- 230000008629 immune suppression Effects 0.000 description 1
- 230000006058 immune tolerance Effects 0.000 description 1
- 239000012274 immune-checkpoint protein inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000003022 immunostimulating agent Substances 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 229960005386 ipilimumab Drugs 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 1
- 229960003301 nivolumab Drugs 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 229960002621 pembrolizumab Drugs 0.000 description 1
- 229940023041 peptide vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000001050 pharmacotherapy Methods 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- PTJWIQPHWPFNBW-GBNDHIKLSA-N pseudouridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1C1=CNC(=O)NC1=O PTJWIQPHWPFNBW-GBNDHIKLSA-N 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000003938 response to stress Effects 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037439 somatic mutation Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000003239 susceptibility assay Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 229940022511 therapeutic cancer vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229940021747 therapeutic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000009258 tissue cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 230000005751 tumor progression Effects 0.000 description 1
- 230000037455 tumor specific immune response Effects 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- ABDKAPXRBAPSQN-UHFFFAOYSA-N veratrole Chemical compound COC1=CC=CC=C1OC ABDKAPXRBAPSQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Abstract
Description
Область техникиField of technology
Изобретение относится к иммунологии и онкологии. Предложенное изобретение может применяться в терапии пациентов с онкологическими заболеваниями различной этиологии. Формирование системы иммунного надзора за опухолевыми клетками у млекопитающих позволяет иммунной системе эффективно обнаруживать и уничтожать клетки опухоли. Кроме того, настоящее изобретение может применять для регуляции микроокружения опухоли.The invention relates to immunology and oncology. The proposed invention can be used in the therapy of patients with oncological diseases of various etiologies. The formation of an immune surveillance system for tumor cells in mammals allows the immune system to effectively detect and destroy tumor cells. In addition, the present invention can be used to regulate the tumor microenvironment.
Уровень техникиState of the art
Онкологические заболевания являются одной из ведущих причин смертности во всем мире. По данным ВОЗ в 2022 г. в мире было зарегистрировано 20 млн новых случаев рака и 9,7 млн случаев смерти от онкологических заболеваний. Число людей, которые оставались в живых через 5 лет с момента постановки диагноза, в 2022 г составляло 53,5 млн человек. Согласно этим данным, приблизительно у каждого пятого человека в течение жизни может развиться какое-либо онкологическое заболевание; примерно 1 из 9 мужчин и 1 из 12 женщин погибнут от данного заболевания [“Глобальное Бремя Онкологических Заболеваний Растет Параллельно с Ростом Потребности в Услугах.” World Health Organization, World Health Organization, www.who.int/ru/news/item/01-02-2024-global-cancer-burden-growing--amidst-mounting-need-for-services. Дата обращения: 18 июня 2024 года].Cancer is one of the leading causes of death worldwide. According to WHO, in 2022 there will be 20 million new cases of cancer and 9.7 million deaths from cancer worldwide. The number of people alive 5 years after diagnosis in 2022 was 53.5 million. According to these data, approximately one in five people will develop some kind of cancer during their lifetime; approximately 1 in 9 men and 1 in 12 women will die from this disease [“Global Cancer Burden Growing as Need for Services Grows.” World Health Organization, World Health Organization, www.who.int/ru/news/item/01-02-2024-global-cancer-burden-growing--amidst-mounting-need-for-services. Accessed 18 June 2024].
Согласно прогнозу Международного агентства по изучению рака (МАИР) к 2050 году число случаев онкологических заболеваний в мире может увеличиться примерно на 77%. [Cancer rates set to rise 77 per cent by 2050 https://news.un.org/en/story/2024/02/1146127. Дата обращения: 18 июня 2024 года]. Быстрый рост глобального бремени онкологических заболеваний является следствием как старения населения и демографического роста, так и изменения в подверженности людей воздействию факторов риска.According to the International Agency for Research on Cancer (IARC), the number of cancer cases worldwide could increase by approximately 77% by 2050. [Cancer rates set to rise 77 per cent by 2050 https://news.un.org/en/story/2024/02/1146127. Accessed on 18 June 2024]. The rapid increase in the global burden of cancer is a consequence of both population aging and demographic growth, and changes in people's exposure to risk factors.
Развитие рака включает прогрессирующую трансформацию нормальных клеток в злокачественные, которая является результатом происходящих в клетках генетических и эпигенетических изменений. Первоначально возникающие опухолевые клетки могут быть устранены клетками-эффекторами иммунной системы. Однако этот процесс приводит к иммунной селекции (иммуноредактированию опухоли), которая способствует отбору клонов опухолевых клеток с меньшей иммуногенностью, обладающих способностью блокировать активность иммунокомпетентных клеток. В итоге во время опухолевой прогрессии, когда опухоль достигает размеров, обнаруживаемых клиническими методами, растворимые факторы, секретируемые клетками опухоли, могут создавать в опухолевом микроокружении благоприятные условия для ускользания от воздействия иммунной системы.Cancer development involves progressive transformation of normal cells into malignant cells, which is the result of genetic and epigenetic changes occurring in the cells. Initially, emerging tumor cells can be eliminated by effector cells of the immune system. However, this process leads to immune selection (tumor immunoediting), which favors the selection of tumor cell clones with less immunogenicity, which have the ability to block the activity of immunocompetent cells. Finally, during tumor progression, when the tumor reaches a size detectable by clinical methods, soluble factors secreted by tumor cells can create favorable conditions in the tumor microenvironment for evasion from the effects of the immune system.
Известно, что опухолевые клетки способны подавлять направленный иммунный ответ, используя различные механизмы защиты. Некоторые из них связаны с активацией системы ингибиторных механизмов (контрольных точек иммунного ответа), которые передают ингибирующий сигнал цитотоксическому Т-лимфоциту, тем самым подавляя иммунологическую реактивность в начальной фазе иммунного ответа - индуктивной. В результате происходит блокирование активации Т-лимфоцитов, что приводит к преобладанию Т регуляторных клеток в опухолевом микроокружении и развитию иммунной толерантности и анергии [Шубникова Е.В., Букатина Т.М., Вельц Н.Ю., Каперко Д.А., Кутехова Г.В. Ингибиторы контрольных точек иммунного ответа: новые риски нового класса противоопухолевых средств // Безопасность и риск фармакотерапии, 2020, №1, стр. 9-20].It is known that tumor cells are able to suppress the targeted immune response using various defense mechanisms. Some of them are associated with the activation of the system of inhibitory mechanisms (immune response checkpoints), which transmit an inhibitory signal to the cytotoxic T lymphocyte, thereby suppressing immunological reactivity in the initial phase of the immune response - inductive. As a result, the activation of T lymphocytes is blocked, which leads to the predominance of T regulatory cells in the tumor microenvironment and the development of immune tolerance and anergy [Shubnikova E.V., Bukatina T.M., Velts N.Yu., Kaperko D.A., Kutekhova G.V. Immune response checkpoint inhibitors: new risks of a new class of antitumor agents // Safety and risk of pharmacotherapy, 2020, No. 1, pp. 9-20].
Открытие контрольных точек иммунного ответа произвело революцию в онкоиммунологии. В настоящее время разработан целый класс препаратов, которые представляют собой гуманизированные моноклональные антитела ингибирующие контрольные точки иммунного ответа. Данный класс препаратов значительно улучшил выживаемость пациентов и стал существенным прорывом в противоопухолевой терапии. В настоящее время в России зарегистрировано 4 препарата класса блокаторов иммунных контрольных точек: ипилимумаб, ниволумаб, пембролизумаб и атезолизумаб. Кроме того, это направление активно развивается и проводится поиск новых мишеней. Однако данный класс препаратов не может решить ряд проблем, связанных с низкой иммуногенностью и недостаточной презентацией опухолевых антигенов. В результате чего часть опухолевых клеток способна ускользать от иммунного ответа.The discovery of immune checkpoints has revolutionized oncoimmunology. Currently, a whole class of drugs has been developed that are humanized monoclonal antibodies that inhibit immune checkpoints. This class of drugs has significantly improved patient survival and has become a significant breakthrough in antitumor therapy. Currently, 4 drugs of the immune checkpoint blocker class are registered in Russia: ipilimumab, nivolumab, pembrolizumab and atezolizumab. In addition, this area is actively developing and a search for new targets is underway. However, this class of drugs cannot solve a number of problems associated with low immunogenicity and insufficient presentation of tumor antigens. As a result, some tumor cells are able to elude the immune response.
Другим направлением развития онкоиммунологии является разработка терапевтических вакцин. Существует несколько классов данных препаратов, которые используют разные антигены и различные механизмы образования клеточно-опосредованного иммунного ответа:Another direction of development of oncoimmunology is the development of therapeutic vaccines. There are several classes of these drugs that use different antigens and different mechanisms of formation of cell-mediated immune response:
1) Вакцины на основе дендритных клеток (ДК). Дендритные клетки (ДК) выполняют роль антигенпрезентирующих клеток в иммунной системе человека. В этом типе вакцин ДК усиливают презентацию опухолевых антигенов лимфоцитам. После активации наивных лимфоцитов они становятся способными уничтожать опухолевые клетки, представляющие эти антигены [Боженко В.К. Противоопухолевые вакцины. Вестник Российского научного центра рентгенорадиологии Минздрава России 2022 год №1 т.22]. Противораковые вакцины данного типа обычно включают ДК, выделенные у пациентов или полученные ex vivo, путем культивирования гемопоэтических клеток-предшественников или моноцитов пациента. ДК дополнительно загружают опухолевыми антигенами и иногда объединяют с иммуностимулирующими агентами, такими как GM-CSF. Хотя собранные данные свидетельствуют о том, что ДК-вакцины хорошо переносятся и имеют хороший профиль безопасности, четкие терапевтические результаты достигаются менее чем у 15% пациентов Calmeiro J, Carrascal MA, Tavares AR, Ferreira DA, Gomes C, Falcão A, Cruz MT, Neves BM. Dendritic Cell Vaccines for Cancer Immunotherapy: The Role of Human Conventional Type 1 Dendritic Cells. Pharmaceutics. 2020 Feb 15;12(2):158. doi: 10.3390/pharmaceutics12020158. PMID: 32075343; PMCID: PMC7076373.1) Dendritic cell (DC)-based vaccines. Dendritic cells (DC) act as antigen-presenting cells in the human immune system. In this type of vaccine, DC enhance the presentation of tumor antigens to lymphocytes. After activation of naive lymphocytes, they become capable of destroying tumor cells presenting these antigens [Bozhenko V.K. Antitumor vaccines. Bulletin of the Russian Scientific Center of Roentgenology and Radiology of the Ministry of Health of the Russian Federation 2022, No. 1, v. 22]. Cancer vaccines of this type typically include DC isolated from patients or obtained ex vivo by culturing the patient's hematopoietic progenitor cells or monocytes. DC are additionally loaded with tumor antigens and are sometimes combined with immunostimulatory agents such as GM-CSF. Although the collected data indicate that DC vaccines are well tolerated and have a good safety profile, clear therapeutic outcomes are achieved in less than 15% of patients Calmeiro J, Carrascal MA, Tavares AR, Ferreira DA, Gomes C, Falcão A, Cruz MT, Neves BM. Dendritic Cell Vaccines for Cancer Immunotherapy: The Role of Human Conventional Type 1 Dendritic Cells. Pharmaceutics. 2020 Feb 15;12(2):158. doi: 10.3390/pharmaceutics12020158. PMID: 32075343; PMCID: PMC7076373.
2) Другой класс противораковых вакцин основан на модифицированных (например, облученных сублетальными дозами) опухолевых клетках, используемых в качестве антигенов, также в комбинации с иммуностимулирующими агентами. Вакцины данного типа в настоящее время, находящиеся на клинических испытаниях, основаны как на аутологичных (например, OncoVAX, LipoNova), так и на аллогенных (например, Canvaxin, Onyvax-P, GVAX) опухолевых клеточных линиях. Использование этих методов вакцинации позволяет получить воспроизводимый, безопасный вакцинный продукт, в котором инъецированные опухолевые клетки не могут размножаться. Облученные опухолевые клетки естественным образом экспрессируют многочисленные специфические антигены, таким образом, способствуя инициации противоопухолевого иммунного ответа. Также было показано, что иммунное распознавание опухолевых клеток CD8+Т-клетками и антигенпрезентирующими клетками усиливается после облучения. Кроме того, цельноклеточные вакцины могут быть модифицированы для повышения иммуногенности путем трансфекции иммуностимулирующих молекул. Например, платформа вакцины GVAX включает использование облученных аллогенных линий опухолевых клеток, модифицированных для секреции GM-CSF для усиления иммуногенности вакцины. Несмотря на все преимущества, данный тип вакцин имеет ряд недостатков. Так, например, при облучении клеток фосфатидилсерин, иммуносупрессивный фосфолипид, обычно находящийся на внутреннем листочке плазматической мембраны, транслоцируется с внутренней стороны плазматической мембраны на ее внешнюю сторону, что в свою очередь приводит секреции иммуносупрессивных факторов дендритными клетками и ингибирует их созревание, способствуя иммуносупрессивному окружению опухоли. Более того, облученные клетки могут сохранять способность секретировать иммуносупрессивные факторы подобно исходным опухолевым клеткам. Таким образом, вызванное облучением подавление иммунитета частично сводит на нет иммуногенный эффект облученных целых клеток [Srivatsan S, Patel JM, Bozeman EN, Imasuen IE, He S, Daniels D, Selvaraj P. Allogeneic tumor cell vaccines: the promise and limitations in clinical trials. Hum Vaccin Immunother. 2014;10(1):52-63. doi: 10.4161/hv.26568. Epub 2013 Sep 24. PMID: 24064957; PMCID: PMC4181031].2) Another class of cancer vaccines is based on modified (e.g., irradiated with sublethal doses) tumor cells used as antigens, also in combination with immunostimulating agents. Vaccines of this type currently in clinical trials are based on both autologous (e.g., OncoVAX, LipoNova) and allogeneic (e.g., Canvaxin, Onyvax-P, GVAX) tumor cell lines. The use of these vaccination methods allows for the production of a reproducible, safe vaccine product in which the injected tumor cells are unable to proliferate. Irradiated tumor cells naturally express numerous specific antigens, thus facilitating the initiation of an antitumor immune response. It has also been shown that immune recognition of tumor cells by CD8+ T cells and antigen-presenting cells is enhanced after irradiation. In addition, whole-cell vaccines can be modified to enhance immunogenicity by transfection of immunostimulatory molecules. For example, the GVAX vaccine platform involves the use of irradiated allogeneic tumor cell lines modified to secrete GM-CSF to enhance the immunogenicity of the vaccine. Despite all the advantages, this type of vaccine has a number of disadvantages. For example, when cells are irradiated, phosphatidylserine, an immunosuppressive phospholipid normally found on the inner leaflet of the plasma membrane, is translocated from the inner side of the plasma membrane to its outer side, which in turn leads to the secretion of immunosuppressive factors by dendritic cells and inhibits their maturation, promoting an immunosuppressive environment for the tumor. Moreover, irradiated cells may retain the ability to secrete immunosuppressive factors similar to the original tumor cells. Thus, radiation-induced immune suppression partially negates the immunogenic effect of irradiated whole cells [Srivatsan S, Patel JM, Bozeman EN, Imasuen IE, He S, Daniels D, Selvaraj P. Allogeneic tumor cell vaccines: the promise and limitations in clinical trials. Hum Vaccin Immunother. 2014;10(1):52-63. doi: 10.4161/hv.26568. Epub 2013 Sep 24. PMID: 24064957; PMCID: PMC4181031].
3) Следующий класс терапевтических противоопухолевых вакцин основан на пептидных фрагментах антигенов, селективно экспрессированных опухолевыми клетками. Пептиды вводят самостоятельно или в комбинации с иммуностимулирующими агентами, которые могут включать адъюванты и цитокины, такие как гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF). Пептиды, загруженные в MHC класса I, распознаются специфическим TCR CD8+ Т-клеток, которые активируются для проявления своей цитотоксической активности против опухолевых клеток, представляющих тот же комплекс пептид-MHC-I. Этот процесс определяется как активная иммунотерапия, поскольку иммунная система хозяина либо активируется de novo, либо рестимулируется для запуска эффективной специфичной к опухоли иммунной реакции, которая в конечном итоге может привести к регрессии опухоли. Однако, хотя доклинические данные часто показывали обнадеживающие результаты, клинические испытания терапевтических противораковых вакцин, в том числе вакцин на основе пептидов, на сегодняшний день не дали удовлетворительных данных. Ограниченная эффективность противораковых вакцин на основе пептидов является следствием нескольких факторов, включая идентификацию специфических опухолевых антигенов-мишеней, ограниченную иммуногенность пептидов и высокоиммуносупрессивное микроокружение опухоли.3) The next class of therapeutic antitumor vaccines are based on peptide fragments of antigens selectively expressed by tumor cells. The peptides are administered alone or in combination with immunostimulatory agents, which may include adjuvants and cytokines such as granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF). The peptides loaded into MHC class I are recognized by specific TCRs of CD8+ T cells, which are activated to exert their cytotoxic activity against tumor cells presenting the same peptide-MHC-I complex. This process is defined as active immunotherapy, since the host immune system is either activated de novo or restimulated to mount an effective tumor-specific immune response that can ultimately lead to tumor regression. However, although preclinical data have often shown encouraging results, clinical trials of therapeutic cancer vaccines, including peptide-based vaccines, have yielded insufficient data to date. The limited efficacy of peptide-based cancer vaccines is a consequence of several factors, including the identification of specific tumor antigen targets, limited immunogenicity of peptides, and a highly immunosuppressive tumor microenvironment.
Таким образом, в уровне техники существует потребность в разработке способов формирования системы иммунного надзора организма, которая позволит иммунной системе эффективно распознавать и элиминировать опухолевые клетки.Thus, there is a need in the state of the art to develop methods for forming an immune surveillance system of the body that will allow the immune system to effectively recognize and eliminate tumor cells.
Раскрытие изобретения Disclosure of invention
Целью настоящего изобретения является разработка способа обнаружения опухолевых клеток с целью их уничтожения иммунной системой in vivo. The aim of the present invention is to develop a method for detecting tumor cells for the purpose of their destruction by the immune system in vivo.
Технический результат заключается в разработке способа индукции иммунного ответа к опухолевым клеткам в организме млекопитающих, который позволяет детектировать опухолевые клетки, запускать эффективный иммунный ответ против данных клеток и менять микроокружение опухоли. The technical result consists in developing a method for inducing an immune response to tumor cells in the body of mammals, which makes it possible to detect tumor cells, launch an effective immune response against these cells and change the tumor microenvironment.
Указанный технический результат достигается тем, что разработан способ формирования системы иммунного надзора за опухолевыми клетками в организме млекопитающих, включающий а) выявление отличий в генных сигнатурах опухолевых и нормальных клеток, включающее приоритизацию по уровню экспрессии мутантного гена, уникальности, агретопности; б) синтез набора ДНК-матриц, каждая из которых содержит открытую рамку считывания, кодирующую одну из обнаруженных генных сигнатур или открытую рамку считывания, кодирующую от 2 до 80 обнаруженных генных сигнатур; в) синтез набора мРНК на основе полученного набора ДНК-матриц; г) получение липидных наночастиц, содержащих синтезированные мРНК; д) введение полученных липидных наночастиц в организм млекопитающих. The specified technical result is achieved by developing a method for forming an immune surveillance system for tumor cells in the body of mammals, which includes a) identifying differences in the gene signatures of tumor and normal cells, including prioritization by the level of expression of the mutant gene, uniqueness, and aggretopicity; b) synthesizing a set of DNA matrices, each of which contains an open reading frame encoding one of the detected gene signatures or an open reading frame encoding from 2 to 80 detected gene signatures; c) synthesizing a set of mRNA based on the obtained set of DNA matrices; d) obtaining lipid nanoparticles containing the synthesized mRNA; d) introducing the obtained lipid nanoparticles into the body of mammals.
В одном варианте данное изобретение описывает способ формирования системы иммунного надзора за опухолевыми клетками в организме млекопитающих, в котором мРНК имеет последовательность SEQ ID NO:1 до открытой рамки считывания, кодирующей обнаруженные генные сигнатуры, и имеет последовательность SEQ ID NO:6 после открытой рамки считывания, кодирующей обнаруженные генные сигнатуры. In one embodiment, the present invention describes a method for forming an immune surveillance system for tumor cells in a mammalian body, wherein the mRNA has the sequence of SEQ ID NO:1 before the open reading frame encoding the detected gene signatures, and has the sequence of SEQ ID NO:6 after the open reading frame encoding the detected gene signatures.
В другом варианте данное изобретение описывает способ формирования системы иммунного надзора за опухолевыми клетками в организме млекопитающих в котором мРНК имеет последовательность SEQ ID NO:2 до открытой рамки считывания, кодирующей обнаруженные генные сигнатуры, и имеет последовательность SEQ ID NO:6 после открытой рамки считывания, кодирующей обнаруженные генные сигнатуры. In another embodiment, the present invention describes a method for forming an immune surveillance system for tumor cells in a mammalian organism, wherein the mRNA has the sequence SEQ ID NO:2 before the open reading frame encoding the detected gene signatures, and has the sequence SEQ ID NO:6 after the open reading frame encoding the detected gene signatures.
Также разработан вариант изобретения, в котором мРНК имеет последовательность SEQ ID NO:3 до открытой рамки считывания, кодирующей обнаруженные генные сигнатуры, и имеет последовательность SEQ ID NO:6 после открытой рамки считывания, кодирующей обнаруженные генные сигнатуры. A variant of the invention has also been developed in which the mRNA has the sequence SEQ ID NO:3 before the open reading frame encoding the detected gene signatures and has the sequence SEQ ID NO:6 after the open reading frame encoding the detected gene signatures.
Осуществление изобретенияImplementation of the invention
Краткое описание чертежейBrief description of the drawings
На Фиг. 1 представлены результаты измерения биолюминесценции in vivo на приборе IVIS Imaging System (Perkin elmer, США).Fig. 1 shows the results of in vivo bioluminescence measurements using the IVIS Imaging System (Perkin Elmer, USA).
На фотографии номерами обозначены животные, которым вводили следующие варианты мРНК:The numbers in the photograph indicate animals that were injected with the following mRNA variants:
1. мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO:1 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID NO:6 после открытой рамки считывания.1. mRNA that has the sequence of SEQ ID NO:1 upstream of the open reading frame and has the sequence of SEQ ID NO:6 downstream of the open reading frame.
2. мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO:2 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID NO:6 после открытой рамки считывания.2. mRNA that has the sequence of SEQ ID NO:2 upstream of the open reading frame and has the sequence of SEQ ID NO:6 downstream of the open reading frame.
3. мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO:3 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID NO:6 после открытой рамки считывания.3. mRNA that has the sequence of SEQ ID NO:3 before the open reading frame and has the sequence of SEQ ID NO:6 after the open reading frame.
4. мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO:4 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID NO:6 после открытой рамки считывания.4. mRNA that has the sequence of SEQ ID NO:4 upstream of the open reading frame and has the sequence of SEQ ID NO:6 downstream of the open reading frame.
5. мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO:5 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID NO:6 после открытой рамки считывания.5. mRNA that has the sequence of SEQ ID NO:5 upstream of the open reading frame and has the sequence of SEQ ID NO:6 downstream of the open reading frame.
6. мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO:8 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID NO:6 после открытой рамки считывания.6. mRNA that has the sequence of SEQ ID NO:8 upstream of the open reading frame and has the sequence of SEQ ID NO:6 downstream of the open reading frame.
7. мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO:1 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID NO:7 после открытой рамки считывания.7. mRNA that has the sequence of SEQ ID NO:1 upstream of the open reading frame and has the sequence of SEQ ID NO:7 downstream of the open reading frame.
8. мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO:2 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID NO:7 после открытой рамки считывания.8. mRNA that has the sequence of SEQ ID NO:2 upstream of the open reading frame and has the sequence of SEQ ID NO:7 downstream of the open reading frame.
9. мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO:3 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID NO:7 после открытой рамки считывания.9. mRNA that has the sequence of SEQ ID NO:3 upstream of the open reading frame and has the sequence of SEQ ID NO:7 downstream of the open reading frame.
10. мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO:4 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID NO:7 после открытой рамки считывания.10. mRNA that has the sequence of SEQ ID NO:4 upstream of the open reading frame and has the sequence of SEQ ID NO:7 downstream of the open reading frame.
11. мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO:5 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID NO:7 после открытой рамки считывания.11. mRNA that has the sequence of SEQ ID NO:5 upstream of the open reading frame and has the sequence of SEQ ID NO:7 downstream of the open reading frame.
12. мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO:8 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID NO:7 после открытой рамки считывания.12. mRNA that has the sequence of SEQ ID NO:8 upstream of the open reading frame and has the sequence of SEQ ID NO:7 downstream of the open reading frame.
На Фиг. 2 представлены результаты измерения объема опухоли у животных, которым вводили фосфатный-буферный раствор и исследуемые препараты мРНК.Fig. 2 shows the results of measuring the tumor volume in animals that were injected with a phosphate buffer solution and the studied mRNA preparations.
На оси ординат представлен объем опухоли, мм3.The ordinate axis shows the tumor volume, mm3 .
На оси абсцисс представлены различные группы животных, гдеThe abscissa axis shows different groups of animals, where
1. Контрольные мыши, которым вводили фосфатно-солевой буферный раствор1. Control mice injected with phosphate-buffered saline
2. Мыши, которым вводили мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID NO:9;2. Mice injected with mRNA containing an open reading frame encoding the identified gene signature SEQ ID NO:9;
3. Мыши, которым вводили мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID NO:10;3. Mice injected with mRNA containing an open reading frame encoding the identified gene signature SEQ ID NO:10;
4. Мыши, которым вводили мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID NO:11;4. Mice injected with mRNA containing an open reading frame encoding the identified gene signature SEQ ID NO:11;
5. Мыши, которым вводили мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID NO:12;5. Mice injected with mRNA containing an open reading frame encoding the identified gene signature SEQ ID NO:12;
6. Мыши, которым вводили мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID NO:13;6. Mice injected with mRNA containing an open reading frame encoding the identified gene signature SEQ ID NO:13;
7. Мыши, которым вводили мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID NO:14;7. Mice injected with mRNA containing an open reading frame encoding the identified gene signature SEQ ID NO:14;
8. Мыши, которым вводили мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID NO:15;8. Mice injected with mRNA containing an open reading frame encoding the identified gene signature SEQ ID NO:15;
9. Мыши, которым вводили мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID NO:16;9. Mice injected with mRNA containing an open reading frame encoding the identified gene signature SEQ ID NO:16;
10. Мыши, которым вводили мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID NO:17;10. Mice injected with mRNA containing an open reading frame encoding the identified gene signature SEQ ID NO:17;
11. Мыши, которым вводили мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID NO:18;11. Mice injected with mRNA containing an open reading frame encoding the identified gene signature SEQ ID NO:18;
12. Мыши, которым вводили мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей 10 обнаруженных генных сигнатур SEQ ID NO:19;12. Mice injected with mRNA containing an open reading frame encoding the 10 identified gene signatures of SEQ ID NO:19;
13. Мыши, которым вводили мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей 3 обнаруженных генных сигнатуры SEQ ID NO:20.13. Mice injected with mRNA containing an open reading frame encoding the 3 identified gene signatures of SEQ ID NO:20.
На Фиг. 3 представлены результаты измерения объема опухоли у животных, которым вводили фосфатный-буферный раствор и исследуемые препараты мРНК.Fig. 3 shows the results of measuring the tumor volume in animals that were injected with a phosphate buffer solution and the studied mRNA preparations.
На оси ординат представлен объем опухоли, мм3.The ordinate axis shows the tumor volume, mm3 .
На оси абсцисс представлены различные группы животных, гдеThe abscissa axis shows different groups of animals, where
1. Фосфатно-солевой буфер;1. Phosphate buffered saline;
2. мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID NO:9;2. mRNA with an open reading frame encoding the detected gene signature SEQ ID NO:9;
3. мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID NO:9 и мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID NO:10;3. mRNA with an open reading frame encoding the detected gene signature of SEQ ID NO:9 and mRNA with an open reading frame encoding the detected gene signature of SEQ ID NO:10;
4. мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID NO:9 и мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID NO:10 и мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID NO:9 и мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID NO:11.4. mRNA with an open reading frame encoding the detected gene signature of SEQ ID NO:9 and mRNA with an open reading frame encoding the detected gene signature of SEQ ID NO:10 and mRNA with an open reading frame encoding the detected gene signature of SEQ ID NO:9 and mRNA with an open reading frame encoding the detected gene signature of SEQ ID NO:11.
На Фиг. 4 представлены результаты определения клеточного состава микроокружения опухоли, гдеFig. 4 shows the results of determining the cellular composition of the tumor microenvironment, where
А - оценка процентного содержания макрофагов,A - assessment of the percentage of macrophages,
Б - Т-лимфоцитов.B - T-lymphocytes.
1 - интактные мыши (не вводился препарат),1 - intact mice (no drug was administered),
2 - исследуемый препарат.2 - the drug under study.
* - p<0.05, критерий Манна-Уитни.* - p<0.05, Mann-Whitney test.
Реагируя на стресс, опухолевые клетки адаптируются, подхватывая мутации и изменяя уровень редких белков необходимых, например, для выживания клеток. Это может привести к изменениям в молекулярных сигнатурах антигенов, присутствующих в опухолевых клетках, которые способна распознавать иммунная система. Отслеживание этих изменений может выявить новые мишени, на которые могут быть нацелены терапевтические средства. Однако каждый злокачественный процесс имеет свои уникальные характеристики. Поэтому генетические сигнатуры опухолевых клеток у разных пациентов могут сильно отличаться, даже при условии одинаковой локализации опухолевого процесса.In response to stress, tumor cells adapt by picking up mutations and changing the levels of rare proteins that are essential, for example, for cell survival. This can lead to changes in the molecular signatures of antigens present in tumor cells that the immune system can recognize. Tracking these changes can reveal new targets that can be targeted by therapeutic agents. However, each malignancy has its own unique characteristics. Therefore, the genetic signatures of tumor cells in different patients can differ greatly, even if the tumor localization is the same.
Разработанный способ предполагает секвенирование ДНК, выделенной из опухолевых клеток пациента, по результатам которого составляется мутантом - совокупность мутаций соматического рака в отдельной опухоли. При этом с помощью оригинального алгоритма определяются генные сигнатуры присущие опухолевым клеткам конкретного пациента (т.е. специфические изменения в экспрессии генов, характерные для опухолевых клеток данного пациента). Конечной целью определения генных сигнатур является поиск высокоиммунногенных антигенов, строго специфичных для опухолевых клеток. Далее происходит создание набора ДНК-матриц, содержащих открытую рамку считывания, кодирующую обнаруженные генные сигнатуры. При этом существует вариант, когда в одной ДНК-матрице содержится открытая рамка считывания, которая кодирует одну обнаруженную генную сигнатуру. В другом варианте одна ДНК-матрица содержит открытую рамку считывания, кодирующую от 2 до 80 обнаруженных генных сигнатур. Максимальное количество генных сигнатур в одной ДНК матрице в этом варианте определяется максимальной емкостью генетической конструкции. Также это количество зависит от того, сколько специфических генных сигнатур было обнаружено в опухоли у конкретного пациента. Кроме открытой рамки считывания, ДНК-матрица содержит все конструктивные элементы для транскрипции функциональной мРНК, а также элементы, необходимые для наращивания плазмиды в культуре бактериальных клеток.The developed method involves sequencing DNA isolated from the patient's tumor cells, the results of which are used to compile a mutant - a set of somatic cancer mutations in a single tumor. In this case, using an original algorithm, gene signatures inherent in the tumor cells of a specific patient are determined (i.e. specific changes in gene expression characteristic of the tumor cells of a given patient). The ultimate goal of determining gene signatures is to search for highly immunogenic antigens that are strictly specific for tumor cells. Next, a set of DNA matrices is created containing an open reading frame encoding the detected gene signatures. In this case, there is an option when one DNA matrix contains an open reading frame that encodes one detected gene signature. In another option, one DNA matrix contains an open reading frame encoding from 2 to 80 detected gene signatures. The maximum number of gene signatures in one DNA matrix in this variant is determined by the maximum capacity of the genetic construct. This number also depends on how many specific gene signatures were detected in the tumor of a particular patient. In addition to the open reading frame, the DNA matrix contains all the constructive elements for the transcription of functional mRNA, as well as the elements necessary for the growth of the plasmid in the bacterial cell culture.
Было разработано несколько вариантов ДНК-матриц, кодирующих:Several variants of DNA matrices have been developed encoding:
1) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO:1 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID NO:6 после открытой рамки считывания.1) mRNA that has the sequence SEQ ID NO:1 before the open reading frame and has the sequence SEQ ID NO:6 after the open reading frame.
2) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO:2 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID NO:6 после открытой рамки считывания.2) mRNA that has the sequence SEQ ID NO:2 before the open reading frame and has the sequence SEQ ID NO:6 after the open reading frame.
3) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO:3 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID NO:6 после открытой рамки считывания.3) mRNA that has the sequence SEQ ID NO:3 before the open reading frame and has the sequence SEQ ID NO:6 after the open reading frame.
4) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO:4 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID NO:6 после открытой рамки считывания.4) mRNA that has the sequence SEQ ID NO:4 before the open reading frame and has the sequence SEQ ID NO:6 after the open reading frame.
5) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO:5 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID NO:6 после открытой рамки считывания.5) mRNA that has the sequence SEQ ID NO:5 before the open reading frame and has the sequence SEQ ID NO:6 after the open reading frame.
6) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO:8 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID NO:6 после открытой рамки считывания.6) mRNA that has the sequence SEQ ID NO:8 before the open reading frame and has the sequence SEQ ID NO:6 after the open reading frame.
7) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO:1 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID NO:7 после открытой рамки считывания.7) mRNA that has the sequence SEQ ID NO:1 before the open reading frame and has the sequence SEQ ID NO:7 after the open reading frame.
8) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO:2 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID NO:7 после открытой рамки считывания.8) mRNA that has the sequence SEQ ID NO:2 before the open reading frame and has the sequence SEQ ID NO:7 after the open reading frame.
9) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO:3 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID NO:7 после открытой рамки считывания.9) mRNA that has the sequence SEQ ID NO:3 before the open reading frame and has the sequence SEQ ID NO:7 after the open reading frame.
10) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO:4 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID NO:7 после открытой рамки считывания.10) mRNA that has the sequence of SEQ ID NO:4 before the open reading frame and has the sequence of SEQ ID NO:7 after the open reading frame.
11) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO:5 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID NO:7 после открытой рамки считывания.11) mRNA that has the sequence SEQ ID NO:5 before the open reading frame and has the sequence SEQ ID NO:7 after the open reading frame.
12) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO:8 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID NO:7 после открытой рамки считывания.12) mRNA that has the sequence of SEQ ID NO:8 before the open reading frame and has the sequence of SEQ ID NO:7 after the open reading frame.
Во всех представленных последовательностях мРНК уридин был заменен на псевдоуридин.In all presented mRNA sequences, uridine was replaced by pseudouridine.
В примере 5 продемонстрировано, что все перечисленные конструкции мРНК способны обеспечивать трансляцию мРНК. Для этого был созданы перечисленные выше мРНК, содержащие различные конструктивные элементы на 5' (SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 SEQ ID NO:8) и 3' концах (SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:7), c открытой рамкой считывания, кодирующей люциферазу. Таким образом, после введения данных мРНК в мышей, можно было оценить синтез люциферазы по реакции с люциферином, которая сопровождается люминесценцией. Кроме того, авторы получали различные варианты данных конструкций с открытой рамкой считывания, кодирующей опухолевые генные сигнатуры, которые обладали высокой противоопухолевой активностью.Example 5 demonstrates that all of the listed mRNA constructs are capable of providing mRNA translation. For this purpose, the above mRNAs were created, containing various constructs at the 5' (SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 SEQ ID NO:8) and 3' ends (SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:7), with an open reading frame encoding luciferase. Thus, after introducing these mRNAs into mice, it was possible to evaluate the synthesis of luciferase by the reaction with luciferin, which is accompanied by luminescence. In addition, the authors obtained various versions of these constructs with an open reading frame encoding tumor gene signatures, which had high antitumor activity.
мРНК, полученные в результате транскрипции in vitro с использованием разработанных ДНК-матриц, в дальнейшем упаковывали в липидные наночастицы и вводили в организм млекопитающих.mRNAs obtained from in vitro transcription using the designed DNA templates were then packaged into lipid nanoparticles and administered to mammals.
Было показано, что трансляция мРНК, содержащих открытую рамку считывания, кодирующую генные сигнатуры, специфичные для опухолевых клеток способствует распознаванию иммунной системой опухолевых антигенов. В результате иммунная система эффективно находит и уничтожает опухолевые клетки, таким образом формируя систему надзора за опухолевыми клетками. Было показано, что данный эффект коррелирует с изменениями в микроокружении опухоли. Осуществление изобретения подтверждается следующими примерами.Translation of mRNA containing an open reading frame encoding gene signatures specific to tumor cells has been shown to promote recognition of tumor antigens by the immune system. As a result, the immune system effectively finds and destroys tumor cells, thus forming a tumor cell surveillance system. This effect has been shown to correlate with changes in the tumor microenvironment. The implementation of the invention is supported by the following examples.
Пример 1. Выявление отличий в генных сигнатурах опухолевых и нормальных клеток.Example 1. Identification of differences in gene signatures of tumor and normal cells.
Поиск генетических сигнатур опухолевых и нормальных клеток осуществляется на основе получения генетических данных, характеризующих полный геном и/или экзом (для нормальных и опухолевых клеток) и транскриптом (для опухолевых клеток). Экстракция нуклеиновых кислот из образцов и проведение секвенирования выполняются с использованием доступных коммерческих наборов в соответствии с инструкциями производителя. Полученные данные анализируются с помощью оригинального программного обеспечения, которое позволяет провести контроль качества геномных данных, фильтрацию и удаление низкокачественных данных секвенирования, картирование на референсную последовательность, определение зародышевых и соматических мутаций, поиска специфических антигенов, включая биоинформатическое предсказание связывания пептидов с молекулами главного комплекса гистосовместимости (ГКГ), которые могут быть представлены на поверхности клеток и распознаны Т-клетками, а также оценку иммуногенности и ряда других показателей. В зависимости от генетического ландшафта опухоли количество отобранных генных сигнатур может варьироваться от нескольких единиц до двух сотен, которые могут быть представлены в генетической конструкции в моноварианте (одна конструкция - одна генная сигнатура), так и объединены в конкатемер (несколько выявленных генных сигнатур расположены последовательно друг за другом). Для демонстрации работоспособности подхода была использована модель мышиной меланомы. Однако приведенный пример использования биоинформатического алгоритма для выбора генных сигнатур, характерных для опухолевых клеток, является универсальным и может быть использован для разных видов опухолей и разных видов млекопитающих, в том числе для людей.The search for genetic signatures of tumor and normal cells is performed based on obtaining genetic data characterizing the complete genome and/or exome (for normal and tumor cells) and transcriptome (for tumor cells). Extraction of nucleic acids from samples and sequencing are performed using available commercial kits in accordance with the manufacturer's instructions. The obtained data are analyzed using original software that allows for quality control of genomic data, filtering and removal of low-quality sequencing data, mapping to a reference sequence, determining germline and somatic mutations, searching for specific antigens, including bioinformatic prediction of peptide binding to major histocompatibility complex (MHC) molecules that can be presented on the cell surface and recognized by T cells, as well as assessment of immunogenicity and a number of other indicators. Depending on the genetic landscape of the tumor, the number of selected gene signatures can vary from several units to two hundred, which can be presented in the genetic construct in a monovariant (one construct - one gene signature), or combined into a concatemer (several identified gene signatures are located sequentially one after another). To demonstrate the efficiency of the approach, a mouse melanoma model was used. However, the given example of using a bioinformatics algorithm to select gene signatures characteristic of tumor cells is universal and can be used for different types of tumors and different species of mammals, including humans.
В эксперименте использовались мыши C57BL/6 (самки, возраст 6-8 недель, средний вес 20 г). Все исследования на животных проводились в соответствии с этическими нормами. Сингенные клетки мышиной меланомы B16-F10 были получены из коллекции ФГБУ «НИЦЭМ им Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России. Клетки культивировали в среде DMEM (Gibco, США) с добавлением 10% FBS (Gibco, США), 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (Gibco, США) в инкубаторе с содержанием 5% CO2 при температуре 37°С. По достижению 70-80% монослоя, клетки открепляли трипсином и переносили в центрифужные пробирки. А затем осаждали на центрифуге при 1000 оборотах, 10 минут. Далее к осадку добавляли однократный фосфатно-солевой буфер, перемешивали и осаждали на центрифуге при 1000 оборотах, 10 минут. Промывку фосфатно-солевым буфером проводили дважды. Клетки разводили в однократном фосфатно-солевом буфере в концентрации 2×106 кл/мл. Перед введением опухолевых клеток мышей линии C57b/6 подвергали ингаляционному наркозу (3% Изофлуран). Клетки вводили подкожно в правый бок мыши по 100 мкл (2×105 клеток на мышь).C57BL/6 mice (female, 6-8 weeks old, average weight 20 g) were used in the experiment. All animal studies complied with ethical standards. Syngeneic mouse melanoma B16-F10 cells were obtained from the collection of the Gamaleya National Research Center for Epidemiology and Microbiology of the Russian Ministry of Health. The cells were cultured in DMEM (Gibco, USA) supplemented with 10% FBS (Gibco, USA), 100 U/ml penicillin, and 100 μg/ml streptomycin (Gibco, USA) in an incubator containing 5% CO 2 at 37°C. Upon reaching 70-80% confluency, the cells were detached with trypsin and transferred to centrifuge tubes. They were then centrifuged at 1000 rpm for 10 minutes. Next, a single phosphate-buffered saline was added to the sediment, mixed and sedimented in a centrifuge at 1000 rpm for 10 minutes. Washing with phosphate-buffered saline was performed twice. The cells were diluted in a single phosphate-buffered saline at a concentration of 2×10 6 cells/ml. Before the introduction of tumor cells, C57b/6 mice were subjected to inhalation anesthesia (3% Isoflurane). The cells were injected subcutaneously into the right side of the mouse at 100 μl (2×10 5 cells per mouse).
Через 12 дней отбирали образцы опухолевой и здоровой ткани. Далее проводили полногеномное, экзомное и транскриптомное секвенирования на приборе MGI G400 (MGI, Китай). Полученные данные анализировали с помощью оригинального программного обеспечения, которое позволило выявить около 500 мутаций, характерных для данной опухоли. На основании полученного мутанома был сформирован список специфических антигенов, который в дальнейшем был отфильтрован и приоритизирован по ряду критериев: уровень экспрессии мутантного гена, уникальность (для минимизации риска аутоиммунных реакций), агретопность.After 12 days, tumor and healthy tissue samples were collected. Then, whole-genome, exome, and transcriptome sequencing was performed on an MGI G400 device (MGI, China). The obtained data were analyzed using original software, which made it possible to identify about 500 mutations characteristic of this tumor. Based on the obtained mutanome, a list of specific antigens was formed, which was then filtered and prioritized according to a number of criteria: the expression level of the mutant gene, uniqueness (to minimize the risk of autoimmune reactions), and aggretopicity.
Таким образом, в результате проведенной работы было выявлено 10 генных сигнатур, характерных для данного типа опухоли: SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18. Полученные последовательности далее были использованы для получения ДНК-матриц.Thus, as a result of the work carried out, 10 gene signatures characteristic of this type of tumor were identified: SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18. The obtained sequences were then used to obtain DNA matrices.
Пример 2. Создание ДНК-матрицы для получения мРНК.Example 2. Creation of a DNA matrix for obtaining mRNA.
Целью данного этапа работы являлось создание ДНК-матрицы для получения мРНК. ДНК матрица представляет собой кольцевую плазмидную ДНК, содержащую открытую рамку считывания, кодирующую выявленные генные сигнатуры. В ходе работы были разработаны варианты ДНК-матриц содержащие как отдельные генные сигнатуры опухолевых клеток, так содержащие несколько генных сигнатур в одной рамке считывания.The goal of this stage of the work was to create a DNA matrix for obtaining mRNA. The DNA matrix is a circular plasmid DNA containing an open reading frame encoding the identified gene signatures. In the course of the work, DNA matrix variants were developed containing both individual gene signatures of tumor cells and several gene signatures in one reading frame.
Кроме, открытой рамки считывания, ДНК-матрица содержит все структурные компоненты необходимые для эффективной наработки мРНК in vitro, а также элементы необходимые для репликации ДНК в E.coli и ген устойчивости к ампициллину.In addition to the open reading frame, the DNA matrix contains all the structural components necessary for efficient mRNA production in vitro, as well as elements necessary for DNA replication in E. coli and the ampicillin resistance gene.
После транскрипции с разработанной ДНК матрицы образуется мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO:2 до открытой рамки считывания и SEQ ID NO:7 после открытой рамки считывания.After transcription from the designed DNA template, mRNA is formed, which has the sequence SEQ ID NO:2 before the open reading frame and SEQ ID NO:7 after the open reading frame.
Последовательности, кодирующие выявленные генные сигнатуры (SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18) были синтезированы из олигонуклеотидных праймеров и фланкированы зонами гомологии с плазмидным вектором, необходимым для сборки ДНК-матрицы. Далее, линеаризованный по сайту HindIII плазмидный вектор и ПЦР-продукт (содержащий генные сигнатуры) были объединены методом сборки по Гибсону с использованием коммерческого набора Gibson Assembly® Ultra kit (Codex, USA). Все молекулярно-биологические работы (клонирования), проводились с помощью E. coli Top10 электрокомпетентных клеток. Подбор олигонуклеотидных праймеров проводился с помощью программы SnapGene v6.1.2.Sequences encoding the identified gene signatures (SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18) were synthesized from oligonucleotide primers and flanked by homology zones with the plasmid vector required for assembly of the DNA template. Next, the plasmid vector linearized at the HindIII site and the PCR product (containing the gene signatures) were combined by the Gibson assembly method using the commercial Gibson Assembly® Ultra kit (Codex, USA). All molecular biology work (cloning) was performed using E. coli Top10 electrocompetent cells. The selection of oligonucleotide primers was carried out using the SnapGene v6.1.2 program.
Амплификация нуклеиновых кислот проводилась на приборах MiniAmp (Thermofisher) и Т100 (Biorad). Высокоспецифичная амплификация фрагментов ДНК проводилась с помощью набора 2X Platinum SuperFi Green MasterMix. Условия амплификации согласно рекомендации производителя. Очистка ПЦР-продуктов для клонирования из агарозного геля проводилась набором QIAquick Gel Extraction kit (QIAGEN) согласно инструкции производителя.Nucleic acid amplification was performed using MiniAmp (Thermofisher) and T100 (Biorad) devices. Highly specific amplification of DNA fragments was performed using the 2X Platinum SuperFi Green MasterMix kit. Amplification conditions were as recommended by the manufacturer. Purification of PCR products for cloning from agarose gel was performed using the QIAquick Gel Extraction kit (QIAGEN) according to the manufacturer's instructions.
Кроме того, были получены: последовательность, кодирующая несколько генных сигнатур в одной рамке считывания (SEQ ID NO:19), а также последовательность, кодирующая три генных сигнатуры в одной рамке считывания, соединенные через линкер (SEQ ID NO:20). Данные последовательности были синтезированы ЗАО «Евроген» и помещены в ДНК-матрицу с помощью методов генной инженерии, аналогично описанному выше.In addition, a sequence encoding several gene signatures in one reading frame (SEQ ID NO:19) and a sequence encoding three gene signatures in one reading frame connected via a linker (SEQ ID NO:20) were obtained. These sequences were synthesized by Evrogen CJSC and placed into a DNA matrix using genetic engineering methods similar to those described above.
Наращивание клеток E. сoli, трансформированных ДНК-матрицей, проводилось в жидкой среде 2xYT (1,6% Триптон, 1% Дрожжевой экстракт, 0,5% NaCl) или на твердой среде 2xYT + 2% агар, с антибиотиком. Плазмидная ДНК выделялась из ночной культуры E. coli объемом 4 мл с помощью QIAGEN Plasmid Midi Kit (100) (QIAGEN: 12143) или QIAGEN Plasmid Maxi Kit (25) (QIAGEN: 12163) по стандартному протоколу, предложенному производителем. После выделения плазмидной ДНК измеряли ее концентрацию на флуориметре Qubit®4.0 (Invitrogene, США) с использованием реагентов из коммерческого набора Qubit®dsDNA High Sensitivity Assay Kits (Life Technologies: Q32854) по стандартному протоколу, предложенному производителем. Правильность сборки финальных плазмид подтверждалась секвенированием по Сэнгеру на аппарате Genetic Analyzer 3500 (Applied Biosystems), используя коммерческий набор BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit, согласно рекомендациям производителя.E. coli cells transformed with DNA template were grown in 2xYT liquid medium (1.6% Tryptone, 1% Yeast extract, 0.5% NaCl) or on 2xYT solid medium + 2% agar with antibiotic. Plasmid DNA was isolated from 4 ml overnight E. coli culture using QIAGEN Plasmid Midi Kit (100) (QIAGEN: 12143) or QIAGEN Plasmid Maxi Kit (25) (QIAGEN: 12163) according to the standard protocol suggested by the manufacturer. After plasmid DNA isolation, its concentration was measured on a Qubit®4.0 fluorimeter (Invitrogene, USA) using reagents from the commercial Qubit®dsDNA High Sensitivity Assay Kits (Life Technologies: Q32854) according to the standard protocol suggested by the manufacturer. The correct assembly of the final plasmids was confirmed by Sanger sequencing on a Genetic Analyzer 3500 (Applied Biosystems) using the commercial BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit, according to the manufacturer's recommendations.
Кроме того был получен ряд ДНК-матриц, которые содержат открытую рамку считывания с последовательностью люциферазы и кодируют различные варианты конструктивных элементов мРНК, в частности:In addition, a number of DNA matrices were obtained that contain an open reading frame with a luciferase sequence and encode various variants of mRNA constructs, in particular:
13) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO:1 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID NO:6 после открытой рамки считывания.13) mRNA that has the sequence SEQ ID NO:1 before the open reading frame and has the sequence SEQ ID NO:6 after the open reading frame.
14) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO:2 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID NO:6 после открытой рамки считывания.14) mRNA that has the sequence of SEQ ID NO:2 before the open reading frame and has the sequence of SEQ ID NO:6 after the open reading frame.
15) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO:3 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID NO:6 после открытой рамки считывания.15) mRNA that has the sequence SEQ ID NO:3 before the open reading frame and has the sequence SEQ ID NO:6 after the open reading frame.
16) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO:4 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID NO:6 после открытой рамки считывания.16) mRNA that has the sequence of SEQ ID NO:4 before the open reading frame and has the sequence of SEQ ID NO:6 after the open reading frame.
17) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO:5 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID NO:6 после открытой рамки считывания.17) mRNA that has the sequence of SEQ ID NO:5 before the open reading frame and has the sequence of SEQ ID NO:6 after the open reading frame.
18) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO:8 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID NO:6 после открытой рамки считывания.18) mRNA that has the sequence of SEQ ID NO:8 before the open reading frame and has the sequence of SEQ ID NO:6 after the open reading frame.
19) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO:1 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID NO:7 после открытой рамки считывания.19) mRNA that has the sequence SEQ ID NO:1 before the open reading frame and has the sequence SEQ ID NO:7 after the open reading frame.
20) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO:2 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID NO:7 после открытой рамки считывания.20) mRNA that has the sequence of SEQ ID NO:2 before the open reading frame and has the sequence of SEQ ID NO:7 after the open reading frame.
21) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO:3 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID NO:7 после открытой рамки считывания.21) mRNA that has the sequence of SEQ ID NO:3 before the open reading frame and has the sequence of SEQ ID NO:7 after the open reading frame.
22) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO:4 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID NO:7 после открытой рамки считывания.22) mRNA that has the sequence of SEQ ID NO:4 before the open reading frame and has the sequence of SEQ ID NO:7 after the open reading frame.
23) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO:5 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID NO:7 после открытой рамки считывания.23) mRNA that has the sequence of SEQ ID NO:5 before the open reading frame and has the sequence of SEQ ID NO:7 after the open reading frame.
24) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO:8 до открытой рамки считывания и имеет последовательность SEQ ID NO:7 после открытой рамки считывания.24) mRNA that has the sequence of SEQ ID NO:8 before the open reading frame and has the sequence of SEQ ID NO:7 after the open reading frame.
Таким образом, в результате проведенной работы был получен ряд ДНК матриц, кодирующих мРНК с последовательностью SEQ ID NO:2 до открытой рамки считывания и последовательностью SEQ ID NO:7 после открытой рамки считывания, при этом рамка считывания кодирует одну или несколько генных сигнатур опухолевых клеток (SEQ ID NO:9, или SEQ ID NO:10, или SEQ ID NO:11, или SEQ ID NO:12, или SEQ ID NO:13, или SEQ ID NO:14, или SEQ ID NO:15, или SEQ ID NO:16, или SEQ ID NO:17, или SEQ ID NO:18, или SEQ ID NO:19, или SEQ ID NO:20).Thus, as a result of the work performed, a series of DNA matrices were obtained encoding mRNA with the sequence SEQ ID NO:2 before the open reading frame and the sequence SEQ ID NO:7 after the open reading frame, wherein the reading frame encodes one or more gene signatures of tumor cells (SEQ ID NO:9, or SEQ ID NO:10, or SEQ ID NO:11, or SEQ ID NO:12, or SEQ ID NO:13, or SEQ ID NO:14, or SEQ ID NO:15, or SEQ ID NO:16, or SEQ ID NO:17, or SEQ ID NO:18, or SEQ ID NO:19, or SEQ ID NO:20).
Кроме того, были получены ДНК-матрицы, кодирующие мРНК с различными конструктивными элементами на 5' (SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 SEQ ID NO:8) и 3' концах (SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:7), c открытой рамкой считывания, кодирующей люциферазу.In addition, DNA templates encoding mRNA with various structural elements at the 5' (SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:8) and 3' ends (SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:7), with an open reading frame encoding luciferase, were obtained.
Пример 3. Синтез мРНК на основе полученных ДНК-матриц, содержащих открытую рамку считывания, кодирующую обнаруженные генные сигнатуры.Example 3. Synthesis of mRNA based on the obtained DNA matrices containing an open reading frame encoding the detected gene signatures.
Для синтеза мРНК проводили реакцию транскрипции in vitro с использованием ДНК-матриц, полученных в предыдущем примере.To synthesize mRNA, an in vitro transcription reaction was performed using DNA templates obtained in the previous example.
Для проведения реакции in vitro транскрипции необходимы следующие компоненты:To carry out the in vitro transcription reaction, the following components are required:
- смесь нуклеотидов (Аденозин - 5'- трифосфат (ATP), Гуанозин - 5' - трифосфат (GTP), Цитидин - 5' - трифосфат (CTP) и N1-метилпсевдоуридин-5'-трифосфат (N1-Me-PseudoUTP)) (Биолабмикс);- a mixture of nucleotides (Adenosine - 5'-triphosphate (ATP), Guanosine - 5'-triphosphate (GTP), Cytidine - 5'-triphosphate (CTP) and N1-methylpseudouridine-5'-triphosphate (N1-Me-PseudoUTP)) (Biolabmix);
- аналог структуры кэпа1 m7GmAmG (Биолабмикс);- analogue of the structure of cap1 m7GmAmG (Biolabmix);
- ингибитор РНКаз (Биолабмикс);- RNase inhibitor (Biolabmix);
- пирофосфатаза;- pyrophosphatase;
- T7-РНК-полимераза (Биолабмикс);- T7 RNA polymerase (Biolabmix);
- T7-буфер для IVT;- T7 buffer for IVT;
- добавочный буфер.- additional buffer.
В таблице 1 представлен состав реакционной смеси, рассчитанный на 100 мкл реакции с количеством ДНК-матрицы от 2 до 5 мкг. При необходимости объем реакции можно уменьшать до 25 мкл кратно снижая количества компонентов. Перед началом IVT все компоненты размораживаются на льду, перемешиваются на вортексе. Далее составляется реакция, компоненты добавляются в представленном порядке.Table 1 shows the composition of the reaction mixture calculated for 100 µl of the reaction with a DNA matrix amount of 2 to 5 µg. If necessary, the reaction volume can be reduced to 25 µl by reducing the number of components several times. Before starting IVT, all components are defrosted on ice and mixed on a vortex. Then the reaction is composed, the components are added in the order presented.
Таблица 1. Состав реакционной для синтеза мРНК с котранскрипционным кэпированием аналогом кэпа-1 m7GmAmGTable 1. Composition of the reaction for the synthesis of mRNA with cotranscriptional capping by the cap-1 analog m7GmAmG
Реакционную смесь инкубируют при температуре +37°С в течение 120 минут, после чего к ней добавляют 1 мкл ДНКазы + 12 мкл буфера для ДНКазы (10х) («Синтол») и смесь инкубируют еще 30 минут.The reaction mixture is incubated at a temperature of +37°C for 120 minutes, after which 1 µl of DNase + 12 µl of DNase buffer (10x) (Synthol) are added to it and the mixture is incubated for another 30 minutes.
Таким образом, в результате проведенной работы был получен набор мРНК с последовательностью SEQ ID NO:2 до открытой рамки считывания и последовательностью SEQ ID NO:7 после открытой рамки считывания, при этом рамка считывания кодирует одну или несколько генных сигнатур опухолевых клеток (SEQ ID NO:9, или SEQ ID NO:10, или SEQ ID NO:11, или SEQ ID NO:12, или SEQ ID NO:13, или SEQ ID NO:14, или SEQ ID NO:15, или SEQ ID NO:16, или SEQ ID NO:17, или SEQ ID NO:18, или SEQ ID NO:19, или SEQ ID NO:20 ).Thus, as a result of the work performed, a set of mRNA was obtained with the sequence SEQ ID NO:2 before the open reading frame and the sequence SEQ ID NO:7 after the open reading frame, wherein the reading frame encodes one or more gene signatures of tumor cells (SEQ ID NO:9, or SEQ ID NO:10, or SEQ ID NO:11, or SEQ ID NO:12, or SEQ ID NO:13, or SEQ ID NO:14, or SEQ ID NO:15, or SEQ ID NO:16, or SEQ ID NO:17, or SEQ ID NO:18, or SEQ ID NO:19, or SEQ ID NO:20).
Кроме того, были получен набор мРНК с различными конструктивными элементами на 5' (SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 SEQ ID NO:8) и 3' концах (SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:7), c открытой рамкой считывания, кодирующей люциферазу.In addition, a set of mRNAs with different constructs at the 5' (SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:8) and 3' ends (SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:7), with an open reading frame encoding luciferase, were obtained.
Пример 4. Получение липидных наночастиц, содержащих синтезированные мРНК.Example 4. Obtaining lipid nanoparticles containing synthesized mRNA.
мРНК, синтез которых описан в примере 3 инкапсулировали в липидные наночастицы (ЛНЧ) с использованием процесса микрофлюидного смешивания быстрого раствора мРНК (pH 3,0) с раствором липидов, растворенных в спирте. Для этого липиды растворяли в 96 % этаноле при молярных соотношениях 46,3:9:42,7:1,6 (ионизируемый липид: дистеароилфосфатидилхолин (DSPC): холестерин: пегилированный липид (ПЭГ-липид)). Ионизируемый липид Acuitas (ALC-0315) и ПЭГ-липид (1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-метоксиполиэтиленгликоль 2000) были приобретены в Cayman Chemical Company. Раствор мРНК с рабочей концентрацией 0,2 мг/мл готовили смешением воды Molecular biology grade, 10x цитратного буфера (pH 3,0) и стокового раствора мРНК. Раствор липидов объединяли с раствором мРНК (0,2 мг/мл) в объемном соотношении 3:1 (водный раствор: спиртовой раствор), используя микрожидкостное смешивание в системе Nanoassmblr Benchtop (Precision NanoSystems). Отношение ионизируемых атомов азота в ионизируемом липиде к количеству фосфатных групп в мРНК (соотношение N:P) равно 6 для каждой композиции. Полученные формуляции подвергали диализу против раствора PBS (pH 7,2) в диализных кассетах 20 kDa Slide-A-Lyzer (Thermo Fisher Scientific) overnight при слабом перемешивании буферного раствора на магнитной мешалке в холодильной камере при +4°. По завершению диализа шприцом отбирали суспензию липидных наночастиц из диализной кассеты, фильтровали через 0,2 мкм Acrodisk фильтр (Supor membrane, Pall corporation) и хранили препараты ЛНЧ при +4°C до использования.mRNAs, the synthesis of which is described in Example 3, were encapsulated in lipid nanoparticles (LNPs) using a microfluidic mixing process of a rapid solution of mRNA (pH 3.0) with a solution of lipids dissolved in alcohol. For this, lipids were dissolved in 96% ethanol at molar ratios of 46.3:9:42.7:1.6 (ionizable lipid: distearoylphosphatidylcholine (DSPC): cholesterol: PEGylated lipid (PEG lipid)). Acuitas ionizable lipid (ALC-0315) and PEG lipid (1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-methoxypolyethyleneglycol 2000) were purchased from Cayman Chemical Company. An mRNA solution with a working concentration of 0.2 mg/mL was prepared by mixing molecular biology grade water, 10x citrate buffer (pH 3.0), and mRNA stock solution. The lipid solution was combined with the mRNA solution (0.2 mg/mL) in a volume ratio of 3:1 (aqueous solution: alcohol solution) using microfluidic mixing in a Nanoassmblr Benchtop system (Precision NanoSystems). The ratio of ionizable nitrogen atoms in the ionizable lipid to the number of phosphate groups in the mRNA (N:P ratio) was 6 for each composition. The resulting formulations were dialyzed against PBS (pH 7.2) in 20 kDa Slide-A-Lyzer dialysis cassettes (Thermo Fisher Scientific) overnight with gentle stirring of the buffer solution on a magnetic stirrer in a refrigerator at +4°. Upon completion of dialysis, the lipid nanoparticle suspension was withdrawn from the dialysis cassette using a syringe, filtered through a 0.2 μm Acrodisk filter (Supor membrane, Pall corporation), and the LNP preparations were stored at +4°C until use.
Таким образом, в результате проведенной работы был получен набор липидных частиц, содержащих мРНК с последовательностью SEQ ID NO:2 до открытой рамки считывания и последовательностью SEQ ID NO:7 после открытой рамки считывания, при этом рамка считывания кодирует одну или несколько генных сигнатур опухолевых клеток (SEQ ID NO:9, или SEQ ID NO:10, или SEQ ID NO:11, или SEQ ID NO:12, или SEQ ID NO:13, или SEQ ID NO:14, или SEQ ID NO:15, или SEQ ID NO:16, или SEQ ID NO:17, или SEQ ID NO:18, или SEQ ID NO:19, или SEQ ID NO:20 ).Thus, as a result of the work performed, a set of lipid particles was obtained containing mRNA with the sequence SEQ ID NO:2 before the open reading frame and the sequence SEQ ID NO:7 after the open reading frame, wherein the reading frame encodes one or more gene signatures of tumor cells (SEQ ID NO:9, or SEQ ID NO:10, or SEQ ID NO:11, or SEQ ID NO:12, or SEQ ID NO:13, or SEQ ID NO:14, or SEQ ID NO:15, or SEQ ID NO:16, or SEQ ID NO:17, or SEQ ID NO:18, or SEQ ID NO:19, or SEQ ID NO:20).
Кроме того, были получен набор липидных частиц, содержащих мРНК с различными конструктивными элементами на 5' (SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 SEQ ID NO:8) и 3' концах (SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:7), c открытой рамкой считывания, кодирующей люциферазу.In addition, a set of lipid particles containing mRNA with different structural elements at the 5' (SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:8) and 3' ends (SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:7), with an open reading frame encoding luciferase, were obtained.
Полученные липидные частицы использовались для доставки мРНК в клетки млекопитающих.The resulting lipid particles were used to deliver mRNA into mammalian cells.
Пример 5. Оценка экспрессии целевого антигена после введения различных конструкций мРНК, кодирующих люциферазу.Example 5. Evaluation of target antigen expression after administration of various mRNA constructs encoding luciferase.
В данном эксперименте были использованы мыши линии BALB/c весом около 18 г. Животные были разделены на несколько экспериментальных групп, которым вводили:In this experiment, BALB/c mice weighing about 18 g were used. The animals were divided into several experimental groups, which were administered:
1) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO:1 на 5' конце, открытую рамку считывания, кодирующую люциферазу и последовательность SEQ ID NO:6 на 3' конце.1) mRNA that has the sequence SEQ ID NO:1 at the 5' end, an open reading frame encoding luciferase and the sequence SEQ ID NO:6 at the 3' end.
2) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO:2 на 5' конце, открытую рамку считывания, кодирующую люциферазу и последовательность SEQ ID NO:6 на 3' конце.2) mRNA that has the sequence SEQ ID NO:2 at the 5' end, an open reading frame encoding luciferase and the sequence SEQ ID NO:6 at the 3' end.
3) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO:3 на 5' конце, открытую рамку считывания, кодирующую люциферазу и последовательность SEQ ID NO:6 на 3' конце.3) mRNA that has the sequence SEQ ID NO:3 at the 5' end, an open reading frame encoding luciferase and the sequence SEQ ID NO:6 at the 3' end.
4) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO:4 на 5' конце, открытую рамку считывания, кодирующую люциферазу и последовательность SEQ ID NO:6 на 3' конце.4) mRNA that has the sequence SEQ ID NO:4 at the 5' end, an open reading frame encoding luciferase and the sequence SEQ ID NO:6 at the 3' end.
5) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO:5 на 5' конце, открытую рамку считывания, кодирующую люциферазу и последовательность SEQ ID NO:6 на 3' конце.5) mRNA that has the sequence SEQ ID NO:5 at the 5' end, an open reading frame encoding luciferase and the sequence SEQ ID NO:6 at the 3' end.
6) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO:8 на 5' конце, открытую рамку считывания, кодирующую люциферазу и последовательность SEQ ID NO:6 на 3' конце.6) mRNA that has the sequence SEQ ID NO:8 at the 5' end, an open reading frame encoding luciferase and the sequence SEQ ID NO:6 at the 3' end.
7) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO:1 на 5' конце, открытую рамку считывания, кодирующую люциферазу и последовательность SEQ ID NO:7 на 3' конце.7) mRNA that has the sequence SEQ ID NO:1 at the 5' end, an open reading frame encoding luciferase and the sequence SEQ ID NO:7 at the 3' end.
8) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO:2 на 5' конце, открытую рамку считывания, кодирующую люциферазу и последовательность SEQ ID NO:7 на 3' конце.8) mRNA that has the sequence SEQ ID NO:2 at the 5' end, an open reading frame encoding luciferase and the sequence SEQ ID NO:7 at the 3' end.
9) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO:3 на 5' конце, открытую рамку считывания, кодирующую люциферазу и последовательность SEQ ID NO:7 на 3' конце.9) mRNA that has the sequence SEQ ID NO:3 at the 5' end, an open reading frame encoding luciferase and the sequence SEQ ID NO:7 at the 3' end.
10) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO:4 на 5' конце, открытую рамку считывания, кодирующую люциферазу и последовательность SEQ ID NO:7 на 3' конце.10) mRNA that has the sequence SEQ ID NO:4 at the 5' end, an open reading frame encoding luciferase and the sequence SEQ ID NO:7 at the 3' end.
11) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO:5 на 5' конце, открытую рамку считывания, кодирующую люциферазу и последовательность SEQ ID NO:7 на 3' конце.11) mRNA that has the sequence SEQ ID NO:5 at the 5' end, an open reading frame encoding luciferase and the sequence SEQ ID NO:7 at the 3' end.
12) мРНК, которая имеет последовательность SEQ ID NO:8 на 5' конце, открытую рамку считывания, кодирующую люциферазу и последовательность SEQ ID NO:7 на 3' конце12) mRNA that has the sequence SEQ ID NO:8 at the 5' end, an open reading frame encoding luciferase and the sequence SEQ ID NO:7 at the 3' end
Через 3 часа после введения экспериментальных средств мышам внутрибрюшинно вводили 100 мкл раствора D-люциферина в PBS (25 мг/мл). Через 5 минут после инъекции животных анестезировали 1-2% изофлураном и помещали в систему визуализации IVIS Lumina III (Perkin Elmer). Фотографии мышей были обработаны с помощью программного обеспечения Living Image (Perkin Elmer).Three hours after the administration of the experimental agents, mice were intraperitoneally injected with 100 μl of D-luciferin solution in PBS (25 mg/ml). Five minutes after the injection, the animals were anesthetized with 1-2% isoflurane and placed in the IVIS Lumina III imaging system (Perkin Elmer). Photographs of the mice were processed using Living Image software (Perkin Elmer).
Полученные данные показаны на Фиг. 1. Как видно из результатов эксперимента после введения все исследуемых конструкций мРНК наблюдалась экспрессия люциферазы в месте введения и печени животных.The obtained data are shown in Fig. 1. As can be seen from the results of the experiment, after the introduction of all the studied mRNA constructs, expression of luciferase was observed at the injection site and in the liver of the animals.
Пример 6. Способ применения разработанного иммунобиологического средства для индукции иммунного ответа к опухолевым клеткам, имеющим генные сигнатуры, входящие в состав мРНК вектора.Example 6. Method of using the developed immunobiological agent to induce an immune response to tumor cells that have gene signatures included in the mRNA vector.
В эксперименте использовалась клеточная линия B16-F10 сингенная меланома мышей линии C57bl/6. Клетки культивировали в 75 см2 культуральных флаконах в среде DMEM (Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium) c добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, пенициллина, стрептомицина и L-глутамина в инкубаторе с содержанием 5% CO2 при температуре 37°С. По достижению 70-80% монослоя, клетки открепляли трипсином и переносили в центрифужные пробирки. А затем осаждали на центрифуге при 1000 оборотах, 10 минут. Затем к осадку добавляли однократный фосфатно-солевой буфер, перемешивали и осаждали на центрифуге при 1000 оборотах, 10 минут. Промывку фосфатно-солевым буфером проводили дважды. Клетки разводили в однократном фосфатно-солевом буфере в концентрации 2×106 клеток в миллилитре.The B16-F10 cell line, syngeneic melanoma of mice C57bl/6, was used in the experiment. The cells were cultured in 75 cm2 culture flasks in DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) supplemented with 10% fetal calf serum, penicillin, streptomycin, and L-glutamine in an incubator containing 5% CO2 at 37°C. Upon reaching 70-80% monolayer, the cells were detached with trypsin and transferred to centrifuge tubes. Then they were pelleted in a centrifuge at 1000 rpm for 10 minutes. Then a single phosphate-buffered saline was added to the pellet, mixed, and pelleted in a centrifuge at 1000 rpm for 10 minutes. Washing with phosphate-buffered saline was performed twice. Cells were diluted in 1× phosphate-buffered saline at a concentration of 2× 106 cells per milliliter.
Перед введением опухолевых клеток мышей линии C57bl/6 подвергали ингаляционному наркозу (3% Изофлуран). Клетки вводили подкожно в правый бок мыши по 100 мкл (2×105 клеток на мышь) шприцом на 1 мл с иглой диаметром 22G.Before the introduction of tumor cells, C57bl/6 mice were anesthetized with inhalation anesthesia (3% Isoflurane). The cells were injected subcutaneously into the right side of the mouse at 100 μl (2×10 5 cells per mouse) using a 1 ml syringe with a 22G needle.
Животные были разделены на несколько групп, в зависимости от типа препарата, который им вводили:The animals were divided into several groups, depending on the type of drug they were administered:
1) мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID NO:9;1) mRNA with an open reading frame encoding the detected gene signature SEQ ID NO:9;
2) мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID NO:10;2) mRNA with an open reading frame encoding the detected gene signature SEQ ID NO:10;
3) мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID NO:11;3) mRNA with an open reading frame encoding the detected gene signature SEQ ID NO:11;
4) мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID NO:12;4) mRNA with an open reading frame encoding the detected gene signature SEQ ID NO:12;
5) мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID NO:13;5) mRNA with an open reading frame encoding the detected gene signature SEQ ID NO:13;
6) мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID NO:14;6) mRNA with an open reading frame encoding the detected gene signature SEQ ID NO:14;
7) мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID NO:15;7) mRNA with an open reading frame encoding the detected gene signature SEQ ID NO:15;
8) мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID NO:16;8) mRNA with an open reading frame encoding the detected gene signature SEQ ID NO:16;
9) мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID NO:17;9) mRNA with an open reading frame encoding the detected gene signature SEQ ID NO:17;
10) мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID NO:18;10) mRNA with an open reading frame encoding the detected gene signature SEQ ID NO:18;
1) мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей 10 обнаруженных генных сигнатур SEQ ID NO:19;1) mRNA with an open reading frame encoding 10 detected gene signatures SEQ ID NO:19;
12) мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей 3 обнаруженные генные сигнатуры SEQ ID NO:20.12) mRNA with an open reading frame encoding the 3 identified gene signatures of SEQ ID NO:20.
13) Фосфатно-солевой буфер13) Phosphate buffered saline
Исследуемый препарат вводили на следующие сутки после инокуляции опухолевых клеток из расчета 20 мкг мРНК на мышь инсулиновым шприцом с иглой 29G. Препарат вводили каждые 4 дня внутримышечно.The test drug was administered the following day after tumor cell inoculation at a dose of 20 μg mRNA per mouse using an insulin syringe with a 29G needle. The drug was administered intramuscularly every 4 days.
На 8 день исследования определяли размер опухоли и рассчитывали ее объем. Полученные данные представлены на Фиг.2. Как видно из результатов эксперимента, введение мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженные генные сигнатуры опухолевых клеток, приводит к ограничению роста опухолевых клеток. Таким образом формируется система иммунного надзора за опухолевыми клетками организме млекопитающих, которая позволяет эффективно обнаруживать и элиминировать опухолевые клетки.On the 8th day of the study, the tumor size was determined and its volume was calculated. The data obtained are presented in Fig. 2. As can be seen from the results of the experiment, the introduction of mRNA with an open reading frame encoding the detected gene signatures of tumor cells leads to a limitation of tumor cell growth. Thus, an immune surveillance system for tumor cells in the body of mammals is formed, which allows for the effective detection and elimination of tumor cells.
Пример 7. Способ применения разработанного иммунобиологического средства для индукции иммунного ответа к опухолевым клеткам, в котором одновременно вводят более 2 иммунобиологических средств, кодирующих различные опухолевые генные сигнатуры.Example 7. A method for using the developed immunobiological agent to induce an immune response to tumor cells, in which more than 2 immunobiological agents encoding different tumor gene signatures are simultaneously administered.
В эксперименте использовалась клеточная линия B16-F10 сингенная меланома мышей линии C57bl/6. Клетки культивировали в 75 см2 культуральных флаконах в среде DMEM (Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium) c добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, пенициллина, стрептомицина и L-глутамина в инкубаторе с содержанием 5% CO2 при температуре 37°С. По достижению 70-80% монослоя, клетки открепляли трипсином и переносили в центрифужные пробирки. А затем осаждали на центрифуге при 1000 оборотах, 10 минут. Затем к осадку добавляли однократный фосфатно-солевой буфер, перемешивали и осаждали на центрифуге при 1000 оборотах, 10 минут. Промывку фосфатно-солевым буфером проводили дважды. Клетки разводили в однократном фосфатно-солевом буфере в концентрации 2×106 клеток в миллилитре.The B16-F10 cell line, syngeneic melanoma of mice C57bl/6, was used in the experiment. The cells were cultured in 75 cm2 culture flasks in DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) supplemented with 10% fetal calf serum, penicillin, streptomycin, and L-glutamine in an incubator containing 5% CO2 at 37°C. Upon reaching 70-80% monolayer, the cells were detached with trypsin and transferred to centrifuge tubes. Then they were pelleted in a centrifuge at 1000 rpm for 10 minutes. Then a single phosphate-buffered saline was added to the pellet, mixed, and pelleted in a centrifuge at 1000 rpm for 10 minutes. Washing with phosphate-buffered saline was performed twice. Cells were diluted in 1× phosphate-buffered saline at a concentration of 2× 106 cells per milliliter.
Перед введением опухолевых клеток мышей линии C57bl/6 подвергали ингаляционному наркозу (3% Изофлуран). Клетки вводили подкожно в правый бок мыши по 100 мкл (2×105 клеток на мышь) шприцом на 1 мл с иглой диаметром 22G.Before the introduction of tumor cells, C57bl/6 mice were anesthetized with inhalation anesthesia (3% Isoflurane). The cells were injected subcutaneously into the right side of the mouse at 100 μl (2×10 5 cells per mouse) using a 1 ml syringe with a 22G needle.
Животные были разделены на несколько групп, которым вводили:The animals were divided into several groups and were given:
1) мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID NO:9 однократно;1) mRNA with an open reading frame encoding the detected gene signature SEQ ID NO:9 once;
2) мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID NO:9 и мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID NO:10;2) mRNA with an open reading frame encoding the detected gene signature SEQ ID NO:9 and mRNA with an open reading frame encoding the detected gene signature SEQ ID NO:10;
3) мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID NO:9 и мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID NO:10 и мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID NO:9 и мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID NO:11;3) mRNA with an open reading frame encoding the detected gene signature of SEQ ID NO:9 and mRNA with an open reading frame encoding the detected gene signature of SEQ ID NO:10 and mRNA with an open reading frame encoding the detected gene signature of SEQ ID NO:9 and mRNA with an open reading frame encoding the detected gene signature of SEQ ID NO:11;
4) Фосфатно-солевой буфер4) Phosphate buffered saline
Исследуемый препарат вводили на следующие сутки после инокуляции опухолевых клеток из расчета 20 мкг мРНК (общее количество пропорционально делили количество мРНК векторов) на мышь инсулиновым шприцом с иглой 29G. Препарат вводили каждые 4 дня внутримышечно.The test drug was administered the following day after tumor cell inoculation at a rate of 20 μg mRNA (the total amount was proportionally divided by the amount of mRNA vectors) per mouse using an insulin syringe with a 29G needle. The drug was administered intramuscularly every 4 days.
На 8 день исследования определяли размер опухоли и рассчитывали ее объем. Полученные данные представлены на Фиг.3. Как видно из результатов эксперимента, введение нескольких вариантов мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующей обнаруженные генные сигнатуры опухолевых клеток, приводит к ограничению роста опухолевых клеток. Таким образом формируется система иммунного надзора за опухолевыми клетками организме млекопитающих, которая позволяет эффективно обнаруживать и элиминировать опухолевые клетки.On the 8th day of the study, the tumor size was determined and its volume was calculated. The data obtained are presented in Fig. 3. As can be seen from the results of the experiment, the introduction of several variants of mRNA with an open reading frame encoding the detected gene signatures of tumor cells leads to a limitation of tumor cell growth. Thus, an immune surveillance system for tumor cells in the body of mammals is formed, which allows for the effective detection and elimination of tumor cells.
Пример 8. Изменение микроокружения опухоли.Example 8. Changes in the tumor microenvironment.
В эксперименте использовалась клеточная линия B16-F10 сингенная меланома мышей линии C57bl/6. Клетки культивировали в 75 см2 культуральных флаконах в среде DMEM (Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium) c добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, пенициллина, стрептомицина и L-глутамина в инкубаторе с содержанием 5% CO2 при температуре 37°С. По достижению 70-80% монослоя, клетки открепляли трипсином и переносили в центрифужные пробирки. А затем осаждали на центрифуге при 1000 оборотах, 10 минут. Затем к осадку добавляли однократный фосфатно-солевой буфер, перемешивали и осаждали на центрифуге при 1000 оборотах, 10 минут. Промывку фосфатно-солевым буфером проводили дважды. Клетки разводили в однократном фосфатно-солевом буфере в концентрации 2×106 клеток в миллилитре.The B16-F10 cell line, syngeneic melanoma of mice C57bl/6, was used in the experiment. The cells were cultured in 75 cm2 culture flasks in DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) supplemented with 10% fetal calf serum, penicillin, streptomycin, and L-glutamine in an incubator containing 5% CO2 at 37°C. Upon reaching 70-80% monolayer, the cells were detached with trypsin and transferred to centrifuge tubes. Then they were pelleted in a centrifuge at 1000 rpm for 10 minutes. Then a single phosphate-buffered saline was added to the pellet, mixed, and pelleted in a centrifuge at 1000 rpm for 10 minutes. Washing with phosphate-buffered saline was performed twice. Cells were diluted in 1× phosphate-buffered saline at a concentration of 2× 106 cells per milliliter.
Перед введением опухолевых клеток мышей линии C57bl/6 подвергали ингаляционному наркозу (3% Изофлуран). Клетки вводили подкожно в правый бок мыши по 100 мкл (2×105 клеток на мышь) шприцом на 1 мл с иглой диаметром 22G.Before the introduction of tumor cells, C57bl/6 mice were anesthetized with inhalation anesthesia (3% Isoflurane). The cells were injected subcutaneously into the right side of the mouse at 100 μl (2×10 5 cells per mouse) using a 1 ml syringe with a 22G needle.
Животные были разделены на 2 группы, которым каждые 4 дня вводили:The animals were divided into 2 groups, which were administered every 4 days:
1) мРНК с открытой рамкой считывания, кодирующая 21 обнаруженную генную сигнатуру SEQ ID NO:19.1) mRNA with an open reading frame encoding 21 identified gene signatures SEQ ID NO:19.
2) Фосфатно-солевой буфер2) Phosphate buffered saline
Препараты начинали вводить препарат с 1 дня исследования.The drugs were administered starting from day 1 of the study.
Контрольные мыши (интактные животные) и мыши, которым был введен исследуемый препарат, подвергались эвтаназии углекислым газом. Опухоль отделяли от окружающей ткани ножницами, а затем размельчали и протирали через нейлоновое ситечко с размером пор 100 мкм в 10 мл фосфатно-солевого буфера с 1% эмбриональной телячьей сыворотки. Суспензию клеток осаждали при 450g 10 минут, осадок ресуспендировали в 1 мл фосфатно-солевого буфера с 1% эмбриональной телячьей сыворотки. Далее из суспензии отбирали 1 млн клеток, осаждали при 450g 10 минут. К осадку добавляли Fc-блок, инкубировали 30 минут на +4°С. Далее к суспензии клеток добавляли по 1 мл фосфатно-солевого буфера, осаждали при 450g 10 минут. К осадку добавляли смесь антител, разведенных в буфере для окрашивания (Stain buffer, BD). В исследование использовались антител к следующим маркерам клеток: CD45 - маркер всех лейкоцитов, CD3 - маркер Т-лимфоцитов, F4/80- маркер макрофагов. Далее к суспензии клеток добавляли по 1 мл фосфатно-солевого буфера, осаждали при 450g 10 минут. Осадок ресуспендировали в 100 мкл фосфатно-солевого буфера с DAPI анализировали методом проточной цитометрии. DAPI использовали для оценки выживаемости клеток, так как данный краситель попадает только в клетки с поврежденной мембранной.Control mice (intact animals) and mice injected with the test drug were euthanized with carbon dioxide. The tumor was separated from the surrounding tissue with scissors, then crushed and passed through a nylon sieve with a pore size of 100 μm in 10 ml of phosphate-buffered saline with 1% fetal calf serum. The cell suspension was sedimented at 450 g for 10 minutes, the sediment was resuspended in 1 ml of phosphate-buffered saline with 1% fetal calf serum. Then 1 million cells were selected from the suspension and sedimented at 450 g for 10 minutes. Fc block was added to the sediment, and the mixture was incubated for 30 minutes at +4°C. Then 1 ml of phosphate-buffered saline was added to the cell suspension, and the mixture was sedimented at 450 g for 10 minutes. A mixture of antibodies diluted in staining buffer (BD) was added to the sediment. Antibodies to the following cell markers were used in the study: CD45 - a marker of all leukocytes, CD3 - a marker of T-lymphocytes, F4/80 - a marker of macrophages. Then 1 ml of phosphate-buffered saline was added to the cell suspension, sedimentation was carried out at 450g for 10 minutes. The sediment was resuspended in 100 μl of phosphate-buffered saline with DAPI and analyzed by flow cytometry. DAPI was used to assess cell viability, since this dye only gets into cells with damaged membranes.
Полученные данные представлены на Фиг.4 Как видно из результатов эксперимента, после введения мРНК, которая содержит открытую рамку считывания, кодирующую обнаруженную генную сигнатуру, меняется микроокружение опухоли. В частности уменьшается количество макрофагов F4/80+, которые играют важную роль в васкуляризации опухоли, а также увеличивается количество CD3+ Т лимфоцитов, что согласно литературным данным является прогностическим маркером успешной терапии.The obtained data are presented in Fig. 4. As can be seen from the experimental results, after the introduction of mRNA, which contains an open reading frame encoding the detected gene signature, the tumor microenvironment changes. In particular, the number of F4/80+ macrophages, which play an important role in tumor vascularization, decreases, and the number of CD3+ T lymphocytes increases, which, according to literature data, is a prognostic marker for successful therapy.
Таким образом, полученные данные показывают, что разработанный способ формирования системы иммунного надзора за опухолевыми клетками в организме млекопитающих приводит к изменениям микроокружения опухолевых клеток.Thus, the obtained data show that the developed method for forming an immune surveillance system for tumor cells in the body of mammals leads to changes in the microenvironment of tumor cells.
Промышленная применимостьIndustrial applicability
Разработанный способ формирования системы иммунного надзора за опухолевыми клетками в организме млекопитающих может использоваться для терапии пациентов с онкологическими заболеваниями различной этиологии.The developed method for forming an immune surveillance system for tumor cells in the body of mammals can be used to treat patients with oncological diseases of various etiologies.
--->--->
<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?><?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>
<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing <!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing
1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">
<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="последовательности <ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="sequences
способ формир исправленная.xml" softwareName="WIPO Sequence" method of forming corrected.xml" softwareName="WIPO Sequence"
softwareVersion="2.3.0" productionDate="2024-06-28">softwareVersion="2.3.0" productionDate="2024-06-28">
<ApplicationIdentification><ApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode> <IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText></ApplicationNumberText> <ApplicationNumberText></ApplicationNumberText>
<FilingDate>2024-06-25</FilingDate> <FilingDate>2024-06-25</FilingDate>
</ApplicationIdentification></ApplicationIdentification>
<ApplicantFileReference>20240706</ApplicantFileReference> <ApplicantFileReference>20240706</ApplicantFileReference>
<ApplicantName languageCode="ru">федеральное государственное <ApplicantName languageCode="ru">federal state
бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр budgetary institution "National Research Center"
эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Epidemiology and Microbiology named after the honorary academician
Н.Ф.Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской N.F. Gamaleya" of the Ministry of Health of the Russian Federation
Федерации</ApplicantName>Federations</ApplicantName>
<ApplicantNameLatin>The National Research Center for Epidemiology <ApplicantNameLatin>The National Research Center for Epidemiology
and Microbiology named after Honorary Academician N.F. Gamaleya of and Microbiology named after Honorary Academician N.F. Gamaleya of
the Ministry of Health of the Russian Federatio</ApplicantNameLatin>the Ministry of Health of the Russian Federatio</ApplicantNameLatin>
<InventionTitle languageCode="ru">Способ формирования системы <InventionTitle languageCode="en">Method of forming a system
иммунного надзора за опухолевыми клетками в организме immune surveillance of tumor cells in the body
млекопитающих.</InventionTitle>mammals.</InventionTitle>
<SequenceTotalQuantity>20</SequenceTotalQuantity> <SequenceTotalQuantity>20</SequenceTotalQuantity>
<SequenceData sequenceIDNumber="1"> <SequenceData sequenceIDNumber="1">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>87</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>87</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..87</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..87</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other RNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other RNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q2"><INSDQualifier id="q2">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>aggaccgccgagaccgcgtccgccccgcgagcacagagcctcgcctttg <INSDSeq_sequence>aggaccgccgagaccgcgtccgccccgcgagcacagagcctcgcctttg
ccgatccgccgcccgtccacacccgccgccagctcacc</INSDSeq_sequence>ccgatccgccgcccgtccacacccgccgccagctcacc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="2"> <SequenceData sequenceIDNumber="2">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>211</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>211</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..211</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..211</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other RNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other RNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q4"><INSDQualifier id="q4">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>aggtgctctgagtttttggtttctgtttcaccttgtgtctgagctggtc <INSDSeq_sequence>aggtgctctgagtttttggtttctgtttcaccttgtgtctgagctggtc
tgaaggctggttgttcagactgagcttcctgcctgcctgtaccccgccaacagcttcagaagaaggagcatgaaggctggttgttcagactgagcttcctgcctgcctgtaccccgccaacagcttcagaagaaggagca
gcccctgggtgcgtccactttctgggcacgtgaggttgggccttggccgcctgagcccttgagttggtcagcccctgggtgcgtccactttctgggcacgtgaggttgggccttggccgcctgagcccttgagttggtca
cttgaaccttgggaatattgag</INSDSeq_sequence>cttgaaccttgggaatattgag</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="3"> <SequenceData sequenceIDNumber="3">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>54</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>54</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..54</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..54</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other RNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other RNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q6"><INSDQualifier id="q6">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>aggatcggcgctttgccacttgtacccgagtttttgattctcaagatgg <INSDSeq_sequence>aggatcggcgctttgccacttgtacccgagtttttgattctcaagatgg
cggca</INSDSeq_sequence>cggca</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="4"> <SequenceData sequenceIDNumber="4">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>217</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>217</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..217</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..217</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other RNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other RNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q8"><INSDQualifier id="q8">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>aggaacggctagcctgaggagctgctgcgacagtccactacctttttcg <INSDSeq_sequence>aggaacggctagcctgaggagctgctgcgacagtccactacctttttcg
agagtgactcccgttgtcccaaggcttcccagagcgaacctgtgcggctgcaggcaccggcgcgtcgagtagagtgactcccgttgtcccaaggcttcccagagcgaacctgtgcggctgcaggcaccggcgcgtcgagt
ttccggcgtccggaaggaccgagctcttctcgcggatccagtgttccgtttccagcccccaatctcagagttccggcgtccggaaggaccgagctcttctcgcggatccagtgttccgtttccagcccccaatctcagag
ccgagccgacagagagcagggaaccggc</INSDSeq_sequence>ccgagccgacagagagcagggaaccggc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="5"> <SequenceData sequenceIDNumber="5">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>205</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>205</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..205</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..205</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other RNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other RNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q10"> <INSDQualifier id="q10">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>aggactctcttcgcatcgctgtctgcgagggccagctgttgggctcgcg <INSDSeq_sequence>aggactctcttcgcatcgctgtctgcgagggccagctgttgggctcgcg
gttgaggacaaactcttcgcggtctttccagtactcttggatcggaaacccgtcggcctccgaacggtacgttgaggacaaactcttcgcggtctttccagtactcttggatcggaaacccgtcggcctccgaacggtac
tccgccaccgagggacctgagcgagtccgcatcgaccggatcggaaaacctctcgagaaaggcgtctaactccgccaccgagggacctgagcgagtccgcatcgaccggatcggaaaacctctcgagaaaggcgtctaac
cagtcacagtcgcaag</INSDSeq_sequence>cagtcacagtcgcaag</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="6"> <SequenceData sequenceIDNumber="6">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>43</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>43</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..43</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..43</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other RNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other RNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q12"> <INSDQualifier id="q12">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>aggattcttctggtccccacagactcagagagaacccgccacc</INSD <INSDSeq_sequence>aggattcttctggtccccacagactcagagagaacccgccacc</INSD
Seq_sequence>Seq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="7"> <SequenceData sequenceIDNumber="7">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>203</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>203</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..203</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..203</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other RNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other RNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q46"> <INSDQualifier id="q46">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>taaatataagctggagcctcggtggcctagcttcttgccccttgggcct <INSDSeq_sequence>taaatataagctggagcctcggtggcctagcttcttgccccttgggcct
ccccccagcccctcctccccttcctgcacccgtacccccgtggtctttgaataaagtctgagtgggcggcccccccagcccctcctccccttcctgcacccgtacccccgtggtctttgaataaagtctgagtgggcggc
aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaagcatatgactaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaagcatatgactaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
aaaaaaaaaaaaaa</INSDSeq_sequence>aaaaaaaaaaaaaa</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="8"> <SequenceData sequenceIDNumber="8">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>142</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>142</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..142</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..142</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other RNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other RNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q16"> <INSDQualifier id="q16">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>taaatataacctcgccccggacctgccctcccgccaggtgcacccacct <INSDSeq_sequence>taaatataacctcgccccggacctgccctcccgccaggtgcacccacct
gcaataaatgcagcgaagccgggaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaagcatatgactaaaaaaaagcaataaatgcagcgaagccgggaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaagcatatgactaaaaaaaa
aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa</INSDSeq_sequence>aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="9"> <SequenceData sequenceIDNumber="9">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>27</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>27</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..27</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..27</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q29"> <INSDQualifier id="q29">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Mus musculus</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Mus musculus</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>atccaggtgacccacatgaccccattc</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>atccaggtgacccacatgaccccattc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="10"> <SequenceData sequenceIDNumber="10">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>48</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>48</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..48</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..48</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q30"> <INSDQualifier id="q30">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Mus musculus</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Mus musculus</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ttctccttacccaatattacatattcggtcattgaaaagaagcgaaat< <INSDSeq_sequence>ttctccttacccaatattacatattcggtcattgaaaagaagcgaaat<
/INSDSeq_sequence>/INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="11"> <SequenceData sequenceIDNumber="11">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>81</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>81</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..81</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..81</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q31"> <INSDQualifier id="q31">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Mus musculus</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Mus musculus</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ggccgaggccatctcctgggccgcctggcggccatcgtgggtaagcagg <INSDSeq_sequence>ggccgaggccatctcctgggccgcctggcggccatcgtgggtaagcagg
tgcttctgggtcgaaaggtggtggttgtgcgc</INSDSeq_sequence>tgcttctgggtcgaaaggtggtggttgtgcgc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="12"> <SequenceData sequenceIDNumber="12">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>81</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>81</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..81</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..81</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q32"> <INSDQualifier id="q32">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Mus musculus</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Mus musculus</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ggaagtccttttccagcagctgtaattctcagagatgctttgcacatgg <INSDSeq_sequence>ggaagtcctttccagcagctgtaattctcagagatgctttgcacatgg
ccagagggctaaagtacctgcaccaagaaaag</INSDSeq_sequence>cccagggctaaagtacctgcaccaagaaaag</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="13"> <SequenceData sequenceIDNumber="13">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>63</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>63</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..63</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..63</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q33"> <INSDQualifier id="q33">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Mus musculus</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Mus musculus</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>atcaaagcctttgaccggacatttgctaacaacccaggtcccatggttg <INSDSeq_sequence>atcaaagcctttgaccggacatttgctaacaacccaggtcccatggttg
tgtttgccacacct</INSDSeq_sequence>tgtttgccacacct</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="14"> <SequenceData sequenceIDNumber="14">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>27</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>27</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..27</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..27</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q28"> <INSDQualifier id="q28">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Mus musculus</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Mus musculus</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tctcccgtgttggccgtaagctgccgg</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>tctcccgtgttggccgtaagctgccgg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="15"> <SequenceData sequenceIDNumber="15">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>81</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>81</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..81</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..81</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q35"> <INSDQualifier id="q35">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Mus musculus</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Mus musculus</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ccctccaaacccagcttccaggaatttgttgactgggaaaatgtttccc <INSDSeq_sequence>ccctccaaacccagcttccaggaatttgttgactgggaaaatgtttccc
cggagctgaacagtaccgaccagccctttctc</INSDSeq_sequence>cggagctgaacagtaccgaccagccctttctc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="16"> <SequenceData sequenceIDNumber="16">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>81</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>81</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..81</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..81</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q37"> <INSDQualifier id="q37">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Mus musculus</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Mus musculus</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>agccactgccactggaacgacctggctgtgatccccgcgggcgtggtgc <INSDSeq_sequence>agccactgccactggaacgacctggctgtgatccccgcgggcgtggtgc
acaactgggacttcgagccgcgcaaggtgtcc</INSDSeq_sequence>acaactgggacttcgagccgcgcaaggtgtcc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="17"> <SequenceData sequenceIDNumber="17">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>81</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>81</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..81</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..81</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q39"> <INSDQualifier id="q39">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Mus musculus</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Mus musculus</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gttgatcgaaatcctcagttccttgaccctgtgttggcctatttgatga <INSDSeq_sequence>gttgatcgaaatcctcagttccttgaccctgtgttggcctatttgatga
aaggcctgtgtgaaaagcccctggcttctgct</INSDSeq_sequence>aaggcctgtgtgaaaagcccctggcttctgct</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="18"> <SequenceData sequenceIDNumber="18">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>27</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>27</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..27</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..27</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q41"> <INSDQualifier id="q41">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Mus musculus</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Mus musculus</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tattacatcatgaatggcccccagcta</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>tattacatcatgaatggcccccagcta</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="19"> <SequenceData sequenceIDNumber="19">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>1923</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>1923</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..1923</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..1923</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q43"> <INSDQualifier id="q43">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>atgagagtgacagcccctcggaccgtgctgctgctgctgagcggcgccc <INSDSeq_sequence>atgagagtgacagcccctcggaccgtgctgctgctgctgagcggcgccc
tggccctgaccgagacctgggccggcagcggccggatcagcggcattggcagcgccttcggatcccggtctggccctgaccgagacctgggccggcagcggccggatcagcggcattggcagcgccttcggatcccggtc
cctgtataacctgggcggaacccggagggtgtccatcggagccagcctgagcgaggccgtgcaagccgcccctgtataacctgggcggaacccggagggtgtccatcggagccagcctgagcgaggccgtgcaagccgcc
tatatgctgagataccagaagtgtctggacgccagaagccagacaagcactctgagcgagaatattagcctatatgctgagataccagaagtgtctggacgccagaagccagacaagcactctgagcgagaatattagcc
acggactgctgctgaggaaggcccctgtgctgcactatctgtactacctcgcccaaatcggccccatcacacggactgctgctgaggaaggcccctgtgctgcactatctgtactacctcgcccaaatcggccccatcac
agcccacatgtacgaggccgtggctctgatcaaggatcacactctcgtgaactccctgatccgggtgctgagcccacatgtacgaggccgtggctctgatcaaggatcacactctcgtgaactccctgatccgggtgctg
cagttcaatatcacagctgacccctatgaacgagtggacctctccagcatgtatcccggcattgtcaagacagttcaatatcacagctgacccctatgaacgagtggacctctccagcatgtatcccggcattgtcaaga
agctgctgagaaggccttcccaagtcacagagatgttcaatcaaggccgcgctttcgccgctgtccgcctagctgctgagaaggccttcccaagtcacagagatgttcaatcaaggccgcgctttcgccgctgtccgcct
ccccttttgtggccataagaacattctcgtgcattacctcagactgtctctggagtacctccgggcttggccccttttgtggccataagaacattctcgtgcattacctcagactgtctctggagtacctccgggcttgg
cactctgaggacgtgagcctcgggacctggctcgccaatcactctggcctcgtgactttccaagccttcacactctgaggacgtgagcctcgggacctggctcgccaatcactctggcctcgtgactttccaagccttca
ttgacgtgatgtctcgggagacgaccgacacagacacggccgatcaagtgattgttgttgatagaaacccttgacgtgatgtctcgggagacgaccgacacagacacggccgatcaagtgattgttgttgatagaaaccc
tcagttccttgatcctgtcctcgcctaccttatgaaaggcctttgtgaaaagcccctggcttctgctccctcagttccttgatcctgtcctcgcctaccttatgaaaggcctttgtgaaaagcccctggcttctgctccc
gaggctaagtacgatgctttccttgtgactaacatggtgcagatgtaccccgcatttaaacgagtctggagaggctaagtacgatgctttccttgtgactaacatggtgcagatgtaccccgcatttaaacgagtctgga
cctatttcggtggtctcgctgggccagatgggaccaagtctgttttcgggcagatgttcgccaaaatgtccctatttcggtggtctcgctggggccagatgggaccaagtctgttttcgggcagatgttcgccaaaatgtc
ctcattttctcctgattcatttatgttctcacttccaaatatcacctatagcgtgatcgaaaagaagagactcattttctcctgattcatttatgttctcacttccaaatatcacctatagcgtgatcgaaaagaagaga
aactttctacgttggaaaacctggttggaatctagtgggcacgtgggattcattttcaagagtgggaagaaactttctacgttggaaaacctggttggaatctagtgggcacgtgggattcattttcaagagtgggaaga
tgacttctatcgttaaggattcatccgccgctcgcaacggagactccggctcgccttttccagccgcagttgacttctatcgttaaggattcatccgccgctcgcaacggagactccggctcgccttttccagccgcagt
tatcctccgcgatgcactgcacatggctcgaggcttgaagtacttgcaccaggagaaactcgcagtctcttatcctccgcgatgcactgcacatggctcgaggcttgaagtacttgcaccaggagaaactcgcagtctct
tttgctccccttgtacagttgtcgaagaacgacaacggcactcctgattcagttggtttgccaccatgcgtttgctccccttgtacagttgtcgaagaacgacaacggcactcctgattcagttggtttgccaccatgcg
acgcactgcaggagtactcccacaattcctttgcattgcagtgcttattgaactcgttcccgggtgacttacgcactgcaggagtactcccacaattcctttgcattgcagtgcttattgaactcgttcccgggtgactt
agaattcaagaggaatatagaaggaatcgacaaacttacccagctgaagaaaccatttctagtgaacaacagaattcaagaggaatatagaaggaatcgacaaacttacccagctgaagaaaccatttctagtgaacaac
aaaattaacaaaattgagaatatccgcgagggagtcgaactatgccccgggaacaaatacgagatgaggaaaaattaacaaaattgagaatatccgcgagggagtcgaactatgccccgggaacaaatacgagatgagga
ggcatggtacaacacatagtttagttatccatgatccttccaaacccagtttccaggagtttgttgactgggcatggtacaacacatagtttagttatccatgatccttccaaacccagtttccaggagtttgttgactg
ggaaaatgtgtcaccggaactgaattcaacggatcagccctttctcgcagctccctgctcaccgatccctggaaaatgtgtcaccggaactgaattcaacggatcagccctttctcgcagctccctgctcaccgatccct
aatgaaccagtagcggcgacagccgctaatggaagtgcgggtggttgtcagccaagaggatttagtcagcaatgaaccagtagcggcgacagccgctaatggaagtgcgggtggttgtcagccaagaggatttagtcagc
cattgcgaaggcttgtacttcatgtcgtcagtgccgcccaggccgagaggttagcgcgcgctgaagaagccattgcgaaggcttgtacttcatgtcgtcagtgccgcccaggccgagaggttagcgcgcgctgaagaagc
agcagcaccagcaatgttaattccgattgcagtcggaggggcacttgcggggttggtattgatagtattaagcagcaccagcaatgttaattccgattgcagtcggaggggcacttgcggggttggtattgatagtatta
atagcatatctgatcgggcgcaaacgtagtcatgcggggtatcagactatatga</INSDSeq_sequenatagcatatctgatcgggcgcaaacgtagtcatgcggggtatcagactatatga</INSDSeq_sequen
ce>ce>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="20"> <SequenceData sequenceIDNumber="20">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>606</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>606</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..606</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..606</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q45"> <INSDQualifier id="q45">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>atgagagtgaccgctcctaggaccgtgctgctcctgcttagcggcgccc <INSDSeq_sequence>atgagagtgaccgctcctaggaccgtgctgctcctgcttagcggcgccc
tggctctcactgaaacatgggctggtagcggttctggctccggttccgggagcggaagtccctcaaagcctggctctcactgaaacatgggctggtagcggttctggctccggttccgggagcggaagtccctcaaagcc
aagtttccaagaattcgtcgattgggaaaatgtttctccggagttaaactcgacagaccagcccttcctcaagtttccaagaattcgtcgattgggaaaatgtttctccggagttaaactcgacagaccagcccttcctc
ggctccggtagcgggtccggctcaggatcaggacggggacaccttttggggcgcttagcagcgatagtggggctccggtagcgggtccggctcaggatcaggacggggacaccttttggggcgcttagcagcgatagtgg
ggaagcaggtgctgctgggtcgaaaagtcgtcgttgtacgtggtagtggtagtgggagtggcagtggtagggaagcaggtgctgctgggtcgaaaagtcgtcgttgtacgtggtagtggtagtgggagtggcagtggtag
ttctcactgccactggaacgacttagcagtgatccccgccggggtcgttcataattgggatttcgaaccattctcactgccactggaacgacttagcagtgatccccgccggggtcgttcataattgggatttcgaacca
aggaaggtatcaggatccggtagtgggtctggctccggttctatcgtgggaatcgtggccgggttagctgaggaaggtatcaggatccggtagtgggtctggctccggttctatcgtgggaatcgtggccgggttagctg
tcttggctgtggtcgttattggagctgtggttgcaacagttatgtgccgaaggaaatcttctggaggtaatcttggctgtggtcgttattggagctgtggttgcaacagttatgtgccgaaggaaatcttctggaggtaa
gggcggttcttactcacaagcagcttcatccgattcagcgcagggttcagatgtatcattgacagcg</Igggcggttcttactcacaagcagcttcatccgattcagcgcagggttcagatgtatcattgacagcg</I
NSDSeq_sequence>NSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
</ST26SequenceListing></ST26SequenceListing>
<---<---
Claims (6)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2828654C1 true RU2828654C1 (en) | 2024-10-15 |
Family
ID=
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2550267C2 (en) * | 2012-12-12 | 2015-05-10 | Елена Андреевна Чирясова | Method of influencing proloferative status of cells by means of specific nucleotide sequences of g-chain of human telomeric dna |
| WO2018144082A1 (en) * | 2017-02-01 | 2018-08-09 | Modernatx, Inc. | Rna cancer vaccines |
| JP2019054813A (en) * | 2012-04-02 | 2019-04-11 | モデルナティエックス インコーポレイテッドＭｏｄｅｒｎａＴＸ，Ｉｎｃ． | Modified polynucleotides for production of proteins associated with human disease |
| US11162102B2 (en) * | 2019-05-13 | 2021-11-02 | Dna Twopointo Inc. | Modifications of mammalian cells using artificial micro-RNA to alter their properties and the compositions of their products |
| RU2779946C2 (en) * | 2011-05-24 | 2022-09-15 | Бионтех Рна Фармасьютикалс Гмбх | Individualized anti-tumor vaccines |
| US11827922B2 (en) * | 2018-03-07 | 2023-11-28 | Wisconsin Alumni Research Foundation | High throughput nucleic acid profiling of single cells |
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2779946C2 (en) * | 2011-05-24 | 2022-09-15 | Бионтех Рна Фармасьютикалс Гмбх | Individualized anti-tumor vaccines |
| JP2019054813A (en) * | 2012-04-02 | 2019-04-11 | モデルナティエックス インコーポレイテッドＭｏｄｅｒｎａＴＸ，Ｉｎｃ． | Modified polynucleotides for production of proteins associated with human disease |
| RU2550267C2 (en) * | 2012-12-12 | 2015-05-10 | Елена Андреевна Чирясова | Method of influencing proloferative status of cells by means of specific nucleotide sequences of g-chain of human telomeric dna |
| WO2018144082A1 (en) * | 2017-02-01 | 2018-08-09 | Modernatx, Inc. | Rna cancer vaccines |
| US11827922B2 (en) * | 2018-03-07 | 2023-11-28 | Wisconsin Alumni Research Foundation | High throughput nucleic acid profiling of single cells |
| US11162102B2 (en) * | 2019-05-13 | 2021-11-02 | Dna Twopointo Inc. | Modifications of mammalian cells using artificial micro-RNA to alter their properties and the compositions of their products |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| И.Г. Козлов, Д.В. Кудрявцев, ЛИГАНДЫ РЕЦЕПТОРА NKG2D В КОМПЛЕКСНОЙ ОЦЕНКЕ ИММУНИТЕТА У ОНКОЛОГИЧЕСКИХ БОЛЬНЫХ И РАЗРАБОТКА МЕТОДА АДАПТИВНОЙ ИММУНОТЕРАПИИ, Диссертация на соискание учёной степени доктора медицинских наук, Москва 2018, стр. 34, 46. П.Ф. Литвицкий, Система иммунобиологического надзора и иммунопатологические синдромы, Вопросы современной педиатрии, 2007, т. 6, номер 3, стр. 63-70. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7065907B2 (en) | Cancer vaccine containing mRNA encoding M-like protein | |
| JP2020198875A (en) | Novel peptides and combinations of peptides for use in immunotherapy against epithelial ovarian cancer and other cancers | |
| JP2020505403A (en) | Core / shell platform for immunotherapy | |
| KR20080097203A (en) | HLA-A * 3303 restrictive PT1 peptide, and pharmaceutical composition comprising the same | |
| UA122661C2 (en) | A PEPTIDE THAT HAS THE ABILITY TO BIND TO THE MOUNTAIN MOLECULA AND CLASS | |
| JP7762132B2 (en) | Novel cancer antigens and methods | |
| Lladser et al. | Intradermal DNA electroporation induces survivin-specific CTLs, suppresses angiogenesis and confers protection against mouse melanoma | |
| Brown et al. | Adenovirus-transduced dendritic cells injected into skin or lymph node prime potent simian immunodeficiency virus-specific T cell immunity in monkeys | |
| KR101757798B1 (en) | Immunity inducer | |
| JP2022538609A (en) | Novel cancer antigens and methods | |
| US20210290746A1 (en) | Individualized Vaccines for Cancer | |
| JP7751817B2 (en) | Novel cancer antigens and methods | |
| JP2015520129A (en) | Multivalent breast cancer vaccine | |
| CN105396144A (en) | Genetic products differentially expressed in tumors and use thereof | |
| US8404803B2 (en) | Cancer-associated antigen analogue peptides and uses thereof | |
| JP2003502273A (en) | PAGE-4, an X-linked GAGE-like gene expressed in normal prostate, testis, and uterus and neoplastic prostate, testis, and uterus, and uses thereof | |
| RU2828654C1 (en) | Method for forming immune surveillance system for tumour cells in mammal body | |
| RU2828631C1 (en) | IMMUNOBIOLOGICAL AGENT FOR THERAPY OF ONCOLOGICAL DISEASES BASED ON mRNA VECTOR | |
| WO2010117071A1 (en) | Ubiquitin fusion gene, and dna vaccine using same | |
| US20230302109A1 (en) | Antigen pool | |
| KR20200055136A (en) | Multivalent antigens that stimulate Th1 and Th2 (MULTIVALENT ANTIGENS STIMULATING TH1 AND TH2) | |
| JP4039483B2 (en) | CD8 + cytotoxic T lymphocyte mHA epitope peptide and use thereof | |
| JP4705697B2 (en) | MN / CA9-derived HLA-A24 restricted tumor antigen peptide | |
| WO2024215711A1 (en) | Modified mammalian vesicles and compositions and methods related thereto | |
| WO2025133007A1 (en) | Novel cancer antigens and methods |