RU2828232C1

RU2828232C1 - Кристалл соединения пиримидина

Info

Publication number: RU2828232C1
Application number: RU2023103224A
Authority: RU
Inventors: Хироюки НАКАМУРА; Хироеси ЯМАНАКА; Такахиро АСАИ
Original assignee: Тайхо Фармасьютикал Ко., Лтд.
Priority date: 2020-07-15
Filing date: 2021-07-14
Publication date: 2024-10-08

Abstract

Изобретение относится к кристаллу, имеющему пики при углах дифракции (2θ±0,2°), выбранных из 5,5°, 6,8°, 9,3°, 13,4°, 15,3°, 16,3°, 18,5°, 19,8°, 22,0° и 24,5° на спектре порошковой рентгеновской дифракции, который представляет собой кристалл типа II 7-((3R,5S)-1-акрилоил-5-метилпирролидин-3-ил)-4-амино-6-(циклопропилэтинил)-N-((R)-1-фенилэтил)-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-5-карбоксамида с фумаровой кислотой, где молярное соотношение составляет 1:1. Изобретение относится к фармацевтической композиции, обладающей HER2 ингибирующей активностью, содержащей эффективное количество кристалла по изобретению. Также изобретение относится к противоопухолевому средству для лечения опухоли, ассоциированной с HER2, содержащему кристалл по изобретению. Технический результат – кристалл 7-((3R,5S)-1-акрилоил-5-метилпирролидин-3-ил)-4-амино-6-(циклопропилэтинил)-N-((R)-1-фенилэтил)-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-5-карбоксамида с фумаровой кислотой в качестве ингибитора HER2, который обладает стабильностью, хорошей всасываемостью в полости рта. 4 н. и 2 з.п. ф-лы, 32 ил., 19 табл., 27 пр.

Description

Область техники

[0001]

Настоящее изобретение относится к кристаллу соединения пиримидина, пригодному в качестве противоопухолевого средства, и к фармацевтической композиции, содержащей кристалл.

Уровень техники

[0002]

HER2 (который также обозначается как "ErbB2") представляет собой рецепторную тирозинкиназу, принадлежащую семейству ErbB.

HER2 считается протоонкогеном. Сообщалось, что при различных типах злокачественных опухолей происходит амплификация, сверхэкспрессия, мутация и т.п. гена HER2. На основе данных неклинических и клинических исследований было установлено, что активация HER2 и нижеследующие сигналы играют важную роль в выживании и/или пролиферации и т.д. злокачественных клеток, ассоциированных с генетической аномалией, сверхэкспрессией и т.д. HER2 (непатентный документ 1).

Таким образом, предполагается, что ингибитор, способный регулировать киназную активность HER2, ингибирует HER2 и нижерасположенные сигналы в злокачественных клетках, имеющих амплификацию, сверхэкспрессию или мутацию гена HER2, демонстрируя противоопухолевые эффекты в отношении злокачественных клеток. Соответственно, считается, что такой ингибитор будет пригодным для лечения, продления жизни или улучшения качества жизни QOL пациентов со злокачественной опухолью.

[0003]

Было описано, что метастазы в головной мозг возникают приблизительно в 25%-40% случаев рака легкого, приблизительно в 15%-30% случаев рака молочной железы, и в определенных процентах других множественных случаев злокачественных опухолей (непатентные документы 2 и 3). Фактически, описано, что метастазы в головной мозг возникают приблизительно в 20%-30% HER2-положительных случаев рака молочной железы (непатентный документ 4).

[0004]

Соединения, обладающие активностью ингибирования HER2, такие как лапатиниб и нератиниб, одобрены в качестве терапевтических средств против HER2-положительного рака молочной железы. Однако сообщалось, что, поскольку все из этих терапевтических средств являются субстратами p-gp или Bcrp, свойства проникновения в головной мозг у этих средств в доклинических тестах были ограничены (непатентный документ 5). Фактически, в клинических тестах с использованием лапатиниба или нератиниба не смогли достигнуть достаточных эффектов этих средств в отношении метастазирующей в головной мозг злокачественной опухоли (непатентные документы 6, 7, 8 и 9).

С точки зрения контроля патологических состояний, включающих метастатические очаги в головном мозге, является желательной разработка ингибитора HER2, обладающего активностью ингибирования HER2 и также имеющего свойства проникновения в головной мозг.

[0005]

Обычно, когда соединение используют в качестве активного ингредиента в фармацевтическом продукте, необходима химическая и физическая стабильность соединения для сохранения стабильного качества и/или для облегчения контроля хранения. Является желательной разработка ингибитора HER2, обладающего химической и физической стабильностью и ингибиторной активностью против HER2, а также обладающего свойствами проникновения в головной мозг.

Список литературы

Непатентные документы

[0006]

Непатентный документ 1: Cancer Treatment Reviews, 40, pp. 770-780 (2014)

Непатентный документ 2: Current Oncology, 25, pp. S103-S114 (2018)

Непатентный документ 3: Breast Cancer Research, 18(1), 8, pp. 1-9 (2016)

Непатентный документ 4: Journal of Clinical Oncology, 28, pp. 3271-3277 (2010)

Непатентный документ 5: Journal of Medicinal Chemistry, 59, pp. 10030-10066 (2016)

Непатентный документ 6: Journal of Medicinal Chemistry, 26, pp. 2999-3005 (2008)

Непатентный документ 7: Journal of Clinical Oncology, 26, pp. 1993-1999 (2008)

Непатентный документ 8: Journal of Clinical Oncology, 28, pp. 1301-1307 (2010)

Непатентный документ 9: Journal of Clinical Oncology, 34, pp. 945-952 (2016).

Сущность изобретения

Техническая проблема

[0007]

Задачей настоящего изобретения является предоставление ингибитора HER2, обладающего химической и физической стабильностью и активностью ингибирования HER2, а также обладающего свойствами проникновения в головной мозг. В частности, задачей настоящего изобретения является предоставление кристалла ингибитора HER2, который обладает превосходной стабильностью, обладает хорошей всасываемостью в полости рта и может быть получен с хорошей воспроизводимостью.

Решение проблемы

[0008]

В результате детальных исследований для достижения указанных выше задач авторы настоящего изобретения обнаружили, что 7-((3R,5S)-1-акрилоил-5-метилпирролидин-3-ил)-4-амино-6-(циклопропилэтинил)-N-((R)-1-фенилэтил)-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-5-карбоксамид, соответствующий приведенной ниже формуле (I) (далее также обозначаемый как "соединение (I)"), обладает активностью ингибирования HER2 и свойствами проникновения в головной мозг, и является пригодным в качестве терапевтического средства против заболеваний, вовлекающих HER2 (в частности, злокачественной опухоли), посредством ингибирования HER2.

[0009]

(I)

[0010]

Кроме того, авторы настоящего изобретения обнаружили, что существует два типа кристаллов свободной формы (кристалл типа I и кристалл типа II) и кристаллы с кислотами (кристаллы солей или сокристаллы) соединения (I), включая кристаллы с хлористоводородной кислотой (кристалл типа I с хлористоводородной кислотой, кристалл типа II с хлористоводородной кислотой, кристалл типа III с хлористоводородной кислотой), кристаллы с бромистоводородной кислотой, кристаллы с 1 эквивалентом виннокаменной кислоты, кристаллы с фумаровой кислотой (кристалл типа I с 0,5 эквивалента фумаровой кислоты, кристалл типа II с 0,5 эквивалента фумаровой кислоты, кристалл типа I с 1 эквивалентом фумаровой кислоты, кристалл типа II с 1 эквивалентом фумаровой кислоты, кристалл типа III с 1 эквивалентом фумаровой кислоты, кристалл типа IV с 1 эквивалентом фумаровой кислоты, кристалл типа V с 1 эквивалентом фумаровой кислоты) и кристаллы с янтарной кислотой.

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что среди этих кристаллов кристалл свободной формы типа I, кристалл свободной формы типа II, кристалл типа II с 1 эквивалентом фумаровой кислоты, кристалл типа V с 1 эквивалентом фумаровой кислоты имеют преимущественные свойства для фармацевтического производства, такие как свойство негигроскопичности и превосходной стабильности твердого вещества, и также обладают превосходной всасываемостью в полости рта. Это привело к осуществлению настоящего изобретения.

[0011]

В частности, настоящее изобретение включает следующие варианты вариант осуществления.

[1] Кристалл, имеющий пики при трех или более углах дифракции (2Ɵ ± 0,2°), выбранных из 5,5°, 6,8°, 9,3°, 13,4°, 15,3°, 16,3°, 18,5°, 19,8°, 22,0° и 24,5°, на спектре порошковой рентгеновской дифракции, который представляет собой кристалл типа II 7-((3R,5S)-1-акрилоил-5-метилпирролидин-3-ил)-4-амино-6-(циклопропилэтинил)-N-((R)-1-фенилэтил)-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-5-карбоксамида с фумаровой кислотой, где молярное соотношение 7-((3R,5S)-1-акрилоил-5-метилпирролидин-3-ил)-4-амино-6-(циклопропилэтинил)-N-((R)-1-фенилэтил)-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-5-карбоксамида и фумаровой кислоты составляет 1:1.

[2] Кристалл согласно [1], который имеет пики при углах дифракции (2Ɵ±0,2°) 5,5°, 6,8°, 9,3°, 13,4°, 15,3°, 16,3°, 18,5°, 19,8°, 22,0° и 24,5° на спектре порошковой рентгеновской дифракции.

[3] Кристалл согласно [1] или [2], который представляет собой кристалл, имеющий спектр порошковой рентгеновской дифракции, показанный на фиг.1.

[4] Кристалл согласно любому из [1]-[3], который имеет эндотермический пик, определенный посредством одновременного термогравиметрического-дифференциального термического анализа, на уровне приблизительно 178°C.

[5] Кристалл согласно любому из [1]-[4], где чистота кристалла составляет 90% по массе или более.

[6] Кристалл, имеющий пики при трех или более углах дифракции (2Ɵ±0,2°), выбранных из 8,3°, 14,8°, 17,3°, 18,0°, 19,1°, 20,3°, 21,0°, 22,5°, 23,0° и 26,2°, на спектре порошковой рентгеновской дифракции, который представляет собой кристалл типа II 7-((3R,5S)-1-акрилоил-5-метилпирролидин-3-ил)-4-амино-6-(циклопропилэтинил)-N-((R)-1-фенилэтил)-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-5-карбоксамида.

[7] Кристалл согласно [6], который имеет пики при углах дифракции (2Ɵ±0,2°) 8,3°, 14,8°, 17,3°, 18,0°, 19,1°, 20,3°, 21,0°, 22,5°, 23,0° и 26,2° на спектре порошковой рентгеновской дифракции.

[8] Кристалл согласно [6] или [7], который представляет собой кристалл, имеющий спектр порошковой рентгеновской дифракции, показанный на фиг.3.

[9] Кристалл согласно любому из [6]-[8], который имеет эндотермический пик, определенный посредством одновременного термогравиметрического-дифференциального термического анализа, на уровне приблизительно 182°C.

[10] Кристалл согласно любому из [6]-[9], где чистота кристалла составляет 90% по массе или более.

[11] Кристалл, имеющий пики при четырех или более углах дифракции (2Ɵ±0,2°), выбранных из 9,9°, 11,7°, 13,2°, 17,7°, 18,1°, 18,8° и 20,8°, на спектре порошковой рентгеновской дифракции, который представляет собой кристалл типа I 7-((3R,5S)-1-акрилоил-5-метилпирролидин-3-ил)-4-амино-6-(циклопропилэтинил)-N-((R)-1-фенилэтил)-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-5-карбоксамида.

[12] Кристалл согласно [11], который имеет пики при углах дифракции (2Ɵ±0,2°) 9,9°, 11,7°, 13,2°, 17,7°, 18,1°, 18,8° и 20,8° на спектре порошковой рентгеновской дифракции.

[13] Кристалл согласно [11] или [12], который представляет собой кристалл, имеющий спектр порошковой рентгеновской дифракции, показанный на фиг. 5.

[14] Кристалл согласно любому из [11]-[13], который имеет эндотермический пик, определенный посредством одновременного термогравиметрического-дифференциального термического анализа, на уровне приблизительно 182°C.

[15] Кристалл согласно любому из [11]-[14], где чистота кристалла составляет 90% по массе или более.

[16] Кристалл, имеющий пики при четырех или более углах дифракции (2Ɵ±0,2°), выбранных из 6,9°, 9,4°, 10,2°, 13,7°, 21,1°, 23,6° и 26,5°, на спектре порошковой рентгеновской дифракции, который представляет собой кристалл типа V 7-((3R,5S)-1-акрилоил-5-метилпирролидин-3-ил)-4-амино-6-(циклопропилэтинил)-N-((R)-1-фенилэтил)-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-5-карбоксамида с фумаровой кислотой, где молярное соотношение 7-((3R,5S)-1-акрилоил-5-метилпирролидин-3-ил)-4-амино-6-(циклопропилэтинил)-N-((R)-1-фенилэтил)-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-5-карбоксамида и фумаровой кислоты составляет 1:1.

[17] Кристалл согласно [16], который имеет пики при углах дифракции (2Ɵ±0,2°) 6,9°, 9,4°, 10,2°, 13,7°, 21,1°, 23,6° и 26,5° на спектре порошковой рентгеновской дифракции.

[18] Кристалл согласно [16] или [17], который представляет собой кристалл, имеющий спектр порошковой рентгеновской дифракции, показанный на фиг. 7.

[19] Кристалл согласно любому из [16]-[18], который имеет эндотермический пик, определенный посредством одновременного термогравиметрического-дифференциального термического анализа, на уровне приблизительно 151°C.

[20] Кристалл согласно любому из [16]-[19], где чистота кристалла составляет 90% по массе или более.

[21] Кристалл, имеющий пики при четырех или более углах дифракции (2Ɵ±0,2°), выбранных из 6,4°, 10,3°, 12,8°, 15,0°, 20,7°, 23,4° и 26,6°, на спектре порошковой рентгеновской дифракции, который представляет собой кристалл типа I 7-((3R,5S)-1-акрилоил-5-метилпирролидин-3-ил)-4-амино-6-(циклопропилэтинил)-N-((R)-1-фенилэтил)-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-5-карбоксамида с фумаровой кислотой, где молярное соотношение 7-((3R,5S)-1-акрилоил-5-метилпирролидин-3-ил)-4-амино-6-(циклопропилэтинил)-N-((R)-1-фенилэтил)-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-5-карбоксамида и фумаровой кислоты составляет 1:1.

[22] Кристалл согласно [21], который имеет пики при углах дифракции (2Ɵ±0,2°) 6,4°, 10,3°, 12,8°, 15,0°, 20,7°, 23,4° и 26,6° на спектре порошковой рентгеновской дифракции.

[23] Кристалл согласно [21] или [22], который представляет собой кристалл, имеющий спектр порошковой рентгеновской дифракции, показанный на фиг.9.

[24] Кристалл согласно любому из [21]-[23], который имеет эндотермический пик, определенный посредством одновременного термогравиметрического-дифференциального термического анализа, на уровне приблизительно 153°C.

[25] Кристалл согласно любому из [21]-[24], где чистота кристалла составляет 90% по массе или более.

[26] Кристалл, имеющий пики при четырех или более углах дифракции (2Ɵ±0,2°), выбранных из 6,4°, 7,5°, 9,7°, 11,7°, 15,1°, 19,6° и 23,9°, на спектре порошковой рентгеновской дифракции, который представляет собой кристалл типа I 7-((3R,5S)-1-акрилоил-5-метилпирролидин-3-ил)-4-амино-6-(циклопропилэтинил)-N-((R)-1-фенилэтил)-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-5-карбоксамида с фумаровой кислотой, где молярное соотношение 7-((3R,5S)-1-акрилоил-5-метилпирролидин-3-ил)-4-амино-6-(циклопропилэтинил)-N-((R)-1-фенилэтил)-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-5-карбоксамида и фумаровой кислоты составляет 1:0,5.

[27] Кристалл согласно [26], который имеет пики при углах дифракции (2Ɵ±0,2°) 6,4°, 7,5°, 9,7°, 11,7°, 15,1°, 19,6° и 23,9° на спектре порошковой рентгеновской дифракции.

[28] Кристалл согласно [26] или [27], который представляет собой кристалл, имеющий спектр порошковой рентгеновской дифракции, показанный на фиг.11.

[29] Кристалл согласно любому из [26]-[28], который имеет эндотермический пик, определенный посредством одновременного термогравиметрического-дифференциального термического анализа, на уровне приблизительно 161°C.

[30] Кристалл согласно любому из [26]-[29], где чистота кристалла составляет 90% по массе или более.

[31] Кристалл, имеющий пики при четырех или более углах дифракции (2Ɵ±0,2°), выбранных из 5,4°, 6,4°, 7,3°, 12,8°, 13,4°, 14,7° и 15,4°, на спектре порошковой рентгеновской дифракции, который представляет собой кристалл типа I 7-((3R,5S)-1-акрилоил-5-метилпирролидин-3-ил)-4-амино-6-(циклопропилэтинил)-N-((R)-1-фенилэтил)-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-5-карбоксамида с фумаровой кислотой, где молярное соотношение 7-((3R,5S)-1-акрилоил-5-метилпирролидин-3-ил)-4-амино-6-(циклопропилэтинил)-N-((R)-1-фенилэтил)-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-5-карбоксамида и фумаровой кислоты составляет 1:0,5.

[32] Кристалл согласно [31], который имеет пики при углах дифракции (2Ɵ±0,2°) 5,4°, 6,4°, 7,3°, 12,8°, 13,4°, 14,7° и 15,4° на спектре порошковой рентгеновской дифракции.

[33] Кристалл согласно [31] или [32], который представляет собой кристалл, имеющий спектр порошковой рентгеновской дифракции, показанный на фиг.13.

[34] Кристалл согласно любому из [31]-[33], который имеет эндотермический пик, определенный посредством одновременного термогравиметрического-дифференциального термического анализа, на уровне приблизительно 162°C.

[35] Кристалл согласно любому из [31]-[34], где чистота кристалла составляет 90% по массе или более.

[36] Фармацевтическая композиция, содержащая кристалл согласно любому из [1]-[35].

[37] Фармацевтическая композиция для перорального введения, содержащая кристалл согласно любому из [1]-[35].

[38] Противоопухолевое средство, содержащее кристалл согласно любому из [1]-[35].

[39] Кристалл согласно любому из [1]-[35] для применения в качестве лекарственного средства.

[40] Применение кристалла согласно любому из [1]-[35] для производства противоопухолевого средства для перорального введения.

[41] Кристалл согласно любому из [1]-[35] для применения для лечения опухоли.

[42] Кристалл согласно любому из [1]-[35] для применения для лечения опухоли посредством его перорального введения.

[43] Способ лечения опухоли, включающий введение эффективного количества кристалла согласно любому из [1]-[12] индивидууму, нуждающемуся в этом.

[44] Применение кристалла согласно любому из [1]-[35] для производства фармацевтической композиции.

[45] Применение кристалла согласно любому из [1]-[35] для производства противоопухолевого средства.

Эффекты изобретения

[0012]

Кристалл свободной формы типа I, кристалл свободной формы типа II, кристалл типа II с 1 эквивалентом фумаровой кислоты, кристалл типа V с 1 эквивалентом фумаровой кислоты соединения (I) (7-((3R,5S)-1-акрилоил-5-метилпирролидин-3-ил)-4-амино-6-(циклопропилэтинил)-N-((R)-1-фенилэтил)-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-5-карбоксамид) по настоящему изобретению являются лучшими, чем другие формы кристаллов, с точки зрения высокой стабильности, удобства переработки (более низкая гигроскопичность), возможности контроля качества и т.п. Кроме того, кристалл свободной формы типа II и кристалл типа II с 1 эквивалентом фумаровой кислоты обладают превосходной всасываемостью в полости рта и, таким образом, они являются пригодными формами при использовании соединения в качестве активного фармацевтического ингредиента. Кристалл типа I с 1 эквивалентом фумаровой кислоты имеет форму, которая может быть выделена в качестве твердого вещества из ацетона (растворитель) (после выделения, его сушат с получением кристалла типа V), он также является пригодным в качестве промежуточного материала для получения кристалла типа V.

В соответствии с настоящим изобретением, предусматривается новый кристалл соединения (I) или новый кристалл соединения (I) с кислотой и фармацевтическая композиция, противоопухолевое средство или противоопухолевое средство для перорального введения, содержащие новый кристалл.

В предпочтительных аспектах кристалл типа II с 1 эквивалентом фумаровой кислоты, кристалл свободной формы типа II, кристалл свободной формы типа I, кристалл типа V с 1 эквивалентом фумаровой кислоты, кристалл типа I с 0,5 эквивалента фумаровой кислоты, и кристалл типа II с 0,5 эквивалента фумаровой кислоты соединения (I) имеет по меньшей мере одно из преимущественных свойств при фармацевтическом производстве, такое как свойство негигроскопичности, возможность воспроизводимого получения, стабильность твердого вещества и всасываемость в полости рта.

Краткое описание чертежей

[0013]

[Фигура 1] На фиг.1 представлен спектр порошковой рентгеновской дифракции кристалла типа II соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты, полученного согласно примеру 1 (по вертикальной оси представлена интенсивность (единицы счета), и по горизонтальной оси представлен угол дифракции (2Ɵ)).

[Фигура 2] На фиг.2 представлены результаты одновременного термогравиметрического-дифференциального термического анализа (TG-DTA) для кристалла типа II соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты, полученного согласно примеру 1 (по левой вертикальной оси представлена масса (мг) на кривой TG, по правой вертикальной оси представлен тепловой поток (мкВ) на кривой DTA и по горизонтальной оси представлена температура (°C)).

[Фигура 3] На фиг.3 представлен спектр порошковой рентгеновской дифракции кристалла типа II соединения (I), полученного согласно примеру 2 (по вертикальной оси представлена интенсивность (единицы счета) и по горизонтальной оси представлен угол дифракции (2Ɵ)).

[Фигура 4] На фиг.4 представлены результаты одновременного термогравиметрического-дифференциального термического анализа (TG-DTA) для кристалла типа II соединения (I), полученного согласно примеру 2 (по левой вертикальной оси представлена масса (мг) на кривой TG, по правой вертикальной оси представлен тепловой поток (мкВ) на кривой DTA и по горизонтальной оси представлена температура (°C)).

[Фигура 5] На фиг.5 представлен спектр порошковой рентгеновской дифракции кристалла типа I соединения (I), полученного согласно примеру 3 (по вертикальной оси представлена интенсивность (единицы счета) и по горизонтальной оси представлен угол дифракции (2Ɵ)).

[Фигура 6] На фиг.6 представлены результаты одновременного термогравиметрического-дифференциального термического анализа (TG-DTA) для кристалла типа I соединения (I), полученного согласно примеру 3 (по левой вертикальной оси представлена масса (мг) на кривой TG, по правой вертикальной оси представлен тепловой поток (мкВ) на кривой DTA и по горизонтальной оси представлена температура (°C)).

[Фигура 7] На фиг.7 представлен спектр порошковой рентгеновской дифракции кристалла типа V соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты, полученного согласно примеру 4 (по вертикальной оси представлена интенсивность (единицы счета), и по горизонтальной оси представлен угол дифракции (2Ɵ)).

[Фигура 8] На фиг.8 представлены результаты одновременного термогравиметрического-дифференциального термического анализа (TG-DTA) для кристалла типа V соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты, полученного согласно примеру 4 (по левой вертикальной оси представлена масса (мг) на кривой TG, по правой вертикальной оси представлен тепловой поток (мкВ) на кривой DTA, и по горизонтальной оси представлена температура (°C)).

[Фигура 9] На фиг.9 представлен спектр порошковой рентгеновской дифракции кристалла типа I соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты, полученного согласно примеру 5 (по вертикальной оси представлена интенсивность (единицы счета) и по горизонтальной оси представлен угол дифракции (2Ɵ)).

[Фигура 10] На фиг.10 представлены результаты одновременного термогравиметрического-дифференциального термического анализа (TG-DTA) для кристалла типа I соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты, полученного согласно примеру 5 (по левой вертикальной оси представлена масса (мг) на кривой TG, по правой вертикальной оси представлен тепловой поток (мкВ) на кривой DTA, и по горизонтальной оси представлена температура (°C)).

[Фигура 11] На фиг.11 представлен спектр порошковой рентгеновской дифракции кристалла типа I соединения (I) с 0,5 эквивалента фумаровой кислоты, полученного согласно примеру 6 (по вертикальной оси представлена интенсивность (единицы счета), и по горизонтальной оси представлен угол дифракции (2Ɵ)).

[Фигура 12] На фиг.12 представлены результаты одновременного термогравиметрического-дифференциального термического анализа (TG-DTA) для кристалла типа I соединения (I) с 0,5 эквивалента фумаровой кислоты, полученного согласно примеру 6 (по левой вертикальной оси представлена масса (мг) на кривой TG, по правой вертикальной оси представлен тепловой поток (мкВ) на кривой DTA, и по горизонтальной оси представлена температура (°C)).

[Фигура 13] На фиг.13 представлен спектр порошковой рентгеновской дифракции кристалла типа II соединения (I) с 0,5 эквивалента фумаровой кислоты, полученного согласно примеру 7 (по вертикальной оси представлена интенсивность (единицы счета), и по горизонтальной оси представлен угол дифракции (2Ɵ)).

[Фигура 14] На фиг.14 представлены результаты одновременного термогравиметрического-дифференциального термического анализа (TG-DTA) для кристалла типа II соединения (I) с 0,5 эквивалента фумаровой кислоты, полученного согласно примеру 7 (по левой вертикальной оси представлена масса (мг) на кривой TG, по правой вертикальной оси представлен тепловой поток (мкВ) на кривой DTA, и по горизонтальной оси представлена температура (°C)).

[Фигура 15] На фиг.15 представлен спектр порошковой рентгеновской дифракции кристалла типа III соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты, полученного согласно справочному примеру 1 (по вертикальной оси представлена интенсивность (единицы счета), и по горизонтальной оси представлен угол дифракции (2Ɵ)).

[Фигура 16] На фиг.16 представлены результаты одновременного термогравиметрического-дифференциального термического анализа (TG-DTA) для кристалла типа III соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты, полученного согласно справочному примеру 1 (по левой вертикальной оси представлена масса (мг) на кривой TG, по правой вертикальной оси представлен тепловой поток (мкВ) на кривой DTA, и по горизонтальной оси представлена температура (°C)).

[Фигура 17] На фиг.17 представлен спектр порошковой рентгеновской дифракции кристалла типа IV соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты, полученного согласно справочному примеру 2 (по вертикальной оси представлена интенсивность (единицы счета), и по горизонтальной оси представлен угол дифракции (2Ɵ)).

[Фигура 18] На фиг.18 представлены результаты одновременного термогравиметрического-дифференциального термического анализа (TG-DTA) для кристалла типа IV соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты, полученного согласно справочному примеру 2 (по левой вертикальной оси представлена масса (мг) на кривой TG, по правой вертикальной оси представлен тепловой поток (мкВ) на кривой DTA, и по горизонтальной оси представлена температура (°C)).

[Фигура 19] На фиг.19 представлен спектр порошковой рентгеновской дифракции кристалла типа I соединения (I) с хлористоводородной кислотой, полученного согласно справочному примеру 3 (по вертикальной оси представлена интенсивность (единицы счета), и по горизонтальной оси представлен угол дифракции (2Ɵ)).

[Фигура 20] На фиг.20 представлены результаты одновременного термогравиметрического-дифференциального термического анализа (TG-DTA) для кристалла типа I соединения (I) с хлористоводородной кислотой, полученного согласно справочному примеру 3 (по левой вертикальной оси представлена масса (мг) на кривой TG, по правой вертикальной оси представлен тепловой поток (мкВ) на кривой DTA, и по горизонтальной оси представлена температура (°C)).

[Фигура 21] На фиг.21 представлен спектр порошковой рентгеновской дифракции кристалла типа II соединения (I) с хлористоводородной кислотой, полученного согласно справочному примеру 4 (по вертикальной оси представлена интенсивность (единицы счета), и по горизонтальной оси представлен угол дифракции (2Ɵ)).

[Фигура 22] На фиг.22 представлены результаты одновременного термогравиметрического-дифференциального термического анализа (TG-DTA) для кристалла типа II соединения (I) с хлористоводородной кислотой, полученного согласно справочному примеру 4 (по левой вертикальной оси представлена масса (мг) на кривой TG, по правой вертикальной оси представлен тепловой поток (мкВ) на кривой DTA, и по горизонтальной оси представлена температура (°C)).

[Фигура 23] На фиг.23 представлен спектр порошковой рентгеновской дифракции кристалла типа III соединения (I) с хлористоводородной кислотой, полученного согласно справочному примеру 5 (по вертикальной оси представлена интенсивность (единицы счета), и по горизонтальной оси представлен угол дифракции (2Ɵ)).

[Фигура 24] На фиг.24 представлены результаты одновременного термогравиметрического-дифференциального термического анализа (TG-DTA) для кристалла типа III соединения (I) с хлористоводородной кислотой, полученного согласно справочному примеру 5 (по левой вертикальной оси представлена масса (мг) на кривой TG, по правой вертикальной оси представлен тепловой поток (мкВ) на кривой DTA, и по горизонтальной оси представлена температура (°C)).

[Фигура 25] На фиг.25 представлен спектр порошковой рентгеновской дифракции кристалла соединения (I) с бромистоводородной кислотой, полученного согласно справочному примеру 6 (по вертикальной оси представлена интенсивность (единицы счета), и по горизонтальной оси представлен угол дифракции (2Ɵ)).

[Фигура 26] На фиг.26 представлены результаты одновременного термогравиметрического-дифференциального термического анализа (TG-DTA) для кристалла соединения (I) с бромистоводородной кислотой, полученного согласно справочному примеру 6 (по левой вертикальной оси представлена масса (мг) на кривой TG, по правой вертикальной оси представлен тепловой поток (мкВ) на кривой DTA, и по горизонтальной оси представлена температура (°C)).

[Фигура 27] На фиг.27 представлен спектр порошковой рентгеновской дифракции кристалла соединения (I) с L-виннокаменной кислотой, полученного согласно справочному примеру 7 (по вертикальной оси представлена интенсивность (единицы счета), и по горизонтальной оси представлен угол дифракции (2Ɵ)).

[Фигура 28] На фиг.28 представлены результаты одновременного термогравиметрического-дифференциального термического анализа (TG-DTA) для кристалла соединения (I) с L-виннокаменной кислотой, полученного согласно справочному примеру 7 (по левой вертикальной оси представлена масса (мг) на кривой TG, по правой вертикальной оси представлен тепловой поток (мкВ) на кривой DTA, и по горизонтальной оси представлена температура (°C)).

[Фигура 29] На фиг.29 представлен спектр порошковой рентгеновской дифракции кристалла соединения (I) с янтарной кислотой, полученного согласно справочному примеру 8 (по вертикальной оси представлена интенсивность (единицы счета), и по горизонтальной оси представлен угол дифракции (2Ɵ)).

[Фигура 30] На фиг.30 представлены результаты одновременного термогравиметрического-дифференциального термического анализа (TG-DTA) для кристалла соединения (I) с янтарной кислотой, полученного согласно справочному примеру 8 (по левой вертикальной оси представлена масса (мг) на кривой TG, по правой вертикальной оси представлен тепловой поток (мкВ) на кривой DTA, и по горизонтальной оси представлена температура (°C)).

[Фигура 31] На фиг.31 представлены противоопухолевые эффекты соединений (I) в моделях, вовлекающих прямую трансплантацию в головной мозг экспрессирующей HER2 клеточной линии с встроенным геном люциферазы (NCI-N87-luc).

[Фигура 32] На фиг.32 представлен процент вызванного соединением (I) снижения массы тела в моделях, вовлекающих прямую трансплантацию в головной мозг экспрессирующей HER2 клеточной линии с встроенным геном люциферазы (NCI-N87-luc).

Описание вариантов осуществления

[0014]

Настоящее изобретение относится к кристаллу 7-((3R,5S)-1-акрилоил-5-метилпирролидин-3-ил)-4-амино-6-(циклопропилэтинил)-N-((R)-1-фенилэтил)-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-5-карбоксамида и его кристаллу с кислотой (кристалл его соли или сокристалл).

(I)

В частности, настоящее изобретение относится к кристаллу типа II с 1 эквивалентом фумаровой кислоты, кристаллу свободной формы типа II, кристаллу свободной формы типа I, кристаллу типа V с 1 эквивалентом фумаровой кислоты, кристаллу типа I с 1 эквивалентом фумаровой кислоты, кристаллу типа I с 0,5 эквивалента фумаровой кислоты, кристаллу типа II с 0,5 эквивалента фумаровой кислоты соединения (I).

В настоящем описании тип I, тип II, тип III, тип IV и тип V являются удобными названиями для различения форм кристаллов, и кристаллы в соответствии с настоящим изобретением не ограничиваются этими названиями.

[0015]

В настоящем описании кристалл 7-((3R,5S)-1-акрилоил-5-метилпирролидин-3-ил)-4-амино-6-(циклопропилэтинил)-N-((R)-1-фенилэтил)-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-5-карбоксамида (соединение (I)) с кислотой означает кристалл соли или сокристалл с кислотой. Кристалл соли представляет собой кристалл, в котором соединение (I) и молекула кислоты связаны ионной связью и сокристалл представляет собой кристалл, в котором соединение (I) и молекула кислоты связаны посредством неионного взаимодействия. В рамках настоящего изобретения кристалл соединения (I) с кислотой может представлять собой кристалл соли или сокристалл, и он включает оба значения. Например, кристалл типа II 7-((3R,5S)-1-акрилоил-5-метилпирролидин-3-ил)-4-амино-6-(циклопропилэтинил)-N-((R)-1-фенилэтил)-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-5-карбоксамида с фумаровой кислотой означает кристалл фумарата 7-((3R,5S)-1-акрилоил-5-метилпирролидин-3-ил)-4-амино-6-(циклопропилэтинил)-N-((R)-1-фенилэтил)-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-5-карбоксамида или сокристалл 7-((3R,5S)-1-акрилоил-5-метилпирролидин-3-ил)-4-амино-6-(циклопропилэтинил)-N-((R)-1-фенилэтил)-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-5-карбоксамида с фумаровой кислотой.

[0016]

Кристалл представляет собой твердое вещество, в котором атомы и молекулы имеют регулярные повторяющиеся структуры, и отличается от аморфного твердого вещества, не имеющего повторяющихся структур. Кристаллические или аморфные твердые вещества можно исследовать способами, такими как анализ с использованием порошковой рентгеновской дифракции (анализ XRD), дифференциальная сканирующая калориметрия (анализ DSC), одновременный термогравиметрический-дифференциальный термический анализ (анализ TG-DTA) и анализ монокристалла. Известно, что полиморф кристалла означает, что молекулы являются такими же, но расположение атомов и молекул отличаются в кристалле, и пики, полученные посредством анализа XRD, различаются среди полиморфов кристаллов. Также известно, что каждый полиморф имеет отличающуюся растворимость, всасываемость в полости рта, стабильность и т.п.

[0017]

В настоящем описании термины "кристалл" и "аморфный" используются в их обычным значении.

[0018]

В настоящем описании описание "соединение (I)" просто означает 7-((3R,5S)-1-акрилоил-5-метилпирролидин-3-ил)-4-амино-6-(циклопропилэтинил)-N-((R)-1-фенилэтил)-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-5-карбоксамид, который используется в значении, включающем как "аморфный", так и "кристалл".

В настоящем описании описание "кристалл соединения (I)" используют в значении, включающем любой из кристаллов свободной формы соединения (I) и кристаллов соединения (I) с кислотой (кристалл соли соединения (I) и сокристалл соединения (I)).

В настоящем описании кристалл, для которого молекулы, отличные от соединения (I), составляющие кристалл (другие молекулы, составляющие кристалл соли или сокристалл), не указаны, означает кристалл свободной формы 7-((3R,5S)-1-акрилоил-5-метилпирролидин-3-ил)-4-амино-6-(циклопропилэтинил)-N-((R)-1-фенилэтил)-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-5-карбоксамида (соединение (I)).

В настоящем описании, термин "эквивалент" означает "молярный эквивалент".

В кристалле соединения (I) с кислотой (кристалл солевой формы или сокристалл), эквивалент кислоты к соединению (I) можно анализировать, например, посредством ЯМР или ионной хроматографии.

В настоящем описании кристаллы могут быть гидратами.

[0019]

Кроме того, настоящее изобретение также охватывает меченое соединение (I) или его соль, т.е. соединение, полученное путем замены одного или нескольких атомов соединения (I) или его соли радиоактивными или нерадиоактивными изотопами.

[0020]

Если кристалл включает кристалл соединения (I), он может представлять собой только один тип кристалла соединения (I) или он может представлять собой полиморфную смесь, содержащую другой тип кристалла соединения (I) в дополнение к одному типу кристалла соединения (I). В частности, предпочтительно, чтобы чистота кристалла составляла 50% по массе или более, иными словами, 50% по массе или более представляли собой монокристалл. Более предпочтительно, чтобы чистота кристалла составляла 75% по массе или более, иными словами, 75% по массе или более представляли собой монокристалл. Еще более предпочтительно, чтобы чистота кристалла составляла 90% по массе или более, иными словами, 90% по массе или более представляли собой монокристалл. Еще более предпочтительно, чтобы чистота кристалла составляла 95% по массе или более, иными словами, 95% по массе или более представляли собой монокристалл. Особенно предпочтительно, чтобы чистота кристалла составляла 99% по массе или более, иными словами, 99% по массе или более представляли собой монокристалл.

[0021]

В настоящем описании химическая чистота представляет собой чистоту, измеренную посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), и, когда ее описывают в качестве химической чистоты соединения (I), это означает чистоту соединения (I), измеренную высокоэффективной жидкостной хроматографией. В то же время, длина волны детектора, используемого для измерения чистоты, может быть установлена соответствующим образом. В частности, химическая чистота соединения (I) предпочтительно составляет 95% или более, более предпочтительно 98% или более, и особенно предпочтительно 99% или более.

[0022]

Для паттернов порошковой рентгеновской дифракции угол дифракции и общий паттерн являются важными при установлении идентичности кристаллов вследствие природы данных. Относительная интенсивность паттерна порошковой рентгеновской дифракции может несколько варьироваться в зависимости от направления роста кристаллов, размера частиц и условий измерения и, таким образом, не должна пониматься строго.

[0023]

Числовые величины, полученные из разных паттернов, могут иметь некоторые погрешности в зависимости от направления роста кристаллов, размера частиц, условий измерения и т.п. Таким образом, в настоящем описании числовая величина угла дифракции (2Ɵ) в паттерне порошковой рентгеновской дифракции может иметь погрешность измерения в диапазоне приблизительно ±0,2°.

[0024]

В настоящем описании "комнатная температура" в основном означает от приблизительно 10°C до приблизительно 35°C.

[0025]

Кроме того, эндотермический пик на кривой одновременного термогравиметрического-дифференциального термического анализа (TG-DTA), главным образом, означает величину с погрешностью измерения в диапазоне приблизительно ±5,0°C, поскольку температура измерения может варьироваться в зависимости от диапазона повышения температуры в минуту, химической чистоты образца и т.п. Таким образом, когда проводят измерение для кристалла в соответствии с настоящим изобретением (TG-DTA), учитывается погрешность пика (величины вершины пика) ±5,0°C. Термин "приблизительно", используемый в таком случае, означает ±5,0°C.

[0026]

Один из вариантов осуществления настоящего изобретения относится к кристаллу свободной формы (кристалл типа I или кристалл типа II) соединения (I), кристаллу (кристалл типа I, кристалл типа II, кристалл типа III, кристалл типа IV или кристалл типа V) соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты, и кристаллу (кристалл типа I или кристалл типа II) соединения (I) с 0,5 эквивалента фумаровой кислоты.

[0027]

(Кристалл типа II соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты)

Кристалл типа II соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты имеет спектр порошковой рентгеновской дифракции, представленный на фиг.1, а также имеет кривую одновременного термогравиметрического-дифференциального термического анализа (TG-DTA), представленную на фиг.2.

Кроме того, в одном варианте осуществления настоящего изобретения кристалл типа II соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты имеет угол дифракции (2Ɵ) и интенсивность (единицы счета), представленные в таблице 2, при порошковой рентгеновской дифракции.

[0028]

Здесь, характеристические пики на спектре порошковой рентгеновской дифракции кристалла типа II соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты могут иметь углы дифракции (2Ɵ±0,2°) 5,5°, 6,8°, 9,3°, 13,4°, 15,3°, 16,3°, 18,5°, 19,8°, 22,0° и 24,5°.

Кристалл типа II соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты в соответствии с настоящим изобретением представляет собой кристалл, имеющий три или более пиков, выбранных из вышеуказанных характеристических пиков. Предпочтительно он представляет собой кристалл, имеющий четыре или более пиков, выбранных из указанных характеристических пиков, более предпочтительно кристалл, имеющий пять или более пиков, выбранных из указанных характеристических пиков, еще более предпочтительно кристалл, имеющий шесть или более пиков, выбранных из указанных характеристических пиков, еще более предпочтительно кристалл, имеющий семь или более пиков, выбранных из указанных характеристических пиков, еще более предпочтительно кристалл, имеющий восемь или более пиков, выбранных из указанных характеристических пиков, еще более предпочтительно кристалл, имеющий девять или более пиков, выбранных из указанных характеристических пиков и особенно предпочтительно кристалл, имеющий все из пиков.

[0029]

Эндотермический пик (величина вершины пика) кристалла типа II соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты, определенный посредством одновременного термогравиметрического-дифференциального термического анализа, может составлять от 173°C до 183°C, иными словами, приблизительно 178°C.

[0030]

(Кристалл свободной формы типа II соединения (I))

Кристалл типа II соединения (I) имеет спектр порошковой рентгеновской дифракции, представленный на фиг.3, и также имеет кривую одновременного термогравиметрического-дифференциального термического анализа (TG-DTA), показанную на фиг.4.

Кроме того, в одном варианте осуществления настоящего изобретения кристалл свободной формы типа II соединения (I) имеет угол дифракции (2Ɵ) и интенсивность (единицы счета), представленные в таблице 3, при порошковой рентгеновской дифракции.

[0031]

Здесь, характеристические пики на спектре порошковой рентгеновской дифракции кристалла типа II соединения (I) могут иметь углы дифракции (2Ɵ±0,2°) 8,3°, 14,8°, 17,3°, 18,0°, 19,1°, 20,3°, 21,0°, 22,5°, 23,0° и 26,2°.

Кристалл типа II соединения (I) в соответствии с настоящим изобретением представляет собой кристалл, имеющий три или более пиков, выбранных из приведенных выше характеристических пиков. Предпочтительно он представляет собой кристалл, имеющий четыре или более пиков, выбранных из указанных характеристических пиков, более предпочтительно кристалл, имеющий пять или более пиков, выбранных из указанных характеристических пиков, еще более предпочтительно кристалл, имеющий шесть или более пиков, выбранных из указанных характеристических пиков, еще более предпочтительно кристалл, имеющий семь или более пиков, выбранных из указанных характеристических пиков, еще более предпочтительно кристалл, имеющий восемь или более пиков, выбранных из указанных характеристических пиков, еще более предпочтительно кристалл, имеющий девять или более пиков, выбранных из указанных характеристических пиков, и особенно предпочтительно кристалл, имеющий все из характеристических пиков.

[0032]

Эндотермический пик (величина вершины пика) кристалла типа II соединения (I), определенный посредством одновременного термогравиметрического-дифференциального термического анализа, может составлять от 177°C до 187°C, иными словами, приблизительно 182°C.

[0033]

(Кристалл свободной формы типа I соединения (I))

Кристалл типа I соединения (I) имеет спектр порошковой рентгеновской дифракции, представленный на фиг.5, и также имеет кривую одновременного термогравиметрического-дифференциального термического анализа (TG-DTA), показанную на фиг.6.

Кроме того, в одном варианте осуществления настоящего изобретения, кристалл свободной формы типа I соединения (I) имеет угол дифракции (2Ɵ) и интенсивность (единицы счета), представленные в таблице 4, при порошковой рентгеновской дифракции.

[0034]

Здесь, характеристические пики на спектре порошковой рентгеновской дифракции кристалла типа I соединения (I) могут иметь углы дифракции (2Ɵ±0,2°) 9,9°, 11,7°, 13,2°, 17,7°, 18,1°, 18,8° и 20,8°.

Кристалл типа I соединения (I) в соответствии с настоящим изобретением представляет собой кристалл, имеющий три или более пиков, выбранных из приведенных выше характеристических пиков. Предпочтительно он представляет собой кристалл, имеющий четыре или более пиков, выбранных из указанных характеристических пиков, более предпочтительно кристалл, имеющий пять или более пиков, выбранных из указанных характеристических пиков, еще более предпочтительно кристалл, имеющий шесть или более пиков, выбранных из указанных характеристических пиков, и особенно предпочтительно кристалл, имеющий все из характеристических пиков.

Здесь, характеристические пики на спектре порошковой рентгеновской дифракции кристалла типа I соединения (I) могут иметь углы дифракции (2Ɵ±0,2°) 9,9°, 11,7°, 13,2°, 18,8° и 20,8°.

Кристалл типа I соединения (I) в соответствии с настоящим изобретением представляет собой кристалл, имеющий три или более пиков, выбранных из приведенных выше характеристических пиков. Предпочтительно он представляет собой кристалл, имеющий четыре или более пиков, выбранных из указанных характеристических пиков, и особенно предпочтительно кристалл, имеющий все из характеристических пиков.

[0035]

Эндотермический пик (величина вершины пика) кристалла типа I соединения (I), определенная посредством одновременного термогравиметрического-дифференциального термического анализа, может составлять от 178°C до 188°C, иными словами, приблизительно 183°C.

[0036]

(Кристалл типа V соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты)

Кристалл типа V соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты имеет спектр порошковой рентгеновской дифракции, представленный на фиг.7, и также имеет кривую одновременного термогравиметрического-дифференциального термического анализа (TG-DTA), показанную на фиг.8.

Кроме того, в одном варианте осуществления настоящего изобретения кристалл типа V соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты имеет угол дифракции (2Ɵ) и интенсивность (единицы счета), представленные в таблице 5, при порошковой рентгеновской дифракции.

[0037]

Здесь, характеристические пики на спектре порошковой рентгеновской дифракции кристалла типа V соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты могут иметь углы дифракции (2Ɵ±0,2°) 6,9°, 9,4°, 10,2°, 13,7°, 21,1°, 23,6° и 26,5°.

Кристалл типа V соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты в соответствии с настоящим изобретением представляет собой кристалл, имеющий три или более пиков, выбранных из приведенных выше характеристических пиков. Предпочтительно он представляет собой кристалл, имеющий четыре или более пиков, выбранных из указанных характеристических пиков, более предпочтительно кристалл, имеющий пять или более пиков, выбранных из указанных характеристических пиков, еще более предпочтительно кристалл, имеющий шесть или более пиков, выбранных из указанных характеристических пиков, и особенно предпочтительно кристалл, имеющий все из характеристических пиков.

Здесь, характеристические пики на спектре порошковой рентгеновской дифракции кристалла типа V соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты могут иметь углы дифракции (2Ɵ±0,2°) 6,9°, 13,7°, 21,1°, 23,6° и 26,5°.

Кристалл типа V соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты в соответствии с настоящим изобретением представляет собой кристалл, имеющий три или более пиков, выбранных из приведенных выше характеристических пиков. Предпочтительно он представляет собой кристалл, имеющий четыре или более пиков, выбранных из указанных характеристических пиков, и особенно предпочтительно кристалл, имеющий все из характеристических пиков.

[0038]

Эндотермический пик (величина вершины пика) кристалла типа V соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты, определенный посредством одновременного термогравиметрического-дифференциального термического анализа, может быть на уровне от 146°C до 156°C, иными словами, приблизительно 151°C.

[0039]

(Кристалл типа I соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты)

Кристалл типа I соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты имеет спектр порошковой рентгеновской дифракции, представленный на фиг.9, а также имеет кривую одновременного термогравиметрического-дифференциального термического анализа (TG-DTA), показанную на фиг.10.

Кроме того, в одном варианте осуществления настоящего изобретения кристалл типа I соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты имеет угол дифракции (2Ɵ) и интенсивность (единицы счета), представленные в таблице 6, при порошковой рентгеновской дифракции.

[0040]

Здесь, характеристические пики на спектре порошковой рентгеновской дифракции кристалла типа V соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты могут иметь углы дифракции (2Ɵ±0,2°) 6,4°, 10,3°, 12,8°, 15,0°, 20,7°, 23,4° и 26,6°.

Кристалл типа I соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты в соответствии с настоящим изобретением представляет собой кристалл, имеющий три или более пиков, выбранных из приведенных выше характеристических пиков. Предпочтительно он представляет собой кристалл, имеющий четыре или более пиков, выбранных из указанных характеристических пиков, более предпочтительно кристалл, имеющий пять или более пиков, выбранных из указанных характеристических пиков, еще более предпочтительно кристалл, имеющий пять или более пиков, выбранных из указанных характеристических пиков, и особенно предпочтительно кристалл, имеющий все из характеристических пиков.

Эндотермический пик (величина вершины пика) кристалла типа I соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты, определенный посредством одновременного термогравиметрического-дифференциального термического анализа, может быть на уровне от 148°C до 158°C, иными словами, приблизительно 153°C.

Здесь, характеристические пики на спектре порошковой рентгеновской дифракции кристалла типа V соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты могут иметь углы дифракции (2Ɵ±0,2°) 6,4°, 10,3°, 12,8°, 20,7°, 23,4° и 26,6°.

Кристалл типа I соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты в соответствии с настоящим изобретением представляет собой кристалл, имеющий три или более пиков, выбранных из приведенных выше характеристических пиков. Предпочтительно он представляет собой кристалл, имеющий четыре или более пиков, выбранных из указанных характеристических пиков, более предпочтительно кристалл, имеющий пять или более пиков, выбранных из указанных характеристических пиков, и особенно предпочтительно кристалл, имеющий все из характеристических пиков.

[0041]

(Кристалл типа I соединения (I) с 0,5 эквивалента фумаровой кислоты)

Кристалл типа I соединения (I) с 0,5 эквивалента фумаровой кислоты имеет спектр порошковой рентгеновской дифракции, представленный на фиг.11, а также имеет кривую одновременного термогравиметрического-дифференциального термического анализа (TG-DTA), показанную на фиг.12.

[0042]

Здесь, характеристические пики на спектре порошковой рентгеновской дифракции кристалла типа I соединения (I) с 0,5 эквивалента фумаровой кислоты могут иметь углы дифракции (2Ɵ±0,2°) 6,4°, 7,5°, 9,7°, 11,7°, 15,1°, 19,6° и 23,9°.

Кристалл типа I соединения (I) с 0,5 эквивалента фумаровой кислоты в соответствии с настоящим изобретением представляет собой кристалл, имеющий четыре или более пиков, выбранных из приведенных выше характеристических пиков. Предпочтительно он представляет собой кристалл, имеющий пять или более пиков, выбранных из указанных характеристических пиков, более предпочтительно кристалл, имеющий шесть или более пиков, выбранных из указанных характеристических пиков, и особенно предпочтительно кристалл, имеющий все из характеристических пиков.

[0043]

Эндотермический пик (величина вершины пика) кристалла типа I соединения (I) с 0,5 эквивалента фумаровой кислоты, определенный посредством одновременного термогравиметрического-дифференциального термического анализа, может быть на уровне от 156°C до 166°C, иными словами, приблизительно 161°C.

[0044]

(Кристалл типа II соединения (I) с 0,5 эквивалента фумаровой кислоты)

Кристалл типа II соединения (I) с 0,5 эквивалента фумаровой кислоты имеет спектр порошковой рентгеновской дифракции, представленный на фиг.13, а также имеет кривую одновременного термогравиметрического-дифференциального термического анализа (TG-DTA), показанную на фиг.14.

[0045]

Здесь, характеристические пики на спектре порошковой рентгеновской дифракции кристалла типа II соединения (I) с 0,5 эквивалента фумаровой кислоты могут иметь углы дифракции (2Ɵ±0,2°) 5,4°, 6,4°, 7,3°, 12,8°, 13,4°, 14,7° и 15,4°.

Кристалл типа II соединения (I) с 0,5 эквивалента фумаровой кислоты в соответствии с настоящим изобретением представляет собой кристалл, имеющий четыре или более пиков, выбранных из приведенных выше характеристических пиков. Предпочтительно он представляет собой кристалл, имеющий пять или более пиков, выбранных из указанных характеристических пиков, более предпочтительно кристалл, имеющий шесть или более пиков, выбранных из указанных характеристических пиков, и особенно предпочтительно кристалл, имеющий все из характеристических пиков.

[0046]

Эндотермический пик (величина вершины пика) кристалла типа II соединения (I) с 0,5 эквивалента фумаровой кислоты, определенный посредством одновременного термогравиметрического-дифференциального термического анализа, может быть на уровне от 157°C до 167°C, иными словами, приблизительно 162°C.

[0047]

(Кристалл типа III соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты)

Кристалл типа III соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты имеет спектр порошковой рентгеновской дифракции, представленный на фиг.15, а также имеет кривую одновременного термогравиметрического-дифференциального термического анализа (TG-DTA), показанную на фиг.16.

[0048]

Здесь, характеристические пики на спектре порошковой рентгеновской дифракции кристалла типа III соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты могут иметь углы дифракции (2Ɵ±0,2°) 8,1°, 13,2°, 20,4°, 23,1°, 24,7° и 26,1°.

Кристалл типа III соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты в соответствии с настоящим изобретением представляет собой кристалл, имеющий три или более пиков, выбранных из приведенных выше характеристических пиков. Предпочтительно он представляет собой кристалл, имеющий четыре или более пиков, выбранных из указанных характеристических пиков, более предпочтительно кристалл, имеющий пять или более пиков, выбранных из указанных характеристических пиков, и особенно предпочтительно кристалл, имеющий все из характеристических пиков.

Экзотермический пик (величина вершины пика) кристалла типа III соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты, определенный посредством одновременного термогравиметрического-дифференциального термического анализа, может быть на уровне от 148°C до 158°C, иными словами, приблизительно 153°C.

[0049]

(Кристалл типа IV соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты)

Кристалл типа IV соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты имеет спектр порошковой рентгеновской дифракции, представленный на фиг.17, а также имеет кривую одновременного термогравиметрического-дифференциального термического анализа (TG-DTA), показанную на фиг.18.

[0050]

Здесь, характеристические пики на спектре порошковой рентгеновской дифракции кристалла типа IV соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты могут иметь углы дифракции (2Ɵ±0,2°) 6,0°, 15,7° и 18,8°.

Кристалл типа IV соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты в соответствии с настоящим изобретением представляет собой кристалл, имеющий все из указанных выше характеристических пиков.

Экзотермический пик (величина вершины пика) кристалла типа IV соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты, определенный посредством одновременного термогравиметрического-дифференциального термического анализа, может быть на уровне от 125°C до 135°C, иными словами, приблизительно 130°C.

[0051]

(Способ получения кристалла типа II с 1 эквивалентом фумаровой кислоты)

В одном варианте осуществления настоящего описания кристалл типа II соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты может быть получен способом, включающим, например, следующие две стадии.

Стадия 1: стадия добавления фумаровой кислоты, а затем растворителя к кристаллу типа I соединения (I) и необязательно добавления затравочного кристалла.

Стадия 2: стадия перемешивания суспензии, полученной на указанной выше стадии, с получением кристалла соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты.

После этого полученное твердое вещество выделяют фильтрацией. Предпочтительно, чтобы выделенное твердое вещество промывали водой и сушили.

На стадии 1 предпочтительно добавляют 1,5-10 эквивалентов (более предпочтительно от 2 до 5 эквивалентов и наиболее предпочтительно 3 эквивалента) фумаровой кислоты относительно 1 эквивалента соединения (I) в свободной форме.

Растворитель на стадии 1 добавляют в количестве, предпочтительно большем в 5-35 раз (об./масс.) (более предпочтительно от 5 до 30 раз (об./масс.) и наиболее предпочтительно 10 раз (об./масс.)).

Примеры растворителя, используемого на стадии 1, могут включать простые растворители или смешанные растворители из спиртов, таких как метанол, этанол, изопропанол и трет-бутанол, простых эфиров, таких как 1,4-диоксан и тетрагидрофуран, кетонов, таких как ацетон и метилэтилкетон, и апротонных полярных растворителей, таких как ацетонитрил.

Кристалл типа I соединения (I) может быть получен способом раздела "(Способ получения кристалла свободной формы типа I)" или способом, описанным ниже в примере 3.

Температура в ходе реакции на стадии 2 предпочтительно представляет собой комнатную температуру или выше и ниже температуры кипения каждого растворителя, как описано выше, но она конкретно не ограничена и может быть соответствующим образом установлена предпочтительно на 25°C-70°C (более предпочтительно 40°C-60° C и наиболее предпочтительно 50°C).

Время перемешивания в ходе реакции на стадии 2 предпочтительно составляет от 24 до 124 часов (более предпочтительно от 48 до 72 часов и наиболее предпочтительно от 60 до 65 часов) для перемешивания суспензии.

[0052]

(Способ получения кристалла свободной формы типа II)

(Способ A-1)

В одном варианте осуществления настоящего описания кристалл свободной формы типа II соединения (I) может быть получен способом, включающим, например, следующие две стадии (способ A-1).

Стадия 1: стадия добавления одной из янтарной кислоты, фосфорной кислоты и адипиновой кислоты и смешанного растворителя из хорошего растворителя/плохого растворителя к соединению (I) и необязательно добавления затравочного кристалла.

Стадия 2: стадия перемешивания суспензии, полученной на указанной выше стадии, с получением кристалла соединения (I) в твердой форме.

В процессе суспендирования и перемешивания, описанных выше, при необходимости неоднократно может быть добавлен дополнительный растворитель (например, 1-пропанол в качестве хорошего растворителя), в зависимости от степени испарения растворителя.

После этого полученное твердое вещество выделяют посредством фильтрации и сушат.

Предпочтительно на стадии 1 добавляют 0,5-2 эквивалента (более предпочтительно 0,75-1,5 эквивалента и особенно предпочтительно 1 эквивалент) кислоты относительно 1 эквивалента соединения (I).

Смешанный растворитель из хорошего растворителя/плохого растворителя на стадии 1 (например, 1-пропанол/вода) добавляют в количестве, предпочтительно в 5-50 раз (об./масс.) (более предпочтительно 10-30 раз (об./масс.) и особенно предпочтительно в 20 раз (об./масс.)) превышающем количество соединения (I) в свободной форме.

Температура в ходе реакции на стадии 2 составляет предпочтительно 25°C-70°C (более предпочтительно 40°C-60°C и особенно предпочтительно 50°C).

Время перемешивания в ходе реакции на стадии 2 предпочтительно составляет от 2 до 7 суток (более предпочтительно от 3 до 5 суток и особенно предпочтительно 4 суток) для перемешивания суспензии.

[0053]

(Способ A-2)

В другом варианте осуществления настоящего описания кристалл свободной формы типа II соединения (I) может быть получен способом, включающим, например, следующие две стадии (способ A-2).

Стадия 1: стадия добавления смешанного растворителя из хорошего растворителя/плохого растворителя и затравочного кристалла к соединению (I) и необязательно добавления любой из янтарной кислоты, фосфорной кислоты и адипиновой кислоты.

В процессе суспендирования и перемешивания, описанных выше при необходимости неоднократно может быть добавлен дополнительный растворитель (например, 1-пропанол в качестве хорошего растворителя), в зависимости от степени испарения растворителя.

Предпочтительно на стадии 1 добавляют 0,5-2 эквивалента (более предпочтительно 0,75-1,5 эквивалента и особенно предпочтительно 1 эквивалент) янтарной кислоты относительно 1 эквивалента соединения (I).

Смешанный растворитель из хорошего растворителя/плохого растворителя на стадии 1 (например, смешанный растворитель из 1-пропанола/воды) добавляют в количестве, предпочтительно в 1-10 раз (об./масс.) (более предпочтительно 2-5 раз (об./масс.) и особенно предпочтительно 3 раза (об./масс.)) превышающем количество соединения (I) в свободной форме, и к нему добавляют затравочный кристалл (например, затравочный кристалл, полученный либо на (i), либо на (ii)).

Температура реакции на стадии 2 предпочтительно составляет от 25°C до 70°C (более предпочтительно от 40°C до 60°C и особенно предпочтительно 50°C).

Время реакции на стадии 2 предпочтительно составляет от 6 до 48 часов (более предпочтительно от 12 до 24 часов и наиболее предпочтительно от 17,5 до 24 часов).

[0054]

(Способ B)

В другом варианте осуществления настоящего описания кристалл свободной формы типа II соединения (I) может быть получен способом, включающим, например, следующие две стадии (способ B).

Стадия 1: стадия добавления плохого растворителя к соединению (I) и необязательно добавления затравочного кристалла.

Стадия 2: стадия добавления хорошего растворителя к раствору, полученному на указанной выше стадии, и перемешивания полученной суспензии с получением кристалла соединения (I) в твердой форме.

Плохой растворитель (например, диизопропиловый эфир) на стадия 1 добавляют в количестве, предпочтительно в 2-10 раз (об./масс.) (более предпочтительно 3-7 раз (об./масс.) и особенно предпочтительно в 5 раз (об./масс.)) превышающем количество соединения (I) в свободной форме.

Время реакции на стадии 1 предпочтительно составляет от 24 до 96 часов (более предпочтительно от 36 до 72 часов и особенно предпочтительно 44,5 часа) для суспендирования и перемешивания.

Хороший растворитель на стадии 2 (например, этанол) добавляют в количестве, предпочтительно в 0,5-3 раза (об./масс.) (более предпочтительно 0,8-2 раза (об./масс.) и особенно предпочтительно 1 раз (об./масс.)) превышающем количество свободной формы соединения (I).

Время перемешивания на стадии 2 предпочтительно составляет от 6 до 72 часов (более предпочтительно от 12 до 48 часов и особенно предпочтительно 21 час), после чего твердое вещество выделяют фильтрацией и сушат.

В процессе суспендирования и перемешивания, описанных выше, при необходимости неоднократно может быть добавлен дополнительный растворитель (например, диизопропиловый эфир в качестве плохого растворителя и/или этанол в качестве хорошего растворителя) в зависимости от степени испарения растворителя.

[0055]

Примеры комбинации хорошего растворителя и плохого растворителя, используемых при получении кристалла свободной формы типа II соединения (I), включают метанол (хороший растворитель) и воду (плохой растворитель), метанол (хороший растворитель) и диизопропиловый эфир (IPE) (плохой растворитель), метанол (хороший растворитель) и гептан (плохой растворитель), этанол (хороший растворитель) и IPE (плохой растворитель), этанол (хороший растворитель) и гептан (плохой растворитель), 1-пропанол (хороший растворитель) и воду (плохой растворитель), 1-пропанол (хороший растворитель) и IPE (плохой растворитель), 1-пропанол (хороший растворитель) и гептан (плохой растворитель), 2-пропанол (хороший растворитель) и гептан (плохой растворитель), ацетон (хороший растворитель) и IPE (плохой растворитель), ацетон (хороший растворитель) и гептан (плохой растворитель), диметилсульфоксид (DMSO) (хороший растворитель) и воду (плохой растворитель), диметилацетамид (DMA) (хороший растворитель) и воду (плохой растворитель), тетрагидрофуран (THF) (хороший растворитель) и IPE (плохой растворитель), и THF (хороший растворитель) и гептан (плохой растворитель).

Среди них предпочтительной комбинацией хорошего растворителя и плохого растворителя является этилацетат (хороший растворитель) и н-гептан (плохой растворитель), этанол (хороший растворитель) и вода (плохой растворитель), 1-пропанол (хороший растворитель) и вода (плохой растворитель) или этанол (хороший растворитель) и диизопропиловый эфир (плохой растворитель). Количество плохого растворителя предпочтительно в 1-20 раз (об./об.) и более предпочтительно в 1-10 раз (об./об.) превышает количество хорошего растворителя.

[0056]

В описанном выше способе добавляемое количество затравочного кристалла предпочтительно может составлять от 0,5% до 30% (масс./масс.), более предпочтительно 1%-5% (масс./масс.) от добавляемого количества соединения (I).

[0057]

(Способ получения кристалла свободной формы типа I)

В одном варианте осуществления настоящего описания кристалл свободной формы типа I соединения (I) может быть получен способом, включающим, например, стадию суспендирования неочищенного продукта соединения (I) в растворителе и необязательно добавления затравочного кристалла с получением кристалла соединения (I) в твердой форме.

Затравочный кристалл необязательно добавляют для способствования кристаллизации кристалла свободной формы типа I, и в качестве затравочного кристалла может быть добавлено надлежащее количество кристалла типа I соединения (I) или смешанного кристалла, включающего кристалл типа I. Кристалл типа I соединения (I) может быть получен описанным выше способом без добавления затравочного кристалла. Однако посредством добавления затравочного кристалла время получения соединения может быть уменьшено. Кроме того, кристаллизацию можно проводить при перемешивании для уменьшения времени кристаллизации и контроля размера частиц.

Затравочный кристалл добавляют в количестве 0,5%-30% (масс./масс.) и предпочтительно 1%-10% (масс./масс.) относительно количество добавленного соединения (I).

Температура может быть установлена соответствующим образом, однако предпочтительно она составляет от 50°C до 65°C.

Соединение (I) может выпадать в осадок при указанной выше температуре растворения. Однако, если оно не выпадает в осадок при температуре растворения, может быть получен кристалл свободной формы типа I путем охлаждения до 25°C.

[0058]

В качестве растворителя можно использовать этилацетат, этанол, ацетонитрил, ацетон, трет-бутилметиловый эфир и т.п.

[0059]

(Способ получения кристалла типа V с 1 эквивалентом фумаровой кислоты)

В одном варианте осуществления настоящего описания кристалл типа V соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты может быть получен способом, включающим, например, следующие две стадии.

Стадия 1: стадия добавления к соединению (I) 1-2 эквивалентов фумаровой кислоты и ацетона в качестве растворителя в количестве, большем в 40-60 раз (об./масс.) относительно 1 эквивалента соединения (I) в свободной форме, и необязательно добавления затравочного кристалла.

Стадия 2: стадия перемешивания суспензии, полученной на указанной выше стадии, фильтрации суспензии и выделения твердого вещества.

Стадия 3: стадия сушки твердого вещества, полученного на описанной выше стадии, в условиях пониженного давления (предпочтительно при давлении 2 кПа или менее) при предпочтительно от 20°C до 60°C с получением кристалла соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты.

Фумаровую кислоту на стадии 1 более предпочтительно добавляют в количестве от 2 эквивалентов до 1 эквивалента соединения (I) в свободной форме.

Ацетон на стадии 1 предпочтительно добавляют в количестве, в 40-60 раз (об./масс.) (более предпочтительно, в 50 раз (об./масс.)) превышающем количество соединения (I) в свободной форме.

Температура реакции на стадии 2 предпочтительно составляет от 10°C до 30°C (предпочтительно 25°C).

Время реакции на стадии 2 предпочтительно составляет от 12 до 96 часов (более предпочтительно 71 час).

Температура реакции на стадии 3 составляет от 20°C до 60°C (например, комнатная температура) для полученного твердого вещества.

Время пониженного давления на стадии 3 (например, давление 2 кПа или менее) включает сушку в течение предпочтительно 6-24 часов (более предпочтительно 7,5 часов).

[0060]

В одном варианте осуществления настоящего описания кристалл типа V соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты может быть получен способом, включающим, например, следующую стадию.

Стадия 1: стадия сушки кристалла типа I с 1 эквивалентом фумаровой кислоты в условиях пониженного давления (предпочтительно при давлении 2 кПа или менее).

Температура реакции на стадии 1 составляет от 20°C до 60°C.

[0061]

(Способ получения кристалла типа I с 1 эквивалентом фумаровой кислоты)

В одном варианте осуществления настоящего описания, кристалл типа I соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты может быть получен способом, включающим, например, следующие две стадии.

Стадия 2: стадия перемешивания суспензии, полученной на указанной выше стадии, при 30°С или менее с получением кристалла соединения (I) с фумаровой кислотой.

После этого полученное твердое вещество выделяют фильтрацией.

Ацетон на стадии 1 предпочтительно добавляют в количестве, в 40-60 раз (более предпочтительно в 50 раз) превышающем количество соединения (I) в свободной форме.

Время реакции на стадии 2 предпочтительно составляет от 12 до 24 часов (более предпочтительно 19,5 часа).

[0062]

(Способ получения кристалла типа III с 1 эквивалентом фумаровой кислоты)

В одном варианте осуществления настоящего описания кристалл типа III соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты может быть получен способом, включающим, например, следующие две стадии.

Стадия 1: стадия добавления фумаровой кислоты и ацетонитрила в качестве растворителя к соединению (I) и необязательно добавления затравочного кристалла.

Стадия 2: стадия перемешивания суспензии, полученной на указанной выше стадии, в течение короткого периода времени, составляющего 1,5 часа или менее, с получением кристалла соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты.

К 1 эквиваленту соединения (I) в свободной форме на стадии 1 предпочтительно добавляют 1-5 эквивалентов (более предпочтительно 3 эквивалента) фумаровой кислоты.

Растворитель (например, ацетонитрил) на стадии 1 предпочтительно добавляют в количестве, в 25-35 раз (об./масс.) (более предпочтительно в 30 раз (об./масс.)) превышающем количество соединения (I) в свободной форме.

Температура реакции на стадии 2 предпочтительно составляет от 45°C до 55°C (особенно предпочтительно 50°C).

Время реакции на стадии 2 предпочтительно составляет от 0,5 до 1,5 часа (более предпочтительно 1 час).

[0063]

(Способ получения кристалла типа IV с 1 эквивалентом фумаровой кислоты)

В одном варианте осуществления настоящего описания кристалл типа IV соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты может быть получен способом, включающим, например, следующие две стадии.

Стадия 1: стадия добавления фумаровой кислоты и воды в качестве растворителя к соединению (I) и необязательно добавления затравочного кристалла.

Стадия 2: стадия перемешивания суспензии, полученной на указанной выше стадии, в течение короткого периода времени, составляющего 2 часа или менее, с получением кристалла соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты.

На стадии 1 к 1 эквиваленту соединения (I) в свободной форме добавляют предпочтительно 1-5 эквивалентов (более предпочтительно 3 эквивалента) фумаровой кислоты.

Воду в качестве растворителя на стадии 1 добавляют в количестве, предпочтительно в 15-25 раз (более предпочтительно в 20 раз) превышающем количество соединения (I) в свободной форме.

Время реакции на стадии 2 предпочтительно составляет от 1 до 2 часов (более предпочтительно 1,5 часа).

[0064]

(Способ получения кристалла типа I с 0,5 эквивалента фумаровой кислоты)

В одном варианте осуществления настоящего описания кристалл типа I соединения (I) с 0,5 эквивалента фумаровой кислоты может быть получен способом, включающим, например, следующие две стадии.

Стадия 2: стадия перемешивания суспензии, полученной на указанной выше стадии, при температуре предпочтительно от комнатной температуры или выше и ниже температуры кипения растворителя с получением кристалла.

На стадии 1 добавляют предпочтительно 0,5-1 эквивалент (более предпочтительно 0,5-0,75 эквивалента и наиболее предпочтительно 0,5 эквивалента) фумаровой кислоты относительно 1 эквивалента соединения (I) в свободной форме.

Воду в качестве растворителя на стадии 1 добавляют в количестве, предпочтительно в 10-40 раз (об./масс.) (более предпочтительно в 15-25 раз (об./масс.) и наиболее предпочтительно в 20 раз (об./масс.)) превышающем количество соединения (I) в свободной форме.

Температура реакции на стадии 2 предпочтительно составляет от 40°C до 60°C (более предпочтительно от 45°C до 55°C и особенно предпочтительно 50°C).

Время реакции на стадии 2 предпочтительно составляет от 48 до 120 часов (более предпочтительно от 72 до 96 часов и наиболее предпочтительно 93,5 часов).

[0065]

(Способ получения кристалла типа II с 0,5 эквивалента фумаровой кислоты)

В одном варианте осуществления настоящего описания кристалл типа II соединения (I) с 0,5 эквивалента фумаровой кислоты может быть получен способом, включающим, например, следующие две стадии.

Стадия 1: стадия добавления фумаровой кислоты и этанола к соединению (I) и необязательно добавления затравочного кристалла.

На стадии 1 к 1 эквиваленту соединения (I) в свободной форме предпочтительно добавляют 0,5-1 эквивалент (более предпочтительно 1 эквивалент) фумаровой кислоты.

Этанол в качестве растворителя на стадии 1 добавляют в количестве, предпочтительно в 10-40 раз (об./масс.) (более предпочтительно в 15-25 раз (об./масс.) и наиболее предпочтительно в 20 раз (об./масс.)) превышающем количество соединения (I) в свободной форме.

Время реакции на стадии 2 предпочтительно составляет от 6 до 48 часов (более предпочтительно от 12 до 24 часов и наиболее предпочтительно 19,5 часа).

[0066]

Кристалл типа II с 1 эквивалентом фумаровой кислоты, кристалл свободной формы типа II, кристалл свободной формы типа I, кристалл типа V с 1 эквивалентом фумаровой кислоты, кристалл типа I с 0,5 эквивалента фумаровой кислоты и кристалл типа II с 0,5 эквивалента фумаровой кислоты соединения (I) имеют по меньшей мере одно из преимущественных свойств в фармацевтическом производстве, таких как свойство негигроскопичности, возможность воспроизводимого получения, стабильность твердого вещества и всасываемость в полости рта.

Среди них, кристалл типа II с 1 эквивалентом фумаровой кислоты, кристалл свободной формы типа II, кристалл свободной формы типа I и кристалл типа V с 1 эквивалентом фумаровой кислоты соединения (I) имеют преимущественные свойства в фармацевтическом производстве, такие как свойство негигроскопичности, возможность воспроизводимого получения, стабильность твердого вещества и всасываемость в полости рта, по сравнению с другими формами кристаллов соединения (I).

[0067]

Кристалл типа II соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты является менее гигроскопичным и возможность его получения так, чтобы он был стабильным, является меньшей. Для промышленного производства фармацевтических продуктов является важным, чтобы можно было стабильно получить соединения-кандидаты для разработки лекарственного средства, которые являются менее гигроскопичными. Кроме того, он имеет свойства, которые упрощают переработку в качестве фармацевтических продуктов, такие как стабильность и растворимость твердого вещества, и превосходную всасываемость в полости рта. Таким образом, кристалл типа II соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты имеет превосходные свойства, необходимые для фармацевтического продукта или активного фармацевтического ингредиента.

[0068]

Кристалл свободной формы типа II соединения (I) является менее гигроскопичным. Для промышленного производства фармацевтических продуктов является важным наличие стабильного качества соединений, являющихся кандидатами для разработки лекарственного средства. Кроме того, он имеет свойства, которые упрощают переработку в качестве фармацевтических продуктов, такие как стабильность и растворимость твердого вещества, и превосходную всасываемость в полости рта. Таким образом, кристалл свободной формы соединения (I) имеет превосходные свойства, необходимые для фармацевтического продукта или активного фармацевтического ингредиента.

[0069]

Кристалл свободной формы типа I соединения (I) является менее гигроскопичным и обладает превосходной способностью быть полученным стабильно. Для промышленного производства фармацевтических продуктов со стабильным качеством также является важным, чтобы соединения, являющиеся кандидатами для разработки лекарственных средств, были менее гигроскопичными, и их можно было стабильно получить. Таким образом, кристалл типа I соединения (I) имеет превосходные свойства, необходимые для фармацевтического продукта или активного фармацевтического ингредиента.

[0070]

Кристалл типа V соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты является менее гигроскопичным, и он может быть получен стабильно. Для промышленного производства фармацевтических продуктов со стабильным качеством также является важным, чтобы соединения, являющиеся кандидатами для разработки лекарственных средств, были менее гигроскопичными, и их можно было стабильно получить. Таким образом, кристалл типа V соединения (I) имеет превосходные свойства, необходимые для фармацевтического продукта или активного фармацевтического ингредиента.

[0071]

Кристалл типа I соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты обладает превосходной способностью быть полученным стабильно. Для промышленного производства фармацевтических продуктов со стабильным качеством также является важным, чтобы соединения, являющиеся кандидатами для разработки лекарственных средств, можно было стабильно получить. Таким образом, кристалл типа I соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты имеет превосходные свойства, необходимые для фармацевтического продукта или активного фармацевтического ингредиента.

Поскольку кристалл типа I соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты может быть выделен в твердой форме, он также является пригодным в качестве промежуточного соединения для получения кристалла типа V с 1 эквивалентом фумаровой кислоты.

[0072]

Кристалл типа III соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты обладает превосходной способностью быть полученным стабильно. Для промышленного производства фармацевтических продуктов со стабильным качеством также является важным, чтобы соединения, являющиеся кандидатами для разработки лекарственного средства, можно было стабильно получить. Таким образом, кристалл типа III соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты обладает превосходными свойствами, необходимыми для фармацевтического продукта или активного фармацевтического ингредиента.

[0073]

Кристалл типа IV соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты обладает превосходной способностью быть полученным стабильно. Для промышленного производства фармацевтических продуктов со стабильным качеством также является важным, чтобы соединения, являющиеся кандидатами для разработки лекарственного средства, можно было стабильно получить. Таким образом, кристалл типа IV соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты обладает превосходными свойствами, необходимыми для фармацевтического продукта или активного фармацевтического ингредиента.

[0074]

Кристалл типа I соединения (I) с 0,5 эквивалента фумаровой кислоты обладает превосходной способностью быть полученным стабильно. Для промышленного производства фармацевтических продуктов со стабильным качеством также является важным, чтобы соединения, являющиеся кандидатами для разработки лекарственного средства, можно было стабильно получить. Таким образом, кристалл типа I соединения (I) с 0,5 эквивалента фумаровой кислоты обладает превосходными свойствами, необходимыми для фармацевтического продукта или активного фармацевтического ингредиента.

[0075]

Кристалл типа II соединения (I) с 0,5 эквивалента фумаровой кислоты обладает превосходной способностью быть полученным стабильно. Для промышленного производства фармацевтических продуктов со стабильным качеством также является важным, чтобы соединения, являющиеся кандидатами для разработки лекарственного средства, можно было стабильно получить. Таким образом, кристалл типа II соединения (I) с 0,5 эквивалента фумаровой кислоты в соответствии с настоящим изобретением имеет превосходные свойства, необходимые для фармацевтического продукта или активного фармацевтического ингредиента.

[0076]

(Кристаллы с другими кислотами)

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к кристаллу соединения (I) с хлористоводородной кислотой (кристалл типа I, кристалл типа II или кристалл типа III), кристаллу соединения (I) с бромистоводородной кислотой, кристаллу соединения (I) с 1 эквивалентом L-виннокаменной кислоты или кристаллу соединения (I) с янтарной кислотой.

Спектры порошковой рентгеновской дифракции и кривые одновременного термогравиметрического-дифференциального термического анализа (TG-DTA) для этих кристаллов представлены на фиг.19-30.

Характеристические пики на спектрах порошковой рентгеновской дифракции этих кристаллов описаны в справочных примерах 3-7. Эти кристаллы представляют собой кристаллы, имеющие три или более (предпочтительно четыре или более и, при наличии, более предпочтительно 5 или более) пиков, выбранных из указанных характеристических пиков, описанных в справочных примерах, и, в частности, они представляют собой кристаллы, имеющие все из характеристических пиков.

Кроме того, температуры эндотермического пика, определенные посредством одновременного термогравиметрического-дифференциального термического анализа, для этих кристаллов также описаны в справочных примерах.

[0077]

Что касается кристаллов свободной формы соединения (I) и кристаллов соединения (I) с кислотой (кристалл соли или сокристалл), как описано выше, выпавший в осадок кристалл можно выделять и очищать из раствора, в котором кристалл растворен, с которым смешан и т.п., известными способами разделения и очистки, такими как фильтрация, промывание водой и сушка при пониженном давлении.

[0078]

Кристаллы свободной формы или кристаллы с кислотами (кристаллы солей или сокристаллы) соединения (I) по настоящему изобретению обладают превосходной активностью ингибирования HER2. Более того, кристаллы свободной формы или кристаллы с кислотами (кристаллы солей или сокристаллы) соединения (I) по настоящему изобретению обладают превосходной селективностью в отношении HER2. Таким образом, кристаллы свободной формы или кристаллы с кислотами (кристаллы солей или сокристаллы) соединения (I) по настоящему изобретению являются пригодными в качестве противоопухолевого средства против заболеваний или злокачественных опухолей, имеющих сверхэкпспрессию HER2, амплификацию гена HER2, мутацию HER2 и т.д. Кроме того, кристаллы свободной формы или кристаллы с кислотами (кристаллы солей или сокристаллы) соединения (I) по настоящему изобретению являются преимущественными в том, что они имеют мало побочных эффектов.

В настоящем описании термин "HER2" включает HER2 человека или не являющегося человеком млекопитающего, и предпочтительно он представляет собой HER2 человека. Более того, термин "HER2" включает изоформы.

Поскольку кристаллы свободной формы или кристаллы с кислотами (кристаллы солей или сокристаллы) соединения (I) по настоящему изобретению обладают превосходной активностью ингибирования HER2, они являются полезными в качестве лекарственного средства для лечения заболевания, ассоциированного с HER2.

"Заболевание, ассоциированное с HER2," означает заболевание, при котором уменьшение встречаемости, или ремиссия, облегчение и/или полное устранение его симптомов достигаются путем устранения, подавления и/или ингибирования функции HER2. Примеры такого заболевания могут включать, но не ограничиваться ими, злокачественные опухоли. Предпочтительные примеры заболевания могут включать злокачественные опухоли, имеющие сверхэкспрессию HER2, амплификацию гена HER2 или мутацию HER2.

[0079]

Кристаллы свободной формы или кристаллы с кислотами (кристаллы солей или сокристаллы) соединения (I) по настоящему изобретению селективно ингибируют HER2 дикого типа и мутантный HER2, имеющий одну или несколько инсерционных мутаций, точковых мутаций, делеционных мутаций и т.д. в его домене HER2, как например, инсерционная мутация в экзоне 20.

Один из вариантов осуществления настоящего изобретения относится к: кристаллам свободной формы или кристаллам с кислотами (кристаллы солей или сокристаллы) соединения (I), обладающего активностью ингибирования HER2 дикого типа и мутантного HER2, имеющего инсерционную мутацию YVMA, которая является одной из инсерционных мутаций экзона 20, или его соли; или лекарственному средству или фармацевтической композиции, содержащей их.

Один из вариантов осуществления настоящего изобретения относится к ингибитору HER2 дикого типа и мутантного HER2, включая HER2, имеющий инсерционную мутацию YVMA, и т.д., где ингибитор содержит кристаллы свободной формы или кристаллы с кислотами (кристаллы солей или сокристаллы) соединения (I) по настоящему изобретению.

[0080]

Ген HER2 человека представлен, например, в SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 5. Белок HER2 дикого типа состоит из аминокислотной последовательности, указанной, например, под SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 6. Информация о нуклеотидной последовательности гена HER2 человека и информация об аминокислотной последовательности белка HER2 дикого типа может быть получена, например, из последовательностей под номером доступа № NM_004448, NM_001289936, NM_001005862 и т.п.

[0081]

В нескольких вариантах осуществления кристаллы свободной формы или кристаллы с кислотами (кристаллы солей или сокристаллы) соединения (I) по настоящему изобретению демонстрируют ингибиторную активность против мутантного HER2, содержащего одну или несколько мутаций из G309A, S310F, R678Q, L755S, L755_T759del, D769H, A775_G776insYVMA, V777L, V842I и R896C, с использованием аминокислотной последовательности, указанной под SEQ ID NO: 2 в качестве эталона. В другом варианте осуществления кристаллы свободной формы или кристаллы с кислотами (кристаллы солей или сокристаллы) соединения (I) по настоящему изобретению демонстрируют ингибиторную активность против мутантного HER2, содержащего A775_G776insYVMA, с использованием аминокислотной последовательности, указанной под SEQ ID NO: 2, в качестве эталона.

В нескольких вариантах осуществления кристаллы свободной формы или кристаллы с кислотами (кристаллы солей или сокристаллы) соединения (I) по настоящему изобретению демонстрируют активность ингибирования мутантного HER2, содержащего одну или несколько мутаций из G294A, S295F, R663Q, L740S, L740_T744del, D754H, A760_G761insYVMA, V762L, V827I и R881C, с использованием аминокислотной последовательности, указанной под SEQ ID NO: 4, в качестве эталона. В другом варианте осуществления кристаллы свободной формы или кристаллы с кислотами (кристаллы солей или сокристаллы) соединения (I) по настоящему изобретению демонстрируют активность ингибирования мутантного HER2, содержащего A760_G761insYVMA, с использованием аминокислотной последовательности, указанной под SEQ ID NO: 4, в качестве эталона.

В нескольких вариантах осуществления кристаллы свободной формы или кристаллы с кислотами (кристаллы солей или сокристаллы) соединения (I) по настоящему изобретению демонстрируют активность ингибирования мутантного HER2, содержащего одну или несколько мутаций из G279A, S280F, R648Q, L725S, L725_T729del, D739H, A745_G746insYVMA, V747L, V812I и R866C, с использованием аминокислотной последовательности, указанной под SEQ ID NO: 6, в качестве эталона. В другом варианте осуществления кристаллы свободной формы или кристаллы с кислотами (кристаллы солей или сокристаллы) соединения (I) по настоящему изобретению демонстрируют активность ингибирования мутантного HER2, содержащего A745_G746insYVMA, с использованием аминокислотной последовательности, указанной под SEQ ID NO: 6, в качестве эталона.

[0082]

Кроме того, в нескольких вариантах осуществления, что касается мутации в определенной изоформе HER2, даже когда положение мутации отличается от аминокислотного положения, показанного под SEQ ID NO: 2, вследствие делеции или инсерции аминокислоты(аминокислот), понятно, что мутация является такой же, как и мутация в положении, соответствующем положению аминокислоты, показанной под SEQ ID NO: 2. Таким образом, например, глицин в положении 309 в HER2, показанном под SEQ ID NO: 2, соответствует глицину в положении 294 в HER2, состоящем из аминокислотной последовательности, указанной под SEQ ID NO: 4. Например, термин "G309A" означает, что глицин в положении 309 в HER2, показанном под SEQ ID NO: 2, заменен на аланин. Поскольку такой "G309" находится в положении, соответствующем аминокислоте в положении 294 в HER2, состоящем из аминокислотной последовательности, указанной под SEQ ID NO: 4, "G294A" в HER2, состоящем из аминокислотной последовательности, указанной под SEQ ID NO: 4, соответствует "G309A" в HER2, показанном под SEQ ID NO: 2. Помимо этого, положение аминокислоты в SEQ ID NO: 2, которое соответствует определенной аминокислоте в определенной изоформе HER2, может быть подтверждено посредством множественного выравнивания с использованием BLAST.

[0083]

Список последовательностей

SEQ ID NO: 1

№ доступа: NM_004448

CDS: 262..4029

1 gcttgctccc aatcacagga gaaggaggag gtggaggagg agggctgctt gaggaagtat

61 aagaatgaag ttgtgaagct gagattcccc tccattggga ccggagaaac caggggagcc

121 ccccgggcag ccgcgcgccc cttcccacgg ggccctttac tgcgccgcgc gcccggcccc

181 cacccctcgc agcaccccgc gccccgcgcc ctcccagccg ggtccagccg gagccatggg

241 gccggagccg cagtgagcac catggagctg gcggccttgt gccgctgggg gctcctcctc

301 gccctcttgc cccccggagc cgcgagcacc caagtgtgca ccggcacaga catgaagctg

361 cggctccctg ccagtcccga gacccacctg gacatgctcc gccacctcta ccagggctgc

421 caggtggtgc agggaaacct ggaactcacc tacctgccca ccaatgccag cctgtccttc

481 ctgcaggata tccaggaggt gcagggctac gtgctcatcg ctcacaacca agtgaggcag

541 gtcccactgc agaggctgcg gattgtgcga ggcacccagc tctttgagga caactatgcc

601 ctggccgtgc tagacaatgg agacccgctg aacaatacca cccctgtcac aggggcctcc

661 ccaggaggcc tgcgggagct gcagcttcga agcctcacag agatcttgaa aggaggggtc

721 ttgatccagc ggaaccccca gctctgctac caggacacga ttttgtggaa ggacatcttc

781 cacaagaaca accagctggc tctcacactg atagacacca accgctctcg ggcctgccac

841 ccctgttctc cgatgtgtaa gggctcccgc tgctggggag agagttctga ggattgtcag

901 agcctgacgc gcactgtctg tgccggtggc tgtgcccgct gcaaggggcc actgcccact

961 gactgctgcc atgagcagtg tgctgccggc tgcacgggcc ccaagcactc tgactgcctg

1021 gcctgcctcc acttcaacca cagtggcatc tgtgagctgc actgcccagc cctggtcacc

1081 tacaacacag acacgtttga gtccatgccc aatcccgagg gccggtatac attcggcgcc

1141 agctgtgtga ctgcctgtcc ctacaactac ctttctacgg acgtgggatc ctgcaccctc

1201 gtctgccccc tgcacaacca agaggtgaca gcagaggatg gaacacagcg gtgtgagaag

1261 tgcagcaagc cctgtgcccg agtgtgctat ggtctgggca tggagcactt gcgagaggtg

1321 agggcagtta ccagtgccaa tatccaggag tttgctggct gcaagaagat ctttgggagc

1381 ctggcatttc tgccggagag ctttgatggg gacccagcct ccaacactgc cccgctccag

1441 ccagagcagc tccaagtgtt tgagactctg gaagagatca caggttacct atacatctca

1501 gcatggccgg acagcctgcc tgacctcagc gtcttccaga acctgcaagt aatccgggga

1561 cgaattctgc acaatggcgc ctactcgctg accctgcaag ggctgggcat cagctggctg

1621 gggctgcgct cactgaggga actgggcagt ggactggccc tcatccacca taacacccac

1681 ctctgcttcg tgcacacggt gccctgggac cagctctttc ggaacccgca ccaagctctg

1741 ctccacactg ccaaccggcc agaggacgag tgtgtgggcg agggcctggc ctgccaccag

1801 ctgtgcgccc gagggcactg ctggggtcca gggcccaccc agtgtgtcaa ctgcagccag

1861 ttccttcggg gccaggagtg cgtggaggaa tgccgagtac tgcaggggct ccccagggag

1921 tatgtgaatg ccaggcactg tttgccgtgc caccctgagt gtcagcccca gaatggctca

1981 gtgacctgtt ttggaccgga ggctgaccag tgtgtggcct gtgcccacta taaggaccct

2041 cccttctgcg tggcccgctg ccccagcggt gtgaaacctg acctctccta catgcccatc

2101 tggaagtttc cagatgagga gggcgcatgc cagccttgcc ccatcaactg cacccactcc

2161 tgtgtggacc tggatgacaa gggctgcccc gccgagcaga gagccagccc tctgacgtcc

2221 atcatctctg cggtggttgg cattctgctg gtcgtggtct tgggggtggt ctttgggatc

2281 ctcatcaagc gacggcagca gaagatccgg aagtacacga tgcggagact gctgcaggaa

2341 acggagctgg tggagccgct gacacctagc ggagcgatgc ccaaccaggc gcagatgcgg

2401 atcctgaaag agacggagct gaggaaggtg aaggtgcttg gatctggcgc ttttggcaca

2461 gtctacaagg gcatctggat ccctgatggg gagaatgtga aaattccagt ggccatcaaa

2521 gtgttgaggg aaaacacatc ccccaaagcc aacaaagaaa tcttagacga agcatacgtg

2581 atggctggtg tgggctcccc atatgtctcc cgccttctgg gcatctgcct gacatccacg

2641 gtgcagctgg tgacacagct tatgccctat ggctgcctct tagaccatgt ccgggaaaac

2701 cgcggacgcc tgggctccca ggacctgctg aactggtgta tgcagattgc caaggggatg

2761 agctacctgg aggatgtgcg gctcgtacac agggacttgg ccgctcggaa cgtgctggtc

2821 aagagtccca accatgtcaa aattacagac ttcgggctgg ctcggctgct ggacattgac

2881 gagacagagt accatgcaga tgggggcaag gtgcccatca agtggatggc gctggagtcc

2941 attctccgcc ggcggttcac ccaccagagt gatgtgtgga gttatggtgt gactgtgtgg

3001 gagctgatga cttttggggc caaaccttac gatgggatcc cagcccggga gatccctgac

3061 ctgctggaaa agggggagcg gctgccccag ccccccatct gcaccattga tgtctacatg

3121 atcatggtca aatgttggat gattgactct gaatgtcggc caagattccg ggagttggtg

3181 tctgaattct cccgcatggc cagggacccc cagcgctttg tggtcatcca gaatgaggac

3241 ttgggcccag ccagtccctt ggacagcacc ttctaccgct cactgctgga ggacgatgac

3301 atgggggacc tggtggatgc tgaggagtat ctggtacccc agcagggctt cttctgtcca

3361 gaccctgccc cgggcgctgg gggcatggtc caccacaggc accgcagctc atctaccagg

3421 agtggcggtg gggacctgac actagggctg gagccctctg aagaggaggc ccccaggtct

3481 ccactggcac cctccgaagg ggctggctcc gatgtatttg atggtgacct gggaatgggg

3541 gcagccaagg ggctgcaaag cctccccaca catgacccca gccctctaca gcggtacagt

3601 gaggacccca cagtacccct gccctctgag actgatggct acgttgcccc cctgacctgc

3661 agcccccagc ctgaatatgt gaaccagcca gatgttcggc cccagccccc ttcgccccga

3721 gagggccctc tgcctgctgc ccgacctgct ggtgccactc tggaaaggcc caagactctc

3781 tccccaggga agaatggggt cgtcaaagac gtttttgcct ttgggggtgc cgtggagaac

3841 cccgagtact tgacacccca gggaggagct gcccctcagc cccaccctcc tcctgccttc

3901 agcccagcct tcgacaacct ctattactgg gaccaggacc caccagagcg gggggctcca

3961 cccagcacct tcaaagggac acctacggca gagaacccag agtacctggg tctggacgtg

4021 ccagtgtgaa ccagaaggcc aagtccgcag aagccctgat gtgtcctcag ggagcaggga

4081 aggcctgact tctgctggca tcaagaggtg ggagggccct ccgaccactt ccaggggaac

4141 ctgccatgcc aggaacctgt cctaaggaac cttccttcct gcttgagttc ccagatggct

4201 ggaaggggtc cagcctcgtt ggaagaggaa cagcactggg gagtctttgt ggattctgag

4261 gccctgccca atgagactct agggtccagt ggatgccaca gcccagcttg gccctttcct

4321 tccagatcct gggtactgaa agccttaggg aagctggcct gagaggggaa gcggccctaa

4381 gggagtgtct aagaacaaaa gcgacccatt cagagactgt ccctgaaacc tagtactgcc

4441 ccccatgagg aaggaacagc aatggtgtca gtatccaggc tttgtacaga gtgcttttct

4501 gtttagtttt tacttttttt gttttgtttt tttaaagatg aaataaagac ccagggggag

4561 aatgggtgtt gtatggggag gcaagtgtgg ggggtccttc tccacaccca ctttgtccat

4621 ttgcaaatat attttggaaa acagctaaaa aaaaaaaaaa aaaa

SEQ ID NO: 2

№ доступа: NM_004448

MELAALCRWG LLLALLPPGA ASTQVCTGTD MKLRLPASPE THLDMLRHLY QGCQVVQGNL 60

ELTYLPTNAS LSFLQDIQEV QGYVLIAHNQ VRQVPLQRLR IVRGTQLFED NYALAVLDNG 120

DPLNNTTPVT GASPGGLREL QLRSLTEILK GGVLIQRNPQ LCYQDTILWK DIFHKNNQLA 180

LTLIDTNRSR ACHPCSPMCK GSRCWGESSE DCQSLTRTVC AGGCARCKGP LPTDCCHEQC 240

AAGCTGPKHS DCLACLHFNH SGICELHCPA LVTYNTDTFE SMPNPEGRYT FGASCVTACP 300

YNYLSTDVGS CTLVCPLHNQ EVTAEDGTQR CEKCSKPCAR VCYGLGMEHL REVRAVTSAN 360

IQEFAGCKKI FGSLAFLPES FDGDPASNTA PLQPEQLQVF ETLEEITGYL YISAWPDSLP 420

DLSVFQNLQV IRGRILHNGA YSLTLQGLGI SWLGLRSLRE LGSGLALIHH NTHLCFVHTV 480

PWDQLFRNPH QALLHTANRP EDECVGEGLA CHQLCARGHC WGPGPTQCVN CSQFLRGQEC 540

VEECRVLQGL PREYVNARHC LPCHPECQPQ NGSVTCFGPE ADQCVACAHY KDPPFCVARC 600

PSGVKPDLSY MPIWKFPDEE GACQPCPINC THSCVDLDDK GCPAEQRASP LTSIISAVVG 660

ILLVVVLGVV FGILIKRRQQ KIRKYTMRRL LQETELVEPL TPSGAMPNQA QMRILKETEL 720

RKVKVLGSGA FGTVYKGIWI PDGENVKIPV AIKVLRENTS PKANKEILDE AYVMAGVGSP 780

YVSRLLGICL TSTVQLVTQL MPYGCLLDHV RENRGRLGSQ DLLNWCMQIA KGMSYLEDVR 840

LVHRDLAARN VLVKSPNHVK ITDFGLARLL DIDETEYHAD GGKVPIKWMA LESILRRRFT 900

HQSDVWSYGV TVWELMTFGA KPYDGIPARE IPDLLEKGER LPQPPICTID VYMIMVKCWM 960

IDSECRPRFR ELVSEFSRMA RDPQRFVVIQ NEDLGPASPL DSTFYRSLLE DDDMGDLVDA 1020

EEYLVPQQGF FCPDPAPGAG GMVHHRHRSS STRSGGGDLT LGLEPSEEEA PRSPLAPSEG 1080

AGSDVFDGDL GMGAAKGLQS LPTHDPSPLQ RYSEDPTVPL PSETDGYVAP LTCSPQPEYV 1140

NQPDVRPQPP SPREGPLPAA RPAGATLERP KTLSPGKNGV VKDVFAFGGA VENPEYLTPQ 1200GGAAPQPHPP PAFSPAFDNL YYWDQDPPER GAPPSTFKGT PTAENPEYLG LDVPV 1255

SEQ ID NO: 3

№ доступа: NM_001289936

CDS: 583..4305

1 aagttcctgt gttctttatt ctactctccg ctgaagtcca cacagtttaa attaaagttc

61 ccggattttt gtgggcgcct gccccgcccc tcgtccccct gctgtgtcca tatatcgagg

121 cgatagggtt aagggaaggc ggacgcctga tgggttaatg agcaaactga agtgttttcc

181 atgatctttt ttgagtcgca attgaagtac cacctcccga gggtgattgc ttccccatgc

241 ggggtagaac ctttgctgtc ctgttcacca ctctacctcc agcacagaat ttggcttatg

301 cctactcaat gtgaagatga tgaggatgaa aacctttgtg atgatccact tccacttaat

361 gaatggtggc aaagcaaagc tatattcaag accacatgca aagctactcc ctgagcaaag

421 agtcacagat aaaacggggg caccagtaga atggccagga caaacgcagt gcagcacaga

481 gactcagacc ctggcagcca tgcctgcgca ggcagtgatg agagtgacat gtactgttgt

541 ggacatgcac aaaagtgaga tacttcaaag attccagaag atatgccccg ggggtcctgg

601 aagccacaag tgtgcaccgg cacagacatg aagctgcggc tccctgccag tcccgagacc

661 cacctggaca tgctccgcca cctctaccag ggctgccagg tggtgcaggg aaacctggaa

721 ctcacctacc tgcccaccaa tgccagcctg tccttcctgc aggatatcca ggaggtgcag

781 ggctacgtgc tcatcgctca caaccaagtg aggcaggtcc cactgcagag gctgcggatt

841 gtgcgaggca cccagctctt tgaggacaac tatgccctgg ccgtgctaga caatggagac

901 ccgctgaaca ataccacccc tgtcacaggg gcctccccag gaggcctgcg ggagctgcag

961 cttcgaagcc tcacagagat cttgaaagga ggggtcttga tccagcggaa cccccagctc

1021 tgctaccagg acacgatttt gtggaaggac atcttccaca agaacaacca gctggctctc

1081 acactgatag acaccaaccg ctctcgggcc tgccacccct gttctccgat gtgtaagggc

1141 tcccgctgct ggggagagag ttctgaggat tgtcagagcc tgacgcgcac tgtctgtgcc

1201 ggtggctgtg cccgctgcaa ggggccactg cccactgact gctgccatga gcagtgtgct

1261 gccggctgca cgggccccaa gcactctgac tgcctggcct gcctccactt caaccacagt

1321 ggcatctgtg agctgcactg cccagccctg gtcacctaca acacagacac gtttgagtcc

1381 atgcccaatc ccgagggccg gtatacattc ggcgccagct gtgtgactgc ctgtccctac

1441 aactaccttt ctacggacgt gggatcctgc accctcgtct gccccctgca caaccaagag

1501 gtgacagcag aggatggaac acagcggtgt gagaagtgca gcaagccctg tgcccgagtg

1561 tgctatggtc tgggcatgga gcacttgcga gaggtgaggg cagttaccag tgccaatatc1621 caggagtttg ctggctgcaa gaagatcttt gggagcctgg catttctgcc ggagagcttt

1681 gatggggacc cagcctccaa cactgccccg ctccagccag agcagctcca agtgtttgag

1741 actctggaag agatcacagg ttacctatac atctcagcat ggccggacag cctgcctgac

1801 ctcagcgtct tccagaacct gcaagtaatc cggggacgaa ttctgcacaa tggcgcctac

1861 tcgctgaccc tgcaagggct gggcatcagc tggctggggc tgcgctcact gagggaactg

1921 ggcagtggac tggccctcat ccaccataac acccacctct gcttcgtgca cacggtgccc

1981 tgggaccagc tctttcggaa cccgcaccaa gctctgctcc acactgccaa ccggccagag

2041 gacgagtgtg tgggcgaggg cctggcctgc caccagctgt gcgcccgagg gcactgctgg

2101 ggtccagggc ccacccagtg tgtcaactgc agccagttcc ttcggggcca ggagtgcgtg

2161 gaggaatgcc gagtactgca ggggctcccc agggagtatg tgaatgccag gcactgtttg

2221 ccgtgccacc ctgagtgtca gccccagaat ggctcagtga cctgttttgg accggaggct

2281 gaccagtgtg tggcctgtgc ccactataag gaccctccct tctgcgtggc ccgctgcccc

2341 agcggtgtga aacctgacct ctcctacatg cccatctgga agtttccaga tgaggagggc

2401 gcatgccagc cttgccccat caactgcacc cactcctgtg tggacctgga tgacaagggc

2461 tgccccgccg agcagagagc cagccctctg acgtccatca tctctgcggt ggttggcatt

2521 ctgctggtcg tggtcttggg ggtggtcttt gggatcctca tcaagcgacg gcagcagaag

2581 atccggaagt acacgatgcg gagactgctg caggaaacgg agctggtgga gccgctgaca

2641 cctagcggag cgatgcccaa ccaggcgcag atgcggatcc tgaaagagac ggagctgagg

2701 aaggtgaagg tgcttggatc tggcgctttt ggcacagtct acaagggcat ctggatccct

2761 gatggggaga atgtgaaaat tccagtggcc atcaaagtgt tgagggaaaa cacatccccc

2821 aaagccaaca aagaaatctt agacgaagca tacgtgatgg ctggtgtggg ctccccatat

2881 gtctcccgcc ttctgggcat ctgcctgaca tccacggtgc agctggtgac acagcttatg

2941 ccctatggct gcctcttaga ccatgtccgg gaaaaccgcg gacgcctggg ctcccaggac

3001 ctgctgaact ggtgtatgca gattgccaag gggatgagct acctggagga tgtgcggctc

3061 gtacacaggg acttggccgc tcggaacgtg ctggtcaaga gtcccaacca tgtcaaaatt

3121 acagacttcg ggctggctcg gctgctggac attgacgaga cagagtacca tgcagatggg

3181 ggcaaggtgc ccatcaagtg gatggcgctg gagtccattc tccgccggcg gttcacccac

3241 cagagtgatg tgtggagtta tggtgtgact gtgtgggagc tgatgacttt tggggccaaa

3301 ccttacgatg ggatcccagc ccgggagatc cctgacctgc tggaaaaggg ggagcggctg

3361 ccccagcccc ccatctgcac cattgatgtc tacatgatca tggtcaaatg ttggatgatt

3421 gactctgaat gtcggccaag attccgggag ttggtgtctg aattctcccg catggccagg

3481 gacccccagc gctttgtggt catccagaat gaggacttgg gcccagccag tcccttggac

3541 agcaccttct accgctcact gctggaggac gatgacatgg gggacctggt ggatgctgag

3601 gagtatctgg taccccagca gggcttcttc tgtccagacc ctgccccggg cgctgggggc

3661 atggtccacc acaggcaccg cagctcatct accaggagtg gcggtgggga cctgacacta

3721 gggctggagc cctctgaaga ggaggccccc aggtctccac tggcaccctc cgaaggggct

3781 ggctccgatg tatttgatgg tgacctggga atgggggcag ccaaggggct gcaaagcctc

3841 cccacacatg accccagccc tctacagcgg tacagtgagg accccacagt acccctgccc

3901 tctgagactg atggctacgt tgcccccctg acctgcagcc cccagcctga atatgtgaac

3961 cagccagatg ttcggcccca gcccccttcg ccccgagagg gccctctgcc tgctgcccga

4021 cctgctggtg ccactctgga aaggcccaag actctctccc cagggaagaa tggggtcgtc

4081 aaagacgttt ttgcctttgg gggtgccgtg gagaaccccg agtacttgac accccaggga

4141 ggagctgccc ctcagcccca ccctcctcct gccttcagcc cagccttcga caacctctat

4201 tactgggacc aggacccacc agagcggggg gctccaccca gcaccttcaa agggacacct

4261 acggcagaga acccagagta cctgggtctg gacgtgccag tgtgaaccag aaggccaagt

4321 ccgcagaagc cctgatgtgt cctcagggag cagggaaggc ctgacttctg ctggcatcaa

4381 gaggtgggag ggccctccga ccacttccag gggaacctgc catgccagga acctgtccta

4441 aggaaccttc cttcctgctt gagttcccag atggctggaa ggggtccagc ctcgttggaa

4501 gaggaacagc actggggagt ctttgtggat tctgaggccc tgcccaatga gactctaggg

4561 tccagtggat gccacagccc agcttggccc tttccttcca gatcctgggt actgaaagcc

4621 ttagggaagc tggcctgaga ggggaagcgg ccctaaggga gtgtctaaga acaaaagcga

4681 cccattcaga gactgtccct gaaacctagt actgcccccc atgaggaagg aacagcaatg

4741 gtgtcagtat ccaggctttg tacagagtgc ttttctgttt agtttttact ttttttgttt

4801 tgttttttta aagatgaaat aaagacccag ggggagaatg ggtgttgtat ggggaggcaa

4861 gtgtgggggg tccttctcca cacccacttt gtccatttgc aaatatattt tggaaaacag

4921 ctaaaaaaaa aaaaaaaaaa

SEQ ID NO: 4

№ доступа: NM_001289936

MPRGSWKPQV CTGTDMKLRL PASPETHLDM LRHLYQGCQV VQGNLELTYL PTNASLSFLQ 60

DIQEVQGYVL IAHNQVRQVP LQRLRIVRGT QLFEDNYALA VLDNGDPLNN TTPVTGASPG 120

GLRELQLRSL TEILKGGVLI QRNPQLCYQD TILWKDIFHK NNQLALTLID TNRSRACHPC 180

SPMCKGSRCW GESSEDCQSL TRTVCAGGCA RCKGPLPTDC CHEQCAAGCT GPKHSDCLAC 240

LHFNHSGICE LHCPALVTYN TDTFESMPNP EGRYTFGASC VTACPYNYLS TDVGSCTLVC 300

PLHNQEVTAE DGTQRCEKCS KPCARVCYGL GMEHLREVRA VTSANIQEFA GCKKIFGSLA 360

FLPESFDGDP ASNTAPLQPE QLQVFETLEE ITGYLYISAW PDSLPDLSVF QNLQVIRGRI 420

LHNGAYSLTL QGLGISWLGL RSLRELGSGL ALIHHNTHLC FVHTVPWDQL FRNPHQALLH 480

TANRPEDECV GEGLACHQLC ARGHCWGPGP TQCVNCSQFL RGQECVEECR VLQGLPREYV 540

NARHCLPCHP ECQPQNGSVT CFGPEADQCV ACAHYKDPPF CVARCPSGVK PDLSYMPIWK 600

FPDEEGACQP CPINCTHSCV DLDDKGCPAE QRASPLTSII SAVVGILLVV VLGVVFGILI 660

KRRQQKIRKY TMRRLLQETE LVEPLTPSGA MPNQAQMRIL KETELRKVKV LGSGAFGTVY 720

KGIWIPDGEN VKIPVAIKVL RENTSPKANK EILDEAYVMA GVGSPYVSRL LGICLTSTVQ 780

LVTQLMPYGC LLDHVRENRG RLGSQDLLNW CMQIAKGMSY LEDVRLVHRD LAARNVLVKS 840

PNHVKITDFG LARLLDIDET EYHADGGKVP IKWMALESIL RRRFTHQSDV WSYGVTVWEL 900

MTFGAKPYDG IPAREIPDLL EKGERLPQPP ICTIDVYMIM VKCWMIDSEC RPRFRELVSE 960

FSRMARDPQR FVVIQNEDLG PASPLDSTFY RSLLEDDDMG DLVDAEEYLV PQQGFFCPDP 1020

APGAGGMVHH RHRSSSTRSG GGDLTLGLEP SEEEAPRSPL APSEGAGSDV FDGDLGMGAA 1080

KGLQSLPTHD PSPLQRYSED PTVPLPSETD GYVAPLTCSP QPEYVNQPDV RPQPPSPREG 1140

PLPAARPAGA TLERPKTLSP GKNGVVKDVF AFGGAVENPE YLTPQGGAAP QPHPPPAFSP 1200

AFDNLYYWDQ DPPERGAPPS TFKGTPTAEN PEYLGLDVPV 1240

SEQ ID NO: 5

№ доступа: NM_001005862

CDS: 577..4254

1 aagttcctgt gttctttatt ctactctccg ctgaagtcca cacagtttaa attaaagttc

61 ccggattttt gtgggcgcct gccccgcccc tcgtccccct gctgtgtcca tatatcgagg

121 cgatagggtt aagggaaggc ggacgcctga tgggttaatg agcaaactga agtgttttcc

181 atgatctttt ttgagtcgca attgaagtac cacctcccga gggtgattgc ttccccatgc

241 ggggtagaac ctttgctgtc ctgttcacca ctctacctcc agcacagaat ttggcttatg

301 cctactcaat gtgaagatga tgaggatgaa aacctttgtg atgatccact tccacttaat

361 gaatggtggc aaagcaaagc tatattcaag accacatgca aagctactcc ctgagcaaag

421 agtcacagat aaaacggggg caccagtaga atggccagga caaacgcagt gcagcacaga

481 gactcagacc ctggcagcca tgcctgcgca ggcagtgatg agagtgacat gtactgttgt

541 ggacatgcac aaaagtgagt gtgcaccggc acagacatga agctgcggct ccctgccagt

601 cccgagaccc acctggacat gctccgccac ctctaccagg gctgccaggt ggtgcaggga

661 aacctggaac tcacctacct gcccaccaat gccagcctgt ccttcctgca ggatatccag

721 gaggtgcagg gctacgtgct catcgctcac aaccaagtga ggcaggtccc actgcagagg

781 ctgcggattg tgcgaggcac ccagctcttt gaggacaact atgccctggc cgtgctagac

841 aatggagacc cgctgaacaa taccacccct gtcacagggg cctccccagg aggcctgcgg

901 gagctgcagc ttcgaagcct cacagagatc ttgaaaggag gggtcttgat ccagcggaac

961 ccccagctct gctaccagga cacgattttg tggaaggaca tcttccacaa gaacaaccag

1021 ctggctctca cactgataga caccaaccgc tctcgggcct gccacccctg ttctccgatg

1081 tgtaagggct cccgctgctg gggagagagt tctgaggatt gtcagagcct gacgcgcact

1141 gtctgtgccg gtggctgtgc ccgctgcaag gggccactgc ccactgactg ctgccatgag

1201 cagtgtgctg ccggctgcac gggccccaag cactctgact gcctggcctg cctccacttc

1261 aaccacagtg gcatctgtga gctgcactgc ccagccctgg tcacctacaa cacagacacg

1321 tttgagtcca tgcccaatcc cgagggccgg tatacattcg gcgccagctg tgtgactgcc

1381 tgtccctaca actacctttc tacggacgtg ggatcctgca ccctcgtctg ccccctgcac

1441 aaccaagagg tgacagcaga ggatggaaca cagcggtgtg agaagtgcag caagccctgt

1501 gcccgagtgt gctatggtct gggcatggag cacttgcgag aggtgagggc agttaccagt

1561 gccaatatcc aggagtttgc tggctgcaag aagatctttg ggagcctggc atttctgccg

1621 gagagctttg atggggaccc agcctccaac actgccccgc tccagccaga gcagctccaa

1681 gtgtttgaga ctctggaaga gatcacaggt tacctataca tctcagcatg gccggacagc

1741 ctgcctgacc tcagcgtctt ccagaacctg caagtaatcc ggggacgaat tctgcacaat

1801 ggcgcctact cgctgaccct gcaagggctg ggcatcagct ggctggggct gcgctcactg

1861 agggaactgg gcagtggact ggccctcatc caccataaca cccacctctg cttcgtgcac

1921 acggtgccct gggaccagct ctttcggaac ccgcaccaag ctctgctcca cactgccaac

1981 cggccagagg acgagtgtgt gggcgagggc ctggcctgcc accagctgtg cgcccgaggg

2041 cactgctggg gtccagggcc cacccagtgt gtcaactgca gccagttcct tcggggccag

2101 gagtgcgtgg aggaatgccg agtactgcag gggctcccca gggagtatgt gaatgccagg

2161 cactgtttgc cgtgccaccc tgagtgtcag ccccagaatg gctcagtgac ctgttttgga

2221 ccggaggctg accagtgtgt ggcctgtgcc cactataagg accctccctt ctgcgtggcc

2281 cgctgcccca gcggtgtgaa acctgacctc tcctacatgc ccatctggaa gtttccagat

2341 gaggagggcg catgccagcc ttgccccatc aactgcaccc actcctgtgt ggacctggat

2401 gacaagggct gccccgccga gcagagagcc agccctctga cgtccatcat ctctgcggtg

2461 gttggcattc tgctggtcgt ggtcttgggg gtggtctttg ggatcctcat caagcgacgg

2521 cagcagaaga tccggaagta cacgatgcgg agactgctgc aggaaacgga gctggtggag

2581 ccgctgacac ctagcggagc gatgcccaac caggcgcaga tgcggatcct gaaagagacg

2641 gagctgagga aggtgaaggt gcttggatct ggcgcttttg gcacagtcta caagggcatc

2701 tggatccctg atggggagaa tgtgaaaatt ccagtggcca tcaaagtgtt gagggaaaac

2761 acatccccca aagccaacaa agaaatctta gacgaagcat acgtgatggc tggtgtgggc

2821 tccccatatg tctcccgcct tctgggcatc tgcctgacat ccacggtgca gctggtgaca

2881 cagcttatgc cctatggctg cctcttagac catgtccggg aaaaccgcgg acgcctgggc

2941 tcccaggacc tgctgaactg gtgtatgcag attgccaagg ggatgagcta cctggaggat

3001 gtgcggctcg tacacaggga cttggccgct cggaacgtgc tggtcaagag tcccaaccat

3061 gtcaaaatta cagacttcgg gctggctcgg ctgctggaca ttgacgagac agagtaccat

3121 gcagatgggg gcaaggtgcc catcaagtgg atggcgctgg agtccattct ccgccggcgg

3181 ttcacccacc agagtgatgt gtggagttat ggtgtgactg tgtgggagct gatgactttt

3241 ggggccaaac cttacgatgg gatcccagcc cgggagatcc ctgacctgct ggaaaagggg

3301 gagcggctgc cccagccccc catctgcacc attgatgtct acatgatcat ggtcaaatgt

3361 tggatgattg actctgaatg tcggccaaga ttccgggagt tggtgtctga attctcccgc

3421 atggccaggg acccccagcg ctttgtggtc atccagaatg aggacttggg cccagccagt

3481 cccttggaca gcaccttcta ccgctcactg ctggaggacg atgacatggg ggacctggtg

3541 gatgctgagg agtatctggt accccagcag ggcttcttct gtccagaccc tgccccgggc

3601 gctgggggca tggtccacca caggcaccgc agctcatcta ccaggagtgg cggtggggac

3661 ctgacactag ggctggagcc ctctgaagag gaggccccca ggtctccact ggcaccctcc

3721 gaaggggctg gctccgatgt atttgatggt gacctgggaa tgggggcagc caaggggctg

3781 caaagcctcc ccacacatga ccccagccct ctacagcggt acagtgagga ccccacagta

3841 cccctgccct ctgagactga tggctacgtt gcccccctga cctgcagccc ccagcctgaa

3901 tatgtgaacc agccagatgt tcggccccag cccccttcgc cccgagaggg ccctctgcct

3961 gctgcccgac ctgctggtgc cactctggaa aggcccaaga ctctctcccc agggaagaat

4021 ggggtcgtca aagacgtttt tgcctttggg ggtgccgtgg agaaccccga gtacttgaca

4081 ccccagggag gagctgcccc tcagccccac cctcctcctg ccttcagccc agccttcgac

4141 aacctctatt actgggacca ggacccacca gagcgggggg ctccacccag caccttcaaa

4201 gggacaccta cggcagagaa cccagagtac ctgggtctgg acgtgccagt gtgaaccaga

4261 aggccaagtc cgcagaagcc ctgatgtgtc ctcagggagc agggaaggcc tgacttctgc

4321 tggcatcaag aggtgggagg gccctccgac cacttccagg ggaacctgcc atgccaggaa

4381 cctgtcctaa ggaaccttcc ttcctgcttg agttcccaga tggctggaag gggtccagcc

4441 tcgttggaag aggaacagca ctggggagtc tttgtggatt ctgaggccct gcccaatgag

4501 actctagggt ccagtggatg ccacagccca gcttggccct ttccttccag atcctgggta

4561 ctgaaagcct tagggaagct ggcctgagag gggaagcggc cctaagggag tgtctaagaa

4621 caaaagcgac ccattcagag actgtccctg aaacctagta ctgcccccca tgaggaagga

4681 acagcaatgg tgtcagtatc caggctttgt acagagtgct tttctgttta gtttttactt

4741 tttttgtttt gtttttttaa agatgaaata aagacccagg gggagaatgg gtgttgtatg

4801 gggaggcaag tgtggggggt ccttctccac acccactttg tccatttgca aatatatttt

4861 ggaaaacagc taaaaaaaaa aaaaaaaaa

SEQ ID NO: 6

№ доступа: NM_001005862

MKLRLPASPE THLDMLRHLY QGCQVVQGNL ELTYLPTNAS LSFLQDIQEV QGYVLIAHNQ 60

VRQVPLQRLR IVRGTQLFED NYALAVLDNG DPLNNTTPVT GASPGGLREL QLRSLTEILK 120

GGVLIQRNPQ LCYQDTILWK DIFHKNNQLA LTLIDTNRSR ACHPCSPMCK GSRCWGESSE 180

DCQSLTRTVC AGGCARCKGP LPTDCCHEQC AAGCTGPKHS DCLACLHFNH SGICELHCPA 240

LVTYNTDTFE SMPNPEGRYT FGASCVTACP YNYLSTDVGS CTLVCPLHNQ EVTAEDGTQR 300

CEKCSKPCAR VCYGLGMEHL REVRAVTSAN IQEFAGCKKI FGSLAFLPES FDGDPASNTA 360

PLQPEQLQVF ETLEEITGYL YISAWPDSLP DLSVFQNLQV IRGRILHNGA YSLTLQGLGI 420

SWLGLRSLRE LGSGLALIHH NTHLCFVHTV PWDQLFRNPH QALLHTANRP EDECVGEGLA 480

CHQLCARGHC WGPGPTQCVN CSQFLRGQEC VEECRVLQGL PREYVNARHC LPCHPECQPQ 540

NGSVTCFGPE ADQCVACAHY KDPPFCVARC PSGVKPDLSY MPIWKFPDEE GACQPCPINC 600

THSCVDLDDK GCPAEQRASP LTSIISAVVG ILLVVVLGVV FGILIKRRQQ KIRKYTMRRL 660

LQETELVEPL TPSGAMPNQA QMRILKETEL RKVKVLGSGA FGTVYKGIWI PDGENVKIPV 720

AIKVLRENTS PKANKEILDE AYVMAGVGSP YVSRLLGICL TSTVQLVTQL MPYGCLLDHV 780

RENRGRLGSQ DLLNWCMQIA KGMSYLEDVR LVHRDLAARN VLVKSPNHVK ITDFGLARLL 840

DIDETEYHAD GGKVPIKWMA LESILRRRFT HQSDVWSYGV TVWELMTFGA KPYDGIPARE 900

IPDLLEKGER LPQPPICTID VYMIMVKCWM IDSECRPRFR ELVSEFSRMA RDPQRFVVIQ 960

NEDLGPASPL DSTFYRSLLE DDDMGDLVDA EEYLVPQQGF FCPDPAPGAG GMVHHRHRSS 1020

STRSGGGDLT LGLEPSEEEA PRSPLAPSEG AGSDVFDGDL GMGAAKGLQS LPTHDPSPLQ 1080

RYSEDPTVPL PSETDGYVAP LTCSPQPEYV NQPDVRPQPP SPREGPLPAA RPAGATLERP 1140

KTLSPGKNGV VKDVFAFGGA VENPEYLTPQ GGAAPQPHPP PAFSPAFDNL YYWDQDPPER 1200

GAPPSTFKGT PTAENPEYLG LDVPV 1225

[0084]

Один из вариантов осуществления настоящего изобретения относится к противоопухолевому средству, содержащему описанный выше кристалл соединения (I) (т.е. кристалл свободной формы соединения (I) или кристалл соединения (I) с кислотой (кристалл соли или сокристалл)). Кроме того, один из вариантов осуществления настоящего изобретения относится к способу лечения опухоли, включающему введение эффективного количества описанного выше кристалла соединения (I) (т.е. кристалл свободной формы соединения (I) или кристалл соединения (I) с кислотой (кристалл соли или сокристалл)) индивидууму, нуждающемуся в этом. Более того, один из вариантов осуществления настоящего изобретения относится к применению описанного выше кристалла соединения (I) (т.е. кристалл свободной формы соединения (I) или кристалл соединения (I) с кислотой (кристалл соли или сокристалл)) для изготовления противоопухолевого средства. Более того, один из вариантов осуществления настоящего изобретения относится к описанному кристаллу соединения (I) (т.е. кристалл свободной формы соединения (I) или кристалл соединения (I) с кислотой (кристалл соли или сокристалл)) для применения для лечения опухоли.

[0085]

Кристаллы по настоящему изобретению могут использоваться в послеоперационной адъювантной химиотерапии, проводимой для предупреждения рецидива после хирургического удаления опухоли, или могут использоваться в неоадъювантной химиотерапии, проводимой заранее до хирургического удаления опухоли.

[0086]

Опухоль, которая является мишенью настоящего изобретения, конкретно не ограничена. Примеры опухоли могут включать опухоль головного мозга, рак головы и шеи, рак пищеварительного тракта (рак пищевода, рак желудка, рак двенадцатиперстной кишки, рак печени, рак желчевыводящих путей (рак желчного пузыря и/или рак желчных протоков, и т.д.), рак поджелудочной железы, рак ободочной и прямой кишки (рак толстого кишечника, рак прямой кишки, и т.д.), и т.д.), рак легкого (немелкоклеточный рак легкого, мелкоклеточный рак легкого, мезотелиома, и т.д.), рак молочной железы, рак гениталий (рак яичника, рак тела матки (рак шейки матки, рак эндометрия, и т.д.), и т.д.), рак органов мочеполовой системы (рак почки, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы, рак яичка, и т.д.), гемопоэтическую опухоль (лейкоз, злокачественная лимфома, множественная миелома и т.д.), опухоль костей и/или мягких тканей, и рак кожи. Среди них предпочтительным является рак легкого, рак молочной железы, рак желудка, рак ободочной и прямой кишки, рак мочевого пузыря, рак желчевыводящих путей или рак тела матки, и более предпочтительным является рак легкого, рак молочной железы, рак желудка, рак мочевого пузыря или рак желчевыводящих путей.

[0087]

В одном варианте осуществления опухоль представляет собой опухоль головного мозга. Соединение по настоящему изобретению может быть пригодным для лечения симптомов головного мозга, для которого необходимо преодолеть гематоэнцефалический барьер. Соединение согласно одному из вариантов осуществления имеет хорошую способность проникать через гематоэнцефалический барьер для доставки в головной мозг, а именно, превосходными свойствами проникновения в головной мозг. В качестве показателя свойств проникновения соединения в головной мозг применяется концентрация соединения в головном мозге или величина Kp (соотношения концентрации лекарственного средства в головном мозге и плазме).

Опухоль головного мозга, которую лечат соединением по настоящему изобретению, включает метастатическую опухоль головного мозга и первичную опухоль головного мозга.

Примеры опухоли головного мозга могут включать, но не ограничиваться ими, метастатическую опухоль головного мозга (например, метастаз в головной мозг рака легкого, рака молочной железы, рака желудка, рака ободочной и прямой кишки, рака мочевого пузыря, рака желчевыводящих путей, рака тела матки, и т.д. (предпочтительно, рак легкого, рак молочной железы, или рак желудка)), пилоцитарную астроцитому, диффузную астроцитому, олигодендрому и/или олигодендроастроцитому, анапластическую астроцитому и/или анапластическую олигоденроглиому, анапластическую олигодендроастроцитому, глиобластому, эпендимому, анапластическую эпендимому, ганглиоглиому, центральную нейроцитому, медуллобластому, герминому, злокачественную лимфому центральной нервной системы, менингиому, неврилеммому, GH-секретирующую аденому гипофиза, PRL-секретирующую аденому гипофиза, ACTH-секретирующую аденому гипофиза, нефункциональную аденому гипофиза, краниофарингиому, хордому, геманиобластому и эпидермоидную опухоль.

[0088]

В настоящем описании термин "эффективное количество" соединения означает количество соединения по настоящему изобретению, которое индуцирует биологический или медицинский ответ у индивидуума, например, такой как снижение или ингибирование активности фермента или белка; или смягчает симптомы, облегчает состояние, и замедляет или отсрочивает прогрессирование заболевания и т.п. (терапевтически эффективное количество).

В настоящем описании термин "индивидуум" включает млекопитающих и не млекопитающих. Примеры млекопитающего могут включать, но не ограничиваться ими, человека, шимпанзе, человекообразную обезьяну, макака, животного подсемейства бычьих, лощадь, овцу, козу, свинью, кролика, собаку, кошку, крысу, мышь, морскую свинку, ежа, кенгуру, крота, кабана, медведя, тигра и льва. Примеры не млекопитающего могут включать, но не ограничиваться ими, птиц, рыб и пресмыкающихся. В одном варианте осуществления индивидуумом является человек, и им может быть человек, у которого диагностирована необходимость в лечении симптомов, состояний или заболевания, описанных в настоящем описании.

[0089]

При использовании соединения (I) или его кристалла соли или его сокристалла в качестве лекарственного средства, можно использовать различные типы дозированных форм в зависимости от терапевтической цели, с разрушением кристалла или без него. Примеры дозированной формы могут включать все из пероральных средств, таких как таблетки, капсулы, гранулы, мелкие гранулы, порошки и сухие сиропы, суппозитории, ингаляционные средства, назальные капли, мази, пластыри и инъекционные формы. Фармацевтические композиции, пригодные для этих дозированных форм, можно получать широко используемыми способами получения, которые известны специалистам, с использованием фармацевтически приемлемых носителей.

[0090]

Один из вариантов осуществления настоящего изобретения относится к противоопухолевому средству, содержащему описанный выше кристалл соединения (I) (т.е. кристалл свободной формы соединения (I) или кристалл соединения (I) с кислотой (кристалл соли или сокристалл)). Один из вариантов осуществления настоящего изобретения также относится к способу лечения опухоли, включающему введение эффективного количества кристалла соединения (I) (т.е. кристалл свободной формы соединения (I) или кристалл соединения (I) с кислотой (кристалл соли или сокристалл)) индивидууму, нуждающемуся в этом. Один из вариантов осуществления настоящего изобретения также относится к применению кристалла соединения (I) (т.е. кристалл свободной формы соединения (I) или кристалл соединения (I) с кислотой (кристалл соли или сокристалл)) для получения противоопухолевого средства. Один из вариантов осуществления настоящего изобретения также относится к кристаллу соединения (I) (т.е. кристалл свободной формы соединения (I) или кристалл соединения (I) с кислотой (кристалл соли или сокристалл)) для применения для лечения опухоли посредством его введения.

Один из вариантов осуществления настоящего изобретения относится к противоопухолевому средству для перорального введения, содержащему описанный выше кристалл соединения (I) (т.е. кристалл свободной формы соединения (I) или кристалл соединения (I) с кислотой (кристалл соли или сокристалл)). Один из вариантов осуществления настоящего изобретения также относится к способу лечения опухоли, включающему пероральное введение эффективного количества кристалла соединения (I) (т.е. кристалл свободной формы соединения (I) или кристалл соединения (I) с кислотой (кристалл соли или сокристалл)) индивидууму, нуждающемуся в этом. Один из вариантов осуществления настоящего изобретения также относится к применению кристалла соединения (I) (т.е. кристалл свободной формы соединения (I) или кристалл соединения (I) с кислотой (кристалл соли или сокристалл)) для получения противоопухолевого средства для перорального введения. Один из вариантов осуществления настоящего изобретения также относится к кристаллу соединения (I) (т.е. кристалл свободной формы соединения (I) или кристалл соединения (I) с кислотой (кристалл соли или сокристалл)) для применения для лечения опухоли посредством перорального его введения.

[0091]

Один из вариантов осуществления настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, содержащей кристалл соединения (I) (т.е. кристалл свободной формы соединения (I) или кристалл соединения (I) с кислотой (кристалл соли или сокристалл)). Фармацевтическая композиция в одном варианте осуществления настоящего изобретения содержит кристалл соединения (I) (т.е. кристалл свободной формы соединения (I) или кристалл соединения (I) с кислотой (кристалл соли или сокристалл)) и фармацевтически приемлемый носитель. Один из вариантов осуществления настоящего изобретения также относится к применению кристалла соединения (I) (т.е. кристалл свободной формы соединения (I) или кристалл соединения (I) с кислотой (кристалл соли или сокристалл)) для получения фармацевтической композиции. Один из вариантов осуществления настоящего изобретения относится к кристаллу соединения (I) (т.е. кристалл свободной формы соединения (I) или кристалл соединения (I) с кислотой (кристалл соли или сокристалл)) для применения в качестве лекарственного средства. Один из вариантов осуществления настоящего изобретения относится к набору, содержащему (i) фармацевтическую композицию, содержащую кристалл соединения (I) (т.е. кристалл свободной формы соединения (I) или кристалл соединения (I) с кислотой (кристалл соли или сокристалл)) и (ii) инструкцию по применению фармацевтической композиции.

[0092]

В качестве фармацевтически приемлемых носителей используют различные типы органических или неорганических носителей, которые широко используются в качестве материалов для производства. Когда соединение по настоящему изобретению преобразовывают в твердый препарат, примеры фармацевтически приемлемого носителя, примешиваемого к соединению по настоящему изобретению, могут включать эксципиент, связующее вещество, разрыхлитель, смазывающее вещество и вещество покрытия. Когда соединение по настоящему изобретению преобразовывают в жидкий препарат, примеры фармацевтически приемлемого носителя, примешиваемого к соединению по настоящему изобретению, могут включать растворитель, солюбилизатор, суспендирующее вещество, обеспечивающее изотоничность средство, буфер и смягчающее средство. Кроме того, также при необходимости могут использоваться добавки для препарата, такие как антисептик, антиоксидант, краситель, подсластитель и стабилизатор.

[0093]

Примеры эксципиента могут включать лактозу, сахарозу, D-маннит, крахмал, кристаллическую целлюлозу и силикат кальция.

Примеры связующего вещества могут включать гидроксипропилцеллюлозу, метилцеллюлозу, поливинилпирролидон, сахарную пудру и гипромеллозу.

Примеры разрыхлителя могут включать натрия крахмала гликолят, кармеллозу кальция, кроскармеллозу натрия, кросповидон, гидроксипропилцеллюлозу с низкой степенью замещения и частично прежелатинизированный крахмал.

Примеры смазывающего вещества могут включать тальк, стеарат магния, сложный эфир сахарозы и жирной кислоты, стеариновую кислоту и стеарилфумарат натрия.

Примеры вещества покрытия могут включать этилцеллюлозу, сополимер аминоалкилметакрилата RS, гипромеллозу и сахарозу.

Примеры растворителя могут включать воду, пропиленгликоль и физиологический раствор.

Примеры солюбилизатора могут включать полиэтиленгликоль, этанол, α-циклодекстрин, макрогол 400 и полисорбат 80.

Примеры суспендирующего вещества могут включать каррагенан, кристаллическую целлюлозу/кармеллозу натрий и полиоксиэтилен-гидрогенизированное касторовое масло.

Примеры обеспечивающего изотоничность средства могут включать хлорид натрия, глицерин и хлорид калия.

Примеры средства для коррекции pH/буфера могут включать цитрат натрия, хлористоводородную кислоту, молочную кислоту, фосфорную кислоту и дигидрофосфат натрия.

Примеры смягчающего средства могут включать прокаина гидрохлорид и лидокаин.

Примеры антисептика могут включать этилпараоксибензоат, крезол и хлорид бензалкония.

Примеры антиоксиданта могут включать сульфит натрия, аскорбиновую кислоту и натуральный витамин E.

Примеры красителя могут включать оксид титана, полуторный оксид железа, пищевой синий № 1 и медный хлорофилл.

Примеры корригирующего вещества могут включать аспартам, сахарин, сукралозу, l-ментол и мятную вкусовую добавку.

Примеры стабилизатора могут включать пиросульфит натрия, эдетат натрия, эриторбовую кислоту, оксид магния и дибутилгидрокситолуол.

[0094]

В случае получения твердого препарата для перорального введения эксципиент и при необходимости связующее вещество, разрыхлитель, смазывающее вещество, краситель, корригирующее вещество и т.п. добавляют к кристаллу соединения (I) (т.е. кристалл свободной формы соединения (I) или кристалл соединения (I) с кислотой (кристалл соли или сокристалл)), и после этого можно получать таблетку, покрытую таблетку, гранулу, порошковое средство, капсулу и т.п. обычными способами.

В случае получения инъекционной формы, средство для коррекции pH, буфер, стабилизатор, обеспечивающее изотоничность средство, местный анестетик и т.п. добавляют к кристаллу соединения (I) (т.е. кристалл свободной формы соединения (I) или кристалл соединения (I) с кислотой (кристалл соли или сокристалл)), и после этого можно получать подкожные, внутримышечные и внутривенные инъекционные формы обычными способами.

[0095]

Количество кристалла соединения (I) (т.е. кристалл свободной формы соединения (I) или кристалл соединения (I) с кислотой (кристалл соли или сокристалл)) для примешивания к каждой описанной выше единичной дозированной форме зависит от симптомов пациента, у которого должны применять кристалл, дозированной формы и т.п., и, таким образом, количество соединения по настоящему изобретению не является постоянным. Как правило, предпочтительно, чтобы применяемая доза была выбрана так, чтобы она составляла приблизительно от 0,05 до 1000 мг на единичную дозированную форму в случае перорального средства, приблизительно от 0,1 до 500 мг на единичную дозированную форму в случае инъекционной формы, и приблизительно от 1 до 1000 мг на единичную дозированную форму в случае суппозитория или средства для местного применения в расчете на соединение (I) в свободной форме.

[0096]

Суточная доза кристалла соединения (I) (т.е. кристалл свободной формы соединения (I) или кристалл соединения (I) с кислотой (кристалл соли или сокристалл)) в лекарственном средстве, имеющем описанную выше дозированную форму, различается в зависимости от симптомов, массы тела, возраста, пола и т.п. пациента, и, таким образом, она не может быть определена. Однако кристалл можно вводить взрослому (масса тела: 50 кг) в суточной дозе, обычно составляющей приблизительно от 0,05 до 5000 мг, и предпочтительно от 0,1 до 1000 мг в расчете на соединение (I) в свободной форме, и предпочтительно ее вводят один раз в сутки или 2-3 разделенными дозами.

ПРИМЕРЫ

[0097]

Далее настоящее изобретение описано конкретно с помощью примеров, приведенных ниже. Однако эти примеры не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения. Хотя настоящее изобретение полностью описано посредством примеров, будет понятно, что специалисты в данной области могут внести различные изменения и/или модификации. Таким образом, такие изменения и/или модификации включены в изобретение, если только они не выходят за пределы объема настоящего изобретения.

[0098]

В приведенных ниже примерах, касающихся соединений, "%" указывает на процент по массе, если нет иных указаний.

[0099]

Различные типы реагентов, используемые в примерах, представляли собой коммерчески доступные продукты, если нет иных указаний. Хроматографию на силикагеле проводили с использованием Purif-Pack (зарегистрированный торговый знак) SI, произведенного MORITEX Corporation, заполненной диоксидом кремния колонки KP-Sil (зарегистрированный торговый знак), произведенной Biotage Japan Ltd., или заполненной диоксидом кремния колонки HP-Sil (зарегистрированный торговый знак), произведенной Biotage Japan Ltd. Базовую колоночную хроматографию на силикагеле проводили с использованием Purif-Pack (зарегистрированный торговый знак) NH, произведенного MORITEX Corporation, или заполненной колонки KP-NH (зарегистрированный торговый знак), произведенной Biotage Japan Ltd. Препаративную тонкослойную хроматографию проводили с использованием Kieselgel TM60F254, арт. 5744, произведенного Merck, или NH2 Silicagel 60F254 Plate, произведенного Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Для спектрального анализа с использованием ЯМР, использовали спектрометр AL400 (400 МГц; JEOL Ltd. (JEOL)), спектрометр типа Mercury400 (400 МГц; Agilent Technologies) или спектрометр типа Inova400 (400 МГц; Agilent Technologies), оборудованный зондом 400 MNMR (Protasis). Когда тетраметилсилан присутствовал в тяжелом растворителе, тетраметилсилан использовали в качестве внутреннего эталона, а в других случаях ЯМР-растворитель использовали в качестве внутреннего эталона для измерения и общую величину δ представляли в м.д.

[0100]

Кроме того, спектральное измерение LCMS проводили с использованием ACQUITY SQD (квадрупольный тип), произведенного Waters, в следующих условиях.

Колонка: XSelect CSH C18 (4,6×150 мм, 3,5 мкм), произведенная Waters

MS-детекция: ESI-положительные

УФ-детекция: 246 нм

Температура колонки: 40°C

Скорость потока колонки: 1,0 мл/мин

Подвижная фаза: вода/ацетонитрил (0,1% муравьиная кислота)

Инъецируемое количество: 5 мкл

Устройство для охлаждения образцов: 5°C

Концентрация образца: 1 мг/мл

Градиент (таблица 1)

[0101]

[Таблица 1]

Время (мин)	Вода	Ацетонитрил
0-0,1	95%	5%
0,1-2,1	95%→5%	5%→95%
2,1-3,1	5%	95%

[0102]

Очистку посредством обращенно-фазовой препаративной ВЭЖХ проводили в следующих условиях с использованием препаративной системы, произведенной WATERS.

Колонка: колонка, использовали колонку, полученную путем соединения YMC-Actus Triart C18 (20×50 мм, 5 мкм), произведенной YMC, и YMC-Actus Triart C18 (20×10 мм, 5 мкм), произведенной YMC.

УФ-детекция: 254 нм

MS-детекция: ESI-положительные

Скорость потока колонки: 25 мл/мин

Инжектируемое количество: 0,1-0,5 мл

[0103]

Сокращенные обозначения имеют следующие значения.

с: синглет

д: дублет

т: триплет

дт: двойной триплет

м: мультиплет

DMSO-d6: дейтерированный диметилсульфоксид

CDCl₃: дейтерированный хлороформ

THF: тетрагидрофуран

DMA: N, N-диметилацетамид

NMP: 1-метил-2-пирролидинон

DMSO: диметилсульфоксид

[0104]

Анализ с использованием порошковой рентгеновской дифракции

Анализ с использованием порошковой рентгеновской дифракции проводили в соответствии с любыми из следующих условий тестирования после небольшого распыления соответствующего количества тестируемого вещества в агатовой ступке при необходимости.

[0105]

Устройство: EMPYREAN (способ A), произведенный PANalytical

Способ отражения (способ концентрирования)

Мишень: Cu

Ток в рентгеновской трубке: 40 мА

Напряжение в рентгеновской трубке: 45 кВ

Диапазон сканирования: 2Ɵ=от 5,0° до 40,0°

Стадия: 2Ɵ=0,0131°

Среднее время/стадия: 8,670 с

Скорость сканирования: 0,0015°/с

Щель расходимости: 1°

Щель рассеивания: 2,0 мм

Светоприемная щель: 8,0 мм

Устройство: EMPYREAN (способ B), произведенный PANalytical

Способ проникновения

Мишень: Cu

Ток в рентгеновской трубке: 40 мА

Напряжение в рентгеновской трубке: 45 кВ

Диапазон сканирования: 2Ɵ=от 2,0° до 40,0°

Стадия: 2Ɵ=0,0066°

Среднее время/стадия: 8,670 с

Скорость сканирования: 0,0008°/с

Щель расходимости: 1/2°

Щель рассеивания: 2,0 мм

Светоприемная щель: нет

[0106]

Использование устройств, включая обработку данных, проводили в соответствии со способами и методиками, указанными в инструкциях для каждого устройства. Числовые величины, полученные для различных спектров, могут несколько варьироваться в зависимости от направления роста кристаллов, размера частиц, условий анализа и т.п. Таким образом, эти числовые величины не следует понимать строго конкретно.

[0107]

Что касается одновременного термогравиметрического-дифференциального термического анализа (TG-DTA), анализ проводили с использованием 2-3 мг тестируемого вещества в соответствии со следующими условиями тестирования.

Устройство: TG/DTA7200, произведенное Hitachi High-Tech Science Corporation

Контейнер для образца: изготовлен из алюминия

Скорость повышения температуры: температуру увеличивали от 25°C до 290°C при 10°C/мин.

Атмосферный газ: воздух (200 мл/мин)

Контрольное вещество: пустой контейнер

Использование устройств, включая обработку данных, проводили в соответствии со способами и методиками, указанными в инструкциях для каждого устройства.

[0108]

Пример синтеза 1

Синтез 7-((3R,5S)-1-акрилоил-5-метилпирролидин-3-ил)-4-амино-6-(циклопропилэтинил)-N-((R)-1-фенилэтил)-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-5-карбоксамида (соединение (I))

Пример синтеза 1 (1)

Синтез трет-бутил (2S,4R)-4-(4-амино-5-йод-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-7-ил)-2-метилпирролидин-1-карбоксилата

Трет-бутил (2S,4S)-4-гидрокси-2-метилпирролидин-1-карбоксилат (19,0 г) и 4-хлор-5-йод-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин (13,1 г) растворяли в THF (190 мл), а затем полученный раствор охлаждали до 0°C. После этого к реакционному раствору добавляли трифенилфосфин (37,2 г) и диизопропилазодикарбоксилат (28,1 мл), а затем температуру смеси увеличивали до комнатной температуры, а затем перемешивали в течение 1 часа. После этого реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении, а затем полученный остаток очищали хроматографией на силикагеле (гексан:этилацетат) с получением соответствующего основы для присоединения. Полученное соединение использовали в следующей реакции без дополнительной очистки.

Полученную основу для присоединения, THF (114 мл) и аммиачную воду (114 мл) добавляли в устойчивую к давлению пробирку, а затем полученную смесь перемешивали при 100°C в течение 14 часов. После этого реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, а затем переливали в воду (285 мл). Полученную таким образом смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 5 часов. После этого выпавшее в осадок твердое вещество собирали фильтрации, затем промывали водой, а затем сушили с получением представляющего интерес продукта (34,5 г).

¹H-ЯМР (CDCl₃) δ: 8,27 (с, 1H) 7,15 (с, 1H) 5,55-5,73 (м, 2H) 5,12-5,25 (м, 1H) 3,86-4,18 (м, 2H) 3,43-3,57 (м, 1H) 2,59-2,69 (м, 1H) 1,92-2,03 (м, 1H) 1,48 (с, 9H) 1,30-1,40 (м, 3H)

ESI-MS m/z 444 (MH⁺)

[0109]

Пример синтеза 1(2)

Синтез 4-амино-7-((3R,5S)-1-(трет-бутоксикарбонил)-5-метилпирролидин-3-ил)-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты

Соединение примера синтеза 1(1) (28,0 г), катализатор 10% палладий на угле (720 мг), NMP (84 мл), метанол (26 мл) и триэтиламин (17,6 мл) добавляли в устойчивую к давлению пробирку, затем проводили вытеснение монооксидом углерода, и полученную смесь перемешивали при 100°C в течение 2 часов. После этого реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, затем к ней добавляли 2 M водный раствор гидроксида натрия (79 мл), а затем полученную смесь перемешивали при 80°C в течение 2 часов. После этого реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, затем фильтровали, а затем промывали метанолом. Затем метанол в фильтрате концентрировали при пониженном давлении. Затем добавляли воду и водный слой промывали трет-бутилметиловым эфиром. К водному слою добавляли 1 M водный раствор гидросульфата калия для доведения pH приблизительно до 3. Выпавшее в осадок твердое вещество собирали фильтрации, затем промывали водой, а затем сушили с получением представляющего интерес продукта (23,4 г).

¹H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ: 8,14 (с, 1H) 8,08 (с, 1H) 5,16-4,93 (м, 1H) 4,07-3,79 (м, 2H) 3,61-3,45 (м, 1H) 2,53 (м, 1H) 2,33-2,02 (м, 1H) 1,42 (с, 9H) 1,29(д, J=6,1 Гц, 3H) ESI-MS m/z 362 (MH⁺)

[0110]

Пример синтеза 1(3)

Синтез трет-бутил(2S,4R)-4-(4-амино-6-бром-5-(((R)-1-фенилэтил)карбамоил)-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-7-ил)-2-метилпирролидин-1-карбоксилата

К соединению примера синтеза 1(2) (1,00 г) добавляли (R)-(+)-1-фенилэтиламин (0,503 г), диизопропилэтиламин (1,79 г) и N, N-диметилформамид (10 мл), а затем добавляли HATU (1,58 г). Полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. После этого в реакционную смесь добавляли этилацетат и насыщенный водный раствор гидрокарбоната натрия, а затем полученную смесь экстрагировали этилацетатом. Собранный органический слой промывали водой, а затем насыщенным солевым раствором. Полученный материал сушили над безводным сульфатом натрия, а затем концентрировали при пониженном давлении. Полученный остаток очищали хроматографией на силикагеле (гексан:ацетон) с получением амидной формы (1,53 г). Полученное соединение использовали в следующей реакции без дальнейшей очистки.

К амидной форме (1,53 г) добавляли хлороформ (15 мл), а затем полученную смесь охлаждали до 0°C. После этого к реакционной смеси добавляли N-бромсукцинимид (0,88 г), а затем полученную смесь перемешивали при 0°C в течение 1 часа. После этого реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и полученный остаток очищали хроматографией на силикагеле (гексан:этилацетат) с получением представляющего интерес продукта (1,39 г).

¹H-ЯМР (CDCl₃) δ: 8,21 (с, 1H) 7,42-7,28 (м, 5H) 6,97 (д, J=7,3 Гц, 1H) 5,36-5,29 (м, 1H) 5,20-5,07 (м, 1H) 4,30 (т, J=10,3 Гц, 1H) 4,04-3,72 (м, 2H) 3,00-2,86 (м, 1H) 2,38 (дт, J=14,3,6,0 Гц, 1H) 1,63 (д, J=7,0 Гц, 3H) 1,53-1,43 (м, 12H)

ESI-MS m/z 543,545 (MH⁺)

[0111]

Пример синтеза 1(4)

7-((3R,5S)-1-акрилоил-5-метилпирролидин-3-ил)-4-амино-6-бром-N-((R)-1-фенилэтил)-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-5-карбоксамид

К соединению примера синтеза 1(3) (600 мг) добавляли хлороформ (3 мл), а затем полученную смесь охлаждали до 0°C. После этого к реакционной смеси добавляли трифторуксусную кислоту (4,44 г), а затем полученную таким образом смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. После этого реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении, а затем к остатку добавляли ацетонитрил (5 мл). Полученную смесь вновь концентрировали при пониженном давлении с получением формы амина. Полученное соединение использовали в следующей реакции без дальнейшей очистки.

К полученной форме амина добавляли ацетонитрил (3 мл), а затем полученную смесь охлаждали до 0°C. После этого добавляли акрилоилхлорид (99,9 мг) и диизопропилэтиламин (713 мг), а затем полученную смесь перемешивали при 0°C в течение 1 часа. После этого реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и полученный остаток очищали хроматографией на силикагеле (этилацетат:метанол) с получением представляющего интерес продукта (281 мг).

¹H-ЯМР (CDCl₃) δ: 8,20 (д, J=7,3 Гц, 1H) 7,42-7,36 (м, 4H) 7,32-7,28 (м, 1H) 7,00-6,94 (м, 1H) 6,57-6,33 (м, 2H) 5,76-5,66 (м, 1H) 5,36-5,29 (м, 1H) 5,14-5,08 (м, 1H) 4,71 (т, J=9,9 Гц, 0,7H) 4,42-4,23 (м, 1,6H) 3,83 (т, J=8,6 Гц, 0,7H) 3,03-2,92 (м, 1H) 2,60-2,57 (м, 0,3H) 2,44-2,40 (м, 0,7H) 1,64 (д, J=6,6 Гц, 3H) 1,56 (дд, J=11,7,6,2 Гц, 3H)

ESI-MS m/z 497,499 (MH⁺)

[0112]

Пример синтеза 1(5)

К соединению примера синтеза 1(4) (65 мг) добавляли дихлорбис(трифенилфосфин)дипалладий (9,2 мг), йодид меди(I) (5,0 мг), циклопропилацетилен (13,0 мг), триэтиламин (39,7 мг) и N, N-диметилформамид (1,3 мл), а затем внутри реакционной системы проводили вытеснение азотом. После этого смесь перемешивали при 70°C в течение 2,5 часов. После этого к реакционной смеси добавляли этилацетат и насыщенный водный раствор хлорида аммония, а затем полученную смесь экстрагировали этилацетатом. Собранный органический слой промывали водой, а затем насыщенным солевым раствором. Полученный материал сушили над безводным сульфатом натрия, а затем концентрировали при пониженном давлении. Полученный остаток очищали хроматографией на силикагеле (хлороформ:метанол) с получением представляющего интерес продукта (50 мг).

¹H-ЯМР (CDCl₃) δ: 8,22 (д, J=5,1 Гц, 1H) 7,82 (д, J=7,3 Гц, 1H) 7,43-7,35 (м, 4H) 7,30 (т, J=6,8 Гц, 1H) 6,58-6,34 (м, 2H) 5,77-5,66 (м, 1H) 5,35-5,20 (м, 2H) 4,54 (т, J=10,1 Гц, 0,7H) 4,35-4,25 (м, 1,6H) 3,88 (т, J=8,8 Гц, 0,7H) 2,90-2,78 (м, 1H) 2,65-2,56 (м, 0,3H) 2,49-2,40 (м, 0,7H) 1,63 (д, J=7,0 Гц, 3H) 1,56-1,45 (м, 4H) 1,03-0,91 (м, 2H) 0,84-0,69 (м, 2H)

ESI-MS m/z 483 (MH⁺)

[0113]

Пример 1

Получение кристалла типа II 7-((3R,5S)-1-акрилоил-5-метилпирролидин-3-ил)-4-амино-6-(циклопропилэтинил)-N-((R)-1-фенилэтил)-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-5-карбоксамида (соединение (I)) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты

Кристаллы типа II соединения (I) с фумаровой кислотой получали двумя способами, описанными ниже в способе получения 1 и способе получения 2. Кристалл свободной формы типа I соединения (I) синтезировали тем же способом, что и в примере 3, описанном ниже.

(i) Способ получения 1

Фумаровую кислоту (3 эквивалента) добавляли к 30 мг кристалла свободной формы типа I соединения (I), добавляли 0,3 мл трет-бутанола, суспензию перемешивали при 25°C в течение приблизительно 124 часов, а затем твердое вещество собирали фильтрацией, выделяли и сушили с получением представляющего интерес кристалла.

(ii) Способ получения 2

Фумаровую кислоту (1,06 г) и 22 мл ацетона добавляли к 2,20 г кристалла свободной формы типа I соединения (I), суспензию перемешивали при 50°C в течение приблизительно 62 часов, охлаждали естественным путем в течение 30 минут, а затем твердое вещество собирали фильтрацией и извлекали. Его промывали 2-пропанолом, а затем твердое вещество собирали фильтрацией, извлекали и сушили с получением 2,27 г представляющего интерес кристалла.

[0114]

Спектр порошковой рентгеновской дифракции (способ A): См. фиг.1. Спектральные данные порошковой рентгеновской дифракции представлены в таблице 2.

[Таблица 2]

Таблица 2: Спектральные данные порошковой рентгеновской дифракции кристалла типа II соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты

Положение пика [°2Ɵ]	Суммарная интенсивность (единицы счета)	Положение пика [°2Ɵ]	Суммарная интенсивность (единицы счета)	Положение пика [°2Ɵ]	Суммарная интенсивность (единицы счета)
5,5	1065	18,5	1706	27,3	358
6,8	489	19,8	516	27,9	144
8,1	187	20,5	236	28,1	137
9,3	370	22,0	1123	29,0	154
10,8	54	22,6	101	29,9	183
12,1	107	23,3	129	30,9	106
13,4	564	23,8	151	32,0	73
14,0	319	24,5	929	32,9	104
14,6	171	25,1	676	34,3	174
15,3	771	25,5	774	35,1	125
16,3	602	26,2	432	38,2	105
17,1	101	27,2	455	39,1	114

Кроме того, характеристические углы дифракции являются следующими.

Характеристический угол дифракции (2Ɵ±0,2°):

5,5°, 6,8°, 9,3°, 13,4°, 15,3°, 16,3°, 18,5°, 19,8°, 22,0° и 24,5°.

Кривая одновременного термогравиметрического-дифференциального термического анализа: см. фиг.2.

Эндотермический пик (величина вершины пика) на кривой одновременного термогравиметрического-дифференциального термического анализа: приблизительно 182°C

[0115]

Пример 2

Получение кристалла свободной формы типа II 7-((3R,5S)-1-акрилоил-5-метилпирролидин-3-ил)-4-амино-6-(циклопропилэтинил)-N-((R)-1-фенилэтил)-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-5-карбоксамида (соединение (I))

Кристаллы свободной формы типа II получали четырьмя способами, описанными ниже в способах получения 1-4.

(i) Способ получения 1

Янтарную кислоту (1 эквивалент) и 0,3 мл 1-пропанола/воды (1:3 об./об.) добавляли к 15 мг соединения (I), полученного способом примера синтеза 1, смесь суспендировали и перемешивали при 50°C в течение 4 суток, а затем твердое вещество собирали фильтрацией, выделяли и сушили с получением представляющего интерес кристалла.

(ii) Способ получения 2

Янтарную кислоту (1 эквивалент) и 1,5 мл 1-пропанола/воды (1:3 об./об.) добавляли к 300 мг соединения (I), полученного способом примера синтеза 1, добавляли небольшое количество кристаллов, полученных в (i), в качестве затравочного кристалла, смесь суспендировали и перемешивали при 50°C в течение 5 часов, затем добавляли 0,3 мл 1-пропанола, смесь далее суспендировали и перемешивали при 50°C в течение 2 часов, а затем добавляли 0,3 мл 1-пропанола, смесь суспендировали и перемешивали при 50°C в течение 17 часов, а затем твердое вещество собирали фильтрацией, извлекали и сушили с получением 84,5 мг представляющего интерес кристалла.

(iii) Способ получения 3

Янтарную кислоту (1 эквивалент) и 3 мл 1-пропанола/воды (1:1 об./об.) добавляли к 1000 мг соединения (I), полученного способом примера синтеза 1, добавляли небольшое количество кристаллов, полученных в (ii), в качестве затравочного кристалла, смесь суспендировали и перемешивали при 50°C в течение 17,5 часов, а затем твердое вещество собирали фильтрацией (промывая водой в ходе фильтрации), извлекали и сушили с получением 487,6 мг представляющего интерес кристалла.

(iv) Способ получения 4

Диизопропиловый эфир (5 мл) добавляли к 1000 мг соединения (I), полученного способом примера синтеза 1, добавляли небольшое количество кристаллов, полученных в (iii), в качестве затравочного кристалла, и смесь суспендировали и перемешивали при 50°C. Через 42,5 часа, поскольку произошло испарение растворителя, добавляли 5 мл диизопропилового эфира. Смесь суспендировали и перемешивали при 50°C в течение 2 часов, а затем добавляли 0,5 мл этанола. Смесь далее суспендировали и перемешивали при 50°C в течение 2 часов, а затем добавляли 0,5 мл этанола. Смесь далее суспендировали и перемешивали при 50°C в течение 19 часов и естественным образом охлаждали в течение 30 минут, а затем твердое вещество собирали фильтрацией, извлекали и сушили с получением 798,8 мг представляющего интерес кристалла.

[0116]

Спектр порошковой рентгеновской дифракции (способ A): cм. фиг.3. Спектральные данные порошковой рентгеновской дифракции представлены в таблице 3.

[Таблица 3]

Таблица 3: Спектральные данные порошковой рентгеновской дифракции кристалла свободной формы типа II соединения (I)

Положение пика [°2Ɵ]	Суммарная интенсивность (единицы счета)	Положение пика [°2Ɵ]	Суммарная интенсивность (единицы счета)	Положение пика [°2Ɵ]	Суммарная интенсивность (единицы счета)
8,3	1844	19,4	154	27,6	218
9,7	179	20,3	952	28,3	100
10,2	531	21,0	963	28,6	101
11,5	248	21,6	271	29,7	374
12,5	660	21,9	520	30,9	113
13,6	440	22,5	957	31,7	261
14,8	2512	23,0	1442	32,3	148
15,8	530	23,6	559	34,0	229
16,0	105	23,9	980	34,6	159
16,5	641	24,7	418	35,3	67
16,9	117	25,0	367	36,4	59
17,3	2130	25,5	208	37,0	123
18,0	945	26,2	1551	37,7	60
18,3	269	26,8	323	38,6	53
19,1	844	27,2	771	39,0	55

[0117]

Характеристический угол дифракции (2Ɵ±0,2°):

8,3°, 14,8°, 17,3°, 18,0°, 19,1°, 20,3°, 21,0°, 22,5°, 23,0° и 26,2°.

Кривая одновременного термогравиметрического-дифференциального термического анализа: см. фиг.4.

Эндометрический пик (величина вершины пика) на кривой одновременного термогравиметрического-дифференциального термического анализа: приблизительно 182°C.

[0118]

Пример 3

Получение кристалла свободной формы типа I 7-((3R,5S)-1-акрилоил-5-метилпирролидин-3-ил)-4-амино-6-(циклопропилэтинил)-N-((R)-1-фенилэтил)-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-5-карбоксамида (соединение (I))

Неочищенный продукт (100 мг) соединения (I) суспендировали в этаноле (500 мкл) и перемешивали при 50°C в течение ночи. Раствор охлаждали до 25°C и полученную суспензию фильтровали с получением кристалла свободной формы типа I соединения (I) (31 мг).

[0119]

Спектр порошковой рентгеновской дифракции (способ A): См. фиг.5. Спектральные данные порошковой рентгеновской дифракции представлены в таблице 4.

[Таблица 4]

Таблица 4: Спектральные данные порошковой рентгеновской дифракции кристалла свободной формы типа I соединения (I)

Положение пика [°2Ɵ]	Суммарная интенсивность (единицы счета)	Положение пика [°2Ɵ]	Суммарная интенсивность (единицы счета)	Положение пика [°2Ɵ]	Суммарная интенсивность (единицы счета)
9,9	623	21,5	481	30,3	208
10,4	278	22,4	437	31,0	72
11,7	1459	23,3	198	31,8	113
12,0	457	23,9	297	32,2	114
13,2	618	24,3	230	32,5	108
14,6	74	24,9	293	33,0	126
15,7	588	25,5	379	33,6	171
16,0	555	26,1	321	34,7	68
17,7	730	27,1	99	35,5	82
18,1	1070	28,0	183	36,9	80
18,8	1539	28,3	545	37,2	55
19,7	120	28,9	391	38,0	50
20,1	382	29,5	168
20,8	2893	29,8	105

Характеристический угол дифракции (2Ɵ±0,2°): 9,9°, 11,7°, 13,2°, 17,7°, 18,1°, 18,8° и 20,8°.

Кривая одновременного термогравиметрического-дифференциального термического анализа: см. фиг.6.

Эндотермический пик (величина вершины пика) на кривой одновременного термогравиметрического-дифференциального термического анализа: приблизительно 183°C.

[0120]

Пример 4

Получение кристалла типа V 7-((3R,5S)-1-акрилоил-5-метилпирролидин-3-ил)-4-амино-6-(циклопропилэтинил)-N-((R)-1-фенилэтил)-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-5-карбоксамида (соединение (I)) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты

Фумаровую кислоту (481 мг) и 50 мл ацетона добавляли к 1000 мг соединения (I), полученного способом примера синтеза 1, смесь суспендировали и перемешивали при 25°C в течение 71 часа, а затем твердое вещество собирали фильтрацией и извлекали. Его сушили в условиях комнатной температуры и пониженного давления в течение 7,5 часа с получением 695,0 мг представляющего интерес кристалла.

[0121]

Спектр порошковой рентгеновской дифракции (способ A): см. фиг.7. Спектральные данные порошковой рентгеновской дифракции представлены в таблице 5.

[Таблица 5]

Таблица 5: Спектральные данные порошковой рентгеновской дифракции кристалла типа V соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты

Положение пика [°2Ɵ]	Суммарная интенсивность (единицы счета)	Положение пика [°2Ɵ]	Суммарная интенсивность (единицы счета)	Положение пика [°2Ɵ]	Суммарная интенсивность (единицы счета)
6,9	180	18,1	201	27,5	235
8,7	184	18,7	278	28,2	140
9,4	470	20,1	319	29,0	103
10,2	450	21,1	481	31,0	92
11,9	197	21,7	215	32,4	65
13,7	219	23,1	343	33,0	54
14,5	199	23,6	573	34,4	74
15,9	350	24,6	206
17,5	356	26,5	519

Характеристический угол дифракции (2Ɵ±0,2°): 6,9°, 9,4°, 10,2°, 13,7°, 21,1°, 23,6° и 26,5°.

Кривая одновременного термогравиметрического-дифференциального термического анализа: см. фиг.8.

Эндотермический пик (величина вершины пика) на кривой одновременного термогравиметрического-дифференциального термического анализа: приблизительно 151°C

[0122]

Пример 5

Получение кристалла типа I 7-((3R,5S)-1-акрилоил-5-метилпирролидин-3-ил)-4-амино-6-(циклопропилэтинил)-N-((R)-1-фенилэтил)-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-5-карбоксамида (соединение (I)) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты

Фумаровую кислоту (481 мг) и 50 мл ацетона добавляли к 1000 мг соединения (I), полученного способом примера синтеза 1, смесь суспендировали и перемешивали при 25°C в течение 19,5 часа, а затем твердое вещество собирали фильтрацией и извлекали с получением 868,8 мг представляющего интерес кристалла.

[0123]

Спектр порошковой рентгеновской дифракции (способ A): см. фиг.9. Спектральные данные порошковой рентгеновской дифракции представлены в таблице 6.

[Таблица 6]

Таблица 6: Спектральные данные порошковой рентгеновской дифракции кристалла типа I соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты

Положение пика [°2Ɵ]	Суммарная интенсивность (единицы счета)	Положение пика [°2Ɵ]	Суммарная интенсивность (единицы счета)	Положение пика [°2Ɵ]	Суммарная интенсивность (единицы счета)
6,4	637	17,8	129	26,6	931
8,5	145	18,4	290	28,1	112
8,9	115	19,2	145	28,9	164
10,3	461	19,4	151	30,3	70
11,4	321	20,7	938	30,8	75
12,8	279	21,4	195	31,6	77
14,4	172	22,1	146	32,9	138
15,0	393	22,9	451	33,4	61
15,7	326	23,4	690	34,6	57
16,0	422	24,2	157
16,9	206	24,8	146

Характеристический угол дифракции (2Ɵ±0,2°): 6,4°, 10,3°, 12,8°, 15,0°, 20,7°, 23,4° и 26,6°.

Кривая одновременного термогравиметрического-дифференциального термического анализа: см. фиг.10.

Эндотермический пик (величина вершины пика) на кривой одновременного термогравиметрического-дифференциального термического анализа: приблизительно 153°С

[0124]

Пример 6

Получение кристалла типа I 7-((3R,5S)-1-акрилоил-5-метилпирролидин-3-ил)-4-амино-6-(циклопропилэтинил)-N-((R)-1-фенилэтил)-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-5-карбоксамида (соединение (I))с 0,5 эквивалента фумаровой кислоты

Фумаровую кислоту (0,5 эквивалента) и 0,3 мл воды добавляли к 15 мг соединения (I), полученного способом примера синтеза 1, смесь суспендировали и перемешивали при 50°C в течение 93,5 часа, а затем твердое вещество собирали фильтрацией, извлекали и сушили с получением представляющего интерес кристалла.

[0125]

Спектр порошковой рентгеновской дифракции (способ B): см. фиг.11.

Характеристический угол дифракции (2Ɵ±0,2°): 6,4°, 7,5°, 9,7°, 11,7°, 15,1°, 19,6° и 23,9°.

Кривая одновременного термогравиметрического-дифференциального термического анализа: см. фиг.12.

Эндотермический пик (величина вершины пика) на кривой одновременного термогравиметрического-дифференциального термического анализа: приблизительно 161°C

[0126]

Пример 7

Получение кристалла типа II 7-((3R,5S)-1-акрилоил-5-метилпирролидин-3-ил)-4-амино-6-(циклопропилэтинил)-N-((R)-1-фенилэтил)-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-5-карбоксамида (соединение (I)) с 0,5 эквивалента фумаровой кислоты

Фумаровую кислоту (1 эквивалент) и 6 мл этанола добавляли к 300 мг соединения (I), полученного способом примера синтеза 1, смесь суспендировали и перемешивали при 50°C в течение 19,5 часа и естественным образом охлаждали в течение 3 часов, а затем твердое вещество собирали фильтрацией и извлекали. Его промывали водой, а затем твердое вещество собирали фильтрацией, извлекали и сушили с получением 224,6 мг представляющего интерес кристалла.

[0127]

Спектр порошковой рентгеновской дифракции: cм. фиг.13.

Характеристический угол дифракции (2Ɵ±0,2°): 5,4°, 6,4°, 7,3°, 12,8°, 13,4°, 14,7° и 15,4°.

Кривая одновременного термогравиметрического-дифференциального термического анализа: см. фиг.14.

Эндотермический пик (величина вершины пика) на кривой одновременного термогравиметрического-дифференциального термического анализа: приблизительно 162°C.

[0128]

Пример 8

Анализ молярного соотношения соединения (I) и фумаровой кислоты

Молярное соотношение соединения (I) и фумаровой кислоты и молярное соотношение соединения (I) и L-виннокаменной кислоты подтверждали посредством 1H-ЯМР. Результаты измерения спектра ЯМР кристалла типа I соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты, кристалла типа II соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты и кристалла типа V соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты представлены ниже. Результаты измерения спектров ЯМР кристалла свободной формы соединения (I) и кристалла свободной формы II соединения (I) также представлены ниже.

(Кристалл свободной формы I соединения (I))

¹H-ЯМР(400 МГц,DMSO-d6) δ: 8,32 (ушир. д, J=7,38 Гц, 1H) 8,14 (с, 1H) 7,25-7,50 (м, 5H) 6,54-6,72 (м, 1H) 6,13-6,23 (м, 1H) 5,65-5,76 (м, 1H) 5,12-5,39 (м, 2H) 4,33-4,40 (м, 1H) 4,00-4,22 (м, 2H) 2,44-2,70 (м, 2H) 1,73 (тт, J=4,99,8,27 Гц, 1H) 1,51 (д, J=6,88 Гц, 3H) 1,36-1,43 (м, 3H) 0,78-1,03 (м, 4H)

(Кристалл свободной формы II соединения (I))

¹H-ЯМР(400 МГц,DMSO-d₆) δ: 8,32 (ушир. д, J=7,38 Гц, 1H) 8,14 (с, 1H) 7,27-7,46 (м, 5H) 6,54-6,72 (м, 1H) 6,13-6,23 (м, 1H) 5,65-5,76 (м, 1H) 5,12-5,39 (м, 2H) 4,32-4,40 (м, 1H) 4,00-4,22 (м, 2H) 2,44-2,69 (м, 2H) 1,73 (тт, J=4,99,8,27 Гц, 1H) 1,51 (д, J=6,88 Гц, 3H) 1,40-1,43 (м, 3H) 0,78-1,03 (м, 4H)

¹H-ЯМР (400 МГц,DMSO-d6) δ: 13,13 (ушир. с, 2H) 8,32 (ушир. д, J=7,38 Гц, 1H) 8,14 (с, 1H) 7,24-7,48 (м, 5H) 6,46-6,78 (м, 3H) 6,06-6,30 (м, 1H) 5,63-5,77 (м, 1H) 5,11-5,38 (м, 2H) 4,27-4,44 (м, 1H) 3,98-4,23 (м, 2H) 2,42-2,73 (м, 2H) 1,73 (тт, J=5,02,8,30 Гц, 1H) 1,51 (д, J=6,88 Гц, 3H) 1,32-1,45 (м, 3H) 0,77-1,02 (м, 4H).

¹H-ЯМР (400 МГц,DMSO-d6) δ: 13,14 (ушир. с, 2H) 8,32 (ушир. д, J=7,38 Гц, 1H) 8,14 (с, 1H) 7,25-7,49 (м, 5H) 6,39-6,89 (м, 3H) 6,07-6,28 (м, 1H) 5,62-5,77 (м, 1H) 5,12-5,39 (м, 2H) 4,27-4,45 (м, 1H) 3,99-4,24 (м, 2H) 2,42-2,75 (м, 2H) 1,74 (тт, J=5,02,8,30 Гц, 1H) 1,51 (д, J=6,88 Гц, 3H) 1,37-1,46 (м, 3H) 0,78-1,03 (м, 4H)

¹H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ: 13,13 (ушир. с, 2H) 8,32 (ушир. д, J=7,38 Гц, 1H) 8,14 (с, 1H) 7,21-7,49 (м, 5H) 6,47-6,80 (м, 3H) 6,09-6,26 (м, 1H) 5,63-5,77 (м, 1H) 5,11-5,38 (м, 2H) 4,27-4,44 (м, 1H) 3,98-4,23 (м, 2H) 2,42-2,72 (м, 2H) 1,73 (тт, J=4,99,8,27 Гц, 1H) 1,51 (д, J=6,88 Гц, 3H) 1,34-1,46 (м, 3H) 0,77-1,02 (м, 4H)

[0129]

Справочный пример 1

Получение кристалла типа III 7-((3R,5S)-1-акрилоил-5-метилпирролидин-3-ил)-4-амино-6-(циклопропилэтинил)-N-((R)-1-фенилэтил)-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-5-карбоксамида (соединение (I)) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты

Фумаровую кислоту (3 эквивалента) и 9 мл ацетонитрила добавляли к 300 мг соединения (I), полученного способом примера синтеза 1, смесь суспендировали и перемешивали при 50°C в течение 1 часа и естественным образом охлаждали, а затем твердое вещество собирали фильтрацией и извлекали. Его сушили с получением 303,7 мг представляющего интерес кристалла.

[0130]

Спектр порошковой рентгеновской дифракции (способ B): см. фиг.15.

Характеристический угол дифракции (2Ɵ±0,2°):8,1°, 13,2°, 20,4°, 23,1°, 24,7° и 26,1°.

Кривая одновременного термогравиметрического-дифференциального термического анализа: см. фиг.16.

Экзотермический пик (величина вершины пика) на кривой одновременного термогравиметрического-дифференциального термического анализа: приблизительно 153°C.

[0131]

Справочный пример 2

Получение кристалла типа IV 7-((3R,5S)-1-акрилоил-5-метилпирролидин-3-ил)-4-амино-6-(циклопропилэтинил)-N-((R)-1-фенилэтил)-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-5-карбоксамида (соединение (I)) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты

Фумаровую кислоту (3 эквивалента) и 6 мл воды добавляли к 300 мг соединения (I), полученного способом примера синтеза 1, смесь суспендировали и перемешивали при 50°C в течение 1,5 часа и естественным образом охлаждали в течение 3 часов, а затем твердое вещество собирали фильтрацией и извлекали. Его промывали водой, а затем твердое вещество собирали фильтрацией, извлекали и сушили с получением 311,2 мг представляющего интерес кристалла.

[0132]

Спектр порошковой рентгеновской дифракции (способ B): cм. фиг.17.

Характеристический угол дифракции (2Ɵ±0,2°): 6,0°, 15,7° и 18,8°.

Кривая одновременного термогравиметрического-дифференциального термического анализа: см. фиг.18.

Экзотермический пик (величина вершины пика) на кривой одновременного термогравиметрического-дифференциального термического анализа: приблизительно 130°C.

[0133]

Справочный пример 3

Получение кристалла типа I 7-((3R,5S)-1-акрилоил-5-метилпирролидин-3-ил)-4-амино-6-(циклопропилэтинил)-N-((R)-1-фенилэтил)-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-5-карбоксамида (соединение (I)) с хлористоводородной кислотой

2 M раствор хлористоводородной кислоты/этанол (15 мкл) и 0,3 мл жидкой смеси 2-пропанол/гептан (1:3 об./об.) добавляли к 15 мг соединения (I), полученного способом примера синтеза 1, смесь суспендировали и перемешивали в течение 4 суток и естественным образом охлаждали, а затем твердое вещество собирали фильтрацией и извлекали. Его сушили с получением представляющего интерес кристалла.

[0134]

Спектр порошковой рентгеновской дифракции (способ B): см. фиг.19.

Характеристический угол дифракции (2Ɵ±0,2°): 7,0°, 7,4°, 12,6°, 19,0° и 25,4°.

Кривая одновременного термогравиметрического-дифференциального термического анализа: см. фиг.20.

Эндотермический пик (величина вершины пика) на кривой одновременного термогравиметрического-дифференциального термического анализа: приблизительно 51°С и 179°С.

[0135]

Справочный пример 4

Получение кристалла типа II 7-((3R,5S)-1-акрилоил-5-метилпирролидин-3-ил)-4-амино-6-(циклопропилэтинил)-N-((R)-1-фенилэтил)-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-5-карбоксамида (соединение (I)) с хлористоводородной кислотой

2 M раствор хлористоводородной кислоты/этанол (15 мкл) и 0,3 мл жидкой смеси ацетон/гептан (1:3 об./об.) добавляли к 15 мг соединения (I), полученного способом примера синтеза 1, смесь суспендировали и перемешивали в течение 4 суток и естественным образом охлаждали, а затем твердое вещество собирали фильтрацией и извлекали. Его сушили с получением представляющего интерес кристалла.

[0136]

Спектр порошковой рентгеновской дифракции (способ B): см. фиг.21.

Характеристический угол дифракции (2Ɵ±0,2°): 6,3°, 7,4°, 8,0°, 17,6°, 22,0° и 23,6°.

Кривая одновременного термогравиметрического-дифференциального термического анализа: cм. фиг.22.

Эндотермический пик (величина вершины пика) на кривой одновременного термогравиметрического-дифференциального термического анализа: приблизительно 147°С.

[0137]

Справочный пример 5

Получение кристалла типа III 7-((3R,5S)-1-акрилоил-5-метилпирролидин-3-ил)-4-амино-6-(циклопропилэтинил)-N-((R)-1-фенилэтил)-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-5-карбоксамида (соединение (I)) с хлористоводородной кислотой

2 M раствор хлористоводородной кислоты/этанол (15 мкл) и 0,3 мл этилацетата добавляли к 15 мг соединения (I), полученного способом примера синтеза 1, смесь суспендировали и перемешивали в течение 4 суток и естественным образом охлаждали, а затем твердое вещество собирали фильтрацией и извлекали. Его сушили с получением представляющего интерес кристалла

[0138]

Спектр порошковой рентгеновской дифракции (способ B): см. фиг.23.

Характеристический угол дифракции (2Ɵ±0,2°): 5,3°, 6,5°, 8,1°, 15,3° и 24,2°

Кривая одновременного термогравиметрического-дифференциального термического анализа: см. фиг.24.

Эндотермический пик (величина вершины пика) на кривой одновременного термогравиметрического-дифференциального термического анализа: приблизительно 156°С.

[0139]

Справочный пример 6

Получение кристалла 7-((3R,5S)-1-акрилоил-5-метилпирролидин-3-ил)-4-амино-6-(циклопропилэтинил)-N-((R)-1-фенилэтил)-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-5-карбоксамида (соединение (I)) с бромистоводородной кислотой

Бромистоводородную кислоту (1 эквивалент) и 0,3 мл жидкой смеси 2-пропанол/гептан (1:3 об./об.) добавляли к 15 мг соединения (I), полученного способом примера синтеза 1, смесь суспендировали и перемешивали в течение 5 суток и естественным образом охлаждали, а затем твердое вещество собирали фильтрацией и извлекали. Его сушили с получением представляющего интерес кристалла.

[0140]

Спектр порошковой рентгеновской дифракции (способ B): см. фиг.25.

Характеристический угол дифракции (2Ɵ±0,2°): 7,0°, 7,4°, 13,4°, 15,6°, 19,2° и 25,6°.

Кривая одновременного термогравиметрического-дифференциального термического анализа: см. фиг.26.

Эндотермический пик (величина вершины пика) на кривой одновременного термогравиметрического-дифференциального термического анализа: приблизительно 204°С.

[0141]

Справочный пример 7

Получение кристалла типа IV 7-((3R,5S)-1-акрилоил-5-метилпирролидин-3-ил)-4-амино-6-(циклопропилэтинил)-N-((R)-1-фенилэтил)-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-5-карбоксамида (соединение (I)) с 1 эквивалентом L-виннокаменной кислоты

L-виннокаменную кислоту (466 мг) и 10 мл ацетона добавляли к 500 мг соединения (I), полученного способом примера синтеза 1, и смесь перемешивали при 50°C в течение 40 минут для растворения. После этого, растворенную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 17 часов, суспензию фильтровали и полученное твердое вещество извлекали. Его сушили с получением 506,3 мг представляющего интерес кристалла.

[0142]

Спектр порошковой рентгеновской дифракции (способ A): см. фиг.27.

Характеристический угол дифракции (2Ɵ±0,2°): 7,2°, 12,6°, 17,3° и 23,4°.

Кривая одновременного термогравиметрического-дифференциального термического анализа: см. фиг.28.

Эндотермический пик (величина вершины пика) на кривой одновременного термогравиметрического-дифференциального термического анализа: приблизительно 121°С.

[0143]

Справочный пример 8

Получение кристалла 7-((3R,5S)-1-акрилоил-5-метилпирролидин-3-ил)-4-амино-6-(циклопропилэтинил)-N-((R)-1-фенилэтил)-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-5-карбоксамида (соединение (I)) с янтарной кислотой

Янтарную кислоту (3 эквивалента) и 0,3 мл ацетонитрила добавляли к 15 мг соединения (I), полученного способом примера синтеза 1, смесь суспендировали и перемешивали при 50°C в течение 3 суток и естественным образом охлаждали, а затем твердое вещество собирали фильтрацией и извлекали. Его сушили с получением представляющего интерес кристалла.

[0144]

Спектр порошковой рентгеновской дифракции (способ B): см. фиг.29.

Характеристический угол дифракции (2Ɵ±0,2°): 6,5°, 10,7°, 13,2°, 14,6°, 18,7° и 23,9°.

Кривая одновременного термогравиметрического-дифференциального термического анализа: см. фиг.30.

Эндотермический пик (величина вершины пика) на кривой одновременного термогравиметрического-дифференциального термического анализа: приблизительно 148°С и 159°С.

[0145]

Пример тестирования 1

Измерение ингибиторного эффекта ( in vitro ) на активность фосфорилирования HER2

Для определения условий способа измерения активности соединения in vitro в отношении ингибирования фосфорилирования активности HER2, на основе сообщения, касающегося киназной реакции HER2, с использованием в качестве пептидного субстрата, имеющего ту же последовательность (5-FAM-EEPLYWSFPAKKK-CONH₂), что и ProfilerPro Peptide 22 от PerkinElmer (Xie H et al., PLoS One.2011; 6(7): e21487) в качестве субстрата использовали ProfilerPro Peptide 22. Очищенный рекомбинантный белок HER2 человека в настоящем тесте приобретали от Carna Biosciences, Inc. При определении активности ингибирования соединения сначала соединение (I), полученное способом примера синтеза 1, разбавляли постепенно диметилсульфоксидом (DMSO). Затем белок HER2, пептидный субстрат (конечная концентрация: 1 мкМ), хлорид марганца (конечная концентрация: 10 мМ), ATP (конечная концентрация: 5 мкМ) и соединение (I) в растворе DMSO (конечная концентрация DMSO: 5%) добавляли к буферу для киназной реакции (13,5 мМ Tris (pH 7,5), 2 мМ дитиотреитол и 0,009% Tween 20), а затем полученную смесь инкубировали при 25°C в течение 30 минут, так чтобы протекала киназная реакция. К реакционному раствору добавляли EDTA до конечной концентрации 30 мМ для завершения реакции. Наконец, с использованием LabChip (зарегистрированный торговый знак) EZ Reader II (PerkinElmer), нефосфорилированный пептидный субстрат (S) и фосфорилированный пептид (P) разделяли и проводили детекцию посредством микроканального капиллярного электрофореза. Из высот пиков S и P, определяли величину фосфорилирования, и концентрацию соединения, способную ингибировать реакцию фосфорилирования на 50%, определяли в качестве величины IC50 (нМ). Результаты представлены в таблице 1.

[0146]

Пример тестирования 2

Определение ингибиторного действия ( in vitro ) против активности фосфорилирования инсерционного мутанта экзона 20 HER2 (HER2ex20insYVMA)

Для определения условий для способа определения активности соединения in vitro в отношении ингибирования активности фосфорилирования HER2 с инсерционной мутацией в экзоне 20, как и в случае HER2, в качестве субстрата использовали ProfilerPro Peptide 22. Очищенный рекомбинантный белок HER2 человека с инсерционной мутацией в экзоне 20 (A775_G776insYVMA) приобретали от SignalChem. При определении активности ингибирования соединения сначала соединение (I), полученное способом примера синтеза 1, разбавляли постепенно диметилсульфоксидом (DMSO). Затем добавляли белок HER2 с инсерционной мутацией в экзоне 20 и соединение (I) в растворе DMSO (конечная концентрация of DMSO: 5%) в буфер для киназной реакции (13,5 мМ Tris (pH 7,5), 2 мМ дитиотреитол и 0,009% Tween 20), а затем полученную смесь преинкубировали при 25°C в течение 30 минут. После этого в реакционную смесь добавляли пептидный субстрат (конечная концентрация: 1 мкМ), хлорид марганца (конечная концентрация: 25 мМ), хлорид магния (конечная концентрация: 20 мМ) и ATP (конечная концентрация: 200 мкМ), а затем полученную таким образом смесь инкубировали при 25°C в течение 220 минут, так чтобы протекала киназная реакция. К этому реакционному раствору добавляли EDTA до конечной концентрации 30 мМ для завершения реакции. Наконец, с использованием LabChip (зарегистрированный торговый знак) EZ Reader II (PerkinElmer), нефосфорилированный пептидный субстрат (S) и фосфорилированный пептид (P) разделяли и проводили детекцию посредством микроканального капиллярного электрофореза. Из высот пиков S и P, определяли величину фосфорилирования, и концентрацию соединения, способную ингибировать реакцию фосфорилирования на 50%, определяли в качестве величины IC50 (нМ). Результаты представлены в таблице 7.

[0147]

[Таблица 7]

Активность ингибирования HER2, Величина IC50 (нМ)	Активность ингибирования HER2ex20insYVMA, Величина IC50 (нМ)
3,2	< 0,30

[0148]

Из приведенных выше результатов было обнаружено, что соединение (I) обладает превосходной активность ингибирования фосфорилирования HER2 и фосфорилирования HER2 с инсерционной мутацией в экзоне 20.

[0149]

Пример тестирования 3

Определение активности ингибирования роста экспрессирующей HER2 клеточной линии

Клетки SK-BR-3 в качестве сверхэкспрессирующей HER2 клеточной линии рака молочной железы человека суспендировали в среде МакКоя 5a (произведенной Life Technologies), дополненной 10% эмбриональной телячьей сывороткой. Клеточную суспензию высевали в каждую лунку 384-луночного микропланшета с плоским дном, а затем культивировали в содержащей 5% газообразный диоксид углерода емкости при 37°C в течение 1 суток. После этого соединение (I), полученное способом примера синтеза 1, растворяли в DMSO, и соединение разбавляли до 500-кратной конечной концентрации в DMSO. Соединение в растворе DMSO разбавляли раствором DMSO или средой, использованной в суспензии клеток, а затем полученный раствор добавляли в каждую лунку планшета для культивирования так, чтобы конечная концентрация DMSO составила 0,2%. Полученную смесь далее культивировали в содержащей 5% газообразный диоксид углерода емкости для культивирования при 37°C в течение 3 суток. После завершения культивирования в течение 3 суток в присутствии соединения клетки подсчитывали с использованием CellTiter-Glo 2.0 (произведенный Promega), а затем вычисляли процент ингибирования роста по приведенному ниже уравнению. Концентрацию соединения, при которой происходило ингибирование роста клеток на 50%, определяли как IC₅₀ (нМ).

Процент ингибирования роста (%)=(C-T)/(C)×100

T: Интенсивность эмиссии в лунке, в которую добавляли тестируемое соединение

C: Интенсивность эмиссии в лунке, в которую тестируемое соединение не добавляли

Результаты приведены в приведенной ниже таблице 8.

[0150]

Пример тестирования 4

Определение активности ингибирования роста клеточной линии, экспрессирующей HER2 с инсерционной мутацией в экзоне 20

Активность ингибирования роста в отношении HER2 с инсерционной мутацией в экзоне 20 определяли с использованием Ba/F3-клеток, которые представляли собой линию клеток-предшественников B-лимфоцитов мыши, в которую включен HER2 человека с инсерционной мутацией экзона 20. Клетки Ba/F3 поддерживали в среде RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific), дополненной 10% эмбриональной телячьей сывороткой (FBS), 100 Е/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина (Thermo Fisher Scientific) и 1 нг/мл интерлейкина-3 мыши (mIL-3) (CST). После этого в клетки Ba/F3 вводили вектор pCDNA3.1-hyg(+), в который был включен ген HER2 человека с инсерционной мутацией в экзоне 20 (A775_G776insYVMA (HER2ex20insYVMA)), внутренняя последовательность связывания рибосомы (IRES) и ген Kusabira orange, способом электропорации с использованием набора Cell Line Nucleofector (зарегистрированный торговый знак) Kit V от Amaxa (зарегистрированный торговый знак). Клетки Ba/F3, которые экспрессировали HER2 с инсерционной мутацией в экзоне 20 (Ba/F3-HER2insYVMA), которые были подвергнуты селекции с гигромицином B (Nacalai Tesque), демонстрировали независимый от mIL-3 рост.

Для оценки активности ингибирования роста клеток клетки Ba/F3-HER2insYVMA суспендировали в среде RPMI-1640, дополненной 10% FBS, 100 Е/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Суспензию клеток высевали в каждую лунку 96-луночного микропланшета с плоским дном, а затем культивировали в содержавшей 5% газообразный диоксид углерода емкости при 37°C в течение 1 суток. Соединение (I), полученное способом примера синтеза 1, растворяли в DMSO, а затем разбавляли DMSO или средой, использованной для суспендирования клеток. Затем полученный раствор добавляли в каждую лунку планшета для культивирования так, чтобы конечная концентрация DMSO составила 0,2%. Полученную смесь далее культивировали в содержащей 5% газообразный диоксид углерода емкости для культивирования при 37°C в течение 3 суток. После завершения культивирования в течение 3 суток в присутствии соединения клетки подсчитывали с использованием CellTiter-Glo 2.0 (произведенный Promega), а затем вычисляли процент ингибирования роста по приведенному ниже уравнению. Концентрацию соединения, при которой происходило ингибирование роста клеток на 50%, определяли как IC50 (нМ).

Процент ингибирования роста (%)=(C-T)/(C)×100

[0151]

[Таблица 8]

Активность ингибирования роста клеток SK-BR-3 Величина IC50 (нМ)	Активность ингибирования роста клеток HER2ex20insYVMA Величина IC50 (нМ)
6,6	29

[0152]

Из приведенных выше результатов было выявлено, что соединение (I) обладает превосходной активностью ингибирования роста клеток в равной степени в отношении экспрессирующей HER2 клеточной линии (SK-BR-3) и в отношении клеточной линии, экспрессирующей HER2 с инсерционной мутацией в экзоне 20 (Ba/F3-HER2insYVMA).

[0153]

Пример тестирования 5

Определение активности ингибирования роста экспрессирующей HER2 клеточной линии (NCI-N87)

Клетки NCI-N87 в качестве сверхэкспрессирующей HER2 клеточной линии рака желудка человека (American Type Culture Collection, каталожный номер № ATCC (зарегистрированный торговый знак) CRL-5822) суспендировали в среде RPMI1640 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), дополненной 10% эмбриональной телячьей сывороткой. Затем клеточную суспензию высевали в каждую лунку 96-луночного микропланшета с плоским дном, а затем культивировали в содержавшей 5% газообразный диоксид углерода емкости при 37°C в течение 1 суток. После этого соединение (I), полученное способом примера синтеза 1, растворяли в DMSO, и соединение разбавляли до 1000-кратной конечной концентрации в DMSO. Соединение (I) в растворе DMSO разбавляли средой, использованной для суспендирования клеток, а затем полученный раствор добавляли в каждую лунку культурального планшета, так чтобы конечная концентрация DMSO составила 0,1%. Что касается контрольной лунки, DMSO разбавляли средой, использованной в суспензии клеток, а затем полученный раствор добавляли в каждую лунку планшета для культивирования, так чтобы конечная концентрация DMSO составила 0,1%. После добавления раствора лекарственного средства полученную смесь культивировали в содержавшей 5% газообразный диоксид углерода емкости при 37°C в течение 3 суток. После завершения культивирования в течение 3 суток в присутствии соединения клетки подсчитывали с использованием CellTiter-Glo 2.0 (произведенный Promega), а затем вычисляли процент ингибирования роста по приведенному ниже уравнению. Концентрацию соединения, при которой происходило ингибирование роста клеток на 50%, определяли как IC₅₀ (нМ).

Процент ингибирования роста (%)=(C-T)/(C)×100

Результаты приведены в приведенной ниже таблице 9.

[0154]

[Таблица 9]

Активность ингибирования роста клеток NCI-N87
Величина IC50 (нМ)

9,9

[0155]

Из приведенных выше результатов было обнаружено, что соединение (I) обладает превосходной активностью ингибирования роста клеток в отношении клеточной линии, сверхэкспрессирующей HER2 (NCI-N87).

[0156]

Пример тестирования 6

Оценка всасываемости в полости рта

Соединение (I), полученное способом примера синтеза 1, суспендировали или растворяли в 0,5% водном растворе HPMC и 0,1 Н хлористоводородной кислоте, и полученную суспензию или раствор вводили перорально мышам BALB/cA (CLEA Japan, Inc.) в дозе 50 мг/кг/сутки. Через 0,5, 1, 2, 4 и 6 часов после завершения перорального введения проводили взятие крови из лицевой вены постепенно для получения плазмы. Концентрацию соединения в полученной плазме определяли посредством LC-MS/MS, и оценивали всасываемость соединения по настоящему изобретению в полости рта.

Результаты приведены в приведенной ниже таблице 10.

[0157]

[Таблица 10]

AUC 0-6 ч (мкМ ∙ч)

31

[0158]

Из приведенных выше результатов было обнаружено, что соединение по настоящему изобретению содержалось в достаточной концентрации в плазме, так что соединение (I) демонстрировало хорошую всасываемость в полости рта.

[0159]

Пример тестирования 7

Оценка свойств проникновения в головной мозг

Соединение (I), полученное способом примера синтеза 1, суспендировали или растворяли в 0,5% водном растворе HPMC и 0,1 Н хлористоводородной кислоте, и полученную суспензию или раствор перорально вводили мышам BALB/cA (CLEA Japan, Inc.) в дозе 50 мг/кг/сутки. Через 0,5 часа после завершения перорального введения проводили взятие крови из лицевой вены, а затем весь головной мозг извлекали, получая образцы плазмы и головного мозга. К полученному образцу головного мозга добавляли воду в количестве, в 3 раза превышающем объем образца головного мозга, а затем полученный материал гомогенизировали с использованием ультразвукового гомогенизатора, получая гомогенат головного мозга. Концентрацию соединения в полученном гомогенате плазмы и головного мозга определяли посредством LC-MS/MS, и свойство соединения по настоящему изобретению проникать в головной мозг оценивали из концентрации соединения в головном мозге/плазме.

Результаты приведены в приведенной ниже таблице 11.

[0160]

[Таблица 11]

Концентрация соединения в плазме (мкМ)	Концентрация соединения в головном мозге (мкМ)	Величина Kp (Концентрация соединения в головном мозге/плазме)
12	2,7	0,23

[0161]

Из приведенных выше результатов было выявлено, что соединение (I) демонстрировало благоприятные свойства проникновения в головной мозг.

[0162]

Пример тестирования 8

Тест для подтверждения противоопухолевого эффекта ( in vivo ) на моделях с прямой трансплантацией в головной мозг, в которых прямо трансплантировали экспрессирующую HER2 клеточную линию с введенным геном люциферазы (NCI-N87-luc)

Для подтверждения противоопухолевых эффектов тестируемого соединения на модели с прямой трансплантацией в головной мозг использовали NCI-N87-Luc, которые были получены путем введения гена люциферазы в NCI-N87, которая представляла собой опухолевую клеточную линию рака желудка человека, приобретенную от American Type Culture Collection. NCI-N87-Luc добавляли в содержавшую 10% эмбриональную телячью сыворотку (FBS) среду RPMI-1640 (дополненная 4,5 г/л глюкозы, 10 мМ HEPES и 1 мМ пируватом натрия) (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), а затем эту клеточную линию культивировали в инкубаторе с 5% CO2 при 37°C.

Клетки NCI-N87-Luc ресуспендировали в PBS в концентрации 6,25×10⁷ клеток/мл.

С использованием ушного фиксатора для мышей, мышей nude в возрасте 6-7 недель (BALB/cAJcl-nu/nu, CLEA Japan, Inc.) фиксировали в стереотаксическом устройстве для головного мозга, и кожу над верхней частью головного мозга дезинфицировали смоченной спиртом ватой, а затем разрезали хирургическим ножом.

Микросверло использовали для высверливания отверстия в черепе, а затем с использованием иглы, манипулятора и шприцевого насоса 4 мкл суспензии клеток трансплантировали в головной мозг со скоростью 0,8 мкл/мин.

В качестве эталона для величины опухоли головного мозга, приблизительно через 3 недели после трансплантации определяли суммарный поток (фотон/с) во всех случаях выживших животных с использованием IVIS (PerkinElmer, Inc., модель: Lumina II). НА основе полученных результатов по 6 животных распределяли в каждую группу с использованием программы распределения на группы MiSTAT (Ver. 2.00).

Тестируемое соединение вводили перорально мышам один раз в сутки в течение 21 сутки, начиная на следующий день после распределения на группы (сутки 1-21).

Для установления наличия или отсутствия эффектов использовали величину (Log10), полученную посредством логарифмического преобразования суммарного потока на дату установления. Соединение (I), полученное способом примера синтеза 1, в качестве тестируемого соединения вводили мышам в дозе 25 мг/кг/сутки.

Строили график с величиной, полученной посредством логарифмического преобразования (Log10) среднего суммарного потока по вертикальный оси, и с количеством суток (Сутки) после трансплантации по горизонтальной оси. Наблюдали перемещение суммарного потока с течением времени в период введения лекарственного средства.

В качестве контроля использовали 0,1 Н HCl и 0,5% водный раствор HPMC.

[0163]

Результаты представлены на приведенной ниже фиг.31 и фиг.32. Величину, полученную посредством логарифмического преобразования (Log10) суммарного потока на 22 сутки в каждой группе, анализировали посредством теста значимости. В результате, было продемонстрировано, что вышеуказанная величина для соединения была на статистически значимом уровне более низкой, чем величина в контрольной группе (уровень значимости (обе стороны): 5%). Для измерения массы тела использовали электронные весы для животных. Процент изменения массы тела (изменение массы тела; BWCn) относительно массы тела на n-е сутки (BWn), вычисляли по следующему уравнению:

BWCn (%)=[(масса тела на n-е сутки) - (масса тела на сутки распределения на группы)] / [(масса тела на сутки распределения на группы)] × 100.

Из результатов этого теста было обнаружено, что соединение (I) обладает превосходными противоопухолевыми эффектами против клеточной линии, сверхэкспрессирующей HER2 (NCI-N87-luc), трансплантированной мышам nude. Более того, ни у одной из мышей, которым проводилось введение, не наблюдалось снижение массы тела, составляющее -20% или более. Таким образом, было обнаружено, что отсутствуют серьезные побочные эффекты.

[0164]

Пример тестирования 9

Тест стабильности твердого вещества

Кристаллы свободной формы типа II соединения (I) и его кристаллы типа II с 1 эквивалентом фумаровой кислоты, полученные согласно примерам и сравнительным примерам, оценивали в отношении стабильности твердого вещества после хранения в течение 4 недель.

Условия хранения: 60°C (закрытая система)

Период хранения: 4 недели

Хранившееся количество: приблизительно 30 мг

Контейнер для хранения: стеклянная бутылка

Результаты приведены в приведенной ниже таблице 12.

[Таблица 12]

	Кристалл свободной формы типа II	Кристалл типа II с 1 эквивалентом фумаровой кислоты
Химическая чистота до хранения (%)	99,87	99,85
Химическая чистота после хранения (%)	99,88	99,85
Количество родственных веществ до хранения (%)	0,13	0,15
Количество родственных веществ после хранения (%)	0,12	0,15

Приблизительно 1 мг образца отвешивали, растворяли приблизительно в 1 мл жидкой смеси вода/ацетонитрил (1:1) и точно отмеряли 5 мкл этого раствора. Изменения количества родственных веществ (количество выявленных веществ, отличных от соединения (I)) анализировали с использованием ВЭЖХ посредством следующего способа.

Способ анализа посредством ВЭЖХ (испытание стабильности)

Количество родственных веществ в растворе образца измеряли посредством анализа ВЭЖХ. Использование устройств, включая обработку данных, соответствовало способам и методикам, указанным в инструкциях для каждого устройства.

Колонка: XSelect CSH C18 (4,6× 150 мм, 3,5 мкм), произведенная Waters

УФ-детекция: 246 нм

Температура колонки: 40°C

Скорость потока: 1,0 мл/мин

Устройство для охлаждения образца: 5°C

Концентрация образца: 1 мг/мл

Подвижная фаза A: жидкая смесь 5 ммоль/л буфера на основе формиата аммония (pH 6,5)/ацетонитрила (9:1)

Подвижная фаза B: ацетонитрил

Градиенты представлены в таблице 13.

[Таблица 13]

Время (мин)	Подвижная фаза A (об.%)	Подвижная фаза B (об.%)
0-31	90→30	10→70
31-36	30	70
36-37	30→90	70→10

В результате, не наблюдали изменения паттерна порошковой рентгеновской дифракции ни в случае кристалла свободной формы типа II соединения (I), ни случае кристалл типа II указанного соединения с 1 эквивалентом фумаровой кислоты, и практически не наблюдали повышения уровня родственных веществ. Было выявлено, что они являются чрезвычайно стабильными кристаллами.

[0165]

Пример тестирования 10

Тест динамической сорбции паров (DVS)

Тесты динамической сорбции паров проводили с использованием кристалла типа II соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты, кристалла свободной формы типа II указанного соединения, кристалла свободной формы типа I указанного соединения, кристалла типа V указанного соединения с 1 эквивалентом фумаровой кислоты и кристалла указанного соединения с 1 эквивалентом L-виннокаменной кислоты, полученного согласно примерам и справочным примерам.

Тест динамической сорбции паров проводили для измерения в следующих условиях.

Приблизительно 10 мг каждого образца помещали в специализированную кварцевую кассету и массу образца при каждой влажности непрерывно измеряли и регистрировали в следующих условиях. Использование устройств, включая обработку данных, соответствовало способам и методикам, указанным в инструкциях для каждого устройства.

Устройство: VTI SA+ (произведенное TA Instruments)

Температура сушки: 60°C

Скорость повышения температуры: 1°C/мин

Равновесие сушки: было подтверждено, что снижение на 0,01 масс.% за 5 минут не происходило в пределах диапазона, не превышающего 300 минут.

Измерение температуры: 25°C

Равновесие увлажнения: было подтверждено, что увеличение на 0,01 масс.% за 5 минут не происходило в пределах диапазона, не превышающего 120 минут.

Программа относительной влажности: увеличение на 5% RH от 5% RH до 95% RH и снижение на 5% RH от 95% RH до 5% RH

Изменение массы в диапазоне условий измерения, полученные в этих тестах, представлены в таблицах 14-18.

[Таблица 14]

Таблица 14: результаты теста динамической сорбции паров для кристалла типа II соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты

	Скорость изменения массы (%)
Относительная влажность (%)	Адсорбция	Десорбция
5	0,01	0,04
20	0,11	0,13
40	0,18	0,20
60	0,27	0,30
80	0,34	0,34
95	0,38	0,38

[Таблица 15]

Таблица 15: Результаты теста динамической сорбции паров для кристалла свободной формы типа II соединения (I)

	Скорость изменения массы (%)
Относительная влажность (%)	Адсорбция	Десорбция
5	0,01	0,01
20	0,02	0,03
40	0,05	0,06
60	0,08	0,08
80	0,10	0,11
95	0,12	0,12

[Таблица 16]

Таблица 16: результаты теста динамической сорбции паров для кристалла свободной формы типа I соединения (I)

	Скорость изменения массы (%)
Относительная влажность (%)	Адсорбция	Десорбция
5	0,01	0,01
20	0,04	0,04
40	0,10	0,13
60	0,26	0,60
80	0,50	0,69
95	0,72	0,72

[Таблица 17]

Таблица 17: Результаты теста динамической сорбции пара для кристалла типа V соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты

	Скорость изменения массы (%)
Относительная влажность (%)	Адсорбция	Десорбция
5	0,01	0,06
20	0,11	0,16
40	0,21	0,27
60	0,33	0,39
80	0,47	0,51
95	0,59	0,59

[Таблица 18]

Таблица 18: Результаты теста динамической сорбции паров для кристалла соединения (I) с 1 эквивалентом L-виннокаменной кислоты

	Скорость изменения массы (%)
Относительная влажность (%)	Адсорбция	Десорбция
5	0,50	0,54
20	1,05	1,16
40	1,60	1,67
60	2,16	2,38
80	3,26	3,64
95	6,41	6,41

[0166]

Как показано в таблице 14, кристалл типа II соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты имел увеличение массы 0,38% в тесте динамической сорбции паров при относительной влажности 95%, что составляло менее 1%. Было определено, что кристалл является практически негигроскопичным. Аналогично, кристалл свободной формы типа II соединения (I), кристалл свободной формы типа I указанного соединения и кристалл типа V указанного соединения с 1 эквивалентом фумаровой кислоты также имели увеличение массы менее 1% в тесте динамической сорбции паров при относительной влажности 95%, что составило менее 1%. Было определено, что кристаллы были практически негигроскопичными (таблицы 15-17). Между тем, как показано в таблице 18, кристалл соединения (I) с 1 эквивалентом L-виннокаменной кислоты имел увеличение массы целых 6,41% в тесте динамической сорбции паров при относительной влажности 95%, что составило менее 1%. Было определено, что кристалл является в высокой степени гигроскопичным.

Таким образом, поскольку кристалл типа II соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты, кристалл свободной формы типа II указанного соединения, кристалл свободной формы типа I указанного соединения и кристалл типа V с 1 эквивалентом фумаровой кислоты являются менее гигроскопичными, чем кристалл соединения (I) с 1 эквивалентом L-виннокаменной кислоты, их можно считать превосходными соединениями-кандидатами для разработки лекарственного средства с точки зрения промышленного производства фармацевтических продуктов со стабильным качеством. Было подтверждено, что кристалл типа II соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты, кристалл свободной формы типа II указанного соединения, кристалл свободной формы типа I указанного соединения и кристалл типа V указанного соединения с 1 эквивалентом фумаровой кислоты обладают превосходными свойствами в качестве фармацевтических продуктов или активных фармацевтических ингредиентов.

[0167]

Пример тестирования 11

Тест для определения концентрации в крови

Тесты для определения концентрации в крови проводили для кристалла типа I соединения (I), кристалла типа II соединения (I) и кристалла типа II соединения (I) с 1 эквивалентом фумарата, полученных согласно примерам. В частности, 0,5% HPMC, содержавшую 0,1 Н хлористоводородную кислоту, использовали для кристалла типа I соединения (I) и 0,5% HPMC использовали для кристалла типа II соединения (I) и кристалла типа II соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты для конвертирования каждого кристалла в соединение (I) (свободная форма) в единицах молекулярной массы, чтобы получить суспензии 100 мг/10 мл и 300 мг/10 мл. Эти растворы для введения перорально вводили самкам крыс (Crl:CD(SD), Charles River Laboratories Japan, Inc.), которых держали в условиях с доступом к корму в объеме 10 мл/кг массы тела с использованием зонда для перорального введения. После введения крыс возвращали в клетку для крыс, и проверяли их состояние. Вода и корм были свободно доступны в клетке. Через 0,5, 1, 2, 4 и 6 часов после введения крыс подвергали анестезии изофлураном, и собирали приблизительно 80 мкл крови из яремной вены с использованием покрытого гепарином шприца и иглы для инъекций (25 G).

Полученную кровь охлаждали на льду и отделяли плазму посредством центрифугирования. После завершения взятия крови крыс возвращали в клетку для крыс и проверяли состояние после пробуждения от анестезии. После последнего взятия крови проверяли глубину анестезии изофлураном. Затем конечности фиксировали в положении лежа на спине с использованием небольшого экспериментального устройства для удержания животных, и живот вскрывали так, чтобы добиться умерщвления крысы путем обескровливания через разрез в брюшной аорте и полой вене.

AUC0-6ч (площадь под кривой концентрация в крови-время в течение 0-6 часов после введения, вычисленная методом трапеций), Cmax (максимальная концентрация в крови) и Tmax (время до достижения максимальной концентрации в крови) вычисляли из концентрации соединения (I) в каждом образце плазмы, измеренной способом MRM с использованием LC/MS/MS и количественно определенной из калибровочной кривой с использованием Phoenix WinNonlin (v6.4.0.Certara USA, Inc.).

[0168]

Результаты представлены в таблице 19. Когда доза возрастала от 100 мг/кг до 300 мг/кг, для кристалла типа I соединения (I) с хлористоводородной кислотой и кристалла типа II соединения (I) Cmax возрастала в 0,8 раза и 1,2 раза, соответственно, и AUC 0-6ч возрастала в 1,0 раза и 1,5 раза, соответственно. Между тем, для кристалла типа II соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты, каждая из C_max и AUC0-6ч возрастала в 1,9 раза. Кроме того, в дозе 300 мг/кг C_max кристалла типа II соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты была в 1,7 раза выше величины для кристалла типа I соединения (I) с кислотой и в 1,4 раза выше величины для кристалла типа II соединения (I), и AUC_0-6ч кристалла типа II соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты была в 2,4 раза выше величин для кристалла типа I соединения (I) с кислотой и кристалла типа II соединения (I). Таким образом, было подтверждено, что кристалл типа II соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты в соответствии с настоящим изобретением демонстрирует более благоприятную всасываемость в полости рта.

[Таблица 19]

Доза	Параметр	Пероральное введение
Доза	Параметр	Кристалл типа I соединения (I) (с хлористоводородной кислотой)	Кристалл типа II соединения (I)	Кристалл типа II соединения (I) с 1 эквивалентом фумаровой кислоты
100 мг/кг	AUC_0-6ч (мкм⋅ч)	7,42	5,79	6,14
	C_max (мкм)	2,67	1,88	2,74
	T_max (ч)	0,75	1,50	1,25
300 мг/кг	AUC_0-6hr (мкм⋅ч)	7,11	8,53	11,9
	C_max (мкм)	2,25	2,25	5,34
	T_max (ч)	3,25	3,33	0,5

[0169]

Следует отметить, что все документы и публикации, цитированные в настоящем описании, включены в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме, независимо от их назначения. Более того, настоящее описание включает содержание, раскрытое в формуле изобретения, описании и чертежах патентной заявки Японии № 2020-121520 (поданной 15 июля 2020 года), по которой настоящей заявке испрашивается приоритет.

Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения описаны выше. Однако эти варианты осуществления предоставлены только для иллюстративных целей и, таким образом, не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения. Эти новые варианты осуществления можно осуществлять в различных формах, и можно вносить различные сокращения, замены и изменения, если они не отклоняются от сущности изобретения. Эти варианты осуществления и их модификации включены в объем или сущность изобретения, и они также включены в изобретение в соответствии с пунктами формулы изобретения и в эквивалентном им объеме.

Claims

1. Кристалл, имеющий пики при углах дифракции (2θ±0,2°), выбранных из 5,5°, 6,8°, 9,3°, 13,4°, 15,3°, 16,3°, 18,5°, 19,8°, 22,0° и 24,5° на спектре порошковой рентгеновской дифракции, который представляет собой кристалл типа II 7-((3R,5S)-1-акрилоил-5-метилпирролидин-3-ил)-4-амино-6-(циклопропилэтинил)-N-((R)-1-фенилэтил)-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-5-карбоксамида с фумаровой кислотой, где молярное соотношение 7-((3R,5S)-1-акрилоил-5-метилпирролидин-3-ил)-4-амино-6-(циклопропилэтинил)-N-((R)-1-фенилэтил)-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин-5-карбоксамида и фумаровой кислоты составляет 1:1.

2. Кристалл по п.1, который представляет собой кристалл, имеющий спектр порошковой рентгеновской дифракции, показанный на фиг.1.

3. Кристалл по п.1 или 2, который имеет эндотермический пик, определенный посредством одновременного термогравиметрического-дифференциального термического анализа, на уровне приблизительно 178°C±5,0°С.

4. Фармацевтическая композиция, обладающая HER2 ингибирующей активностью, содержащая эффективное количество кристалла по любому из пп.1-3.

5. Фармацевтическая композиция для перорального приема, обладающая HER2 ингибирующей активностью, содержащая эффективное количество кристалла по любому из пп.1-3.

6. Противоопухолевое средство для лечения опухоли, ассоциированной с HER2, содержащее кристалл по любому из пп.1-3.