RU2828270C1 - METHOD FOR GENOTYPING POLYMORPHIC LOCUS rs17155992 (G>A) OF HSPA14 GENE IN HUMAN BY REAL-TIME PCR USING ALLELE-SPECIFIC FLUORESCENT PROBES - Google Patents
METHOD FOR GENOTYPING POLYMORPHIC LOCUS rs17155992 (G>A) OF HSPA14 GENE IN HUMAN BY REAL-TIME PCR USING ALLELE-SPECIFIC FLUORESCENT PROBES Download PDFInfo
- Publication number
- RU2828270C1 RU2828270C1 RU2024115986A RU2024115986A RU2828270C1 RU 2828270 C1 RU2828270 C1 RU 2828270C1 RU 2024115986 A RU2024115986 A RU 2024115986A RU 2024115986 A RU2024115986 A RU 2024115986A RU 2828270 C1 RU2828270 C1 RU 2828270C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- hspa14
- gene
- allele
- insdseq
- insdqualifier
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 29
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 title claims description 9
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 title abstract description 5
- 101001041756 Homo sapiens Heat shock 70 kDa protein 14 Proteins 0.000 title description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 29
- 101150084066 HSPA14 gene Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims description 17
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 abstract description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 21
- 102100021410 Heat shock 70 kDa protein 14 Human genes 0.000 description 6
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000007614 genetic variation Effects 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 238000000816 matrix-assisted laser desorption--ionisation Methods 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 108020005087 unfolded proteins Proteins 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 4-[4-[[2,5-dimethoxy-4-[(4-nitrophenyl)diazenyl]phenyl]diazenyl]-n-methylanilino]butanoic acid Chemical compound COC=1C=C(N=NC=2C=CC(=CC=2)N(C)CCCC(O)=O)C(OC)=CC=1N=NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 102100035345 Cerebral dopamine neurotrophic factor Human genes 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 208000023281 Fallot tetralogy Diseases 0.000 description 1
- 101000737775 Homo sapiens Cerebral dopamine neurotrophic factor Proteins 0.000 description 1
- 101000696699 Homo sapiens Histone-lysine N-methyltransferase SUV39H2 Proteins 0.000 description 1
- 101000720958 Homo sapiens Protein artemis Proteins 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 102100025918 Protein artemis Human genes 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 201000003005 Tetralogy of Fallot Diseases 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000011314 chaperone cofactor-dependent protein refolding Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000030788 protein refolding Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
Abstract
Description
Область техники, к которой относится изобретение. Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярно-генетической диагностики, в частности к оценке однонуклеотидного полиморфизма rs17155992 (G>A) гена HSPA14 молекулярно-генетическим методом исследования.Field of technology to which the invention relates. The invention relates to the field of biotechnology, molecular genetic diagnostics, in particular to the assessment of the single nucleotide polymorphism rs17155992 (G>A) of the HSPA14 gene by a molecular genetic research method.
Уровень техники.State of the art.
Предполагается, что ген HSPA14 активирует несколько функций, включая активность связывания АТФ; активность связывания неправильно свернутых белков; и развернутая белок-связывающая активность. Предполагается, что он участвует в нескольких процессах, включая клеточный ответ на развернутый белок; рефолдинг белка, зависимый от кофактора шаперона; и рефолдинг белка. Расположен в цитозоле. Колокализуется с рибосомой. Заболевания, связанные с HSPA14, включают атеросклероз и тетраду Фалло [https://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=HSPA14&keywords=HSPA14]. The HSPA14 gene is predicted to activate multiple functions, including ATP binding activity; misfolded protein binding activity; and unfolded protein binding activity. It is predicted to be involved in multiple processes, including the cellular response to unfolded protein; chaperone cofactor-dependent protein refolding; and protein refolding. It is located in the cytosol. It colocalizes with the ribosome. Diseases associated with HSPA14 include atherosclerosis and tetralogy of Fallot [https://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=HSPA14&keywords=HSPA14].
Ген HSPA14 (Gene ID: 51182) локализован на хромосоме The HSPA14 gene (Gene ID: 51182) is located on chromosome
10p13. Согласно SNPinfo Web Server/ LD TAG SNP Selection [https://snpinfo.niehs.nih.gov/snpinfo/snptag.html] полиморфный вариант rs17155992 HSPA14 является таргетным (то есть репрезентативным однонуклеотидным полиморфизмом в геномной области с высокой степенью неравновесия по сцеплению с группами других полиморфных локусов, составляющих гаплотип). SNP rs17155992 позиция chr10:14849407 (GRCh38.p14) [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/rs17155992] локализован в интроне характеризуется заменой G>A. SNP rs17155992 отличается высокой функциональной значимостью. Согласно биоинформатическому ресурсу GTEx Portal, данный генетический вариант влияет на экспрессию генов CDNF, DCLRE1C, SUV39H2 в различных органах и тканях посредством eQTL-эффектов [https://gtexportal.org/home/snp/rs17155992]. Кроме того, обнаружено его влияние на связывание с транскрипционными факторами [http://atsnp.biostat.wisc.edu/search]. Это создает потребность в создании простого в исполнении, недорого и доступного исследователям, работающим в области генетической эпидемиологии, метода идентификации однонуклеотидного полиморфизма rs17155992 (G>A) гена HSPA14. 10p13. According to SNPinfo Web Server/ LD TAG SNP Selection [https://snpinfo.niehs.nih.gov/snpinfo/snptag.html] the polymorphic variant rs17155992 HSPA14 is a target (i.e. a representative single nucleotide polymorphism in a genomic region with a high degree of linkage disequilibrium with groups of other polymorphic loci that make up the haplotype). SNP rs17155992 position chr10:14849407 (GRCh38.p14) [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/rs17155992] is localized in the intron and is characterized by the G>A substitution. SNP rs17155992 is characterized by high functional significance. According to the bioinformatics resource GTEx Portal, this genetic variant affects the expression of the CDNF, DCLRE1C, SUV39H2 genes in various organs and tissues through eQTL effects [https://gtexportal.org/home/snp/rs17155992]. In addition, its effect on binding to transcription factors was found [http://atsnp.biostat.wisc.edu/search]. This creates a need for a simple to implement, inexpensive and accessible to researchers working in the field of genetic epidemiology, a method for identifying the single nucleotide polymorphism rs17155992 (G>A) of the HSPA14 gene.
Известен способ анализа генетических вариаций в геноме человека методом секвенирования амплифицированных участков ДНК [Mardis E. R. DNA sequencing technologies: 2006-2016 //Nature protocols. - 2017. - Vol. 12. - №. 2. - P. 213-218]. Недостатками метода являются высокая стоимость оборудования и реагентов, что исключает широкое внедрение метода в экспериментальные исследования, особенно изучение многофакторных заболеваний, которые требуют большого размера выборок для обеспечения высокой мощности исследований. A method for analyzing genetic variations in the human genome by sequencing amplified DNA regions is known [Mardis E. R. DNA sequencing technologies: 2006-2016 //Nature protocols. - 2017. - Vol. 12. - No. 2. - P. 213-218]. The disadvantages of the method are the high cost of equipment and reagents, which excludes the widespread implementation of the method in experimental studies, especially the study of multifactorial diseases that require large sample sizes to ensure high research power.
Известен способ анализа генетических вариаций в геноме человека методом матричноактивированной лазерной десорбционно-ионизационной масс-спектрометрии (MALDI). Метод заключается в том, анализируемая ДНК переносится на подложку, где она кристаллизуется с матрицей. Затем кристаллизованные аналиты переносят, облучают лазером, вызывая десорбцию и ионизацию молекул в вакуумной камере. Положительно заряженные ионы ДНК ускоряются и мигрируют через вакуумную трубку к высокочувствительному детектору с разной скоростью в зависимости от массы ионов, что приводит к различному времени пролета. Используя время пролета отдельных ионизированных ДНК-аналитов, система определяет массу и отображает масс-спектр, идентифицирующий различные генетические мишени [Li D. et al. MALDI-TOF mass spectrometry in clinical analysis and research //ACS Measurement Science Au. - 2022. - Vol. 2. - №. 5. - P. 385-404]. Недостатками метода являются трудоемкость, высокая стоимость оборудования, высокая стоимость эксперимента, наличие высококвалифицированного персонала.A method for analyzing genetic variations in the human genome using matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry (MALDI) is known. The method involves transferring the DNA to be analyzed onto a substrate where it crystallizes with the matrix. The crystallized analytes are then transferred and irradiated with a laser, causing desorption and ionization of the molecules in a vacuum chamber. Positively charged DNA ions are accelerated and migrate through the vacuum tube to a highly sensitive detector at different speeds depending on the mass of the ions, resulting in different times of flight. Using the time of flight of individual ionized DNA analytes, the system determines the mass and displays a mass spectrum identifying different genetic targets [Li D. et al. MALDI-TOF mass spectrometry in clinical analysis and research //ACS Measurement Science Au. - 2022. - Vol. 2. - No. 5. - P. 385-404]. The disadvantages of the method are labor intensity, high cost of equipment, high cost of the experiment, and the need for highly qualified personnel.
За прототип выбран коммерческий набор по генотипированию rs17155992 (A/G) HSPA14 (Assay ID C__34526650_10; каталог 4351379) компании ThermoFisher. Однако, генотипирование с использованием коммерческих наборов характеризуется высокой стоимостью, а информация о структуре необходимых для проведения ПЦР праймеров и аллель-специфических зондов является закрытой для исследователей, в связи с чем он не может быть воспроизведен при наличии стандартного набора оборудования и реактивов. The commercial genotyping kit rs17155992 (A/G) HSPA14 (Assay ID C__34526650_10; catalog 4351379) from ThermoFisher was chosen as a prototype. However, genotyping using commercial kits is characterized by high cost, and information on the structure of the primers and allele-specific probes required for PCR is closed to researchers, and therefore it cannot be reproduced with a standard set of equipment and reagents.
Таким образом, существует реальная потребность в создании быстрого, недорогого и легко воспроизводимого способа идентификации полиморфизма rs17155992 (G>A) гена HSPA14, с доступной всем исследователям структурой праймеров и аллель-специфических зондов, который мог бы использоваться в качестве «рутинного» метода генотипирования в любой ПЦР-лаборатории.Thus, there is a real need to create a rapid, inexpensive and easily reproducible method for identifying the rs17155992 (G>A) polymorphism of the HSPA14 gene, with a structure of primers and allele-specific probes available to all researchers, which could be used as a “routine” genotyping method in any PCR laboratory.
Раскрытие сущности изобретения. Техническим результатом данного изобретения является разработка простого в исполнении и экономически целесообразного способа генотипирования однонуклеотидного полиморфизма rs17155992 (G>A), локализованного в позиции chr10:14849407 (GRCh38.p14) гена HSPA14 (Gene ID: 51182) методом полимеразной цепной реакции в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических сигнальных зондов, содержащие флуорофоры FAM и ROX.Disclosure of the essence of the invention. The technical result of this invention is the development of a simple to implement and economically feasible method for genotyping the single nucleotide polymorphism rs17155992 (G>A), localized in position chr10:14849407 (GRCh38.p14) of the HSPA14 gene (Gene ID: 51182) by the polymerase chain reaction method in "real time" mode using allele-specific signal probes containing FAM and ROX fluorophores.
Технический результат достигается тем, что идентификацию аллельных вариантов rs17155992 (G>A) гена HSPA14 осуществляют с использованием прямого праймера rs17155992 5′-TCCTTCAGCCCTGTAATGATGT-3′ (SEQ ID NO 1), обратного праймера rs17155992 5′-GGCTTCAGTATCAACCATCTTCT-3′ (SEQ ID NO 2), rs17155992-G-аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда 5′-(FAM)CTAACATTATGACGTTGTGTCTTC(RTQ1)-3′ (SEQ ID NO 3), rs17155992-A-аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда 5′-(ROX)CTAACATTATGACATTGTGTCTTC(BHQ2)-3′ (SEQ ID NO 4). The technical result is achieved in that the identification of allelic variants of rs17155992 (G>A) of the HSPA14 gene is carried out using the forward primer rs17155992 5′-TCCTTCAGCCCTGTAATGATGT-3′ (SEQ ID NO 1), the reverse primer rs17155992 5′-GGCTTCAGTATCAACCATCTTCT-3′ (SEQ ID NO 2), the rs17155992-G-allele-specific fluorescently labeled probe 5′-(FAM)CTAACATTATGACGTTGTGTCTTC(RTQ1)-3′ (SEQ ID NO 3), the rs17155992-A-allele-specific fluorescently labeled probe 5′-(ROX)CTAACATTATGACATTGTGTCTTC(BHQ2)-3′ (SEQ ID NO 4).
Изобретение поясняется следующей фигурой: дискриминация аллелей по локусу rs17155992 гена HSPA14 при генотипировании методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов по данным величин RFU (относительные единицы флуоресценции) на амплификаторе CFX96: генотипы rs17155992-G/G показаны оранжевыми кругами, генотипы rs17155992-G/A показаны зелеными треугольниками, генотипы rs17155992-A/A показаны голубыми квадратами; черным ромбом отмечен отрицательный контроль.The invention is explained by the following figure: discrimination of alleles at the rs17155992 locus of the HSPA14 gene during genotyping by the PCR method in "real time" mode using allele-specific fluorescent probes according to RFU (relative fluorescence units) values on a CFX96 amplifier: rs17155992-G/G genotypes are shown as orange circles, rs17155992-G/A genotypes are shown as green triangles, rs17155992-A/A genotypes are shown as blue squares; the negative control is marked with a black diamond.
Работа над дизайном олигонуклеотидов включала несколько этапов:The work on the design of oligonucleotides included several stages:
1) С применением открытой базы данных Ensembl genome browser 109 [https://www.ensembl.org/index.html] выбран синвенс, фланкирующий искомую однонуклеотидную замену [G/A] rs17155992 HSPA14, и затем с помощью доступного онлайн программного обеспечения Primer3web version 4.1.0 [https://primer3.ut.ee/] подобрана последовательность олигонуклеотидов, используемых для проведения ПЦР-реакции: 1) Using the open database Ensembl genome browser 109 [https://www.ensembl.org/index.html], a sequence flanking the desired single nucleotide substitution [G/A] rs17155992 HSPA14 was selected, and then, using the available online software Primer3web version 4.1.0 [https://primer3.ut.ee/], a sequence of oligonucleotides used to carry out the PCR reaction was selected:
прямой общий праймер rs17155992 5′-TCCTTCAGCCCTGTAATGATGT-3′ (SEQ ID NO 1), forward common primer rs17155992 5′-TCCTTCAGCCCTGTAATGATGT-3′ (SEQ ID NO 1),
обратный общий праймер rs17155992 5′-GGCTTCAGTATCAACCATCTTCT-3′ (SEQ ID NO 2).reverse common primer rs17155992 5′-GGCTTCAGTATCAACCATCTTCT-3′ (SEQ ID NO 2).
Размер амплифицируемого в ходе ПЦР фрагмента гена HSPA14 составляет 157 пар нуклеотидовThe size of the HSPA14 gene fragment amplified during PCR is 157 nucleotide pairs.
(TCCTTCAGCCCTGTAATGATGTTAAGAACTTGGGGGTTGGAAGGCAGGCTTTAAA(TCCTTCAGCCCTGTAATGATGTTAAGAACTTGGGGGTTGGAAGGCAGGCTTTAAA
TGTAGAGAACTAACATTATGAC[G/A]TTGTGTCTTCACATGGATGCGTTAGGAGCTTTGTAGAGAACTAACATTATGAC[G/A]TTGTGTCTTCACATGGATGCGTTAGGAGCTT
ATTCTCCATGGAGTCAGTCTAATTCAGAAGATGGTTGATACTGAAGCC).ATTCTCCATGGAGTCAGTCTAATTCAGAAGATGGTTGATACTGAAGCC).
2). Для дизайна зондов пользовались практическими рекомендациями [Basu C. (ed.). PCR primer design. - New york: Humana Press, 2015]. В реакции использовались гидролизные зонды. Последовательность зонда подбирали таким образом, чтобы он отжигался на матрицу между прямым и обратным праймерами. Каждый зонд снабжали флуорофором и гасителем флуоресценции, спектр поглощения которого соответствует длинам волн спектра флуорофора. Для гашения флуоресценции FAM пользовались гасителем RTQ1; для гашения флуоресценции ROX - гасителем BHQ2. 2). The design of probes was based on practical recommendations [Basu C. (ed.). PCR primer design. - New York: Humana Press, 2015]. Hydrolysis probes were used in the reaction. The probe sequence was selected so that it annealed to the matrix between the forward and reverse primers. Each probe was equipped with a fluorophore and a fluorescence quencher, the absorption spectrum of which corresponded to the wavelengths of the fluorophore spectrum. The RTQ1 quencher was used to quench FAM fluorescence; the BHQ2 quencher was used to quench ROX fluorescence.
На основании изложенных критериев и практических рекомендаций были подобраны зонды со следующей структурой:Based on the stated criteria and practical recommendations, probes with the following structure were selected:
rs17155992-G-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5′-(FAM)CTAACATTATGACGTTGTGTCTTC(RTQ1)-3′ (SEQ ID NO 3), rs17155992-A-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5′-(ROX)CTAACATTATGACATTGTGTCTTC(BHQ2)-3′ (SEQ ID NO 4). rs17155992-G-allele-specific fluorescently labeled probe 5′-(FAM)CTAACATTATGACGTTGTGTCTTC(RTQ1)-3′ (SEQ ID NO 3), rs17155992-A-allele-specific fluorescently labeled probe 5′-(ROX)CTAACATTATGACATTGTGTCTTC(BHQ2)-3′ (SEQ ID NO 4).
3) Изготовление праймеров и зондов осуществлялось в сервисном центре НПК «Синтол», Москва.3) The production of primers and probes was carried out at the service center of NPK Sintol, Moscow.
4) С помощью практических экспериментов подобраны оптимальные условия для проведения генотипирования, которые включают следующие этапы: 50°C в течение 2 минут, 95°C в течение 10 минут, затем 39 циклов [95°C в течение 10 секунд и 58°C в течение 1 минуты]. 4) Using practical experiments, optimal conditions for genotyping were selected, which include the following steps: 50°C for 2 minutes, 95°C for 10 minutes, then 39 cycles [95°C for 10 seconds and 58°C for 1 minute].
5) Разработанный способ был апробирован в лаборатории геномных исследований на 200 образцах ДНК здоровых индивидуумов биобанка НИИ генетической и молекулярной эпидемиологии КГМУ. Генотипирование осуществляли по данным величин RFU (относительные единицы флуоресценции) зондов с флуоресцентными красителями. По результатам генотипирования rs17155992 172 человека (86%) индивидуумов оказались гомозиготами по аллелю G (генотип G/G), 26 человек (13%) являлись гетерозиготами (генотип G/А), 2 человека (1%) оказались гомозиготами по аллелю А (генотип А/А). 5) The developed method was tested in the laboratory of genomic studies on 200 DNA samples of healthy individuals of the biobank of the Research Institute of Genetic and Molecular Epidemiology of KSMU. Genotyping was carried out according to the RFU (relative fluorescence units) values of probes with fluorescent dyes. According to the results of genotyping of rs17155992, 172 individuals (86%) were homozygotes for the G allele (genotype G/G), 26 people (13%) were heterozygotes (genotype G/A), 2 people (1%) were homozygotes for the A allele (genotype A/A).
6) Валидацию способа проводили методом масс-спектрометрического анализа на геномном времяпролетном масс-спектрометре MassArray analyzer 4 (Agena Bioscience). Результаты обоих способов генотипирования полностью (100% генотипов) совпали. Однако патентуемый способ генотипирования полиморфного локуса rs17155992 (G>A) гена HSPA14 методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических зондов позволяет значительно (на 6 часов) сократить время проведения анализа, а также снижает себестоимость анализа (в 4-5 раз).6) The method was validated by mass spectrometric analysis on a MassArray analyzer 4 genomic time-of-flight mass spectrometer (Agena Bioscience). The results of both genotyping methods were completely (100% of genotypes) identical. However, the patented method of genotyping the polymorphic locus rs17155992 (G>A) of the HSPA14 gene by PCR in "real time" mode using allele-specific probes allows to significantly (by 6 hours) reduce the analysis time, and also reduces the cost of the analysis (by 4-5 times).
Осуществление изобретения.Implementation of the invention.
Способ осуществляют следующим образом:The method is carried out as follows:
1. Выделение ДНК из периферической венозной крови. На первом этапе к 0,5 мл крови добавляли 0,5 мл PBS и центрифугировали 10 мин при 12 тыс. об/мин. Надосадочную жидкость сливали, добавляли 1 мл PBS и вновь центрифугировали при тех же условиях. Надосадочную жидкость сливали, добавляли 200 мкл ТЕ-буфера, пипетировали до растворения осадка и затем последовательно добавляли 10 мкл 1% раствора додецилсульфата натрия SDS и 5 мкл протеиназы К. Пробирки инкубировали в термостате при t=37°C 12 ч. В ходе второго этапа проводили четыре последовательных центрифугирования с фенолом и хлороформом согласно протоколу методики (10 мин, 8 тыс. об/мин), после чего ДНК осаждали ледяным раствором 95% этилового спирта и центрифугировали 10 мин при 14,3 тыс. об/мин. По испарении спирта ДНК растворяли в 100 мкл деионизированной дистиллированной воды. Получаемый раствор ДНК в воде имел чистоту в диапазоне А260/280=1,5-2,0 и среднюю концентрацию около 180-200 нг/мкл. 1. Isolation of DNA from peripheral venous blood. In the first step, 0.5 ml of PBS was added to 0.5 ml of blood and centrifuged for 10 min at 12 thousand rpm. The supernatant was poured off, 1 ml of PBS was added and centrifuged again under the same conditions. The supernatant was decanted, 200 μl of TE buffer was added, the mixture was pipetted until the sediment dissolved, and then 10 μl of 1% sodium dodecyl sulfate (SDS) solution and 5 μl of proteinase K were successively added. The tubes were incubated in a thermostat at t=37°C for 12 h. During the second stage, four successive centrifugations with phenol and chloroform were carried out according to the protocol of the method (10 min, 8 thousand rpm), after which the DNA was precipitated with an ice-cold solution of 95% ethyl alcohol and centrifuged for 10 min at 14.3 thousand rpm. After evaporation of the alcohol, the DNA was dissolved in 100 μl of deionized distilled water. The resulting DNA solution in water had a purity in the range of A260/280=1.5-2.0 and an average concentration of about 180-200 ng/μl.
2. Подготовка образцов ДНК к генотипированию. Качество выделенной ДНК оценивали по степени чистоты и концентрации раствора на спектрофотометре NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, США). Все анализируемые образцы ДНК были разведены деионизированной водой до концентрации 15-20 нг/мкл при А260/280=1,5-2,0.2. Preparation of DNA samples for genotyping. The quality of the isolated DNA was assessed by the degree of purity and concentration of the solution using a NanoDrop spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific, USA). All analyzed DNA samples were diluted with deionized water to a concentration of 15-20 ng/µl at A260/280=1.5-2.0.
3. Анализ полиморфизма rs17155992 (G>A) гена HSPA14 с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени с использованием аллель-специфических зондов. Для генотипирования использовали два фланкирующих праймера, прямой (SEQ ID NO 1) и обратный (SEQ ID NO 2), а также аллель-специфические зонды: G-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд (SEQ ID NO 3), A-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд (SEQ ID NO 4). 3. Analysis of the rs17155992 (G>A) polymorphism of the HSPA14 gene using real-time polymerase chain reaction with allele-specific probes. For genotyping, two flanking primers were used, forward (SEQ ID NO 1) and reverse (SEQ ID NO 2), as well as allele-specific probes: G-allele-specific fluorescently labeled probe (SEQ ID NO 3), A-allele-specific fluorescently labeled probe (SEQ ID NO 4).
ПЦР в «реальном времени» проводили в 25 мл реакционной смеси, содержащей 1,25 ЕД ДНК-полимеразы Hot Start Taq («Биолабмикс», Новосибирск, Россия), 20 нг ДНК, по 10 мкМ каждого праймера, по 5 мкМ каждого зонда, 0.03 мМ каждого dNTP, 3,0 мМ MgCl2; 1хПЦР-буфер [67 мМ Tris-HCl, pH 8,8, 16,6 мМ (NH4)2SO4, 0,01% Tween-20]. Реакция амплификации состояла из стадии нагревания до 50°C в течение 2 минут, 95°C в течение 10 минут, затем 39 циклов [95°C в течение 10 секунд и 58°C в течение 1 минуты].Real-time PCR was performed in a 25 ml reaction mixture containing 1.25 U Hot Start Taq DNA polymerase (Biolabmix, Novosibirsk, Russia), 20 ng DNA, 10 μM of each primer, 5 μM of each probe, 0.03 mM of each dNTP, 3.0 mM MgCl2; 1x PCR buffer [67 mM Tris-HCl, pH 8.8, 16.6 mM (NH4)2SO4, 0.01% Tween-20]. The amplification reaction consisted of a heating step to 50°C for 2 min, 95°C for 10 min, then 39 cycles [95°C for 10 sec and 58°C for 1 min].
4. Генотипирование. При проведении ПЦР в амплификаторе с флуоресцентной детекцией (Bio-Rad CFX96 или аналогичном амплификаторе) генотипирование осуществляют по данным величин RFU (относительных единиц флуоресценции). Для rs17155992 (G>A) гена HSPA14 зонд с флуоресцентным красителем FAM соответствует аллелю G, зонд с красителем ROX - аллелю A (фиг. 1). На фигуре видно четкое разделение образцов на кластеры, где черный ромб соответствуют отрицательному контролю, кластер оранжевых кругов - соответствует зонду с флуоресцентным красителем FAM и позволяет идентифицировать гомозигот G/G. Кластер синих квадратов соответствует зонду с красителем ROX и позволяет идентифицировать гомозигот A/A. Кластер зеленых треугольников соответствует накоплению уровня флуоресценции по обоим зондам и позволяет идентифицировать гетерозигот G/A.4. Genotyping. When performing PCR in a fluorescent detection amplifier (Bio-Rad CFX96 or similar amplifier), genotyping is performed based on RFU (relative fluorescence units) values. For rs17155992 (G>A) of the HSPA14 gene, the probe with the fluorescent dye FAM corresponds to the G allele, and the probe with the dye ROX corresponds to the A allele (Fig. 1). The figure shows a clear division of the samples into clusters, where the black diamond corresponds to the negative control, the cluster of orange circles corresponds to the probe with the fluorescent dye FAM and allows identification of G/G homozygotes. The cluster of blue squares corresponds to the probe with the dye ROX and allows identification of A/A homozygotes. The cluster of green triangles corresponds to the accumulation of fluorescence levels for both probes and allows identification of G/A heterozygotes.
Резюме.Resume.
Таким образом, разработан эффективный и недорогой способ для экспресс-идентификации полиморфного варианта rs17155992 (G>A) гена HSPA14 у человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов, который может быть использован в медицине при определении наследственной предрасположенности к развитию заболеваний, ассоциированных с носительством полиморфизмов гена HSPA14, а также в научных целях.Thus, an effective and inexpensive method for rapid identification of the polymorphic variant rs17155992 (G>A) of the HSPA14 gene in humans by the PCR method in real time using allele-specific fluorescent probes has been developed, which can be used in medicine to determine hereditary predisposition to the development of diseases associated with the carriage of HSPA14 gene polymorphisms, as well as for scientific purposes.
--->--->
<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?><?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>
<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing <!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing
1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">
<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Способ <ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Method
генотипирования полиморфного локуса rs17155992 (G A) гена HSPA14 у genotyping of the polymorphic locus rs17155992 (G A) of the HSPA14 gene in
человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением human by the PCR method in "real time" mode using
аллель- специфических флуоресцентных зондов.xml" softwareName="WIPO allele-specific fluorescent probes.xml" softwareName="WIPO
Sequence" softwareVersion="2.3.0" productionDate="2024-05-03">Sequence" softwareVersion="2.3.0" productionDate="2024-05-03">
<ApplicationIdentification><ApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode> <IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText></ApplicationNumberText> <ApplicationNumberText></ApplicationNumberText>
<FilingDate></FilingDate><FilingDate></FilingDate>
</ApplicationIdentification></ApplicationIdentification>
<ApplicantFileReference>2029</ApplicantFileReference> <ApplicantFileReference>2029</ApplicantFileReference>
<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное <ApplicantName languageCode="ru">Federal State
бюджетное образовательное учреждение высшего образования budgetary educational institution of higher education
"Курский государственный медицинский университет" "Kursk State Medical University"
Министерства здравоохранения Российской Федерации,</ApplicantName>Ministry of Health of the Russian Federation,</ApplicantName>
<ApplicantNameLatin>Kursk State Medical <ApplicantNameLatin>Kursk State Medical
University</ApplicantNameLatin>University</ApplicantNameLatin>
<InventionTitle languageCode="ru">Способ генотипирования <InventionTitle languageCode="en">Genotyping method
полиморфного локуса rs17155992 (G>A) гена HSPA14 у человека polymorphic locus rs17155992 (G>A) of the HSPA14 gene in humans
методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель- by the PCR method in real time using alleles
специфических флуоресцентных зондов</InventionTitle>specific fluorescent probes</InventionTitle>
<SequenceTotalQuantity>4</SequenceTotalQuantity> <SequenceTotalQuantity>4</SequenceTotalQuantity>
<SequenceData sequenceIDNumber="1"> <SequenceData sequenceIDNumber="1">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q2"><INSDQualifier id="q2">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tccttcagccctgtaatgatgt</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>tccttcagccctgtaatgatgt</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="2"> <SequenceData sequenceIDNumber="2">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>23</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q4"><INSDQualifier id="q4">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ggcttcagtatcaaccatcttct</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>ggcttcagtatcaaccatcttct</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="3"> <SequenceData sequenceIDNumber="3">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>24</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>24</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..24</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..24</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q6"><INSDQualifier id="q6">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ctaacattatgacgttgtgtcttc</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>ctaacattatgacgttgtgtcttc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="4"> <SequenceData sequenceIDNumber="4">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>24</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>24</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..24</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..24</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q8"><INSDQualifier id="q8">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ctaacattatgacattgtgtcttc</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>ctaacattatgacattgtgtcttc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
</ST26SequenceListing></ST26SequenceListing>
<---<---
Claims (1)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2828270C1 true RU2828270C1 (en) | 2024-10-08 |
Family
ID=
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2808841C1 (en) * | 2023-10-16 | 2023-12-05 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Курский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | METHOD OF GENOTYPING rs346157 (A>G) POLYMORPHIC LOCUS OF C19orf53 GENE IN HUMANS BY REAL-TIME PCR USING ALLELE-SPECIFIC FLUORESCENT PROBES |
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2808841C1 (en) * | 2023-10-16 | 2023-12-05 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Курский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | METHOD OF GENOTYPING rs346157 (A>G) POLYMORPHIC LOCUS OF C19orf53 GENE IN HUMANS BY REAL-TIME PCR USING ALLELE-SPECIFIC FLUORESCENT PROBES |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| SOERENSEN, M. et al., Evidence from case-control and longitudinal studies supports associations of genetic variation in APOE, CETP, and IL6 with human longevity, Age (Dordrecht, Netherlands), 2013, 35(2), pp. 487-500. AMBROCIO-ORTIZ, E. et al., Effect of SNPs in HSP Family Genes, Variation in the mRNA and Intracellular Hsp Levels in COPD Secondary to Tobacco Smoking and Biomass-Burning Smoke, Frontiers in genetics, 2020, 10, 1307. NEIL J. GIBSON, The use of real-time PCR methods in DNA sequence variation analysis, Clinica Chimica Acta, 2006, Volume 363, Issues 1-2, Pages 32-47, ISSN 0009-8981. MALKKI, M. et al., Genotyping of single nucleotide polymorphisms by 5' nuclease allelic discrimination, Methods in molecular biology (Clifton, N.J.), 2012, 882, 173-182. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2828270C1 (en) | METHOD FOR GENOTYPING POLYMORPHIC LOCUS rs17155992 (G>A) OF HSPA14 GENE IN HUMAN BY REAL-TIME PCR USING ALLELE-SPECIFIC FLUORESCENT PROBES | |
| RU2830244C1 (en) | METHOD FOR GENOTYPING POLYMORPHIC LOCUS rs4279640 (T>C) OF HSF1 GENE IN HUMAN BY REAL-TIME PCR USING ALLELE-SPECIFIC FLUORESCENT PROBES | |
| RU2829225C1 (en) | METHOD FOR GENOTYPING POLYMORPHIC LOCUS rs4926222 (G>A) OF DNAJB1 GENE IN HUMAN BY REAL-TIME PCR USING ALLELE-SPECIFIC FLUORESCENT PROBES | |
| RU2830632C1 (en) | METHOD FOR GENOTYPING POLYMORPHIC LOCUS rs556439 (AG) OF HSF2 GENE IN HUMAN BY REAL-TIME PCR USING ALLELE-SPECIFIC FLUORESCENT PROBES | |
| RU2825464C1 (en) | METHOD FOR GENOTYPING POLYMORPHIC LOCUS rs648595 (T>G) OF GCLC GENE IN HUMAN BY REAL-TIME PCR USING ALLELE-SPECIFIC FLUORESCENT PROBES | |
| RU2830246C1 (en) | METHOD FOR GENOTYPING POLYMORPHIC LOCUS rs6909985 (G>T) OF HSF2 GENE IN HUMAN BY REAL-TIME PCR USING ALLELE-SPECIFIC FLUORESCENT PROBES | |
| RU2828867C1 (en) | METHOD FOR GENOTYPING POLYMORPHIC LOCUS rs910652 (T>C) OF HSPA12B GENE IN PERSON BY REAL-TIME PCR USING ALLELE-SPECIFIC FLUORESCENT PROBES | |
| RU2830245C1 (en) | METHOD FOR GENOTYPING POLYMORPHIC LOCUS rs6457452 (C>T) OF HSPA1B GENE IN HUMAN BY REAL-TIME PCR USING ALLELE-SPECIFIC FLUORESCENT PROBES | |
| RU2828035C1 (en) | METHOD FOR GENOTYPING POLYMORPHIC LOCUS rs862832 (CT) OF HSPA12B GENE IN HUMAN BY REAL-TIME PCR USING ALLELE-SPECIFIC FLUORESCENT PROBES | |
| RU2833707C1 (en) | METHOD FOR GENOTYPING POLYMORPHIC LOCUS rs3170633 (C>T) OF GCLM GENE IN HUMAN BY REAL-TIME PCR USING ALLELE-SPECIFIC FLUORESCENT PROBES | |
| RU2830243C1 (en) | Method for genotyping a polymorphic locus rs1801310 (a>g) of the gss gene in a human by real-time pcr using allele-specific fluorescent probes | |
| RU2828034C1 (en) | METHOD FOR GENOTYPING POLYMORPHIC LOCUS rs196329 (AG) OF THE BAG3 GENE IN HUMAN BY REAL-TIME PCR USING ALLELE-SPECIFIC FLUORESCENT PROBES | |
| RU2852770C1 (en) | METHOD FOR GENOTYPING POLYMORPHIC LOCUS rs2236626 (C>T) OF GGT1 GENE IN HUMANS BY PCR METHOD IN REAL TIME USING ALLELE-SPECIFIC FLUORESCENT PROBES | |
| RU2832336C1 (en) | METHOD FOR GENOTYPING POLYMORPHIC LOCUS rs3203295 (A>C) OF C11orf58 GENE IN HUMAN BY REAL-TIME PCR USING ALLELE-SPECIFIC FLUORESCENT PROBES | |
| RU2825466C1 (en) | METHOD FOR GENOTYPING POLYMORPHIC LOCUS rs7928675 (A>C) OF C11orf58 GENE IN HUMAN BY REAL-TIME PCR USING ALLELE-SPECIFIC FLUORESCENT PROBES | |
| RU2810474C1 (en) | METHOD OF GENOTYPING rs2901077 (C>T) POLYMORPHIC LOCUS OF C19orf53 GENE IN HUMANS BY REAL-TIME PCR USING ALLELE-SPECIFIC FLUORESCENT PROBES | |
| RU2828869C1 (en) | METHOD FOR GENOTYPING POLYMORPHIC LOCUS rs1043618 (G>C) OF HSPA1A GENE IN HUMAN BY REAL-TIME PCR USING ALLELE-SPECIFIC FLUORESCENT PROBES | |
| RU2819835C1 (en) | METHOD FOR GENOTYPING POLYMORPHIC LOCUS rs7951676 (GT) OF C11orf58 GENE IN PERSON BY REAL-TIME PCR USING ALLELE-SPECIFIC FLUORESCENT PROBES | |
| RU2824979C1 (en) | METHOD FOR GENOTYPING POLYMORPHIC LOCUS rs4757430 (A>G) OF C11orf58 GENE IN HUMAN BY REAL-TIME PCR USING ALLELE-SPECIFIC FLUORESCENT PROBES | |
| RU2834032C1 (en) | METHOD FOR GENOTYPING POLYMORPHIC LOCUS rs7907606 (T>G) IN HUMAN BY REAL-TIME PCR USING ALLELE-SPECIFIC FLUORESCENT PROBES | |
| RU2828032C1 (en) | METHOD FOR GENOTYPING POLYMORPHIC LOCUS rs58415480 (C>G) OF SYNE1 GENE IN HUMAN BY REAL-TIME PCR USING ALLELE-SPECIFIC FLUORESCENT PROBES | |
| RU2826734C1 (en) | METHOD FOR GENOTYPING POLYMORPHIC LOCUS rs7986407 (A>G) OF FOXO1 GENE IN HUMAN BY REAL-TIME PCR USING ALLELE-SPECIFIC FLUORESCENT PROBES | |
| RU2831059C1 (en) | METHOD FOR GENOTYPING POLYMORPHIC LOCUS rs111837807 (T>C) OF CCHCR1 GENE IN HUMAN BY REAL-TIME PCR USING ALLELE-SPECIFIC FLUORESCENT PROBES | |
| RU2824973C1 (en) | METHOD FOR GENOTYPING POLYMORPHIC LOCUS rs4757429 (C>T) OF C11orf58 GENE IN HUMAN BY REAL-TIME PCR USING ALLELE-SPECIFIC FLUORESCENT PROBES | |
| RU2830633C1 (en) | METHOD FOR GENOTYPING POLYMORPHIC LOCUS rs753856 (CG) OF HSPA6 GENE IN HUMAN BY REAL-TIME PCR USING ALLELE-SPECIFIC FLUORESCENT PROBES |