RU2828011C2

RU2828011C2 - Антитела против рецептора программируемой смерти pd-1 человека

Info

Publication number: RU2828011C2
Application number: RU2022103028A
Authority: RU
Inventors: Санджив Кумар Мендиратта; Каушик Банерджи; Дипти МЕХТА; Рамкрашан КАСЕРА; Арун Сингх; Ашини Парикх; Панкадж КАЛИТА; Руту Парашандра ДЭЙВ; Вибхути ШАРМА; Хардик ПАНДИА
Original assignee: Зидус Лайфсайенсиз Лимитед
Priority date: 2019-07-09
Filing date: 2020-07-09
Publication date: 2024-10-07

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии. Описано антитело против PD-1, или его антигенсвязывающая часть, содержащее аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 149 и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 152, где антитело против PD-1 содержит константную область IgG4 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 153, содержащей единичную аминокислотную замену S228P, P329G, M428L и N434S. Изобретение расширяет арсенал средств для лечения заболеваний, при которых экспрессия PD-1 является вредной. 4 з.п. ф-лы, 10 ил., 9 табл., 12 пр.

Description

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающей части, которые могут связываться с белком 1 программируемой клеточной смерти (PD-1) человека. Антитело по настоящему изобретению, кроме того, используют в получении лекарственного средства для лечения заболеваний, при которых экспрессия PD-1 является вредной.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ДЛЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

PD-1 (CD279) представляет собой белок из 288 аминокислот, ингибирующий рецептор, экспрессированный на активированных T-клетках и B-клетках, клетках естественных киллерах и моноцитах. PD-1 является членом семейства T-клеточных коингибирующих рецепторов CD28/CTLA-4 (антигена цитотоксических T-лимфоцитов)/ICOS (индуцируемого костимулятора). Рецептор PD-1 имеет два лиганда, а именно, белок лиганд смерти 1 (PD-L1) и белок лиганд смерти 2 (PD-L2). PD-L1 (CD274, B7H 1) широко экспрессируется как на лимфоидных, так и на нелимфоидных тканях, таких как CD4 и CD8 T-клетки, клетки линий макрофагов, периферические ткани, так же как на клетках опухолей, инфицированных вирусом клетках и клетках аутоиммунной ткани. PD-L2 (CD273, B7-DC) имеет более ограниченную экспрессию, чем PD-L1, являясь экспрессированным на активированных дендритных клетках и макрофагах (1). PD-L1 экспрессируется в большинстве злокачественных опухолей человека, включая меланому, глиому, немелкоклеточный рак легкого, плоскоклеточную карциному головы и шеи, лейкоз, рак поджелудочной железы, почечноклеточную карциному и печеночноклеточную карциному, и может являться индуцируемым почти во всех типах злокачественных опухолей (2). Связывание PD-1 с его лигандами приводит к уменьшенной пролиферации T-клеток и секреции цитокинов, супрессируя гуморальный и клеточный иммунные ответы и ухудшая течение заболеваний, где активный иммунный ответ в ином случае облегчал бы состояние заболевания. Эту иммуносупрессию можно обращать посредством ингибирования локального взаимодействия PD-1 с PD-L1, и эффект является аддитивным также, когда взаимодействие PD-1 с PD-L2 блокировано (3, 4).

Блокирование PD-1 с использованием антагонистов, включая моноклональные антитела, исследовали при лечении злокачественных опухолей и хронических вирусных инфекций (5).

Моноклональные антитела против PD-1 известны в данной области и описаны, например, в Патентных документах WO2006121168, WO2009114335, WO2008156712, WO2012145493, WO2015036394, WO2015112800, WO2016015685 и WO2018128939.

Три антитела, нацеленные на PD-1 человека, для лечения различных злокачественных опухолей, в комбинации с общепринятыми лекарственными средствами, являются коммерчески доступными. Эти три антитела представляют собой ниволумаб, пембролизумаб и цемиплимаб.

Несмотря на клинический успех антител против PD-1, эти терапевтические антитела имеют несколько недостатков, включая высокую стоимость, ограниченное время полужизни и иммуногенность.

Соответственно, в данной области существует постоянная необходимость основанного на пути PD-1/PD-L1 лечения заболеваний с использованием антител, которые могут эффективно связывать PD-1 человека и блокировать его связывание с PD-L1 или PD-L2, а также обеспечивать улучшение, по отношению к некоторым из проблем существующих видов терапии. Настоящее изобретение относится к таким новым антителам.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к новым антителам против PD-1, которые имеют одну или несколько улучшенных характеристик, например, относительно известных антител против PD-1, используемых для терапевтических целей. Антитело против PD-1 или его антигенсвязывающая часть по настоящему изобретению связывает с высокой аффинностью PD-1 человека. Аминокислотная последовательность константной области антитела против PD-1 состоит из константной области IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM или IgD, предпочтительно, IgGl или IgG4. Кроме того, одно или несколько антител против PD-1 по настоящему изобретению имеют модифицированную или уменьшенную, или отсутствующую активность ADCC и/или CDC. В некоторых аспектах, настоящее изобретение относится к антителам против PD-1, имеющим высокую активность ADCC и/или CDC, которые могут приводить к лизису экспрессирующих PD-1 клеток. Антитело против PD-1 или его антигенсвязывающая часть по настоящему изобретению имеет K_D 10^-10 M или менее, более предпочтительно, 10^-11 M или менее и даже более предпочтительно, 10^-12 M или менее для антигена PD-1. Значение K_Dпредставляет собой измерение аффинности связывания антитела по отношению к его антигену-мишени. Антитело против PD-1 или его антигенсвязывающую часть по настоящему изобретению можно использовать для лечения заболеваний, где взаимодействие PD-1 с PDL1 и/или PDL2 вовлечено в модификацию состояния заболевания, например, при инфекциях и различных злокачественных опухолях. В одном аспекте, антитело против PD-1 или его антигенсвязывающая часть по настоящему изобретению блокирует взаимодействие рецептора PD-1 с его природным лигандом PD-L1 и/или PD-L2. В другом аспекте изобретения, антитело против PD-1 или его антигенсвязывающая часть уничтожает T-клетки, экспрессирующие PD-1. Настоящее изобретение относится также к способам получения новых антител против PD-1 и содержащих их фармацевтических композиций.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг. 1 изображена общая схема вектора для векторной конструкции pZRCIIhyg LC-HC против PD-1, которую используют для получения полноразмерного моноклонального антитела против PD-1 по настоящему изобретению.

На фиг. 2 изображена общая схема вектора pSEX83, используемого для получения библиотеки, для получения Fab против PD-1 по настоящему изобретению.

На фиг. 3 изображена общая схема вектора для векторной конструкции pZRCIIIhyg LC-HC против PD-1, которую используют для получения полноразмерного моноклонального антитела против PD-1 из Fab против PD-1 по настоящему изобретению.

На фиг. 4 изображены результаты эксперимента проточной цитометрии, показывающие, что антитела против PD-1 IP-H4.2L1, IP-H4L1 (IgG1) и IP-H4L1 (IgG4) по настоящему изобретению, направленные против PD-1 человека, связывают PD-1 на клеточной поверхности PBMC человека.

На фиг. 5 изображены результаты эксперимента проточной цитометрии с использованием линий клеток HEK 293T, показывающие, что антитела против PD-1 IP-H4.2L1, IP-H4.19L1, IP-H4.36L1 по настоящему изобретению, направленные против PD-1 человека, связывают PD-1 на клеточной поверхности.

На фиг. 6 изображены результаты эксперимента проточной цитометрии с использованием линий клеток HEK 293T, показывающие, что антитела против PD-1 N5NL, N6NL, N7NL, N9NL и N10NL по настоящему изобретению, направленные против PD-1 человека, связывают PD-1 на клеточной поверхности.

На фиг. 7 изображены результаты эксперимента, показывающие, что антитела против PD-1 IP-H4.2L1, IP-H4.19L1, IP-H4.36L1 по настоящему изобретению, направленные против PD-1 человека, стимулируют секрецию интерлейкина-2 (IL-2) в анализе реакции смешанной культуры лимфоцитов.

На фиг. 8 изображены результаты эксперимента, показывающие, что антитела против PD-1 IP-H4.2L1, IP-H4.19L1, IP-H4.36L1 по настоящему изобретению, направленные против PD-1 человека, стимулируют секрецию IFN-гамма (IFN-γ) в анализе реакции смешанной культуры лимфоцитов.

На фиг. 9 изображены результаты эксперимента, показывающие, что антитела против PD-1 N5NL, N6NL, N9NL и N10NL по настоящему изобретению, направленные против PD-1 человека, стимулируют секрецию IL-2 в анализе реакции смешанной культуры лимфоцитов.

На фиг. 10 изображены результаты эксперимента, показывающие, что антитела против PD-1 N5NL, N6NL, N9NL и N10NL по настоящему изобретению, направленные против PD-1 человека, стимулируют секрецию IFN-γ в анализе реакции смешанной культуры лимфоцитов.

Определения

Термин «антитело», как обозначено в настоящем описании, включает полноразмерные антитела и любой их антигенсвязывающий фрагмент (т.е., «антигенсвязывающую часть») или их одиночные цепи. «Антитело» относится к гликопротеину, содержащему по меньшей мере две тяжелые (H) цепи и две легкие (L) цепи, соединенные между собой дисульфидными связями, или его антигенсвязывающей части. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (сокращенно обозначенной в настоящем описании как VH) и константной области тяжелой цепи (сокращенно обозначенной в настоящем описании как CH). Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов, CH1, CH2 и CH3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (сокращенно обозначенной в настоящем описании как VL) и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена, CL. Области VH и VL можно дополнительно подразделять на области гипервариабельности, названные определяющими комплементарность областями (CDR), перемежающиеся областями, которые являются более консервативными, названными каркасными областями (FR). Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, аранжированных от амино-конца к карбокси-концу в следующем порядке: FRl, CDRl, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные области тяжелых и легких цепей содержат связывающий домен, взаимодействующий с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, включая различные клетки иммунной системы (например, иммуноэффекторные клетки) и первый компонент (C1q) классической системы комплемента.

Термин «функционально связанный» предназначен для обозначения того, что ген антитела лигирован в вектор таким образом, что последовательности для контроля транскрипции и трансляции внутри вектора служат для предназначенной для них функции регуляции транскрипции и трансляции гена антитела.

Термины «Ka» и Kd хорошо известны специалисту в данной области, где «Ka» представляет собой скорость связывания для конкретного взаимодействия антитело-антиген, в то время как термин «Kd» представляет собой скорость диссоциации для конкретного взаимодействия антитело-антиген. Термин «K_D» представляет собой константу аффинности, которую получают из соотношения Kd и Ka. Ее можно измерять с использованием способа поверхностного плазмонного резонанса, который хорошо известен в данной области. Значение K_Dявляется измерением аффинности связывания антитела по отношению к его антигену-мишени. Термин «K_D» определен также в WO 2006121168. Содержание этого Патентного документа приведено в настоящем описании в качестве ссылки.

Термины «моноклональные антитело» или «композиция моноклональных антител», в рамках изобретения, относятся к препарату молекул антител одного молекулярного состава. Композиция моноклональных антител имеет одну специфичность связывания и аффинность для конкретного эпитопа.

Термин «биспецифическое антитело» относится к гомогенной популяции антител, вовлеченной в высоко специфическое узнавание и связывание двух различных антигенных детерминант или эпитопов.

Термин «рекомбинантное антитело» по настоящему изобретению, включает моноклональные антитела, которые получают рекомбинантным способом с использованием синтетических генов тяжелых и легких цепей. Рекомбинантные антитела по этому изобретению представляют собой моноклональные антитела (mAb), которые не получены с использованием традиционных технологий на основе гибридомы, и не нуждаются в гибридомах и животных в процессе получения.

Термин «иммуноэффекторная функция», в рамках изобретения, представляет собой биохимическое событие, возникающее в результате взаимодействия области Fc антитела с рецептором или лигандом Fc. Эффекторные функции включают, но без ограничения ADCC, ADCP и CDC. Термин также представляет физиологическое событие, такое как время полужизни в кровотоке лекарственного средства или нацеливание лекарственного средства на конкретный тип клетки или ткани.

Термин «ADCC» или «антителозависимая опосредованная клетками цитотоксичность», в рамках изобретения, представляет собой опосредованную клетками реакцию, где неспецифические цитотоксические клетки, которые экспрессируют FcγR, узнают связанное антитело на клетке-мишени и затем вызывают лизис клетки-мишени.

Термин «ADCP» или «антителозависимый опосредованный клетками фагоцитоз», в рамках изобретения, представляет собой опосредованную клетками реакцию, где неспецифические цитотоксические клетки, которые экспрессируют FcγR, узнают связанное антитело на клетке-мишени и впоследствии вызывают фагоцитоз клетки-мишени.

Термин «иммуноэффекторная клетка», в рамках изобретения, представляет собой клетку, которая экспрессирует один или несколько рецепторов Fc и опосредует одну или несколько эффекторных функций. Эффекторные клетки включают, но без ограничения, моноциты, макрофаги, нейтрофилы, дендритные клетки, эозинофилы, тучные клетки, тромбоциты, B-клетки, большие гранулярные лимфоциты, клетки Лангерганса, клетки естественные киллеры (NK), и γδ - T-клетки, и могут происходить из любого организма, включая, но без ограничения, человека, мышей, крыс, кроликов и обезьян.

Термин фрагмент «Fc», название которого отражает его способность легко кристаллизоваться. В молекулах IgG, область Fc получают посредством расщепления папаином на N-конце от Cys 226. Область Fc является центральной для иммуноэффекторных функций антител.

Термин «белок Fc», в рамках изобретения, относится к части одной тяжелой цепи иммуноглобулина, начинающейся в шарнирной области непосредственно выше участка расщепления папаином и заканчивающийся на C-конце антитела., соответственно, полный домен Fc содержит по меньшей мере часть шарнирного (например, верхней, средней и/или нижней шарнирной области) домена, домена CH2 и домена CH3.

Термин «фармацевтический состав» относится к препаратам, которые находятся в такой форме, чтобы обеспечивать однозначно эффективную биологическую активность активных ингредиентов. Термин «фармацевтический состав» или «фармацевтическая композиция», или «композиция» могут быть использованы в настоящем описании взаимозаменяемо.

Термин «наполнитель» относится к средству, которое можно добавлять к составу для стабилизации активной лекарственной субстанции в составленной форме для коррекции и поддержания осмоляльности и pH фармацевтических препаратов. Примеры общеупотребительных наполнителей включают, но без ограничения, сахара, полиолы, аминокислоты, поверхностно-активные вещества и полимеры. «Фармацевтически приемлемые» наполнители представляют собой наполнители, которые можно целесообразно вводить субъекту-млекопитающему для обеспечения эффективной дозы используемого активного ингредиента.

Термин «лечение» или «терапевтические средства», в рамках изобретения, относится к любому лечению заболевания у млекопитающего, в частности, у человека. Он включает: (a) предотвращение возникновения заболевания у субъекта, который может являться предрасположенным к заболеванию или подверженным риску получения заболевания, но еще не был диагностирован как имеющий его; (b) ингибирование заболевания, т.е., остановка его развития; и (c) облегчение заболевания, т.е., вызов регрессии заболевания.

Термины «пациент» и «субъект» использованы взаимозаменяемо и использованы в своем общепринятом смысле для обозначения живого организма, страдающего от состояния или подверженного состоянию, которое можно предотвращать или лечить посредством введения композиции по настоящему изобретению, и включают как человека, так и не относящихся к человеку животных. Примеры субъектов включают, но без ограничения, человека, шимпанзе и другие виды обезьян старого и нового света; сельскохозяйственных животных, таких как крупный рогатый скот, овцы, свиньи, козы и лошади; домашних млекопитающих, таких как собаки и кошки; лабораторных животных, включая грызунов, таких как мыши, крысы и морские свинки; птиц, включая домашних, диких и промысловых птиц, таких как куры, индюшки и другие куриные, утки, гуси и т.п. Термин не обозначает конкретный возраст. Таким образом, взрослые, молодые и новорожденные индивидуумы представляют интерес.

«Эффективное количество» антитела по изобретению, или его композиции представляет собой количество, которое доставляют субъекту-млекопитающему, либо в однократной дозе, либо в качестве части из серий, которое является эффективным для индукции иммунного ответа против антигена-мишени у указанного субъекта. Это количество меняется в зависимости от состояния здоровья и физического состояния индивидуума, подлежащего лечению, таксономической группы индивидуума, подлежащего лечению, и других важных факторов. Ожидают, что количество может попадать в относительно широкий диапазон, который можно определять посредством общепринятых исследований.

«Фармацевтически эффективная доза» или «терапевтически эффективная доза» представляет собой дозу, необходимую для лечения или предотвращения, или облегчения одного или нескольких связанных с PD-1 нарушений или симптомов у субъекта, предпочтительно, по настоящему изобретению, для злокачественной опухоли или инфекции, или аутоиммунного заболевания. Фармацевтически эффективная доза зависит, среди прочего, от конкретного соединения (в настоящем описании оно представляет собой антитело против PD-1 или его комбинацию или конъюгат, или биспецифическое антитело) для введения, тяжести симптомов, чувствительности субъекта к побочным эффектам, типа заболевания, используемой композиции, способа введения, типа млекопитающего, подвергаемого лечению, физических характеристик конкретного млекопитающего, принимаемых во внимание, таких как состояние здоровья и физическое состояние, сопутствующее лекарственное средство, желательная степень защиты и другие факторы, хорошо известные специалисту в данной области.

Сокращенные наименования аминокислот, как использовано в настоящей заявке, представлены в таблице ниже.

Полное наименование	Сокращенное наименование (3-буквенное)	Сокращенное наименование (1-буквенное)
Аланин	Ala	A
Аргинин	Arg	R
Аспарагин	Asn	N
Аспартат	Asp	D
Цистеин	Cys	C
Глутамат	Glu	E
Глутамин	Gln	Q
Глицин	Gly	G
Гистидин	His	H
Изолейцин	Ile	I
Лейцин	Leu	L
Лизин	Lys	K
Метионин	Met	M
Фенилаланин	Phe	F
Пролин	Pro	P
Серин	Ser	S
Треонин	Thr	T
Триптофан	Trp	W
Тирозин	Tyr	Y
Валин	Val	V

Другие сокращения, используемые в настоящей заявке:

ACT: Адоптивный перенос клеток

ADCC: Антителозависимая клеточная цитотоксичность

ADCP: Антителозависимый клеточный фагоцитоз

CDC: Комплементзависимая цитотоксичность

CDR: Определяющая комплементарность область

КОЕ: Колониеобразующая единица

CH: Константная область тяжелой цепи

cHL: Классическая лимфома Ходжкина

CL: Константная область легкой цепи

dNTP: Дезоксирибонуклеотидтрифосфат

ESCC: Плоскоклеточная карцинома пищевода

FACS: Активированная флуоресценцией сортировка клеток

HC: Тяжелая цепь

HCC: Печеночноклеточная карцинома

HCVR: Вариабельная область тяжелой цепи

HEK: Эмбриональная почка человека

hyg: гигромицин

IFN-γ: IFN-гамма

LC: Легкая цепь

LCVR: Вариабельная область легкой цепи

mAb: Моноклональное антитело

MCC: Карцинома из клеток Меркеля

MLR: Реакция смешанной культуры лимфоцитов

MOI: Множественность инфекции

NSCLC: Немелкоклеточный рак легкого

PBMC: Мононуклеарные клетки периферической крови

PD-1/PD 1: Рецептор 1 программируемой клеточной смерти

PD-L1/PD L1: Лиганд 1 программируемой смерти

PD-L2/PD L2: Лиганд 2 программируемой смерти

Pfx: ДНК-полимераза с корректирующей активностью, Pfx™от Invitrogen.

PMBCL: Первичная медиастинальная крупноклеточная B-клеточная лимфома

sRCA: Избирательная амплификация по типу катящегося кольца

RCC: Почечноклеточная карцинома

об/мин: Оборотов в минуту

SCCHN: Плоскоклеточная карцинома головы и шеи

SCLC: Мелкоклеточный рак легкого

SEQ/seq: Последовательность

SPR: Поверхностный плазмонный резонанс

VH: Вариабельная область тяжелой цепи

VL: Вариабельная область легкой цепи.

ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к новым антителам против PD-1, которые можно использовать для терапевтических целей.

В одном варианте осуществления, антитело против PD-1 или его антигенсвязывающая часть по настоящему изобретению связывает с высокой аффинностью PD-1 человека.

В одном варианте осуществления, аминокислотная последовательность константной области антитела против PD-1 состоит из константной области IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgG2/G4, IgA, IgE, IgM или IgD, предпочтительно, IgGl или IgG4.

В другом варианте осуществления, одно или несколько антител против PD-1 по настоящему изобретению имеют модифицированную или уменьшенную, или отсутствующую активность ADCC и/или CDC. В одном из вариантов осуществления, антитело против PD-1 или его антигенсвязывающая часть имеет уменьшенный потенциал для вызова проблемы с безопасностью ADCC и CDC. В другом варианте осуществления, антитело против PD-1 или его антигенсвязывающая часть имеет активность ADCC и/или CDC.

В другом варианте осуществления, одно или несколько антител против PD-1 по настоящему изобретению имеет активность ADCP.

В одном из вариантов осуществления, антитело против PD-1 или его антигенсвязывающая часть по настоящему изобретению имеет K_D 10^-8 M или менее, более предпочтительно, 10^-10 M или менее и даже более предпочтительно, 10^-11 M или менее, даже более предпочтительно, 10^-12 M или менее для антигена PD-1. Значение K_D представляет собой измерение аффинности связывания антитела по отношению к его антигену-мишени.

В одном из вариантов осуществления, антитело против PD-1 или его антигенсвязывающая часть по настоящему изобретению вступает в перекрестную реакцию с PD-1 из видов, отличных от человека.

В одном из вариантов осуществления, антитело против PD-1 или его антигенсвязывающая часть по настоящему изобретению имеет более высокую специфичность связывания для PD-1 человека.

В одном из вариантов осуществления, антитело против PD-1 или его антигенсвязывающая часть по настоящему изобретению имеет увеличенное время полужизни у субъекта.

В одном варианте осуществления, антитело против PD-1 или его антигенсвязывающая часть по настоящему изобретению блокирует функцию PD-1.

В одном варианте осуществления, антитело против PD-1 или его антигенсвязывающая часть по настоящему изобретению предотвращает связывание PD-1 с экспрессирующими PD-L1 клетками-мишенями.

В одном из вариантов осуществления, антитело против PD-1 или его антигенсвязывающая часть по настоящему изобретению предотвращает связывание PD-1 с экспрессирующими PD-L2 клетками-мишенями.

В другом варианте осуществления, антитело против PD-1 или его антигенсвязывающая часть по настоящему изобретению уничтожает T-клетки, экспрессирующие PD-1.

В одном варианте осуществления, антитело против PD-1 или его антигенсвязывающая часть по настоящему изобретению имеет улучшенное время полужизни в кровотоке.

В другом варианте осуществления, антитело против PD-1 или антигенсвязывающая часть по настоящему изобретению является способным связывать PD-1 обезьяны, обеспечивая простоту разработки лекарственного средства посредством предоставления соответствующей модели фармакологии и токсикологии на животных.

В одном варианте осуществления, настоящее изобретение относится к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело против PD-1 или его антигенсвязывающую часть по настоящему изобретению.

В одном варианте осуществления, настоящее изобретение относится к экспрессирующему вектору, содержащему последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую антитело против PD-1 или его антигенсвязывающую часть по настоящему изобретению.

В одном варианте осуществления, настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, содержащей экспрессирующий вектор, где экспрессирующий вектор содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую антитело против PD-1 или его антигенсвязывающую часть по настоящему изобретению.

В одном из вариантов осуществления, настоящее изобретение относится к композиции, содержащей антитело против PD-1 или его антигенсвязывающую часть, специфически связывающие PD-1 человека, и приемлемый носитель.

В одном из вариантов осуществления, настоящее изобретение относится к иммуноконъюгату, содержащему антитело против PD-1 или его антигенсвязывающую часть, связанные с лекарственным средством.

В одном из вариантов осуществления, настоящее изобретение относится к биспецифической молекуле, содержащей антитело против PD-1 или его антигенсвязывающую часть, связанные с второй функциональной группой, имеющей специфичность связывания, отличную от указанного антитела или его антигенсвязывающей части.

В одном из вариантов осуществления, настоящее изобретение относится к комбинации, содержащей по меньшей мере два или более антитела или их антигенсвязывающих частей, где по меньшей мере одно антитело или его антигенсвязывающая часть представляет собой антитело против PD-1 или его антигенсвязывающую часть по настоящему изобретению.

В другом варианте осуществления, антитело против PD-1 или его антигенсвязывающую часть по настоящему изобретению можно использовать для лечения заболеваний, при которых активность PD-1 является вредной, таких как различные злокачественные опухоли, различные инфекции. В одном из вариантов осуществления, антитело против PD-1 или его антигенсвязывающую часть по настоящему изобретению можно использовать для лечения аутоиммунных нарушений.

В одном из вариантов осуществления, антитело против PD-1 или его антигенсвязывающую часть по настоящему изобретению можно использовать для лечения злокачественной опухоли, выбранной из NSCLC, SCLC, RCC, cHL, SCCHN, уротелиальной карциномы, колоректального рака, ESCC, первичной медиастинальной крупноклеточной B-клеточной лимфомы, злокачественной опухоли с высокой микросателлитной нестабильностью, рака желудка, рака шейки матки, карциномы из клеток Меркеля, эндометриальной карциномы и злокачественной опухоли с высокой мутационной нагрузкой опухоли (TMB-H), где активность PD-1 умножена.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В одном варианте осуществления, CDR1 тяжелой цепи (далее в настоящем описании обозначено как CDRH1) антитела против PD-1 или его антигенсвязывающей части по настоящему изобретению имеет аминокислотную последовательность общей формулы (I): X_1a-A_1a-X_2a-A_2a, где

X_1a представляет собой аминокислоту, выбранную из аспарагина, глицина и треонина;

A_1a представляет собой дипептид, выбранный из Tyr-Tyr и Ile-Thr;

X_2a представляет собой аминокислоту, выбранную из изолейцина, лейцина, валина, фенилаланина, метионина и аланина;

A_2a представляет собой одиночную аминокислоту или дипептид, или трипептид, или тетрапептид, выбранные из тирозина, аспарагина, серина, глицина, Asn-Ser, Asn-Ser-Gly и Ser-Asn-Ser-Gly, при условии, что аспарагин в качестве X_1aи метионин в качестве X_2a не присутствуют совместно.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления, CDRH1 тяжелой цепи антитела против PD-1 или его антигенсвязывающей части по настоящему изобретению имеет аминокислотную последовательность формулы (Ia): X_1a-Y-Y-X_2a-Y, где

X_1a представляет собой аминокислоту, выбранную из аспарагина и треонина;

X_2a представляет собой аминокислоту, выбранную из изолейцина, лейцина, валина, метионина и аланина, при условии, что аспарагин в качестве X_1a и метионин в качестве X_2a не присутствуют совместно.

В более предпочтительном варианте осуществления, CDRH1 антитела против PD-1 или его антигенсвязывающей части по настоящему изобретению представляет собой TYYIY.

В альтернативном предпочтительном варианте осуществления, CDRH1 антитела против PD-1 или его антигенсвязывающей части по настоящему изобретению представляет собой GITFSNSG.

В одном варианте осуществления, CDR2 тяжелой цепи (далее в настоящем описании обозначено как CDRH2) антитела против PD-1 или его антигенсвязывающей части по настоящему изобретению имеет аминокислотную последовательность общей формулы (II): A_1b-X_1b-A_2b-X_2b-X_3b-A_3b-X_4b-X_5b-X_6b-X_7b-X_8b-A_4b, где

A_1b необязательно присутствует, и когда присутствует, представляет собой глицин;

X_1bпредставляет собой аминокислоту, выбранную из метионина, изолейцина, лейцина, глицина, валина и аланина;

A_2b представляет собой трипептид или тетрапептид, выбранный из Asn-Pro-Ser-Asn или Trp-Tyr-Asp;

Каждый из X_2b и X_3b независимо представляет собой аминокислоту, выбранную из глицина и серина;

A_3b представляет собой одиночную аминокислоту или дипептид, выбранные из лизина или Thr-Asn;

X_4b представляет собой аминокислоту, выбранную из тирозина, аргинина и фенилаланина;

X_5b представляет собой аминокислоту, выбранную из серина, тирозина и аспарагина;

X_6b может необязательно присутствовать, и когда присутствует, представляет собой аминокислоту, выбранную из глутаминовой кислоты и глутамина;

X_7b может необязательно присутствовать, и когда присутствует, представляет собой аминокислоту, выбранную из аспарагина и лизина;

X_8b может необязательно присутствовать, и когда присутствует, представляет собой аминокислоту, выбранную из тирозина и фенилаланина;

A_4b может необязательно присутствовать, и когда присутствует, представляет собой лизин.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления, CDRH2 тяжелой цепи антитела против PD-1 или его антигенсвязывающей части по настоящему изобретению имеет аминокислотную последовательность формулы (IIa): G-X_1b-N-P-S-N-X_2b-X_3b-T-N-X_4b-X_5b-X_6b-X_7b-X_8b-K, где

X_1b представляет собой аминокислоту, выбранную из метионина, изолейцина, лейцина, глицина, валина и аланина;

Каждый из X_4b и X_8b независимо представляет собой аминокислоту, выбранную из тирозина и фенилаланина;

X_5b представляет собой аминокислоту, выбранную из серина и аспарагина;

X_6b представляет собой аминокислоту, выбранную из глутаминовой кислоты и глутамина;

X_7b представляет собой аминокислоту, выбранную из аспарагина и лизина.

В более предпочтительном варианте осуществления, CDRH2 антитела против PD-1 или его антигенсвязывающей части по настоящему изобретению выбрана из GVNPSNGGTNYNENYK, GVNPSNGGTNYNQNYK или GVNPSNSGTNYNENYK.

В альтернативном предпочтительном варианте осуществления, CDRH2 антитела против PD-1 или его антигенсвязывающей части по настоящему изобретению представляет собой IWYDGSKRY.

В одном варианте осуществления, CDR3 тяжелой цепи (далее в настоящем описании обозначено как CDRH3) антитела против PD-1 или его антигенсвязывающей части по настоящему изобретению имеет аминокислотную последовательность общей формулы (III): A_1c-X_1c-A_2c-X_2c-A_3c-X_3c-A_4c-X_4c-X_5c-A_5c, где

A_1c может необязательно присутствовать, и когда присутствует, представляет собой аргинин;

X_1c представляет собой аминокислоту, выбранную из аспарагиновой кислоты, аспарагина и глутаминовой кислоты;

A_2c представляет собой аминокислоту или дипептид, выбранные из аспарагина, серина и треонина или Tyr-Arg;

X_2c представляет собой аминокислоту, выбранную из тирозина, гистидина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, глицина и фенилаланина;

A_3c представляет собой аминокислоту, выбранную из аспарагиновой кислоты, тирозина, изолейцина, фенилаланина, гистидина и триптофана;

X_3c может необязательно присутствовать, и когда присутствует, представляет собой аминокислоту, выбранную из изолейцина, лейцина, валина, аланина, глутамина и метионина;

A_4c может необязательно присутствовать, и когда присутствует, представляет собой глицин;

X_4c может необязательно присутствовать, и когда присутствует, представляет собой аминокислоту, выбранную из тирозина, гистидина и фенилаланина;

X_5c может необязательно присутствовать, и когда присутствует, представляет собой аминокислоту, выбранную из аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты;

A_5c может необязательно присутствовать, и когда присутствует, представляет собой тирозин.

В одном из вариантов осуществления, CDRH3 тяжелой цепи антитела против PD-1 или его антигенсвязывающей части по настоящему изобретению имеет аминокислотную последовательность формулы (IIIa): R-X_1c-Y-R-X_2c-D-X_3c-G-X_4c-X_5c-Y, где

Каждый из X_1c и X_5c независимо представляет собой аминокислоту, выбранную из аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты;

Каждый из X_2c и X_4c независимо представляет собой аминокислоту, выбранную из тирозина, гистидина и фенилаланина;

X_3cпредставляет собой аминокислоту, выбранную из изолейцина, лейцина, валина, аланина, глутамина и метионина.

В более предпочтительном варианте осуществления CDRH3 антитела против PD-1 или его антигенсвязывающей части по настоящему изобретению выбран из RDYRYDMGFDY или RDYRYDMGYDY, или RDYRYDMGHDY.

В альтернативном предпочтительном варианте осуществления, CDRH3 антитела против PD-1 или его антигенсвязывающей части по настоящему изобретению представляет собой ESEY или NNDI, или NSDF, или NSDH, или NSDY, или NSGY, или NTDW, или NTDY.

В одном варианте осуществления, CDR1 легкой цепи (далее в настоящем описании обозначено как CDRL1) антитела против PD-1 или его антигенсвязывающей части по настоящему изобретению имеет аминокислотную последовательность общей формулы (IV): A_1d-X_1d-A_2d-X_2d-X_3d-A_3d-X_4d-A_4d-X_5d-A_5d, где

A_1d представляет собой дипептид или трипептид, выбранный из Gln-Ser или Arg-Ala-Ser;

X_1dпредставляет собой аминокислоту, выбранную из валина, глутаминовой кислоты и лизина;

A_2d представляет собой аминокислоту, выбранную из глицина и серина;

X_2d представляет собой аминокислоту, выбранную из изолейцина, лейцина, валина, аланина, серина и метионина;

X_3d представляет собой аминокислоту, выбранную из серина, тирозина и глутаминовой кислоты;

A_3d может необязательно присутствовать, и когда присутствует, представляет собой аминокислоту, выбранную из треонина;

X_4d может необязательно присутствовать, и когда присутствует, представляет собой аминокислоту, выбранную из серина, аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты.

A_4d может необязательно присутствовать, и когда присутствует, представляет собой тетрапептид Gly-Tyr-Ser-Tyr;

X_5d может необязательно присутствовать, и когда присутствует, представляет собой аминокислоту, выбранную из изолейцина, лейцина, валина, аланина и метионина;

A_5d может необязательно присутствовать, и когда присутствует, представляет собой гистидин.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления, CDRL1 легкой цепи (антитела против PD-1 или его антигенсвязывающей части по настоящему изобретению) имеет аминокислотную последовательность формулы (IVa): R-A-S-X_1d-G-X_2d-X_3d-T-X_4d-G-Y-S-Y-X_5d-H, где

X_1dпредставляет собой аминокислоту, выбранную из глутаминовой кислоты и лизина;

Каждый из X_2d и X_5d независимо представляет собой аминокислоту, выбранную из изолейцина, лейцина, валина, аланина и метионина;

X_3d представляет собой аминокислоту, выбранную из серина и глутаминовой кислоты;

X_4d представляет собой аминокислоту, выбранную из серина, аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты.

В более предпочтительном варианте осуществления CDRL1 антитела против PD-1 или его антигенсвязывающей части по настоящему изобретению представляет собой RASKGVSTSGYSYLH.

В альтернативном предпочтительном варианте осуществления CDRL1 антитела против PD-1 или его антигенсвязывающей части по настоящему изобретению представляет собой QSVSSY.

В одном варианте осуществления, CDRL2 легкой цепи (далее в настоящем описании обозначено как CDRL2) антитела против PD-1 или его антигенсвязывающей части имеет аминокислотную последовательность общей формулы (V): A_1e-X_1e-A_2e-X_2e-A_3e, где

A_1e может необязательно присутствовать, и когда присутствует, представляет собой дипептид Leu-Ala;

X_1e представляет собой аминокислоту, выбранную из серина, аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты;

A_2e представляет собой аминокислоту, выбранную из тирозина или аланина;

X_2e представляет собой аминокислоту, выбранную из изолейцина, лейцина, валина, аланина, серина и метионина;

A_3e может необязательно присутствовать, и когда присутствует, представляет собой дипептид Glu-Ser.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления, CDRL2 легкой цепи антитела против PD-1 или его антигенсвязывающей части имеет аминокислотную последовательность формулы (Va): L-A-X_1e-Y-X_2e-E-S, где

X_2e представляет собой аминокислоту, выбранную из изолейцина, лейцина, валина, аланина и метионина.

В более предпочтительном варианте осуществления CDRL2 антитела против PD-1 или его антигенсвязывающей части по настоящему изобретению представляет собой LASYLES.

В альтернативном предпочтительном варианте осуществления CDRL2 антитела против PD-1 или его антигенсвязывающей части по настоящему изобретению представляет собой DAS.

В одном варианте осуществления, CDR3 легкой цепи (далее в настоящем описании обозначено как CDRL3) антитела против PD-1 или его антигенсвязывающей части имеет аминокислотную последовательность общей формулы (VI): A_1f-X_1f-A_2f-X_2f-X_3f-X_4f-X_5f-X_6f, где

A_1f представляет собой дипептид, выбранный из Gln-His и Gln-Gln;

X_1f представляет собой аминокислотную последовательность, выбранную из серина, аргинина, аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты;

A_2f представляет собой аминокислоту, выбранную из аргинина и серина;

X_2f представляет собой аминокислоту, выбранную из аспарагиновой кислоты, аспарагина и глутаминовой кислоты;

Каждый из X_3f и X_5f независимо представляет собой аминокислотную последовательность, выбранную из изолейцина, лейцина, валина, аланина, триптофана, аргинина и метионина;

X_4f представляет собой пролин;

X_6f представляет собой треонин.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления, CDRL3 легкой цепи антитела против PD-1 или его антигенсвязывающей части имеет аминокислотную последовательность формулы (VIa): Q-H-X_1f-R-X_2f-X_3f-P-X_4f-T, где

X_2f представляет собой аминокислоту, выбранную из аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты;

Каждый из X_3f и X_4f независимо представляет собой аминокислотную последовательность, выбранную из изолейцина, лейцина, валина, аланина и метионина.

В более предпочтительном варианте осуществления CDRL3 антитела против PD-1 или его антигенсвязывающей части по настоящему изобретению представляет собой QHSRDLPLT.

В альтернативном предпочтительном варианте осуществления CDRL3 антитела против PD-1 или его антигенсвязывающей части по настоящему изобретению представляет собой QQSSNWPRT.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления, CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 и CDRL3 антитела против PD-1 или его антигенсвязывающей части по настоящему изобретению выбраны из аминокислотных последовательностей, как приведено ниже в таблице 1.

Таблица 1: Аминокислотные последовательности области CDR
Seq. ID No.	Область CDR	Аминокислотная последовательность области CDR
1	CDRH1	NYYLY
2	CDRH1	NYYVY
3	CDRH1	NYYIY
4	CDRH1	TYYIY
5	CDRH1	TYYVY
6	CDRH1	TYYMY
7	CDRH1	GITFSNSG
8	CDRH2	GVNPSNGGTNYNENYK
9	CDRH2	GVNPSNSGTNYNENYK
10	CDRH2	GVNPSNSGTNYNQNYK
11	CDRH2	GVNPSNGSTNYNQNYK
12	CDRH2	GMNPSNGGTNYNENYK
13	CDRH2	GMNPSNGSTNYNQNYK
14	CDRH2	GVNSSNGGTNYNENYK
15	CDRH2	GINSSNGGTNYNENYK
16	CDRH2	GVNSSNGSTNYNENYK
17	CDRH2	GLNSSNGSTNYNENYK
18	CDRH2	GVNPSNGGTNYSEKYK
19	CDRH2	GVNPSNGGTNYSEKFK
20	CDRH2	GLNPSNSGTNYNENYK
21	CDRH2	GLNPSNGSTNYNENYK
22	CDRH2	GINPSNGGTNYNENYK
23	CDRH2	GVNPSNGGTNFNENYK
24	CDRH2	GVNPSNGGTNYNEKYK
25	CDRH2	GVNPSNGGTNYNENFK
26	CDRH2	GVNPSNGGTNYNQNYK
27	CDRH2	GVNPSNSGTNYNQNYK
28	CDRH2	GVNPSNGSTNYNQNYK
29	CDRH2	GMNPSNGGTNYNENYK
30	CDRH2	IWYDGSKRY
31	CDRH3	RDYRFDMGYDY
32	CDRH3	RDYRYDMGFDY
33	CDRH3	RDYRYDMGYDY
34	CDRH3	REYRFDMGYDY
35	CDRH3	REYRFDMGYEY
36	CDRH3	REYRYDMGYEY
37	CDRH3	RDYRYDLGYDY
38	CDRH3	REYRYDMGFDY
39	CDRH3	RDYRYDMGFEY
40	CDRH3	RDYRYDMGYEY
41	CDRH3	REYRYDMGYEY
42	CDRH3	RDYRYDIGFDY
43	CDRH3	REYRYDIGYDY
44	CDRH3	REYRYDIGYEY
45	CDRH3	RDYRYDQGYDY
46	CDRH3	REYRYDQGYEY
47	CDRH3	RDYRYDMGHDY
48	CDRH3	ESEY
49	CDRH3	NNDI
50	CDRH3	NSDF
51	CDRH3	NSDH
52	CDRH3	NSDY
53	CDRH3	NSGY
54	CDRH3	NTDW
55	CDRH3	NTDY
56	CDRL1	RASKGVSTSGYSFLH
57	CDRL1	RASKGVSTSGYSWLH
58	CDRL1	RASKGVSTSGYSYLY
59	CDRL1	RASKGVSTSGYSYIY
60	CDRL1	RASKGVSTSGYSFLY
61	CDRL1	RASKGVSTSGYTYLY
62	CDRL1	RASKNVSTSGYSYLY
63	CDRL1	RASEGVSTSGYSYLH
64	CDRL1	RASEGVSTSGFSYIH
65	CDRL1	RASKNVSTTGFSYLH
66	CDRL1	RASKNVSSTSYSYLH
67	CDRL1	RASKNVSSTSFSYLY
68	CDRL1	RASKGVSSTSFSYIH
69	CDRL1	RASRGISTSGYSYIH
70	CDRL1	RASEGISTSGYSYIH
71	CDRL1	RASEGLDTSGYSYIH
72	CDRL1	RASEGLETSGYSYIH
73	CDRL1	RASEGISTSGYSYVH
74	CDRL1	RASKGISTDGYSYMH
75	CDRL1	RASKGISTEGYSYMH
76	CDRL1	RADKGVSTSGYSYMH
77	CDRL1	RASKGVSTSGYSYLH
78	CDRL1	RASKSVSTSGFSYLH
79	CDRL1	RASQSVSSYLA
80	CDRL1	RGSKGVSSGIYSYLH
81	CDRL1	QSVSSY
82	CDRL2	IASYLES
83	CDRL2	MASYLES
84	CDRL2	VASYLES
85	CDRL2	FASYLES
86	CDRL2	AASYLES
87	CDRL2	IASFLES
88	CDRL2	IASWLES
89	CDRL2	IASHLES
90	CDRL2	MASFLES
91	CDRL2	MASWLES
92	CDRL2	LASYLQS
93	CDRL2	IASYLQS
94	CDRL2	IASFLQS
95	CDRL2	LASFLQS
96	CDRL2	LASWLQS
97	CDRL2	IASWLQS
98	CDRL2	VASWLQS
99	CDRL2	AASFLES
100	CDRL2	LADYLES
101	CDRL2	LADYIES
102	CDRL2	LADYVES
103	CDRL2	LAEYMES
104	CDRL2	LAEYVES
105	CDRL2	LADYLEDY
106	CDRL2	LADYIEDY
107	CDRL2	LAEYLEDY
108	CDRL2	LASYLES
109	CDRL2	LASNLES
110	CDRL2	DASNRAT
111	CDRL2	KASSLES
112	CDRL2	DAS
113	CDRL3	QHSRELPLT
114	CDRL3	QHSRNLPLT
115	CDRL3	QHSREIPLT
116	CDRL3	QHSRNIPLT
117	CDRL3	QHSRDIPLT
118	CDRL3	QHSRDFPLT
119	CDRL3	QHSRNFPLT
120	CDRL3	QHSRDIPIT
121	CDRL3	QHSRDFPIT
122	CDRL3	QRSRDLPLT
123	CDRL3	QKSRDLPLT
124	CDRL3	QYSRDLPIT
125	CDRL3	QRSRDIPLT
126	CDRL3	QKSRDIPLT
127	CDRL3	QYSRDIPLT
128	CDRL3	QHERDLPLT
129	CDRL3	QHERDIPLT
130	CDRL3	QHRRDIPVT
131	CDRL3	QHDRDLPMT
132	CDRL3	QHSRDLPLT
133	CDRL3	QHSWELPLT
134	CDRL3	QHYSNYPLT
135	CDRL3	QHSRDAPLT
136	CDRL3	QQSSNWPRT

В одном из вариантов осуществления, настоящее изобретение относится к антителу против PD-1 или его антигенсвязывающей части, содержащим:

(a) CDRH1 общей формулы (I): X_1a-A_1a-X_2a-A_2a;

(b) CDRH2 общей формулы (II): A_1b-X_1b-A_2b-X_2b-X_3b-A_3b-X_4b-X_5b-X_6b-X_7b- X_8b-A_4b;

(c) CDRH3общей формулы (III): A_1c-X_1c-A_2c-X_2c-A_3c-X_3c-A_4c-X_4c-X_5c-A_5c;

(d) CDRL1 общей формулы (IV): A_1d-X_1d-A_2d-X_2d-X_3d-A_3d-X_4d-A_4d-X_5d-A_5d;

(e) CDRL2 общей формулы (V): A_1e-X_1e-A_2e-X_2e-A_3eи

(f) CDRL3 общей формулы (VI): A_1f-X_1f-A_2f-X_2f -X_3f- X_4f -X_5f-X_6f,

где

A_2a представляет собой одиночную аминокислоту или дипептид, или трипептид, или тетрапептид, выбранные из тирозина, аспарагина, серина, глицина, Asn-Ser, Asn-Ser-Gly и Ser-Asn-Ser-Gly;

A_4b может необязательно присутствовать, и когда присутствует, представляет собой лизин;

A_5c может необязательно присутствовать, и когда присутствует, представляет собой тирозин;

X_1d представляет собой аминокислоту, выбранную из валина, глутаминовой кислоты и лизина;

X_4d может необязательно присутствовать, и когда присутствует, представляет собой аминокислоту, выбранную из серина, аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты;

A_5d может необязательно присутствовать, и когда присутствует, представляет собой гистидин;

A_3e может необязательно присутствовать, и когда присутствует, представляет собой дипептид Glu-Ser;

X_4f представляет собой пролин;

X_6f представляет собой треонин,

при условии, что аспарагин в качестве X_1aи метионин в качестве X_2a не присутствуют совместно.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления, настоящее изобретение относится к антителу против PD-1 или его антигенсвязывающей части, содержащим:

(a) CDRH1, содержащую аминокислотную последовательность формулы (Ia): X_1a-Y-Y-X_2a-Y;

(b) CDRH2, содержащую аминокислотную последовательность формулы (IIa):G-X_1b-N-P-S-N-X_2b-X_3b-T-N-X_4b-X_5b-X_6b-X_7b-X_8b-K, и

(c) CDRH3, содержащую аминокислотную последовательность формулы (IIIa): R-X_1c-Y-R-X_2c-D-X_3c-G-X_4c-X_5c-Y;

(d) CDRL1, содержащую аминокислотную последовательность формулы (IVa): R-A-S-X_1d-G-X_2d-X_3d-T-X_4d-G-Y-S-Y-X_5d-H;

(e) CDRL2, содержащую аминокислотную последовательность формулы (Va): L-A-X_1e-Y-X_2e-E-S;

(f) CDRL3, содержащую аминокислотную последовательность формулы (VIa): Q-H-X_1f-R- X_2f-X_3f-P-X_4f-T,

где

X_2a представляет собой аминокислоту, выбранную из изолейцина, лейцина, валина, метионина и аланина;

X_7b представляет собой аминокислоту, выбранную из аспарагина и лизина;

X_3c представляет собой аминокислоту, выбранную из изолейцина, лейцина, валина, аланина, глутамина и метионина;

X_1d представляет собой аминокислоту, выбранную из глутаминовой кислоты и лизина

X_4d представляет собой аминокислоту, выбранную из серина, аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты;

X_2e представляет собой аминокислоту, выбранную из изолейцина, лейцина, валина, аланина и метионина;

Каждый из X_3f и X_4f независимо представляет собой аминокислотную последовательность, выбранную из изолейцина, лейцина, валина, аланина и метионина,

В одном из предпочтительных вариантов осуществления, аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2 и CDRH3 антитела против PD-1 или его антигенсвязывающей части по настоящему изобретению представляют собой TYYIY, GVNPSNGGTNYNENYK и RDYRYDMGFDY, соответственно.

В другом из предпочтительных вариантов осуществления, аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2 и CDRH3 антитела против PD-1 или его антигенсвязывающей части по настоящему изобретению представляют собой TYYIY, GVNPSNGGTNYNENYK и RDYRYDMGYDY, соответственно.

В другом из предпочтительных вариантов осуществления, аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2 и CDRH3 антитела против PD-1 или его антигенсвязывающей части по настоящему изобретению представляют собой TYYIY, GVNPSNGGTNYNENYK и RDYRYDMGHDY, соответственно.

В другом из предпочтительных вариантов осуществления, аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2 и CDRH3 антитела против PD-1 или его антигенсвязывающей части по настоящему изобретению представляют собой TYYIY, GVNPSNSGTNYNENYK и RDYRYDMGFDY, соответственно.

В другом из предпочтительных вариантов осуществления, аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2 и CDRH3 антитела против PD-1 или его антигенсвязывающей части по настоящему изобретению представляют собой TYYIY, GVNPSNSGTNYNENYK и RDYRYDMGYDY, соответственно.

В другом из предпочтительных вариантов осуществления, аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2 и CDRH3 антитела против PD-1 или его антигенсвязывающей части по настоящему изобретению представляют собой TYYIY, GVNPSNSGTNYNENYK и RDYRYDMGHDY, соответственно.

В другом из предпочтительных вариантов осуществления, аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2 и CDRH3 антитела против PD-1 или его антигенсвязывающей части по настоящему изобретению представляют собой TYYIY, GVNPSNGGTNYNQNYK и RDYRYDMGFDY, соответственно.

В другом из предпочтительных вариантов осуществления, аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2 и CDRH3 антитела против PD-1 или его антигенсвязывающей части по настоящему изобретению представляют собой TYYIY, GVNPSNGGTNYNQNYK и RDYRYDMGYDY, соответственно.

В другом из предпочтительных вариантов осуществления, аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2 и CDRH3 антитела против PD-1 или его антигенсвязывающей части по настоящему изобретению представляют собой TYYIY, GVNPSNGGTNYNQNYK и RDYRYDMGHDY, соответственно.

В другом из предпочтительных вариантов осуществления, аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2 и CDRH3 антитела против PD-1 или его антигенсвязывающей части по настоящему изобретению представляют собой GITFSNSG, IWYDGSKRY и NSDF, соответственно.

В другом из предпочтительных вариантов осуществления, аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2 и CDRH3 антитела против PD-1 или его антигенсвязывающей части по настоящему изобретению представляют собой GITFSNSG, IWYDGSKRY и NSDH, соответственно.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления, аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2 и CDRH3 антитела против PD-1 или его антигенсвязывающей части по настоящему изобретению представляют собой GITFSNSG, IWYDGSKRY и NSDY, соответственно.

В другом из предпочтительных вариантов осуществления, аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2 и CDRH3 антитела против PD-1 или его антигенсвязывающей части по настоящему изобретению представляют собой GITFSNSG, IWYDGSKRY и NTDW, соответственно.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления, аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2 и CDRH3 антитела против PD-1 или его антигенсвязывающей части по настоящему изобретению представляют собой GITFSNSG, IWYDGSKRY и NTDY, соответственно.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления, аминокислотные последовательности CDRL1, CDRL2 и CDRL3 антитела против PD-1 или его антигенсвязывающей части по настоящему изобретению представляют собой RASKGVSTSGYSYLH, LASYLES и QHSRDLPLT, соответственно.

В другом из предпочтительных вариантов осуществления, аминокислотные последовательности CDRL1, CDRL2 и CDRL3 антитела против PD-1 или его антигенсвязывающей части по настоящему изобретению представляют собой QSVSSY, DAS и QQSSNWPRT, соответственно.

В другом варианте осуществления, настоящее изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающей части, содержащим:

(a) CDRH1, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6 и 7;

(b) CDRH2, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 и 30;

(c) CDRH3, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 и 55;

(d) CDRL1, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79,80 и 81;

(e) CDRL2, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111 и 112; и

(f) CDRL3, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135 и 136;

где антитело специфически связывает PD-1, предпочтительно, PD-1 человека.

В одном из вариантов осуществления, HCVR и LCVR антитела против PD-1 или его антигенсвязывающей части по настоящему изобретению выбраны из аминокислотных последовательностей, как приведено ниже в таблице 2.

Таблица 2: Аминокислотные последовательности вариабельной области
Seq ID No.	Вариабельная область	Аминокислотная последовательность вариабельной области
137	HCVR IP-H4	QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYYIYWVRQAPGQGLEWMGGVNPSNGGTNYNENYKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRYDMGFDYWGQGTTVTVSS
138	HCVR IP-H4.2	QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYYIYWVRQAPGQGLEWMGGVNPSNGGTNYNENYKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRYDMGYDYWGQGTTVTVSS
139	HCVR IP-H4.2 (Y.H)	QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYYIYWVRQAPGQGLEWMGGVNPSNGGTNYNENYKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRYDMGHDYWGQGTTVTVSS
140	HCVR IP-H4.19	QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYYIYWVRQAPGQGLEWMGGVNPSNSGTNYNENYKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRYDMGFDYWGQGTTVTVSS
141	HCVR IP-H4.19 (F.Y)	QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYYIYWVRQAPGQGLEWMGGVNPSNSGTNYNENYKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRYDMGYDYWGQGTTVTVSS
142	HCVR IP-H4.19 (Y.H)	QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYYIYWVRQAPGQGLEWMGGVNPSNSGTNYNENYKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRYDMGHDYWGQGTTVTVSS
143	HCVR IP-H4.36	QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYYIYWVRQAPGQGLEWMGGVNPSNGGTNYNQNYKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRYDMGFDYWGQGTTVTVSS
144	HCVR IP-H4.36 (F.Y)	QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYYIYWVRQAPGQGLEWMGGVNPSNGGTNYNQNYKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRYDMGYDYWGQGTTVTVSS
145	HCVR IP-H4.36 (Y.H)	QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYYIYWVRQAPGQGLEWMGGVNPSNGGTNYNQNYKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRYDMGHDYWGQGTTVTVSS
146	HCVR N5	QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNSDFWGQGTLVTVSSASTKG
147	HCVR N6	QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNSDHWGQGTLVTVSSASTKG
148	HCVR N7	QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNSDYWGQGTLVTVSSASTKG
149	HCVR N9	QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNTDWWGQGTLVTVSSASTKG
150	HCVR N10	QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNTDYWGQGTLVTVSSASTKG
151	LCVR IP-L1	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIK
152	LCVR NL	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIK

В одном из вариантов осуществления, вариабельная область тяжелой цепи антитела против PD-1 или его антигенсвязывающей части по настоящему изобретению состоит из CDRH1, CDRH2 и CDRH3, содержащих аминокислотные последовательности, выбранные из приведенной ниже таблицы 3.

Таблица 3: области CDR из выбранных последовательностей HCVR
Seq ID No. HCVR	Области CDR из последовательностей HCVR
Seq ID No. HCVR	CDRH1	CDRH2	CDRH3
137	TYYIY	GVNPSNGGTNYNENYK	RDYRYDMGFDY
138	TYYIY	GVNPSNGGTNYNENYK	RDYRYDMGYDY
139	TYYIY	GVNPSNGGTNYNENYK	RDYRYDMGHDY
140	TYYIY	GVNPSNSGTNYNENYK	RDYRYDMGFDY
141	TYYIY	GVNPSNSGTNYNENYK	RDYRYDMGYDY
142	TYYIY	GVNPSNSGTNYNENYK	RDYRYDMGHDY
143	TYYIY	GVNPSNGGTNYNQNYK	RDYRYDMGFDY
144	TYYIY	GVNPSNGGTNYNQNYK	RDYRYDMGYDY
145	TYYIY	GVNPSNGGTNYNQNYK	RDYRYDMGHDY
146	GITFSNSG	IWYDGSKRY	NSDF
147	GITFSNSG	IWYDGSKRY	NSDH
148	GITFSNSG	IWYDGSKRY	NSDY
149	GITFSNSG	IWYDGSKRY	NTDW
150	GITFSNSG	IWYDGSKRY	NTDY

В одном из вариантов осуществления, вариабельная область легкой цепи антитела против PD-1 или его антигенсвязывающей части по настоящему изобретению состоит из CDRL1, CDRL2 и CDRL3, содержащих аминокислотные последовательности, выбранные из приведенной ниже таблицы 4.

Таблица 4: области CDR из выбранных последовательностей LCVR
Seq ID No. LCVR	Области CDR из последовательностей LCVR
Seq ID No. LCVR	CDRL1	CDRL2	CDRL3
151	RASKGVSTSGYSYLH	LASYLES	QHSRDLPLT
152	QSVSSY	DAS	QQSSNWPRT

Соответственно, настоящее изобретение относится к антителу против PD-1 или его антигенсвязывающей части, содержащим вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где:

(a) вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145146147, 148, 149 и 150;

(b) вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:151 и 152.

Предпочтительные комбинации CDR:

Предпочтительная комбинация CDR антитела против PD-1 или его антигенсвязывающей части по настоящему изобретению содержит:

(a) CDRH1 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO:4;

(b) CDRH2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO:8;

(c) CDRH3 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO:32;

(d) CDRL1 вариабельной области легкой цепи, содержащую SEQ ID NO:77;

(e) CDRL2 вариабельной области легкой цепи, содержащую SEQ ID NO:108; и

(f) CDRL3 вариабельной области легкой цепи, содержащую SEQ ID NO:132.

Другая предпочтительная комбинация CDR антитела против PD-1 или его антигенсвязывающей части по настоящему изобретению содержит:

(b) CDRH2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO:9;

(b) CDRH2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO:26;

Более предпочтительная комбинация CDR антитела против PD-1 или его антигенсвязывающей части по настоящему изобретению содержит:

(c) CDRH3 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO:33;

(c) CDRH3 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO:47;

(a) CDRH1 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO:7;

(b) CDRH2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO:30;

(c) CDRH3 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO:50;

(d) CDRL1 вариабельной области легкой цепи, содержащую SEQ ID NO:81;

(e) CDRL2 вариабельной области легкой цепи, содержащую SEQ ID NO:112; и

(f) CDRL3 вариабельной области легкой цепи, содержащую SEQ ID NO:136.

(c) CDRH3 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO:51;

(c) CDRH3 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO:52;

(c) CDRH3 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO:54;

(c) CDRH3 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO:55;

Предпочтительные комбинации вариабельных областей:

Предпочтительная комбинация HCVR и LCVR антитела против PD-1 или его антигенсвязывающей части по настоящему изобретению содержит:

(a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:137; и

(b) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:151.

(a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:138; и

(a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:139; и

(a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:140; и

Другая предпочтительная комбинация HCVR и LCVR антитела против PD-1 или его антигенсвязывающей части по настоящему изобретению содержит:

(a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:141; и

(a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:142; и

(a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:143; и

(a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:144; и

(a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:145; и

(a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:146; и

(b) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:152.

(a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:147; и

(a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:148; и

(a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:149; и

(a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:150; и

В одном из вариантов осуществления, антитело или его антигенсвязывающая часть по настоящему изобретению имеет по меньшей мере одну из следующих характеристик:

(a) вступает в перекрестную реакцию с PD-1 из видов, отличных от человека;

(b) более высокая специфичность связывания для PD-1 человека;

(c) стимулирует секрецию цитокина IL-2;

(d) стимулирует более высокую секрецию IFN-гамма;

(e) блокирует взаимодействие рецептора PD-1 с его природным лигандом PD-L1 и/или PD-L2;

(f) стимулирует пролиферацию T-клеток и

(g) имеет улучшенное время полужизни в кровотоке.

В одном из вариантов осуществления, антитело против PD-1 или его антигенсвязывающая часть имеет K_D 10^-10 M или менее, более предпочтительно, 10^-11 M или менее, для антигена PD-1. В предпочтительном варианте осуществления, антитело против PD-1 или его антигенсвязывающая часть по настоящему изобретению связывает PD-1 человека с K_D 10^-10 M или менее, предпочтительно, 10^-11 M или менее. Значение K_Dпредставляет собой измерение аффинности связывания антитела по отношению к его антигену-мишени. Такую аффинность связывания и кинетику связывания антител против PD-1 можно исследовать посредством анализа SPR. Указанный анализ является очень хорошо известным в данной области для измерения аффинности антитела или его антигенсвязывающей части по отношению к его антигену-мишени, и специалисту в данной области хорошо известны способы проведения такого анализа.

В одном из вариантов осуществления, антитело против PD-1 или его антигенсвязывающая часть по настоящему изобретению имеет высокую специфичность для PD-1. Антитело против PD-1 по настоящему изобретению имеет высокую аффинность для антигена/эпитопа PD-1 человека. В другом варианте осуществления, антитело против PD-1 или его антигенсвязывающая часть по настоящему изобретению имеет высокую специфичность связывания для PD-1 человека. Специфичность связывания исследуют способом SPR. «Высокая специфичность для PD-1 или для PD-1 человека» означает, что антитело или его антигенсвязывающая часть не связывает другие коингибирующие рецепторы T-клетки с такой же аффинностью.

В одном из вариантов осуществления, антитело против PD-1 или его антигенсвязывающая часть вступает в перекрестную реакцию с PD-1 из другого вида, такого как яванский макак и т.д. с достаточной аффинностью.

В другом варианте осуществления, антитело против PD-1 или его антигенсвязывающая часть по настоящему изобретению блокирует взаимодействие PD-1 с его лигандом в анализе поверхностного плазмонного резонанса.

В одном варианте осуществления, антитело против PD-1 или его антигенсвязывающая часть по настоящему изобретению стимулирует секрецию цитокина IL-2. В таком варианте осуществления, антитело против PD-1 или его антигенсвязывающая часть по настоящему изобретению, когда являются доступными в ходе MLR, приводят к увеличенной продукции IL-2, как измерено посредством ELISA.

В одном варианте осуществления, антитело против PD-1 или его антигенсвязывающая часть по настоящему изобретению стимулирует более высокую секрецию IFN-гамма. Термин «более высокая» обозначен в настоящем описании по отношению к известному антителу против PD-1. В другом варианте осуществления, антитело против PD-1 или его антигенсвязывающая часть по настоящему изобретению, когда являются доступными в ходе MLR, приводят к увеличенной продукции IFN-гамма, как измерено посредством ELISA. В эксперименты по трансплантации костного мозга с использованием мышей IFN-γR-/- включали IFN-γ в качестве существенного звена для контроля опосредованной PD-1-инфильтрации опухоли T-клетками. Также оценивали и подтвердили, что другие индуцируемые IFN-γ хемокины также могут играть роль в синергическом эффекте антитела против PD-1 на ACT. (7) Кроме того, опубликовано, что IFN-γ является важным маркером для прогнозирования ответа на блокирование иммунной контрольной точки (8).

В одном варианте осуществления, антитело против PD-1 или его антигенсвязывающая часть по настоящему изобретению стимулирует пролиферацию T-клеток. В таком варианте осуществления, антитело против PD-1 или его антигенсвязывающая часть по настоящему изобретению, когда являются доступными в ходе MLR, приводят к увеличенной пролиферации T-клеток, как измерено посредством анализа измерения пролиферации. Такие анализы известны специалисту в данной области.

В одном из вариантов осуществления, антитело против PD-1 или его антигенсвязывающая часть по настоящему изобретению имеет улучшенные фармакокинетические свойства.

В одном из вариантов осуществления, антитело против PD-1 или его антигенсвязывающая часть по настоящему изобретению имеет увеличенное время полужизни у человека.

Фармакокинетический профиль антитела против PD1 по настоящему изобретению определяют у яванского макака. Поскольку намеченным способом введения у пациентов является внутривенный, антитело против PD1 вводят внутривенно животным в исследованиях, в буферном растворе. Кратко, исследование включает 3 животных/пол/группу, которых подвергают введению на уровнях дозирования вплоть до 50 мг/кг. Исследуют PD эффекты антитела против PD1, такие как модуляция популяции периферических иммуноцитов, и изменение абсолютного количества лимфоцитов (ALC).

В одном варианте осуществления, антитело против PD-1 или его антигенсвязывающая часть по настоящему изобретению блокирует взаимодействие рецептора PD-1 с его природными лигандами PD-L1 и/или PD-L2. Антитела против PD-1 по настоящему изобретению тестируют по их способности блокировать связывание лигандов PD-L1 и PD-L2 с PD-1, экспрессированным на клетках, с использованием реакции смешанной культуры лимфоцитов (MLR). Антитела против PD-1 по настоящему изобретению тестируют по их способности блокировать связывание лигандов PD-L1 и PD-L2 с PD-1 посредством SPR.

В одном из вариантов осуществления, эффект связывания антитела против PD-1 или его антигенсвязывающей части по настоящему изобретению с PD-1 на активацию T-клеток анализируют посредством подходящих анализов, известных в данной области. Антитело против PD-1 или его антигенсвязывающая часть по настоящему изобретению связывает PD-1, экспрессированный на экспрессирующей PD-1 трансфицированной линии клеток. Кроме того, антитела против PD-1 или их антигенсвязывающая часть по настоящему изобретению связываются с мононуклеарными клетками периферической крови (PBMC).

Антитела по настоящему изобретению могут являться полноразмерными (например, антитело IgG1 или IgG4) или могут содержать только антигенсвязывающую часть (например, фрагмент Fab, F(ab')2 или scFv), и необязательно, являться модифицированными для влияния на функциональность, например, для уничтожения остаточных эффекторных функций, таких как активность ADCC и CDC.

В одном из вариантов осуществления, аминокислотные последовательности константной области антитела против PD-1 представляют собой константную область IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM, IgD или гибрид упомянутых константных областей, таких как IgG2/IgG4, предпочтительно, IgG1 или IgG4, более предпочтительно, IgG4.

В другом варианте осуществления, область Fc антител по настоящему изобретению изменяют посредством замены по меньшей мере одного аминокислотного остатка на другой аминокислотный остаток для изменения эффекторной функции (функций) антитела.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления, аминокислотные последовательности константной области тяжелой цепи антитела против PD-1 по настоящему изобретению имеют мутацию в его шарнирной области, предпочтительно, мутацию серина до пролина в шарнирной области константной области антитела IgG4. Человеческие антитела IgG4 могут существовать в двух формах, которые ассоциированы с гетерогенностью шарнира. В одной форме, антитело содержит стабильную четырехцепочечную конструкцию приблизительно 150-160 кДа, в которой димеры удерживаются вместе дисульфидной связью между тяжелыми цепями. Во второй форме димеры не связаны межцепочечными дисульфидными связями, и образуется молекула приблизительно 75-80 кДа, состоящая из ковалентно связанных легкой и тяжелой цепей (полуантитело). Последние формы было чрезвычайно сложно отделять от полноразмерного антитела, даже после аффинной очистки. Частота образования второй формы в различных интактных изотипах IgG4 обусловлена, но без ограничения, структурными различиями, ассоциированными с шарнирной областью изотипа антитела. Одиночная аминокислотная замена в шарнирной области шарнира человеческого IgG4 может значительно уменьшать образование второй формы (6), до уровней, обычно наблюдаемых с использованием человеческого шарнира IgG1. Полноразмерные антитела, содержащие CDR или вариабельные области по настоящему изобретению дополнительно содержат указанную одиночную аминокислотную замену (т.е. S228P), когда оно разработано в форме IgG4.

В одном варианте осуществления, антитело против PD-1 по настоящему изобретению имеет активность ADCC и/или CDC. В предпочтительном варианте осуществления, антитело против PD-1 по настоящему изобретению с модифицированной или уменьшенной, или отсутствующей активностью ADCC и/или CDC представляет собой антитело против PD-1 с константной областью IgG1 или IgG4, или IgG2/IgG4. В другом варианте осуществления, область Fc антител по настоящему изобретению изменяют посредством замены по меньшей мере одного аминокислотного остатка на другой аминокислотный остаток для увеличения активность ADCC и/или CDC. В одном из предпочтительных вариантов осуществления, антитело против PD-1 по настоящему изобретению с увеличенной активностью ADCC и/или CDC представляет собой антитело против PD-1 с константной областью IgG1 или IgG1 с по меньшей мере одним измененным аминокислотным остатком. IgG1 с константной областью с по меньшей мере одним измененным аминокислотным остатком, как обозначено в настоящем описании, представляет собой модифицированную IgG1, которое может обеспечивать более высокую активность ADCC и/или CDC, по сравнению с IgG1 без такой модификации.

В другом предпочтительном варианте осуществления, антитело против PD-1 по настоящему изобретению с уменьшенной или отсутствующей активностью ADCC и/или CDC представляет собой антитело против PD-1 с константной областью IgG1 или IgG1 с по меньшей мере одним измененным аминокислотным остатком. IgG1 с константной областью с по меньшей мере одним измененным аминокислотным остатком, как обозначено в настоящем описании, представляет собой модифицированное IgG1, которое может обеспечивать уменьшенную или отсутствующую активность ADCC и/или CDC, по сравнению с IgG1 без такой модификации.

В другом предпочтительном варианте осуществления, антитело против PD-1 по настоящему изобретению с уменьшенной или отсутствующей активностью ADCC и/или CDC представляет собой антитело против PD-1 с IgG4 или IgG4 с константной областью с по меньшей мере одним измененным аминокислотным остатком. IgG4 с константной областью с по меньшей мере одним измененным аминокислотным остатком, как обозначено в настоящем описании, представляет собой модифицированное IgG4, которое может обеспечивать уменьшенную или отсутствующую активность ADCC и/или CDC, по сравнению с IgG4 без такой модификации.

В другом аспекте антитело против PD-1 по настоящему изобретению имеет увеличенное связывание FcRn и увеличенное время полужизни с модифицированной или уменьшенной, или отсутствующей активностью ADCC и/или CDC. В одном из вариантов осуществления, антитело против PD-1 по настоящему изобретению имеет аминокислотные последовательности константной области IgG1 или IgG4 с мутацией P329G и/или M428L и N434S. Константные области антитела против PD-1 с упомянутыми всеми тремя мутациями в константной области IgG1 и IgG4 обозначены в настоящем описании как IgG1(GLS) и IgG4(GLS), соответственно.

В предпочтительном варианте осуществления, антитело против PD-1 по настоящему изобретению содержит одиночную аминокислотную замену, выбранную из S228P, P329G, M428L, N434S и их подходящих комбинаций.

В одном из вариантов осуществления, антитело против PD-1 по настоящему изобретению представляет собой моноклональное антитело или биспецифическое антитело, или поликлональное антитело, предпочтительно, моноклональные антитело.

В одном из вариантов осуществления, антитело или его антигенсвязывающая часть, нацеленные на антиген PD-1, по настоящему изобретению, являются мышиными, химерными, рекомбинантными или гуманизированными по характеру, предпочтительно, рекомбинантными по характеру.

Иммуноконъюгаты и биспецифические антитела

В одном из вариантов осуществления, антитело против PD-1 по настоящему изобретению является конъюгированным с лекарственным средством, предпочтительно, цитотоксическим средством, необязательно, через линкер. Настоящее изобретение также относится к иммуноконъюгату, содержащему антитело по изобретению или его антигенсвязывающую часть, связанные с другим лекарственным средством, таким как цитотоксин или радиоактивный изотоп. Такие иммуноконъюгаты, полученные по настоящему изобретению, специфически связываются с экспрессирующими PD1 иммуноцитами, приводя к их лизису. Эти иммуноциты могут включать T-клетки, клетки NK, B-клетки, моноциты и т.п., экспрессирующие PD-1. Таким образом, иммуноконъюгаты, полученные по настоящему изобретению, помогают лечить заболевание, при котором активность экспрессирующих PD-1 иммуноцитов является вредной.

В одном из вариантов осуществления, антитело против PD-1 по настоящему изобретению используют для получения биспецифической молекулы. Биспецифическая молекула, содержащая антитело или его антигенсвязывающую часть, по настоящему изобретению, имеющие два уникальных антигенсвязывающих плеча или функциональных группы, таких, что одно связывает PD-1 и другое имеет отличную специфичность связывания. В одном из вариантов осуществления, вторая функциональная группа по настоящему изобретению может связывать антиген, выбранный из CTLA-4, PD-L1, LAG-3, TIGIT и HER2.

Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие антитела против PD-1, векторы и клетки-хозяева

Настоящее изобретение относится к молекулам нуклеиновой кислоты или последовательностям нуклеиновой кислоты, кодирующим антитела или их антигенсвязывающие части по настоящему изобретению, так же как к экспрессирующим векторам, содержащим такие последовательности нуклеиновой кислоты, и к клеткам-хозяевам, содержащим такие экспрессирующие векторы. В настоящей заявке, векторы pZRCII, так же как pZRCIII, используют для клонирования и экспрессии антител против PD-1 по настоящему изобретению. Вектор pZRCII (pZRCIIhyg) и вектор pZRCIII описаны в Патентных документах WO 2007/017903 и WO 2012/046255A2, соответственно. Клетка-хозяин по настоящему изобретению представляет собой прокариотическую или эукариотическую клетку, предпочтительно, клетка-хозяин представляет собой клетку E. coli или клетку млекопитающего, такую как клетка CHO или клетка NS0, или клетка CHO-GS, или клетка CHO-S или клетка CHO-K1.

Получение антител

По настоящему изобретению, антитело против PD-1 или его антигенсвязывающую часть получают с использованием рекомбинантным способов. В рекомбинантном способе по настоящему изобретению, используют подходящие экспрессирующие векторы. Вектор для получения антител по настоящему изобретению может представлять собой вектор, хорошо известный специалисту в данной области. Экспрессирующий вектор и последовательности для контроля экспрессии выбирают, чтобы они являлись совместимыми с используемой экспрессирующей клеткой-хозяином. Ген легкой цепи антитела и ген тяжелой цепи антитела можно вставлять в отдельный вектор или, более типично, оба гена вставляют в один и тот же экспрессирующий вектор. Гены антитела вставляют в экспрессирующий вектор посредством стандартных способов (например, лигирования комплементарных участков рестрикции в фрагменте ген антитела и векторе, или лигирования тупых концов, если не присутствует участков рестрикции), известных специалистам в данной области. Например, для экспрессии антител, или фрагментов антител из них, ДНК, кодирующие частичные или полноразмерные легкие и тяжелые цепи, можно получать посредством стандартных способов молекулярной биологии (например, амплификации ПЦР или клонирования кДНК с использованием гибридомы, которая экспрессирует представляющее интерес антитело), и ДНК можно вставлять в экспрессирующие векторы таким образом, чтобы гены являлись функционально связанными с последовательностями для контроля транскрипции и трансляции. В дополнение к генам цепей антител и регуляторным последовательностям, рекомбинантные экспрессирующие векторы по изобретению могут нести дополнительные последовательности, такие как последовательности, регулирующие репликацию вектора в клетках-хозяевах (например, точки начала репликации) и гены селективных маркеров. Вариабельные области тяжелых цепей антител, описанных в настоящем описании, можно использовать для получения полноразмерных генов антител любого изотипа антитела посредством их вставки в экспрессирующие векторы, уже кодирующие константную область тяжелой цепи и полноразмерную легкую цепь желательного изотипа таким образом, чтобы фрагмент V_Hявлялся функционально связанным с фрагментом(фрагментами) C_Hвнутри вектора. Дополнительно или альтернативно, рекомбинантный экспрессирующий вектор может кодировать сигнальный пептид, облегчающий секрецию цепи антитела из клетки-хозяина. Для экспрессии легких и тяжелых цепей, экспрессирующий вектор(ы), кодирующие тяжелые и легкие цепи, трансфицируют в клетку-хозяина посредством стандартных способов, таких как опосредованная липидами трансфекция, электропорация, преципитация фосфатом кальция, трансфекция с использованием DEAE-декстрана и т.п. Предпочтительные клетки-хозяева млекопитающих для экспрессии рекомбинантных антител по изобретению включают клетки яичника китайского хомяка (клетки CHO) (включая клетки DHFR- CHO), клетки миеломы NSO, клетки COS и клетки SP2. В частности, для использования с клетками миеломы NSO, другой предпочтительной системой экспрессии является система экспрессии генов GS. Антитела, полученные по настоящему изобретению, можно, кроме того, получать посредством известных способов культивирования клеток для крупномасштабной продукции антител. Антитела можно выделять из культуральной среды с использованием стандартных способов очистки белка. При использованием рекомбинантных способов, антитело может быть продуцировано внутриклеточно, в периплазматическом пространстве, или непосредственно секретировано в среду. Если антитело продуцировано внутриклеточно, в качестве первой стадии, частицы дебриса, либо клеток-хозяев, либо лизированных фрагментов, удаляют, например, посредством центрифугирования или ультрафильтрации. Антитела по изобретению можно тестировать по связыванию с PD-1, посредством, например, стандартного ELISA.

Антитела против PD-1 по настоящему изобретению также получают с использованием способа библиотек фагового дисплея после получения библиотек Fab с использованием способа сайт-направленного мутагенеза, как описано в примерах в настоящем описании. В этом способе, с использованием способа библиотеки фагов, получают области Fab против PD-1, которые далее конвертируют в полноразмерные с использованием рекомбинантных способов на основе экспрессирующего вектора, как описано в настоящей заявке.

Комбинирование антитела против PD-1 по настоящему изобретению с другими лекарственными средствами

Настоящее изобретение относится к комбинации, содержащей по меньшей мере два или более антител или их антигенсвязывающих частей, где по меньшей мере одно антитело или его антигенсвязывающая часть представляет собой антитело против PD-1 по настоящему изобретению. Комбинация по настоящему изобретению может содержать второе антитело или его антигенсвязывающую часть, выбранные из антитела против LAG3, антитела против CTLA4, антитела против HER2, антитела против VEGF, антитела против PDL1, антитела против PD-1, в комбинации с антителом против PD-1 или его антигенсвязывающей частью по настоящему изобретению. В другом варианте осуществления, настоящее изобретение относится к комбинации, состоящей из антитела против PD-1 или его антигенсвязывающей части(частей) и пептида, или к комбинации, содержащей антитело против PD-1 или его антигенсвязывающую часть(части) и цитокин (предпочтительно, интерлейкин).

Фармацевтические композиции

Может быть разработана фармацевтическая композиция, содержащая одно или комбинацию из моноклональных антител или их антигенсвязывающей части(частей), или комбинацию из антитела против PD-1 или его антигенсвязывающей части(частей) и пептида, или комбинацию из антитела против PD-1 или его антигенсвязывающей части(частей) и цитокина (предпочтительно, интерлейкина), по настоящему изобретению, составленные вместе с фармацевтически приемлемым носителем. Настоящее изобретение относится также к композиции, например, фармацевтической композиции, содержащей одно или комбинацию из моноклональных антител или их антигенсвязывающей части(частей), или комбинацию из антитела против PD-1 или его антигенсвязывающей части(частей) и пептида, или комбинацию из антитела против PD-1 или его антигенсвязывающей части(частей) и цитокина (предпочтительно интерлейкина), по настоящему изобретению, составленные вместе с фармацевтически приемлемым носителем. Такие композиции могут включать одно или комбинацию из (например, двух или более различных) антител или иммуноконъюгатов, или биспецифических молекул по изобретению. Например, фармацевтическая композиция по изобретению может содержать комбинацию антител (или иммуноконъюгатов или биспецифических антител), которые связываются с различными эпитопами на антигене-мишени или с различными эпитопами на различных антигенах-мишенях, или которые имеют комплементирующую активность.

В одном из вариантов осуществления, антитело против PD-1 или его антигенсвязывающую часть можно комбинировать с другим подходящим лекарственным средством для лечения различных злокачественных опухолей, инфекций или аутоиммунных нарушений.

Антитело против PD-1 или его антигенсвязывающую часть по настоящему изобретению можно комбинировать или можно использовать в комбинации с другим подходящим химически синтезированным терапевтическим средством(средствами). Указанное химически синтезированное терапевтическое средство может представлять собой противораковые или противоинфекционные лекарственные средства, или комбинацию таких лекарственных средств.

Антитело против PD-1 или его антигенсвязывающую часть по настоящему изобретению можно комбинировать с химиотерапевтическим средством(средствами) в клинических условиях.

Антитело против PD-1 или его антигенсвязывающую часть по настоящему изобретению можно использовать в комбинации с вакциной(вакцинами) для индукции иммунных ответов T- и B-клеток, возможно, посредством продления индуцированной вакциной пролиферации T- или B-клеток, как в профилактических, так и в терапевтических условиях.

Терапевтические применения

В одном из вариантов осуществления, антитело против PD-1 или его антигенсвязывающую часть, или комбинацию, или конъюгат, или биспецифическое антитело по настоящему изобретению можно использовать для лечения заболеваний, при которых активность PD-1 или экспрессия PD-1 является вредной. Такие заболевания хорошо известны специалисту в данной области.

Антитело против PD-1 или его антигенсвязывающую часть, или комбинацию, или конъюгат, или биспецифическое антитело по настоящему изобретению можно использовать для лечения различных злокачественных опухолей, таких как NSCLC, SCLC, RCC, cHL, SCCHN, рак молочной железы, уротелиальная карцинома, колоректальный рак, ESCC, первичная медиастинальная крупноклеточная B-клеточная лимфома, злокачественная опухоль с высокой микросателлитной нестабильностью, рак желудка, рак яичника, рак предстательной железы, глиомы, глиобластома, астроцитомы, мультиформная глиобластома, синдром Баннаяна-Зонана, болезнь Каудена, болезнь Лермитта-Дюкло, воспалительный рак молочной железы, опухоль Вильмса, саркома Юинга, рабдомиосаркома, эпендимома, медуллобластома, рак почки, рак печени, меланома, рак поджелудочной железы, саркома, остеосаркома, гигантоклеточная опухоль кости, рак щитовидной железы, лимфобластный T-клеточный лейкоз, хронический миелогенный лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз, волосатоклеточный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз, острый миелогенный лейкоз, AML, хронический нейтрофильный лейкоз, острый лимфобластный T-клеточный лейкоз, плазмацитома, иммунобластный крупноклеточный лейкоз, лейкоз из клеток мантийной зоны, множественная миелома, мегакариобластный лейкоз, множественная миелома, острый мегакариоцитарный лейкоз, промиелоцитарный лейкоз, эритролейкоз, злокачественная лимфома, лимфома Ходжкина, неходжкинская лимфома, лимфобластная T-клеточная лимфома, лимфома Беркитта, фолликулярная лимфома, нейробластома, рак шейки матки, карцинома из клеток Меркеля, эндометриальная карцинома, злокачественная опухоль с высокой мутационной нагрузкой опухоли (TMB-H), рак женских наружных половых органов, рак слюнных желез, рак носоглотки, буккальный рак, злокачественная опухоль полости рта, GIST (стромальная опухоль желудочно-кишечного тракта) и рак яичка.

Антитело против PD-1 или его антигенсвязывающую часть, или комбинацию, или конъюгат, или биспецифическое антитело по настоящему изобретению можно использовать для лечения различных инфекций. Примерами таких инфекций могут являться инфекции, вызванные патогенами, выбранными из HIV, инфекции гепатита (A, B и C), гриппа, герпеса, жиардии, малярии, лейшмании, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, SARS-CoV, MERS-CoV, SARS-CoV-2, Ebola и т.д.

Антитело против PD-1 или его антигенсвязывающую часть, или комбинацию или конъюгат, или биспецифическое антитело по настоящему изобретению можно использовать для лечения различных аутоиммунных нарушений. Примерами таких аутоиммунных нарушений являются ревматоидный артрит, псориаз, псориатический артрит, анкилозирующий спондилит, ювенильный ревматоидный артрит, болезнь Крона, язвенный колит, сепсис, атопическое заболевание, такое как астма, экзема, аллергия, рассеянный склероз, системная красная волчанка, васкулит, миастения, болезнь Грэйвса, тиреоидит Хашимото, сепсис, аутоиммунная гемолитическая анемия, пернициозная анемия, идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, синдром Гудпасчера, буллезный пемфигоид, обычный пемфигоид, тиреоидит Хашимото, инсулинзависимый сахарный диабет (IDDM), диабет CIDP, воздействие антианемических средств (против бета-талассемии), гематопоэтических средств, офтальмологических лекарственных средств, заболевания кости, неврологические генетические нарушения, связанная с возрастом дегенерация желтого пятна, диабетическая ретинопатия, макулярные заболевания, офтальмологические генетические нарушения, гемофилия B, воздействие средств против (недостаточности фактора свертывания IX (9)), сердечно-сосудистые заболевания, диабет типа 2, воздействие иммунодепрессантов, лечения отторжения трансплантата, терапии миелодиспластического синдрома, ретинопатия, апластическая анемия, воздействие анальгетических лекарственных средств, гематологические генетические нарушения, мультисистемные генетические нарушения, остеоартрит, склеродермия, воздействие лечения аутоиммунных заболеваний, лечения подагры, крапивница, воздействие терапии сердечной недостаточности, терапии лимфомы, нефрит, респираторные нарушения и воздействие терапии врожденных нарушений метаболизма.

В предпочтительном варианте осуществления, настоящее изобретение относится к эффективному количеству антитела против PD-1 или его антигенсвязывающей части(частей), как раскрыто по настоящему изобретению, которое может уменьшать опосредованную PD-1 иммуносупрессию. Эти антитела можно вводить общепринятыми способами и в общепринятых дозах, таких как «фармацевтически эффективная доза» или «терапевтически эффективная доза».

Примеры

Следующие примеры являются иллюстративными, и их не следует рассматривать как ограничивающие объем настоящего изобретения никаким образом, поскольку множество вариантов и эквивалентов станут очевидными специалисту в данной области после прочтения настоящего описания. Полное содержание всех патентов, патентных заявок и публикаций, процитированных в настоящем описании, приведено в настоящем описании в качестве ссылки.

Пример 1: Получение векторов pZRCII hyg для легкой и тяжелой цепи антитела против PD-1

Конструирование вектора pZRCII hygIgG4

Химически синтезированную константную область человеческого IgG4 (SEQ ID NO:156) амплифицировали для включения выступающих концов участков рестрикционных ферментов SalI, ApaI на 5’- и выступающих концов участка NotI на 3’-концах посредством 30 циклов ПЦР с использованием 0,2 пМ специфических олигонуклеотидных праймеров, содержащих вышеуказанные участки рестрикции, в объеме 50 мкл, содержащем 1× буфер для Pfx, 1,5 мМ MgSO₄, 2,5 мкМ каждый из 4 dNTP и 1 единицу полимеразы Pfx. Каждый цикл амплификации ПЦР состоял из инкубаций при 95°C в течение 30 секунд (денатурация), 55°C в течение 45 секунд (гибридизация) и 72°C в течение 1 минуты (удлинение). Амплифицированный продукт реакции ПЦР разделяли в 1% агарозном геле. Желательный фрагмент размером приблизительно 980 пар оснований вырезали из геля и очищали с использованием набора для экстракции из геля Qiagen. Этот очищенный фрагмент продукта ПЦР и вектор pZRCII с геном устойчивости к гигромицину расщепляли с использованием рестрикционных ферментов SalI и NotI. Вектор pZRCII получали, как описано в патентной публикации WO 2007/017903. Фрагмент вектора приблизительно 7692 пар оснований очищали из геля с использованием набора для экстракции из геля Qiagen. Расщепленный фрагмент продукта ПЦР также очищали с использованием набора для экстракции из геля Qiagen. Расщепленный и очищенный продукт ПЦР и вектор pZRCII hyg лигировали, и продукт лигирования трансформировали в E. coli штамма Top 10F'. Трансформанты оценивали на основании устойчивости к канамицину. Плазмидную ДНК, выделенную из таких колоний, анализировали по присутствию фрагмента константной области IgG4 посредством рестрикционного расщепления с использованием рестрикционных ферментов SalI и NotI. Одна из плазмид, для которой показан ожидаемый профиль рестрикции, имеющая фрагмент константной области IgG4, интегрированный в вектор pZRCII, названа pZRC II IgG4 константная область. Таким же способом, химически синтезированный Fc IgG1 (SEQ ID NO:157) клонирован в вектор pZRCII и назван вектор pZRCIIhyg.IgG1.

Конструирование векторных конструкций pZRCIIhyg LC-HC против PD-1

Гены легкой цепи и тяжелой цепи антитела против PD1 химически синтезировали и клонировали в клонирующий вектор pMA (Geneart, Germany). Для клонирования гена легкой цепи в вектор pZRCIIhyg.IgG4 константная область, векторы pMA с легкой цепью и pZRCIIhyg.IgG4 расщепляли с использованием рестрикционных ферментов XhoI и kpnI. Легкую цепь размером приблизительно 737 п.о. (SEQ ID NO:163) и вектор pZRCIIhyg.IgG4 приблизительно 8672 пар оснований вырезали из геля и очищали с использованием набора для экстракции из геля Qiagen. Расщепленные и очищенные легкую цепь и вектор pZRCIIhyg.IgG4 лигировали и трансформировали в E. coli штамма Top 10F'. Трансформанты отбирали на основании устойчивости к канамицину. Плазмидную ДНК, выделенную из приблизительно 20 таких колоний, анализировали по присутствию гена легкой цепи посредством рестрикционного расщепления с использованием различных рестрикционных ферментов. Одна такая плазмида, имеющая ген легкой цепи, интегрированный в первый транскрипционный блок вектора pZRCIIhyg.IgG4, выбрана для получения векторов pZRCIIhyg. LC-HC. Для клонирования генов тяжелой цепи, химически синтезированные вариабельные фрагменты гена тяжелой цепи (SEQ ID No.:158, 159, 160, 161 и 162), все размером приблизительно 446 пар оснований, и вектор pZRCII hyg. LC-IgG4, имеющий легкую цепь из SEQ ID NO:163, расщепляли с использованием SalI и ApaI. Расщепленные и очищенные фрагменты гена вариабельной области тяжелой цепи (SEQ ID NO:158, 159, 160, 161 и 162) индивидуально лигировали в вектор pZRCIIhyg LC IgG4 против PD-1 и трансформировали в E. coli Top 10F'. Трансформанты отбирали на основании устойчивости к канамицину. Плазмидную ДНК, выделенную из трансформантов, анализировали по присутствию гена тяжелой цепи посредством рестрикционного расщепления с использованием SalI и NotI. Конечные векторы, содержащие легкую цепь из SEQ ID NO:163 и тяжелую цепь из SEQ ID No.:158, легкую цепь из SEQ ID NO:163 и тяжелую цепь из SEQ ID NO:159, легкую цепь из SEQ ID NO:163 и тяжелую цепь из SEQ ID NO:160, легкую цепь из SEQ ID NO:163 и тяжелую цепь из SEQ ID NO:161, легкую цепь из SEQ ID NO:163 и тяжелую цепь из SEQ ID NO:162, подтверждали посредством нуклеотидного секвенирования тяжелых и легких цепей. Конечные конструкции, содержащие различные комбинации тяжелой цепи и легкой цепи, названы как IP-H4L1, IP-H4.2L1, IP-H4.2(Y.H)L1, IP-H4.19L1, и IP-H4.36L1, соответственно. Указанные различные конструкции кодируют аминокислотные последовательности HCVR и LCVR антител против PD-1 по настоящему изобретению, как описано в таблице 5.

Таблица 5: Список конструкций антител против PD-1 с их соответствующими SEQ ID NO HCVR и LCVR
Наименование конструкции	SEQ ID No. HCVR	SEQ ID No. LCVR
IP-H4L1(IgG1)	137	151
IP-H4L1(IgG4)	137	151
IP-H4.2L1	138	151
IP-H4.2(Y.H)L1	139	151
IP-H4.19L1	140	151
IP-H4.36L1	143	151

Общая схема вектора указанной конструкции представлена на фигуре 1. IP-H4L1 получали также с изотипом IgG1, как проиллюстрировано в настоящем описании, с использованием химически синтезированной константной области человеческого IgG1 (SEQ ID NO:157).

Аминокислотные последовательности вариабельных областей тяжелых цепей и легких цепей, представлены в таблице 2, и константные области IgG1, IgG4 и легкой цепи приведены в конце настоящего описания. Таким же образом, нуклеотидные последовательности вариабельных областей тяжелых цепей, константной области IgG1 и IgG4 и легкой цепи также приведены в конце настоящего описания.

Пример 2: Получение mAb против PD-1, синтезированных с использованием вектора pZRCII

Для получения материала для исследований для подтверждения концепции, различные конструкции антител против PD-1, как получено в примере 1 (IP-H4L1, IP-H4.2L1, IP-H4.2(Y.H)L1, IP-H4.19L1 и IP-H4.36L1) экспрессировали с использованием системы экспрессии ExpiCHO™ (Gibco). За одни сутки до трансфекции, ExpiCHO-S™ рассевали до конечной плотности 3 × 10⁶ жизнеспособных клеток/мл в встряхиваемой колбе/пробирке для культивирования и позволяли расти в течение ночи. На следующие сутки, клетки подсчитывали и доводили до конечной плотности 6 × 10⁶ жизнеспособных клеток/мл с использованием свежей среды для экспрессии ExpiCHO™, предварительно нагретой до 37°C. Подготавливали комплексы реагента для трансфекции CHO ExpiFectamine™ и плазмидной ДНК. Раствор медленно добавляли к суспензии клеток с осторожным перемешиванием. Клетки инкубировали в инкубаторе 37°C с увлажненной атмосферой и 5% CO₂ в орбитальном встряхивателе. Температуру переводили на 32°C на сутки 1. Усилитель продукции белка ExpiFectamine™ CHO Enhancer и подпитку добавляли на сутки 1, с последующей второй подпиткой на сутки 5 после трансфекции. Культуры собирали (на сутки 8-12), и одностадийную очистку проводили с использованием матрикса агарозы-белка A (смола для очистки антител MAbselect SuRe, GE). Связанное антитело элюировали с использованием глицинового буфера, pH 2,5, и нейтрализовали до pH 7 с использованием Трис-буфера, pH 9. Концентрацию белка для очищенного антитела определяли способом HPLC с белком A.

Пример 3: Получение библиотеки фагового дисплея Fab

(a) Получение плазмиды с Fab

Для получения библиотеки, оптимизированную для E. coli область Fab с выступающими концами участков для EcoRI и BamHI химически синтезировали и клонировали в векторы pMA/pMK, полученные из Geneart, Germany.

Ген Fab (SEQ ID No. 164) выделяли из векторной конструкции pMA после расщепления с использованием EcoRI и BamHI. Аминокислотная последовательность клонированного гена Fab представлена в настоящем описании как SEQ ID NO:165 для VH и 166 для VL.

Модифицировали фагмидный вектор pSEX81 (кат. No: PR3005, Progen), в котором ген pIII фагмидного вектора укорачивали и расщепляли с использованием EcoRI и BamHI, и линеаризованный вектор лигировали с расщепленным геном Fab. Полученный модифицированный вектор обозначен в настоящем описании как pSEX83. Карта вектора pSEX83 приведена в настоящем описании как фиг. 2. Расщепленные фрагменты Fab и вектора pSEX83 анализировали в агарозном геле и очищали из геля с использованием набора для экстракции из геля QIAquick (Qiagen кат. no 28706). Продукты лигирования как Fab (вставки), так и pSEX83 (вектора) трансформировали в электрокомпетентные клетки E. coli TG1 (кат. No: 60502-1, Lucigen). Трансформированные клетки рассевали на чашки с агаром 2xYT, содержащие ампициллин (100 мкг/мл). Клоны анализировали посредством рестрикционного расщепления EcoRI и BamHI, и секвенирования ДНК с использованием способа Сэнгера.

(b) Получение библитотек

Следовали двум стадиям для получения библиотеки фагового дисплея Fab.

Стадия 1: Сайт-направленный мутагенез на основе праймеров для ПЦР в CDRH1

В данном случае нацеливались на область CDRH1 Fab для получения вариантов. Мутации в выбранные области вводили с использованием ПЦР с соответствующей парой праймеров (NI-CDRH1F и NI-CDRH1R), имеющих участок рестрикции SapI (Таблица 6). Каждую пару праймеров конструировали таким образом, чтобы они амплифицировали полную плазмиду в линейной форме, что после рестрикционного расщепления посредством SapI с последующим лигированием с использованием ДНК-лигазы T4 приводило к получению кольцевой плазмиды с мутациями, введенными посредством пары праймеров.

100 нг ДНК-матрицы гена Fab в векторе pSEX83 использовали для амплификации с использованием пар праймеров, упомянутых в таблице 6. После амплификации матрицы с использованием рандомизированных праймеров, продукт расщепляли с использованием SapI для получения липких концов. После очистки продукта ПЦР, расщепленный продукт лигировали в течение ночи при 16°C. Затем лигированной ДНК трансформировали свежеприготовленные электрокомпетентные клетки (TG1). Трансформированные клетки культивировали для получения фагов. Получение фагов выполняли отдельно для каждой библиотеки, как объяснено ранее (9).

Таблица 6: Список праймеров, использованных для сайт-направленного мутагенез на основе праймеров для ПЦР
NI-CDRH1F	Actatcgttagctcttctnnsnnsnnsnnsnnscactgggttcgtcaagccccc
NI-CDRH1R	Actatcgttagctcttctsnnagtaattcctgaggctttgcagtccagacgc
NI-CDRH2.1	Aaccgagtccgcgtagtaacgtttsnnsnnsnnsnnsnnsnnsnntgctacccactccaacccttttcc
NI-CDRH2.2	Gcgacctttaaccgagtccgcgtasnnsnnsnnsnnsnnsnnsnnccagatcactgctacccactccaa
NI-CDRH2.3	Aatagtaaagcgacctttaaccgasnnsnnsnnsnnsnnsnnsnngccatcataccagatcactgctac
NI-CDRL3.01	Ttccaccttggtaccttgaccaaatgtacgaggsnnsnnsnnsnnsnnsnngcagtagtaaaccgcgaagtcttc
NI-CDRL3.02	Ttccaccttggtaccttgaccaaatgtacgsnnsnnsnnsnnsnnsnnttggcagtagtaaaccgcgaagtcttc
NI-CDRL3.03	Ttccaccttggtaccttgaccaaatgtsnnsnnsnnsnnsnnsnnttgttggcagtagtaaaccgcgaagtcttc
NI-CDRL3.04	Ttccaccttggtaccttgaccaaasnnsnnsnnsnnsnnsnnggattgttggcagtagtaaaccgcgaagtcttc
NI-CDRL3.05	Ttccaccttggtaccttgaccaaatgtacgsnnsnnsnnsnnsnnsnngcagtagtaaaccgcgaagtcttc
NI-CDRL3.06	Ttccaccttggtaccttgaccaaatgtsnnsnnsnnsnnsnnsnngcagtagtaaaccgcgaagtcttc
NI-CDRL3.07	Ttccaccttggtaccttgaccaaasnnsnnsnnsnnsnnsnngcagtagtaaaccgcgaagtcttc
NI-CDRL3.08	Ttccaccttggtaccttgaccaaasnnsnnsnnsnnsnnsnncgaggattgttggcagtagtaaaccgcgaagtcttc
NI-CDRL3.09	Ttccaccttggtaccttgaccaaasnnsnnsnnsnnsnnsnngttcgaggattgttggcagtagtaaaccgcgaagtcttc
NI-CDRL3.10	Ttccaccttggtaccttgaccaaasnnsnnsnnsnnsnnsnnccagttcgaggattgttggcagtagtaaaccgcgaagtcttc
NI-CDRH3.00	Tcactaatgtaccttgaccccasnnsnnsnnsnntgtggcgcaatagtacactgcc
NI-CDRH3.01	Tcactaatgtaccttgaccccasnnsnnsnnsnnsnntgtggcgcaatagtacactgcc
NI-CDRH3.02	Tcactaatgtaccttgaccccasnnsnnsnnsnnsnnsnntgtggcgcaatagtacactgcc
NI-CDRH3.03	Tcactaatgtaccttgaccccasnnsnnsnnsnnsnnsnnatttgtggcgcaatagtacact
NI-CDRH3.04	Tcactaatgtaccttgaccccasnnsnnsnnsnnsnnsnnatcatttgtggcgcaatagtac
NI-CDRH3.05	Tcactaatgtaccttgaccccasnnsnnsnnsnnsnnsnnatcatcatttgtggcgcaatag
NI-CDRH3.06	Tcactaatgtaccttgaccccasnnsnnsnnsnnsnnsnnataatcatcatttgtggcgcaa
NI-CDRH3.07	Tcactaatgtaccttgaccccasnnsnnsnnsnnsnnsnnsnnataatcatcatttgtggcgcaa

Стадия 2: мутагенез по Кункелю и sRCA

Мутагенез по Кункелю проводили с использованием sRCA, следуя Huovinen et al 2012. Небольшое количество культуры клеток CJ236 инфицировали фагами, несущими плазмиду с подвергнутым мутагенезу в CDRH1 геном Fab. Инфицированные клетки выращивали в 2xYT, содержащей уридин (6 мкг/мл) и антибиотик карбенициллин (100 мкг/мл). Фаги продуцировали после суперинфекции фагом-помощником VCS M13 (Agilent technologies, USA) и очищали посредством преципитации с использованием PEG6000 (4%) и NaCl (500 мМ). Одноцепочечную уридилированную ДНК (оц(U)ДНК), выделяли из очищенных фагов с использованием набора для очистки M13 из E.Z.N.A.^® M13 DNA mini kit (OMEGA bio-tek, USA) следуя инструкциям производителя.

Эту оц(U)ДНК использовали в качестве матрицы в мутагенезе по Кункелю, и различные праймеры со случайными мутациями использовали для получения библиотеки. Праймеры, нацеленные на различные CDR, т.е., CDRH2, CDRH3 и CDRL3 Fab ниволумаба (Таблица 6) гибридизовали отдельно с матрицей оц(U)ДНК и удлиняли посредством способа мутагенеза по Кункелю. Продукт обрабатывали UDG и избирательно амплифицировали посредством RCA (10). Продукт RCA расщепляли с использованием Hind III, циркуляризовали с использованием ДНК-лигазы T4 и трансформировали в SS320 клетки. Фаги (вторичную библиотеку) продуцировали отдельно для каждого праймера для мутагенеза посредством суперинфекции фагом-помощником, как описано ниже.

Пример 4: Продукция фага с мутантным Fab и его очистка

В колбы, содержащие среды 2xYT с карбенициллином или ампициллином (100 мкл/мл), инокулировали клетки из препарата для хранения в глицерине из вышеописанной библиотеки при начальной концентрации 0,06 OD₆₀₀. Культуры выращивали при 37°C с встряхиванием при 250 об/мин, пока они не достигали OD₆₀₀ вплоть до ~ 0,4-0,6. Затем фаги-помощники, либо VCSM13 (Agilent, кат. no. 200251), либо M13KO7 (GE healthcare, кат. no. 27152401), добавляли в культуру при множественности инфекции (MOI) 20, и инкубировали сначала без встряхивания при 37°C в течение 40 минут, с последующими другими 40 минут инкубации при 37°C с встряхиванием. Канамицин затем добавляли в среды, и культуру выращивали в течение ночи при 26°C при 150 об/мин. В течение ночи культуру фагов центрифугировали при 4000 g, и осадок клеток отбрасывали. Раствор PEG (20%)/NaCl (2,5 М) в соотношении 1:5 добавляли к супернатанту для преципитации фагов. Ресуспендированный раствор инкубировали на льду в течение 20 минут, с последующим центрифугированием при 14000 g в течение 15 минут при 4°C. Супернатант отбрасывали, и осадок ресуспендировали в 1 мл стерильного PBS с 0,01% азидом натрия. Фаги хранили при 4°C до дальнейшего использования.

Пример 5: Биопэннинг фагов, экспрессирующих высокоаффинные варианты Fab

Библиотеку (1×10¹² бое), полученную в примере 4, подвергали скринингу по высокоаффинным Fab, связывающим рецептор PD1. Первый цикл пэннинга против антигена рекомбинантного рецептора PD1 (Sino biological, кат. No, 10377-H08H) при pH 7,4, проводили с использованием имеющих иммобилизованный антиген иммунопробирок (Quidel, USA), которые подготавливали посредством их инкубации с раствором 5 мкг/мл белка PD1 в карбонатном буфере (0,1 M, pH 9,6) в течение ночи при 4°C. Иммунопробирки промывали 3 раза с использованием PBS и затем инкубировали с фагами в PBS в течение 2 час при 25°C с постоянным вращением. Пробирки промывали десять раз с использованием 4 мл PBS с tween 20 (0,1%) и затем 10 раз с использованием PBS. Связанные фаги элюировали с использованием глицина-HCL pH 2,1 (0,1 M). Элюированные фаги спасали посредством инфекции клеток TG1 E. coli, рассевали, и фаги продуцировали, как описано в примере 4.

Второй и третий цикл пэннинга проводили в покрытых антигеном PD1 иммунопробирках таким образом, что использовали выходные фаги из первого цикла пэннинга (1×10¹¹ КОЕ) и второго (1×10¹⁰ КОЕ) цикла пэннинга, в качестве входных фагов для второго и третьего цикла пэннинга, соответственно. Фагами после третьего цикла пэннинга инфицировали клетки TG1, как упомянуто ранее, и фагмидную ДНК выделяли для клонирования антитела против PD-1 в подходящем экспрессирующем векторе.

Пример 6: Скрининг индивидуальных клонов антител против PD-1 в форме растворимых белков Fab

Клонирование в экспрессирующий вектор и продукция белка

Гены антител против PD-1 из обогащенной библиотеки, полученной после 3 циклов пэннинга, клонировали в экспрессирующий вектор pOPE101 (устойчивый к карбенициллину) (Progen, Germany), таким образом, чтобы индивидуальные клоны антитела против PD-1 можно было получать в форме меченных His слитых продуктов. Как векторную ДНК (pOPE101), так и фагмидную ДНК, расщепляли с использованием рестрикционных ферментов (EcoRI и BamHI) для выделения вектора и генов антитела против PD-1, соответственно. Рестрикционно расщепленные как вектор, так и ген антитела против PD-1 лигировали и трансформировали в электрокомпетентные клетки TG1. Трансформированные клетки рассевали на чашки с агаром 2xYT, содержащие антибиотик карбенициллин. Индивидуальные клоны отбирали с чашек с агаром 2xYT и культивировали в 15 мл пробирках с 5 мл сред 2xYT, содержащих карбенициллин или ампициллин (100 мкл/мл), в течение ночи при 32°C при 200 об/мин. На следующие сутки, культуры повторно инокулировали в свежую среду 2xYT, содержащую карбенициллин (100 мкг/мл) и глюкозу (0,1%) в объемном соотношении 1:200. Культуры выращивали до достижения OD₆₀₀ ~ 0,6-0,8. После этого 1 мМ изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид (IPTG) добавляли в культуру и выращивали в течение ночи при 30°C при 200 об/мин. Ночную культуру центрифугировали при 10800 g в течение 15 минут, и супернатант удаляли. Осадок клеток ресуспендировали в 1/20^й объема исходной культуры 1x PBS буфера pH-7,4, содержащего 2 мг/мл лизоцима, 0,1% triton X и 1 ед./100 мл бензоназы, и инкубировали при 37°C в течение 1 час. Ресуспендированный осадок центрифугировали при 10800 g в течение 15 минут, и супернатант собирали в форме лизата клеток, содержащего растворимые меченные His варианты Fab. Эту фракцию лизата клеток использовали в иммуноанализах для исследования связывания антитела против PD-1 после количественной оценки растворимого Fab в периплазматической фракции.

Определение концентрации растворимых Fab против PD-1 в периплазматической фракции

Клоны культивировали индивидуально для продукции растворимых вариантов Fab, как описано выше. Тотальные Fab в лизате клеток или периплазматической фракции оценивали количественно посредством иммобилизации растворимых Fab на планшетах maxisorp, предварительно покрытых антителом козы против человеческого IgG (специфическим для Fab) (Sigma-Aldrich, кат. no. I5260). Покрытие осуществляли в течение ночи с использованием антитела козы против человеческого IgG (специфического для Fab) (Sigma-Aldrich, кат. no. I5260) при концентрациях 1 мкг/мл (100 мкл/лунку) в буфере для покрытия (0,1M NaHCO3, pH 9,6). После промывки планшета дважды, добавляли лизат клеток 100 мкл (1/20 об/об в 1x PBS) и инкубировали в течение 1 час при 25°C. Известные концентрации серийно разведенных человеческих Fab использовали в качестве стандартов для расчета количества белка Fab в лизате клеток. Планшет промывали 3 раза с использованием PBST (0,1% Tween20 в 1x PBS). 100 мкл (1:10000) конъюгированного с HRP антитела козы против человеческого IgG (специфического для Fab) (Sigma-Aldrich, кат. no. A0293) добавляли в каждую лунку планшета и инкубировали в течение 1 час. Планшет затем промывали 5 раз с использованием PBST, с последующим добавлением субстрата o-фенилендиаминдигидрохлорида (OPD) (100 мкл/лунку) на 15 минут при 37°C. Реакцию останавливали с использованием 1Н H₂SO₄ (100 мкл/лунку), и оптическую плотность (OD) измеряли при 450 нм с использованием TECAN INFINITE^® M1000pro. Концентрацию Fab в лизате клеток затем рассчитывали с использованием эталонных стандартов.

Качественный анализ связывающих Fab против PD-1

Рекомбинантным антигеном PD1 покрывали полистирольный планшет (100 нг/100 мкл/лунку), в течение ночи при 4°C в буфере для покрытия (0,1 М NaHCO3, pH 9,6). После промывки планшета дважды, 100 нг связывающего Fab, разведенного в 100 мкл PBS, pH 6,0, добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение 1 час при 25°C. Планшеты промывали 4 раза с использованием PBST (0,1% Tween20 в 1x PBS, pH 6,0) с последующим добавлением 100 мкл (1:10000) конъюгированного с HRP антитела козы против человеческого IgG (специфического для Fab) (Sigma-Aldrich, кат. no. A0293) и инкубации в течение 1 час при 25°C. Затем планшет промывали 5 раз с использованием PBST, с последующим добавлением субстрата o-фенилендиаминдигидрохлорида (OPD) (100 мкл/лунку) в течение 15 минут при 37°C. Реакцию останавливали с использованием 1 Н H₂SO₄ (100 мкл/лунку), и оптическую плотность измеряли при 450 нм с использованием TECAN INFINITE^® M1000pro. Индивидуальные клоны с относительно высоким сигналом OD, по сравнению с исходным Fab, включали в укороченный список для дальнейшей характеризации.

Пример 7: Получение векторов pZRCIII hyg для легкой и тяжелой цепи антитела против PD-1

Пять клонов включены в укороченный список, на основании результатов, полученных из качественного анализа связывающих Fab против PD-1. Эти пять клонов обозначены в настоящем описании как N5, N6, N7, N9 и N10, на основании области HCVR связывающих Fab.

Гены, кодирующие вариабельные области тяжелой цепи из N5, N6, N7, N9 и N10 (аминокислотные последовательности SEQ ID No.:146-150 и нуклеотидные последовательности SEQ ID NO:169-173, соответственно), и ген легкой цепи (SEQ ID NO:167 и 174 представляют собой аминокислотную и нуклеотидную последовательность, соответственно.) химически синтезировали и клонировали в вектор pMA (GeneArt, Germany). Для клонирования легкой цепи в экспрессирующий вектор для млекопитающих, вектор pZRCIII hyg.IgG4 расщепляли с использованием рестрикционных ферментов XhoI и KpnI. Вставку легкой цепи, расщепленную с использованием таких же рестрикционных ферментов, лигировали в расщепленный с использованием XhoI и KpnI вектор pZRCIII hyg.IgG4 и трансформировали в E. coli штамма Top 10F'. Трансформанты отбирали на основании устойчивости к канамицину. Плазмидную ДНК, выделенную из таких колоний, анализировали по присутствию гена легкой цепи посредством рестрикционного расщепления с использованием рестрикционных ферментов XhoI и KpnI. Одну из плазмид, для которой показан ожидаемый профиль рестрикции, дополнительно расщепляли с использованием рестрикционных ферментов SalI и ApaI для вставки генов, кодирующих вариабельные области тяжелой цепи из N5, N6, N7, N9 и N10 (аминокислотные последовательности SEQ ID No.:146-150 и нуклеотидные последовательности SEQ ID NO:169-173, соответственно) в рамке считывания с константной областью IgG4 (SEQ ID NO:168 и 175 представляют собой аминокислотную и нуклеотидную последовательность, соответственно), из вектора pZRCIII hyg.IgG4. Вектор и вставку, расщепленные с использованием рестрикционных ферментов SalI и ApaI, лигировали и трансформировали в E. coli штамма Top 10F'. Трансформанты отбирали на основании устойчивости к канамицину. Плазмидную ДНК из трансформантов расщепляли с использованием рестрикционных ферментов SalI и ApaI для подтверждения присутствия соответствующей вариабельной области. Конечные векторы, содержащие легкую цепь из SEQ ID NO:174 и тяжелую цепь из SEQ ID No.:169; легкую цепь из SEQ ID NO:174 и тяжелую цепь из SEQ ID NO:170; легкую цепь из SEQ ID NO:174 и тяжелую цепь из SEQ ID NO:171; легкую цепь из SEQ ID NO:174 и тяжелую цепь из SEQ ID NO:172; и легкую цепь из SEQ ID NO:174 и тяжелую цепь из SEQ ID NO:173, подтверждали посредством нуклеотидного секвенирования тяжелых и легких цепей. Эти конечные векторы обозначены как N5NL, N6NL, N7NL, N8NL, N9NL и N10NL, соответственно.

Указанные различные конструкции кодируют аминокислотные последовательности HCVR и LCVR антител против PD-1 по настоящему изобретению, как описано в таблице 7.

Таблица 7: Список конструкций антител против PD-1 с их соответствующими SEQ ID NO аминокислотных последовательностей HCVR и LCVR
Наименование конструкции	SEQ ID No. HCVR	SEQ ID NO. LCVR
N5NL	146	152
N6NL	147	152
N7NL	148	152
N9NL	149	152
N10NL	150	152

Общая схема вектора для указанной конструкции представлена на фигуре 3.

Аминокислотные последовательности вариабельных областей тяжелых цепей и легких цепей представлены в таблице 2, и константные области IgG1, IgG4 и легкой цепи приведены в конце настоящего описания. Таким же образом, нуклеотидные последовательности вариабельных областей тяжелых цепей, константные области IgG1 и IgG4, и легкой цепи также приведены в конце настоящего описания.

Пример 8: Получение mAb против PD-1, синтезированных с использованием вектора pZRCIII

Для получения материала для исследований для подтверждения концепции, различные конструкции антител против PD-1, как получено в примере 7 (N5NL, N6NL, N7NL, N9NL и N10NL), экспрессировали в клетках CHO-S (Invitrogen). Клетки общепринятым образом культивировали в средах CDM от Lonza. Клетки рассевали за ~24 часа до трансфекции. Трансфекции проводили посредством электропорации с использованием системы для трансфекции Neon (Invitrogen) с использованием предварительно оптимизированных условий. После трансфекции, клетки рассевали в 24-луночный планшет, содержащий 1 мл предварительно нагретых бессывороточных сред. Клетки инкубировали в увлажненном инкубаторе при 37°C в присутствии 5% CO₂. Отбор трансфицированного пула выполняли в присутствии 600 мкг/мл гигромицина в бессывороточной среде. Количество клеток из пула мониторировали регулярно в ходе процесса отбора в течение периода 2-3 недель и проводили регулярные замены сред. Экспрессирующие антитела против PD-1 пулы стабильных трансфектантов размножали, и антитела получали с использованием периодических культур с подпиткой. Клетки рассевали при плотности 0,3×10⁶ клеток/мл в 125 мл встряхиваемых колбах Эрленмейера в химически определенных средах. Колбы инкубировали в увлажненном встряхивателе-инкубаторе Kuhner при температуре 37°C, уровне CO₂ 5%, со скоростью встряхивания 110 об/мин. Фиксированному режиму ежесуточной подпитки следовали на протяжении всего культивирования. Использовали химически определенные подпитки от Hyclone, GE. Подпитку начинали через 72 часа культивирования и продолжали до сбора культуры. Культуры собирали (на сутки 8-12), и одностадийную очистку проводили с использованием матрикса агарозы-белка A (смола для очистки антител MAbselect SuRe, GE). Связанное антитело элюировали с использованием глицинового буфера, pH 2,5, и нейтрализовали до pH 7 с использованием Трис-буфера, pH 9. Концентрацию белка для очищенного антитела определяли способом HPLC с белком A.

Пример 9: Анализ аффинности антитела против PD-1 человека способом поверхностного плазмонного резонанса (SPR)

Константы аффинности для связывания антител-кандидатов против PD-1 (IP-H4L1 (IgG4), IP-H4L1 (IgG1), IP-H4.2L1, IP-H4.19L1, IP-H4.36L1, N5NL, N6NL, N7NL, N9NL и N10NL) с PD-1 человека определяли с использованием Proteon XPR (Biorad).

PD-1 человека (AcroBiosystems) напрямую иммобилизовали на чипе GLC (ProteOn) с использованием способа связывания по аминогруппе для получения уровня иммобилизации лиганда приблизительно 500 RU. 10 мМ фосфатно-солевой буфер (PBS) (10 мМ фосфатный буфер, pH 7,4, 300 мМ NaCl, 0,005% поверхностно-активного вещества P20) использовали в качестве рабочего буфера для проведения кинетических измерений. Все образцы антител после одностадийной очистки разводили в рабочем буфере, описанном выше, при подходящей концентрации, в сериях концентраций от 10 нМ до 0,09 нМ. Эти образцы инъецировали поверх чипа при скорости потока 50 мкл/мин со временем связывания 300 с и временем диссоциации 1800 с. После анализа каждого образца, поверхность чипа регенерировали с использованием 10 мМ глицинового буфера pH 1,5 в течение 18 с при скорости потока 100 мкл/мин.

Значения K_D (кинетические константы) определяли как отношение скорости диссоциации (kd) к скорости связывания (ka), т.е. K_D=kd/ka, с использованием программного обеспечения ProteOn manager v3.1.0.6.

Результаты представлены в таблице 8. Данные анализировали с использованием модели связывания Ленгмюра.

Таблица 8: Результаты анализа аффинности антител против PD-1 посредством поверхностного плазмонного резонанса
Детали образца	Константа скорости связывания Ka (1/Мс)	Константа скорости диссоциации Kd (1/с)	Константа аффинности K_D(M)
IP-H4.19L1	1,54E+06	6,28E-05	4,09E-11
IP-H4,2 L1	1,67E+06	1,37E-05	8,20E-12
IP-H4.36L1	1,96E+06	6,20E-05	3,17E-11
IP-H4L1 (IgG4)	1,87E+06	5,36E-05	2,86E-11
IP-H4L1 (IgG1)	2,12E+06	5,21E-05	2,48E-11
N5NL	2,03E+06	1,51E-04	7,50E-11
N6NL	1,86E+06	1,54E-04	8,26E-11
N7NL	1,95E+06	9,54E-05	4,91E-11
N9NL	1,48E+06	7,17E-05	4,86E-11
N10NL	1,34E+06	8,51E-05	6,39E-11

Пример 10: Анализ антител против PD-1 с использованием проточного цитометрического анализа в клетках PBMC

Человеческие мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC), истощенные по моноцитам, активировали с использованием планетов, покрытых антителом против CD3 (клон UCHT-1; BD Biosciences), в течение 3 суток. После промывки, клетки инкубировали с различными концентрациями антител против PD-1 IP- H4.2L1, IP-H4L1 (IgG1) и IP-H4L1 (IgG4). Связывание этих антител против PD-1 с PD1, экспрессированным на активированных клетках, оценивали с использованием конъюгированного с R-фикоэритрином фрагмента F(ab)² козы против человеческого IgG, специфического для фрагмента Fcγ, в качестве вторичного реагента, и оценки образцов с использованием проточного цитометра (BD FACS Canto™ II). Данные связывания показаны на фигуре 4. Они показывают специфичность связывания IP-H4.2L, IP-H4L1 (IgG1) и IP-H4L1 (IgG4) для PD1 человека, экспрессированного на клетках.

Пример 11: Анализ антител против PD-1 с использованием проточного цитометрического анализа в клетках HEK-293T

Клетки HEK 293T, стабильно трансфицированные для экспрессии PD-1 человека, инкубировали с различными концентрациями антител против PD-1 IP-H4.19L1, IP-H4.2L1 и IP-H4.36L1. Связывание этих антител с PD1 на клетках HEK-293T оценивали с использованием конъюгированного с R-фикоэритрином фрагмента F(ab)² козы против человеческого IgG, специфического для фрагмента Fcγ, в качестве вторичного реагента, оцененного с использованием проточного цитометра (BD FACS CantoTM II). Данные показаны на фигуре 5. Они показывают специфичность связывания IP- H4.19L1, IP-H4.2L1 и IP-H4.36L1 для PD1 человека, экспрессированного на клетках.

Сходным способом, другие антитела против PD-1 N5NL, N6NL, N7NL, N9NL и N10NL анализировали с использованием проточного цитометрического анализа в клетках HEK-293T. Данные показаны на фигуре 6.

Пример 12: Анализ антитела против PD-1 в реакции смешанной культуры лимфоцитов

Дендритные клетки (DC) получали посредством культивирования моноцитов, выделенных из PBMC, in vitro в течение 7 суток с 50 нг/мл интерлейкина-4 (IL-4) и 100 нг/мл GM-CSF (11). Истощенные по моноцитам PBMC (5×10⁴) и аллогенные DC (1×10⁴) совместно культивировали в присутствии или в отсутствие различных концентраций антител против PD1 IP-H4.2L1, IP-H4.36L1, IP- H4.19L1, IP-H4L1 (IgG4) и аналога ниволумаба, добавленных в начале анализа. Через 5 суток, культуральные супернатанты собирали и анализировали по секреции IL2 и IFN гамма посредством ELISA (BD Biosciences). Увеличенную секрецию либо IL-2, либо IFN гамма, обусловленную данным антителом против PD-1, рассчитывали после вычитания значений, полученных с использованием контроля изотипа IgG4 из соответствующей группы. Результаты IL2 и IFN-гамма показаны на фигурах 7 и 8, соответственно. Полученные результаты показывают, что антитела против PD1, антитела против PD-1 по настоящему изобретению являются способными стимулировать секрецию IL-2 и IFN-гамма T-клетками в MLR.

Подобным образом, другие антитела против PD-1 N5NL, N6NL, N9NL и N10NL анализировали в реакции смешанной культуры лимфоцитов для анализа увеличенной секреции IL2 и IFN гамма посредством ELISA (BD Biosciences). Результаты для IL2 и IFN гамма показаны на фигурах 9 и 10, соответственно.

Список аминокислотных последовательностей, используемых по настоящему изобретению:

SEQ ID NO:153 - Константная область IgG4

ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

SEQ ID NO:154 - Константная область IgG1

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:155 - Константная область легкой цепи IP-L1

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO:165 - Вариабельная область тяжелой цепи ниволумаба (полученная синтетически)

QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPC

SEQ ID NO:166 - Легкая цепь ниволумаба (полученная синтетически)

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO:167 - Легкая цепь NL

SEQ ID NO:168 - Константная область IgG4

PSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

Список нуклеотидных последовательностей, используемых по настоящему изобретению:

SEQ ID NO:156 - Константная область IgG4

GCCTCCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCTCTGGCCCCTTGCTCCCGGTCCACCTCCGAGTCTACCGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTGAAAGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCTGCCGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGTCCTCCGTGGTGACCGTGCCCTCCTCCAGCCTGGGCACCAAGACCTACACCTGTAACGTGGACCACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGCGGGTGGAATCTAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCTGAATTTCTGGGCGGACCTTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAAGATCCCGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAACAGTTCAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCTGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCTCCAGCATCGAAAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCCCGCGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCCAGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAAGGCTTCTACCCCTCCGATATCGCCGTGGAATGGGAGTCCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGTACTCTCGGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGGAAGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGAGCCTGGGTAAGTGATGA

SEQ ID NO:157 - Константная область IgG1

GCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA

SEQ ID NO:158 - Вариабельная область тяжелой цепи IP-H4

CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGCGTGGAAGTGAAGAAACCTGGCGCCTCCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACCACCTACTACATCTACTGGGTCCGACAGGCCCCAGGCCAGGGCCTGGAATGGATGGGCGGCGTGAACCCTTCCAACGGCGGCACCAACTACAACGAGAACTACAAGAACAGAGTGACCCTGACCACCGACTCCTCCACCACCACCGCCTACATGGAACTGAAGTCCCTGCAGTTCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGACGGGACTACAGATACGACATGGGCTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGTCCTCT

SEQ ID NO:159 - Вариабельная область тяжелой цепи IP-H4.2

CAGGTTCAATTGGTGCAGTCCGGCGTGGAAGTGAAGAAACCTGGCGCTTCTGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCTGGCTACACCTTTACCACCTACTACATCTACTGGGTCCGACAGGCTCCTGGACAGGGACTTGAATGGATGGGCGGCGTGAACCCTTCTAACGGCGGCACCAACTACAACGAGAACTACAAGAACAGAGTGACCCTGACCACCGACTCCTCTACCACCACCGCCTACATGGAACTGAAGTCCCTGCAGTTCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAAGAGACTACAGATACGACATGGGCTACGACTACTGGGGCCAGGGCACAACAGTGACCGTGTCCTCT

SEQ ID NO:160 - Вариабельная область тяжелой цепи IP-H4.2 (Y.H)

CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGCGTGGAAGTGAAGAAACCTGGCGCCTCCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACCACCTACTACATCTACTGGGTCCGACAGGCCCCAGGCCAGGGCCTGGAATGGATGGGCGGCGTGAACCCTTCCAACGGCGGCACCAACTACAACGAGAACTACAAGAACAGAGTGACCCTGACCACCGACTCCTCCACCACCACCGCCTACATGGAACTGAAGTCCCTGCAGTTCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGACGGGACTACAGATACGACATGGGCCATGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGTCCTCTGCCTCCACCAAGGGCCC

SEQ ID NO:161 - Вариабельная область тяжелой цепи IP- H4.19

CAGGTTCAATTGGTGCAGTCCGGCGTGGAAGTGAAGAAACCTGGCGCTTCTGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCTGGCTACACCTTTACCACCTACTACATCTACTGGGTCCGACAGGCTCCTGGACAGGGACTTGAATGGATGGGCGGCGTGAACCCTTCCAACTCCGGCACCAACTACAACGAGAACTACAAGAACAGAGTGACCCTGACCACCGACTCCTCTACCACCACCGCCTACATGGAACTGAAGTCCCTGCAGTTCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAAGAGACTACAGATACGACATGGGCTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACAACAGTGACCGTGTCCTCT

SEQ ID NO:162 - Вариабельная область тяжелой цепи IP-H4.36

CAGGTTCAATTGGTGCAGTCCGGCGTGGAAGTGAAGAAACCTGGCGCTTCTGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCTGGCTACACCTTTACCACCTACTACATCTACTGGGTCCGACAGGCTCCTGGACAGGGACTTGAATGGATGGGCGGCGTGAACCCTTCTAACGGCGGCACCAACTACAACCAGAACTACAAGAACAGAGTGACCCTGACCACCGACTCCTCTACCACCACCGCCTACATGGAACTGAAGTCCCTGCAGTTCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAAGAGACTACAGATACGACATGGGCTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACAACAGTGACCGTGTCCTCT

SEQ ID NO:163 - Легкая цепь IP-L1

GAGATCGTGCTGACCCAGTCCCCCGCCACCCTGTCTCTGTCTCCCGGCGAGAGAGCCACCCTGAGCTGCAGAGCCTCCAAGGGCGTGTCCACCTCCGGCTACTCCTACCTGCACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCTCGGCTGCTGATCTACCTGGCCTCCTACCTGGAATCCGGCGTGCCCGCCAGATTCTCCGGCTCTGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCCAGCCTGGAACCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCACTCCCGGGACCTGCCCCTGACCTTTGGCGGAGGCACCAAGGTGGAAATCAAGCGGACCGTGGCCGCTCCCTCCGTGTTCATCTTCCCACCCTCCGACGAGCAGCTGAAGTCCGGCACCGCCTCCGTCGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGCGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGTCCGGCAACTCCCAGGAATCCGTCACCGAGCAGGACTCCAAGGACAGCACCTACTCCCTGTCCTCCACCCTGACCCTGTCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAAGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGTCCTTCAACCGGGGCGAGTGCTAATGAGGTACC

SEQ ID NO:164 - Ген Fab ниволумаба

GGATAACAATTTCACACAGAATTCATTAAAGAGGAGAAATTAACCATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAATGCCTATGCATCCGAAATCGTGCTGACCCAGTCGCCCGCTACATTATCGTTGTCACCGGGGGAACGCGCGACATTGTCCTGTCGCGCATCACAGAGCGTATCTTCGTATTTGGCCTGGTATCAGCAAAAGCCAGGCCAAGCCCCCCGTCTTTTAATTTATGACGCCTCTAATCGCGCAACCGGCATTCCTGCACGCTTTTCCGGCTCAGGGAGTGGCACGGATTTCACTTTGACGATCAGTAGTCTTGAACCAGAAGACTTCGCGGTTTACTACTGCCAACAATCCTCGAACTGGCCTCGTACATTTGGTCAAGGTACCAAGGTGGAAATCAAACGCACCGTAGCCGCACCGTCAGTCTTCATCTTCCCTCCCTCTGACGAACAATTAAAATCTGGCACAGCTTCCGTTGTATGCCTTCTTAACAACTTTTATCCACGTGAAGCGAAAGTCCAATGGAAAGTTGATAATGCACTTCAGTCTGGGAACTCACAGGAGTCCGTAACGGAACAGGACTCTAAGGACTCAACCTATAGCTTATCTTCAACATTGACATTGTCAAAGGCAGACTATGAGAAGCACAAAGTGTACGCTTGTGAAGTCACCCATCAGGGCTTGTCTTCTCCAGTAACCAAAAGTTTCAATCGCGGGGAGTGTGGTGGTTCTGATTACAAAGATGACGATGACAAATAATTAACTCGAGGCTGAGCAAAGCAGACTACTAATAACATAAAGTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCCTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAAGGGTAACTAGAGGTTGAGGTGATTTTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAACGCGTACGCTGAGATCTCCCAAGTCCAGCTGGTTGAATCAGGTGGGGGAGTTGTTCAACCGGGGCGTTCCCTGCGTCTGGACTGCAAAGCCTCAGGAATTACTTTTTCAAACTCCGGGATGCACTGGGTTCGTCAAGCCCCCGGAAAAGGGTTGGAGTGGGTAGCAGTGATCTGGTATGATGGCTCAAAACGTTACTACGCGGACTCGGTTAAAGGTCGCTTTACTATTTCACGCGACAACTCGAAAAATACTTTGTTCTTACAGATGAACTCTCTTCGCGCCGAAGATACGGCAGTGTACTATTGCGCCACAAATGATGATTATTGGGGTCAAGGTACATTAGTGACCGTCAGTAGCGCGAGTACGAAGGGACCTAGCGTGTTTCCCTTAGCACCATGTAGTCGTTCGACAAGCGAATCCACAGCGGCCTTAGGGTGCTTAGTGAAGGATTATTTTCCCGAGCCAGTAACAGTATCGTGGAATAGCGGCGCATTAACTTCCGGCGTTCATACCTTCCCTGCCGTTTTACAGTCATCCGGTTTGTATTCTCTTTCGTCAGTAGTAACAGTGCCTTCCTCCTCGCTGGGGACCAAGACCTATACCTGCAATGTGGACCATAAGCCTTCAAACACAAAAGTAGACAAACGTGTTGAATCAAAGTACGGCCCGCCTTGTCCGCCCTGCGGATCCAAAGATATCAGATCTGGT

SEQ ID NO:169 - Вариабельная область тяжелой цепи N5

CAGGTTCAATTGGTTGAATCTGGCGGCGGAGTGGTGCAGCCTGGAAGAAGTCTGAGACTGGATTGCAAGGCCTCCGGCATCACCTTCTCCAACTCTGGCATGCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGAAAAGGACTGGAATGGGTCGCCGTGATTTGGTACGACGGCTCTAAGCGGTACTACGCCGACTCCGTGAAGGGCAGATTCACCATCTCTCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTTTCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCACCAACTCTGATTTTTGGGGCCAGGGCACACTGGTCACCGTGTCCTCTGCTTCTACAAAGGGCCC

SEQ ID NO:170 - Вариабельная область тяжелой цепи N6

CAGGTTCAATTGGTTGAATCTGGCGGCGGAGTGGTGCAGCCTGGAAGAAGTCTGAGACTGGATTGCAAGGCCTCCGGCATCACCTTCTCCAACTCTGGCATGCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGAAAAGGACTGGAATGGGTCGCCGTGATTTGGTACGACGGCTCTAAGCGGTACTACGCCGACTCCGTGAAGGGCAGATTCACCATCTCTCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTTTCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCACCAATTCTGATCATTGGGGCCAGGGCACACTGGTCACCGTGTCCTCTGCTTCTACAAAGGGCCC

SEQ ID NO:171 - Вариабельная область тяжелой цепи N7

CAGGTTCAATTGGTTGAATCTGGCGGCGGAGTGGTGCAGCCTGGAAGAAGTCTGAGACTGGATTGCAAGGCCTCCGGCATCACCTTCTCCAACTCTGGCATGCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGAAAAGGACTGGAATGGGTCGCCGTGATTTGGTACGACGGCTCTAAGCGGTACTACGCCGACTCCGTGAAGGGCAGATTCACCATCTCTCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTTTCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCACCAACTCTGATTATTGGGGCCAGGGCACACTGGTCACCGTGTCCTCTGCTTCTACAAAGGGCCC

SEQ ID NO:172 - Вариабельная область тяжелой цепи N9

CAGGTTCAATTGGTTGAATCTGGCGGCGGAGTGGTGCAGCCTGGAAGAAGTCTGAGACTGGATTGCAAGGCCTCCGGCATCACCTTCTCCAACTCTGGCATGCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGAAAAGGACTGGAATGGGTCGCCGTGATTTGGTACGACGGCTCTAAGCGGTACTACGCCGACTCCGTGAAGGGCAGATTCACCATCTCTCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTTTCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCACAAATACCGATTGGTGGGGCCAGGGCACACTGGTCACAGTGTCCTCTGCTTCCACAAAGGGCCC

SEQ ID NO:173 - Вариабельная область тяжелой цепи N10

CAGGTTCAATTGGTTGAATCTGGCGGCGGAGTGGTGCAGCCTGGAAGAAGTCTGAGACTGGATTGCAAGGCCTCCGGCATCACCTTCTCCAACTCTGGCATGCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGAAAAGGACTGGAATGGGTCGCCGTGATTTGGTACGACGGCTCTAAGCGGTACTACGCCGACTCCGTGAAGGGCAGATTCACCATCTCTCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTTTCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCACCAATACCGATTATTGGGGCCAGGGCACACTGGTCACCGTGTCCTCTGCTTCTACAAAGGGCCC

SEQ ID NO:174 - Легкая цепь NL

GAGATCGTGCTGACCCAGTCCCCCGCCACCCTGTCTCTGAGCCCTGGCGAGAGAGCCACCCTGAGCTGCAGAGCCTCCCAGTCCGTGTCCTCCTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCTCGGCTGCTGATCTACGACGCCTCCAACCGGGCCACCGGCATCCCTGCCAGATTCTCCGGCTCTGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCCAGCCTGGAACCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTCCTCCAACTGGCCCCGGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAGCGGACCGTGGCCGCTCCCTCCGTGTTCATCTTCCCACCCTCCGACGAGCAGCTGAAGTCCGGCACCGCCTCCGTGGTCTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGCGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGTCCGGCAACTCCCAGGAATCCGTGACCGAGCAGGACTCCAAGGACAGCACCTACTCCCTGTCCTCCACCCTGACCCTGTCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAAGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGTCCTTCAACCGGGGCGAGTGCTGATGA

SEQ ID NO:175 - Константная область IgG4

GGGCCCCTCCGTGTTCCCTCTGGCCCCTTGCTCCCGGTCCACCTCCGAGTCTACCGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTGAAAGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCTGCCGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGTCCTCCGTGGTGACCGTGCCCTCCTCCAGCCTGGGCACCAAGACCTACACCTGTAACGTGGACCACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGCGGGTGGAATCTAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCTGAATTTCTGGGCGGACCTTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAAGATCCCGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAACAGTTCAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCTGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCTCCAGCATCGAAAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCCCGCGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCCAGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAAGGCTTCTACCCCTCCGATATCGCCGTGGAATGGGAGTCCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGTACTCTCGGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGGAAGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGAGCCTGGGCAAGTGATGA

Ссылки, включенные в настоящую патентную заявку:

1. Dong et al. B7-H1, a third member of the B7 family, co-stimulates T-cell proliferation and interleukin-10 secretion, Nature Med., 1999 Dec;5(12):1365-9, 1999.

2. Zou et al. Inhibitory B7-family molecules in the tumour microenvironment, Nature Review Immunol., Jun;8(6):467-77, 2008.

3. Iwai et al. Involvement of PD-L1 on Tumor Cells in the Escape From Host Immune System and Tumor Immunotherapy by PD-L1 Blockade, Proc. Nat 7. Acad. ScL USA 99: 12293-7, 2002.

4. Brown et al. Blockade of Programmed Death-1 Ligands on Dendritic Cells Enhances T Cell Activation and Cytokine Production, J. Immunol. 170:1257-66, 2003.

5. Sheridan et al. Cautious optimism surrounds early clinical data for PD-1 blocker, Nature Biotechnology 30: 729-730, 2012.

6. Angal S., King D.J., Bodmer M.W., Turner A., Lawson A.D., Roberts G., Pedley B., Adair J.R. A single amino acid substitution abolishes the heterogeneity of chimeric mouse/human (IgG4) antibody. Mol Immunol. 1993; 30(1): 105-8.

7. Weiyi Peng, Chengwen Liu et al. PD-1 blockade enhances T cell migration to tumors by elevating IFN-γ inducible chemokines Cancer Res. 2012 October 15; 72(20): 5209-5218.

8. Niki Karachaliou, Maria Gonzalez-Cao, Guillermo Crespo et al. Interferon gamma, an important marker of response to immune checkpoint blockade in non-small cell lung cancer and melanoma patients Therapeutic Advances in Medical Oncology, 2018, vol. 10: 1-23, 2018.

9. Brockmann et al. Synthetic single-framework antibody library integrated with rapid affinity maturation by VL shuffling, Protein Engineering, Design & Selection, vol. 24 no. 9 pp. 691-700, 2011.

10. Huovinen T., Brockmann E.-C., Akter S., Perez-Gamarra S., Ylä-Pelto J. et al. Primer Extension Mutagenesis Powered by Selective Rolling Circle Amplification, volume 7, issue 2, e31817, 2012.

11. Palucka et al. Dendritic Cells as the Terminal Stage of Monocyte Differentiation, J Immunology, 160:4587-4595, 1998.

Включение в качестве ссылки

Полное содержание каждого из Патентных документов и научных статей, на которые ссылаются в настоящем описании, приведено в качестве ссылки для всех целей.

Эквиваленты

Изобретение можно осуществлять в других конкретных формах без отклонения от содержания или его важных характеристик. Приведенные выше варианты осуществления, таким образом, следует считать во всех отношениях иллюстративными, а не ограничивающими изобретение, описанное в настоящем описании. Объем изобретения, таким образом, указан в прилагаемой формуле изобретения, а не в приведенном выше описании, и все изменения, которые попадают в рамки значения и диапазона эквивалентности пунктов формулы изобретения, предназначены для охвата ими.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> КАДИЛА ХЕЛЗКЭР ЛИМИТЕД

<120> Антитела против рецептора программируемой смерти PD-1 человека

<130> CHL- PCT 0802

<150> 201921027443

<151> 2019-07-09

<160> 175

<170> PatentIn версии 3.5

<210> 1

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 1

Asn Tyr Tyr Leu Tyr

1 5

<210> 2

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 2

Asn Tyr Tyr Val Tyr

1 5

<210> 3

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 3

Asn Tyr Tyr Ile Tyr

1 5

<210> 4

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 4

Thr Tyr Tyr Ile Tyr

1 5

<210> 5

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 5

Thr Tyr Tyr Val Tyr

1 5

<210> 6

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 6

Thr Tyr Tyr Met Tyr

1 5

<210> 7

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 7

Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser Gly

1 5

<210> 8

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 8

Gly Val Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Asn Tyr Lys

1 5 10 15

<210> 9

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 9

Gly Val Asn Pro Ser Asn Ser Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Asn Tyr Lys

1 5 10 15

<210> 10

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 10

Gly Val Asn Pro Ser Asn Ser Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Asn Tyr Lys

1 5 10 15

<210> 11

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 11

Gly Val Asn Pro Ser Asn Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Gln Asn Tyr Lys

1 5 10 15

<210> 12

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 12

Gly Met Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Asn Tyr Lys

1 5 10 15

<210> 13

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 13

Gly Met Asn Pro Ser Asn Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Gln Asn Tyr Lys

1 5 10 15

<210> 14

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 14

Gly Val Asn Ser Ser Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Asn Tyr Lys

1 5 10 15

<210> 15

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 15

Gly Ile Asn Ser Ser Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Asn Tyr Lys

1 5 10 15

<210> 16

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 16

Gly Val Asn Ser Ser Asn Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Asn Tyr Lys

1 5 10 15

<210> 17

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 17

Gly Leu Asn Ser Ser Asn Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Asn Tyr Lys

1 5 10 15

<210> 18

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 18

Gly Val Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Ser Glu Lys Tyr Lys

1 5 10 15

<210> 19

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 19

Gly Val Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Ser Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

<210> 20

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 20

Gly Leu Asn Pro Ser Asn Ser Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Asn Tyr Lys

1 5 10 15

<210> 21

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 21

Gly Leu Asn Pro Ser Asn Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Asn Tyr Lys

1 5 10 15

<210> 22

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 22

Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Asn Tyr Lys

1 5 10 15

<210> 23

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 23

Gly Val Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Asn Tyr Lys

1 5 10 15

<210> 24

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 24

Gly Val Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Tyr Lys

1 5 10 15

<210> 25

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 25

Gly Val Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Asn Phe Lys

1 5 10 15

<210> 26

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 26

Gly Val Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Asn Tyr Lys

1 5 10 15

<210> 27

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 27

Gly Val Asn Pro Ser Asn Ser Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Asn Tyr Lys

1 5 10 15

<210> 28

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 28

Gly Val Asn Pro Ser Asn Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Gln Asn Tyr Lys

1 5 10 15

<210> 29

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 29

Gly Met Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Asn Tyr Lys

1 5 10 15

<210> 30

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 30

Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr

1 5

<210> 31

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 31

Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Tyr Asp Tyr

1 5 10

<210> 32

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 32

Arg Asp Tyr Arg Tyr Asp Met Gly Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 33

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 33

Arg Asp Tyr Arg Tyr Asp Met Gly Tyr Asp Tyr

1 5 10

<210> 34

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 34

Arg Glu Tyr Arg Phe Asp Met Gly Tyr Asp Tyr

1 5 10

<210> 35

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 35

Arg Glu Tyr Arg Phe Asp Met Gly Tyr Glu Tyr

1 5 10

<210> 36

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 36

Arg Glu Tyr Arg Tyr Asp Met Gly Tyr Glu Tyr

1 5 10

<210> 37

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 37

Arg Asp Tyr Arg Tyr Asp Leu Gly Tyr Asp Tyr

1 5 10

<210> 38

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 38

Arg Glu Tyr Arg Tyr Asp Met Gly Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 39

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 39

Arg Asp Tyr Arg Tyr Asp Met Gly Phe Glu Tyr

1 5 10

<210> 40

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 40

Arg Asp Tyr Arg Tyr Asp Met Gly Tyr Glu Tyr

1 5 10

<210> 41

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 41

Arg Glu Tyr Arg Tyr Asp Met Gly Tyr Glu Tyr

1 5 10

<210> 42

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 42

Arg Asp Tyr Arg Tyr Asp Ile Gly Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 43

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 43

Arg Glu Tyr Arg Tyr Asp Ile Gly Tyr Asp Tyr

1 5 10

<210> 44

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 44

Arg Glu Tyr Arg Tyr Asp Ile Gly Tyr Glu Tyr

1 5 10

<210> 45

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 45

Arg Asp Tyr Arg Tyr Asp Gln Gly Tyr Asp Tyr

1 5 10

<210> 46

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 46

Arg Glu Tyr Arg Tyr Asp Gln Gly Tyr Glu Tyr

1 5 10

<210> 47

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 47

Arg Asp Tyr Arg Tyr Asp Met Gly His Asp Tyr

1 5 10

<210> 48

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 48

Glu Ser Glu Tyr

1

<210> 49

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 49

Asn Asn Asp Ile

1

<210> 50

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 50

Asn Ser Asp Phe

1

<210> 51

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 51

Asn Ser Asp His

1

<210> 52

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 52

Asn Ser Asp Tyr

1

<210> 53

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 53

Asn Ser Gly Tyr

1

<210> 54

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 54

Asn Thr Asp Trp

1

<210> 55

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 55

Asn Thr Asp Tyr

1

<210> 56

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 56

Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Phe Leu His

1 5 10 15

<210> 57

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 57

Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Trp Leu His

1 5 10 15

<210> 58

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 58

Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Leu Tyr

1 5 10 15

<210> 59

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 59

Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Ile Tyr

1 5 10 15

<210> 60

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 60

Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Phe Leu Tyr

1 5 10 15

<210> 61

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 61

Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser Gly Tyr Thr Tyr Leu Tyr

1 5 10 15

<210> 62

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 62

Arg Ala Ser Lys Asn Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Leu Tyr

1 5 10 15

<210> 63

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 63

Arg Ala Ser Glu Gly Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Leu His

1 5 10 15

<210> 64

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 64

Arg Ala Ser Glu Gly Val Ser Thr Ser Gly Phe Ser Tyr Ile His

1 5 10 15

<210> 65

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 65

Arg Ala Ser Lys Asn Val Ser Thr Thr Gly Phe Ser Tyr Leu His

1 5 10 15

<210> 66

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 66

Arg Ala Ser Lys Asn Val Ser Ser Thr Ser Tyr Ser Tyr Leu His

1 5 10 15

<210> 67

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 67

Arg Ala Ser Lys Asn Val Ser Ser Thr Ser Phe Ser Tyr Leu Tyr

1 5 10 15

<210> 68

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 68

Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Ser Thr Ser Phe Ser Tyr Ile His

1 5 10 15

<210> 69

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 69

Arg Ala Ser Arg Gly Ile Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Ile His

1 5 10 15

<210> 70

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 70

Arg Ala Ser Glu Gly Ile Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Ile His

1 5 10 15

<210> 71

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 71

Arg Ala Ser Glu Gly Leu Asp Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Ile His

1 5 10 15

<210> 72

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 72

Arg Ala Ser Glu Gly Leu Glu Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Ile His

1 5 10 15

<210> 73

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 73

Arg Ala Ser Glu Gly Ile Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Val His

1 5 10 15

<210> 74

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 74

Arg Ala Ser Lys Gly Ile Ser Thr Asp Gly Tyr Ser Tyr Met His

1 5 10 15

<210> 75

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 75

Arg Ala Ser Lys Gly Ile Ser Thr Glu Gly Tyr Ser Tyr Met His

1 5 10 15

<210> 76

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 76

Arg Ala Asp Lys Gly Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His

1 5 10 15

<210> 77

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 77

Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Leu His

1 5 10 15

<210> 78

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 78

Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Phe Ser Tyr Leu His

1 5 10 15

<210> 79

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 79

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 80

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 80

Arg Gly Ser Lys Gly Val Ser Ser Gly Ile Tyr Ser Tyr Leu His

1 5 10 15

<210> 81

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 81

Gln Ser Val Ser Ser Tyr

1 5

<210> 82

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 82

Ile Ala Ser Tyr Leu Glu Ser

1 5

<210> 83

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 83

Met Ala Ser Tyr Leu Glu Ser

1 5

<210> 84

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 84

Val Ala Ser Tyr Leu Glu Ser

1 5

<210> 85

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 85

Phe Ala Ser Tyr Leu Glu Ser

1 5

<210> 86

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 86

Ala Ala Ser Tyr Leu Glu Ser

1 5

<210> 87

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 87

Ile Ala Ser Phe Leu Glu Ser

1 5

<210> 88

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 88

Ile Ala Ser Trp Leu Glu Ser

1 5

<210> 89

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 89

Ile Ala Ser His Leu Glu Ser

1 5

<210> 90

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 90

Met Ala Ser Phe Leu Glu Ser

1 5

<210> 91

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 91

Met Ala Ser Trp Leu Glu Ser

1 5

<210> 92

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 92

Leu Ala Ser Tyr Leu Gln Ser

1 5

<210> 93

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 93

Ile Ala Ser Tyr Leu Gln Ser

1 5

<210> 94

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 94

Ile Ala Ser Phe Leu Gln Ser

1 5

<210> 95

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 95

Leu Ala Ser Phe Leu Gln Ser

1 5

<210> 96

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 96

Leu Ala Ser Trp Leu Gln Ser

1 5

<210> 97

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 97

Ile Ala Ser Trp Leu Gln Ser

1 5

<210> 98

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 98

Val Ala Ser Trp Leu Gln Ser

1 5

<210> 99

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 99

Ala Ala Ser Phe Leu Glu Ser

1 5

<210> 100

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 100

Leu Ala Asp Tyr Leu Glu Ser

1 5

<210> 101

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 101

Leu Ala Asp Tyr Ile Glu Ser

1 5

<210> 102

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 102

Leu Ala Asp Tyr Val Glu Ser

1 5

<210> 103

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 103

Leu Ala Glu Tyr Met Glu Ser

1 5

<210> 104

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 104

Leu Ala Glu Tyr Val Glu Ser

1 5

<210> 105

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 105

Leu Ala Asp Tyr Leu Glu Asp Tyr

1 5

<210> 106

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 106

Leu Ala Asp Tyr Ile Glu Asp Tyr

1 5

<210> 107

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 107

Leu Ala Glu Tyr Leu Glu Asp Tyr

1 5

<210> 108

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LASYLES

<400> 108

Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser

1 5

<210> 109

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 109

Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser

1 5

<210> 110

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 110

Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr

1 5

<210> 111

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 111

Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser

1 5

<210> 112

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 112

Asp Ala Ser

1

<210> 113

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 113

Gln His Ser Arg Glu Leu Pro Leu Thr

1 5

<210> 114

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 114

Gln His Ser Arg Asn Leu Pro Leu Thr

1 5

<210> 115

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 115

Gln His Ser Arg Glu Ile Pro Leu Thr

1 5

<210> 116

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 116

Gln His Ser Arg Asn Ile Pro Leu Thr

1 5

<210> 117

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 117

Gln His Ser Arg Asp Ile Pro Leu Thr

1 5

<210> 118

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 118

Gln His Ser Arg Asp Phe Pro Leu Thr

1 5

<210> 119

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 119

Gln His Ser Arg Asn Phe Pro Leu Thr

1 5

<210> 120

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 120

Gln His Ser Arg Asp Ile Pro Ile Thr

1 5

<210> 121

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 121

Gln His Ser Arg Asp Phe Pro Ile Thr

1 5

<210> 122

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 122

Gln Arg Ser Arg Asp Leu Pro Leu Thr

1 5

<210> 123

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 123

Gln Lys Ser Arg Asp Leu Pro Leu Thr

1 5

<210> 124

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 124

Gln Tyr Ser Arg Asp Leu Pro Ile Thr

1 5

<210> 125

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 125

Gln Arg Ser Arg Asp Ile Pro Leu Thr

1 5

<210> 126

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 126

Gln Lys Ser Arg Asp Ile Pro Leu Thr

1 5

<210> 127

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 127

Gln Tyr Ser Arg Asp Ile Pro Leu Thr

1 5

<210> 128

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 128

Gln His Glu Arg Asp Leu Pro Leu Thr

1 5

<210> 129

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 129

Gln His Glu Arg Asp Ile Pro Leu Thr

1 5

<210> 130

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 130

Gln His Arg Arg Asp Ile Pro Val Thr

1 5

<210> 131

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 131

Gln His Asp Arg Asp Leu Pro Met Thr

1 5

<210> 132

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 132

Gln His Ser Arg Asp Leu Pro Leu Thr

1 5

<210> 133

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 133

Gln His Ser Trp Glu Leu Pro Leu Thr

1 5

<210> 134

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 134

Gln His Tyr Ser Asn Tyr Pro Leu Thr

1 5

<210> 135

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 135

Gln His Ser Arg Asp Ala Pro Leu Thr

1 5

<210> 136

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 136

Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg Thr

1 5

<210> 137

<211> 120

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 137

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Tyr Ile Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Val Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Asn Tyr

50 55 60

Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Tyr Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 138

<211> 120

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 138

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Tyr Ile Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Val Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Asn Tyr

50 55 60

Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Tyr Asp Met Gly Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 139

<211> 120

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 139

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Tyr Ile Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Val Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Asn Tyr

50 55 60

Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Tyr Asp Met Gly His Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 140

<211> 120

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 140

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Tyr Ile Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Val Asn Pro Ser Asn Ser Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Asn Tyr

50 55 60

Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Tyr Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 141

<211> 120

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 141

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Tyr Ile Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Val Asn Pro Ser Asn Ser Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Asn Tyr

50 55 60

Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Tyr Asp Met Gly Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 142

<211> 120

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 142

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Tyr Ile Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Val Asn Pro Ser Asn Ser Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Asn Tyr

50 55 60

Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Tyr Asp Met Gly His Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 143

<211> 120

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 143

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Tyr Ile Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Val Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Asn Tyr

50 55 60

Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Tyr Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 144

<211> 120

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 144

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Tyr Ile Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Val Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Asn Tyr

50 55 60

Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Tyr Asp Met Gly Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 145

<211> 120

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 145

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Tyr Ile Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Val Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Asn Tyr

50 55 60

Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Tyr Asp Met Gly His Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 146

<211> 118

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 146

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Asn Ser Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser Ala Ser Thr Lys Gly

115

<210> 147

<211> 118

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 147

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Asn Ser Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser Ala Ser Thr Lys Gly

115

<210> 148

<211> 118

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 148

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Asn Ser Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser Ala Ser Thr Lys Gly

115

<210> 149

<211> 118

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 149

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Asn Thr Asp Trp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser Ala Ser Thr Lys Gly

115

<210> 150

<211> 118

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 150

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Asn Thr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser Ala Ser Thr Lys Gly

115

<210> 151

<211> 111

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 151

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg

85 90 95

Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 152

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 152

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 153

<211> 327

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 153

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

115 120 125

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

130 135 140

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

145 150 155 160

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

165 170 175

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

180 185 190

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

195 200 205

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

210 215 220

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

225 230 235 240

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

245 250 255

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

260 265 270

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

275 280 285

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

290 295 300

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

305 310 315 320

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

325

<210> 154

<211> 330

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 154

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 155

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 155

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 156

<211> 987

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 156

Gly Cys Cys Thr Cys Cys Ala Cys Cys Ala Ala Gly Gly Gly Cys Cys

1 5 10 15

Cys Cys Thr Cys Cys Gly Thr Gly Thr Thr Cys Cys Cys Thr Cys Thr

20 25 30

Gly Gly Cys Cys Cys Cys Thr Thr Gly Cys Thr Cys Cys Cys Gly Gly

35 40 45

Thr Cys Cys Ala Cys Cys Thr Cys Cys Gly Ala Gly Thr Cys Thr Ala

50 55 60

Cys Cys Gly Cys Cys Gly Cys Thr Cys Thr Gly Gly Gly Cys Thr Gly

65 70 75 80

Cys Cys Thr Gly Gly Thr Gly Ala Ala Ala Gly Ala Cys Thr Ala Cys

85 90 95

Thr Thr Cys Cys Cys Cys Gly Ala Gly Cys Cys Cys Gly Thr Gly Ala

100 105 110

Cys Cys Gly Thr Gly Thr Cys Cys Thr Gly Gly Ala Ala Cys Thr Cys

115 120 125

Thr Gly Gly Cys Gly Cys Cys Cys Thr Gly Ala Cys Cys Ala Gly Cys

130 135 140

Gly Gly Cys Gly Thr Gly Cys Ala Cys Ala Cys Cys Thr Thr Cys Cys

145 150 155 160

Cys Thr Gly Cys Cys Gly Thr Gly Cys Thr Gly Cys Ala Gly Thr Cys

165 170 175

Cys Thr Cys Cys Gly Gly Cys Cys Thr Gly Thr Ala Cys Thr Cys Cys

180 185 190

Cys Thr Gly Thr Cys Cys Thr Cys Cys Gly Thr Gly Gly Thr Gly Ala

195 200 205

Cys Cys Gly Thr Gly Cys Cys Cys Thr Cys Cys Thr Cys Cys Ala Gly

210 215 220

Cys Cys Thr Gly Gly Gly Cys Ala Cys Cys Ala Ala Gly Ala Cys Cys

225 230 235 240

Thr Ala Cys Ala Cys Cys Thr Gly Thr Ala Ala Cys Gly Thr Gly Gly

245 250 255

Ala Cys Cys Ala Cys Ala Ala Gly Cys Cys Cys Thr Cys Cys Ala Ala

260 265 270

Cys Ala Cys Cys Ala Ala Gly Gly Thr Gly Gly Ala Cys Ala Ala Gly

275 280 285

Cys Gly Gly Gly Thr Gly Gly Ala Ala Thr Cys Thr Ala Ala Gly Thr

290 295 300

Ala Cys Gly Gly Cys Cys Cys Thr Cys Cys Cys Thr Gly Cys Cys Cys

305 310 315 320

Cys Cys Cys Cys Thr Gly Cys Cys Cys Thr Gly Cys Cys Cys Cys Thr

325 330 335

Gly Ala Ala Thr Thr Thr Cys Thr Gly Gly Gly Cys Gly Gly Ala Cys

340 345 350

Cys Thr Thr Cys Cys Gly Thr Gly Thr Thr Cys Cys Thr Gly Thr Thr

355 360 365

Cys Cys Cys Cys Cys Cys Ala Ala Ala Gly Cys Cys Cys Ala Ala Gly

370 375 380

Gly Ala Cys Ala Cys Cys Cys Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Cys Thr

385 390 395 400

Cys Cys Cys Gly Gly Ala Cys Cys Cys Cys Cys Gly Ala Ala Gly Thr

405 410 415

Gly Ala Cys Cys Thr Gly Cys Gly Thr Gly Gly Thr Gly Gly Thr Gly

420 425 430

Gly Ala Cys Gly Thr Gly Thr Cys Cys Cys Ala Gly Gly Ala Ala Gly

435 440 445

Ala Thr Cys Cys Cys Gly Ala Gly Gly Thr Gly Cys Ala Gly Thr Thr

450 455 460

Cys Ala Ala Thr Thr Gly Gly Thr Ala Cys Gly Thr Gly Gly Ala Cys

465 470 475 480

Gly Gly Cys Gly Thr Gly Gly Ala Ala Gly Thr Gly Cys Ala Cys Ala

485 490 495

Ala Cys Gly Cys Cys Ala Ala Gly Ala Cys Cys Ala Ala Gly Cys Cys

500 505 510

Cys Ala Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Ala Cys Ala Gly Thr Thr Cys

515 520 525

Ala Ala Cys Thr Cys Cys Ala Cys Cys Thr Ala Cys Cys Gly Gly Gly

530 535 540

Thr Gly Gly Thr Gly Thr Cys Thr Gly Thr Gly Cys Thr Gly Ala Cys

545 550 555 560

Cys Gly Thr Gly Cys Thr Gly Cys Ala Cys Cys Ala Gly Gly Ala Cys

565 570 575

Thr Gly Gly Cys Thr Gly Ala Ala Cys Gly Gly Cys Ala Ala Ala Gly

580 585 590

Ala Gly Thr Ala Cys Ala Ala Gly Thr Gly Cys Ala Ala Gly Gly Thr

595 600 605

Gly Thr Cys Cys Ala Ala Cys Ala Ala Gly Gly Gly Cys Cys Thr Gly

610 615 620

Cys Cys Cys Thr Cys Cys Ala Gly Cys Ala Thr Cys Gly Ala Ala Ala

625 630 635 640

Ala Gly Ala Cys Cys Ala Thr Cys Thr Cys Cys Ala Ala Gly Gly Cys

645 650 655

Cys Ala Ala Gly Gly Gly Cys Cys Ala Gly Cys Cys Cys Cys Gly Cys

660 665 670

Gly Ala Gly Cys Cys Cys Cys Ala Gly Gly Thr Gly Thr Ala Cys Ala

675 680 685

Cys Cys Cys Thr Gly Cys Cys Cys Cys Cys Thr Ala Gly Cys Cys Ala

690 695 700

Gly Gly Ala Ala Gly Ala Gly Ala Thr Gly Ala Cys Cys Ala Ala Gly

705 710 715 720

Ala Ala Cys Cys Ala Gly Gly Thr Gly Thr Cys Cys Cys Thr Gly Ala

725 730 735

Cys Cys Thr Gly Thr Cys Thr Gly Gly Thr Gly Ala Ala Ala Gly Gly

740 745 750

Cys Thr Thr Cys Thr Ala Cys Cys Cys Cys Thr Cys Cys Gly Ala Thr

755 760 765

Ala Thr Cys Gly Cys Cys Gly Thr Gly Gly Ala Ala Thr Gly Gly Gly

770 775 780

Ala Gly Thr Cys Cys Ala Ala Cys Gly Gly Cys Cys Ala Gly Cys Cys

785 790 795 800

Cys Gly Ala Gly Ala Ala Cys Ala Ala Cys Thr Ala Cys Ala Ala Gly

805 810 815

Ala Cys Cys Ala Cys Cys Cys Cys Cys Cys Cys Thr Gly Thr Gly Cys

820 825 830

Thr Gly Gly Ala Cys Thr Cys Cys Gly Ala Cys Gly Gly Cys Thr Cys

835 840 845

Cys Thr Thr Cys Thr Thr Cys Cys Thr Gly Thr Ala Cys Thr Cys Thr

850 855 860

Cys Gly Gly Cys Thr Gly Ala Cys Cys Gly Thr Gly Gly Ala Cys Ala

865 870 875 880

Ala Gly Thr Cys Cys Cys Gly Gly Thr Gly Gly Cys Ala Gly Gly Ala

885 890 895

Ala Gly Gly Cys Ala Ala Cys Gly Thr Gly Thr Thr Cys Thr Cys Cys

900 905 910

Thr Gly Cys Thr Cys Cys Gly Thr Gly Ala Thr Gly Cys Ala Cys Gly

915 920 925

Ala Gly Gly Cys Cys Cys Thr Gly Cys Ala Cys Ala Ala Cys Cys Ala

930 935 940

Cys Thr Ala Cys Ala Cys Cys Cys Ala Gly Ala Ala Gly Thr Cys Cys

945 950 955 960

Cys Thr Gly Thr Cys Cys Cys Thr Gly Ala Gly Cys Cys Thr Gly Gly

965 970 975

Gly Thr Ala Ala Gly Thr Gly Ala Thr Gly Ala

980 985

<210> 157

<211> 993

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 157

Gly Cys Thr Ala Gly Cys Ala Cys Cys Ala Ala Gly Gly Gly Cys Cys

1 5 10 15

Cys Ala Thr Cys Gly Gly Thr Cys Thr Thr Cys Cys Cys Cys Cys Thr

20 25 30

Gly Gly Cys Ala Cys Cys Cys Thr Cys Cys Thr Cys Cys Ala Ala Gly

35 40 45

Ala Gly Cys Ala Cys Cys Thr Cys Thr Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala

50 55 60

Cys Ala Gly Cys Gly Gly Cys Cys Cys Thr Gly Gly Gly Cys Thr Gly

65 70 75 80

Cys Cys Thr Gly Gly Thr Cys Ala Ala Gly Gly Ala Cys Thr Ala Cys

85 90 95

Thr Thr Cys Cys Cys Cys Gly Ala Ala Cys Cys Gly Gly Thr Gly Ala

100 105 110

Cys Gly Gly Thr Gly Thr Cys Gly Thr Gly Gly Ala Ala Cys Thr Cys

115 120 125

Ala Gly Gly Cys Gly Cys Cys Cys Thr Gly Ala Cys Cys Ala Gly Cys

130 135 140

Gly Gly Cys Gly Thr Gly Cys Ala Cys Ala Cys Cys Thr Thr Cys Cys

145 150 155 160

Cys Gly Gly Cys Thr Gly Thr Cys Cys Thr Ala Cys Ala Gly Thr Cys

165 170 175

Cys Thr Cys Ala Gly Gly Ala Cys Thr Cys Thr Ala Cys Thr Cys Cys

180 185 190

Cys Thr Cys Ala Gly Cys Ala Gly Cys Gly Thr Gly Gly Thr Gly Ala

195 200 205

Cys Cys Gly Thr Gly Cys Cys Cys Thr Cys Cys Ala Gly Cys Ala Gly

210 215 220

Cys Thr Thr Gly Gly Gly Cys Ala Cys Cys Cys Ala Gly Ala Cys Cys

225 230 235 240

Thr Ala Cys Ala Thr Cys Thr Gly Cys Ala Ala Cys Gly Thr Gly Ala

245 250 255

Ala Thr Cys Ala Cys Ala Ala Gly Cys Cys Cys Ala Gly Cys Ala Ala

260 265 270

Cys Ala Cys Cys Ala Ala Gly Gly Thr Gly Gly Ala Cys Ala Ala Gly

275 280 285

Ala Ala Ala Gly Thr Thr Gly Ala Gly Cys Cys Cys Ala Ala Ala Thr

290 295 300

Cys Thr Thr Gly Thr Gly Ala Cys Ala Ala Ala Ala Cys Thr Cys Ala

305 310 315 320

Cys Ala Cys Ala Thr Gly Cys Cys Cys Ala Cys Cys Gly Thr Gly Cys

325 330 335

Cys Cys Ala Gly Cys Ala Cys Cys Thr Gly Ala Ala Cys Thr Cys Cys

340 345 350

Thr Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ala Cys Cys Gly Thr Cys Ala Gly Thr

355 360 365

Cys Thr Thr Cys Cys Thr Cys Thr Thr Cys Cys Cys Cys Cys Cys Ala

370 375 380

Ala Ala Ala Cys Cys Cys Ala Ala Gly Gly Ala Cys Ala Cys Cys Cys

385 390 395 400

Thr Cys Ala Thr Gly Ala Thr Cys Thr Cys Cys Cys Gly Gly Ala Cys

405 410 415

Cys Cys Cys Thr Gly Ala Gly Gly Thr Cys Ala Cys Ala Thr Gly Cys

420 425 430

Gly Thr Gly Gly Thr Gly Gly Thr Gly Gly Ala Cys Gly Thr Gly Ala

435 440 445

Gly Cys Cys Ala Cys Gly Ala Ala Gly Ala Cys Cys Cys Thr Gly Ala

450 455 460

Gly Gly Thr Cys Ala Ala Gly Thr Thr Cys Ala Ala Cys Thr Gly Gly

465 470 475 480

Thr Ala Cys Gly Thr Gly Gly Ala Cys Gly Gly Cys Gly Thr Gly Gly

485 490 495

Ala Gly Gly Thr Gly Cys Ala Thr Ala Ala Thr Gly Cys Cys Ala Ala

500 505 510

Gly Ala Cys Ala Ala Ala Gly Cys Cys Gly Cys Gly Gly Gly Ala Gly

515 520 525

Gly Ala Gly Cys Ala Gly Thr Ala Cys Ala Ala Cys Ala Gly Cys Ala

530 535 540

Cys Gly Thr Ala Cys Cys Gly Thr Gly Thr Gly Gly Thr Cys Ala Gly

545 550 555 560

Cys Gly Thr Cys Cys Thr Cys Ala Cys Cys Gly Thr Cys Cys Thr Gly

565 570 575

Cys Ala Cys Cys Ala Gly Gly Ala Cys Thr Gly Gly Cys Thr Gly Ala

580 585 590

Ala Thr Gly Gly Cys Ala Ala Gly Gly Ala Gly Thr Ala Cys Ala Ala

595 600 605

Gly Thr Gly Cys Ala Ala Gly Gly Thr Cys Thr Cys Cys Ala Ala Cys

610 615 620

Ala Ala Ala Gly Cys Cys Cys Thr Cys Cys Cys Ala Gly Cys Cys Cys

625 630 635 640

Cys Cys Ala Thr Cys Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Cys Cys Ala Thr

645 650 655

Cys Thr Cys Cys Ala Ala Ala Gly Cys Cys Ala Ala Ala Gly Gly Gly

660 665 670

Cys Ala Gly Cys Cys Cys Cys Gly Ala Gly Ala Ala Cys Cys Ala Cys

675 680 685

Ala Gly Gly Thr Gly Thr Ala Cys Ala Cys Cys Cys Thr Gly Cys Cys

690 695 700

Cys Cys Cys Ala Thr Cys Cys Cys Gly Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly

705 710 715 720

Ala Thr Gly Ala Cys Cys Ala Ala Gly Ala Ala Cys Cys Ala Gly Gly

725 730 735

Thr Cys Ala Gly Cys Cys Thr Gly Ala Cys Cys Thr Gly Cys Cys Thr

740 745 750

Gly Gly Thr Cys Ala Ala Ala Gly Gly Cys Thr Thr Cys Thr Ala Thr

755 760 765

Cys Cys Cys Ala Gly Cys Gly Ala Cys Ala Thr Cys Gly Cys Cys Gly

770 775 780

Thr Gly Gly Ala Gly Thr Gly Gly Gly Ala Gly Ala Gly Cys Ala Ala

785 790 795 800

Thr Gly Gly Gly Cys Ala Gly Cys Cys Gly Gly Ala Gly Ala Ala Cys

805 810 815

Ala Ala Cys Thr Ala Cys Ala Ala Gly Ala Cys Cys Ala Cys Gly Cys

820 825 830

Cys Thr Cys Cys Cys Gly Thr Gly Cys Thr Gly Gly Ala Cys Thr Cys

835 840 845

Cys Gly Ala Cys Gly Gly Cys Thr Cys Cys Thr Thr Cys Thr Thr Cys

850 855 860

Cys Thr Cys Thr Ala Cys Ala Gly Cys Ala Ala Gly Cys Thr Cys Ala

865 870 875 880

Cys Cys Gly Thr Gly Gly Ala Cys Ala Ala Gly Ala Gly Cys Ala Gly

885 890 895

Gly Thr Gly Gly Cys Ala Gly Cys Ala Gly Gly Gly Gly Ala Ala Cys

900 905 910

Gly Thr Cys Thr Thr Cys Thr Cys Ala Thr Gly Cys Thr Cys Cys Gly

915 920 925

Thr Gly Ala Thr Gly Cys Ala Thr Gly Ala Gly Gly Cys Thr Cys Thr

930 935 940

Gly Cys Ala Cys Ala Ala Cys Cys Ala Cys Thr Ala Cys Ala Cys Gly

945 950 955 960

Cys Ala Gly Ala Ala Gly Ala Gly Cys Cys Thr Cys Thr Cys Cys Cys

965 970 975

Thr Gly Thr Cys Thr Cys Cys Gly Gly Gly Thr Ala Ala Ala Thr Gly

980 985 990

Ala

<210> 158

<211> 360

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 158

Cys Ala Gly Gly Thr Gly Cys Ala Gly Cys Thr Gly Gly Thr Gly Cys

1 5 10 15

Ala Gly Thr Cys Cys Gly Gly Cys Gly Thr Gly Gly Ala Ala Gly Thr

20 25 30

Gly Ala Ala Gly Ala Ala Ala Cys Cys Thr Gly Gly Cys Gly Cys Cys

35 40 45

Thr Cys Cys Gly Thr Gly Ala Ala Gly Gly Thr Gly Thr Cys Cys Thr

50 55 60

Gly Cys Ala Ala Gly Gly Cys Cys Thr Cys Cys Gly Gly Cys Thr Ala

65 70 75 80

Cys Ala Cys Cys Thr Thr Cys Ala Cys Cys Ala Cys Cys Thr Ala Cys

85 90 95

Thr Ala Cys Ala Thr Cys Thr Ala Cys Thr Gly Gly Gly Thr Cys Cys

100 105 110

Gly Ala Cys Ala Gly Gly Cys Cys Cys Cys Ala Gly Gly Cys Cys Ala

115 120 125

Gly Gly Gly Cys Cys Thr Gly Gly Ala Ala Thr Gly Gly Ala Thr Gly

130 135 140

Gly Gly Cys Gly Gly Cys Gly Thr Gly Ala Ala Cys Cys Cys Thr Thr

145 150 155 160

Cys Cys Ala Ala Cys Gly Gly Cys Gly Gly Cys Ala Cys Cys Ala Ala

165 170 175

Cys Thr Ala Cys Ala Ala Cys Gly Ala Gly Ala Ala Cys Thr Ala Cys

180 185 190

Ala Ala Gly Ala Ala Cys Ala Gly Ala Gly Thr Gly Ala Cys Cys Cys

195 200 205

Thr Gly Ala Cys Cys Ala Cys Cys Gly Ala Cys Thr Cys Cys Thr Cys

210 215 220

Cys Ala Cys Cys Ala Cys Cys Ala Cys Cys Gly Cys Cys Thr Ala Cys

225 230 235 240

Ala Thr Gly Gly Ala Ala Cys Thr Gly Ala Ala Gly Thr Cys Cys Cys

245 250 255

Thr Gly Cys Ala Gly Thr Thr Cys Gly Ala Cys Gly Ala Cys Ala Cys

260 265 270

Cys Gly Cys Cys Gly Thr Gly Thr Ala Cys Thr Ala Cys Thr Gly Cys

275 280 285

Gly Cys Cys Ala Gly Ala Cys Gly Gly Gly Ala Cys Thr Ala Cys Ala

290 295 300

Gly Ala Thr Ala Cys Gly Ala Cys Ala Thr Gly Gly Gly Cys Thr Thr

305 310 315 320

Cys Gly Ala Cys Thr Ala Cys Thr Gly Gly Gly Gly Cys Cys Ala Gly

325 330 335

Gly Gly Cys Ala Cys Cys Ala Cys Cys Gly Thr Gly Ala Cys Cys Gly

340 345 350

Thr Gly Thr Cys Cys Thr Cys Thr

355 360

<210> 159

<211> 360

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 159

Cys Ala Gly Gly Thr Thr Cys Ala Ala Thr Thr Gly Gly Thr Gly Cys

1 5 10 15

Ala Gly Thr Cys Cys Gly Gly Cys Gly Thr Gly Gly Ala Ala Gly Thr

20 25 30

Gly Ala Ala Gly Ala Ala Ala Cys Cys Thr Gly Gly Cys Gly Cys Thr

35 40 45

Thr Cys Thr Gly Thr Gly Ala Ala Gly Gly Thr Gly Thr Cys Cys Thr

50 55 60

Gly Cys Ala Ala Gly Gly Cys Cys Thr Cys Thr Gly Gly Cys Thr Ala

65 70 75 80

Cys Ala Cys Cys Thr Thr Thr Ala Cys Cys Ala Cys Cys Thr Ala Cys

85 90 95

Thr Ala Cys Ala Thr Cys Thr Ala Cys Thr Gly Gly Gly Thr Cys Cys

100 105 110

Gly Ala Cys Ala Gly Gly Cys Thr Cys Cys Thr Gly Gly Ala Cys Ala

115 120 125

Gly Gly Gly Ala Cys Thr Thr Gly Ala Ala Thr Gly Gly Ala Thr Gly

130 135 140

Gly Gly Cys Gly Gly Cys Gly Thr Gly Ala Ala Cys Cys Cys Thr Thr

145 150 155 160

Cys Thr Ala Ala Cys Gly Gly Cys Gly Gly Cys Ala Cys Cys Ala Ala

165 170 175

Cys Thr Ala Cys Ala Ala Cys Gly Ala Gly Ala Ala Cys Thr Ala Cys

180 185 190

Ala Ala Gly Ala Ala Cys Ala Gly Ala Gly Thr Gly Ala Cys Cys Cys

195 200 205

Thr Gly Ala Cys Cys Ala Cys Cys Gly Ala Cys Thr Cys Cys Thr Cys

210 215 220

Thr Ala Cys Cys Ala Cys Cys Ala Cys Cys Gly Cys Cys Thr Ala Cys

225 230 235 240

Ala Thr Gly Gly Ala Ala Cys Thr Gly Ala Ala Gly Thr Cys Cys Cys

245 250 255

Thr Gly Cys Ala Gly Thr Thr Cys Gly Ala Cys Gly Ala Cys Ala Cys

260 265 270

Cys Gly Cys Cys Gly Thr Gly Thr Ala Cys Thr Ala Cys Thr Gly Cys

275 280 285

Gly Cys Cys Ala Gly Ala Ala Gly Ala Gly Ala Cys Thr Ala Cys Ala

290 295 300

Gly Ala Thr Ala Cys Gly Ala Cys Ala Thr Gly Gly Gly Cys Thr Ala

305 310 315 320

Cys Gly Ala Cys Thr Ala Cys Thr Gly Gly Gly Gly Cys Cys Ala Gly

325 330 335

Gly Gly Cys Ala Cys Ala Ala Cys Ala Gly Thr Gly Ala Cys Cys Gly

340 345 350

Thr Gly Thr Cys Cys Thr Cys Thr

355 360

<210> 160

<211> 377

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 160

Cys Ala Gly Gly Thr Gly Cys Ala Gly Cys Thr Gly Gly Thr Gly Cys

1 5 10 15

Ala Gly Thr Cys Cys Gly Gly Cys Gly Thr Gly Gly Ala Ala Gly Thr

20 25 30

Gly Ala Ala Gly Ala Ala Ala Cys Cys Thr Gly Gly Cys Gly Cys Cys

35 40 45

Thr Cys Cys Gly Thr Gly Ala Ala Gly Gly Thr Gly Thr Cys Cys Thr

50 55 60

Gly Cys Ala Ala Gly Gly Cys Cys Thr Cys Cys Gly Gly Cys Thr Ala

65 70 75 80

Cys Ala Cys Cys Thr Thr Cys Ala Cys Cys Ala Cys Cys Thr Ala Cys

85 90 95

Thr Ala Cys Ala Thr Cys Thr Ala Cys Thr Gly Gly Gly Thr Cys Cys

100 105 110

Gly Ala Cys Ala Gly Gly Cys Cys Cys Cys Ala Gly Gly Cys Cys Ala

115 120 125

Gly Gly Gly Cys Cys Thr Gly Gly Ala Ala Thr Gly Gly Ala Thr Gly

130 135 140

Gly Gly Cys Gly Gly Cys Gly Thr Gly Ala Ala Cys Cys Cys Thr Thr

145 150 155 160

Cys Cys Ala Ala Cys Gly Gly Cys Gly Gly Cys Ala Cys Cys Ala Ala

165 170 175

Cys Thr Ala Cys Ala Ala Cys Gly Ala Gly Ala Ala Cys Thr Ala Cys

180 185 190

Ala Ala Gly Ala Ala Cys Ala Gly Ala Gly Thr Gly Ala Cys Cys Cys

195 200 205

Thr Gly Ala Cys Cys Ala Cys Cys Gly Ala Cys Thr Cys Cys Thr Cys

210 215 220

Cys Ala Cys Cys Ala Cys Cys Ala Cys Cys Gly Cys Cys Thr Ala Cys

225 230 235 240

Ala Thr Gly Gly Ala Ala Cys Thr Gly Ala Ala Gly Thr Cys Cys Cys

245 250 255

Thr Gly Cys Ala Gly Thr Thr Cys Gly Ala Cys Gly Ala Cys Ala Cys

260 265 270

Cys Gly Cys Cys Gly Thr Gly Thr Ala Cys Thr Ala Cys Thr Gly Cys

275 280 285

Gly Cys Cys Ala Gly Ala Cys Gly Gly Gly Ala Cys Thr Ala Cys Ala

290 295 300

Gly Ala Thr Ala Cys Gly Ala Cys Ala Thr Gly Gly Gly Cys Cys Ala

305 310 315 320

Thr Gly Ala Cys Thr Ala Cys Thr Gly Gly Gly Gly Cys Cys Ala Gly

325 330 335

Gly Gly Cys Ala Cys Cys Ala Cys Cys Gly Thr Gly Ala Cys Cys Gly

340 345 350

Thr Gly Thr Cys Cys Thr Cys Thr Gly Cys Cys Thr Cys Cys Ala Cys

355 360 365

Cys Ala Ala Gly Gly Gly Cys Cys Cys

370 375

<210> 161

<211> 360

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 161

Cys Ala Gly Gly Thr Thr Cys Ala Ala Thr Thr Gly Gly Thr Gly Cys

1 5 10 15

Ala Gly Thr Cys Cys Gly Gly Cys Gly Thr Gly Gly Ala Ala Gly Thr

20 25 30

Gly Ala Ala Gly Ala Ala Ala Cys Cys Thr Gly Gly Cys Gly Cys Thr

35 40 45

Thr Cys Thr Gly Thr Gly Ala Ala Gly Gly Thr Gly Thr Cys Cys Thr

50 55 60

Gly Cys Ala Ala Gly Gly Cys Cys Thr Cys Thr Gly Gly Cys Thr Ala

65 70 75 80

Cys Ala Cys Cys Thr Thr Thr Ala Cys Cys Ala Cys Cys Thr Ala Cys

85 90 95

Thr Ala Cys Ala Thr Cys Thr Ala Cys Thr Gly Gly Gly Thr Cys Cys

100 105 110

Gly Ala Cys Ala Gly Gly Cys Thr Cys Cys Thr Gly Gly Ala Cys Ala

115 120 125

Gly Gly Gly Ala Cys Thr Thr Gly Ala Ala Thr Gly Gly Ala Thr Gly

130 135 140

Gly Gly Cys Gly Gly Cys Gly Thr Gly Ala Ala Cys Cys Cys Thr Thr

145 150 155 160

Cys Cys Ala Ala Cys Thr Cys Cys Gly Gly Cys Ala Cys Cys Ala Ala

165 170 175

Cys Thr Ala Cys Ala Ala Cys Gly Ala Gly Ala Ala Cys Thr Ala Cys

180 185 190

Ala Ala Gly Ala Ala Cys Ala Gly Ala Gly Thr Gly Ala Cys Cys Cys

195 200 205

Thr Gly Ala Cys Cys Ala Cys Cys Gly Ala Cys Thr Cys Cys Thr Cys

210 215 220

Thr Ala Cys Cys Ala Cys Cys Ala Cys Cys Gly Cys Cys Thr Ala Cys

225 230 235 240

Ala Thr Gly Gly Ala Ala Cys Thr Gly Ala Ala Gly Thr Cys Cys Cys

245 250 255

Thr Gly Cys Ala Gly Thr Thr Cys Gly Ala Cys Gly Ala Cys Ala Cys

260 265 270

Cys Gly Cys Cys Gly Thr Gly Thr Ala Cys Thr Ala Cys Thr Gly Cys

275 280 285

Gly Cys Cys Ala Gly Ala Ala Gly Ala Gly Ala Cys Thr Ala Cys Ala

290 295 300

Gly Ala Thr Ala Cys Gly Ala Cys Ala Thr Gly Gly Gly Cys Thr Thr

305 310 315 320

Cys Gly Ala Cys Thr Ala Cys Thr Gly Gly Gly Gly Cys Cys Ala Gly

325 330 335

Gly Gly Cys Ala Cys Ala Ala Cys Ala Gly Thr Gly Ala Cys Cys Gly

340 345 350

Thr Gly Thr Cys Cys Thr Cys Thr

355 360

<210> 162

<211> 360

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 162

Cys Ala Gly Gly Thr Thr Cys Ala Ala Thr Thr Gly Gly Thr Gly Cys

1 5 10 15

Ala Gly Thr Cys Cys Gly Gly Cys Gly Thr Gly Gly Ala Ala Gly Thr

20 25 30

Gly Ala Ala Gly Ala Ala Ala Cys Cys Thr Gly Gly Cys Gly Cys Thr

35 40 45

Thr Cys Thr Gly Thr Gly Ala Ala Gly Gly Thr Gly Thr Cys Cys Thr

50 55 60

Gly Cys Ala Ala Gly Gly Cys Cys Thr Cys Thr Gly Gly Cys Thr Ala

65 70 75 80

Cys Ala Cys Cys Thr Thr Thr Ala Cys Cys Ala Cys Cys Thr Ala Cys

85 90 95

Thr Ala Cys Ala Thr Cys Thr Ala Cys Thr Gly Gly Gly Thr Cys Cys

100 105 110

Gly Ala Cys Ala Gly Gly Cys Thr Cys Cys Thr Gly Gly Ala Cys Ala

115 120 125

Gly Gly Gly Ala Cys Thr Thr Gly Ala Ala Thr Gly Gly Ala Thr Gly

130 135 140

Gly Gly Cys Gly Gly Cys Gly Thr Gly Ala Ala Cys Cys Cys Thr Thr

145 150 155 160

Cys Thr Ala Ala Cys Gly Gly Cys Gly Gly Cys Ala Cys Cys Ala Ala

165 170 175

Cys Thr Ala Cys Ala Ala Cys Cys Ala Gly Ala Ala Cys Thr Ala Cys

180 185 190

Ala Ala Gly Ala Ala Cys Ala Gly Ala Gly Thr Gly Ala Cys Cys Cys

195 200 205

Thr Gly Ala Cys Cys Ala Cys Cys Gly Ala Cys Thr Cys Cys Thr Cys

210 215 220

Thr Ala Cys Cys Ala Cys Cys Ala Cys Cys Gly Cys Cys Thr Ala Cys

225 230 235 240

Ala Thr Gly Gly Ala Ala Cys Thr Gly Ala Ala Gly Thr Cys Cys Cys

245 250 255

Thr Gly Cys Ala Gly Thr Thr Cys Gly Ala Cys Gly Ala Cys Ala Cys

260 265 270

Cys Gly Cys Cys Gly Thr Gly Thr Ala Cys Thr Ala Cys Thr Gly Cys

275 280 285

Gly Cys Cys Ala Gly Ala Ala Gly Ala Gly Ala Cys Thr Ala Cys Ala

290 295 300

Gly Ala Thr Ala Cys Gly Ala Cys Ala Thr Gly Gly Gly Cys Thr Thr

305 310 315 320

Cys Gly Ala Cys Thr Ala Cys Thr Gly Gly Gly Gly Cys Cys Ala Gly

325 330 335

Gly Gly Cys Ala Cys Ala Ala Cys Ala Gly Thr Gly Ala Cys Cys Gly

340 345 350

Thr Gly Thr Cys Cys Thr Cys Thr

355 360

<210> 163

<211> 666

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 163

Gly Ala Gly Ala Thr Cys Gly Thr Gly Cys Thr Gly Ala Cys Cys Cys

1 5 10 15

Ala Gly Thr Cys Cys Cys Cys Cys Gly Cys Cys Ala Cys Cys Cys Thr

20 25 30

Gly Thr Cys Thr Cys Thr Gly Thr Cys Thr Cys Cys Cys Gly Gly Cys

35 40 45

Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Cys Cys Ala Cys Cys Cys Thr Gly Ala

50 55 60

Gly Cys Thr Gly Cys Ala Gly Ala Gly Cys Cys Thr Cys Cys Ala Ala

65 70 75 80

Gly Gly Gly Cys Gly Thr Gly Thr Cys Cys Ala Cys Cys Thr Cys Cys

85 90 95

Gly Gly Cys Thr Ala Cys Thr Cys Cys Thr Ala Cys Cys Thr Gly Cys

100 105 110

Ala Cys Thr Gly Gly Thr Ala Thr Cys Ala Gly Cys Ala Gly Ala Ala

115 120 125

Gly Cys Cys Cys Gly Gly Cys Cys Ala Gly Gly Cys Cys Cys Cys Thr

130 135 140

Cys Gly Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly Ala Thr Cys Thr Ala Cys Cys

145 150 155 160

Thr Gly Gly Cys Cys Thr Cys Cys Thr Ala Cys Cys Thr Gly Gly Ala

165 170 175

Ala Thr Cys Cys Gly Gly Cys Gly Thr Gly Cys Cys Cys Gly Cys Cys

180 185 190

Ala Gly Ala Thr Thr Cys Thr Cys Cys Gly Gly Cys Thr Cys Thr Gly

195 200 205

Gly Cys Thr Cys Thr Gly Gly Cys Ala Cys Cys Gly Ala Cys Thr Thr

210 215 220

Cys Ala Cys Cys Cys Thr Gly Ala Cys Cys Ala Thr Cys Thr Cys Cys

225 230 235 240

Ala Gly Cys Cys Thr Gly Gly Ala Ala Cys Cys Cys Gly Ala Gly Gly

245 250 255

Ala Cys Thr Thr Cys Gly Cys Cys Gly Thr Gly Thr Ala Cys Thr Ala

260 265 270

Cys Thr Gly Cys Cys Ala Gly Cys Ala Cys Thr Cys Cys Cys Gly Gly

275 280 285

Gly Ala Cys Cys Thr Gly Cys Cys Cys Cys Thr Gly Ala Cys Cys Thr

290 295 300

Thr Thr Gly Gly Cys Gly Gly Ala Gly Gly Cys Ala Cys Cys Ala Ala

305 310 315 320

Gly Gly Thr Gly Gly Ala Ala Ala Thr Cys Ala Ala Gly Cys Gly Gly

325 330 335

Ala Cys Cys Gly Thr Gly Gly Cys Cys Gly Cys Thr Cys Cys Cys Thr

340 345 350

Cys Cys Gly Thr Gly Thr Thr Cys Ala Thr Cys Thr Thr Cys Cys Cys

355 360 365

Ala Cys Cys Cys Thr Cys Cys Gly Ala Cys Gly Ala Gly Cys Ala Gly

370 375 380

Cys Thr Gly Ala Ala Gly Thr Cys Cys Gly Gly Cys Ala Cys Cys Gly

385 390 395 400

Cys Cys Thr Cys Cys Gly Thr Cys Gly Thr Gly Thr Gly Cys Cys Thr

405 410 415

Gly Cys Thr Gly Ala Ala Cys Ala Ala Cys Thr Thr Cys Thr Ala Cys

420 425 430

Cys Cys Cys Cys Gly Cys Gly Ala Gly Gly Cys Cys Ala Ala Gly Gly

435 440 445

Thr Gly Cys Ala Gly Thr Gly Gly Ala Ala Gly Gly Thr Gly Gly Ala

450 455 460

Cys Ala Ala Thr Gly Cys Cys Cys Thr Gly Cys Ala Gly Thr Cys Cys

465 470 475 480

Gly Gly Cys Ala Ala Cys Thr Cys Cys Cys Ala Gly Gly Ala Ala Thr

485 490 495

Cys Cys Gly Thr Cys Ala Cys Cys Gly Ala Gly Cys Ala Gly Gly Ala

500 505 510

Cys Thr Cys Cys Ala Ala Gly Gly Ala Cys Ala Gly Cys Ala Cys Cys

515 520 525

Thr Ala Cys Thr Cys Cys Cys Thr Gly Thr Cys Cys Thr Cys Cys Ala

530 535 540

Cys Cys Cys Thr Gly Ala Cys Cys Cys Thr Gly Thr Cys Cys Ala Ala

545 550 555 560

Gly Gly Cys Cys Gly Ala Cys Thr Ala Cys Gly Ala Gly Ala Ala Gly

565 570 575

Cys Ala Cys Ala Ala Gly Gly Thr Gly Thr Ala Cys Gly Cys Cys Thr

580 585 590

Gly Cys Gly Ala Ala Gly Thr Gly Ala Cys Cys Cys Ala Cys Cys Ala

595 600 605

Gly Gly Gly Cys Cys Thr Gly Thr Cys Cys Ala Gly Cys Cys Cys Cys

610 615 620

Gly Thr Gly Ala Cys Cys Ala Ala Gly Thr Cys Cys Thr Thr Cys Ala

625 630 635 640

Ala Cys Cys Gly Gly Gly Gly Cys Gly Ala Gly Thr Gly Cys Thr Ala

645 650 655

Ala Thr Gly Ala Gly Gly Thr Ala Cys Cys

660 665

<210> 164

<211> 1678

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 164

Gly Gly Ala Thr Ala Ala Cys Ala Ala Thr Thr Thr Cys Ala Cys Ala

1 5 10 15

Cys Ala Gly Ala Ala Thr Thr Cys Ala Thr Thr Ala Ala Ala Gly Ala

20 25 30

Gly Gly Ala Gly Ala Ala Ala Thr Thr Ala Ala Cys Cys Ala Thr Gly

35 40 45

Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ala Ala Thr Ala Thr Cys Gly Cys Ala Thr

50 55 60

Thr Thr Cys Thr Thr Cys Thr Thr Gly Cys Ala Thr Cys Thr Ala Thr

65 70 75 80

Gly Thr Thr Cys Gly Thr Thr Thr Thr Thr Thr Cys Thr Ala Thr Thr

85 90 95

Gly Cys Thr Ala Cys Ala Ala Ala Thr Gly Cys Cys Thr Ala Thr Gly

100 105 110

Cys Ala Thr Cys Cys Gly Ala Ala Ala Thr Cys Gly Thr Gly Cys Thr

115 120 125

Gly Ala Cys Cys Cys Ala Gly Thr Cys Gly Cys Cys Cys Gly Cys Thr

130 135 140

Ala Cys Ala Thr Thr Ala Thr Cys Gly Thr Thr Gly Thr Cys Ala Cys

145 150 155 160

Cys Gly Gly Gly Gly Gly Ala Ala Cys Gly Cys Gly Cys Gly Ala Cys

165 170 175

Ala Thr Thr Gly Thr Cys Cys Thr Gly Thr Cys Gly Cys Gly Cys Ala

180 185 190

Thr Cys Ala Cys Ala Gly Ala Gly Cys Gly Thr Ala Thr Cys Thr Thr

195 200 205

Cys Gly Thr Ala Thr Thr Thr Gly Gly Cys Cys Thr Gly Gly Thr Ala

210 215 220

Thr Cys Ala Gly Cys Ala Ala Ala Ala Gly Cys Cys Ala Gly Gly Cys

225 230 235 240

Cys Ala Ala Gly Cys Cys Cys Cys Cys Cys Gly Thr Cys Thr Thr Thr

245 250 255

Thr Ala Ala Thr Thr Thr Ala Thr Gly Ala Cys Gly Cys Cys Thr Cys

260 265 270

Thr Ala Ala Thr Cys Gly Cys Gly Cys Ala Ala Cys Cys Gly Gly Cys

275 280 285

Ala Thr Thr Cys Cys Thr Gly Cys Ala Cys Gly Cys Thr Thr Thr Thr

290 295 300

Cys Cys Gly Gly Cys Thr Cys Ala Gly Gly Gly Ala Gly Thr Gly Gly

305 310 315 320

Cys Ala Cys Gly Gly Ala Thr Thr Thr Cys Ala Cys Thr Thr Thr Gly

325 330 335

Ala Cys Gly Ala Thr Cys Ala Gly Thr Ala Gly Thr Cys Thr Thr Gly

340 345 350

Ala Ala Cys Cys Ala Gly Ala Ala Gly Ala Cys Thr Thr Cys Gly Cys

355 360 365

Gly Gly Thr Thr Thr Ala Cys Thr Ala Cys Thr Gly Cys Cys Ala Ala

370 375 380

Cys Ala Ala Thr Cys Cys Thr Cys Gly Ala Ala Cys Thr Gly Gly Cys

385 390 395 400

Cys Thr Cys Gly Thr Ala Cys Ala Thr Thr Thr Gly Gly Thr Cys Ala

405 410 415

Ala Gly Gly Thr Ala Cys Cys Ala Ala Gly Gly Thr Gly Gly Ala Ala

420 425 430

Ala Thr Cys Ala Ala Ala Cys Gly Cys Ala Cys Cys Gly Thr Ala Gly

435 440 445

Cys Cys Gly Cys Ala Cys Cys Gly Thr Cys Ala Gly Thr Cys Thr Thr

450 455 460

Cys Ala Thr Cys Thr Thr Cys Cys Cys Thr Cys Cys Cys Thr Cys Thr

465 470 475 480

Gly Ala Cys Gly Ala Ala Cys Ala Ala Thr Thr Ala Ala Ala Ala Thr

485 490 495

Cys Thr Gly Gly Cys Ala Cys Ala Gly Cys Thr Thr Cys Cys Gly Thr

500 505 510

Thr Gly Thr Ala Thr Gly Cys Cys Thr Thr Cys Thr Thr Ala Ala Cys

515 520 525

Ala Ala Cys Thr Thr Thr Thr Ala Thr Cys Cys Ala Cys Gly Thr Gly

530 535 540

Ala Ala Gly Cys Gly Ala Ala Ala Gly Thr Cys Cys Ala Ala Thr Gly

545 550 555 560

Gly Ala Ala Ala Gly Thr Thr Gly Ala Thr Ala Ala Thr Gly Cys Ala

565 570 575

Cys Thr Thr Cys Ala Gly Thr Cys Thr Gly Gly Gly Ala Ala Cys Thr

580 585 590

Cys Ala Cys Ala Gly Gly Ala Gly Thr Cys Cys Gly Thr Ala Ala Cys

595 600 605

Gly Gly Ala Ala Cys Ala Gly Gly Ala Cys Thr Cys Thr Ala Ala Gly

610 615 620

Gly Ala Cys Thr Cys Ala Ala Cys Cys Thr Ala Thr Ala Gly Cys Thr

625 630 635 640

Thr Ala Thr Cys Thr Thr Cys Ala Ala Cys Ala Thr Thr Gly Ala Cys

645 650 655

Ala Thr Thr Gly Thr Cys Ala Ala Ala Gly Gly Cys Ala Gly Ala Cys

660 665 670

Thr Ala Thr Gly Ala Gly Ala Ala Gly Cys Ala Cys Ala Ala Ala Gly

675 680 685

Thr Gly Thr Ala Cys Gly Cys Thr Thr Gly Thr Gly Ala Ala Gly Thr

690 695 700

Cys Ala Cys Cys Cys Ala Thr Cys Ala Gly Gly Gly Cys Thr Thr Gly

705 710 715 720

Thr Cys Thr Thr Cys Thr Cys Cys Ala Gly Thr Ala Ala Cys Cys Ala

725 730 735

Ala Ala Ala Gly Thr Thr Thr Cys Ala Ala Thr Cys Gly Cys Gly Gly

740 745 750

Gly Gly Ala Gly Thr Gly Thr Gly Gly Thr Gly Gly Thr Thr Cys Thr

755 760 765

Gly Ala Thr Thr Ala Cys Ala Ala Ala Gly Ala Thr Gly Ala Cys Gly

770 775 780

Ala Thr Gly Ala Cys Ala Ala Ala Thr Ala Ala Thr Thr Ala Ala Cys

785 790 795 800

Thr Cys Gly Ala Gly Gly Cys Thr Gly Ala Gly Cys Ala Ala Ala Gly

805 810 815

Cys Ala Gly Ala Cys Thr Ala Cys Thr Ala Ala Thr Ala Ala Cys Ala

820 825 830

Thr Ala Ala Ala Gly Thr Cys Thr Ala Cys Gly Cys Cys Gly Gly Ala

835 840 845

Cys Gly Cys Ala Thr Cys Gly Thr Gly Gly Cys Cys Cys Thr Ala Gly

850 855 860

Thr Ala Cys Gly Cys Ala Ala Gly Thr Thr Cys Ala Cys Gly Thr Ala

865 870 875 880

Ala Ala Ala Ala Gly Gly Gly Thr Ala Ala Cys Thr Ala Gly Ala Gly

885 890 895

Gly Thr Thr Gly Ala Gly Gly Thr Gly Ala Thr Thr Thr Thr Ala Thr

900 905 910

Gly Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ala Ala Thr Ala Thr Cys Gly Cys Ala

915 920 925

Thr Thr Thr Cys Thr Thr Cys Thr Thr Gly Cys Ala Thr Cys Thr Ala

930 935 940

Thr Gly Thr Thr Cys Gly Thr Thr Thr Thr Thr Thr Cys Thr Ala Thr

945 950 955 960

Thr Gly Cys Thr Ala Cys Ala Ala Ala Cys Gly Cys Gly Thr Ala Cys

965 970 975

Gly Cys Thr Gly Ala Gly Ala Thr Cys Thr Cys Cys Cys Ala Ala Gly

980 985 990

Thr Cys Cys Ala Gly Cys Thr Gly Gly Thr Thr Gly Ala Ala Thr Cys

995 1000 1005

Ala Gly Gly Thr Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gly Thr Thr Gly Thr

1010 1015 1020

Thr Cys Ala Ala Cys Cys Gly Gly Gly Gly Cys Gly Thr Thr Cys

1025 1030 1035

Cys Cys Thr Gly Cys Gly Thr Cys Thr Gly Gly Ala Cys Thr Gly

1040 1045 1050

Cys Ala Ala Ala Gly Cys Cys Thr Cys Ala Gly Gly Ala Ala Thr

1055 1060 1065

Thr Ala Cys Thr Thr Thr Thr Thr Cys Ala Ala Ala Cys Thr Cys

1070 1075 1080

Cys Gly Gly Gly Ala Thr Gly Cys Ala Cys Thr Gly Gly Gly Thr

1085 1090 1095

Thr Cys Gly Thr Cys Ala Ala Gly Cys Cys Cys Cys Cys Gly Gly

1100 1105 1110

Ala Ala Ala Ala Gly Gly Gly Thr Thr Gly Gly Ala Gly Thr Gly

1115 1120 1125

Gly Gly Thr Ala Gly Cys Ala Gly Thr Gly Ala Thr Cys Thr Gly

1130 1135 1140

Gly Thr Ala Thr Gly Ala Thr Gly Gly Cys Thr Cys Ala Ala Ala

1145 1150 1155

Ala Cys Gly Thr Thr Ala Cys Thr Ala Cys Gly Cys Gly Gly Ala

1160 1165 1170

Cys Thr Cys Gly Gly Thr Thr Ala Ala Ala Gly Gly Thr Cys Gly

1175 1180 1185

Cys Thr Thr Thr Ala Cys Thr Ala Thr Thr Thr Cys Ala Cys Gly

1190 1195 1200

Cys Gly Ala Cys Ala Ala Cys Thr Cys Gly Ala Ala Ala Ala Ala

1205 1210 1215

Thr Ala Cys Thr Thr Thr Gly Thr Thr Cys Thr Thr Ala Cys Ala

1220 1225 1230

Gly Ala Thr Gly Ala Ala Cys Thr Cys Thr Cys Thr Thr Cys Gly

1235 1240 1245

Cys Gly Cys Cys Gly Ala Ala Gly Ala Thr Ala Cys Gly Gly Cys

1250 1255 1260

Ala Gly Thr Gly Thr Ala Cys Thr Ala Thr Thr Gly Cys Gly Cys

1265 1270 1275

Cys Ala Cys Ala Ala Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Thr Ala

1280 1285 1290

Thr Thr Gly Gly Gly Gly Thr Cys Ala Ala Gly Gly Thr Ala Cys

1295 1300 1305

Ala Thr Thr Ala Gly Thr Gly Ala Cys Cys Gly Thr Cys Ala Gly

1310 1315 1320

Thr Ala Gly Cys Gly Cys Gly Ala Gly Thr Ala Cys Gly Ala Ala

1325 1330 1335

Gly Gly Gly Ala Cys Cys Thr Ala Gly Cys Gly Thr Gly Thr Thr

1340 1345 1350

Thr Cys Cys Cys Thr Thr Ala Gly Cys Ala Cys Cys Ala Thr Gly

1355 1360 1365

Thr Ala Gly Thr Cys Gly Thr Thr Cys Gly Ala Cys Ala Ala Gly

1370 1375 1380

Cys Gly Ala Ala Thr Cys Cys Ala Cys Ala Gly Cys Gly Gly Cys

1385 1390 1395

Cys Thr Thr Ala Gly Gly Gly Thr Gly Cys Thr Thr Ala Gly Thr

1400 1405 1410

Gly Ala Ala Gly Gly Ala Thr Thr Ala Thr Thr Thr Thr Cys Cys

1415 1420 1425

Cys Gly Ala Gly Cys Cys Ala Gly Thr Ala Ala Cys Ala Gly Thr

1430 1435 1440

Ala Thr Cys Gly Thr Gly Gly Ala Ala Thr Ala Gly Cys Gly Gly

1445 1450 1455

Cys Gly Cys Ala Thr Thr Ala Ala Cys Thr Thr Cys Cys Gly Gly

1460 1465 1470

Cys Gly Thr Thr Cys Ala Thr Ala Cys Cys Thr Thr Cys Cys Cys

1475 1480 1485

Thr Gly Cys Cys Gly Thr Thr Thr Thr Ala Cys Ala Gly Thr Cys

1490 1495 1500

Ala Thr Cys Cys Gly Gly Thr Thr Thr Gly Thr Ala Thr Thr Cys

1505 1510 1515

Thr Cys Thr Thr Thr Cys Gly Thr Cys Ala Gly Thr Ala Gly Thr

1520 1525 1530

Ala Ala Cys Ala Gly Thr Gly Cys Cys Thr Thr Cys Cys Thr Cys

1535 1540 1545

Cys Thr Cys Gly Cys Thr Gly Gly Gly Gly Ala Cys Cys Ala Ala

1550 1555 1560

Gly Ala Cys Cys Thr Ala Thr Ala Cys Cys Thr Gly Cys Ala Ala

1565 1570 1575

Thr Gly Thr Gly Gly Ala Cys Cys Ala Thr Ala Ala Gly Cys Cys

1580 1585 1590

Thr Thr Cys Ala Ala Ala Cys Ala Cys Ala Ala Ala Ala Gly Thr

1595 1600 1605

Ala Gly Ala Cys Ala Ala Ala Cys Gly Thr Gly Thr Thr Gly Ala

1610 1615 1620

Ala Thr Cys Ala Ala Ala Gly Thr Ala Cys Gly Gly Cys Cys Cys

1625 1630 1635

Gly Cys Cys Thr Thr Gly Thr Cys Cys Gly Cys Cys Cys Thr Gly

1640 1645 1650

Cys Gly Gly Ala Thr Cys Cys Ala Ala Ala Gly Ala Thr Ala Thr

1655 1660 1665

Cys Ala Gly Ala Thr Cys Thr Gly Gly Thr

1670 1675

<210> 165

<211> 222

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 165

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser

115 120 125

Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp

130 135 140

Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr

145 150 155 160

Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr

165 170 175

Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys

180 185 190

Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp

195 200 205

Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys

210 215 220

<210> 166

<211> 214

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 166

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 167

<211> 214

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 167

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 168

<211> 322

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 168

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser

1 5 10 15

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

20 25 30

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

35 40 45

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

50 55 60

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val

65 70 75 80

Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys

85 90 95

Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly

100 105 110

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

115 120 125

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu

130 135 140

Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

145 150 155 160

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg

165 170 175

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

180 185 190

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu

195 200 205

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

210 215 220

Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

225 230 235 240

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

245 250 255

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

260 265 270

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp

275 280 285

Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

290 295 300

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu

305 310 315 320

Gly Lys

<210> 169

<211> 356

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 169

Cys Ala Gly Gly Thr Thr Cys Ala Ala Thr Thr Gly Gly Thr Thr Gly

1 5 10 15

Ala Ala Thr Cys Thr Gly Gly Cys Gly Gly Cys Gly Gly Ala Gly Thr

20 25 30

Gly Gly Thr Gly Cys Ala Gly Cys Cys Thr Gly Gly Ala Ala Gly Ala

35 40 45

Ala Gly Thr Cys Thr Gly Ala Gly Ala Cys Thr Gly Gly Ala Thr Thr

50 55 60

Gly Cys Ala Ala Gly Gly Cys Cys Thr Cys Cys Gly Gly Cys Ala Thr

65 70 75 80

Cys Ala Cys Cys Thr Thr Cys Thr Cys Cys Ala Ala Cys Thr Cys Thr

85 90 95

Gly Gly Cys Ala Thr Gly Cys Ala Cys Thr Gly Gly Gly Thr Cys Cys

100 105 110

Gly Ala Cys Ala Gly Gly Cys Cys Cys Cys Thr Gly Gly Ala Ala Ala

115 120 125

Ala Gly Gly Ala Cys Thr Gly Gly Ala Ala Thr Gly Gly Gly Thr Cys

130 135 140

Gly Cys Cys Gly Thr Gly Ala Thr Thr Thr Gly Gly Thr Ala Cys Gly

145 150 155 160

Ala Cys Gly Gly Cys Thr Cys Thr Ala Ala Gly Cys Gly Gly Thr Ala

165 170 175

Cys Thr Ala Cys Gly Cys Cys Gly Ala Cys Thr Cys Cys Gly Thr Gly

180 185 190

Ala Ala Gly Gly Gly Cys Ala Gly Ala Thr Thr Cys Ala Cys Cys Ala

195 200 205

Thr Cys Thr Cys Thr Cys Gly Gly Gly Ala Cys Ala Ala Cys Thr Cys

210 215 220

Cys Ala Ala Gly Ala Ala Cys Ala Cys Cys Cys Thr Gly Thr Thr Thr

225 230 235 240

Cys Thr Gly Cys Ala Gly Ala Thr Gly Ala Ala Cys Thr Cys Cys Cys

245 250 255

Thr Gly Ala Gly Ala Gly Cys Cys Gly Ala Gly Gly Ala Cys Ala Cys

260 265 270

Cys Gly Cys Cys Gly Thr Gly Thr Ala Cys Thr Ala Cys Thr Gly Thr

275 280 285

Gly Cys Cys Ala Cys Cys Ala Ala Cys Thr Cys Thr Gly Ala Thr Thr

290 295 300

Thr Thr Thr Gly Gly Gly Gly Cys Cys Ala Gly Gly Gly Cys Ala Cys

305 310 315 320

Ala Cys Thr Gly Gly Thr Cys Ala Cys Cys Gly Thr Gly Thr Cys Cys

325 330 335

Thr Cys Thr Gly Cys Thr Thr Cys Thr Ala Cys Ala Ala Ala Gly Gly

340 345 350

Gly Cys Cys Cys

355

<210> 170

<211> 356

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 170

Cys Ala Gly Gly Thr Thr Cys Ala Ala Thr Thr Gly Gly Thr Thr Gly

1 5 10 15

Ala Ala Thr Cys Thr Gly Gly Cys Gly Gly Cys Gly Gly Ala Gly Thr

20 25 30

Gly Gly Thr Gly Cys Ala Gly Cys Cys Thr Gly Gly Ala Ala Gly Ala

35 40 45

Ala Gly Thr Cys Thr Gly Ala Gly Ala Cys Thr Gly Gly Ala Thr Thr

50 55 60

Gly Cys Ala Ala Gly Gly Cys Cys Thr Cys Cys Gly Gly Cys Ala Thr

65 70 75 80

Cys Ala Cys Cys Thr Thr Cys Thr Cys Cys Ala Ala Cys Thr Cys Thr

85 90 95

Gly Gly Cys Ala Thr Gly Cys Ala Cys Thr Gly Gly Gly Thr Cys Cys

100 105 110

Gly Ala Cys Ala Gly Gly Cys Cys Cys Cys Thr Gly Gly Ala Ala Ala

115 120 125

Ala Gly Gly Ala Cys Thr Gly Gly Ala Ala Thr Gly Gly Gly Thr Cys

130 135 140

Gly Cys Cys Gly Thr Gly Ala Thr Thr Thr Gly Gly Thr Ala Cys Gly

145 150 155 160

Ala Cys Gly Gly Cys Thr Cys Thr Ala Ala Gly Cys Gly Gly Thr Ala

165 170 175

Cys Thr Ala Cys Gly Cys Cys Gly Ala Cys Thr Cys Cys Gly Thr Gly

180 185 190

Ala Ala Gly Gly Gly Cys Ala Gly Ala Thr Thr Cys Ala Cys Cys Ala

195 200 205

Thr Cys Thr Cys Thr Cys Gly Gly Gly Ala Cys Ala Ala Cys Thr Cys

210 215 220

Cys Ala Ala Gly Ala Ala Cys Ala Cys Cys Cys Thr Gly Thr Thr Thr

225 230 235 240

Cys Thr Gly Cys Ala Gly Ala Thr Gly Ala Ala Cys Thr Cys Cys Cys

245 250 255

Thr Gly Ala Gly Ala Gly Cys Cys Gly Ala Gly Gly Ala Cys Ala Cys

260 265 270

Cys Gly Cys Cys Gly Thr Gly Thr Ala Cys Thr Ala Cys Thr Gly Thr

275 280 285

Gly Cys Cys Ala Cys Cys Ala Ala Thr Thr Cys Thr Gly Ala Thr Cys

290 295 300

Ala Thr Thr Gly Gly Gly Gly Cys Cys Ala Gly Gly Gly Cys Ala Cys

305 310 315 320

Ala Cys Thr Gly Gly Thr Cys Ala Cys Cys Gly Thr Gly Thr Cys Cys

325 330 335

Thr Cys Thr Gly Cys Thr Thr Cys Thr Ala Cys Ala Ala Ala Gly Gly

340 345 350

Gly Cys Cys Cys

355

<210> 171

<211> 356

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 171

Cys Ala Gly Gly Thr Thr Cys Ala Ala Thr Thr Gly Gly Thr Thr Gly

1 5 10 15

Ala Ala Thr Cys Thr Gly Gly Cys Gly Gly Cys Gly Gly Ala Gly Thr

20 25 30

Gly Gly Thr Gly Cys Ala Gly Cys Cys Thr Gly Gly Ala Ala Gly Ala

35 40 45

Ala Gly Thr Cys Thr Gly Ala Gly Ala Cys Thr Gly Gly Ala Thr Thr

50 55 60

Gly Cys Ala Ala Gly Gly Cys Cys Thr Cys Cys Gly Gly Cys Ala Thr

65 70 75 80

Cys Ala Cys Cys Thr Thr Cys Thr Cys Cys Ala Ala Cys Thr Cys Thr

85 90 95

Gly Gly Cys Ala Thr Gly Cys Ala Cys Thr Gly Gly Gly Thr Cys Cys

100 105 110

Gly Ala Cys Ala Gly Gly Cys Cys Cys Cys Thr Gly Gly Ala Ala Ala

115 120 125

Ala Gly Gly Ala Cys Thr Gly Gly Ala Ala Thr Gly Gly Gly Thr Cys

130 135 140

Gly Cys Cys Gly Thr Gly Ala Thr Thr Thr Gly Gly Thr Ala Cys Gly

145 150 155 160

Ala Cys Gly Gly Cys Thr Cys Thr Ala Ala Gly Cys Gly Gly Thr Ala

165 170 175

Cys Thr Ala Cys Gly Cys Cys Gly Ala Cys Thr Cys Cys Gly Thr Gly

180 185 190

Ala Ala Gly Gly Gly Cys Ala Gly Ala Thr Thr Cys Ala Cys Cys Ala

195 200 205

Thr Cys Thr Cys Thr Cys Gly Gly Gly Ala Cys Ala Ala Cys Thr Cys

210 215 220

Cys Ala Ala Gly Ala Ala Cys Ala Cys Cys Cys Thr Gly Thr Thr Thr

225 230 235 240

Cys Thr Gly Cys Ala Gly Ala Thr Gly Ala Ala Cys Thr Cys Cys Cys

245 250 255

Thr Gly Ala Gly Ala Gly Cys Cys Gly Ala Gly Gly Ala Cys Ala Cys

260 265 270

Cys Gly Cys Cys Gly Thr Gly Thr Ala Cys Thr Ala Cys Thr Gly Thr

275 280 285

Gly Cys Cys Ala Cys Cys Ala Ala Cys Thr Cys Thr Gly Ala Thr Thr

290 295 300

Ala Thr Thr Gly Gly Gly Gly Cys Cys Ala Gly Gly Gly Cys Ala Cys

305 310 315 320

Ala Cys Thr Gly Gly Thr Cys Ala Cys Cys Gly Thr Gly Thr Cys Cys

325 330 335

Thr Cys Thr Gly Cys Thr Thr Cys Thr Ala Cys Ala Ala Ala Gly Gly

340 345 350

Gly Cys Cys Cys

355

<210> 172

<211> 356

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 172

Cys Ala Gly Gly Thr Thr Cys Ala Ala Thr Thr Gly Gly Thr Thr Gly

1 5 10 15

Ala Ala Thr Cys Thr Gly Gly Cys Gly Gly Cys Gly Gly Ala Gly Thr

20 25 30

Gly Gly Thr Gly Cys Ala Gly Cys Cys Thr Gly Gly Ala Ala Gly Ala

35 40 45

Ala Gly Thr Cys Thr Gly Ala Gly Ala Cys Thr Gly Gly Ala Thr Thr

50 55 60

Gly Cys Ala Ala Gly Gly Cys Cys Thr Cys Cys Gly Gly Cys Ala Thr

65 70 75 80

Cys Ala Cys Cys Thr Thr Cys Thr Cys Cys Ala Ala Cys Thr Cys Thr

85 90 95

Gly Gly Cys Ala Thr Gly Cys Ala Cys Thr Gly Gly Gly Thr Cys Cys

100 105 110

Gly Ala Cys Ala Gly Gly Cys Cys Cys Cys Thr Gly Gly Ala Ala Ala

115 120 125

Ala Gly Gly Ala Cys Thr Gly Gly Ala Ala Thr Gly Gly Gly Thr Cys

130 135 140

Gly Cys Cys Gly Thr Gly Ala Thr Thr Thr Gly Gly Thr Ala Cys Gly

145 150 155 160

Ala Cys Gly Gly Cys Thr Cys Thr Ala Ala Gly Cys Gly Gly Thr Ala

165 170 175

Cys Thr Ala Cys Gly Cys Cys Gly Ala Cys Thr Cys Cys Gly Thr Gly

180 185 190

Ala Ala Gly Gly Gly Cys Ala Gly Ala Thr Thr Cys Ala Cys Cys Ala

195 200 205

Thr Cys Thr Cys Thr Cys Gly Gly Gly Ala Cys Ala Ala Cys Thr Cys

210 215 220

Cys Ala Ala Gly Ala Ala Cys Ala Cys Cys Cys Thr Gly Thr Thr Thr

225 230 235 240

Cys Thr Gly Cys Ala Gly Ala Thr Gly Ala Ala Cys Thr Cys Cys Cys

245 250 255

Thr Gly Ala Gly Ala Gly Cys Cys Gly Ala Gly Gly Ala Cys Ala Cys

260 265 270

Cys Gly Cys Cys Gly Thr Gly Thr Ala Cys Thr Ala Cys Thr Gly Thr

275 280 285

Gly Cys Cys Ala Cys Ala Ala Ala Thr Ala Cys Cys Gly Ala Thr Thr

290 295 300

Gly Gly Thr Gly Gly Gly Gly Cys Cys Ala Gly Gly Gly Cys Ala Cys

305 310 315 320

Ala Cys Thr Gly Gly Thr Cys Ala Cys Ala Gly Thr Gly Thr Cys Cys

325 330 335

Thr Cys Thr Gly Cys Thr Thr Cys Cys Ala Cys Ala Ala Ala Gly Gly

340 345 350

Gly Cys Cys Cys

355

<210> 173

<211> 356

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 173

Cys Ala Gly Gly Thr Thr Cys Ala Ala Thr Thr Gly Gly Thr Thr Gly

1 5 10 15

Ala Ala Thr Cys Thr Gly Gly Cys Gly Gly Cys Gly Gly Ala Gly Thr

20 25 30

Gly Gly Thr Gly Cys Ala Gly Cys Cys Thr Gly Gly Ala Ala Gly Ala

35 40 45

Ala Gly Thr Cys Thr Gly Ala Gly Ala Cys Thr Gly Gly Ala Thr Thr

50 55 60

Gly Cys Ala Ala Gly Gly Cys Cys Thr Cys Cys Gly Gly Cys Ala Thr

65 70 75 80

Cys Ala Cys Cys Thr Thr Cys Thr Cys Cys Ala Ala Cys Thr Cys Thr

85 90 95

Gly Gly Cys Ala Thr Gly Cys Ala Cys Thr Gly Gly Gly Thr Cys Cys

100 105 110

Gly Ala Cys Ala Gly Gly Cys Cys Cys Cys Thr Gly Gly Ala Ala Ala

115 120 125

Ala Gly Gly Ala Cys Thr Gly Gly Ala Ala Thr Gly Gly Gly Thr Cys

130 135 140

Gly Cys Cys Gly Thr Gly Ala Thr Thr Thr Gly Gly Thr Ala Cys Gly

145 150 155 160

Ala Cys Gly Gly Cys Thr Cys Thr Ala Ala Gly Cys Gly Gly Thr Ala

165 170 175

Cys Thr Ala Cys Gly Cys Cys Gly Ala Cys Thr Cys Cys Gly Thr Gly

180 185 190

Ala Ala Gly Gly Gly Cys Ala Gly Ala Thr Thr Cys Ala Cys Cys Ala

195 200 205

Thr Cys Thr Cys Thr Cys Gly Gly Gly Ala Cys Ala Ala Cys Thr Cys

210 215 220

Cys Ala Ala Gly Ala Ala Cys Ala Cys Cys Cys Thr Gly Thr Thr Thr

225 230 235 240

Cys Thr Gly Cys Ala Gly Ala Thr Gly Ala Ala Cys Thr Cys Cys Cys

245 250 255

Thr Gly Ala Gly Ala Gly Cys Cys Gly Ala Gly Gly Ala Cys Ala Cys

260 265 270

Cys Gly Cys Cys Gly Thr Gly Thr Ala Cys Thr Ala Cys Thr Gly Thr

275 280 285

Gly Cys Cys Ala Cys Cys Ala Ala Thr Ala Cys Cys Gly Ala Thr Thr

290 295 300

Ala Thr Thr Gly Gly Gly Gly Cys Cys Ala Gly Gly Gly Cys Ala Cys

305 310 315 320

Ala Cys Thr Gly Gly Thr Cys Ala Cys Cys Gly Thr Gly Thr Cys Cys

325 330 335

Thr Cys Thr Gly Cys Thr Thr Cys Thr Ala Cys Ala Ala Ala Gly Gly

340 345 350

Gly Cys Cys Cys

355

<210> 174

<211> 648

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 174

Gly Ala Gly Ala Thr Cys Gly Thr Gly Cys Thr Gly Ala Cys Cys Cys

1 5 10 15

Ala Gly Thr Cys Cys Cys Cys Cys Gly Cys Cys Ala Cys Cys Cys Thr

20 25 30

Gly Thr Cys Thr Cys Thr Gly Ala Gly Cys Cys Cys Thr Gly Gly Cys

35 40 45

Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Cys Cys Ala Cys Cys Cys Thr Gly Ala

50 55 60

Gly Cys Thr Gly Cys Ala Gly Ala Gly Cys Cys Thr Cys Cys Cys Ala

65 70 75 80

Gly Thr Cys Cys Gly Thr Gly Thr Cys Cys Thr Cys Cys Thr Ala Cys

85 90 95

Cys Thr Gly Gly Cys Cys Thr Gly Gly Thr Ala Thr Cys Ala Gly Cys

100 105 110

Ala Gly Ala Ala Gly Cys Cys Cys Gly Gly Cys Cys Ala Gly Gly Cys

115 120 125

Cys Cys Cys Thr Cys Gly Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly Ala Thr Cys

130 135 140

Thr Ala Cys Gly Ala Cys Gly Cys Cys Thr Cys Cys Ala Ala Cys Cys

145 150 155 160

Gly Gly Gly Cys Cys Ala Cys Cys Gly Gly Cys Ala Thr Cys Cys Cys

165 170 175

Thr Gly Cys Cys Ala Gly Ala Thr Thr Cys Thr Cys Cys Gly Gly Cys

180 185 190

Thr Cys Thr Gly Gly Cys Thr Cys Cys Gly Gly Cys Ala Cys Cys Gly

195 200 205

Ala Cys Thr Thr Cys Ala Cys Cys Cys Thr Gly Ala Cys Cys Ala Thr

210 215 220

Cys Thr Cys Cys Ala Gly Cys Cys Thr Gly Gly Ala Ala Cys Cys Cys

225 230 235 240

Gly Ala Gly Gly Ala Cys Thr Thr Cys Gly Cys Cys Gly Thr Gly Thr

245 250 255

Ala Cys Thr Ala Cys Thr Gly Cys Cys Ala Gly Cys Ala Gly Thr Cys

260 265 270

Cys Thr Cys Cys Ala Ala Cys Thr Gly Gly Cys Cys Cys Cys Gly Gly

275 280 285

Ala Cys Cys Thr Thr Cys Gly Gly Cys Cys Ala Gly Gly Gly Cys Ala

290 295 300

Cys Cys Ala Ala Gly Gly Thr Gly Gly Ala Ala Ala Thr Cys Ala Ala

305 310 315 320

Gly Cys Gly Gly Ala Cys Cys Gly Thr Gly Gly Cys Cys Gly Cys Thr

325 330 335

Cys Cys Cys Thr Cys Cys Gly Thr Gly Thr Thr Cys Ala Thr Cys Thr

340 345 350

Thr Cys Cys Cys Ala Cys Cys Cys Thr Cys Cys Gly Ala Cys Gly Ala

355 360 365

Gly Cys Ala Gly Cys Thr Gly Ala Ala Gly Thr Cys Cys Gly Gly Cys

370 375 380

Ala Cys Cys Gly Cys Cys Thr Cys Cys Gly Thr Gly Gly Thr Cys Thr

385 390 395 400

Gly Cys Cys Thr Gly Cys Thr Gly Ala Ala Cys Ala Ala Cys Thr Thr

405 410 415

Cys Thr Ala Cys Cys Cys Cys Cys Gly Cys Gly Ala Gly Gly Cys Cys

420 425 430

Ala Ala Gly Gly Thr Gly Cys Ala Gly Thr Gly Gly Ala Ala Gly Gly

435 440 445

Thr Gly Gly Ala Cys Ala Ala Cys Gly Cys Cys Cys Thr Gly Cys Ala

450 455 460

Gly Thr Cys Cys Gly Gly Cys Ala Ala Cys Thr Cys Cys Cys Ala Gly

465 470 475 480

Gly Ala Ala Thr Cys Cys Gly Thr Gly Ala Cys Cys Gly Ala Gly Cys

485 490 495

Ala Gly Gly Ala Cys Thr Cys Cys Ala Ala Gly Gly Ala Cys Ala Gly

500 505 510

Cys Ala Cys Cys Thr Ala Cys Thr Cys Cys Cys Thr Gly Thr Cys Cys

515 520 525

Thr Cys Cys Ala Cys Cys Cys Thr Gly Ala Cys Cys Cys Thr Gly Thr

530 535 540

Cys Cys Ala Ala Gly Gly Cys Cys Gly Ala Cys Thr Ala Cys Gly Ala

545 550 555 560

Gly Ala Ala Gly Cys Ala Cys Ala Ala Gly Gly Thr Gly Thr Ala Cys

565 570 575

Gly Cys Cys Thr Gly Cys Gly Ala Ala Gly Thr Gly Ala Cys Cys Cys

580 585 590

Ala Cys Cys Ala Gly Gly Gly Cys Cys Thr Gly Thr Cys Cys Ala Gly

595 600 605

Cys Cys Cys Cys Gly Thr Gly Ala Cys Cys Ala Ala Gly Thr Cys Cys

610 615 620

Thr Thr Cys Ala Ala Cys Cys Gly Gly Gly Gly Cys Gly Ala Gly Thr

625 630 635 640

Gly Cys Thr Gly Ala Thr Gly Ala

645

<210> 175

<211> 976

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность

<400> 175

Gly Gly Gly Cys Cys Cys Cys Thr Cys Cys Gly Thr Gly Thr Thr Cys

1 5 10 15

Cys Cys Thr Cys Thr Gly Gly Cys Cys Cys Cys Thr Thr Gly Cys Thr

20 25 30

Cys Cys Cys Gly Gly Thr Cys Cys Ala Cys Cys Thr Cys Cys Gly Ala

35 40 45

Gly Thr Cys Thr Ala Cys Cys Gly Cys Cys Gly Cys Thr Cys Thr Gly

50 55 60

Gly Gly Cys Thr Gly Cys Cys Thr Gly Gly Thr Gly Ala Ala Ala Gly

65 70 75 80

Ala Cys Thr Ala Cys Thr Thr Cys Cys Cys Cys Gly Ala Gly Cys Cys

85 90 95

Cys Gly Thr Gly Ala Cys Cys Gly Thr Gly Thr Cys Cys Thr Gly Gly

100 105 110

Ala Ala Cys Thr Cys Thr Gly Gly Cys Gly Cys Cys Cys Thr Gly Ala

115 120 125

Cys Cys Ala Gly Cys Gly Gly Cys Gly Thr Gly Cys Ala Cys Ala Cys

130 135 140

Cys Thr Thr Cys Cys Cys Thr Gly Cys Cys Gly Thr Gly Cys Thr Gly

145 150 155 160

Cys Ala Gly Thr Cys Cys Thr Cys Cys Gly Gly Cys Cys Thr Gly Thr

165 170 175

Ala Cys Thr Cys Cys Cys Thr Gly Thr Cys Cys Thr Cys Cys Gly Thr

180 185 190

Gly Gly Thr Gly Ala Cys Cys Gly Thr Gly Cys Cys Cys Thr Cys Cys

195 200 205

Thr Cys Cys Ala Gly Cys Cys Thr Gly Gly Gly Cys Ala Cys Cys Ala

210 215 220

Ala Gly Ala Cys Cys Thr Ala Cys Ala Cys Cys Thr Gly Thr Ala Ala

225 230 235 240

Cys Gly Thr Gly Gly Ala Cys Cys Ala Cys Ala Ala Gly Cys Cys Cys

245 250 255

Thr Cys Cys Ala Ala Cys Ala Cys Cys Ala Ala Gly Gly Thr Gly Gly

260 265 270

Ala Cys Ala Ala Gly Cys Gly Gly Gly Thr Gly Gly Ala Ala Thr Cys

275 280 285

Thr Ala Ala Gly Thr Ala Cys Gly Gly Cys Cys Cys Thr Cys Cys Cys

290 295 300

Thr Gly Cys Cys Cys Cys Cys Cys Cys Thr Gly Cys Cys Cys Thr Gly

305 310 315 320

Cys Cys Cys Cys Thr Gly Ala Ala Thr Thr Thr Cys Thr Gly Gly Gly

325 330 335

Cys Gly Gly Ala Cys Cys Thr Thr Cys Cys Gly Thr Gly Thr Thr Cys

340 345 350

Cys Thr Gly Thr Thr Cys Cys Cys Cys Cys Cys Ala Ala Ala Gly Cys

355 360 365

Cys Cys Ala Ala Gly Gly Ala Cys Ala Cys Cys Cys Thr Gly Ala Thr

370 375 380

Gly Ala Thr Cys Thr Cys Cys Cys Gly Gly Ala Cys Cys Cys Cys Cys

385 390 395 400

Gly Ala Ala Gly Thr Gly Ala Cys Cys Thr Gly Cys Gly Thr Gly Gly

405 410 415

Thr Gly Gly Thr Gly Gly Ala Cys Gly Thr Gly Thr Cys Cys Cys Ala

420 425 430

Gly Gly Ala Ala Gly Ala Thr Cys Cys Cys Gly Ala Gly Gly Thr Gly

435 440 445

Cys Ala Gly Thr Thr Cys Ala Ala Thr Thr Gly Gly Thr Ala Cys Gly

450 455 460

Thr Gly Gly Ala Cys Gly Gly Cys Gly Thr Gly Gly Ala Ala Gly Thr

465 470 475 480

Gly Cys Ala Cys Ala Ala Cys Gly Cys Cys Ala Ala Gly Ala Cys Cys

485 490 495

Ala Ala Gly Cys Cys Cys Ala Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Ala Cys

500 505 510

Ala Gly Thr Thr Cys Ala Ala Cys Thr Cys Cys Ala Cys Cys Thr Ala

515 520 525

Cys Cys Gly Gly Gly Thr Gly Gly Thr Gly Thr Cys Thr Gly Thr Gly

530 535 540

Cys Thr Gly Ala Cys Cys Gly Thr Gly Cys Thr Gly Cys Ala Cys Cys

545 550 555 560

Ala Gly Gly Ala Cys Thr Gly Gly Cys Thr Gly Ala Ala Cys Gly Gly

565 570 575

Cys Ala Ala Ala Gly Ala Gly Thr Ala Cys Ala Ala Gly Thr Gly Cys

580 585 590

Ala Ala Gly Gly Thr Gly Thr Cys Cys Ala Ala Cys Ala Ala Gly Gly

595 600 605

Gly Cys Cys Thr Gly Cys Cys Cys Thr Cys Cys Ala Gly Cys Ala Thr

610 615 620

Cys Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Cys Cys Ala Thr Cys Thr Cys Cys

625 630 635 640

Ala Ala Gly Gly Cys Cys Ala Ala Gly Gly Gly Cys Cys Ala Gly Cys

645 650 655

Cys Cys Cys Gly Cys Gly Ala Gly Cys Cys Cys Cys Ala Gly Gly Thr

660 665 670

Gly Thr Ala Cys Ala Cys Cys Cys Thr Gly Cys Cys Cys Cys Cys Thr

675 680 685

Ala Gly Cys Cys Ala Gly Gly Ala Ala Gly Ala Gly Ala Thr Gly Ala

690 695 700

Cys Cys Ala Ala Gly Ala Ala Cys Cys Ala Gly Gly Thr Gly Thr Cys

705 710 715 720

Cys Cys Thr Gly Ala Cys Cys Thr Gly Thr Cys Thr Gly Gly Thr Gly

725 730 735

Ala Ala Ala Gly Gly Cys Thr Thr Cys Thr Ala Cys Cys Cys Cys Thr

740 745 750

Cys Cys Gly Ala Thr Ala Thr Cys Gly Cys Cys Gly Thr Gly Gly Ala

755 760 765

Ala Thr Gly Gly Gly Ala Gly Thr Cys Cys Ala Ala Cys Gly Gly Cys

770 775 780

Cys Ala Gly Cys Cys Cys Gly Ala Gly Ala Ala Cys Ala Ala Cys Thr

785 790 795 800

Ala Cys Ala Ala Gly Ala Cys Cys Ala Cys Cys Cys Cys Cys Cys Cys

805 810 815

Thr Gly Thr Gly Cys Thr Gly Gly Ala Cys Thr Cys Cys Gly Ala Cys

820 825 830

Gly Gly Cys Thr Cys Cys Thr Thr Cys Thr Thr Cys Cys Thr Gly Thr

835 840 845

Ala Cys Thr Cys Thr Cys Gly Gly Cys Thr Gly Ala Cys Cys Gly Thr

850 855 860

Gly Gly Ala Cys Ala Ala Gly Thr Cys Cys Cys Gly Gly Thr Gly Gly

865 870 875 880

Cys Ala Gly Gly Ala Ala Gly Gly Cys Ala Ala Cys Gly Thr Gly Thr

885 890 895

Thr Cys Thr Cys Cys Thr Gly Cys Thr Cys Cys Gly Thr Gly Ala Thr

900 905 910

Gly Cys Ala Cys Gly Ala Gly Gly Cys Cys Cys Thr Gly Cys Ala Cys

915 920 925

Ala Ala Cys Cys Ala Cys Thr Ala Cys Ala Cys Cys Cys Ala Gly Ala

930 935 940

Ala Gly Thr Cys Cys Cys Thr Gly Thr Cys Cys Cys Thr Gly Ala Gly

945 950 955 960

Cys Cys Thr Gly Gly Gly Cys Ala Ala Gly Thr Gly Ala Thr Gly Ala

965 970 975

<---

Claims

1. Антитело против PD-1, или его антигенсвязывающая часть, содержащее

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 149, и

вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 152,

где антитело против PD-1 содержит константную область IgG4 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 153, содержащей единичную аминокислотную замену S228P, P329G, M428L и N434S.

2. Антитело, или его антигенсвязывающая часть, по п.1, которое связывает с PD-1 человека.

3. Антитело, или его антигенсвязывающая часть, по п.1, которое связывается с PD-1 человека со значением K_D, равным 10^-10 M или менее, предпочтительно, 10^-11 M или менее.

4. Антитело, или его антигенсвязывающая часть, по п.1, обладающее активностью ADCC и/или CDC.

5. Антитело, или его антигенсвязывающая часть, по п.1, где антитело, или его антигенсвязывающая часть, имеет по меньшей мере одну из следующих характеристик:

(a) вступает в перекрестную реакцию с PD-1 видов, отличных от человека;

(b) имеет более высокую специфичность связывания в отношении PD-1 человека;

(c) стимулирует секрецию цитокина IL-2;

(f) стимулирует пролиферацию T-клеток;

(g) имеет повышенное время полужизни у индивида.