RU2827870C1 - Method for monitoring activity of single enzyme molecules - Google Patents
Method for monitoring activity of single enzyme molecules Download PDFInfo
- Publication number
- RU2827870C1 RU2827870C1 RU2023115310A RU2023115310A RU2827870C1 RU 2827870 C1 RU2827870 C1 RU 2827870C1 RU 2023115310 A RU2023115310 A RU 2023115310A RU 2023115310 A RU2023115310 A RU 2023115310A RU 2827870 C1 RU2827870 C1 RU 2827870C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- nanopore
- enzyme
- cis
- molecule
- activity
- Prior art date
Links
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims abstract description 78
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims abstract description 78
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 50
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 44
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 title claims abstract description 32
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims abstract description 77
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 claims abstract description 31
- 108010024976 Asparaginase Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 102000015790 Asparaginase Human genes 0.000 claims abstract description 20
- 229960003272 asparaginase Drugs 0.000 claims abstract description 20
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-M asparaginate Chemical compound [O-]C(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 20
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims abstract description 19
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 19
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims abstract description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 8
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 238000005553 drilling Methods 0.000 claims description 7
- 238000010894 electron beam technology Methods 0.000 claims description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 7
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims description 6
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims description 4
- HQFLTUZKIRYQSP-UHFFFAOYSA-N 3-ethyl-2h-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C1=CC=C2N(CC)CSC2=C1 HQFLTUZKIRYQSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 abstract description 14
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 abstract description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 abstract 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 16
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 13
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 9
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 6
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 238000010884 ion-beam technique Methods 0.000 description 4
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 4
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- -1 polyethylene terephthalate Polymers 0.000 description 3
- 101710092462 Alpha-hemolysin Proteins 0.000 description 2
- 206010011732 Cyst Diseases 0.000 description 2
- 108010016183 Human immunodeficiency virus 1 p16 protease Proteins 0.000 description 2
- 208000031513 cyst Diseases 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 102100025573 1-alkyl-2-acetylglycerophosphocholine esterase Human genes 0.000 description 1
- 235000011330 Armoracia rusticana Nutrition 0.000 description 1
- 240000003291 Armoracia rusticana Species 0.000 description 1
- 102000004041 Caspase 7 Human genes 0.000 description 1
- 108090000567 Caspase 7 Proteins 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N D-OH-Asp Natural products OC(=O)C(N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N L-Aspartic acid Natural products OC(=O)[C@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000588701 Pectobacterium carotovorum Species 0.000 description 1
- 108700020962 Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 229910052581 Si3N4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 108010011834 Streptolysins Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 101150059062 apln gene Proteins 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 229960005261 aspartic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003012 bilayer membrane Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 1
- 238000013500 data storage Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000005669 field effect Effects 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 238000007672 fourth generation sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001451 organic peroxides Chemical class 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 229920000139 polyethylene terephthalate Polymers 0.000 description 1
- 239000005020 polyethylene terephthalate Substances 0.000 description 1
- 229920005597 polymer membrane Polymers 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Abstract
Description
Изобретение относится к области энзимологии единичных молекул и может быть использовано для исследований ферментативных активностей единичных молекул фермента с применением нанотехнологии, а также процессов денатурации единичных молекул ферментов. The invention relates to the field of single molecule enzymology and can be used to study the enzymatic activities of single enzyme molecules using nanotechnology, as well as the processes of denaturation of single enzyme molecules.
Имеются работы по использованию нанопоры как метода детекции единичных молекул ДНК и белков. Так в работе [J. J. Kasianowicz, E. Brandin, D. Branton, D. W. Deamer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93, 13770] рассматривается регистрация альфа-гемолизина через природную нанопору, образованную белковым каналом, этот белок был выделен из Staphylococcus aureus. В этом методе ДНК электрофоретический проходит через альфа-гемолизиновую пору, которая встраивалась в липидный бислой, который в свою очередь покрывал отверстие между двумя резервуарами (цис- и транс-). Между этими резервуарами подавалось напряжение, под действием которого в жидкости происходило движение отрицательно заряженной молекулы ДНК через нанопору из цис-камеры в транс-камеру. При этом регистрировался электрический ток, проходящий через эту пору, которая менялась в зависимости от нуклеотидной последовательности ДНК. Имеется способ детекции последовательности ДНК с помощью такого метода, который приводится в патенте Oxford nanopore [US8673556B2]. Однако этот метод обладает недостатком: невозможность изменять размер поры искусственным путем под требуемые задачи, а также механическая и химическая нестабильность поры [C. Dekker, Nat. Nanotechnol. 2007, 2, 209; J. Li, D. Stein, C. McMullan, D. Branton, M. J. Aziz, J. A. Golovchenko, Nature 2001, 412, 166; A. J. Storm, J. H. Chen, X. S. Ling, H. W. Zandbergen, C. Dekker, Nat. Mater. 2003, 2, 537].There are works on the use of nanopores as a method for detecting single molecules of DNA and proteins. Thus, in the work [J. J. Kasianowicz, E. Brandin, D. Branton, D. W. Deamer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93, 13770] the registration of alpha-hemolysin through a natural nanopore formed by a protein channel is considered; this protein was isolated from Staphylococcus aureus. In this method, DNA electrophoretically passes through an alpha-hemolysin pore, which is embedded in a lipid bilayer, which in turn covers the opening between two reservoirs (cis- and trans-). A voltage was applied between these reservoirs, under the action of which a negatively charged DNA molecule moved through the nanopore from the cis-chamber to the trans-chamber in the liquid. In this case, the electric current passing through this pore was recorded, which changed depending on the nucleotide sequence of DNA. There is a method for detecting DNA sequence using this method, which is given in the Oxford nanopore patent [US8673556B2]. However, this method has a drawback: it is impossible to change the pore size artificially for the required tasks, as well as the mechanical and chemical instability of the pore [C. Dekker, Nat. Nanotechnol. 2007, 2, 209; J. Li, D. Stein, C. McMullan, D. Branton, M. J. Aziz, J. A. Golovchenko, Nature 2001, 412, 166; A. J. Storm, J. H. Chen, X. S. Ling, H. W. Zandbergen, C. Dekker, Nat. Mater. 2003, 2, 537].
Имеются и другие биологические нанопоры, организованные белковыми структурами, которые имеют несколько отличающиеся по размеру апертуры, однако эти изменения не очень значительны для регистрации белковых молекул, так как они, как правило, не позволяют встраивать в эту пору единичную молекулу фермента, например, такие поры как нанопоры MspA из Micobacterium smegmatis [E. A. Manrao, I. M. Derrington, A. H. Laszlo, K. W. Langford, M. K. Hopper, N. Gillgren, M. Pavlenok, M. Niederweis, J. H. Gundlach, Nat. Biotechnol. 2012, 30, 349.]. Размер данных пор в узкой части 1нм, а в широкой - порядка 4 нм.There are also other biological nanopores organized by protein structures that have slightly different aperture sizes, but these changes are not very significant for the registration of protein molecules, since they, as a rule, do not allow a single enzyme molecule to be embedded into this pore, for example, such pores as the MspA nanopores from Micobacterium smegmatis [E. A. Manrao, I. M. Derrington, A. H. Laszlo, K. W. Langford, M. K. Hopper, N. Gillgren, M. Pavlenok, M. Niederweis, J. H. Gundlach, Nat. Biotechnol. 2012, 30, 349.]. The size of these pores in the narrow part is 1 nm, and in the wide part it is about 4 nm.
Имеются описания нанопоры, сформированной в бислойной мембране, в которую иммобилизован нанопоровый объект, состоящий из белка типа бактериального амилоид-секретирующего канала (CsgC), этот канал использован в разработке секвенатора компании «Oxford Nanopore» и с 2016 года содержит в качестве нанопоры модифицированный CsgC [Баркова Дарья Валерьевна, Андрианова Мария Сергеевна, Комарова Наталья Владимировна, Кузнецов Александр Евгеньевич. Канальные и моторные белки для транслокации нуклеиновых кислот в технологии нанопорового секвенирования // Вестник Московского университета. Серия 2. Химия. 2020. №3]. Канал имеет большой размер около 4-5 нм во входной части, однако этот диаметр недостаточен для работы с белковыми структурами, размеры которых превышают 5 нм.There are descriptions of a nanopore formed in a bilayer membrane in which a nanopore object consisting of a protein of the bacterial amyloid-secreting channel (CsgC) type is immobilized; this channel was used in the development of a sequencer by Oxford Nanopore and since 2016 contains a modified CsgC as a nanopore [Barkova Daria Valerievna, Andrianova Maria Sergeevna, Komarova Natalia Vladimirovna, Kuznetsov Alexander Evgenievich. Channel and motor proteins for nucleic acid translocation in nanopore sequencing technology // Bulletin of Moscow University. Series 2. Chemistry. 2020. No. 3]. The channel has a large size of about 4-5 nm in the input part, but this diameter is insufficient for working with protein structures whose sizes exceed 5 nm.
Имеются также поры на базе phi29 моторного белка, диаметр которых 3-6 нм. Однако этот размер недостаточен для работы с широким диапазоном белковых структур, размеры которых могут превышать размеры этих нанопор.There are also pores based on the phi29 motor protein, the diameter of which is 3-6 nm. However, this size is insufficient for working with a wide range of protein structures, the sizes of which may exceed the sizes of these nanopores.
Имеются также белковые поры, размеры которых гораздо больше, порядка 40 нм, например, нанопоры, образованные из Streptolysin, однако их размеры были очень большими, порядка 30 нм, что намного больше размера белков, и белок может проскакивать через эти поры, не иммобилизуясь на нанопоре.There are also protein pores that are much larger in size, on the order of 40 nm, for example, the nanopores formed from Streptolysin, but their sizes were very large, on the order of 30 nm, which is much larger than the size of proteins, and the protein can slip through these pores without being immobilized on the nanopore.
Для преодоления этих недостатков можно использовать твердотельную нанопору. Твердотельная нанопора использовалась для исследования пептидов [Karmi A, Sakala GP, Rotem D, Reches M, Porath D. Durable, Stable, and Functional Nanopores Decorated by Self-Assembled Dipeptides. ACS Appl Mater Interfaces. 2020 Mar 25;12(12):14563-14568. doi: 10.1021/acsami.0c00062. Epub 2020 Mar 16. PMID: 32129065; PMCID: PMC7467542]. Эти твердотельные нанопоры были также использованы для анализа первичной структуры белка (секвенирования), например, в работе [Kolmogorov M, Kennedy E, Dong Z, Timp G, Pevzner PA. Single-molecule protein identification by sub-nanopore sensors. PLoS Comput Biol. 2017 May 9;13(5):e1005356. doi: 10.1371/journal.pcbi.1005356. PMID: 28486472; PMCID: PMC5423552]. To overcome these drawbacks, a solid-state nanopore can be used. A solid-state nanopore has been used to study peptides [Karmi A, Sakala GP, Rotem D, Reches M, Porath D. Durable, Stable, and Functional Nanopores Decorated by Self-Assembled Dipeptides. ACS Appl Mater Interfaces. 2020 Mar 25;12(12):14563-14568. doi: 10.1021/acsami.0c00062. Epub 2020 Mar 16. PMID: 32129065; PMCID: PMC7467542]. These solid-state nanopores have also been used for protein primary structure analysis (sequencing), for example, in the work of [Kolmogorov M, Kennedy E, Dong Z, Timp G, Pevzner PA. Single-molecule protein identification by sub-nanopore sensors. PLoS Comput Biol. 2017 May 9;13(5):e1005356. doi: 10.1371/journal.pcbi.1005356. PMID: 28486472; PMCID: PMC5423552].
Наиболее перспективным направлением в нанопоровой технологии для исследования активности фермента является технология, на базе использования Solid-state nanopore с диаметром поры порядка и более 5 нм [Li, J.; Stein, D.; McMullan, C.; Branton, D.; Aziz, M.J.; Golovchenko, J.A. Ion-beam sculpting at nanometre length scales. Nature 2001, 412, 166–169.]. The most promising direction in nanopore technology for studying enzyme activity is the technology based on the use of solid-state nanopores with a pore diameter of about 5 nm or more [Li, J.; Stein, D.; McMullan, C.; Branton, D.; Aziz, M.J.; Golovchenko, J.A. Ion-beam sculpting at nanometre length scales. Nature 2001, 412, 166–169.].
Solid-state nanopore может быть сконструирована с помощью различных методов, таких как сфокусированный ионный пучок [Li, J.; Stein, D.; McMullan, C.; Branton, D.; Aziz, M.J.; Golovchenko, J.A. Ion-beam sculpting at nanometre length scales. Nature 2001, 412, 166–169.], облучением тяжелыми ионами, которые образуют треки в полимерных мембранах [Apel, P. Yu.; Blonskaya, I. V.; Dmitriev, S. N.; Orelovich, O. L.; Sartowska, B. A. Ion track symmetric and asymmetric nanopores in polyethylene terephthalate foils for versatile applications // Nuclear Inst. and Methods in Physics Research, B, Volume 365, p. 409-413. Pub Date: December 2015 DOI: 10.1016/j.nimb.2015.07.016; Sun H, Yao C, You K, Chen C, Liu S, Xu Z. Nanopore single-molecule biosensor in protein denaturation analysis. Anal Chim Acta. 2023 Feb 22;1243:340830. doi: 10.1016/j.aca.2023.340830. Epub 2023 Jan 12. PMID: 36697181], а также методом electron-beam drilling (EBD) [Nam, S.W.; Rooks, M.J.; Kim, K.B.; Rossnagel, S.M. Ionic field effect transistors with sub-10 nm multiple nanopores. Nano Lett. 2009, 9, 2044–2048]. Solid-state nanopore can be constructed using various methods, such as focused ion beam [Li, J.; Stein, D.; McMullan, C.; Branton, D.; Aziz, M.J.; Golovchenko, J.A. Ion-beam sculpting at nanometre length scales. Nature 2001, 412, 166–169.], irradiation with heavy ions, which form tracks in polymer membranes [Apel, P. Yu.; Blonskaya, I. V.; Dmitriev, S. N.; Orelovich, O. L.; Sartowska, B. A. Ion track symmetric and asymmetric nanopores in polyethylene terephthalate foils for versatile applications // Nuclear Inst. and Methods in Physics Research, B, Volume 365, p. 409–413. Pub Date: December 2015 DOI: 10.1016/j.nimb.2015.07.016; Sun H, Yao C, You K, Chen C, Liu S, Xu Z. Nanopore single-molecule biosensor in protein denaturation analysis. Anal Chim Acta. 2023 Feb 22;1243:340830. doi: 10.1016/j.aca.2023.340830. Epub 2023 Jan 12. PMID: 36697181], as well as the electron-beam drilling (EBD) method [Nam, S.W.; Rooks, M.J.; Kim, K.B.; Rossnagel, S. M. Ionic field effect transistors with sub-10 nm multiple nanopores. Nano Lett. [2009, 9, 2044–2048].
Однако сфокусированный ионный пучок не позволяет сделать качественную нанопору размером порядком 5 нм. В то же время метод облучением тяжелыми ионами, образующими треки, является более близким к цели изготовления нанопоры – для исследования функциональной активности ферментов [Sun H, Yao C, You K, Chen C, Liu S, Xu Z. Nanopore single-molecule biosensor in protein denaturation analysis. Anal Chim Acta. 2023 Feb 22;1243:340830. doi: 10.1016/j.aca.2023.340830. Epub 2023 Jan 12. PMID: 36697181], но он требует очень аккуратного манипулирования с одиночными треками и может не давать точные результаты по изготовлению нанопоры необходимого размера. С этой точки зрения наиболее подходящим методом является метод изготовления нанопоры с использованием electron-beam drilling (EBD). В качестве материалов для изготовления такой нанопоры используется, как правило, Si3N4 или, в общем случае, Six-Ny. However, a focused ion beam does not allow making a high-quality nanopore with a size of about 5 nm. At the same time, the method of irradiation with heavy ions forming tracks is closer to the goal of fabricating a nanopore - to study the functional activity of enzymes [Sun H, Yao C, You K, Chen C, Liu S, Xu Z. Nanopore single-molecule biosensor in protein denaturation analysis. Anal Chim Acta. 2023 Feb 22;1243:340830. doi: 10.1016/j.aca.2023.340830. Epub 2023 Jan 12. PMID: 36697181], but it requires very careful manipulation of single tracks and may not give accurate results for fabricating a nanopore of the required size. From this point of view, the most suitable method is the method of manufacturing a nanopore using electron-beam drilling (EBD). As a material for the manufacture of such a nanopore, Si3N4 or, in general, Six-Ny are used.
Прототипом настоящего изобретения является способ регистрации активности единичных молекул с помощью биологической нанопоры. Эти биологические нанопоры, несмотря на их недостатки, использовались во время работ для изучения активности ферментов в следующих работах:The prototype of the present invention is a method for recording the activity of single molecules using a biological nanopore. These biological nanopores, despite their shortcomings, were used during the work to study the activity of enzymes in the following works:
1.Pham B. et al. A nanopore approach for analysis of caspase-7 activity in cell lysates //Biophysical journal. – 2019. – Т. 117. – №. 5. – С. 844-855.1.Pham B. et al. A nanopore approach for analysis of caspase-7 activity in cell lysates //Biophysical journal. – 2019. – T. 117. – No. 5. – pp. 844-855.
2. Wang L. et al. Real-time label-free measurement of HIV-1 protease activity by nanopore analysis //Biosensors and Bioelectronics. – 2014. – Т. 62. – С. 158-162. 2. Wang L. et al. Real-time label-free measurement of HIV-1 protease activity by nanopore analysis //Biosensors and Bioelectronics. – 2014. – T. 62. – P. 158-162.
3.L. Wang, Y. Han, et al., X. Guan Real-time label-free measurement of HIV-1 protease activity by nanopore analysis Biosens. Bioelectron, 62 (2014), pp. 158-162. 3.L. Wang, Y. Han, et al., X. Guan Real-time label-free measurement of HIV-1 protease activity by nanopore analysis Biosens. Bioelectron, 62 (2014), pp. 158-162.
4.S. Zhou, L. Wang, et al., X. Guan Label-free nanopore single-molecule measurement of trypsin activity ACS Sens, 1 (2016), pp. 607-613; M. Kukwikila, S. Howorka Nanopore-based electrical and label-free sensing of enzyme activity in blood serum Anal. Chem, 87 (2015), pp. 9149-9154].4.S. Zhou, L. Wang, et al., X. Guan Label-free nanopore single-molecule measurement of trypsin activity ACS Sens, 1 (2016), pp. 607-613; M. Kukwikila, S. Howorka Nanopore-based electrical and label-free sensing of enzyme activity in blood serum Anal. Chem, 87 (2015), pp. 9149-9154].
В этих работах исследовалась функционирование единичной молекулы фермента, иммобилизованной вблизи биологической нанопоры, при этом анализировался ионный ток, возникающий при функционировании фермента, который располагался непосредственно вблизи нанопоры. Однако к недостаткам таких нанопор относится их нестабильность во времени, невозможность изменять размер поры искусственным путем под требуемые задачи, а также их механическая и химическая нестабильность [Lee K, Park KB, Kim HJ, Yu JS, Chae H, Kim HM, Kim KB. Recent Progress in Solid-State Nanopores. Adv Mater. 2018 Oct;30(42):e1704680. doi: 10.1002/adma.201704680. Epub 2018 Sep 10. PMID: 30260506].These studies investigated the functioning of a single enzyme molecule immobilized near a biological nanopore, and analyzed the ion current arising from the functioning of the enzyme, which was located directly near the nanopore. However, the disadvantages of such nanopores include their instability over time, the inability to artificially change the pore size for the required tasks, as well as their mechanical and chemical instability [Lee K, Park KB, Kim HJ, Yu JS, Chae H, Kim HM, Kim KB. Recent Progress in Solid-State Nanopores. Adv Mater. 2018 Oct;30(42):e1704680. doi: 10.1002/adma.201704680. Epub 2018 Sep 10. PMID: 30260506].
Техническим результатом предлагаемого в настоящем изобретении способа мониторинга активности единичных молекул фермента с помощью нанопоры является расширение арсенала технических средств осуществления способа мониторинга активности единичных молекул. The technical result of the method for monitoring the activity of single enzyme molecules using a nanopore proposed in the present invention is an expansion of the arsenal of technical means for implementing the method for monitoring the activity of single molecules.
Для достижения заявленного технического результата предлагается способ мониторинга активности единичных молекул фермента класса оксидоредуктаз на примере пероксидазы хрена и класса гидролаз на примере аспарагиназы с использованием нанопорового детектора, содержащего кювету с цис- и транс-камерами, между которыми вставлена нанопора в форме конуса, изготовленная методом electron-beamdrilling (EBD) в Six-Ny, включающий, введение в цис-камеру кюветы нанопорового детектора раствор буфера, содержащего фермент, а в транс-камеру раствор буфера без фермента, подачу напряжения тока между цис- и транс-камерами, с помощью которого в нанопору вводят единичную молекулу фермента с последующей ее иммобилизацией и контролем процесса иммобилизации ее в нанопоре по величине изменения электрического тока, протекающего через нанопору, промывание цис-камеры от не иммобилизованных молекул фермента, добавление в цис-камеру буферного раствора субстрата, вызывающего активность фермента и последующее осуществление по изменению тока, протекающего через нанопору, мониторинга активности фермента при взаимодействии его молекулы с молекулой введенного буферного раствора субстрата. In order to achieve the claimed technical result, a method is proposed for monitoring the activity of single molecules of an enzyme of the oxidoreductase class using horseradish peroxidase as an example and a hydrolase class using asparaginase as an example using a nanopore detector containing a cuvette with cis- and trans-chambers, between which a cone-shaped nanopore is inserted, manufactured by the electron-beam drilling (EBD) method in Six-Ny, including introducing a buffer solution containing the enzyme into the cis-chamber of the nanopore detector cuvette, and a buffer solution without the enzyme into the trans-chamber, applying a voltage between the cis- and trans-chambers, by means of which a single molecule of the enzyme is introduced into the nanopore with its subsequent immobilization and monitoring the process of its immobilization in the nanopore by the magnitude of the change in the electric current flowing through the nanopore, washing the cis-chamber from non-immobilized enzyme molecules, adding a buffer solution of the substrate to the cis-chamber, causing enzyme activity and subsequent monitoring of enzyme activity by changing the current flowing through the nanopore during the interaction of its molecule with a molecule of the introduced substrate buffer solution.
Нанопору изготавливают с помощью метода electron-beam drilling (EBD) в Six-Ny в форме конуса, верхняя часть которого соответствует размеру молекулы фермента, а нижняя часть меньше ее размера, и встраивается в кювету, имеющую цис- и транс-часть, между которыми прикладывается напряжение, которое позволяет доставлять молекулу субстрата в фермент, иммобилизованный в нанопоре. Быстродействие функционирования нанопоры определяется быстродействием работы фермента.The nanopore is fabricated using the electron-beam drilling (EBD) method in Six-Ny in the form of a cone, the upper part of which corresponds to the size of the enzyme molecule, and the lower part is smaller than its size, and is built into a cuvette having a cis- and trans-part, between which a voltage is applied, which allows the substrate molecule to be delivered to the enzyme immobilized in the nanopore. The speed of the nanopore is determined by the speed of the enzyme.
Новизна предлагаемого способа заключается в том, что способ мониторинга активности единичных молекул фермента c помощью нанопоры в форме конуса по изменению силы тока, протекающего через нее, реализуется впервые с использованием в качестве примера единичных молекул ферментов пероксидазы и аспарагиназы, иммобилизованных в нанопоре. The novelty of the proposed method lies in the fact that the method of monitoring the activity of single enzyme molecules using a cone-shaped nanopore by changing the current flowing through it is implemented for the first time using as an example single molecules of the enzymes peroxidase and asparaginase immobilized in a nanopore.
Особенностью и существенными признаками предлагаемого способа как необходимого условия проведения мониторинга активности единичной молекулы фермента при ферментативной реакции является:The peculiarity and essential features of the proposed method as a necessary condition for monitoring the activity of a single enzyme molecule during an enzymatic reaction are:
изготовление искусственной конической нанопоры размера, соответствующего размеру молекулы фермента необходимого для иммобилизации фермента в нанопоре;production of an artificial conical nanopore of a size corresponding to the size of the enzyme molecule required for immobilization of the enzyme in the nanopore;
иммобилизация молекулы фермента в нанопору;immobilization of the enzyme molecule in a nanopore;
контроль иммобилизации фермента в нанопоре по измерению силы тока, протекающего через нанопору;control of enzyme immobilization in a nanopore by measuring the current flowing through the nanopore;
мониторинг при вызове активности единичной молекулы фермента, иммобилизованной в нанопоре, путем измерения силы тока в реальном времени проведения ферментативной реакции введением в цис-камеру кюветы молекулы субстрата или необходимых компонентов для увеличения активности фермента. monitoring the induction of activity of a single enzyme molecule immobilized in a nanopore by measuring the current strength in real time during the enzymatic reaction by introducing a substrate molecule or the necessary components to increase enzyme activity into the cis-chamber of the cuvette.
Проведенный анализ уровня техники показал, что в современных системах мониторинга активности единичных молекул ферментов не использованы технические решения с использованием ферментов, относящихся к классу оксидоредуктаз и к классу гидролаз на примере пероксидазе и аспарагиназе, таким образом, предлагаемое техническое решение, соответствует критерию «новизна».The conducted analysis of the state of the art showed that modern systems for monitoring the activity of single enzyme molecules do not use technical solutions using enzymes belonging to the class of oxidoreductases and to the class of hydrolases, for example, peroxidase and asparaginase, thus, the proposed technical solution meets the criterion of “novelty”.
Пероксидаза, относящаяся к классу ферментов оксидоредуктаз, проводит каталическое окисление различных субстратов с помощью перекиси водорода (H2O2) или органических перекисей. Пероксидазы выделяются из различных источников, но наиболее изучена растительная пероксидаза (из корней хрена; молярная масса 44100). Peroxidase, a class of enzymes called oxidoreductases, catalyzes the oxidation of various substrates using hydrogen peroxide (H2O2) or organic peroxides. Peroxidases are isolated from various sources, but the most studied is plant peroxidase (from horseradish roots; molar mass 44100).
Аспарагиназа, относящаяся к ферменту класса гидролаз, катализирует гидролиз преимущественно L-аспарагина. В настоящем изобретении применяется L-аспарагиназа II типа из продуцента Erwinia carotovora. Она переводит в результате каталитического цикла L-аспарагин в L-аспарагиновую кислоту и ионы аммония. Ее молекулярная масса составляет около 144 kDa и представляет из себя 4 субъединицы массой 36 kDa. Активность сайта этого фермента образована на интерфейсе между субъединицами этого олигомера.Asparaginase, which belongs to the hydrolase class of enzymes, catalyzes the hydrolysis of mainly L-asparagine. In the present invention, L-asparaginase type II from the producer Erwinia carotovora is used. It converts L-asparagine into L-aspartic acid and ammonium ions as a result of the catalytic cycle. Its molecular weight is about 144 kDa and is 4 subunits weighing 36 kDa. The activity site of this enzyme is formed at the interface between the subunits of this oligomer.
При анализе известных аналогов не обнаружены предложения, включающих совокупность существенных признаков, изложенных в формуле изобретения, из чего следует, что для специалистов, занимающихся энзимологией единичных молекул и мониторингом активности фермента, оно явным образом не следует из уровня техники и, следовательно, соответствует критерию «изобретательский уровень».When analyzing known analogues, no proposals were found that include the set of essential features set out in the formula of the invention, from which it follows that for specialists engaged in the enzymology of single molecules and monitoring of enzyme activity, it does not clearly follow from the level of technology and, therefore, meets the criterion of “inventive step”.
Ниже представлен способ осуществления мониторинга активности единичных молекул фермента на примере двух типов ферментов: пероксидазы и аспарагиназы с помощью нанопорового детектора, содержащего кювету с цис- и транс-камерами, которые разделены нанопорой конической формы; электронный блок для преобразования тока, протекающего через нанопору и компьютер, записывающий измеренный ток в текущем реальном времени. Below is presented a method for monitoring the activity of single enzyme molecules using two types of enzymes as an example: peroxidase and asparaginase using a nanopore detector containing a cuvette with cis- and trans-chambers that are separated by a conical nanopore; an electronic unit for converting the current flowing through the nanopore and a computer recording the measured current in real time.
В примерах 1 и 2 осуществления предлагаемого в настоящем изобретении способе мониторинга активности единичной молекулы фермента использовались две различные по размеру поры для иллюстрации различия функционирования активности единичных молекул пероксидазы хрена (HRP) с учетом гетерогенности фермента HRP.In Examples 1 and 2 of the embodiment of the method for monitoring the activity of a single enzyme molecule proposed in the present invention, two pores of different sizes were used to illustrate the difference in the functioning of the activity of single horseradish peroxidase (HRP) molecules, taking into account the heterogeneity of the HRP enzyme.
ПРИМЕР 1.EXAMPLE 1.
Способ мониторинга активности единичных молекул фермента пероксидазы хрена осуществляют поэтапно следующим образом:The method for monitoring the activity of single molecules of the horseradish peroxidase enzyme is carried out in stages as follows:
1. Для подготовки нанопорового детектора изготавливают методом electron-beamdrilling (EBD) в Six-Ny нанопору конической формы с размером порядка размера молекулы пероксидазы хрена, узкая часть конуса которой меньше размера молекулы пероксидазы хрена. 1. To prepare a nanopore detector, a conical shaped nanopore with a size on the order of the size of a horseradish peroxidase molecule is fabricated using electron-beam drilling (EBD) into a Six-Ny, the narrow part of the cone of which is smaller than the size of a horseradish peroxidase molecule.
2. Затем для целей определения иммобилизации в нанопоре молекулы фермента, в цис-камеру кюветы нанопорового детектора вводят раствор буфера молекулы фермента, при этом в транс-камере находится раствор буфера без фермента. После этого между цист- и транс-камерами кюветы подают напряжение тока I, тянущее из цист-камеры в транс-камеру молекулу пероксидазы хрена для введения ее в нанопору. При этом регистрируют изменение силы тока, протекающего через нанопору, для контроля иммобилизации молекулы фермента в нанопоре.2. Then, for the purpose of determining the immobilization of the enzyme molecule in the nanopore, a buffer solution of the enzyme molecule is introduced into the cis-chamber of the nanopore detector cuvette, while the trans-chamber contains a buffer solution without the enzyme. After this, a voltage of current I is applied between the cyst- and trans-chambers of the cuvette, pulling the horseradish peroxidase molecule from the cyst-chamber to the trans-chamber for introducing it into the nanopore. In this case, the change in the current flowing through the nanopore is recorded to control the immobilization of the enzyme molecule in the nanopore.
3. После иммобилизации молекулы пероксидазы хрена в нанопоре цис-камеру промывают для удаления неиммобилизованных молекул и затем для вызова активности молекулы фермента, иммобилизованной в нанопоре, в цис-камеру вводят субстрат ABTS [2,2-азино-бис (3-этилбензти-азолин-6-сульфонат) аммония] и раствор перекиси водорода.3. After immobilization of the horseradish peroxidase molecule in the nanopore, the cis-chamber is washed to remove non-immobilized molecules and then, to induce the activity of the enzyme molecule immobilized in the nanopore, the ABTS [2,2-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonate) ammonium] substrate and hydrogen peroxide solution are introduced into the cis-chamber.
4. Во время проявления ферментативной реакции мониторинг активности фермента определяют по изменению силы тока I, протекающего через нанопору из цис- в транс-камеру. 4. During the enzymatic reaction, monitoring of the enzyme activity is determined by the change in the current I flowing through the nanopore from the cis- to the trans-chamber.
Электрические измерения осуществляют с помощью системы сбора и сохранения данных на основе аналого-цифрового преобразователя. Electrical measurements are carried out using a data collection and storage system based on an analog-to-digital converter.
Результаты способа мониторинга активности единичных молекул фермента пероксидазы хрена при использовании нанопоры размером порядка размера молекулы пероксидазы хрена иллюстрируются на кривой рис. 1, где участок 1 на кривой рис.1 показывает изменение силы тока нанопоры при добавлении HRP (пероксидазы хрена) с концентрацией С = [10]^(-8)М; участок 2 – изменение силы тока нанопоры при добавлении ABTS; участок 3– изменение силы тока, полученного при добавлении Н_2 О_2. The results of the method for monitoring the activity of single molecules of the horseradish peroxidase enzyme using a nanopore with a size on the order of the size of a horseradish peroxidase molecule are illustrated in the curve in Fig. 1, where section 1 in the curve in Fig. 1 shows the change in the nanopore current upon adding HRP (horseradish peroxidase) with a concentration of C = [10]^(-8)M; section 2 – the change in the nanopore current upon adding ABTS; section 3 – the change in the current obtained upon adding H_2O_2.
Начальный уровень значения тока-I при включении нанопоры в отсутствии пероксидазы хрена был порядка -100 пикоампер (пА). Как видно на участке 1 кривой рис. 1 при добавлении HRP концентрации [10]^(-8) М наблюдается уменьшение силы тока I до порядка -50 пА, на участке 2 при добавлении субстрата ABTS, а затем Н_2 О_2 (учаастки 2-3 кривой рис. 1) наблюдается флуктуации изменения силы тока на протяжении реального временного порядка t -5000 сек, связанные с активностью единичной молекулы фермента.The initial level of the current-I value when turning on the nanopore in the absence of horseradish peroxidase was about -100 picoamperes (pA). As can be seen in section 1 of the curve in Fig. 1, upon adding HRP at a concentration of [10]^(-8) M, a decrease in the current I to about -50 pA is observed; in section 2, upon adding the ABTS substrate and then H_2O_2 (sections 2-3 of the curve in Fig. 1), fluctuations in the change in current are observed over a real time of about t -5000 sec, associated with the activity of a single enzyme molecule.
В контрольных измерениях в отсутствии иммобилизованной молекулы HRP в нанопоре существенного изменения тока не наблюдалось.In control measurements in the absence of an immobilized HRP molecule in the nanopore, no significant change in current was observed.
Пример 2. Example 2.
Способ мониторинга активности единичных молекул фермента пероксидазы хрена поэтапно осуществляют следующим образом:The method for monitoring the activity of single molecules of the horseradish peroxidase enzyme is carried out step by step as follows:
1. Для подготовки нанопорового детектора изготавливают как в Примере 1 нанопору конической формы с размером порядка размера молекулы пероксидазы хрена, узкая часть конуса которой меньше размера молекулы пероксидазы хрена. 1. To prepare a nanopore detector, a conical nanopore with a size on the order of the size of a horseradish peroxidase molecule is manufactured as in Example 1, the narrow part of the cone of which is smaller than the size of a horseradish peroxidase molecule.
2. Затем для целей определения иммобилизации в нанопоре молекулы фермента, как в Примере 1, в цис-камеру кюветы нанопорового детектора вводят раствор буфера молекулы фермента, в то время как в транс-камере находится раствор буфера без фермента. После этого между цис- и транс-камерами кюветы подают напряжение тока I, тянущее из цис-камеры в транс-камеру молекулу пероксидазы хрена для введения ее в нанопору. При этом регистрируют изменение силы тока, протекающего через нанопору для контроля иммобилизации молекулы фермента в нанопоре. 2. Then, for the purpose of determining the immobilization of the enzyme molecule in the nanopore, as in Example 1, a buffer solution of the enzyme molecule is introduced into the cis-chamber of the nanopore detector cuvette, while the trans-chamber contains a buffer solution without the enzyme. After this, a current voltage I is applied between the cis- and trans-chambers of the cuvette, pulling the horseradish peroxidase molecule from the cis-chamber to the trans-chamber for introducing it into the nanopore. In this case, the change in the current flowing through the nanopore is recorded to monitor the immobilization of the enzyme molecule in the nanopore.
3. После иммобилизации молекулы пероксидазы хрена в нанопоре цис-камеру промывают для удаления неиммобилизованных молекул и затем для вызова активности молекулы фермента, иммобилизованной в нанопоре, в цис-камеру вводят субстрат ABTS [2,2-азино-бис (3-этилбензти-азолин-6-сульфонат) аммония] и раствор перекиси водорода.3. After immobilization of the horseradish peroxidase molecule in the nanopore, the cis-chamber is washed to remove non-immobilized molecules and then, to induce the activity of the enzyme molecule immobilized in the nanopore, the ABTS [2,2-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonate) ammonium] substrate and hydrogen peroxide solution are introduced into the cis-chamber.
4. Во время проявления ферментативной реакции мониторинг активности фермента определяют по изменению силы тока I, протекающего через нанопору из цис- в транс-камеру. 4. During the enzymatic reaction, monitoring of the enzyme activity is determined by the change in the current I flowing through the nanopore from the cis- to the trans-chamber.
Электрические измерения, как и в Пример 1, осуществляют с помощью системы сбора и сохранения данных на основе аналого-цифрового преобразователя. Electrical measurements, as in Example 1, are carried out using a data acquisition and storage system based on an analog-to-digital converter.
Результаты способа мониторинга активности единичных молекул фермента пероксидазы хрена при использовании нанопоры размером порядка размера молекулы пероксидазы хрена иллюстрируются кривой рис. 2, где участок 1 кривой рис. 2 показывает изменение силы тока нанопоры при добавлении HRP (пероксидазы хрена) с концентрацией С =[10]^(-6) М; участок 2 – изменение силы тока нанопоры при добавлении ABTS; участок 3– изменение силы тока нанопоры, полученного при добавлении Н_2 О_2. The results of the method for monitoring the activity of single molecules of the horseradish peroxidase enzyme using a nanopore with a size on the order of the size of a horseradish peroxidase molecule are illustrated by the curve in Fig. 2, where section 1 of the curve in Fig. 2 shows the change in the nanopore current upon adding HRP (horseradish peroxidase) with a concentration of C = [10] ^ (-6) M; section 2 – the change in the nanopore current upon adding ABTS; section 3 – the change in the nanopore current obtained upon adding H_2 O_2.
Начальный уровень значения тока при включении нанопоры в отсутствии пероксидазы хрена был порядка ~100 пикоампер (пА). Как видно на участке 1 кривой рис. 2 при добавлении HRP концентрации [10]^(-6) М наблюдается сила тока I порядка -200 пА. На участке 2 кривой рис.2 при добавлении субстрата ABTS не наблюдается существенного изменения силы тока, который находился на уровне примерно -200 пА. После дальнейшего добавления перекиси водорода на участке 3 кривой рис.2 наблюдаются флуктуации изменения силы тока на протяжении реального временного порядка t-1500 сек, которые связаны с проявляемой активностью единичной молекулы фермента при ферментативной реакции.The initial level of the current value when turning on the nanopore in the absence of horseradish peroxidase was about ~100 picoamperes (pA). As can be seen in section 1 of the curve in Fig. 2, upon adding HRP at a concentration of [10]^(-6) M, a current strength I of about -200 pA is observed. In section 2 of the curve in Fig. 2, upon adding the ABTS substrate, no significant change in the current strength is observed, which was at a level of approximately -200 pA. After further addition of hydrogen peroxide, fluctuations in the change in current strength are observed in section 3 of the curve in Fig. 2 over a real time of about t-1500 sec, which are associated with the activity of a single enzyme molecule during the enzymatic reaction.
В контрольных измерениях в отсутствии иммобилизованной HRP нанопоре не наблюдалось существенного изменения электрического тока, проходящего через нанопору.In control measurements in the absence of immobilized HRP in the nanopore, no significant change in the electrical current passing through the nanopore was observed.
Пример 3. Example 3.
Способ мониторинга активности единичных молекул агрегата аспарагиназы поэтапно осуществляют следующим образом:The method for monitoring the activity of single molecules of the asparaginase aggregate is carried out step by step as follows:
1. Для подготовки нанопорового детектора изготавливают нанопору конической формы с размером порядка размера олигомера аспарагиназы, узкая часть конуса которой меньше, чем размера олигомера аспарагиназы. 1. To prepare a nanopore detector, a conical nanopore is made with a size on the order of the size of the asparaginase oligomer, the narrow part of the cone of which is smaller than the size of the asparaginase oligomer.
2. Затем, как в Примерах 1 и 2, для целей определения иммобилизации в нанопоре молекулы фермента в цис-камеру кюветы нанопорового детектора вводят раствор буфера молекулы фермента, при этом в транс-камере находится раствор буфера без фермента. После этого между цис- и транс-камерами кюветы подают напряжение тока I, тянущее из цис-камеры в транс-камеру аспарагиназу для введения ее в нанопору. Далее регистрируют изменение силы тока, протекающего через нанопору для контроля иммобилизации молекулы фермента в нанопоре. 2. Then, as in Examples 1 and 2, for the purpose of determining the immobilization of the enzyme molecule in the nanopore, a buffer solution of the enzyme molecule is introduced into the cis-chamber of the nanopore detector cuvette, while the trans-chamber contains a buffer solution without the enzyme. After this, a current voltage I is applied between the cis- and trans-chambers of the cuvette, pulling asparaginase from the cis-chamber to the trans-chamber for introducing it into the nanopore. Then, the change in the current flowing through the nanopore is recorded to monitor the immobilization of the enzyme molecule in the nanopore.
3. После иммобилизации аспарагиназы в нанопоре, цис-камеру промывают для удаления неиммобилизованных молекул и затем для вызова активности молекулы фермента, иммобилизованной в нанопоре, в цис-камеру кюветы нанопорового детектора добавляют раствор аспарагина.3. After immobilization of asparaginase in the nanopore, the cis-chamber is washed to remove non-immobilized molecules and then, to induce the activity of the enzyme molecule immobilized in the nanopore, a solution of asparagine is added to the cis-chamber of the nanopore detector cuvette.
4. Во время проявления ферментативной реакции мониторинг активности фермента определяют по изменению силы тока I, протекающего через нанопору из цис- в транс-камеру. 4. During the enzymatic reaction, monitoring of the enzyme activity is determined by the change in the current I flowing through the nanopore from the cis- to the trans-chamber.
Электрические измерения, как в Примерах 1 и 2, проводят с помощью системы сбора и сохранения данных на основе аналого-цифрового преобразователя. Electrical measurements, as in Examples 1 and 2, are carried out using a data acquisition and storage system based on an analog-to-digital converter.
Результаты предлагаемого способа мониторинга активности единичных молекул агрегата аспарагиназы при использовании нанопоры иллюстрируются кривой рис.3, где участок 1 кривой рис.3 показывает изменение силы тока- I нанопоры при добавлении аспарагиназы с концентрацией С =[10]^(-8) М; участок 2 - изменение силы тока нанопоры при введении аспарагиназы с концентрацией С =[10]^(-7) М; участок 3 кривой рис.3 – изменение силы тока нанопоры при добавлении аспарагина.The results of the proposed method for monitoring the activity of single molecules of the asparaginase aggregate using a nanopore are illustrated by the curve in Fig. 3, where section 1 of curve Fig. 3 shows the change in the current strength I of the nanopore upon adding asparaginase with a concentration of C = [10] ^ (-8) M; section 2 - the change in the current strength of the nanopore upon introducing asparaginase with a concentration of C = [10] ^ (-7) M; section 3 of curve Fig. 3 - the change in the current strength of the nanopore upon adding asparagine.
Начальный уровень значения тока при включении нанопоры в отсутствии аспарагиназы был порядка 100 пикоампер (пА). Как видно на участке 1 кривой рис. 3 при добавлении аспарагиназы концентрации [10]^(-8) М наблюдается постепенное уменьшение силы тока с -60 пА до – 80 пА, на участке 2 кривой рис.3 при введении аспарагиназы большей концентрации наблюдается изменение силы тока практически до нуля, то есть нанопора перекрывается полностью. После добавления раствора субстрата аспарагина наблюдается ферментативная реакция, приводящая к открытию нанопоры (участок 3 кривой рис.3). The initial level of the current value when turning on the nanopore in the absence of asparaginase was about 100 picoamperes (pA). As can be seen in section 1 of the curve in Fig. 3, when adding asparaginase at a concentration of [10]^(-8) M, a gradual decrease in the current strength from -60 pA to -80 pA is observed; in section 2 of the curve in Fig. 3, when introducing asparaginase at a higher concentration, a change in the current strength is observed almost to zero, i.e. the nanopore is completely blocked. After adding the asparagine substrate solution, an enzymatic reaction is observed, leading to the opening of the nanopore (section 3 of the curve in Fig. 3).
В контрольных измерениях в отсутствии иммобилизованной аспарагиназы в нанопоре не наблюдалось существенного изменения силы тока. In control measurements in the absence of immobilized asparaginase in the nanopore, no significant change in current strength was observed.
В предлагаемом в настоящем изобретении способе мониторинга активности единичной молекулы фермента вместо искусственной нанопоры может быть использована природная нанопора, а введение растворов буфера и субстрата можно осуществлять в обратном порядке из транс-камеры кюветы нанопорового детектора в цис-камеру. In the method for monitoring the activity of a single enzyme molecule proposed in the present invention, a natural nanopore can be used instead of an artificial nanopore, and the introduction of buffer and substrate solutions can be carried out in the reverse order from the trans-chamber of the nanopore detector cuvette to the cis-chamber.
Для обеспечения большей активности фермента при ферментативной реакции могут при необходимости вводиться в буферный раствор субстрата дополнительные компоненты.To ensure greater enzyme activity during the enzymatic reaction, additional components can be added to the substrate buffer solution if necessary.
Приведенные примеры реализации предлагаемого в настоящем изобретении способа мониторинга единичной молекулы фермента и полученные результате их осуществления подтверждают обеспечение надежности работы, изготовленной и использованной в предлагаемом способе нанопоры в течение времени ее жизни при функционировании активности фермента в реальном времени. The given examples of the implementation of the method for monitoring a single enzyme molecule proposed in the present invention and the results obtained as a result of their implementation confirm the provision of reliable operation of the nanopore manufactured and used in the proposed method during its lifetime during the functioning of the enzyme activity in real time.
Claims (4)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2827870C1 true RU2827870C1 (en) | 2024-10-03 |
Family
ID=
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013123379A2 (en) * | 2012-02-16 | 2013-08-22 | The Regents Of The University Of California | Nanopore sensor for enzyme-mediated protein translocation |
| RU2017127990A (en) * | 2015-02-02 | 2019-03-04 | Ту Пор Гайс, Инк. | DETECTION BY MEANS OF NANOPORA OF TARGET POLINUCLEOTIDES FROM THE SAMPLE BACKGROUND |
| CN110218766A (en) * | 2019-07-03 | 2019-09-10 | 南京大学 | Single enzyme determination method based on solid nano duct |
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013123379A2 (en) * | 2012-02-16 | 2013-08-22 | The Regents Of The University Of California | Nanopore sensor for enzyme-mediated protein translocation |
| RU2017127990A (en) * | 2015-02-02 | 2019-03-04 | Ту Пор Гайс, Инк. | DETECTION BY MEANS OF NANOPORA OF TARGET POLINUCLEOTIDES FROM THE SAMPLE BACKGROUND |
| CN110218766A (en) * | 2019-07-03 | 2019-09-10 | 南京大学 | Single enzyme determination method based on solid nano duct |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| S. ZHOU, ET AL. Label-free nanopore single-molecule measurement of trypsin activity ACS Sens, N1, 2016, pp. 607-613. PHAM B., ET AL. A nanopore approach for analysis of caspase-7 activity in cell lysates. Biophysical journal. Vol. 117, N5, 2019, p. 844-855. SUN H., ET AL. Nanopore single-molecule biosensor in protein denaturation analysis. Analytica Chimica Acta, Vol. 1243, 22.02.2023, p. 340830. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ali et al. | Sequence-specific recognition of DNA oligomer using peptide nucleic acid (PNA)-modified synthetic ion channels: PNA/DNA hybridization in nanoconfined environment | |
| US11067562B2 (en) | Method of sequencing multiple copies of a sequence in a circular template | |
| CN110231392B (en) | Solid-state nanopore monomolecular protein detection method based on DNA tetrahedron | |
| US12398421B2 (en) | Nanopore sequencing method | |
| CN104312914B (en) | A kind of protein molecule electronic device based on nano-pore structure | |
| Moser et al. | Miniaturized thin film glutamate and glutamine biosensors | |
| Liu et al. | Sensitive Zn 2+ sensor based on biofunctionalized nanopores via combination of DNAzyme and DNA supersandwich structures | |
| Yu et al. | Enzymatic reactivity of glucose oxidase confined in nanochannels | |
| He et al. | The facile surface chemical modification of a single glass nanopore and its use in the nonenzymatic detection of uric acid | |
| Wu et al. | Precise construction and tuning of an aerolysin single-biomolecule interface for single-molecule sensing | |
| Wang et al. | Nanopore‐based confined spaces for single‐molecular analysis | |
| CN106929565A (en) | Protein monomolecular electronic device and its preparation and application based on nanostructured | |
| Schmidt | Membrane platforms for biological nanopore sensing and sequencing | |
| RU2827870C1 (en) | Method for monitoring activity of single enzyme molecules | |
| Zhang et al. | Peptide-modified nanochannel system for carboxypeptidase B activity detection | |
| Yan et al. | A long-term stable solid-state nanopore for the dynamic monitoring of DNA synthesis | |
| Hianik et al. | Immobilization of enzymes on lipid bilayers on a metal support allows study of the biophysical mechanisms of enzymatic reactions | |
| Mizuguchi et al. | Flow-based biosensing system for glucose fabricated by using track-etched microporous membrane electrodes | |
| Berkovich et al. | Direct determination of the structure of single biopolymer molecules using nanopore sequencing | |
| JPS60185153A (en) | immobilized enzyme membrane | |
| US20060269915A1 (en) | Pyrophosphate acid detection sensor, method of detection of nucleic acid, and method of discrimination of base type | |
| CN109234259B (en) | Immobilization method of pyruvate oxidase | |
| Achar et al. | Fabrication of ultrathin silicon nanoporous membranes and their application in filtering industrially important biomolecules | |
| Mikhailova et al. | Effect of some redox mediators on FAD fluorescence of glucose oxidase from Penicillium adametzii LF F-2044.1 | |
| CN109596689A (en) | The method of the super sandwich electrochemical sensor detection gene methylation of dual signal |