RU2825970C2 - Flow cell substrate structuring system and method - Google Patents
Flow cell substrate structuring system and method Download PDFInfo
- Publication number
- RU2825970C2 RU2825970C2 RU2021118884A RU2021118884A RU2825970C2 RU 2825970 C2 RU2825970 C2 RU 2825970C2 RU 2021118884 A RU2021118884 A RU 2021118884A RU 2021118884 A RU2021118884 A RU 2021118884A RU 2825970 C2 RU2825970 C2 RU 2825970C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- layer
- flow cell
- nanowell
- group
- reagents
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 150
- 239000000758 substrate Substances 0.000 title claims abstract description 129
- 239000010410 layer Substances 0.000 claims abstract description 187
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 99
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 74
- 230000005855 radiation Effects 0.000 claims abstract description 73
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims abstract description 17
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims abstract description 16
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims abstract description 16
- 239000011247 coating layer Substances 0.000 claims abstract description 15
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 13
- 238000005498 polishing Methods 0.000 claims abstract description 12
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims abstract description 12
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 63
- 239000000376 reactant Substances 0.000 claims description 55
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 45
- 150000001345 alkine derivatives Chemical class 0.000 claims description 27
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 24
- 239000010949 copper Substances 0.000 claims description 20
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 claims description 18
- IVRMZWNICZWHMI-UHFFFAOYSA-N azide group Chemical group [N-]=[N+]=[N-] IVRMZWNICZWHMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 claims description 16
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 14
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 12
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 12
- 238000002444 silanisation Methods 0.000 claims description 12
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 12
- GJZGXOJVFPHTGC-UHFFFAOYSA-N 4-amino-1,7,7-trimethylbicyclo[2.2.1]heptane-2,3-dione Chemical compound C1CC2(N)C(=O)C(=O)C1(C)C2(C)C GJZGXOJVFPHTGC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 239000003504 photosensitizing agent Substances 0.000 claims description 10
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- BPUBBGLMJRNUCC-UHFFFAOYSA-N oxygen(2-);tantalum(5+) Chemical compound [O-2].[O-2].[O-2].[O-2].[O-2].[Ta+5].[Ta+5] BPUBBGLMJRNUCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- PBCFLUZVCVVTBY-UHFFFAOYSA-N tantalum pentoxide Inorganic materials O=[Ta](=O)O[Ta](=O)=O PBCFLUZVCVVTBY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 238000007740 vapor deposition Methods 0.000 claims description 7
- 230000002165 photosensitisation Effects 0.000 claims description 6
- QPSDFLMKLTXKDA-UHFFFAOYSA-N 3-azidopropyl(trimethoxy)silane Chemical group CO[Si](OC)(OC)CCCN=[N+]=[N-] QPSDFLMKLTXKDA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000005229 chemical vapour deposition Methods 0.000 claims description 4
- BLRPTPMANUNPDV-UHFFFAOYSA-N Silane Chemical compound [SiH4] BLRPTPMANUNPDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 claims description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 3
- 125000003518 norbornenyl group Chemical group C12(C=CC(CC1)C2)* 0.000 claims description 3
- 229910000077 silane Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 2
- 238000006748 scratching Methods 0.000 abstract description 2
- 230000002393 scratching effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 abstract 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 abstract 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 24
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 24
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 22
- 238000012650 click reaction Methods 0.000 description 19
- -1 poly(N-(5-azidoacetamidylpentyl)acrylamide) Polymers 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- 238000004528 spin coating Methods 0.000 description 11
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 10
- 238000001127 nanoimprint lithography Methods 0.000 description 9
- VNQXSTWCDUXYEZ-UHFFFAOYSA-N 1,7,7-trimethylbicyclo[2.2.1]heptane-2,3-dione Chemical compound C1CC2(C)C(=O)C(=O)C1C2(C)C VNQXSTWCDUXYEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 8
- 229930006711 bornane-2,3-dione Natural products 0.000 description 8
- 238000004544 sputter deposition Methods 0.000 description 8
- UKODFQOELJFMII-UHFFFAOYSA-N pentamethyldiethylenetriamine Chemical compound CN(C)CCN(C)CCN(C)C UKODFQOELJFMII-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- UYORIKDXEZTMQA-UHFFFAOYSA-N n-[5-[(2-azidoacetyl)amino]pentyl]prop-2-enamide Chemical compound C=CC(=O)NCCCCCNC(=O)CN=[N+]=[N-] UYORIKDXEZTMQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 5
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 5
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 5
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 5
- 238000000059 patterning Methods 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 125000001494 2-propynyl group Chemical group [H]C#CC([H])([H])* 0.000 description 4
- 238000006352 cycloaddition reaction Methods 0.000 description 4
- 229910044991 metal oxide Inorganic materials 0.000 description 4
- 150000004706 metal oxides Chemical class 0.000 description 4
- BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L potassium carbonate Chemical compound [K+].[K+].[O-]C([O-])=O BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 4
- 239000012099 Alexa Fluor family Substances 0.000 description 3
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 3
- 229910004298 SiO 2 Inorganic materials 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- HSFWRNGVRCDJHI-UHFFFAOYSA-N alpha-acetylene Natural products C#C HSFWRNGVRCDJHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910000365 copper sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- GGRQLKPIJPFWEZ-UHFFFAOYSA-N cycloprop-2-en-1-one Chemical compound O=C1C=C1 GGRQLKPIJPFWEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000002534 ethynyl group Chemical group [H]C#C* 0.000 description 3
- 229920002100 high-refractive-index polymer Polymers 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000010329 laser etching Methods 0.000 description 3
- 238000001459 lithography Methods 0.000 description 3
- 230000000873 masking effect Effects 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 3
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 3
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 2
- 229910000366 copper(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000000151 deposition Methods 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 2
- 238000007306 functionalization reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 229910000027 potassium carbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- KJUGUADJHNHALS-UHFFFAOYSA-N 1H-tetrazole Substances C=1N=NNN=1 KJUGUADJHNHALS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WLCVNBXWMQMKGJ-UHFFFAOYSA-N 2-(5-bicyclo[2.2.1]hept-2-enyl)ethyl-trimethoxysilane Chemical compound C1C2C(CC[Si](OC)(OC)OC)CC1C=C2 WLCVNBXWMQMKGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005749 Copper compound Substances 0.000 description 1
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M Methacrylate Chemical compound CC(=C)C([O-])=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000010461 azide-alkyne cycloaddition reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008094 contradictory effect Effects 0.000 description 1
- 150000001880 copper compounds Chemical class 0.000 description 1
- JZCCFEFSEZPSOG-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate pentahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.[Cu+2].[O-]S([O-])(=O)=O JZCCFEFSEZPSOG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- JFNLZVQOOSMTJK-KNVOCYPGSA-N norbornene Chemical compound C1[C@@H]2CC[C@H]1C=C2 JFNLZVQOOSMTJK-KNVOCYPGSA-N 0.000 description 1
- 238000005580 one pot reaction Methods 0.000 description 1
- 208000017983 photosensitivity disease Diseases 0.000 description 1
- 231100000434 photosensitization Toxicity 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 150000003536 tetrazoles Chemical class 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 1
Abstract
Description
ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА СМЕЖНЫЕ ЗАЯВКИCROSS-REFERENCES TO RELATED APPLICATIONS
[0001] Данная заявка испрашивает приоритет по предварительной заявке на патент США № 62/884 753, поданной 9 августа 2019 г., и заявке на патент Нидерландов № 2023679, поданной 21 августа 2019 г. каждая из которых полностью включена в настоящий документ путем ссылки. [0001] This application claims priority to U.S. Provisional Patent Application No. 62/884,753, filed August 9, 2019, and Dutch Patent Application No. 2023679, filed August 21, 2019, each of which is incorporated herein by reference in its entirety.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯPREREQUISITES FOR THE CREATION OF THE INVENTION
[0002] Изготовление подложек для нанолунок, используемых в промышленных процессах, таких как секвенирование путем синтеза, может включать в себя сложный процесс, включающий функционализацию поверхности микроструйного устройства, такого как, например, проточная кювета, в которой находятся подложки для нанолунок или которая иным образом содержит их. В некоторых примерах особенно сложный аспект изготовления подложки для нанолунок включает в себя удаление существующих поверхностных химических веществ, обнаруженных в промежуточных областях между нанолунками, путем полировки этих промежуточных пространств. К проблемам, связанным с подготовкой поверхности этого типа, относятся избыточная полировка, недостаточная полировка и царапанье или повреждение структурированных поверхностей. Соответственно, существует потребность в способе изготовления подложек нанолунок, которые не имеют вышеуказанных сложностей и трудностей. [0002] The production of nanowell substrates used in industrial processes such as sequencing by synthesis may involve a complex process that includes functionalizing the surface of a microfluidic device, such as, for example, a flow cell, in which the nanowell substrates are located or which otherwise contains them. In some examples, a particularly difficult aspect of the production of a nanowell substrate involves the removal of existing surface chemicals found in the interstitial regions between nanowells by polishing these interstitial spaces. Problems associated with this type of surface preparation include overpolishing, underpolishing, and scratching or damaging the structured surfaces. Accordingly, there is a need for a method of producing nanowell substrates that does not have the above-mentioned complexities and difficulties.
ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯSUMMARY OF THE INVENTION
[0003] Ниже представлено изложение сущности некоторых примеров. Данное изложение сущности изобретения не является широким обзором и не предназначено для определения ключевых или критически важных аспектов или элементов настоящего изобретения или для определения объема его патентной охраны. [0003] The following is a summary of certain examples. This summary is not an extensive overview and is not intended to identify key or critical aspects or elements of the present invention or to determine the scope of patent protection thereof.
[0004] Преимущества вариантов реализации описанной системы и способов заключаются в возможности пространственного разделения химического структурирования наноразмерных элементов внутри микроструйных устройств, таких как проточные кюветы, и улучшении изготовления подложки нанолунок за счет полного устранения этапа полирования. В описанных способах используются плоские волноводы или аналогичные устройства для пространственного контроля химической функционализации конкретных предварительно заданных областей для каждой подложки нанолунки, изготовленной в проточной кювете. Подложки нанолунок структурируют в микроструйные проточные кюветы с использованием известных процессов изготовления проточной кюветы. Плоский волновод направляет возбуждающий свет только в нижнюю часть каждой подложки нанолунки, где он фотоинициирует химическую реакцию, которая ковалентно связывает реагент-мишень с нижней частью нанолуночной подложки. Непрореагировавшие молекулы удаляются на стадии промывки, которая следует за фотоинициацией, без какого-либо неблагоприятного воздействия на структурированные поверхности проточной кюветы. В некоторых вариантах реализации в описанной системе и способах применяют те же источники света, которые используются в процессе секвенирования методом синтеза, и определенные системы фотоинициирования, чувствительные к синему свету (например, с длиной волны 470 нм). [0004] Advantages of embodiments of the described system and methods include the ability to spatially separate the chemical structuring of nanoscale features within microfluidic devices such as flow cells and to improve the fabrication of nanowell substrates by completely eliminating the polishing step. The described methods utilize planar waveguides or similar devices to spatially control the chemical functionalization of specific predetermined regions for each nanowell substrate fabricated in a flow cell. The nanowell substrates are structured into microfluidic flow cells using known flow cell fabrication processes. The planar waveguide directs excitation light only to the bottom of each nanowell substrate where it photoinitiates a chemical reaction that covalently binds a target reagent to the bottom of the nanowell substrate. Unreacted molecules are removed in a washing step that follows photoinitiation without any adverse effect on the structured surfaces of the flow cell. In some embodiments, the described system and methods employ the same light sources that are used in the sequencing by synthesis process and certain photoinitiation systems that are sensitive to blue light (e.g., 470 nm).
[0005] В соответствии с одним вариантом реализации предлагается первый способ структурирования подложки проточной кюветы. Этот способ включает подготовку проточной кюветы к фотоинициированной химической реакции, причем проточная кювета включает в себя подложку, на которой находятся решетки для ввода излучения; первый слой материала, расположенный над подложкой; второй слой материала, расположенный над первым слоем материала; и нанолунки, образованные во втором слое материала, причем каждая нанолунка включает верхнюю часть и нижнюю часть; при этом подготовка проточной кюветы включает силанизацию второго слоя материала; и покрытие первой группой реагентов силанизированного второго слоя материала и нанолунок; введение второй группы реагентов в нанолунки, причем вторая группа реагентов включает по меньшей мере один реагент-мишень, хелатированный медью лиганд и систему светочувствительного фотоинициатора; и направление света внутрь проточной кюветы через решетки для ввода излучения только на нижнюю часть каждой нанолунки для фотоинициирования химической реакции между первой и второй группами реагентов, причем инициированная светом химическая реакция ковалентно связывает реагент-мишень только с нижней частью каждой нанолунки. В некоторых примерах способ дополнительно включает вымывание непрореагировавших реагентов из нанолунок; использование полимерных и азидных компонентов, которые связываются с полимером как первая группа реагентов; использование поли(N-(5-азидоацетамидилпентил)акриламида в качестве полимера; использование камфорхинон-аминной фотосенсибилизирующей системы в качестве светочувствительного фотоинициатора с применением излучения с длиной волны около 470 нм; использование праймера, связанного с алкином, в качестве реагента-мишени; использование флуорофора, связанного с алкином, в качестве реагента-мишени; использование лазера в качестве источника света; и использование материала с показателем преломления от 1,0 до 1,3 для подложки и материала с показателем преломления от 2,0 до 2,15 для первого слоя, хотя возможны и другие значения. [0005] According to one embodiment, a first method of structuring a flow cell substrate is provided. The method includes preparing a flow cell for a photoinitiated chemical reaction, wherein the flow cell includes a substrate on which gratings for coupling radiation are located; a first layer of material located above the substrate; a second layer of material located above the first layer of material; and nanowells formed in the second layer of material, wherein each nanowell includes a top portion and a bottom portion; wherein preparing the flow cell includes silanizing the second layer of material; and coating the silanized second layer of material and the nanowells with a first group of reagents; introducing a second group of reagents into the nanowells, wherein the second group of reagents includes at least one target reagent, a copper-chelated ligand, and a photosensitive photoinitiator system; and directing light into the flow cell through the gratings to couple radiation only to the bottom of each nanowell to photoinitiate a chemical reaction between the first and second groups of reactants, wherein the light-initiated chemical reaction covalently binds the target reactant only to the bottom of each nanowell. In some examples, the method further comprises washing away unreacted reactants from the nanowells; using polymer and azide components that bind to the polymer as the first group of reactants; using poly(N-(5-azidoacetamidylpentyl)acrylamide) as a polymer; using a camphorquinone-amine photosensitizer system as a light-sensitive photoinitiator using radiation with a wavelength of about 470 nm; using a primer linked to an alkyne as a target reagent; using a fluorophore linked to an alkyne as a target reagent; using a laser as a light source; and using a material with a refractive index of 1.0 to 1.3 for the substrate and a material with a refractive index of 2.0 to 2.15 for the first layer, although other values are possible.
[0006] В соответствии с другим вариантом реализации предлагается второй способ структурирования подложек проточных кювет. Этот способ включает в себя изготовление проточной кюветы с плоским волноводом путем формирования слоя решеток для ввода излучения на стеклянной подложке; нанесение среднего слоя на слой решеток для ввода излучения; нанесение покровного слоя на средний слой; и формирование подложек нанолунок в покровном слое, причем каждая подложка нанолунки включает в себя верхнюю часть и нижнюю часть, а подложки нанолунки образуют между собой промежуточные области; силанизацию покровного слоя; покрытие первой группой реагентов силанизированного покровного слоя и подложек нанолунок; введение второй группы реагентов в подложки нанолунок, причем вторая группа реагентов включает по меньшей мере один реагент-мишень, хелатированный медью лиганд и систему светочувствительного фотоинициатора; направление света внутрь проточной кюветы с плоским волноводом через решетки для ввода излучения только к нижней части каждой подложки нанолунки для фотоинициирования химической реакции между первой и второй группами реагентов, причем фотоинициированная химическая реакция ковалентно связывает реагент-мишень только с нижней частью каждой подложки нанолунки. В некоторых примерах способ дополнительно включает вымывание непрореагировавших реагентов из нанолунок; использование полимерных и азидных компонентов, которые связываются с полимером как первая группа реагентов; использование поли(N-(5-азидоацетамидилпентил)акриламида в качестве полимера; использование камфорхинон-аминной фотосенсибилизирующей системы в качестве светочувствительного фотоинициатора с применением излучения с длиной волны около 470 нм; использование праймера, связанного с алкином, в качестве реагента-мишени; использование флуорофора, связанного с алкином, в качестве реагента-мишени; использование лазера в качестве источника света; и использование материала с показателем преломления от 1,0 до 1,3 для слоя решеток, вводящих излучение, и материала с показателем преломления от 2,0 до 2,15 для среднего слоя, хотя возможны и другие значения. [0006] According to another embodiment, a second method for structuring flow cell substrates is provided. This method includes producing a flow cell with a flat waveguide by forming a layer of gratings for coupling radiation on a glass substrate; applying a middle layer to the layer of gratings for coupling radiation; applying a cover layer to the middle layer; and forming nanowell substrates in the cover layer, wherein each nanowell substrate includes an upper portion and a lower portion, and the nanowell substrates form intermediate regions between themselves; silanizing the cover layer; coating the silanized cover layer and the nanowell substrates with a first group of reagents; introducing a second group of reagents into the nanowell substrates, wherein the second group of reagents includes at least one target reagent, a copper-chelated ligand and a light-sensitive photoinitiator system; directing light into a flow cell with a planar waveguide through gratings for coupling radiation only to the bottom of each nanowell substrate to photoinitiate a chemical reaction between the first and second groups of reactants, wherein the photoinitiated chemical reaction covalently binds the target reactant only to the bottom of each nanowell substrate. In some examples, the method further comprises washing out unreacted reactants from the nanowells; using polymer and azide components that bind to the polymer as the first group of reactants; using poly(N-(5-azidoacetamidylpentyl)acrylamide) as a polymer; using a camphorquinone-amine photosensitizer system as a light-sensitive photoinitiator using radiation with a wavelength of about 470 nm; using a primer linked to an alkyne as a target reagent; using a fluorophore linked to an alkyne as a target reagent; using a laser as a light source; and using a material with a refractive index of 1.0 to 1.3 for the radiation-coupling grating layer and a material with a refractive index of 2.0 to 2.15 for the middle layer, although other values are possible.
[0007] В еще одном варианте осуществления предлагается третий способ структурирования подложки проточной кюветы. Этот способ включает в себя изготовление проточной кюветы с плоским волноводом путем формирования слоя решеток для ввода излучения на стеклянной подложке; нанесение среднего слоя на слой решеток для ввода излучения; нанесение покровного слоя на средний слой; и формирование подложек нанолунок в покровном слое, причем каждая подложка нанолунки включает в себя верхнюю часть и нижнюю часть, а подложки нанолунки образуют между собой промежуточные области; и силанизацию покровного слоя; покрытие покровного слоя и подложек нанолунок первой группой реагентов, причем первая группа реагентов дополнительно включает в себя полимер, азидные фрагменты, связанные с полимером, медь-содержащий лиганд и систему светочувствительного фотоинициатора; направление света с заданной длиной волны внутрь проточной кюветы с плоским волноводом только на нижнюю часть каждой подложки нанолунки для фотоинициирования химической реакции между реагентами в первой группе реагентов, причем фотоинициированная химическая реакция ковалентно связывает полимер только с нижней частью каждой подложки нанолунки; введение второй группы реагентов в подложки нанолунок, причем вторая группа реагентов включает по меньшей мере один реагент-мишень, медь-содержащий лиганд и систему светочувствительного фотоинициатора; и направление света с заданной длиной волны внутрь проточной кюветы с плоским волноводом только на нижнюю часть каждой подложки нанолунки для фотоинициирования химической реакции между ковалентно связанным полимером и второй группой реагентов, причем фотоинициированная химическая реакция ковалентно связывает реагент-мишень только с нижней частью подложки каждой нанолунки. В некоторых примерах способ дополнительно включает вымывание непрореагировавших реагентов из подложек нанолунок после каждой фотоинициированной химической реакции; использование 3-азидпропилтриметоксисилана для силанизации покровного слоя; использование поли(N-(5-азидоацетамидилпентил)акриламида в качестве полимера; использование камфорхинон-аминной фотосенсибилизирующей системы в качестве светочувствительного фотоинициатора с применением излучения с длиной волны около 470 нм; использование праймера, связанного с алкином, в качестве реагента-мишени; использование флуорофора, связанного с алкином, в качестве реагента-мишени; использование лазера в качестве источника света; и использование материала с показателем преломления от 1,0 до 1,3 для слоя решеток, вводящих излучение, и материала с показателем преломления от 2,0 до 2,15 для среднего слоя, хотя возможны и другие значения. [0007] In another embodiment, a third method for structuring a flow cell substrate is provided. The method includes producing a flow cell with a planar waveguide by forming a layer of radiation input gratings on a glass substrate; applying a middle layer to the layer of radiation input gratings; applying a cover layer to the middle layer; and forming nanowell substrates in the cover layer, wherein each nanowell substrate includes an upper portion and a lower portion, and the nanowell substrates form intermediate regions between them; and silanizing the cover layer; coating the cover layer and the nanowell substrates with a first group of reagents, wherein the first group of reagents further includes a polymer, azide moieties linked to the polymer, a copper-containing ligand, and a light-sensitive photoinitiator system; directing light of a given wavelength into a flat waveguide flow cell only onto a lower portion of each nanowell substrate to photoinitiate a chemical reaction between reactants in a first group of reactants, wherein the photoinitiated chemical reaction covalently binds a polymer only to the lower portion of each nanowell substrate; introducing a second group of reactants into the nanowell substrates, wherein the second group of reactants includes at least one target reactant, a copper-containing ligand, and a photosensitive photoinitiator system; and directing light of a given wavelength into the flat waveguide flow cell only onto a lower portion of each nanowell substrate to photoinitiate a chemical reaction between the covalently bound polymer and the second group of reactants, wherein the photoinitiated chemical reaction covalently binds the target reactant only to the lower portion of each nanowell substrate. In some examples, the method further comprises washing away unreacted reactants from the nanowell substrates after each photoinitiated chemical reaction; using 3-azidpropyltrimethoxysilane to silanize the coating layer; using poly(N-(5-azidoacetamidylpentyl)acrylamide) as the polymer; using a camphorquinone-amine photosensitizer system as the light-sensitive photoinitiator using radiation with a wavelength of about 470 nm; using a primer linked to an alkyne as the target reagent; using a fluorophore linked to an alkyne as the target reagent; using a laser as the light source; and using a material with a refractive index of 1.0 to 1.3 for the radiation-coupling grating layer and a material with a refractive index of 2.0 to 2.15 for the middle layer, although other values are possible.
[0008] В другом варианте реализации способы, описанные в данном документе, включают силанизацию, проводимую путем осаждения норборненсилана из паровой фазы. В одном примере поли(N-(5-азидоацетамидилпентил)акриламид наносят методом центрифугирования на силанизированный слой при помощи следующей процедуры: Стадия 1-600 об/мин, 5 секунд, ускорение 1500 об/мин/с; Стадия 2-1500 об/мин, 30 секунд, ускорение 5000 об/мин/с; Стадия 3-4000 об/мин, 5 секунд, ускорение 5000 об/мин/с; Стадия 4-600 об/мин, 5 секунд, ускорение 5000 об/мин/с с последующим предпочтительным нагреванием при температуре 65-75 °C в течение 1 часа. В другом примере силанизацию проводят путем осаждения из паровой фазы 3-азидпропилтриметоксисилана, после чего поли(N-(5-азидоацетамидилпентил)акриламид предпочтительно поперечно сшивают с азидными группами, используя фотоинициированную реакцию, в которой применяют бифункциональный сшивающий агент, такой как NH-бис(ПЭГ-2 пропаргил), фотоинициатор (например, камфорхинон при длине волны 470 нм) и сульфат меди с лигандом, например PMDTA. В еще одном примере поли(N-(5-азидоацетамидилпентил)акриламид ковалентно связывают с поверхностями в нижней части нанолунок, используя свет, предпочтительно лазерное излучение. [0008] In another embodiment, the methods described herein include silanization carried out by vapor deposition of norbornene silane. In one example, poly(N-(5-azidoacetamidylpentyl)acrylamide is spin-coated onto the silanized layer using the following procedure: Step 1: 600 rpm, 5 seconds, 1500 rpm/sec acceleration; Step 2: 1500 rpm, 30 seconds, 5000 rpm/sec acceleration; Step 3: 4000 rpm, 5 seconds, 5000 rpm/sec acceleration; Step 4: 600 rpm, 5 seconds, 5000 rpm/sec acceleration, followed by, preferably, heating at 65-75 °C for 1 hour. In another example, silanization is accomplished by vapor deposition of 3-azidopropyltrimethoxysilane, after which the poly(N-(5-azidoacetamidylpentyl)acrylamide is preferably cross-linked with azide groups using a photo-initiated reaction that utilizes a bifunctional crosslinker such as NH-bis(PEG-2 propargyl), a photoinitiator (e.g., camphorquinone at 470 nm), and copper sulfate with a ligand such as PMDTA. In another example, poly(N-(5-azidoacetamidylpentyl)acrylamide) is covalently bonded to surfaces at the bottom of the nanowells using light, preferably laser light.
[0009] В соответствии с другим вариантом реализации способы, описанные в настоящем документе, включают в себя свет, направленный через решетки для ввода излучения только в нижнюю часть каждой нанолунки для фотоинициирования химической реакции между первой и второй группами реагентов. В одном примере медь затем удаляют с помощью разбавленного раствора ЭДТА (0,1 M). В другом примере в способе отсутствует этап полировки для удаления любых существующих поверхностных химических веществ, обнаруженных в промежуточных областях между нанолунками. [0009] According to another embodiment, the methods described herein include light directed through gratings to couple radiation only into the bottom of each nanowell to photoinitiate a chemical reaction between the first and second groups of reactants. In one example, copper is then removed using a dilute EDTA solution (0.1 M). In another example, the method lacks a polishing step to remove any existing surface chemicals found in the interstitial regions between the nanowells.
[0010] В еще одном варианте реализации предложена проточная кювета. В одном примере проточная кювета содержит: подложку, слой решеток для ввода излучения со своим показателем преломления, расположенный на подложке, средний слой со своим показателем преломления, расположенный на слое проводящих свет решеток, причем показатель преломления среднего слоя превышает показатель преломления слоя решеток для ввода излучения, силанизированный слой на среднем слое, в котором множество нанолунок разделены промежуточными областями. В одном примере подложка представляет собой стекло. В другом примере слой решеток для ввода излучения и средний слой образованы из смолы. В еще одном примере слой решеток для ввода излучения и/или средний слой образованы из пентоксида тантала. В еще одном примере проточная кювета содержит поли(N-(5-азидоацетамидилпентил)акриламид, ковалентно связанный с поверхностями в нижней части нанолунок. В другом примере проточная кювета содержит вторую группу реагентов, расположенных на первой группе реагентов, и включает в себя по меньшей мере один реагент-мишень, хелатированный медью лиганд и систему светочувствительного фотоинициатора. В еще одном примере проточная кювета представляет собой проточную кювету с плоским волноводом. Эту проточную кювету можно использовать для секвенирования нуклеиновых кислот, включая крупносерийное секвенирование методом синтеза. Такую кювету можно изготовить в соответствии с любым способом, описанным в настоящем документе, для производства проточных кювет и пространственного структурирования их подложек. [0010] In another embodiment, a flow cell is proposed. In one example, the flow cell comprises: a substrate, a layer of gratings for coupling radiation with its own refractive index, located on the substrate, a middle layer with its own refractive index, located on the layer of light-conducting gratings, wherein the refractive index of the middle layer exceeds the refractive index of the layer of gratings for coupling radiation, a silanized layer on the middle layer, in which a plurality of nanowells are separated by intermediate regions. In one example, the substrate is glass. In another example, the layer of gratings for coupling radiation and the middle layer are formed from resin. In yet another example, the layer of gratings for coupling radiation and/or the middle layer are formed from tantalum pentoxide. In another example, the flow cell comprises poly(N-(5-azidoacetamidylpentyl)acrylamide) covalently bonded to surfaces at the bottom of the nanowells. In another example, the flow cell comprises a second group of reagents disposed on the first group of reagents and includes at least one target reagent, a copper-chelated ligand, and a light-sensitive photoinitiator system. In another example, the flow cell is a planar waveguide flow cell. This flow cell can be used for nucleic acid sequencing, including high-volume sequencing by synthesis. Such a cuvette can be manufactured according to any method described herein for producing flow cells and spatially structuring their supports.
[0011] Следует понимать, что любые соответствующие признаки/примеры каждого из аспектов описания, приведенные в настоящем документе, могут быть реализованы совместно в любом сочетании для достижения преимуществ и результатов, описанных здесь. При этом любые признаки/примеры по любому одному или нескольким этим аспектам могут быть реализованы совместно с любыми признаками другого(-их) аспекта(-ов), как описано в настоящем документе, в любом сочетании для достижения преимуществ, описанных в настоящем документе. [0011] It should be understood that any respective features/examples of each of the aspects of the description given herein may be implemented together in any combination to achieve the advantages and results described herein. Moreover, any features/examples of any one or more of these aspects may be implemented together with any features of the other aspect(s) as described herein, in any combination to achieve the advantages described herein.
[0012] Описание также включает следующие пункты формулы изобретения: [0012] The description also includes the following claims:
1. Способ структурирования подложек проточных кювет, включающий в себя следующие этапы:1. A method for structuring flow cell substrates, which includes the following steps:
подготовку проточной кюветы для фотоинициированной химической реакции, причем проточная кювета включает в себя подложку, содержащую решетки для ввода излучения;preparing a flow cell for a photo-initiated chemical reaction, wherein the flow cell includes a substrate containing gratings for introducing radiation;
первый слой материала, расположенный над подложкой;the first layer of material located above the substrate;
второй слой материала, расположенный над первым слоем материала; и нанолунки, образованные во втором слое материала, причем каждая нанолунка включает верхнюю часть и нижнюю часть, и при этом подготовка проточной кюветы включает:a second layer of material located above the first layer of material; and nanowells formed in the second layer of material, each nanowell comprising a top portion and a bottom portion, and wherein preparing the flow cell comprises:
силанизацию второго слоя материала;silanization of the second layer of material;
покрытие силанизированного второго слоя материала и нанолунок первой группой реагентов;coating the silanized second layer of material and nanowells with the first group of reagents;
введение второй группы реагентов в нанолунки, причем вторая группа реагентов включает по меньшей мере один реагент-мишень, хелатированный медью лиганд и систему светочувствительного фотоинициатора; иintroducing a second group of reagents into the nanowells, wherein the second group of reagents comprises at least one target reagent, a copper-chelated ligand, and a light-sensitive photoinitiator system; and
направление света внутрь проточной кюветы через решетки для ввода излучения только в нижнюю часть каждой нанолунки для фотоинициирования химической реакции между первой и второй группами реагентов,directing light into the flow cell through gratings to introduce radiation only into the lower part of each nanowell to photoinitiate a chemical reaction between the first and second groups of reagents,
причем фотоинициированная химическая реакция ковалентно связывает реагент-мишень только с нижней частью каждой нанолунки.whereby the photo-initiated chemical reaction covalently binds the target reagent only to the bottom of each nanowell.
2. Способ по п. 1, дополнительно включающий вымывание непрореагировавших реагентов из нанолунок.2. The method according to claim 1, further comprising washing out unreacted reagents from the nanowells.
3. Способ по любому из пп. 1-2, дополнительно включающий использование полимера и азидных фрагментов, которые связываются с полимером в качестве первой группы реагентов.3. The method according to any one of claims 1-2, further comprising using a polymer and azide moieties that bind to the polymer as a first group of reactants.
4. Способ по п. 3, дополнительно включающий применение поли(N-(5-азидоацетамидилпентил)акриламида в качестве полимера.4. The method of claim 3, further comprising using poly(N-(5-azidoacetamidylpentyl)acrylamide) as the polymer.
5. Способ по любому из пп. 1-4, дополнительно включающий в себя использование камфорхинон-аминной фотосенсибилизирующей системы в качестве светочувствительного фотоинициатора с применением излучения с длиной волны 470 нм.5. The method according to any one of paragraphs 1-4, further comprising the use of a camphorquinone-amine photosensitizing system as a light-sensitive photoinitiator using radiation with a wavelength of 470 nm.
6. Способ по любому из пп. 1-5, дополнительно включающий в себя использование праймера, связанного с алкином, в качестве реагента-мишени.6. The method according to any one of paragraphs 1-5, further comprising using a primer linked to an alkyne as a target reagent.
7. Способ по любому из пп. 1-6, дополнительно включающий в себя использование флуорофора, связанного с алкином, в качестве реагента-мишени. 7. The method according to any one of claims 1-6, further comprising using a fluorophore linked to an alkyne as a target reagent.
8. Способ по любому из пп. 1-7, дополнительно включающий в себя использование лазера в качестве источника света.8. The method according to any one of paragraphs 1-7, further comprising using a laser as a light source.
9. Способ по любому из пп. 1-8, дополнительно включающий в себя использование материала с показателем преломления от 1,0 до 1,3 для подложки и материала с показателем преломления от 2,0 до 2,15 для первого слоя.9. The method according to any one of paragraphs. 1-8, further comprising using a material with a refractive index from 1.0 to 1.3 for the substrate and a material with a refractive index from 2.0 to 2.15 for the first layer.
10. Способ структурирования подложек проточных кювет, включающий в себя следующие этапы:10. A method for structuring flow cell substrates, which includes the following steps:
изготовление проточной кюветы с плоским волноводом, причем изготовление проточной кюветы с плоским волноводом включает в себя:manufacturing a flow cell with a flat waveguide, wherein the manufacturing of a flow cell with a flat waveguide includes:
формирование слоя решеток для ввода излучения на слое стеклянной подложки;forming a layer of gratings for introducing radiation onto a layer of glass substrate;
нанесение среднего слоя на слой решеток для ввода излучения;application of a middle layer to the layer of radiation input gratings;
нанесение покровного слоя на средний слой; иapplying a top coat to the middle coat; and
формирование подложек нанолунок в покровном слое, причем каждая подложка нанолунки включает в себя верхнюю часть и нижнюю часть, и подложки нанолунки образуют между собой промежуточные области;forming nanowell substrates in the cover layer, wherein each nanowell substrate includes an upper portion and a lower portion, and the nanowell substrates form intermediate regions between themselves;
силанизацию покровного слоя;silanization of the top layer;
покрытие первой группой реагентов силанизированного покровного слоя и подложек нанолунок;coating the silanized cover layer and nanowell substrates with the first group of reagents;
введение второй группы реагентов в подложки нанолунок, причем вторая группа реагентов включает по меньшей мере один реагент-мишень, хелатированный медью лиганд и систему светочувствительного фотоинициатора; иintroducing a second group of reactants into the nanowell substrates, wherein the second group of reactants comprises at least one target reactant, a copper-chelated ligand, and a light-sensitive photoinitiator system; and
направление света внутрь проточной кюветы с плоским волноводом через решетки для ввода излучения только в нижнюю часть каждой нанолунки для фотоинициирования химической реакции между первой и второй группами реагентов,directing light into a flow cell with a flat waveguide through gratings to introduce radiation only into the lower part of each nanowell to photoinitiate a chemical reaction between the first and second groups of reagents,
причем фотоинициированная химическая реакция ковалентно связывает реагент-мишень только с нижней частью каждой нанолунки.whereby the photo-initiated chemical reaction covalently binds the target reagent only to the bottom of each nanowell.
11. Способ по п. 10, дополнительно включающий вымывание непрореагировавших реагентов из нанолунок.11. The method of claim 10, further comprising washing out unreacted reagents from the nanowells.
12. Способ по любому из пп. 10-11, дополнительно включающий использование полимера и азидных фрагментов, которые связываются с полимером в качестве первой группы реагентов.12. The method according to any one of claims 10-11, further comprising using a polymer and azide moieties that bind to the polymer as a first group of reactants.
13. Способ по п. 12, дополнительно включающий применение поли(N-(5-азидоацетамидилпентил)акриламида в качестве полимера.13. The method of claim 12, further comprising using poly(N-(5-azidoacetamidylpentyl)acrylamide) as the polymer.
14. Способ по любому из пп. 10-13, дополнительно включающий в себя использование камфорхинон-аминной фотосенсибилизирующей системы в качестве светочувствительного фотоинициатора с применением излучения с длиной волны 470 нм.14. The method according to any one of paragraphs 10-13, further comprising the use of a camphorquinone-amine photosensitizing system as a light-sensitive photoinitiator using radiation with a wavelength of 470 nm.
15. Способ по любому из пп. 10-14, дополнительно включающий в себя использование праймера, связанного с алкином, в качестве реагента-мишени.15. The method according to any one of paragraphs 10-14, further comprising using a primer linked to an alkyne as a target reagent.
16. Способ по любому из пп. 10-15, дополнительно включающий в себя использование флуорофора, связанного с алкином, в качестве реагента-мишени.16. The method according to any one of claims 10-15, further comprising using a fluorophore linked to an alkyne as a target reagent.
17. Способ по любому из пп. 10-16, дополнительно включающий в себя использование лазера в качестве источника света.17. The method according to any one of paragraphs 10-16, further comprising using a laser as a light source.
18. Способ по любому из пп. 10-17, дополнительно включающий в себя использование материала с показателем преломления от 1,0 до 1,3 для слоя решеток, вводящих излучение, и материала с показателем преломления от 2,0 до 2,15 для среднего слоя.18. The method according to any one of paragraphs 10-17, further comprising using a material with a refractive index of 1.0 to 1.3 for the layer of radiation-introducing gratings and a material with a refractive index of 2.0 to 2.15 for the middle layer.
19. Способ структурирования подложек проточных кювет, включающий в себя следующие этапы:19. A method for structuring flow cell substrates, which includes the following steps:
изготовление проточной кюветы с плоским волноводом, причем изготовление проточной кюветы с плоским волноводом включает в себя:manufacturing a flow cell with a flat waveguide, wherein the manufacturing of a flow cell with a flat waveguide includes:
формирование слоя решеток для ввода излучения на слое стеклянной подложки;forming a layer of gratings for introducing radiation onto a layer of glass substrate;
нанесение среднего слоя на слой решеток для ввода излучения;application of a middle layer to the layer of radiation input gratings;
нанесение покровного слоя на средний слой; иapplying a top coat to the middle coat; and
формирование подложек нанолунок в покровном слое, причем каждая подложка нанолунки включает в себя верхнюю часть и нижнюю часть, и подложки нанолунки образуют между собой промежуточные области; иforming nanowell substrates in the cover layer, wherein each nanowell substrate includes an upper portion and a lower portion, and the nanowell substrates form intermediate regions between them; and
силанизацию покровного слоя;silanization of the top layer;
покрытие покровного слоя и подложек нанолунок первой группой реагентов, причем первая группа реагентов дополнительно включает в себя полимер, азидные фрагменты, связанные с полимером, медь-содержащий лиганд и систему светочувствительного фотоинициатора;coating the coating layer and the nanowell substrates with a first group of reagents, wherein the first group of reagents further comprises a polymer, azide moieties bound to the polymer, a copper-containing ligand, and a light-sensitive photoinitiator system;
направление света с заданной длиной волны внутрь проточной кюветы с плоским волноводом только на нижнюю часть каждой подложки нанолунки для фотоинициирования химической реакции между реагентами в первой группе реагентов, причем фотоинициированная химическая реакция ковалентно связывает полимер только с нижней частью каждой подложки нанолунки;directing light of a given wavelength into a flow cell with a flat waveguide only onto the lower portion of each nanowell substrate to photoinitiate a chemical reaction between the reactants in the first group of reactants, wherein the photoinitiated chemical reaction covalently binds the polymer only to the lower portion of each nanowell substrate;
введение второй группы реагентов в подложки нанолунок, причем вторая группа реагентов включает по меньшей мере один реагент-мишень, медь-содержащий лиганд и систему светочувствительного фотоинициатора; иintroducing a second group of reactants into the nanowell substrates, wherein the second group of reactants comprises at least one target reactant, a copper-containing ligand, and a light-sensitive photoinitiator system; and
направление света с заданной длиной волны внутрь проточной кюветы с плоским волноводом только на нижнюю часть каждой подложки нанолунки для фотоинициирования химической реакции между ковалентно связанным полимером и второй группой реагентов, причем фотоинициированная химическая реакция ковалентно связывает реагент-мишень только с нижней частью подложки каждой нанолунки.directing light of a given wavelength into a flow cell with a flat waveguide only onto the lower portion of each nanowell substrate to photoinitiate a chemical reaction between the covalently bonded polymer and a second group of reagents, wherein the photoinitiated chemical reaction covalently binds the target reagent only to the lower portion of the substrate of each nanowell.
20. Способ по п. 19, дополнительно включающий вымывание непрореагировавших реагентов из нанолунок после каждой фотоинициированной химической реакции.20. The method of claim 19, further comprising washing out unreacted reagents from the nanowells after each photo-initiated chemical reaction.
21. Способ по любому из пп. 19-20, дополнительно включающий применение 3-азидпропилтриметоксисилана для силанизации покровного слоя.21. The method according to any one of claims 19-20, further comprising using 3-azidpropyltrimethoxysilane to silanize the coating layer.
22. Способ по любому из пп. 19-21, дополнительно включающий применение поли(N-(5-азидоацетамидилпентил) акриламида в качестве полимера.22. The method according to any one of claims 19-21, further comprising using poly(N-(5-azidoacetamidylpentyl)acrylamide) as the polymer.
23. Способ по любому из пп. 19-22, дополнительно включающий в себя использование камфорхинон-аминной фотосенсибилизирующей системы в качестве светочувствительного фотоинициатора с применением излучения с длиной волны 470 нм.23. The method according to any one of paragraphs 19-22, further comprising using a camphorquinone-amine photosensitizing system as a light-sensitive photoinitiator using radiation with a wavelength of 470 nm.
24. Способ по любому из пп. 19-23, дополнительно включающий в себя использование праймера, связанного с алкином, в качестве реагента-мишени.24. The method according to any one of paragraphs 19-23, further comprising using a primer linked to an alkyne as a target reagent.
25. Способ по любому из пп. 19-23, дополнительно включающий в себя использование флуорофора, связанного с алкином, в качестве реагента-мишени.25. The method according to any one of paragraphs 19-23, further comprising using a fluorophore linked to an alkyne as a target reagent.
26. Способ по любому из пп. 19-25, дополнительно включающий в себя использование лазера в качестве источника света.26. The method according to any one of paragraphs 19-25, further comprising using a laser as a light source.
27. Способ по любому из пп. 19-26, дополнительно включающий в себя использование материала с показателем преломления от 1,0 до 1,3 для слоя решеток, вводящих излучение, и материала с показателем преломления от 2,0 до 2,15 для среднего слоя.27. The method according to any one of paragraphs 19-26, further comprising using a material with a refractive index of 1.0 to 1.3 for the layer of radiation-introducing gratings and a material with a refractive index of 2.0 to 2.15 for the middle layer.
28. Способ по любому из предшествующих пп. 1-18, в котором силанизацию проводят путем химического осаждения норборненсилана из паровой фазы.28. The method according to any one of the preceding paragraphs 1-18, wherein the silanization is carried out by chemical vapor deposition of norbornene silane.
29. Способ по любому из предшествующих пп. 4-9, 13-18, в котором поли(N-(5-азидоацетамидилпентил)акриламид нанесен методом центрифугирования на силанизированный слой с помощью следующей процедуры: стадия 1-600 об/мин, 5 секунд, ускорение 1500 об/мин/с; Стадия 2-1500 об/мин, 30 секунд, ускорение 5000 об/мин/с; стадия 3-4000 об/мин, 5 секунд, ускорение 5000 об/мин/с; стадия 4-600 об/мин, 5 секунд, ускорение 5000 об/мин/с с последующим предпочтительным нагреванием при температуре 65-75 °C в течение 1 часа.29. The method according to any one of the preceding claims 4-9, 13-18, wherein the poly(N-(5-azidoacetamidylpentyl)acrylamide) is spin-coated onto the silanized layer using the following procedure: Step 1-600 rpm, 5 seconds, acceleration 1500 rpm/s; Step 2-1500 rpm, 30 seconds, acceleration 5000 rpm/s; Step 3-4000 rpm, 5 seconds, acceleration 5000 rpm/s; Step 4-600 rpm, 5 seconds, acceleration 5000 rpm/s followed by heating at a temperature of 65-75 °C for 1 hour, preferably.
30. Способ по любому из предшествующих пп. 21-27, в котором силанизацию проводят путем осаждения из паровой фазы 3-азидпропилтриметоксисилана, после чего поли(N-(5-азидоацетамидилпентил)акриламид предпочтительно поперечно сшивают с азидными группами, используя фотоинициированную реакцию, в которой применяют бифункциональный сшивающий агент, такой как NH-бис(ПЭГ-2 пропаргил), фотоинициатор (например, камфорхинон при длине волны 470 нм), сульфат меди+лиганд, например, PMDTA.30. The method according to any one of the preceding claims 21 to 27, wherein the silanization is carried out by vapor deposition of 3-azidopropyltrimethoxysilane, after which the poly(N-(5-azidoacetamidylpentyl)acrylamide) is preferably crosslinked with azide groups using a photoinitiated reaction in which a bifunctional crosslinker such as NH-bis(PEG-2 propargyl), a photoinitiator (e.g. camphorquinone at a wavelength of 470 nm), copper sulfate + a ligand, e.g. PMDTA, is used.
31. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором поли(N-(5-азидоацетамидилпентил)акриламид ковалентно связывается с поверхностями на дне, используя свет, предпочтительно лазерное излучение.31. A method according to any one of the preceding claims, wherein poly(N-(5-azidoacetamidylpentyl)acrylamide) is covalently bonded to the surfaces on the bottom using light, preferably laser radiation.
32. Способ по п. 30 или 31, в котором медь впоследствии удаляют с использованием разбавленного раствора ЭДТА (0,1 M).32. The method according to claim 30 or 31, wherein the copper is subsequently removed using a dilute EDTA solution (0.1 M).
33. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором отсутствует этап полировки для удаления любых химических веществ, присутствующих на поверхности и обнаруженных в промежуточных областях между нанолунками.33. The method of any one of the preceding claims, wherein there is no polishing step to remove any chemicals present on the surface and found in the interstitial regions between the nanowells.
34. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором свет направляют через решетки для ввода излучения только в нижнюю часть каждой нанолунки для фотоиницирования химической реакции между первой и второй группами реагентов.34. The method of any one of the preceding claims, wherein light is directed through radiation input gratings only into the lower portion of each nanowell to photoinitiate a chemical reaction between the first and second groups of reactants.
35. Проточная кювета (10) для фотоинициированной химической реакции, содержащая:35. A flow cell (10) for a photo-initiated chemical reaction, containing:
подложку (100),backing (100),
слой (200) решетки для ввода излучения, расположенный на подложке (100), причем светопроводящий слой (200) имеет свой показатель преломления,a layer (200) of a grating for inputting radiation, located on a substrate (100), wherein the light-conducting layer (200) has its own refractive index,
средний слой (300), расположенный на слое решетки (200), причем средний слой (300) имеет свой показатель преломления, при этом показатель преломления среднего слоя (300) больше показателя преломления слоя (200) решетки для ввода излучения,a middle layer (300) located on a grating layer (200), wherein the middle layer (300) has its own refractive index, wherein the refractive index of the middle layer (300) is greater than the refractive index of the grating layer (200) for inputting radiation,
силанизированный слой (400), расположенный на среднем слое (300), в котором имеется силанизированный слой (400), множество нанолунок (500),a silanized layer (400) located on a middle layer (300) in which there is a silanized layer (400), a plurality of nanoholes (500),
причем нанолунки (500) разделены промежуточными областями (600).wherein the nanowells (500) are separated by intermediate regions (600).
36. Проточная кювета (10) по заключению 35, в которой подложка (100) представляет собой стекло.36. A flow cell (10) according to conclusion 35, in which the substrate (100) is glass.
37. Проточная кювета по п. 35 или 36, в которой слой решетки (200) для ввода излучения и средний слой (300) выполнены из смолы.37. A flow cell according to claim 35 or 36, in which the grating layer (200) for introducing radiation and the middle layer (300) are made of resin.
38. Проточная кювета по п. 37, в которой слой решетки (200) для ввода излучения и/или средний слой (300) образованы из пентоксида тантала.38. A flow cell according to claim 37, wherein the radiation input grating layer (200) and/or the middle layer (300) are formed from tantalum pentoxide.
39. Проточная кювета по любому из пп. 35-38, в которой силанизированный слой (400) образован из водного буфера или полимерного покровного слоя.39. A flow cell according to any one of claims 35-38, wherein the silanized layer (400) is formed from an aqueous buffer or a polymeric coating layer.
40. Проточная кювета по любому из предшествующих пп. 35-39, в которой показатель преломления слоя решетки (200) для ввода излучения находится в диапазоне от 0,5 до 2,0. от 0,8 до 1,5; или от 1,0 до 1,3, а показатель преломления среднего слоя (300) находится в диапазоне от 1,5 до 2,5; от 1,8 до 2,3; или от 2,0 до 2,15.40. A flow cell according to any one of the preceding paragraphs 35-39, in which the refractive index of the grating layer (200) for introducing radiation is in the range from 0.5 to 2.0, from 0.8 to 1.5; or from 1.0 to 1.3, and the refractive index of the middle layer (300) is in the range from 1.5 to 2.5, from 1.8 to 2.3; or from 2.0 to 2.15.
41. Проточная кювета по любому из предшествующих пп. 35-40, в которой поли(N-(5-азидоацетамидилпентил)акриламид ковалентно связывается с поверхностями в нижней части нанолунок (500).41. A flow cell according to any one of the preceding paragraphs 35-40, wherein poly(N-(5-azidoacetamidylpentyl)acrylamide) is covalently bonded to surfaces at the bottom of the nanowells (500).
42. Проточная кювета по п. 41, дополнительно содержащая первую группу реагентов, расположенных на поли(N-(5-азидоацетамидилпентил)акриламиде, ковалентно связанных с поверхностями в нижней части нанолунок (500).42. The flow cell according to claim 41, further comprising a first group of reagents located on poly(N-(5-azidoacetamidylpentyl)acrylamide, covalently bonded to surfaces in the lower part of the nanowells (500).
43. Проточная кювета по п. 42, в которой вторая группа реагентов расположена на первой группе реагентов, при этом вторая группа реагентов включает в себя по меньшей мере один реагент-мишень, хелатированный медью лиганд и систему светочувствительного фотоинициатора.43. The flow cell of claim 42, wherein the second group of reagents is located on the first group of reagents, wherein the second group of reagents includes at least one target reagent, a copper-chelated ligand, and a light-sensitive photoinitiator system.
44. Способ секвенирования нуклеиновых кислот с использованием проточной кюветы, изготовленной по любому из предшествующих пп. 1-34, и/или проточной кюветы по любому из пп. 35-43.44. A method for sequencing nucleic acids using a flow cell made according to any of the preceding claims 1-34 and/or a flow cell according to any of claims 35-43.
45. Система фотоинициированных химических реакций, содержащая проточную кювету по любому из предшествующих пп. 35-43 и источник света, предпочтительно источник лазерного излучения.45. A photo-initiated chemical reaction system comprising a flow cell according to any one of the preceding paragraphs 35-43 and a light source, preferably a laser light source.
[0013] Дополнительные признаки и аспекты настоящего изобретения будут очевидны обычным специалистам в данной области после прочтения и понимания представленного ниже подробного описания примеров. Как будет понятно специалисту в данной области, возможны дополнительные примеры изобретения без отступления от его объема и сущности. Соответственно, графические материалы и связанные с ними описания следует рассматривать как иллюстративные и не имеющие ограничительного характера. [0013] Additional features and aspects of the present invention will be apparent to those of ordinary skill in the art upon reading and understanding the detailed description of examples provided below. As will be apparent to those skilled in the art, additional examples of the invention are possible without departing from the scope and spirit thereof. Accordingly, the drawings and related descriptions are to be considered as illustrative and not limiting.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВBRIEF DESCRIPTION OF GRAPHIC MATERIALS
[0014] Подробное описание одного или более вариантов реализации представлено в приведенных ниже сопроводительных графических материалах и описании. Прочие признаки, аспекты и преимущества станут очевидными из описания, рисунков и формулы изобретения, в которых: [0014] A detailed description of one or more embodiments is provided in the accompanying drawings and description below. Other features, aspects and advantages will become apparent from the description, drawings and claims, in which:
[0015] На ФИГ. 1A показана структура проточной кюветы с проточным волноводом в соответствии с одним из вариантов реализации раскрытой системы и способа; [0015] FIG. 1A shows the structure of a flow cell with a flow waveguide in accordance with one embodiment of the disclosed system and method;
[0016] На ФИГ. 1B показан один вариант реализации проточной кюветы, изображенной на ФИГ. 1A, причем верхняя поверхность проточной кюветы покрыта азидными фрагментами с использованием сополимера N-(5-азидоацетамидилпентил)акриламида и акриламида (PAZAM); [0016] FIG. 1B shows one embodiment of the flow cell of FIG. 1A, wherein the top surface of the flow cell is coated with azide moieties using a copolymer of N-(5-azidoacetamidylpentyl)acrylamide and acrylamide (PAZAM);
[0017] На ФИГ. 1C показан один вариант реализации проточной кюветы, показанной на ФИГ. 1B, в которую введены реагенты, причем реагенты включают в себя праймеры, связанные с алкином, хелатированный медью лиганд и систему светочувствительного фотоинициатора; [0017] FIG. 1C shows one embodiment of the flow cell shown in FIG. 1B into which reagents are introduced, wherein the reagents include alkyne-linked primers, a copper-chelated ligand, and a light-sensitive photoinitiator system;
[0018] На ФИГ. 1D показан один вариант реализации проточной кюветы, показанной на ФИГ. 1C, в которой плоский волновод соединен с проточной кюветой и направляет свет в нее; [0018] FIG. 1D shows one embodiment of the flow cell shown in FIG. 1C, in which a flat waveguide is coupled to the flow cell and directs light into the flow cell;
[0019] На ФИГ. 1E, в одном варианте реализации, показан вид крупным планом нанолунки внутри проточной кюветы с указанием областей нанолунки, с которыми ковалентно связываются праймеры; [0019] FIG. 1E, in one embodiment, shows a close-up view of a nanowell within a flow cell indicating regions of the nanowell to which primers are covalently bound;
[0020] На ФИГ. 2A показана химическая реакция, в которой полимер PAZAM-азид присоединен к поверхности проточной кюветы с плоским волноводом в одном варианте реализации описанного способа; [0020] FIG. 2A shows a chemical reaction in which a PAZAM-azide polymer is attached to the surface of a flat waveguide flow cell in one embodiment of the described method;
[0021] На ФИГ. 2B показана химическая реакция, в которой фотоинициированная клик-реакция алкин-азид используется для ковалентного связывания реагента-мишени с подложкой нанолунки в одном варианте реализации описанного способа; [0021] FIG. 2B shows a chemical reaction in which a photo-initiated alkyne-azide click reaction is used to covalently link a target reagent to a nanowell substrate in one embodiment of the described method;
[0022] На ФИГ. 3A показана химическая реакция, в которой полимер PAZAM-азид, нанесенный на поверхность проточной кюветы с плоским волноводом, структурируют с помощью первой фотоинициированной клик-реакции в другом варианте реализации описанного способа; [0022] FIG. 3A shows a chemical reaction in which a PAZAM-azide polymer deposited on the surface of a planar waveguide flow cell is patterned using a first photo-initiated click reaction in another embodiment of the described method;
[0023] На ФИГ. 3B показана химическая реакция, в которой праймеры (флуорофоры) структурированы на слое PAZAM, изображенном на фиг. 3A, с помощью второй фотоинициированной клик-реакции. [0023] FIG. 3B shows a chemical reaction in which primers (fluorophores) are structured on the PAZAM layer of FIG. 3A using a second photoinitiated click reaction.
[0024] На ФИГ. 4 показана блок-схема реализации, на которой показан вариант осуществления первого способа структурирования подложек проточных кювет. [0024] FIG. 4 shows a block diagram of an implementation that shows an embodiment of a first method for structuring flow cell substrates.
[0025] На ФИГ. 5 показана блок-схема реализации второго способа структурирования подложек проточных кювет. и [0025] FIG. 5 shows a block diagram of the implementation of the second method for structuring flow cell substrates. and
[0026] На ФИГ. 6 показана блок-схема реализации третьего способа структурирования подложек проточных кювет. [0026] FIG. 6 shows a block diagram of the implementation of a third method for structuring flow cell substrates.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕDETAILED DESCRIPTION
[0027] В вариантах реализации описанной системы и способа используются плоские волноводы для пространственного управления химической функционализацией нанолунок, используемых в микроструйных устройствах, таких как проточные кюветы, используемые для секвенирования путем синтеза. Плоский волновод (т. е. волновод, имеющий плоскую геометрическую форму, который направляет свет только в одном направлении) направляет возбуждающий свет только в нижний участок нанолунок, где он фотоинициирует химическую реакцию, которая ковалентно связывает реагенты-мишени с дном нанолунок. Непрореагировавшие молекулы удаляют в процессе промывки, таким образом, локализуя реагенты-мишени в нижней части нанолунок. [0027] Embodiments of the disclosed system and method utilize planar waveguides to spatially control the chemical functionalization of nanowells used in microfluidic devices, such as flow cells used for sequencing by synthesis. A planar waveguide (i.e., a waveguide having a flat geometric shape that directs light in only one direction) directs excitation light only to the bottom of the nanowells, where it photoinitiates a chemical reaction that covalently binds target reagents to the bottom of the nanowells. Unreacted molecules are removed in a washing process, thereby localizing the target reagents to the bottom of the nanowells.
[0028] Варианты реализации описанной системы и способа могут включать в себя фотоинициированную клик-реакцию азида с алкином, такую как реакция, применяемая в технологиях секвенирования методом синтеза. При этом типе реакции функциональные группы азида связываются со слоем гидрогеля, образованным на поверхности микроструйного канала, и затем добавляют реагенты алкин-праймер. Клик-реакцию азид-алкин фотоинициируют с использованием, в некоторых примерах, соединения меди и системы фотоинициатора, такой как система фотоинициирования II типа, например, камфорхинон. Данная система фотоинициатора может использовать синий свет с длиной волны приблизительно 470 нм в качестве источника возбуждения. Смешанные химические соединения могут быть использованы путем добавления замещающих функциональных групп в слой гидрогеля путем их включения в PAZAM. Например, азиды и тетразолы могут быть включены в PAZAM. Клик-реакцию азид-алкин фотоинициирует свет, имеющий длину волны от 450 нм до 495 нм (например, синий), а реакцию тетразол-алкен - свет, имеющий другую длину волны от 520 нм до 560 нм (например, зеленый). В одном примере используемый синий свет имеет длину волны приблизительно 470 нм. [0028] Embodiments of the disclosed system and method may include a photoinitiated click reaction of an azide with an alkyne, such as the reaction used in sequencing by synthesis technologies. In this type of reaction, azide functional groups are coupled to a hydrogel layer formed on the surface of a microfluidic channel, and then alkyne-primer reagents are added. The azide-alkyne click reaction is photoinitiated using, in some examples, a copper compound and a photoinitiator system, such as a type II photoinitiation system, for example, camphorquinone. This photoinitiator system may use blue light with a wavelength of approximately 470 nm as an excitation source. Mixed chemistries may be used by adding substituent functional groups to the hydrogel layer by incorporating them into a PAZAM. For example, azides and tetrazoles may be incorporated into a PAZAM. The azide-alkyne click reaction is photoinitiated by light having a wavelength of 450 nm to 495 nm (e.g., blue), and the tetrazole-alkene reaction by light having another wavelength of 520 nm to 560 nm (e.g., green). In one example, the blue light used has a wavelength of approximately 470 nm.
[0029] Как правило, клик-реакции (клик-химия) включают биосовместимые низкомолекулярные реакции, обычно используемые в биоконъюгации для соединения различных субстратов со специфическими биомолекулами. Термин «клик-химия» не относится к единственной конкретной реакции, а относится к химическим способам получения веществ путем соединения малых модульных единиц друг с другом. Во многих сферах применения клик-реакций используют для соединения биомолекулы и репортерной молекулы. Клик-химия не ограничивается биологическими задачами, и концепция клик-реакции используется в фармакологической отрасли. Клик-реакция азид-алкин включает катализируемую медью реакцию азида с алкином и с образованием 5-членного гетероатома: катализируемое Cu(I) азид-алкиновое циклоприсоединение (CuAAC). Фотоинициированные реакции такого типа описаны в Chen et al., Photoinitiator Alkyne-aside Click and Radical Cross-Linking Reactions for the Patterning of PEG Hydrogels, BioMacromolecules, 2012, 13: 889-895; Shete и Kloxin, One-pot blue light triggered tough interpenetrating polymeric network (IPN) using CuAAC and methacrylate reactions, Polym. Chem., 2017, 8(24): 3668-3673; и Shete et al., Blue-light activated rapid polymerization for defect-free bulk Cu(i)-catalyzed azide-alkene cycloaddition (CuAAC) crosslinked networks, Chem. Commun (Camb)., 2016, 52(69): 10574-10577. [0029] Click reactions (click chemistry) generally involve biocompatible small molecule reactions commonly used in bioconjugation to couple various substrates to specific biomolecules. The term "click chemistry" does not refer to a single specific reaction, but rather to chemical methods for producing substances by coupling small modular units to each other. In many applications, click reactions are used to couple a biomolecule and a reporter molecule. Click chemistry is not limited to biological applications, and the concept of a click reaction is used in the pharmaceutical industry. The azide-alkyne click reaction involves the copper-catalyzed reaction of an azide with an alkyne to form a 5-membered heteroatom: Cu(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC). Photoinitiated reactions of this type are described in Chen et al ., Photoinitiator Alkyne-aside Click and Radical Cross-Linking Reactions for the Patterning of PEG Hydrogels , BioMacromolecules, 2012, 13: 889-895; Shete and Kloxin, One-pot blue light triggered tough interpenetrating polymeric network (IPN) using CuAAC and methacrylate reactions, Polym. Chem ., 2017, 8(24): 3668-3673; and Shete et al ., Blue-light activated rapid polymerization for defect-free bulk Cu(i)-catalyzed azide-alkene cycloaddition (CuAAC) crosslinked networks , Chem. Commun (Camb), 2016, 52(69): 10574-10577.
[0030] На фиг. 1A - 1E показано изготовление проточной кюветы с плоским волноводом. Пример проточной кюветы с плоским волноводом 10 включает в себя подложку 100, которая может представлять собой стекло; слой для ввода излучения 200, который может представлять собой смолу; средний слой 300, который может представлять собой смолу с показателем преломления выше, чем у смолы, используемой для слоя решетки для ввода излучения 200 (например, пентоксид тантала); и водный буфер или структурированный полимерный покровный слой 400 (см. ФИГ. 1A), в котором образовано множество нанолунок 500. Затем верхняя поверхность покровного слоя 400 покрыта гидрогелем (например, PAZAM), с которым связаны азидные функциональные группы 700 (см. ФИГ. 1B). Затем в проточную кювету 10 вводят различные реагенты 800, причем реагенты включают в себя связанные с алкином праймеры, хелатированный медью лиганд, систему светочувствительного фотоинициатора (см. ФИГ. 1C). Затем свет направляют в проточную кювету с плоским волноводом 10, используя оптический элемент, фокусирующий свет, так что решетки для ввода излучения 200 и средний слой 300 отражают свет внутри проточной кюветы 10. Ослабевающие световые волны проникают в нижнюю часть каждой нанолунки 500, инициируя требуемую химическую реакцию. Праймеры для секвенирования или другие молекулы ковалентно связываются только с нижней частью каждой нанолунки 500 и пространственно исключаются из промежуточных областей 600. На последующем этапе промывки из нанолунок удаляют непрореагировавшие компоненты, такие как любой несвязанный гидрогель или несвязанные праймеры. Подходящие промывочные растворы включают в себя щелочные буферы, имеющие значение pH по меньшей мере 10, и гидроксид натрия. На ФИГ. 1E представлен крупный план нанолунки 500, а области 502 на ФИГ. 1E показывают расположение ковалентно связанных праймеров для секвенирования (или других молекул) после завершения фотоинициированной реакции. [0030] FIGS. 1A - 1E show the manufacture of a flow cell with a planar waveguide. An example of a flow cell with a planar waveguide 10 includes a substrate 100, which can be glass; a radiation input layer 200, which can be a resin; a middle layer 300, which can be a resin with a refractive index higher than the resin used for the radiation input grating layer 200 (e.g., tantalum pentoxide); and an aqueous buffer or a structured polymeric coating layer 400 (see FIG. 1A) in which a plurality of nanowells 500 are formed. The top surface of the coating layer 400 is then coated with a hydrogel (e.g., PAZAM) to which azide functional groups 700 are linked (see FIG. 1B). Various reagents 800 are then introduced into the flow cell 10, wherein the reagents include alkyne-linked primers, a copper-chelated ligand, and a light-sensitive photoinitiator system (see FIG. 1C). Light is then directed into the planar waveguide flow cell 10 using a light focusing optical element such that the light input gratings 200 and the middle layer 300 reflect the light within the flow cell 10. The weakening light waves penetrate into the bottom of each nanowell 500, initiating the desired chemical reaction. Sequencing primers or other molecules are covalently bound only to the bottom of each nanowell 500 and are spatially excluded from the interstitial regions 600. A subsequent wash step removes unreacted components from the nanowells, such as any unbound hydrogel or unbound primers. Suitable wash solutions include alkaline buffers having a pH of at least 10 and sodium hydroxide. FIG. 1E shows a close-up view of nanowell 500, and regions 502 in FIG. 1E show the location of covalently linked sequencing primers (or other molecules) after completion of the photoinitiated reaction.
[0031] В различных вариантах реализации изобретения показатель преломления материала слоя решетки для ввода излучения 200 находится в диапазоне от 0,5 до 2,0; от 0,8 до 1,5; или от 1,0 до 1,3, а показатель преломления материала среднего слоя 300 находится в диапазоне от 1,5 до 2,5; от 1,8 до 2,3; или от 2,0 до 2,15. Увеличение разности контрастности между значениями показателя преломления слоя решетки для ввода излучения 200 и среднего слоя 300 может повысить эффективность ввода света в проточную кювету с плоским волноводом 10 при условии, что показатель преломления верхнего слоя (т.е., среднего слоя 300) остается выше, чем показатель преломления нижнего слоя (т.е. слоя решетки для ввода излучения 200). В одном варианте реализации средний слой 300 включает в себя или изготовлен из оксида металла, такого как, например, пентоксид тантала (Ta2O5). [0031] In various embodiments of the invention, the refractive index of the material of the radiation coupling grating layer 200 is in the range of 0.5 to 2.0; 0.8 to 1.5; or 1.0 to 1.3, and the refractive index of the material of the middle layer 300 is in the range of 1.5 to 2.5; 1.8 to 2.3; or 2.0 to 2.15. Increasing the contrast difference between the refractive index values of the radiation coupling grating layer 200 and the middle layer 300 can improve the efficiency of light coupling into the flow cell with a flat waveguide 10, provided that the refractive index of the upper layer (i.e., the middle layer 300) remains higher than the refractive index of the lower layer (i.e., the radiation coupling grating layer 200). In one embodiment, the middle layer 300 includes or is made of a metal oxide, such as, for example, tantalum pentoxide (Ta 2 O 5 ) .
[0032] В вариантах реализации описанного способа можно использовать следующие доступные в продаже материалы. (i) норборенсилан: [(5-бицикло[2.2.1]ГЕПТ-2-ЕНИЛ)ЭТИЛ]ТРИМЕТОКСИСИЛАН, tech-95, эндо/экзо изомеры (Gelest Inc.); (ii) PAZAM: сополимер поли(N-(5-азидоацетамидилпентил)акриламида с акриламидом) любого соотношения акриламид:Azapa; (iii) Azapa: N-(5-азидоацетамидилпентил)акриламид; (iv) сульфат меди(II) пентагидрат (CuSO4 . 5H2O) (Sigma-Aldrich); (v) N, N,N ',N ",N" - пентаметилдиэтилентриамин (PMDTA), (Sigma-Aldrich); (vi) Alexa Fluor®488 алкин (алкин AF-488) (Invitrogen); (vii) фотоинициатор камфорхинона (CQ) (Sigma-Aldrich); (viii) этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) (Sigma-Aldrich); (ix) NH-бис(ПЭГ-2 пропаргил), (BroadPharm), BP-2313; (x) 3-азидпропилтриметоксисилан (Gelest Inc.). [0032] The following commercially available materials can be used in embodiments of the described method. (i) norborenesilane: [(5-bicyclo[2.2.1]HEPT-2-ENYL)ETHYL]TRIMETHOXYSILANE, tech-95, endo/exo isomers (Gelest Inc.); (ii) PAZAM: copolymer of poly(N-(5-azidoacetamidylpentyl)acrylamide with acrylamide) of any ratio acrylamide:Azapa; (iii) Azapa: N-(5-azidoacetamidylpentyl)acrylamide; (iv) copper(II) sulfate pentahydrate (CuSO 4 . 5H 2 O) (Sigma-Aldrich); (v) N, N,N ',N ",N" - pentamethyldiethylenetriamine (PMDTA), (Sigma-Aldrich); (vi) Alexa Fluor ® 488 alkyne (AF-488 alkyne) (Invitrogen); (vii) camphorquinone (CQ) photoinitiator (Sigma-Aldrich); (viii) ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) (Sigma-Aldrich); (ix) NH-bis(PEG-2 propargyl), (BroadPharm), BP-2313; (x) 3-azidpropyltrimethoxysilane (Gelest Inc.).
Схема I: Одностадийная фотоинициированная клик-реакцияScheme I: One-step photoinitiated click reaction
[0033] Как показано на ФИГ. 2A-2B, в одном варианте реализации описанного способа используется фотоинициирующий механизм для азид-алкиновой клик-реакции, который включает в себя камфорхинон-аминную систему фотосенсибилизации с использованием света, имеющего длину волны приблизительно 470 нм. Проточную кювету с плоским волноводом изготавливают, как описано выше, и покрывающий слой 400 затем обрабатывают с использованием полимера PAZAM, с которым связаны азидные фрагменты. Как показано на ФИГ. 2A, верхнюю поверхность покровного слоя 400 сначала подвергают силанизации производным норборненсилана с использованием процесса химического осаждения из паровой фазы; способ может быть стандартным в промышленности. Поверхность покрывают, а затем термически сшивают с помощью PAZAM. Это можно осуществить следующим способом (описанным в заявке на патент США № 2015/0005447 A1): На поверхность подложки из стекла, силанизируованной норборненом, наносят 500 мкл водного раствора PAZAM (0,25%+ 5% этанола) и распределяют по поверхности. Тонкую пленку PAZAM получают путем нанесения методом центрифугирования в соответствии со следующей процедурой: стадия 1-600 об/мин, 5 секунд, ускорение 1500 об/мин/с; стадия 2-1500 об/мин, 30 секунд, ускорение 5000 об/мин/с; стадия 3-4000 об/мин, 5 секунд, ускорение 5000 об/мин/с; стадия 4-600 об/мин, 5 секунд, ускорение 5000 об/мин/с. После нанесения покрытия методом центрифугирования подложки нагревают при температуре 65-75 °C в печи или на горячей пластине в течение 1 часа. [0033] As shown in FIG. 2A-2B, in one embodiment of the disclosed method, a photoinitiating mechanism is used for an azide-alkyne click reaction that includes a camphorquinone-amine photosensitization system using light having a wavelength of approximately 470 nm. A flow cell with a planar waveguide is made as described above, and a coating layer 400 is then treated with a PAZAM polymer to which azide moieties are linked. As shown in FIG. 2A, the top surface of the coating layer 400 is first silanized with a norbornene silane derivative using a chemical vapor deposition process; the method may be standard in the industry. The surface is coated and then thermally crosslinked with PAZAM. This can be accomplished in the following manner (described in US Patent Application No. 2015/0005447 A1): 500 μl of an aqueous solution of PAZAM (0.25% + 5% ethanol) are applied to the surface of a glass substrate silanized with norbornene and spread over the surface. A thin film of PAZAM is obtained by spin coating according to the following procedure: step 1: 600 rpm, 5 seconds, acceleration 1500 rpm/s; step 2: 1500 rpm, 30 seconds, acceleration 5000 rpm/s; step 3: 4000 rpm, 5 seconds, acceleration 5000 rpm/s; step 4: 600 rpm, 5 seconds, acceleration 5000 rpm/s. After spin coating, the substrates are heated at 65-75°C in an oven or on a hot plate for 1 hour.
[0034] Как показано на ФИГ. 2B, готовят раствор полимера, содержащий Alexa Fluor® 488 (AF-488 алкин) (30% масс.) с карбонатом калия (35 мМ) и равными концентрациями CuSO4 · 5H2O (PMDTA) и фотоинициатора камфорхинона (примечание: вариант данного раствора включает праймеры для секвенирования вместо алкина AF-488). Для облегчения растворения раствор можно обработать ультразвуком. Затем раствор вводят в каналы проточной кюветы и удерживают там в течение последующей фотоинициации клик-реакции при помощи возбуждающего лазерного излучения в плоском волноводе. После завершения фотоинициированной клик-реакции медь вымывают из каналов проточной кюветы раствором ЭДТА (0,1 М), которая образует комплексное соединение с медью. Флуоресцентные изображения можно получить с помощью конфокального флуоресцентного микроскопа для проверки наличия флуорофора в нанолунках проточной кюветы. Как было указано ранее, реакция протекает только в нижней части нанолунок, поскольку свет направляется только в нанолунки посредством решетки с плоским волноводом. Полировку не использовали, поскольку меченные красителем молекулы связаны только в нанолунках, а не в промежуточных областях или участках между нанолунками. [0034] As shown in FIG. 2B, a polymer solution is prepared containing Alexa Fluor® 488 (AF-488 alkyne) (30 wt %) with potassium carbonate (35 mM) and equal concentrations of CuSO4 5H2O (PMDTA) and the photoinitiator camphorquinone (note: a variant of this solution includes sequencing primers in place of the AF-488 alkyne). The solution can be sonicated to facilitate dissolution. The solution is then introduced into the channels of the flow cell and retained there during subsequent photoinitiation of the click reaction using excitation laser light in a planar waveguide. After completion of the photoinitiated click reaction, copper is washed out of the channels of the flow cell with EDTA solution (0.1 M), which forms a complex with copper. Fluorescence images can be obtained using a confocal fluorescence microscope to check for the presence of the fluorophore in the flow cell nanowells. As previously stated, the reaction occurs only in the bottom of the nanowells because the light is only directed into the nanowells by the planar waveguide grating. No polishing was used because the dye-labeled molecules are bound only in the nanowells and not in the intermediate regions or areas between the nanowells.
Схема II: Двухэтапная фотоинициированная клик-реакцияScheme II: Two-step photo-initiated click reaction
[0035] Как показано на ФИГ. 3A-3B, другой вариант реализации описанного способа обеспечивает двухэтапную фотоинициированную клик-реакцию, в которой также используется фотосенсибилизирующая система камфорхинон-амин, в которой используется свет с длиной волны приблизительно 470 нм. Этот двухэтапный процесс сводит к минимуму диффузию реагентов от желаемых целевых областей, что приводит к меньшей функциональности промежуточных зон или участков между нанолунками проточной кюветы. Плоский волновод изготавливают так, как описано выше, и на первом этапе этого варианта реализации (см. ФИГ. 3A) PAZAM является фотоструктурированным в нанолунках с применением первой фотоинициированной клик-реакции. Этот первый этап включает прикрепление азидных групп к поверхности проточной кюветы при помощи 3-азидопропилтриметоксисилана с процессом химического осаждения из паровой фазы; способ может быть стандартным в промышленности. PAZAM затем сшивают с азидными группами с помощью фотоинициированной реакции, в которой применяют бифункциональный сшивающий агент, такой как NH-бис (ПЭГ-2 пропаргил), фотоинициатор, (например, камфорхинон при длине волны 470 нм), сульфат меди с лигандом (например, PMDTA) и свет. PAZAM ковалентно связывается с поверхностями в нижней части нанолунок с использованием лазерного света, направленного в плоский волновод. После завершения реакции медь удаляют разбавленным раствором ЭДТА (0,1 M), который образует комплексное соединение с медью. [0035] As shown in FIGS. 3A-3B, another embodiment of the disclosed method provides a two-step photoinitiated click reaction that also utilizes a camphorquinone-amine photosensitizer system that utilizes light with a wavelength of approximately 470 nm. This two-step process minimizes the diffusion of reactants away from the desired target areas, resulting in less functionality of the intermediate zones or regions between the nanowells of the flow cell. The planar waveguide is fabricated as described above and in the first step of this embodiment (see FIG. 3A), PAZAM is photostructured in the nanowells using a first photoinitiated click reaction. This first step involves attaching azide groups to the surface of the flow cell using 3-azidopropyltrimethoxysilane with a chemical vapor deposition process; the method may be standard in the industry. PAZAM is then crosslinked with azide groups using a photo-initiated reaction that uses a bifunctional crosslinker such as NH-bis(PEG-2 propargyl), a photoinitiator (e.g., camphorquinone at 470 nm), copper sulfate with a ligand (e.g., PMDTA), and light. PAZAM is covalently bonded to surfaces at the bottom of the nanowells using laser light directed into a planar waveguide. After the reaction is complete, the copper is removed with a dilute EDTA solution (0.1 M), which complexes with the copper.
[0036] На второй стадии (см. ФИГ. 3B) флуоресцентная метка (или другая молекула) структурируется с помощью второй фотоинициированной клик-реакции. Получают полимерный раствор, содержащий Alexa Fluor® 488 (алкин AF-488) (30% масс.) с карбонатом калия (35 мМ) и равными концентрациями CuSO4 · 5H2O, PMDTA, а также фотоинициатора камфорхинона. Для облегчения растворения раствор можно обработать ультразвуком. Затем раствор вводят в каналы проточной кюветы и удерживают там в течение последующего фотоинициирования при помощи возбуждающего лазерного излучения в плоском волноводе. После завершения фотоинициированной клик-реакции медь вымывают из каналов раствором ЭДТА (0,1 М), которая образует комплексное соединение с медью. Флуоресцентные изображения получают с помощью конфокального флуоресцентного микроскопа для проверки наличия флуорофора в нанолунках проточной кюветы. Как было указано ранее, реакция протекает только в нижней части нанолунок, поскольку свет направляется только в нанолунки посредством решетки с плоским волноводом. Полировка не требуется, поскольку меченные красителем Alexa молекулы красителя связаны только в нанолунках, а не в промежуточных областях или участках между нанолунками. [0036] In the second step (see FIG. 3B), the fluorescent label (or other molecule) is cross-linked by a second photo-initiated click reaction. A polymer solution is prepared containing Alexa Fluor® 488 (alkyne AF-488) (30 wt %) with potassium carbonate (35 mM) and equal concentrations of CuSO4 5H2O , PMDTA, and the photoinitiator camphorquinone. The solution can be sonicated to facilitate dissolution. The solution is then introduced into the channels of the flow cell and retained there during subsequent photoinitiation using excitation laser radiation in a planar waveguide. After completion of the photo-initiated click reaction, copper is washed out of the channels with EDTA solution (0.1 M), which forms a complex with copper. Fluorescence images are acquired using a confocal fluorescence microscope to verify the presence of the fluorophore in the flow cell nanowells. As previously stated, the reaction occurs only in the bottom of the nanowells because the light is only directed into the nanowells by the planar waveguide grating. No polishing is required because the Alexa-labeled dye molecules are bound only in the nanowells and not in the interstitial or interwell regions.
[0037] На ФИГ. 4 показана блок-схема реализации , на которой показан вариант осуществления первого способа структурирования подложек проточных кювет. Первый способ структурирования подложек проточных кювет 400 включает подготовку проточной кюветы к фотоинициированной химической реакции на этапе 402, причем проточная кювета включает в себя подложку с образованной на ней решеткой для ввода излучения; первый слой материала, расположенный над подложкой; второй слой материала, расположенный над первым слоем материала; и нанолунки, образованные во втором слое материала, причем каждая нанолунка включает верхнюю часть и нижнюю часть; при этом подготовка проточной кюветы включает силанизацию второго слоя материала на этапе 404; и покрытие первой группой реагентов силанизированного второго слоя материала нанолунок на этапе 406; введение второй группы реагентов в нанолунки на этапе 408, причем вторая группа реагентов включает по меньшей мере один реагент-мишень, хелатированный медью лиганд и систему светочувствительного фотоинициатора; и направление света внутрь проточной кюветы через решетки для ввода излучения только на нижнюю часть каждой нанолунки для фотоинициирования химической реакции между первой и второй группами реагентов на этапе 410, причем инициированная светом химическая реакция ковалентно связывает реагент-мишень только с нижней частью каждой нанолунки. [0037] FIG. 4 is a flow chart showing an embodiment of a first method for structuring flow cell substrates. The first method for structuring flow cell substrates 400 includes preparing a flow cell for a photoinitiated chemical reaction at 402, wherein the flow cell includes a substrate with a grating formed thereon for coupling radiation; a first layer of material located above the substrate; a second layer of material located above the first layer of material; and nanowells formed in the second layer of material, wherein each nanowell includes a top portion and a bottom portion; wherein preparing the flow cell includes silanizing the second layer of material at 404; and coating the silanized second layer of material of the nanowells with a first group of reagents at 406; introducing a second group of reactants into the nanowells at step 408, wherein the second group of reactants includes at least one target reactant, a copper-chelated ligand, and a light-sensitive photoinitiator system; and directing light into the flow cell through the radiation coupling grids only onto the bottom of each nanowell to photoinitiate a chemical reaction between the first and second groups of reactants at step 410, wherein the light-initiated chemical reaction covalently binds the target reactant only to the bottom of each nanowell.
[0038] Что касается варианта реализации, показанного на ФИГ. 4, ниже приведены не имеющие ограничительного характера примеры различных аспектов описанного способа. Примеры фотоинициированных химических реакций включают в себя химические реакции азид-алкин с использованием синего света с заданной длиной волны от прибл. 450 нм до 495 нм; химические реакции тетразол-алкин с использованием зеленого света с заданной длиной волны от прибл. 520 нм до 560 нм; и реакции циклоприсоединения азид/ацетилен без присутствия металлов с использованием маскирования тройных связей с дибензоциклооктинами в качестве циклопропенона (см., например, JACS 2009, 131, 15769-15776). Примеры методик формирования решеток для ввода излучения на подложке (которая может быть стеклом) включают в себя фотолитографическое структурирование решетки из диоксида кремния (SiO2), обратную литографию, лазерное травление и наноимпринтинг. К примерам материалов для первого слоя относятся наноимпринтные литографические (NIL) смолы с низким показателем преломления и полимеры с низким показателем преломления. Примеры способов осаждения первого слоя материала на подложку включают покрытие распылением и покрытие центрифугированием. К примерам материалов для второго слоя относятся смолы с высоким показателем преломления, полимеры с высоким показателем преломления и оксиды металлов, такие как, например, пентоксид тантала (Ta2O5). Примеры способов нанесения второго слоя материала на первый слой включают вакуумное тонкопленочное осаждение из паровой фазы, покрытие распылением и покрытие центрифугированием. Примеры методик формирования нанолунок во втором слое материала включают структурирование в виде наноимпринтинговой литографии. Примеры способов покрытия силанизированного второго слоя материала и нанолунок первой группой реагентов включают покрытие распылением и покрытие центрифугированием. Примеры методик введения второй группы реагентов в нанолунки включают использование микроструйной насосной системы, такой как, например, перистальтический насос. Примеры методик направления света внутрь проточной кюветы через решетки для ввода излучения включают использование фокусирующих оптических элементов для направления света от внешнего источника в проточную кювету. [0038] With respect to the embodiment shown in FIG. 4, non-limiting examples of various aspects of the disclosed method are provided below. Examples of photo-initiated chemistry include azide-alkyne chemistry using blue light with a target wavelength of about 450 nm to 495 nm; tetrazole-alkyne chemistry using green light with a target wavelength of about 520 nm to 560 nm; and metal-free azide/acetylene cycloaddition reactions using triple bond masking with dibenzocyclooctynes as cyclopropenone (see, e.g., JACS 2009, 131, 15769-15776). Examples of techniques for forming radiation coupling gratings on a substrate (which may be glass) include photolithographic patterning of a silicon dioxide (SiO 2 ) grating, lift-off lithography, laser etching, and nanoimprinting. Examples of materials for the first layer include low refractive index nanoimprint lithography (NIL) resins and low refractive index polymers. Examples of methods for depositing the first layer of material on the substrate include sputter coating and spin coating. Examples of materials for the second layer include high refractive index resins, high refractive index polymers, and metal oxides such as tantalum pentoxide (Ta 2O 5 ) . Examples of methods for depositing the second layer of material on the first layer include vacuum thin film vapor deposition, sputter coating, and spin coating. Examples of techniques for forming nanowells in the second layer of material include patterning in the form of nanoimprint lithography. Examples of methods for coating the silanized second layer of material and the nanowells with the first group of reagents include spray coating and spin coating. Examples of techniques for introducing the second group of reagents into the nanowells include using a microfluidic pump system, such as a peristaltic pump. Examples of techniques for directing light into the flow cell through radiation injection gratings include using focusing optics to direct light from an external source into the flow cell.
[0039] На ФИГ. 5 показана блок-схема реализации второго способа структурирования подложек проточных кювет. Второй способ структурирования подложек проточных кювет 500 содержит изготовление проточной кюветы с плоским волноводом на этапе 502 путем формирования слоя решеток для ввода излучения на стеклянной подложке на этапе 504; нанесение среднего слоя на слой решеток для ввода излучения на этапе 506; нанесение покровного слоя на средний слой на этапе 508; и формирование подложек нанолунок в покровном слое на этапе 510, причем каждая подложка нанолунки включает в себя верхнюю часть и нижнюю часть, а подложки нанолунки образуют между собой промежуточные области; силанизацию покровного слоя на этапе 512; покрытие первой группой реагентов силанизированного покровного слоя и подложек нанолунок на этапе 514; введение второй группы реагентов в подложки нанолунок на этапе 516, причем вторая группа реагентов включает по меньшей мере один реагент-мишень, хелатированный медью лиганд и систему светочувствительного фотоинициатора; направление света внутрь проточной кюветы с плоским волноводом через решетки для ввода излучения только к нижней части каждой подложки нанолунки для фотоинициирования химической реакции между первой и второй группами реагентов на этапе 518, причем фотоинициированная химическая реакция ковалентно связывает реагент-мишень только с нижней частью каждой подложки нанолунки. [0039] FIG. 5 shows a block diagram of an embodiment of a second method for structuring flow cell substrates. The second method for structuring flow cell substrates 500 comprises producing a flow cell with a planar waveguide at 502 by forming a layer of radiation coupling gratings on a glass substrate at 504; applying a middle layer to the layer of radiation coupling gratings at 506; applying a cap layer to the middle layer at 508; and forming nanowell substrates in the cap layer at 510, wherein each nanowell substrate includes an upper portion and a lower portion, and the nanowell substrates form intermediate regions between them; silanizing the cap layer at 512; coating the silanized cap layer and the nanowell substrates with a first group of reagents at 514; introducing a second group of reactants into the nanowell substrates at step 516, wherein the second group of reactants includes at least one target reactant, a copper-chelated ligand, and a light-sensitive photoinitiator system; directing light into the planar waveguide flow cell through the radiation coupling gratings only to the bottom of each nanowell substrate to photoinitiate a chemical reaction between the first and second groups of reactants at step 518, wherein the photoinitiated chemical reaction covalently binds the target reactant only to the bottom of each nanowell substrate.
[0040] Что касается варианта реализации, показанного на ФИГ. 5, ниже приведены не имеющие ограничительного характера примеры различных аспектов описанного способа. Примеры методик формирования слоя решеток для ввода излучения на подложке (которая может быть стеклом) включают в себя фотолитографическое структурирование решетки из диоксида кремния (SiO2), обратную литографию, лазерное травление и наноимпринтинг. К примерам материалов для среднего слоя относятся наноимпринтные литографические (NIL) смолы с низким показателем преломления и полимеры с низким показателем преломления. Примеры способов нанесения среднего слоя материала на подложку включают покрытие распылением и покрытие центрифугированием. К примерам материалов для покровного слоя относятся смолы с высоким показателем преломления, полимеры с высоким показателем преломления и оксиды металлов, такие как, например, пентоксид тантала (Ta2O5). Примеры способов нанесения покровного слоя на средний слой включают вакуумное тонкопленочное осаждение из паровой фазы, покрытие напылением и покрытие центрифугированием. Примеры методик формирования нанолунок во втором слое материала включают структурирование в виде наноимпринтинговой литографии. Примеры способов покрытия силанизированного покровного слоя и нанолунок первой группой реагентов включают покрытие распылением и покрытие центрифугированием. Примеры методик введения второй группы реагентов в нанолунки включают использование микроструйной насосной системы, такой как, например, перистальтический насос. Примеры методик направления света внутрь проточной кюветы через решетки для ввода излучения включают использование фокусирующих оптических элементов для направления света от внешнего источника в проточную кювету. Примеры фотоинициированных химических реакций включают в себя химические реакции азид-алкин с использованием синего света с заданной длиной волны от прибл. 450 нм до 495 нм; химические реакции тетразол-алкин с использованием зеленого света с заданной длиной волны от прибл. 520 нм до 560 нм; и реакции циклоприсоединения азид/ацетилен без присутствия металлов с использованием маскирования тройных связей с дибензоциклооктинами в качестве циклопропенона (см., например, JACS 2009, 131, 15769-15776). [0040] With respect to the embodiment shown in FIG. 5, non-limiting examples of various aspects of the described method are provided below. Examples of techniques for forming a grating layer for coupling radiation onto a substrate (which may be glass) include photolithographic structuring of a silicon dioxide (SiO 2 ) grating, lift-off lithography, laser etching, and nanoimprinting. Examples of materials for the middle layer include low refractive index nanoimprint lithography (NIL) resins and low refractive index polymers. Examples of methods for applying the middle layer of material to the substrate include sputter coating and spin coating. Examples of materials for the cover layer include high refractive index resins, high refractive index polymers, and metal oxides such as, for example, tantalum pentoxide (Ta 2 O 5 ) . Examples of methods for applying the cap layer to the middle layer include vacuum thin film vapor deposition, sputter coating, and spin coating. Examples of techniques for forming nanowells in the second layer of material include patterning in the form of nanoimprinting lithography. Examples of methods for coating the silanized cap layer and nanowells with the first group of reactants include sputter coating and spin coating. Examples of techniques for introducing the second group of reactants into the nanowells include using a microfluidic pump system, such as, for example, a peristaltic pump. Examples of techniques for directing light into the flow cell through radiation injection gratings include using focusing optical elements to direct light from an external source into the flow cell. Examples of photoinitiated chemistry include azide-alkyne chemistry using blue light of a specified wavelength of from about 450 nm to 495 nm; tetrazole-alkyne chemistry using green light of a specified wavelength of from about 450 nm to 495 nm. 520 nm to 560 nm; and metal-free azide/acetylene cycloaddition reactions using triple bond masking with dibenzocyclooctynes as cyclopropenone (see, e.g., JACS 2009, 131, 15769–15776).
[0041] На ФИГ. 6 показана блок-схема реализации третьего способа структурирования подложек проточных кювет. Третий способ структурирования подложек проточных кювет 600 включает изготовление проточной кюветы с плоским волноводом на этапе 602 путем формирования слоя решеток для ввода излучения на стеклянной подложке на этапе 604; нанесение среднего слоя на слой решеток для ввода излучения на этапе 606; нанесение покровного слоя на средний слой на этапе 608; и формирование подложек нанолунок в покровном слое на этапе 610, причем каждая подложка нанолунки включает в себя верхнюю часть и нижнюю часть, а подложки нанолунки образуют между собой промежуточные области; и силанизацию покровного слоя на этапе 612; покрытие покровного слоя и подложек нанолунок первой группой реагентов на этапе 614, причем первая группа реагентов дополнительно включает в себя полимер, азидные фрагменты, связанные с полимером, медь-содержащий лиганд и систему светочувствительного фотоинициатора; направление света с заданной длиной волны внутрь проточной кюветы с плоским волноводом только на нижнюю часть каждой подложки нанолунки для фотоинициирования химической реакции между реагентами в первой группе реагентов на этапе 616, причем фотоинициированная химическая реакция ковалентно связывает полимер только с нижней частью каждой подложки нанолунки; введение второй группы реагентов в подложки нанолунок на этапе 618, причем вторая группа реагентов включает по меньшей мере один реагент-мишень, медь-содержащий лиганд и систему светочувствительного фотоинициатора; и направление света с заданной длиной волны внутрь проточной кюветы с плоским волноводом только на нижнюю часть каждой подложки нанолунки для фотоинициирования химической реакции между ковалентно связанным полимером и второй группой реагентов на этапе 620, причем фотоинициированная химическая реакция ковалентно связывает реагент-мишень только с нижней частью подложки каждой нанолунки. [0041] FIG. 6 shows a block diagram of an embodiment of a third method for structuring flow cell substrates. The third method for structuring flow cell substrates 600 includes producing a flow cell with a planar waveguide at 602 by forming a layer of radiation coupling gratings on a glass substrate at 604; applying a middle layer to the layer of radiation coupling gratings at 606; applying a cover layer to the middle layer at 608; and forming nanowell substrates in the cover layer at 610, wherein each nanowell substrate includes an upper portion and a lower portion, and the nanowell substrates form intermediate regions between them; and silanizing the cover layer at 612; coating the cap layer and the nanowell substrates with a first group of reagents at step 614, wherein the first group of reagents further includes a polymer, azide moieties linked to the polymer, a copper-containing ligand, and a light-sensitive photoinitiator system; directing light of a given wavelength into a flow cell with a planar waveguide only onto a lower portion of each nanowell substrate to photoinitiate a chemical reaction between the reagents in the first group of reagents at step 616, wherein the photoinitiated chemical reaction covalently binds the polymer only to the lower portion of each nanowell substrate; introducing a second group of reagents into the nanowell substrates at step 618, wherein the second group of reagents includes at least one target reagent, a copper-containing ligand, and a light-sensitive photoinitiator system; and directing light of a given wavelength into the planar waveguide flow cell only onto the bottom of each nanowell substrate to photoinitiate a chemical reaction between the covalently linked polymer and the second group of reactants at step 620, wherein the photoinitiated chemical reaction covalently links the target reactant only to the bottom of each nanowell substrate.
[0042] Что касается варианта реализации, показанного на ФИГ. 6, ниже приведены не имеющие ограничительного характера примеры различных аспектов описанного способа. Примеры методик формирования решеток для ввода излучения на подложке (которая может быть стеклом) включают в себя фотолитографическое структурирование решетки из диоксида кремния (SiO2), обратную литографию, лазерное травление и наноимпринтинг. К примерам материалов для среднего слоя относятся наноимпринтные литографические (NIL) смолы с низким показателем преломления и полимеры с низким показателем преломления. Примеры способов нанесения среднего слоя материала на подложку включают покрытие распылением и покрытие центрифугированием. К примерам материалов для покровного слоя относятся смолы с высоким показателем преломления, полимеры с высоким показателем преломления и оксиды металлов, такие как, например, пентоксид тантала (Ta2O5). Примеры способов нанесения покровного слоя на средний слой включают вакуумное тонкопленочное осаждение из паровой фазы, покрытие напылением и покрытие центрифугированием. Примеры методик формирования нанолунок во втором слое материала включают структурирование в виде наноимпринтинговой литографии. Примеры способов покрытия силанизированного покровного слоя и нанолунок первой группой реагентов включают покрытие распылением и покрытие центрифугированием. Примеры методик введения второй группы реагентов в нанолунки включают использование микроструйной насосной системы, такой как, например, перистальтический насос. Примеры методик направления света внутрь проточной кюветы через решетки для ввода излучения включают использование фокусирующих оптических элементов для направления света от внешнего источника в проточную кювету. Примеры фотоинициированных химических реакций включают в себя химические реакции азид-алкин с использованием синего света с заданной длиной волны от прибл. 450 нм до 495 нм; химические реакции тетразол-алкин с использованием зеленого света с заданной длиной волны от прибл. 520 нм до 560 нм; и реакции циклоприсоединения азид/ацетилен без присутствия металлов с использованием маскирования тройных связей с дибензоциклооктинами в качестве циклопропенона (см., например, JACS 2009, 131, 15769-15776). [0042] With respect to the embodiment shown in FIG. 6, non-limiting examples of various aspects of the described method are provided below. Examples of techniques for forming radiation input gratings on a substrate (which may be glass) include photolithographic structuring of a silicon dioxide (SiO 2 ) grating, lift-off lithography, laser etching, and nanoimprinting. Examples of materials for the middle layer include low refractive index nanoimprint lithography (NIL) resins and low refractive index polymers. Examples of methods for applying the middle layer of material to the substrate include sputter coating and spin coating. Examples of materials for the cover layer include high refractive index resins, high refractive index polymers, and metal oxides such as, for example, tantalum pentoxide (Ta 2 O 5 ) . Examples of methods for applying the cap layer to the middle layer include vacuum thin film vapor deposition, sputter coating, and spin coating. Examples of techniques for forming nanowells in the second layer of material include patterning in the form of nanoimprinting lithography. Examples of methods for coating the silanized cap layer and nanowells with the first group of reactants include sputter coating and spin coating. Examples of techniques for introducing the second group of reactants into the nanowells include using a microfluidic pump system, such as, for example, a peristaltic pump. Examples of techniques for directing light into the flow cell through radiation injection gratings include using focusing optical elements to direct light from an external source into the flow cell. Examples of photoinitiated chemistry include azide-alkyne chemistry using blue light of a specified wavelength of from about 450 nm to 495 nm; tetrazole-alkyne chemistry using green light of a specified wavelength of from about 450 nm to 495 nm. 520 nm to 560 nm; and metal-free azide/acetylene cycloaddition reactions using triple bond masking with dibenzocyclooctynes as cyclopropenone (see, e.g., JACS 2009, 131, 15769–15776).
[0043] Вся литература и аналогичные материалы, цитируемые в настоящей заявке, включая, без ограничений, патенты, заявки на патенты, статьи, книги, научные трактаты и веб-страницы, независимо от формата такой литературы и аналогичных материалов, включены в настоящий документ посредством ссылки. В случае если один или более из включенной в настоящий документ литературы и аналогичных материалов отличаются от настоящей заявки или противоречит ей, включая, без ограничений, определенные термины, использование терминов, описанные методы и т. п., данная заявка имеет преобладающую силу. [0043] All literature and similar materials cited in this application, including, without limitation, patents, patent applications, articles, books, scientific treatises, and web pages, regardless of the format of such literature and similar materials, are incorporated herein by reference. In the event that one or more of the literature and similar materials incorporated herein differs from or conflicts with this application, including, without limitation, defined terms, use of terms, described methods, etc., this application shall control.
[0044] Вышеприведенное описание предоставлено для того, чтобы специалист в данной области мог реализовать на практике различные конфигурации, описанные в настоящем документе. Хотя технология, являющаяся объектом изобретения, описана, в частности, со ссылкой на различные фигуры и конфигурации, следует понимать, что она приведена только в качестве иллюстрации и не должна рассматриваться как ограничивающая объем технологии, являющейся объектом изобретения. [0044] The above description is provided to enable one skilled in the art to practice the various configurations described herein. Although the inventive technology has been described in particular with reference to various figures and configurations, it should be understood that this is provided for illustrative purposes only and should not be construed as limiting the scope of the inventive technology.
[0045] В настоящем документе элемент или стадия, перечисленные в единственном числе и предшествующие слова в единственном числе, следует понимать как не исключающие множественное число указанных элементов или стадий, если такое исключение не указано явным образом. Более того, ссылки на «один вариант реализации» не следует интерпретировать как исключающие существование дополнительных вариантов реализации, которые также включают в себя указанные элементы. Более того, если явно не указано иное, варианты реализации «содержащие» или «имеющие» элемент или множество элементов, имеющих конкретное свойство, могут включать в себя дополнительные элементы, независимо от того, имеют ли они это свойство или нет. [0045] As used herein, an element or step listed in the singular and preceded by words in the singular should be understood as not excluding a plurality of the listed elements or steps, unless such exclusion is explicitly stated. Moreover, references to "one embodiment" should not be interpreted as excluding the existence of additional embodiments that also include the listed elements. Moreover, unless explicitly stated otherwise, embodiments "comprising" or "having" an element or plurality of elements having a particular property may include additional elements, whether or not they have that property.
[0046] Термины «по существу» и «около», используемые в данном описании, используются для описания и учета небольших колебаний, например, из-за вариаций при обработке. Например, они могут относиться к меньшим или равным ± 5%, например, меньшим или равным ± 2%, например, меньшим или равным ± 1%, например, меньшим или равным ± 0,5%, например, меньшим или равным ± 0,2%, например, меньшим или равным ± 0,1%, например, меньшим или равным ± 0,05%. [0046] The terms "substantially" and "about" as used in this specification are used to describe and account for small variations, such as those due to processing variations. For example, they may refer to less than or equal to ±5%, such as less than or equal to ±2%, such as less than or equal to ±1%, such as less than or equal to ±0.5%, such as less than or equal to ±0.2%, such as less than or equal to ±0.1%, such as less than or equal to ±0.05%.
[0047] Существует множество других способов реализации технологии, являющейся объектом изобретения. Различные функции и элементы, описанные в настоящем документе, можно разделять отличным от показанных образом без отступления от объема технологии, являющейся объектом изобретения. Для специалистов в данной области могут быть очевидны различные модификации этих вариантов реализации, и общие принципы, определенные в настоящем документе, могут применяться к другим вариантам реализации. Таким образом, специалист в данной области может вносить множество изменений и модификаций в технологию, являющуюся объектом изобретения, без отступления от объема технологии, являющейся объектом изобретения. Например, может быть использовано разное количество данных модулей или блоков, может быть использован другой тип или типы данных модулей или блоков, может быть добавлен данный модуль или блок или может быть опущен данный модуль или блок. [0047] There are many other ways to implement the inventive technology. The various functions and elements described herein can be separated in a manner different from those shown without departing from the scope of the inventive technology. Various modifications to these embodiments may be apparent to those skilled in the art, and the general principles defined herein may be applied to other embodiments. Thus, a person skilled in the art can make many changes and modifications to the inventive technology without departing from the scope of the inventive technology. For example, a different number of these modules or blocks may be used, a different type or types of these modules or blocks may be used, a given module or block may be added, or a given module or block may be omitted.
[0048] Подчеркнутые и/или выделенные курсивом заголовки и подзаголовки используются только для удобства, не ограничивают технологию, являющуюся объектом изобретения, и не упоминаются в связи с интерпретацией описания технологии, являющейся объектом изобретения. Все структурные и функциональные эквиваленты элементов различных вариантов реализации, описанных в настоящем описании, которые известны или станут позднее известными специалистам в данной области, в явной форме включены в настоящий документ путем ссылки и считаются охваченными технологией, являющейся объектом изобретения. Более того, ничто из раскрытого в настоящем документе не предназначено для общественности, независимо от того, указано ли такое раскрытие в приведенном выше описании в явном виде. [0048] Underlined and/or italicized headings and subheadings are used for convenience only, do not limit the inventive technology, and are not mentioned in connection with the interpretation of the description of the inventive technology. All structural and functional equivalents of elements of the various embodiments described in this specification that are known or later become known to those skilled in the art are expressly incorporated herein by reference and are considered to be covered by the inventive technology. Moreover, nothing disclosed herein is intended for the public, regardless of whether such disclosure is explicitly indicated in the above description.
[0049] Следует понимать, что все комбинации вышеуказанных концепций и дополнительных концепций, более подробно описанных ниже (при условии, что такие концепции не являются взаимно противоречащими), рассматриваются как часть объекта изобретения, описанного в данном документе. В частности, все комбинации заявленного объекта изобретения, появляющиеся в конце данного описания, считаются частью объекта изобретения, описанного в данном документе. [0049] It should be understood that all combinations of the above concepts and additional concepts described in more detail below (provided that such concepts are not mutually contradictory) are considered to be part of the subject matter described herein. In particular, all combinations of claimed subject matter appearing at the end of this description are considered to be part of the subject matter described herein.
Claims (83)
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US62/884,753 | 2019-08-09 | ||
| NL2023679 | 2019-08-21 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2021118884A RU2021118884A (en) | 2023-09-11 |
| RU2825970C2 true RU2825970C2 (en) | 2024-09-02 |
Family
ID=
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU161938A1 (en) * | ||||
| WO2019126040A1 (en) * | 2017-12-21 | 2019-06-27 | Illumina, Inc. | Flow cells with hydrogel coating |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU161938A1 (en) * | ||||
| WO2019126040A1 (en) * | 2017-12-21 | 2019-06-27 | Illumina, Inc. | Flow cells with hydrogel coating |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| WO2021028815A1 (en) | System and method for patterning flow cell substrates | |
| Doh et al. | Photogenerated polyelectrolyte bilayers from an aqueous-processible photoresist for multicomponent protein patterning | |
| WO2021087402A1 (en) | Flow cell systems and methods | |
| US9910005B2 (en) | Biosensor | |
| CN102713684A (en) | Methods for fabricating flexible waveguides using alkyl-functional silsesquioxane resins | |
| US12311362B2 (en) | System and method for patterning flow cell substrates | |
| TW201638670A (en) | Method of producing microfluidic device, microfluidic device, and photosensitive resin composition | |
| RU2825970C2 (en) | Flow cell substrate structuring system and method | |
| KR100601954B1 (en) | A method of manufacturing a substrate having a patterned organosilane layer and a method of using a substrate produced by the method | |
| CN102165317A (en) | Process for producing microbeads and microbeads | |
| CN1942764A (en) | Non-covalent immobilization of indicator molecules | |
| US20110053799A1 (en) | Method of producing microarray substrate, radiation-sensitive composition, partition of microarray substrate, method of producing biochip, and biochip | |
| CN117730396A (en) | Sequencing systems and methods utilizing three-dimensional substrates | |
| WO2004092250A1 (en) | Biocompatible material | |
| HK40060053A (en) | System and method for patterning flow cell substrates | |
| JP4502167B2 (en) | Microarray chip | |
| US20130136924A1 (en) | Three-dimensional polymer-metal complex microstructure and method for producing the same | |
| Jang et al. | Micropatterning of biomolecules on a glass substrate in fused silica microchannels by using photolabile linker-based surface activation | |
| KR20140085006A (en) | microfluidic CHIP and method of preparing the same | |
| RU2021118884A (en) | SYSTEM AND METHOD FOR STRUCTURING FLOW CELL SUBSTRATES | |
| JPWO2021028815A5 (en) | ||
| US20240219835A1 (en) | Etch-free photoresist patterning in multi-depth nanowells | |
| WO2017167973A1 (en) | A biosensor system for use in point-of-care applications and a method for fabricating same | |
| US20050069637A1 (en) | Method for manufacturing planar optical waveguide | |
| KR100426959B1 (en) | Menufacturing Method for Planar Optical Waveguide |