RU2824049C2

RU2824049C2 - Анализ множества аналитов с использованием одного анализа

Info

Publication number: RU2824049C2
Application number: RU2021108043A
Authority: RU
Inventors: Фрэнк Дж. СТИМЕРС; Фань Чжан; Дмитрий К. ПОХОЛОК; Стивен НОРБЕРГ
Original assignee: Иллюмина, Инк.
Priority date: 2018-11-30
Filing date: 2019-11-25
Publication date: 2024-08-01

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии. Описана библиотека нуклеиновых кислот для анализа ДНК и РНК из образца, созданная одновременно из РНК и ДНК в одном компартменте, содержащая библиотеку молекул второй цепи комплементарной ДНК (кДНК), полученную из молекул мРНК и содержащую нуклеиновые кислоты, имеющие первую метку, и библиотеку геномной ДНК (гДНК), полученную из геномной ДНК, тагментированной второй меткой и 3’ поли-А хвостом с применением транспосом с поли-А транспозонами, и при этом указанные библиотеки кДНК и гДНК совместно компартментированы и получены в одной и той же среде. Также описано устройство проточной кюветы для одновременного получения библиотек РНК и ДНК в одном компартменте, содержащее зонд захвата на основе поли-Т, выполненный с возможностью гибридизации с 3’ поли-А хвостом РНК, причем зонд захвата содержит первую общую последовательность (CS1); зонд захвата на основе поли-Т, выполненный с возможностью гибридизации с 3’ поли-А хвостом ДНК, причем зонд захвата содержит CS1; при этом каждый зонд захвата выполнен с возможностью одновременного анализа РНК и ДНК из образца в одном компартменте. Раскрыт способ одновременного анализа ДНК и РНК из образца в одном компартменте, включающий: обеспечение образца, содержащего ДНК и РНК, причем РНК содержит 3’ поли-А хвост; тагментирование ДНК 3’ поли-А хвостом с применением транспосом с поли-А транспозонами; приведение образца в одном компартменте в контакт с зондом захвата на основе поли-Т, выполненным с возможностью гибридизации с 3’ поли-А хвостом РНК и ДНК, причем зонд захвата содержит первую общую последовательность (CS1); гибридизацию зонда захвата на основе поли-Т с РНК и с ДНК, таким образом, одновременно захватывая ДНК и РНК; и анализ ДНК и РНК. Также раскрыт способ одновременного создания в одном компартменте библиотеки нуклеиновых кислот, содержащей гДНК и кДНК, включающий: обеспечение образца, содержащего ДНК и РНК, причем РНК содержит 3’ поли-А хвост; тагментирование ДНК3’ поли-А хвостом с применением транспосом с поли-А транспозонами; приведение образца в одном компартменте в контакт с зондом захвата на основе поли-Т, выполненным с возможностью гибридизации с 3’ поли-А хвостом РНК и ДНК, причем зонд захвата содержит первую общую последовательность (CS1); гибридизацию зонда захвата с РНК и с ДНК, таким образом, одновременно захватывая ДНК и РНК; конвертацию РНК в первую и/или вторую цепь кДНК; и одновременное создание библиотеки кДНК и библиотеки гДНК из гибридизированных РНК и ДНК. Описан набор для одновременного анализа ДНК и РНК из образца в одном компартменте, содержащий реагенты для транспозиции и зонд захвата на основе поли-Т, выполненный с возможностью гибридизации с 3’ поли-А хвостом РНК и 3’ поли-А хвостом ДНК, причем указанный зонд захвата содержит первую общую последовательность (CS1). Изобретение позволяет анализировать ДНК и РНК из одного образца в одном анализе. 5 н. и 38 з.п. ф-лы, 14 ил., 2 табл., 2 пр.

Description

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0001] Представленные в настоящем документе системы, способы и композиции относятся к анализам для одновременного анализа множества аналитов в одном образце. В частности, аспекты, описанные в настоящем документе, относятся к способам анализа ДНК и РНК из одного образца в одном анализе.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0002] Обнаружение специфических нуклеотидных последовательностей, присутствующих в биологическом образце, используют, например, в качестве способа идентификации и классификации микроорганизмов, диагностики инфекционных заболеваний, обнаружения и описания генетических аномалий, выявления генетических изменений, связанных с раком, изучения генетической предрасположенности к тому или иному заболеванию и оценки ответа на различные формы лечения. Распространенной методикой обнаружения специфических нуклеотидных последовательностей в биологическом образце является секвенирование нуклеиновых кислот.

[0003] Секвенирование полного генома, генотипирование, целевое повторное секвенирование, экспрессия генов, геномика одиночной клетки, эпигеномика и анализ экспрессии белков образцов тканей могут иметь большое значение для выявления биомаркеров заболевания, точной диагностики и прогноза заболеваний и выбора правильного лечения пациента. Часто для этого требуется множество анализов для отдельного анализа конкретного интересующего аналита, такого как ДНК, РНК или белки. Для отдельного и индивидуального анализа этих аналитов были представлены различные анализы. Однако комплексный анализ множества аналитов занимает много времени и является трудоемким.

ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0004] Настоящее описание относится к системам, способам и композициям для одновременного анализа множества аналитов в образце с использованием одного анализа.

[0005] Некоторые варианты осуществления, представленные в настоящем документе, относятся к библиотекам нуклеиновых кислот. В некоторых вариантах осуществления библиотеки содержат библиотеку комплементарной ДНК (кДНК) и библиотеку геномной ДНК (гДНК). В некоторых вариантах осуществления библиотеку кДНК получают из молекул мРНК, и она содержат нуклеиновые кислоты, имеющие первую метку, содержащую первый штрихкод. В некоторых вариантах осуществления библиотеку гДНК получают из геномной ДНК, и она содержит нуклеиновые кислоты, имеющие вторую метку, содержащую второй штрихкод. В некоторых вариантах осуществления первый штрихкод и второй штрихкод являются одинаковыми или разными, и первый штрихкод и второй штрихкод идентифицируют общий источник библиотек кДНК и гДНК. В некоторых вариантах осуществления библиотеки кДНК и гДНК совместно компартментируют и получают в одной и той же среде. В некоторых вариантах осуществления метка для ДНК и метка для РНК являются одинаковыми.

[0006] Некоторые варианты осуществления, представленные в настоящем документе, относятся к устройству проточной кюветы. В некоторых вариантах осуществления устройство проточной кюветы содержит первый зонд для захвата РНК, причем первый зонд содержит первый штрихкод и первую последовательность распознавания субстрата, и второй зонд для захвата ДНК, причем второй зонд содержит второй штрихкод и вторую последовательность распознавания субстрата. В некоторых вариантах осуществления первый штрихкод и второй штрихкод являются одинаковыми или разными, и первый штрихкод и второй штрихкод идентифицируют общий источник РНК и ДНК. В некоторых вариантах осуществления первый и второй зонды выполнены с возможностью одновременного анализа РНК и ДНК из образца в одном компартменте. Способ по п. 19, в котором первый и второй зонды захвата иммобилизованы на твердой подложке.

[0007] Некоторые варианты осуществления, представленные в настоящем документе, относятся к способам одновременного анализа ДНК и РНК из образца в одном компартменте. В некоторых вариантах осуществления способы включают обеспечение образца, содержащего ДНК и РНК, причем РНК содержит первую метку, которая дифференцированно метит ДНК второй меткой, приведение образца в контакт в одном компартменте с первым зондом захвата для захвата РНК и вторым зондом захвата для захвата меченой ДНК, гибридизацию первого зонда захвата с РНК и второго зонда захвата с ДНК, таким образом захватывая РНК и ДНК, и анализа ДНК и РНК. В некоторых вариантах осуществления первый зонд захвата содержит первый штрихкод, а второй зонд захвата содержит второй штрихкод, и первый штрихкод и второй штрихкод идентифицируют общий источник РНК и ДНК.

[0008] Некоторые варианты осуществления, представленные в настоящем документе, относятся к способам одновременного получения в одном компартменте библиотеки нуклеиновых кислот, содержащей гДНК и кДНК. В некоторых вариантах осуществления способы включают обеспечение образца, содержащего ДНК и РНК, причем РНК содержит первую метку, которая дифференциально метит ДНК второй меткой, приведение образца в контакт в одном компартменте с первым зондом для захвата РНК и вторым зондом для захвата меченой ДНК, гибридизацию РНК и ДНК с первым и вторым зондами соответственно и одновременное получение из гибридизированных РНК и ДНК библиотеки кДНК и библиотеки гДНК. В некоторых вариантах осуществления первый зонд содержит первый штрихкод, а второй зонд содержит второй штрихкод, и первый штрихкод и второй штрихкод идентифицируют общий источник РНК и ДНК.

[0009] Некоторые варианты осуществления, представленные в настоящем документе, относятся к наборам для одновременного анализа ДНК и РНК в образце в одном компартменте. В некоторых вариантах осуществления наборы включают реагенты для транспозиции и первый зонд, комплементарный первой метке, и второй зонд, комплементарный второй метке, причем первый и второй зонды иммобилизованы на твердой подложке, причем первый зонд содержит первый штрихкод, а второй зонд содержит второй штрихкод, и при этом первый и второй штрихкоды идентифицируют общий источник ДНК и РНК.

[0010] Некоторые представленные в настоящем документе варианты осуществления относятся к способам выполнения анализа доступного для транспозазы хроматина с использованием секвенирования (ATAC-seq) для одиночной клетки. В некоторых вариантах осуществления способы включают обеспечение образца, содержащего популяцию клеток или ядер, выполнение транспозиции с сохранением смежности на целевых нуклеиновых кислотах, разделение популяции клеток или ядер на отдельные капли, причем в одиночную каплю помещают одиночную клетку или ядро, индексирование целевых нуклеиновых кислот и анализ индексированных нуклеиновых кислот.

[0011] Некоторые варианты осуществления, представленные в настоящем документе, относятся к способам комбинаторного индексирования (CPT-seq). В некоторых вариантах осуществления способы включают обеспечение образца, содержащего популяцию клеток или ядер, выполнение индивидуально индексированной транспозиции с сохранением смежности на целевых нуклеиновых кислотах, разделение популяции клеток или ядер на отдельные капли, причем в одиночную каплю помещают множество клеток или ядер, и при этом множество клеток или ядер в одиночной капле имеют уникальный индекс, индексирование целевых нуклеиновых кислот и анализ индексированных нуклеиновых кислот.

[0012] В любом из вариантов осуществления, обобщенных в настоящем документе, аналиты получают из популяции клеток, одиночной клетки, популяции клеточных ядер или ядра клетки. В любом из вариантов осуществления, обобщенных в настоящем документе, аналиты анализируют с помощью различных анализов в зависимости от того, что собой представляет аналит. Например, анализ может включать анализ ДНК, анализ РНК, анализ белков, тагментацию, амплификацию нуклеиновых кислот, секвенирование нуклеиновых кислот, получение библиотеки нуклеиновых кислот, анализ доступного для транспозазы хроматина с использованием секвенирования (ATAC-seq), транспозицию с сохранением смежности (CPT-seq), комбинаторное индексированное секвенирование одиночной клетки (SCI-seq) или амплификацию генома одиночной клетки или любую их комбинацию.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[0013] На ФИГ. 1А представлена схема, иллюстрирующая традиционные способы анализа множества интересующих аналитов в образце, причем каждый интересующий аналит анализируют по отдельности при двух разных наблюдениях. На ФИГ. 1В представлена схема варианта осуществления способа одновременного измерения различных интересующих аналитов в одном и том же компартменте.

[0014] На ФИГ. 2 представлена принципиальная схема, иллюстрирующая вариант осуществления совместного анализа с использованием различных меток для связывания с ДНК и РНК. Показаны различные метки, введенные в одиночную клетку или ядро, имеющее РНК или ДНК. Одиночная клетка или ядро инкапсулированы в капле или отделены в лунке планшета. Штрихкод иммобилизирован на поверхности или добавлен в раствор, он захватывает ДНК и РНК посредством меток.

[0015] На ФИГ. 3 представлена принципиальная схема, иллюстрирующая вариант осуществления совместного анализа с использованием одной и той же метки для связывания с ДНК и РНК. ДНК сначала фрагментируют транспосомой так, чтобы она содержала хвост поли-А. Как фрагменты ДНК, так и мРНК индексируют с использованием поли-Т олигонуклеотидов со штрихкодом, иммобилизованных на поверхности или в растворе. Реакция транспозиции, выполняемая на ДНК, позволяет отличить ДНК от РНК посредством внутренней транспозон-специфичной последовательности.

[0016] На ФИГ. 4 представлена принципиальная схема, иллюстрирующая вариант осуществления способа введения поли-А транспозона в геномную ДНК путем транспозиции. Ядро/клетку инкапсулируют с индексированным олигонуклеотидом, имеющим хвост поли-Т. Индексированный олигонуклеотид гибридизуют и лигируют с транспонированным фрагментом гДНК, а затем гибридизуют с мРНК с образованием первой кДНК. После синтеза второй кДНК двухцепочечную кДНК и гДНК снова транспонируют для добавления на другой конец адаптера ПЦР. Затем фрагменты амплифицируют с помощью ПЦР.

[0017] На ФИГ. 5А-5В схематично представлен анализ доступного для транспозазы хроматина с использованием секвенирования (ATAC-seq). На ФИГ. 5 А схематически показаны общие принципы ATAC-seq, а на ФИГ. 5В приведены стадии выполнения одноклеточного ATAC-seq.

[0018] На ФИГ. 6А-6В показана принципиальная схема, иллюстрирующая вариант осуществления валового совместного анализа. Как показано на ФИГ. 6А, выделяют клеточное ядро, а ДНК тагментируют хвостом поли-А. Тагментированные ДНК и мРНК захватывают зондом и очищают для дополнительного анализа. На ФИГ. 6В представлена дополнительная информация о фрагментах ДНК, используемых в способе, показанном на ФИГ. 6А.

[0019] На ФИГ. 7А-7В показана принципиальная схема, иллюстрирующая вариант осуществления совместного анализа гранул. Как показано на ФИГ. 7А, выделяют клеточное ядро, а ДНК тагментируют хвостом поли-А. Тагментированные ДНК и мРНК захватывают с помощью биотинового захвата. На ФИГ. 7В представлена дополнительная информация о фрагментах ДНК, используемых в способе, показанном на ФИГ. 7А.

[0020] На ФИГ. 8 представлены данные секвенирования валовых совместных анализов, изображенных на ФИГ. 6А-6В. Фрагмент библиотеки АТАС имеет сигнатурную последовательность ME, выделенную на ФИГ. 8.

[0021] На ФИГ. 9 на панелях А и В представлены данные секвенирования валовых совместных анализов, показанных на ФИГ. 6А-6В. Полученную библиотеку секвенировали. Фрагменты АТАС демонстрируют типичное обогащение рядом с промоторными областями (панель А), а фрагменты РНК со стороны 3' демонстрируют накопление чтений вблизи конца гена (панель В).

[0022] На ФИГ. 10 представлена схема, иллюстрирующая вариант осуществления совместного анализа, выполняемого с использованием комбинаторного индексирования, такого как SCI-seq.

[0023] На ФИГ. 11 представлена схема, иллюстрирующая вариант осуществления способа выполнения совместного анализа с использованием комбинаторного секвенирования.

[0024] На ФИГ. 12 показан пример осуществления рабочего процесса секвенирования, демонстрирующий пул гранул со вставленными в них штрихкодами, а также пример праймеров.

[0025] На ФИГ. 13 представлен график, на котором показано количество чтений на клетку, демонстрирующий, что увеличение транспозазы приводит к увеличению количества чтений на клетку.

[0026] На ФИГ. 14 представлен график, отображающий чувствительность для одиночной клетки при использовании ATAC-seq на смеси типов клеток.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

[0027] В приведенном ниже подробном описании содержатся ссылки на соответствующие рисунки, которые являются частью настоящего документа. Если иное не следует из контекста, в графических материалах аналогичные символы, как правило, обозначают аналогичные компоненты. Предполагается, что иллюстративные варианты осуществления, описанные в подробном описании, графических материалах и пунктах формулы изобретения, не имеют ограничительного характера. Допускается использовать другие варианты осуществления и вносить другие изменения без отступления от сущности или объема заявленного объекта изобретения, предложенного в настоящем документе. Следует понимать, что аспекты настоящего описания, как по существу описано в настоящем документе и проиллюстрировано на фигурах, можно перераспределять, заменять, комбинировать, разделять и конструировать в широком спектре разных конфигураций, все из которых явным образом предусмотрены в настоящем описании.

[0028] Варианты осуществления систем, способов и композиций, представленные в настоящем документе, относятся к одновременному анализу множества аналитов в одном образце. В некоторых вариантах осуществления множество аналитов включают ДНК и РНК.

[0029] Традиционные способы анализа множества аналитов из одного образца требуют отдельных анализов, включающих использование отдельных реагентов и стадий для выделения каждого интересующего аналита и последующий анализ каждого интересующего аналита, как показано, например, на ФИГ. 1А. Таким образом, аналиты можно анализировать отдельно во времени и/или в пространстве, например в разное время или в разных компартментах. Например, может быть желательным проанализировать как ДНК, так и РНК из одного образца. В традиционных способах раздельно анализируют ДНК с использованием одного анализа и РНК с использованием другого анализа, тем самым увеличивая время, стоимость и потребление ресурсов. Кроме того, один и тот же образец может также включать дополнительные интересующие аналиты, такие как белок, а для анализа белка также требуется отдельный анализ.

[0030] Библиотеки нуклеиновых кислот используют для определения продуктов генов или для секвенирования полного генома. Можно создавать различные типы библиотек, например библиотеки комплементарной ДНК (кДНК), созданные из библиотек обратно транскрибированной РНК или геномной ДНК (гДНК), в том числе для применения в эпигеномике, например путем анализа доступного для транспозазы хроматина с использованием секвенирования (ATAC-seq) - быстрого и чувствительного способа интегративного эпигеномного анализа. Традиционно эти библиотеки получают отдельно и независимо друг от друга. Библиотеки кДНК могут быть полезными для ряда применений, включая, например, обнаружение новых генов, исследование функции гена, определение экспрессии мРНК, или для определения альтернативного сплайсинга. Библиотеки гДНК можно использовать для ряда отдельных применений, включая, например, определение полного генома организма, изучение функции регуляторных последовательностей или изучение генетических мутаций. Способы, композиции и системы, описанные в настоящем документе, обеспечивают одновременное получение библиотек как кДНК, так и гДНК.

[0031] Один вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой систему и способ анализа множества аналитов в одном образце с использованием одного анализа, причем каждый интересующий аналит анализируют одновременно в одном компартменте, например, как показано на Фиг. 1В. Хотя на Фиг. 1В представлены два аналита в образце, следует понимать, что в образце может присутствовать более двух интересующих аналитов, и каждый интересующий аналит может быть проанализирован одновременно. Описанные в настоящем документе системы, способы и композиции относятся к одновременному анализу множества аналитов в одном образце. Варианты осуществления систем, способов и композиций повышают эффективность анализа за счет уменьшения сложности, стоимости и времени анализа.

[0032] Некоторые варианты осуществления, представленные в настоящем документе, относятся к библиотеке нуклеиновых кислот. В некоторых вариантах осуществления библиотека нуклеиновых кислот содержит библиотеку кДНК, полученную из молекул мРНК и содержащую нуклеиновые кислоты, имеющие первую метку, выполненную с возможностью связывания с субстратом, и последовательность штрихкода, и библиотеку гДНК, полученную из геномной ДНК и содержащую нуклеиновые кислоты, имеющие вторую метку, выполненную с возможностью связывания с субстратом и которая отличается от первой метки. В некоторых вариантах осуществления библиотеку нуклеиновых кислот создают из популяции клеток, одиночной клетки, популяции клеточных ядер или ядра клетки. В некоторых вариантах осуществления первая метка представляет собой метку поли-А. В некоторых вариантах осуществления вторая метка содержит специфичный для транспозазы элемент.

[0033] В некоторых вариантах осуществления способ включает мечение каждого интересующего аналита в образце меткой для индексирования каждого интересующего аналита. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает захват каждого интересующего аналита зондом, комплементарным метке. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает анализ каждого интересующего аналита.

[0034] В некоторых вариантах осуществления способ включает одновременный анализ ДНК и РНК из образца. В некоторых вариантах осуществления способ включает в обеспечение образца, содержащего ДНК и РНК. В некоторых вариантах осуществления РНК содержит первую метку. В некоторых вариантах осуществления способ включает дифференциальное мечение ДНК второй меткой. В некоторых вариантах осуществления способ включает приведение твердой подложки в контакт с образцом, причем твердая подложка содержит первый иммобилизованный зонд для захвата РНК и второй иммобилизованный зонд для захвата меченой ДНК. В некоторых вариантах осуществления способ включает одновременный захват ДНК и РНК на твердой подложке. В некоторых вариантах осуществления способ включает анализ ДНК и РНК.

[0035] В настоящем документе термин «образец» относится к любому образцу, содержащему интересующий аналит. Образец может представлять собой биологический образец, такой как биологический образец, содержащий интересующий аналит, включая, например, цельную кровь, сыворотку, тканевую жидкость, лимфу, спинномозговую жидкость, мокроту, мочу, кал, молоко, пот, слезную жидкость, пуповину, периферическую кровь, костный мозг, клетки или твердую ткань. В некоторых вариантах осуществления образец представляет собой популяцию клеток, клетку, популяцию клеточных ядер или ядро клетки. Образец может быть получен от субъекта, причем у субъекта желательно провести анализ одного или более интересующих аналитов. В настоящем документе термин «субъект» относится к животному, которое является объектом лечения, наблюдения или эксперимента. К «животным» относятся холоднокровные и теплокровные позвоночные и беспозвоночные, такие как рыбы, моллюски, рептилии, и, в частности, млекопитающие. К «млекопитающим» относятся, без ограничений, мыши, крысы, кролики, морские свинки, собаки, кошки, овцы, козы, коровы, лошади, приматы, такие как обезьяны, шимпанзе и человекообразные обезьяны, и, в частности, люди.

[0036] Некоторые варианты осуществления, представленные в настоящем документе, относятся к способу одновременного анализа множества интересующих аналитов в образце, причем интересующий аналит представляет собой одну или более из нуклеиновой кислоты или аминокислоты, такой как ДНК, РНК, белок, любая другая клеточная биомолекула или другая интересующая целевая молекула.

[0037] Образец может представлять собой текучую среду или пробу, полученные из источника в окружающей среде. Например, текучая среда или проба, полученные из источника в окружающей среде, могут быть получены или произведены из пищевых продуктов, продуктов питания, птицы, мяса, рыбы, напитков, молочного продукта, воды (включая сточные воды), прудов, рек, резервуаров, плавательных бассейнов, почв, установок по переработке и/или упаковке пищевых продуктов, сельскохозяйственных участков, гидрокультур (включая фермы по гидропонному выращиванию пищевых продуктов), фармацевтических производственных установок, мест с колониями животных или любых их комбинаций. В некоторых вариантах осуществления образец представляет собой текучую среду или пробу, собранную или полученную из клеточной культуры или колонии микроорганизмов.

[0038] В настоящем документе термины «аналит», «целевой аналит», «интересующий аналит» используются взаимозаменяемо и относятся к аналиту, измеряемому в способах и системах, описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления аналит может представлять собой биомолекулу. Не имеющие ограничительного характера примеры биомолекул включают в себя макромолекулы, такие как полинуклеотид (например, ДНК или РНК), белки, липиды и углеводы. В некоторых случаях аналит может представлять собой гормоны, антитела, факторы роста, цитокины, ферменты, рецепторы (например, нейрональные, гормональные, рецепторы к питательным веществам и рецепторы клеточной поверхности) или их лиганды, маркеры рака (например, ПСА, ФНО-альфа), маркеры инфаркта миокарда (например, тропонин, креатинкиназа и т.п.), токсины, лекарственные средства (например, лекарственные средства, вызывающие зависимость), метаболические агенты (например, включая витамины) и т.п. Не имеющие ограничительного характера варианты осуществления белковых аналитов включают в себя пептиды, полипептиды, фрагменты белка, белковые комплексы, гибридные белки, рекомбинантные белки, фосфопротеины, гликопротеины, липопротеины, белки, меченные олигонуклеотидами, и т.п. Целевой аналит может представлять собой нуклеиновую кислоту.

[0039] К целевым нуклеиновым кислотам может относиться образец, в котором средний размер нуклеиновой кислоты образца менее, более или равен около 2 тыс. п. н., 1 тыс. п. н., 500 п. н., 400 п. н., 200 п. н., 100 п. н., 50 п. н. или находится в диапазоне между любыми двумя из вышеуказанных размеров. В некоторых вариантах осуществления средний размер нуклеиновой кислоты в образце менее, более или равен около 2000 нуклеотидов, 1000 нуклеотидов, 500 нуклеотидов, 400 нуклеотидов, 200 нуклеотидов, 100 нуклеотидов, 50 нуклеотидов или находится в диапазоне из любых двух вышеуказанных размеров.

[0040] В настоящем документе термины «полинуклеотид» и «нуклеиновая кислота» могут использоваться взаимозаменяемо и могут относиться к полимерной форме нуклеотидов любой длины, либо рибонуклеотидов, либо дезоксирибонуклеотидов. Таким образом, эти термины включают одно-, двух- или многоцепочечную ДНК или РНК. Примеры полинуклеотидов включают ген или фрагмент гена, цельную геномную ДНК, геномную ДНК, эпигеном, фрагмент геномной ДНК, экзон, интрон, матричную РНК (мРНК), регуляторную РНК, транспортную РНК, рибосомную РНК, некодирующую РНК (нкРНК), такую как РНК, взаимодействующую с PIWI (пиРНК), малую интерферирующую РНК (миРНК), и длинную некодирующую РНК (длнкРНК), малую шпильку (мшРНК), малую ядерную РНК (мяРНК), микроРНК (мкрРНК), малую ядрышковую РНК (мяшРНК) и вирусную РНК, рибозим, кДНК, рекомбинантный полинуклеотид, разветвленный полинуклеотид, плазмиду, вектор, изолированную ДНК любой последовательности, изолированную РНК любой последовательности, полинуклеотидный зонд, праймер или амплифицированную копию любого из вышеперечисленных. Полинуклеотид может включать в себя модифицированные нуклеотиды, такие как метилированные нуклеотиды и аналоги нуклеотидов, включая нуклеотиды с неприродными основаниями, нуклеотиды с модифицированными природными основаниями, такими как аза- или деазапурины. Полинуклеотид может состоять из определенной последовательности четырех нуклеотидных оснований: аденина (А); цитозина (Ц); гуанина (Г); и тимина (Т). Также может присутствовать урацил (У), например, в качестве естественной замены тимина, если полинуклеотид представляет собой РНК. Урацил также может использоваться в ДНК. Термин «нуклеотидная последовательность» может относиться к буквенному представлению полинуклеотида или любой молекулы нуклеиновой кислоты, включающей природные и неприродные основания.

[0041] Нуклеиновая кислота может содержать фосфодиэфирные связи и может иметь другие типы каркасов, включая, например, фосфорамидные, фосфоротиоатные, фосфородитиоатные, О-метилфосфорамидитные и пептидные каркасы и связи нуклеиновых кислот. Нуклеиновая кислота может содержать любую комбинацию дезоксирибо- и рибонуклеотидов и любую комбинацию оснований, включая урацил, аденин, тимин, цитозин, гуанин, инозин, ксантин, гипоксантин, изоцитозин, изогуанин и аналоги оснований, такие как нитропиррол (включая 3-нитропиррол) и нитроиндол (включая 5-нитроиндол). В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота может включать в себя по меньшей мере одно универсальное основание. Универсальное основание может спариваться с основаниями более чем одного другого типа оснований и может использоваться, например, при включении в олигонуклеотидные праймеры или вставки, которые используют для случайной гибридизации в образцах сложных нуклеиновых кислот, таких как образцы геномной ДНК. Примером универсального основания является инозин, который может спариваться с аденином, тимином или цитозином. К другим примерам относятся гипоксантин, 5-нитроиндол, 5-нитроиндол, 4-нитропиразол, 4-нитроимидазол и 3-нитропиррол. Можно использовать универсальные основания, которые могут спариваться с основаниями по меньшей мере двух, трех, четырех или более типов.

[0042] В настоящем документе термин «одновременный» относится к действию, которое происходит в одно и то же время или по существу в одно и то же время. Таким образом, одновременный анализ множества аналитов означает анализ множества аналитов в одном анализе в одно и то же время или по существу в одно и то же время. Аналогичным образом одновременный сбор или получение секвенируемых элементов относится к сбору или получению секвенируемых элементов в одно и то же время или по существу в одно и то же время.

[0043] В настоящем документе термин «метка» относится к модификации интересующего аналита или аналитов таким образом, чтобы можно было впоследствии выделять, идентифицировать, отслеживать или анализировать интересующий аналит. Таким образом, метка может идентифицировать интересующий аналит в образце. Метка может включать, например, полиаденилированную (поли-А) метку. В некоторых вариантах осуществления метка может включать в себя нуклеотидную последовательность, имеющую длину по меньшей мере 1 нуклеотид, по меньшей мере 2 нуклеотида, по меньшей мере 3 нуклеотида, по меньшей мере 4 нуклеотида, по меньшей мере 5 нуклеотидов, по меньшей мере 10 нуклеотидов, по меньшей мере 15 нуклеотидов, по меньшей мере 20 нуклеотидов, по меньшей мере 25 нуклеотидов, по меньшей мере 30 нуклеотидов, по меньшей мере 35 нуклеотидов, по меньшей мере 40 нуклеотидов, по меньшей мере 45 нуклеотидов, по меньшей мере 50 нуклеотидов или 50 нуклеотидов или более или длину в пределах диапазона между любыми двумя из вышеуказанных длин. В некоторых вариантах осуществления мечение выполняют посредством тагментации. В настоящем документе термин «тагментация» может относиться к вставке транспозонов в целевые нуклеиновые кислоты таким образом, что транспозон расщепляет целевые нуклеиновые кислоты и добавляет адапторные последовательности к концам расщепленных целевых нуклеиновых кислот. Примеры способов тагментации описаны в патентах США №9,115,396; 9,080,211; 9,040,256; в публикации заявки на патент США №2014/0194324, каждая из которых полностью включена в настоящий документ путем ссылки. В некоторых вариантах осуществления метка является одинаковой или разной для каждого интересующего аналита. Например, каждый интересующий аналит может быть помечен одной и той же меткой или может быть помечен отличающейся меткой. Например, «дифференциальное мечение» относится к мечению одного интересующего аналита, например ДНК, таким образом, чтобы это мечение не совпадало с мечением другого интересующего аналита, например РНК, или отличалась от него. В некоторых вариантах осуществления метка отличается для каждого аналита, но взаимосвязь метки заранее известна.

[0044] Технологию на основе транспозонов можно применять для фрагментации ДНК, например, как показано в примере рабочего процесса для наборов подготовки образцов NEXTERA™ XT и FLEX DNA (Illumina, Inc.), в которых целевые нуклеиновые кислоты, такие как геномная ДНК, обрабатывают транспосомными комплексами, которые одновременно фрагментируют и метят (тагментация) мишень, таким образом создавая популяцию фрагментированных молекул нуклеиновой кислоты, меченных уникальными адапторными последовательностями на концах фрагментов.

[0045] Реакция транспозиции представляет собой реакцию, в которой один или более транспозонов вставляются в целевые нуклеиновые кислоты в случайных сайтах или почти случайных сайтах. Компоненты реакции транспозиции включают в себя транспозазу (или другой фермент, способный к фрагментированию и мечению нуклеиновой кислоты, как описано в настоящем документе, такой как интеграза) и транспозонный элемент, который включает в себя двухцепочечную концевую последовательность транспозона, связывающуюся с транспозазой (или другим ферментом, как описано в настоящем документе), и адапторную последовательность, присоединенную к одной из двух концевых последовательностей транспозона. Одна цепь двухцепочечной транспозонной концевой последовательности переносится в одну цепь целевой нуклеиновой кислоты, а комплементарная цепь концевой последовательности транспозона не переносится (непереносимая последовательность транспозона). Адапторная последовательность при необходимости или желании может включать в себя одну или более функциональных последовательностей или компонентов (например, последовательности праймеров, якорные последовательности, универсальные последовательности, спейсерные участки или последовательности индексных меток).

[0046] «Транспосомный комплекс» состоит из по меньшей мере одной транспозазы (или другого фермента, описанного в настоящем документе) и последовательности распознавания транспозона. В некоторых таких системах транспозаза связывается с последовательностью распознавания транспозона с образованием функционального комплекса, который способен катализировать реакцию транспозиции. В некоторых аспектах последовательность распознавания транспозона представляет собой двухцепочечную концевую последовательность транспозона. Транспозаза связывается с сайтом распознавания транспозазы в целевой нуклеиновой кислоте и вставляет последовательность распознавания транспозона в целевую нуклеиновую кислоту. В некоторых таких событиях вставки одна цепь последовательности распознавания транспозона (или концевой последовательности) переносится в целевую нуклеиновую кислоту, в результате чего происходит событие расщепления. Примеры процедур и систем транспозиции, которые можно легко адаптировать к использованию с транспозазами настоящего описания, описаны, например, в публикации РСТ №WO10/048605, патентной публикации США №2012/0301925, патентной публикации США №2012/13470087 или патентной публикации США №2013/0143774, каждая из которых полностью включена в настоящий документ путем ссылки.

[0047] Примеры транспозаз, которые можно использовать с определенными вариантами осуществления, предложенными в настоящем документе, включают в себя (или кодируются): транспозазу Tn5 (см. Reznikoff et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999, 266, 729-734), транспозазу Sleeping Beauty (SB), Vibrio Haryi (транспозаза, охарактеризованная Agilent и используемая в продукте SureSelect QXT), транспозазу MuA и сайт распознавания транспозазы Mu, содержащий концевые последовательности R1 и R2 (Mizuchi, K., Cell, 35: 785, 1983; Savilahti, Η, et al., EMBO J., 14:4893, 1995), Staphylococcus aureus Tn552 (Colegio, O. et al., J. Bacteriol., 183:2384-8, 2001; Kirby, C. et al., Mol. Microbiol., 43:173-86, 2002), Ty1 (Devine & Boeke, Nucleic Acids Res., 22:3765-72, 1994 и публикация PCT No. WO95/23875), Transposon Tn7 (Craig, N.L., Science, 271:1512, 1996; Craig, N.L., Curr. Top. Microbiol. Immunol., 204:27-48, 1996), Tn/O и IS10 (Kleckner N. et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol., 204:49-82, 1996), транспозазу Mariner (Lampe, D.J. et al., EMBO J., 15:5470-9, 1996), Tc1 (Plasterk, R.H., Curr. Top. Microbiol. Immunol., 204:125-43, 1996), Ρ Element (Gloor, G.B., Methods Mol. Biol., 260:97-114, 2004), Tn3 (Ichikawa& Ohtsubo, J. Biol. Chem., 265:18829-32, 1990), бактериальные инсерционные последовательности (Ohtsubo & Sekine, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 204:1-26, 1996), ретровирусы (Brown et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:2525-9, 1989) и ретротранспозон дрожжей (Boeke & Corces, Ann. Rev. Microbiol. 43:403-34, 1989). Дополнительные примеры включают в себя IS5, Τn10, Tn903, IS911 и сконструированные версии ферментов семейства транспозаз (Zhang et al., (2009) PLoS Genet. 5:e1000689. Epub Oct. 16; Wilson C. et al. (2007) J. Microbiol. Methods 71:332-5), причем каждый из источников, процитированных в настоящем документе в отношении транспозазы, полностью включен в настоящий документ путем ссылки. Способы, описанные в настоящем документе, также могут включать комбинации транспозаз, а не только одну транспозазу.

[0048] В некоторых вариантах осуществления транспозаза представляет собой транспозазу Tn5, MuA или транспозазу Vibrio Haryi либо их активный мутант. В других вариантах осуществления транспозаза представляет собой транспозазу Tn5 или ее активный мутант. В некоторых вариантах осуществления транспозаза Tn5 представляет собой гиперактивную транспозазу Tn5 (см., например, Reznikoff et al., публикация PCT №WO2001/009363, патенты США №5,925,545, 5,965,443, 7,083,980 и 7,608,434 и Goryshin и Reznikoff, J. Biol. Chem. 273:7367, 1998) или ее активный мутант. В некоторых аспектах транспозаза Tn5 представляет собой транспозазу Tn5, как описано в публикации PCT №WO2015/160895, которая включена в настоящий документ путем ссылки. В некоторых вариантах осуществления транспозаза Tn5 представляет собой гибридный белок. В некоторых вариантах осуществления гибридный белок транспозаза Tn5 содержит слитую метку - фактор элонгации Ts (Tsf). В некоторых вариантах осуществления транспозаза Tn5 представляет собой гиперактивную транспозазу Tn5, содержащую мутации по аминокислотам 54, 56 и 372 относительно последовательности дикого типа. В некоторых вариантах осуществления гиперактивная транспозаза Tn5 представляет собой гибридный белок, причем необязательно слитый белок представляет собой фактор элонгации Ts (Tsf). В некоторых вариантах осуществления сайт распознавания представляет собой сайт распознавания транспозазы типа Tn5 (Goryshin и Reznikoff, J. Biol. Chem., 273:7367, 1998). В одном варианте осуществления используют сайт распознавания транспозазы, образующий комплекс с гиперактивной транспозазой Tn5 (например, транспозазой EZ-Tn5™, Epicentre Biotechnologies, г. Мэдисон, штат Висконсин, США). В некоторых вариантах осуществления транспозаза Tn5 представляет собой транспозазу Tn5 дикого типа.

[0049] В любом из вариантов осуществления способов, композиций или систем, описанных в настоящем документе, транспозон включает в себя концевую последовательность транспозона. В некоторых вариантах осуществления концевая последовательность транспозона представляет собой мозаичную концевую (ME) последовательность. В некоторых вариантах осуществления ДНК помечена с использованием тагментации, причем ДНК помечена меткой и в метку включена транспозон-специфичная последовательность, такая как МЕ-последовательность. Таким образом, ДНК в образце дифференцируется от РНК на основе транспозон-специфичной последовательности.

[0050] В любом из вариантов осуществления способов, композиций или систем, описанных в настоящем документе, транспозон включает в себя адапторную последовательность. Адапторные последовательности могут содержать одну или более функциональных последовательностей или компонентов, выбранных из группы, состоящей из последовательностей праймеров, якорных последовательностей, универсальных последовательностей, спейсерных областей, индексных последовательностей, последовательностей захвата, штрихкод-последовательностей, последовательностей расщепления, последовательностей, связанных с секвенированием, и их комбинаций. В некоторых вариантах осуществления адапторная последовательность содержит последовательность праймера. В других вариантах осуществления адапторная последовательность содержит последовательность праймера и индексную последовательность или штрихкод-последовательность. Последовательность праймера также может представлять собой универсальную последовательность. Настоящее описание не ограничено типом адапторных последовательностей, которые могут быть использованы, и специалисту в данной области будут понятны дополнительные последовательности, которые можно использовать для получения библиотеки и секвенирования следующего поколения. Универсальная последовательность представляет собой область нуклеотидной последовательности, которая является общей для двух или более фрагментов нуклеиновых кислот. Необязательно два или более фрагмента нуклеиновых кислот также имеют области с различиями в последовательности. Универсальная последовательность, которая может присутствовать в разных из множества фрагментов нуклеиновых кислот, может обеспечивать репликацию или амплификацию множества разных последовательностей с использованием одного универсального праймера, комплементарного универсальной последовательности.

[0051] Адаптеры включают в себя нуклеиновые кислоты, такие как одноцепочечные нуклеиновые кислоты. Адаптеры могут включать в себя короткие нуклеиновые кислоты, имеющие длину менее, более или равную около 5 нуклеотидов, 10 нуклеотидов, 20 нуклеотидов, 30 нуклеотидов, 40 нуклеотидов, 50 нуклеотидов, 60 нуклеотидов, 70 нуклеотидов, 80 нуклеотидов, 90 нуклеотидов, 100 нуклеотидов или находящуюся в диапазоне между любыми двумя из вышеуказанных размеров.

[0052] В любом из вариантов осуществления адапторная последовательность или концевые последовательности транспозона, включая А14-МЕ, ME, В15-МЕ, ME', А14, В15 и ME, представлены ниже:

[0053] В некоторые варианты осуществления включены последовательности праймеров для получения библиотек для секвенирования. В некоторых вариантах осуществления последовательность праймера представляет собой последовательность праймера Р5 или последовательность праймера Р7. Праймеры Р5 и Р7 используют на поверхности коммерческих проточных кювет, поставляемых компанией Illumina, Inc., для секвенирования на различных платформах Illumina. В патентной публикации США №2011/0059865 А1 описаны последовательности праймеров, которые полностью включены в настоящий документ путем ссылки. К примерам праймеров Р5 и Ρ7, которые могут иметь алкиновую концевую группу на 5'-конце, относятся следующие:

и их производные или аналоги. В некоторых примерах последовательность Р7 включает в себя модифицированный гуанин в положении G*, например 8-оксогуанин. В других примерах символ * указывает на то, что связь между G* и смежным 3' А представляет собой фосфоротиоатную связь. В некоторых примерах праймеры Р5 и/или Р7 включают в себя неприродные линкеры. Необязательно один или оба из праймеров Р5 и Р7 могут включать в себя хвост поли-Т. Хвост поли-Т по существу расположен на 5'-конце указанной выше последовательности, например, между 5'-основанием и концевым алкиновым звеном, но в некоторых случаях может быть расположен на 3'-конце. Последовательность поли-Т может включать в себя любое число Т-нуклеотидов, например от 2 до 20. Хотя в качестве примеров приведены праймеры Ρ5 и Р7, следует понимать, что в примерах, представленных в настоящем документе, можно использовать любые подходящие праймеры. Индексные последовательности, содержащие последовательности праймеров, включая последовательности праймеров Р5 и Р7, служат для добавления Р5 и Р7 в целях активации библиотеки для секвенирования.

[0054] В настоящем документе термин «зонд» относится к молекуле захвата, обладающей достаточными свойствами связывания для специфического связывания с целевым аналитом, например с меткой на целевом аналите. Например, зонд может включать в себя полинуклеотид, обладающий достаточной комплементарностью для специфической гибридизации с целевой нуклеиновой кислотой. Например, зонд может включать последовательность поли-Т для специфического связывания с меткой поли-А. В другом примере зонд содержит антитело или белковую метку. Зонд захвата может функционировать как аффинно-связывающая молекула для отделения целевой нуклеиновой кислоты от других нуклеиновых кислот и/или компонентов в смеси. Целевая нуклеиновая кислота также может быть специфически связана зондом захвата через промежуточные молекулы, такие как линкеры, адаптеры и другие мостиковые нуклеиновые кислоты, имеющие достаточную комплементарность, чтобы специфически гибридизироваться как с целевой последовательностью, так и с зондом захвата.

[0055] В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает штрихкод. Штрихкод идентифицирует мишень как получаемую из определенного образца. Например, штрихкод используют для идентификации одного или более аналитов как получаемых из общего источника. Штрихкод, идентифицирующий один аналит, может быть таким же, как штрихкод, идентифицирующий другой аналит, либо отличаться от него. При условии, что взаимосвязь между штрихкодами известна, штрихкоды можно использовать для идентификации аналитов как получаемые из общего источника.

[0056] В некоторых вариантах осуществления штрихкод может включать в себя нуклеотидную последовательность, которую можно использовать для идентификации полинуклеотида в матрице. Штрихкод может включать в себя уникальную нуклеотидную последовательность, которая отличима от других штрихкодов. Она также может быть отличима от других нуклеотидных последовательностей в полинуклеотидах и целевых нуклеиновых кислотах по последовательности штрихкода, а также по положению штрихкода в полинуклеотиде, например по его положению на 5' сайта связывания праймера. Например, в некоторых вариантах осуществления последовательность штрихкода может присутствовать более одного раза во множестве нуклеиновых кислот; однако можно обнаружить штрихкод, размещенный в направлении 5' от сайта связывания праймера. Штрихкод может иметь любую желаемую длину последовательности, достаточную для обеспечения уникальной нуклеотидной последовательности в пределах множества штрихкодов в популяции и/или в пределах множества анализируемых или исследуемых полинуклеотидов и целевых нуклеиновых кислот. В некоторых вариантах осуществления штрихкод представляет собой нуклеиновую кислоту или область внутри полинуклеотида в диапазоне от около 1 до 30 нуклеотидов или более. Например, штрихкод может иметь длину 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов или более. В некоторых вариантах осуществления штрихкод может составлять 35, 40, 45 или 50 нуклеотидов или более. В некоторых вариантах осуществления штрихкод может отличать полинуклеотид от другого полинуклеотида в матрице, так что каждый штрихкод отличается от другого штрихкода. В некоторых вариантах осуществления штрихкод может отличать популяцию полинуклеотидов от другой популяции полинуклеотидов в матрице так, что набор штрихкода отличается от другого набора штрихкодов.

[0057] В некоторых вариантах осуществления штрихкод непосредственно вводят с использованием транспозиции. В таких вариантах осуществления нет необходимости в событии связывания с твердой подложкой. Таким образом, в любом из вариантов осуществления, представленных в настоящем документе, интересующие аналиты одновременно анализируют с твердой подложкой или без нее.

[0058] В некоторых вариантах осуществления зонд можно иммобилизовать на твердой подложке. Твердая подложка может включать, например, протравленную поверхность, лунку, покрытую лунку, матрицу, устройство проточной кюветы, микрожидкостный канал, гранулу, магнитную гранулу, колонку, каплю или микрочастицу. В таких вариантах осуществления интересующий аналит связывается иммобилизованным зондом с твердой подложкой, причем интересующий аналит подвергается дальнейшей обработке или анализу на твердой подложке. В некоторых вариантах осуществления иммобилизованный зонд и твердую подложку используют в растворе. Например, иммобилизованная подложка может представлять собой гранулу, а зонд, присоединенный к грануле, растворим в растворе для захвата интересующего аналита, такого как ДНК и РНК, в растворе. В таких вариантах осуществления меченный аналит, представляющий интерес, связывается с зондом в растворе, и меченный аналит, представляющий интерес, маркируют штрихкодом в растворе. Маркированный штрихкодом интересующий аналит, можно подвергать дополнительной обработке или анализу в растворе или может быть извлечен с использованием извлекающего анализа, в том числе с использованием магнитных гранул.

[0059] В настоящем документе термин «проточная кювета» относится к камере, содержащей твердую поверхность, через которую могут протекать один или более жидких реагентов. Примеры проточных кювет и подобных жидкостных систем и платформ обнаружения, которые можно легко использовать в способах настоящего описания, включают в себя, например, микрожидкостные устройства, микроструктуры, микролунки, микропланшеты и т.п., которые описаны, например, в Bentley et al., Nature 456:53-59 (2008), WO 04/018497; патенте США №7,057,026; WO 91/06678; WO 07/123744; патенте США №7,329,492; патенте США №7,211,414; патенте США №7,315,019; патенте США №7,405,281 и US 2008/0108082; каждый из которых включен в настоящий документ путем ссылки.

[0060] В настоящем документе термин «матрица» может относиться к популяции различных микроэлементов, таких как микроэлементы, содержащие полинуклеотиды, которые связаны или прикреплены к поверхности таким образом, что разные микроэлементы можно отличать друг от друга в соответствии с относительным местоположением. Отдельный элемент матрицы может включать в себя одну копию микроэлемента, или же может присутствовать множество копий микроэлемента в виде популяции микроэлементов в отдельном элементе матрицы. Популяция микроэлементов в каждом элементе, как правило, является гомогенной и имеет один вид микроэлементов. Таким образом, на элементе может присутствовать множество копий одной нуклеотидной последовательности, например множество молекул нуклеиновых кислот, имеющих одинаковую последовательность.

[0061] В некоторых вариантах осуществления на элементе может присутствовать гетерогенная популяция микроэлементов. В некоторых вариантах осуществления элемент может включать в себя только один вид микроэлементов. В некоторых вариантах осуществления элемент может включать в себя множество разных видов микроэлементов, таких как смесь нуклеиновых кислот, имеющих разные последовательности. Соседние элементы матрицы могут быть отделены друг от друга. Элементы могут быть расположены рядом друг с другом или разделены зазором. В вариантах осуществления, в которых элементы разнесены друг от друга, соседние участки могут быть разнесены, например, на расстояние менее 100 мкм, 50 мкм, 10 мкм, 5 мкм, 1 мкм, 0,5 мкм, 100 нм, 50 нм, 10 нм, 5 нм, 1 нм, 0,5 нм или любое расстояние в пределах диапазона из любых двух из вышеперечисленных расстояний. Расположение элементов на матрице также можно понимать с точки зрения межцентровых расстояний между соседними элементами. Матрица, используемая в изобретении, может иметь соседние элементы с межцентровым расстоянием менее около 100 мкм, 50 мкм, 10 мкм, 5 мкм, 1 мкм, 0,5 мкм, 100 нм, 50 нм, 10 нм, 5 нм, 1 нм, 0,5 нм или любым расстоянием в пределах диапазона из любых двух из вышеперечисленных расстояний. В некоторых вариантах осуществления значения расстояний, описанные в настоящем документе, могут представлять собой среднее расстояние между соседними элементами матрицы. Таким образом, не все соседние элементы должны находиться в указанном диапазоне, если иное не указано конкретно, например посредством конкретного утверждения о том, что расстояние представляет собой пороговое расстояние между всеми соседними элементами матрицы. Варианты осуществления могут включать в себя матрицы, имеющие элементы с различными плотностями. Примеры диапазонов плотностей для определенных вариантов осуществления включают в себя от около 10 000 000 элементов/см² до около 2 000 000 000 элементов/см²; от около 100 000 000 элементов/см² до около 1 000 000 000 элементов/см²; от около 100 000 элементов/см² до около 10 000 000 элементов/см²; от около 1 000 000 элементов/см² до около 5 000 000 элементов/см²; от около 10 000 элементов/см² до около 100 000 элементов/см²; от около 20 000 элементов/см² до около 50 000 элементов/см²; от около 1 000 элементов/см² до около 5 000 элементов/см², или любую плотность в пределах диапазона любых двух из вышеуказанных плотностей.

[0062] В настоящем документе термин «поверхность» может относиться к части субстрата или структуры подложки, которая доступна для контакта с реагентами, гранулами или аналитами. Поверхность может быть по существу ровной или плоской. Альтернативно поверхность может иметь закругленную или контурную форму. Примерами контуров, которые можно использовать на поверхности, являются лунки, выемки, столбики, ребра, каналы или т.п. Примеры материалов, которые можно использовать в качестве субстрата или структуры подложки, включают в себя стекло, такое как модифицированное или функционализированное стекло; пластик, такой как акрил, полистирол или сополимер стирола и другого материала, полипропилен, полиэтилен, полибутилен, полиуретан или TEFLON; полисахариды или поперечносшитые полисахариды, такие как агароза или сефароза; нейлон; нитроцеллюлозу; смолу; кремнезем или материалы на основе кремнезема, включая кремний и модифицированный кремний; углеродное волокно; металл; неорганическое стекло; пучок оптических волокон или различные другие полимеры. Поверхность, пригодная для использования в рамках изобретения, может быть изготовлена из одного материала или смеси нескольких различных материалов. В некоторых вариантах осуществления поверхность содержит лунки.

[0063] В настоящем документе термин «гранула» может относиться к небольшому телу, изготовленному из жесткого или полужесткого материала. Тело может иметь форму, описываемую, например, как сфера, овал, микросфера, или иную принятую форму частиц с симметричными или несимметричными размерами. Примеры материалов, подходящих для гранул, включают в себя стекло, такое как модифицированное или функционализированное стекло; пластик, такой как акрил, полистирол или сополимер стирола и другого материала, полипропилен, полиэтилен, полибутилен, полиуретан или TEFLON; полисахариды или поперечносшитые полисахариды, такие как агароза или сефароза; нейлон; нитроцеллюлозу; смолу; кремнезем или материалы на основе кремнезема, включая кремний и модифицированный кремний; углеродное волокно; металл; неорганическое стекло; пучок оптических волокон или различные другие полимеры. Примеры гранул включают в себя стеклянные гранулы с контролируемыми порами, парамагнитные гранулы, золь двуокиси тория, гранулы сефарозы, нанокристаллы и другие известные в данной области гранулы. Гранулы могут быть изготовлены из биологических или небиологических материалов. Магнитные гранулы особенно подходят для использования из-за простоты манипуляций с магнитными гранулами с помощью магнитов. Гранулы, используемые в определенных вариантах осуществления, могут иметь диаметр, ширину или длину от 0,1 мкм до 100 мкм. Размер гранул можно выбирать таким образом, чтобы она имела уменьшенный размер и, следовательно, повышенную плотность, сохраняя при этом достаточный сигнал для анализа элементов.

[0064] В настоящем документе термин «гибридизация», «гибридизировать» или их грамматический эквивалент может относиться к реакции, в которой один или более полинуклеотидов взаимодействуют с образованием комплекса, который по меньшей мере частично образован посредством водородных связей между основаниями нуклеотидных остатков. Водородные связи могут возникать посредством спаривания оснований по Уотсону-Крику, связывания по Хугстину или любым другим специфичным для последовательности способом. Комплекс может иметь две цепочки, образующие дуплексную структуру, три или более цепочки, образующие многоцепочечный комплекс, одну самогибридизующуюся цепь или любую их комбинацию. Кроме водородного связывания цепочки также могут быть поперечно-сшитыми или соединены иными силами.

[0065] В настоящем документе термины «удлиняющий», «удлинение» или их любые грамматические эквиваленты могут относиться к добавлению дНТФ к праймеру, полинуклеотиду или другой молекуле нуклеиновой кислоты ферментом-удлинителем, таким как полимераза. Например, в некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, полученный удлиненный праймер включает в себя информацию о последовательности нуклеиновой кислоты. Хотя в некоторых вариантах осуществления описано выполнение удлинения с использованием полимеразы, такой как ДНК-полимераза или обратная транскриптаза, удлинение может быть выполнено любым другим способом, хорошо известным в данной области. Например, удлинение можно выполнять путем лигирования олигонуклеотидов друг с другом, например олигонуклеотидов, которые гибридизировались с интересующей цепью.

[0066] В настоящем документе термины «лигирование», «лигировать» или другие их грамматические эквиваленты могут относиться к соединению двух нуклеотидных цепей фосфодиэфирной связью. Лигирование может включать в себя химическое лигирование. Такая реакция может быть катализирована лигазой. Термин «лигаза» относится к классу ферментов, которые катализируют эту реакцию с гидролизом АТФ или аналогичного трифосфата.

[0067] Некоторые варианты осуществления, представленные в настоящем документе, относятся к одновременному анализу множества аналитов в образце с использованием одного анализа, причем множество аналитов включает в себя ДНК и РНК. В некоторых вариантах осуществления целевую ДНК и целевую РНК модифицируют путем мечения. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления способ включает модификацию ДНК в образце с помощью первой метки и модификацию РНК в образце с помощью второй метки. В некоторых вариантах осуществления способ включает захват модифицированной ДНК первым зондом, комплементарным первой метке, и захват модифицированной РНК вторым зондом, комплементарным второй метке. В некоторых вариантах осуществления способ включает анализ захваченных ДНК и РНК. В настоящем документе термины «первая метка» и «вторая метка» не относятся к какому-либо конкретному моменту времени или последовательности событий мечения. Напротив, термины просто используют для определения того, что первый аналит включает одну метку, называемую, например, первой меткой, и что второй аналит включает другую метку, называемую, например, второй меткой. В любом из вариантов осуществления, описанных в настоящем документе, первая и вторая метки могут быть одинаковыми или разными. Тогда как штрихкод идентифицирует аналиты как получаемые из общего источника, метка идентифицирует аналит как принадлежащий определенному типу, например ДНК или РНК.

[0068] В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает в себя одновременный анализ дополнительного интересующего аналита, кроме ДНК и РНК, например анализ белка. В таких вариантах осуществления дополнительный интересующий аналит, такой как белок, модифицируют с помощью дополнительной метки.

[0069] В некоторых вариантах осуществления первая и вторая метки (или дополнительные метки, если применимо) являются разными. В некоторых вариантах осуществления первая и вторая метки (или дополнительные метки, если применимо) являются одинаковыми. В некоторых вариантах осуществления первая и вторая метки дополнительно содержат последовательность распознавания субстрата. Последовательность распознавания субстрата представляет собой последовательность, которая распознает субстрат и связывается с ним, тем самым иммобилизуя метку. В некоторых вариантах осуществления последовательность распознавания субстрата первой метки такая же, как последовательность распознавания субстрата второй метки.

[0070] В некоторых вариантах осуществления ДНК помечена посредством процесса тагментации, как показано на Фиг. 2. В варианте осуществления, представленном на Фиг. 2, показан луночный планшет 10, содержащий выделенную одиночную клетку или ядро 15. Ядро 15 содержит ДНК 20 и мРНК 25 внутри ядра 15. Одиночная клетка или ядро 15 могут быть инкапсулированы в капле или отделены в индивидуальных лунках для анализа. Показано, что ДНК 20 помечена меткой TAG1, которая может быть получена посредством тагментации или другого процесса мечения, такого как обратная транскрипция, лигирование или другие способы мечения ДНК. В варианте осуществления, представленном на Фиг. 2, мРНК 25 помечена меткой TAG2. На Фиг. 2 также показаны зонды 30, 35, иммобилизованные на твердой подложке 40, которая может представлять собой гранулу или другую поверхность. Зонд 30, специфичный к ДНК 20, включает в себя захватывающий элемент метки TAG1, который представляет собой захватывающий элемент, специфически связывающийся с меткой TAG1 на ДНК 20. Зонд 35, специфичный к мРНК 25, включает в себя захватывающий элемент метки TAG2, который представляет собой захватывающий элемент, специфически связывающийся с меткой TAG2 на мРНК 25. Каждый зонд также включает в себя штрихкод, что позволяет индексировать интересующие аналиты, в данном случае ДНК и мРНК.

[0071] В некоторых вариантах осуществления мРНК, которая содержит хвост поли-А, не имеет метки. Например, в варианте осуществления, показанном на Фиг. 3, луночный планшет 200 содержит ядра 205, которые включают мРНК 210, имеющую хвост 215 поли-А, но не содержащую иных меток. В варианте осуществления, представленном на Фиг. 3, гДНК 220 помечена хвостом 215 поли-А. После мечения гДНК 220 как гДНК 220, так и мРНК 210 включают в себя хвост 215 поли-А. гДНК 220 может быть помечена хвостом 215 поли-А с помощью, например, тагментации. Как показано на Фиг. 3, гДНК 220, имеющая хвост 215 поли-А, и мРНК 210, также имеющая хвост 215 поли-А, могут быть захвачены одним и тем же зондом 225, содержащим захватывающий элемент 230 поли-Т. Зонд 225 иммобилизован на твердой подложке 240. Таким образом, гДНК 220 и мРНК 210 обрабатывают одновременно и присваивают им одни и те же штрихкоды 235. гДНК 220 можно отличать от мРНК 210 на основе транспозон-специфичной последовательности, которая была встроена в процессе тагментации. Эта концепция будет дополнительно разъяснена со ссылкой на Фиг. 4.

[0072] На Фиг. 4 представлен пример способа одновременного анализа как гДНК, так и мРНК в одном образце. В данном варианте осуществления транспозон поли-А вводят в геномную ДНК путем транспозиции. Ядра/клетку инкапсулируют при помощи индексированного зонда, имеющего хвост поли-Т. Индексированный зонд гибридизируют, а затем лигируют с транспонированным фрагментом гДНК и гибридизируют с мРНК. Это позволяет получить первую кДНК. После транспозиции гДНК включает в себя последовательность ME - последовательность, специфичную для тагментации. После синтеза второй кДНК двухцепочечную кДНК и гДНК снова транспонируют для встраивания адаптера ПЦР. Затем получают фрагменты для ПЦР-амплификации.

[0073] В настоящем документе термин «реагент» описывает агент или смесь из двух или более агентов, используемых для реакции с образцом, взаимодействия с образцом, разведения образца или добавления к образцу, и может включать в себя агенты, используемые в анализах, описанных в настоящем документе, включая агенты для лизиса, анализа нуклеиновых кислот, реакций амплификации нуклеиновых кислот, анализа белков, реакций тагментации, реакций АТАС seq, CPT-seq или SCI-seq или других анализов. Таким образом, реагенты могут включать в себя, например, буферы, химические вещества, ферменты, полимеразу, праймеры, имеющие размер менее 50 пар нуклеотидов, матричные нуклеиновые кислоты, нуклеотиды, метки, красители или нуклеазы. В некоторых вариантах осуществления реагент включает в себя лизоцим, протеиназу K, случайные гексамеры, полимеразу (например, ДНК-полимеразу Ф29, полимеразу Taq, полимеразу Bsu), транспозазу (например, Tn5), праймеры (например, адапторные последовательности Р5 и Р7), лигазу, катализирующий фермент, дезоксинуклеотидтрифосфаты, буферы или двухвалентные катионы.

[0074] В некоторых вариантах осуществления образец включает в себя одиночную клетку, и одиночную клетку фиксируют. В некоторых вариантах осуществления клетки можно фиксировать с помощью фиксатора. В настоящем документе термин «фиксатор» по существу относится к агенту, способному фиксировать клетки. Например, фиксированные клетки могут стабилизировать белковые комплексы, комплексы нуклеиновых кислот или комплексы белок-нуклеиновая кислота в клетке. Подходящие фиксаторы и поперечносшивающие агенты могут включать в себя фиксаторы на основе спирта или альдегида, формальдегид, глутаральдегид, фиксаторы на основе этанола, фиксаторы на основе метанола, ацетон, уксусную кислоту, тетраоксид осмия, дихромат калия, хромовую кислоту, перманганат калия, соединения ртути, пикраты, формалин, параформальдегид, поперечносшивающие агенты на основе реакционноспособных аминов сложных эфиров N-гидроксисукцинимида (NHS), такие как бис[сульфосукцинимидил] суберат (BS3), 3,3'-дитиобис[сульфосукцинимидилпропионат] (DTSSP), этиленгликольбис[сульфосукцинимидилсукцинат] (сульфо-EGS), дисукцинимидилглутарат (DSG), дитиобис[сукцинимидилпропионат] (DSP), дисукцинимидилсуберат (DSS), этиленгликольбис[сукцинимидилсукцинат] (EGS), NHS-эфир/диазирин сшивающие агенты, такие как NHS-диазирин, NHS-LC-диазирин, NHS-SS-диазирин, сульфо-NHS-диазирин, сульфо-NHS-LC-диазирин и сульфо-NHS-SS-диазирин. В некоторых вариантах осуществления фиксация клетки сохраняет внутреннее состояние клетки, тем самым предотвращая модификацию клетки в процессе последующего исследования или в ходе проведения анализа.

[0075] В некоторых вариантах осуществления образец включает в себя источник нуклеиновой кислоты, такой как одиночная клетка, одиночное ядро или популяция клеток или популяция ядер, и одиночную клетку, одиночное ядро, популяцию клеток или популяцию ядер инкапсулируют в капле. В некоторых вариантах осуществления клетку фиксируют перед инкапсуляцией. В контексте настоящего документа капля может включать в себя гидрогелевую гранулу, которая представляет собой гранулу для инкапсуляции одиночной клетки, и состоит из гидрогелевой композиции. В некоторых вариантах осуществления капля представляет собой гомогенную каплю гидрогелевого материала или является полой каплей, имеющей оболочку из полимерного гидрогеля. Капля, однородная или полая, может быть выполнена с возможностью инкапсуляции одиночной клетки. Используемый в настоящем документе термин «гидрогель» относится к веществу, получающемуся при образовании поперечной сшивки органического полимера (природного или синтетического) посредством ковалентной, ионной или водородной связей, создающей трехмерную структуру открытой решетки, которая захватывает молекулы воды с образованием геля. В некоторых вариантах осуществления гидрогель может представлять собой биосовместимый гидрогель. Используемый в настоящем документе термин «биосовместимый гидрогель» относится к полимеру, образующему гель, который не является токсичным для живых клеток и обеспечивает достаточную диффузию кислорода и питательных веществ в захваченные клетки для поддержания их жизнеспособности. В некоторых вариантах осуществления гидрогелевый материал включает в себя альгинат, акриламид или полиэтиленгликоль (PEG), PEG-акрилат, PEG-амин, PEG-карбоксилат, PEG-дитиол, PEG-эпоксид, PEG-изоцианат, PEG-малеимид, полиакриловую кислоту (РАА), поли(метилметакрилат) (РММА), полистирол (PS), полистиролсульфонат (PSS), поливинилпирролидон (PVPON), N,N'-бис(акрилоил)цистамин, полипропиленоксид (РРО), поли(гидроксиэтилметакрилат) (РНЕМА), поли(N-изопропилакриламид) (PNIPAAm), поли(молочную) кислоту (PLA), сополимер поли(молочной) и поли(гликолевой) кислот (PLGA), поликапролактон (PCL), поли(винилсульфоновую) кислоту (PVSA), поли(L-аспарагиновую) кислоту, поли(L-глутаминовую) кислоту, полилизин, агар, агарозу, гепарин, альгината сульфат, декстрана сульфат, гиалуронан, пектин, каррагинан, желатин, хитозан, целлюлозу, коллаген, бисакриламид, диакрилат, диаллиламин, триаллиламин, дивинилсульфон, диаллиловый эфир диэтиленгликоля, диакрилат этиленгликоля, диакрилат полиэтиленгликоля, диакрилат полиэтиленгликоля, триметилопропантриметакрилат, этоксилированный триметилолтриакрилат или этоксилированный пентаэритритолтетракрилат или их комбинации или смеси. В некоторых вариантах осуществления гидрогель представляет собой альгинат, акриламид или материал на основе PEG. В некоторых вариантах осуществления гидрогель представляет собой материал на основе PEG с химическими реакциями акрилат-дитиола и эпоксида-амина. В некоторых вариантах осуществления гидрогель образует полимерную оболочку, которая включает в себя PEG-малеимид/дитиоловое масло, PEG-эпоксидное/аминное масло, PEG-эпоксид/PEG-амин или PEG-дитиол/PEG-акрилат. В некоторых вариантах осуществления гидрогелевый материал выбирают таким образом, чтобы избежать образования свободных радикалов, способных повреждать внутриклеточные биомолекулы. В некоторых вариантах осуществления гидрогелевый полимер включает в себя 60-90% жидкости, такой как вода, и 10-30% полимера. В некоторых вариантах осуществления содержание воды в гидрогеле составляет около 70-80%. Используемый в настоящем документе термин «около» или «приблизительно» при модификации численного значения относится к вариациям, которые могут возникать в численном значении. Например, вариации могут возникать из-за различий при производстве конкретной подложки или компонента. В одном варианте осуществления термин «около» означает значение в пределах 1%, 5% или до 10% от указанного числового значения.

[0076] Гидрогели можно получать с помощью поперечного сшивания гидрофильных биополимеров или синтетических полимеров. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления гидрогель может включать в себя поперечносшивающий агент. Используемый в настоящем документе термин «поперечносшивающий агент» относится к молекуле, которая может образовывать трехмерную сетку при реакции с соответствующими каркасными мономерами. К примерам гидрогелевых полимеров, которые могут включать в себя один или более поперечносшивающих агентов, относятся, без ограничений, гиалуронаны, хитозаны, агар, гепарин, сульфат, целлюлозу, альгинаты (включая сульфат альгината), коллаген, декстраны (включая декстрана сульфат), пектин, каррагинан, полилизин, желатины (включая желатин типа А), агарозу, (мет)акрилат-олиголактид-РЕО-олиголактид-(мет)акрилат, сополимеры РЕО-РРО-РЕО (Pluronics), поли(фосфазен), поли(метакрилаты), поли(N-винилпирролидон), сополимеры PL(G)A-PEO-PL(G)A, поли(этиленимин), полиэтиленгликоль (PEG)-тиол, PEG-акрилат, акриламид, Ν,Ν'-бис(акрилоил)цистамин, PEG, полипропиленоксид (РРО), полиакриловую кислоту, поли(гидроксиэтилметакрилат) (РНЕМА), поли(метилметакрилат) (РММА), поли(N-изопропилакриламид) (PNIPAAm), поли(молочную) кислоту (PLA), сополимер поли(молочной) и поли(гликолевой) кислот (PLGA), поликапролактон (PCL), поли(винилсульфоновую) кислоту (PVSA), поли(L-аспарагиновую) кислоту, поли(L-глутаминовую) кислоту, бисакриламид, диакрилат, диаллиламин, триаллиламин, дивинилсульфон, диаллиловый эфир диэтиленгликоля, диакрилат этиленгликоля, диакрилат полиметиленгликоля, диакрилат полиэтиленгликоля, триметилопропантриметакрилат, этоксилированный триметилолтриакрилат или этоксилированный пентаэритритолтетракрилат или их комбинации. Таким образом, например, комбинация может включать в себя полимер и поперечносшивающий агент, например полиэтиленгликоль (PEG)-тиол/PEG-акрилат, акриламид/Ν,Ν'-бис(акрилоил)цистамин (ВАСу) или PEG/полипропиленоксид (РРО). В некоторых вариантах осуществления полимерная оболочка включает в себя четырехдоменный полиэтиленгликоль (PEG). В некоторых вариантах осуществления четырехдоменный полиэтиленгликоль (PEG) выбран из группы, состоящей из PEG-акрилата, PEG-амина, PEG-карбоксилата, PEG-дитиола, PEG-эпоксида, PEG-изоцианата и PEG-малеимида.

[0077] В некоторых вариантах осуществления поперечносшивающий агент представляет собой мгновенный поперечносшивающий агент или медленный поперечносшивающий агент. Мгновенный поперечносшивающий агент представляет собой поперечносшивающий агент, который мгновенно сшивает гидрогелевый полимер и в настоящем документе называется клик-химией. Мгновенные поперечносшивающие агенты могут включать в себя дитиоловое масло + PEG-малеимид или PEG-эпоксид + аминное масло. Медленный поперечносшивающий агент представляет собой поперечносшивающий агент, который медленно сшивает гидрогелевый полимер и может включать в себя PEG-эпоксид + PEG-амин или PEG-дитиол + PEG-акрилат.Для поперечного сшивания медленным поперечносшивающим агентом может потребоваться более нескольких часов, например для поперечного сшивания может потребоваться более 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 часов. В некоторых вариантах осуществления, представленных в настоящем документе, капли получают с помощью мгновенного поперечносшивающего агента, что позволяет лучше сохранить состояние клетки по сравнению с медленным поперечносшивающим агентом. Без ограничений, накладываемых какой-либо теорией, клетки могут подвергаться физиологическим изменениям посредством внутриклеточных сигнальных механизмов в течение более длительного времени поперечного сшивания.

[0078] В некоторых вариантах осуществления поперечносшивающий агент образует дисульфидную связь в гидрогелевом полимере, таким образом связывая гидрогелевые полимеры. В некоторых вариантах осуществления гидрогелевые полимеры образуют гидрогелевую матрицу, имеющую поры (например, пористую гидрогелевую матрицу). Эти поры способны удерживать в капле достаточно крупные частицы, например, одиночную клетку или экстрагированные из нее нуклеиновые кислоты, но позволяют другим материалам, таким как реагенты, проходить через поры, таким образом перемещаясь внутрь полимерных гранул и наружу из них. В некоторых вариантах осуществления размер пор капель точно регулируют, меняя соотношения концентрации полимера и концентрации поперечносшивающего агента. В некоторых вариантах осуществления соотношение полимера и поперечносшивающего агента составляет 30:1, 25:1, 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:15, 1:20 или 1:30, или соотношение находится в диапазоне, определяемом любыми двумя из вышеупомянутых соотношений. В некоторых вариантах осуществления к полимерной матрице могут прививаться дополнительные функциональные группы, такие как праймер ДНК или заряженные химические группы, чтобы удовлетворять требованиям к различным вариантам применения.

[0079] Используемый в настоящем документе термин «пористость» означает фракционный объем (безразмерный) гидрогеля, который состоит из открытого пространства, например пор или других отверстий. Таким образом, пористость измеряет объем пустот в материале и отражает долю объема пустот от общего объема в процентах от 0 до 100% (или от 0 до 1). Пористость гидрогеля может находиться в диапазоне от 0,5 до 0,99, от около 0,75 до около 0,99 или от около 0,8 до около 0,95.

[0080] В некоторых вариантах осуществления капля может иметь любой размер пор, который обеспечивает достаточную диффузию реагентов, одновременно удерживая отдельную клетку или экстрагированные из нее нуклеиновые кислоты. Используемый в настоящем документе термин «размер пор» относится к диаметру или эффективному диаметру поперечного сечения пор. Термин «размер пор» также может относиться к среднему диаметру или среднему эффективному диаметру поперечного сечения пор по результатам измерений множества пор. Эффективный диаметр некруглого поперечного сечения равен диаметру круглого поперечного сечения с такой же площадью поперечного сечения, что и у некруглого поперечного сечения. В некоторых вариантах осуществления гидрогель может набухать при гидратации гидрогеля. В результате размеры пор могут меняться в зависимости от содержания воды в гидрогеле. В некоторых вариантах осуществления поры гидрогеля могут иметь достаточный размер, чтобы удерживать инкапсулированную клетку внутри гидрогеля, но пропускать реагенты. В некоторых вариантах осуществления внутреннее пространство капли представляет собой водную среду. В некоторых вариантах осуществления одиночная клетка, расположенная внутри капли, свободна от взаимодействия с полимерной оболочкой капли и/или не находится в контакте с полимерной оболочкой. В некоторых вариантах осуществления вокруг клетки формируют полимерную оболочку, и клетка находится в контакте с полимерной оболочкой вследствие того, что полимерная оболочка сближается с поверхностью клетки за счет пассивной адсорбции или при помощи нацеливания, например присоединяется к антителу или другой специфической связывающей молекуле.

[0081] В некоторых вариантах осуществления капля имеет достаточный размер, чтобы инкапсулировать одиночную клетку. В некоторых вариантах осуществления капля имеет диаметр от около 20 мкм до около 200 мкм, например 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 или 200 мкм, или диаметр, находящийся в пределах диапазона, определяемого любыми двумя из вышеупомянутых значений. Размер капли может изменяться под воздействием факторов окружающей среды. В некоторых вариантах осуществления капли увеличиваются в размерах при их отделении от непрерывной масляной фазы и погружении в водную фазу. В некоторых вариантах осуществления увеличение капли в размерах повышает эффективность проведения анализов генетического материала внутри инкапсулированных клеток. В некоторых вариантах осуществления увеличение капли в размерах обеспечивает больше пространства для амплификации индексированных вставок в процессе ПЦР, которое в противном случае было бы ограниченным в случае использования современных клеточных анализов.

[0082] В некоторых вариантах осуществления каплю получают динамическими средствами, например эмульгирования с помощью вихревой мешалки, микрожидкостного получения капель или клапанных микрожидкостных устройств. В некоторых вариантах осуществления получают капли с равномерным распределением размеров. В некоторых вариантах осуществления размер капель точно регулируют, корректируя размер микрожидкостного устройства, размер одного или более каналов или скорость потока через микрожидкостные каналы. В некоторых вариантах осуществления полученная капля имеет диаметр в диапазоне от 20 до 200 мкм, например 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 или 200 мкм, или диаметр, находящийся в пределах диапазона, определяемого любыми двумя из вышеупомянутых значений.

[0083] В некоторых вариантах осуществления анализ одного или более аналитов может включать в себя различные анализы в зависимости от того, что собой представляет аналит. Например, анализ может включать анализ ДНК, анализ РНК, анализ белков, тагментацию, амплификацию нуклеиновых кислот, секвенирование нуклеиновых кислот, получение библиотеки нуклеиновых кислот, анализ доступного для транспозазы хроматина с использованием секвенирования (ATAC-seq), транспозицию с сохранением смежности (CPT-seq), комбинаторное индексированное секвенирование одиночной клетки (SCI-seq) или амплификацию генома одиночной клетки или любую их комбинацию.

[0084] Анализом ДНК называется любая методика, используемая для амплификации, секвенирования или иного анализа ДНК. Амплификацию ДНК можно выполнять с использованием методик ПЦР или пиросеквенирования. Анализ ДНК может также содержать методики ненацеленного и не основанного на ПЦР секвенирования ДНК (например, метагеномика). В качестве не имеющего ограничительного характера примера анализ ДНК может включать в себя секвенирование гипервариабельной области 16S рДНК (рибосомной ДНК) и применение этого секвенирования для идентификации видов по ДНК.

[0085] Анализом РНК называется любая методика, используемая для амплификации, секвенирования или иного анализа РНК. Для амплификации и секвенирования РНК можно использовать те же методики, что и для анализа ДНК. РНК, которая менее стабильна, чем ДНК, транслируется с ДНК в ответ на стимулы. Таким образом, анализ РНК может дать более точную картину метаболически активных членов сообщества и может быть использован для получения информации о работе сообщества организмов в образце. Кроме того, одновременный анализ ДНК и РНК может быть полезным для эффективного определения связанных как с ДНК, так и с РНК исследований. Секвенирование нуклеиновых кислот относится к использованию секвенирования для определения порядка нуклеотидов в последовательности молекулы нуклеиновой кислоты, такой как ДНК или РНК.

[0086] В настоящем документе термин «секвенирование» относится к способу, которым идентифицируют по меньшей мере 10 последовательных нуклеотидов (например, по меньшей мере 20, по меньшей мере 50, по меньшей мере 100 или по меньшей мере 200 или более последовательных нуклеотидов) полинуклеотида.

[0087] Термины «секвенирование следующего поколения», «высокопроизводительное секвенирование» или «NGS» по существу относятся к высокопроизводительным технологиям секвенирования, включая, без ограничений, массивно-параллельное опознавательное секвенирование, высокопроизводительное секвенирование, секвенирование с лигированием (например, секвенирование SOLiD), протон-ионное полупроводниковое секвенирование, секвенирование ДНК на наносферах, секвенирование одиночных молекул и секвенирование через нанопоры, и может относиться к параллелизированным платформам секвенирования путем синтеза или секвенирования путем лигирования, используемым в настоящее время компаниями Illumina, Life Technologies или Roche и т.п. Способы секвенирования следующего поколения могут также включать в себя способы секвенирования через нанопоры или способы электронного обнаружения, такие как технология Ion Torrent, предлагаемая на рынке компанией Life Technologies, или способ, основанный на флуоресценции одиночных молекул, предлагаемый на рынке компанией Pacific Biosciences.

[0088] Анализом белков называется исследование белков, которое может включать в себя протеомный анализ, определение посттрансляционной модификации интересующих белков, определение уровней экспрессии белков или определение взаимодействий белков с другими молекулами, в том числе с другими белками или нуклеиновыми кислотами.

[0089] В настоящем документе термин «тагментация» относится к модификации ДНК транспосомным комплексом, содержащим фермент транспозазу в комплексе с адаптерами, содержащими концевую последовательность транспозона. Тагментация приводит к одновременной фрагментации ДНК и лигированию адаптеров к 5'-концам обеих цепей дуплексных фрагментов. После стадии очистки для удаления фермента-транспозазы к концам адаптированных фрагментов можно добавить дополнительные последовательности, например, с помощью ПЦР, лигирования или любой другой приемлемой методики, известной специалистам в данной области.

[0090] Анализ доступного для транспозазы хроматина с использованием секвенирования (ATAC-seq) относится к быстрому и чувствительному способу интегративного эпигеномного анализа. ATAC-seq захватывает открытые сайты хроматина и выявляет взаимосвязь между геномными позициями открытого хроматина, ДНК-связывающими белками, индивидуальными нуклеосомами и компактизацией более высокого порядка в регуляторных областях с нуклеотидным разрешением. Обнаружены классы ДНК-связывающих факторов, которые строго избегают, допускают или склонны перекрываться с нуклеосомами. Используя ATAC-seq, измеряли и оценивали последовательные ежедневные эпигеномы покоящихся человеческих Т-клеток у испытуемого посредством стандартных заборов крови, демонстрируя возможность считывания личных эпигеномов в клинических масштабах времени для контроля состояния здоровья и течения заболевания. Более конкретно, ATAC-seq можно выполнять путем обработки хроматина из одиночной клетки инсерционным ферментным комплексом с получением меченых фрагментов геномной ДНК. На этой стадии хроматин фрагментируют и метят (например, фрагментируют и метят в одной и той же реакции) с использованием инсерционного фермента, такого как Tn5 или MuA, который расщепляет геномную ДНК в открытых областях хроматина и добавляет адаптеры к обоим концам фрагментов. ATAC-seq допускает транспозицию только в открытых состояниях хроматина, как показано на Фиг. 5А, и она по существу описанав публикации Buenrostro et al. (Nature Methods, 2013, 10, 1213-1218), которая полностью включена в настоящий документ путем ссылки.

[0091] В любом из вариантов осуществления способов, композиций или систем, описанных в настоящем документе, ATAC-seq можно выполнять на одиночной клетке или в массе. ATAC-seq одиночной клетки позволяет проводить эпигенетический анализ одиночной клетки и может быть выполнен в компартментах, например, путем инкапсуляции одиночной клетки или одиночного ядра в каплю или гранулу. В настоящем документе термин «компартмент» относится к физическому либо виртуальному обозначению замкнутого пространства, в котором может происходить реакция. Например, компартмент может представлять собой гранулу, каплю, лунку или другой физический параметр, определяющий область, в которой могут удерживаться компоненты, например в которой одиночную клетку можно подвергать эксперименту и анализу. Термин «совместная компартментация» относится к нахождению в одном копартменте. Например, если указано, что два аналита совместно компартментированы, то оба аналита находятся в одном и том же компартменте. Под продуктами реакции, которые совместно компартментированы, подразумевают продукты, которые размещены внутри одного и того же компартмента или которые были получены в одном компартменте (например, получены в одной среде при одних и тех же условиях реакции).

[0092] Инкапсуляцию одиночной клетки или одиночного ядра внутри гранулы или капли можно выполнять путем разделения одиночной клетки или ядра в грануле. После инкапсуляции одиночную клетку подвергают анализу ATAC-seq, как показано на Фиг. 5В. При выполнении ATAC-seq одиночной клетки, клетки (или ядра) можно компартментировать, метить и анализировать индивидуально. Это позволяет выполнять транспозицию с сохранением смежности (CPT-seq), поскольку это гарантирует, что вся ДНК или библиотеки из одиночной клетки инкапсулированы в одной капле. Как правило, при транспозиции после удаления транспозазы осуществляют вставку адаптеров и фрагментацию ДНК. Следовательно, фрагментация скремблирует чтения с различных клеток в каплю таким образом, что невозможно получить разрешение на уровне одиночной клетки. Напротив, предложенные в настоящем документе способы позволяют транспозазе удерживать все индивидуальные ДНК/фрагменты библиотеки вместе, обеспечивая перемещение всех материалов из одиночной клетки в одиночную каплю. Затем все фрагменты клетки в одиночной капле можно проиндексировать посредством ПЦР с использованием штрихкодированных праймеров (из загруженных в каплю гранул). По существу CPT-seq описано в публикации Amini et al. (Nat Genet, 2014, 46, 1343 1349), которая полностью включена в настоящий документ путем ссылки. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления можно использовать ATAC-seq одиночной клетки для комбинаторного индексирования. Для загрузки множества клеток в одну и ту же лунку или каплю при сохранении разрешения на уровне одиночной клетки/одиночного ядра можно использовать комбинаторное индексирование или индексирование с разделением и объединением. В некоторых вариантах осуществления индекс можно использовать для идентификации образца, экспериментальных условий или для одинаковых клеток. Комбинаторное индексирование можно использовать для повышения применения капель и клеточной пропускной способности, и ее можно использовать с одиночными клетками или ядрами.

[0093] В некоторых случаях условия можно регулировать для получения желаемого уровня вставок в хроматин (например, вставку, которая происходит в среднем каждые 50-200 пар нуклеотидов в открытых областях). Хроматин, используемый в способе, может быть получен любым подходящим способом. В некоторых вариантах осуществления ядра могут быть выделены и лизированы, и хроматин может быть дополнительно очищен, например, от ядерной оболочки. В других вариантах осуществления хроматин может быть выделен путем приведения выделенных ядер в контакт с реакционным буфером. В этих вариантах осуществления выделенные ядра могут лизироваться при контакте с реакционным буфером (который содержит инсерционные ферментные комплексы и другие необходимые реагенты), что обеспечивает доступ инсерционных ферментных комплексов к хроматину. В этих вариантах осуществления способ может включать выделение ядер из популяции клеток; и объединение выделенных ядер с транспозазой и адаптерами, причем объединение приводит как к лизису ядер с высвобождением указанного хроматина, так и к получению меченных адаптером фрагментов геномной ДНК. Хроматин не требует поперечного сшивания, как в других способах (например, в способах ChIP-SEQ).

[0094] После фрагментации и мечения хроматина для получения меченых фрагментов геномной ДНК по меньшей мере некоторые из меченных адаптером фрагментов секвенируют для получения множества чтений последовательностей. Фрагменты можно секвенировать, используя любой подходящий способ. Например, фрагменты можно секвенировать по способу Illumina с обратимым терминатором, способу пиросеквенирования Roche (454), секвенирования Life Technologies путем лигирования (платформа SOLiD) или использования платформы Ion Torrent от Life Technologies. Примеры таких способов описаны в следующих источниках: Margulies et al. (Nature 2005 437: 376-80); Ronaghi et al. (Analytical Biochemistry 1996 242: 84-9); Shendure et al. (Science 2005 309: 1728-32); Imelfort et al. (Brief Bioinform. 2009 10:609-18); Fox et al. (Methods Mol Biol. 2009; 553:79-108); Appleby et al. (Methods Mol Biol. 2009; 513:19-39) и Morozova et al. (Genomics. 2008 92:255-64), которые включены в настоящий документ путем ссылки в целях предоставления общих описаний способов и конкретных стадий способов, включая все исходные продукты, способы получения библиотек, реагенты и конечные продукты для каждой из стадий. Как будет очевидно, сайты праймеров прямого и обратного секвенирования, совместимые с выбранной платформой для секвенирования следующего поколения, можно добавлять к концам фрагментов на стадии амплификации. В определенных вариантах осуществления фрагменты можно амплифицировать с использованием ПЦР-праймеров, которые гибридизуются с метками, добавленными к фрагментам, причем праймер, используемый для ПЦР, имеет 5'-хвосты, совместимые с конкретной платформой секвенирования. Способы выполнения анализа ATAC-seq описаны в заявке на PCT №PCT/US2014/038825, которая полностью включена в настоящий документ путем ссылки.

[0095] В настоящем документе термин «хроматин» относится к комплексу молекул, включающему в себя белки и полинуклеотиды (например, ДНК, РНК), такому как обнаруживаемый в ядре эукариотической клетки. Хроматин частично состоит из гистоновых белков, образующих нуклеосомы, геномной ДНК и других ДНК-связывающих белков (например, факторов транскрипции), которые обычно связаны с геномной ДНК.

[0096] Секвенирование с транспозицией с сохранением смежности (CPT-seq) относится к способу секвенирования при сохранении информации о смежности с использованием транспозазы с целью сохранения связи соседних фрагментов шаблонной нуклеиновой кислоты в целевой нуклеиновой кислоте. Например, СРТ можно проводить на нуклеиновой кислоте, такой как ДНК или РНК. СРТ-нуклеиновую кислоту можно захватывать путем гибридизации комплементарных олигонуклеотидов, имеющих уникальные индексы или штрихкоды, и иммобилизовать на твердой подложке. В некоторых вариантах осуществления олигонуклеотид, иммобилизованный на твердой подложке, в дополнение к штрихкодам может также содержать сайты связывания праймеров, уникальные молекулярные индексы. Преимуществом является то, что такое использование транспосом для поддержания физической близости фрагментиро ванных нуклеиновых кислот повышает вероятность того, что фрагментированные нуклеиновые кислоты из той же исходной молекулы, например хромосомы, получат одинаковый уникальный штрихкод и индексную информацию от олигонуклеотидов, иммобилизованных на твердой подложке. В результате этого получается библиотека смежно-связанного секвенирования с уникальными штрихкодами. Библиотеку смежно-связанного секвенирования можно секвенировать для получения информации о смежности последовательности.

[0097] В настоящем документе термин «информация о смежности» относится к пространственным отношениям между двумя или более фрагментами ДНК на основе общей информации. Общий аспект информации может относиться к ближним, компартментным и дистантным пространственным отношениям. Информация об этих отношениях в молекулах, в свою очередь, облегчает иерархическую сборку или картирование чтений последовательностей, полученных из фрагментов ДНК. Эта информация о смежности повышает эффективность и точность такой сборки или картирования, поскольку традиционные способы сборки или картирования, используемые в связи с традиционными способами секвенирования методом дробовика, не учитывают относительные геномные точки начала или координаты отдельных чтений последовательности применительно к пространственным отношениям между двумя или более фрагментами ДНК, из которых получали отдельные чтения последовательности.

[0098] Таким образом, в соответствии с вариантами осуществления, описанными в настоящем документе, могут быть реализованы способы получения информации о смежности с помощью способов определения смежности в ближнем диапазоне для определения смежных пространственных отношений, способы определения смежности в среднем диапазоне для определения компартментных пространственных отношений или способы определения смежности в дальнем диапазоне для определения дистантных пространственных отношений. Эти способы способствуют точности и качеству сборки или картирования последовательности ДНК и могут быть использованы с любым способом секвенирования, таким как описанные в настоящем документе.

[0099] Информация о смежности включает в себя относительное геномные точки начала или координаты отдельных чтений последовательности применительно к пространственным отношениям между двумя или более фрагментами ДНК, из которых были получены отдельные чтения последовательности. В некоторых вариантах осуществления информация о смежности включает в себя информацию о последовательности из неперекрывающихся чтений последовательности.

[0100] В некоторых вариантах осуществления информация о смежности для целевой нуклеотидной последовательности указывает на информацию о гаплотипе. В некоторых вариантах осуществления информация о смежности для целевой нуклеотидной последовательности указывает на информацию о геномных вариантах.

[0101] Комбинаторное индексированное секвенирование одиночной клетки (SCI-seq) представляет собой методику секвенирования для одновременного получения тысяч библиотек одиночных клеток с низким числом копий для обнаружения соматических вариантов числа копий. Некоторые варианты осуществления, представленные в настоящем документе, относятся к способам, композициям и системам для одновременного анализа множества аналитов в образце с использованием подхода на основе комбинаторного индексирования, такого как SCI-seq. Например, как показано на Фиг. 10, с использованием SCI-seq можно индексировать одновременно ДНК и РНК. После введения специфических меток для ДНК и РНК, клетки/ядра физически разделяют на множество групп. Каждую группу ДНК помечают первым штрихкодом (ШтрихкодI на Фиг. 10), а РНК помечают вторым штрихкодом (ШтрихкодJ на Фиг. 10). Мечение ДНК и РНК может происходить одновременно или последовательно. Затем группы объединяют и случайным образом разделяют на множество групп, которые можно дополнительно помечать третьим штрихкодом (ШтрихкодK на Фиг. 10). Для повышения индексирующей способности процесс разделения и объединения можно повторять во множестве циклов. Частоту соударений при индексировании (один и тот же штрихкод для различных клеток/ядер) можно контролировать числом штрихкодов на цикл и числом ячеек/ядер на группу. Штрихкоды можно вводить посредством обратной транскриптазы, посредством лигирования, посредством тагментации или другими способами введения штрихкодов. В некоторых вариантах осуществления методики комбинаторного секвенирования, описанные в настоящем документе, не требуют отделения или выделения ядра из клеток.

[0102] На Фиг. 11 дополнительно представлены детали комбинаторного секвенирования, например SCI-seq, с индексированием путем лигирования и удлинения. Транспозон с меткой TAG1 вставляют в геномную ДНК путем транспозиции. Олигонуклеотид со штрихкодомI и меткой TAG2 лигируют с гДНК посредством гибридизации с меткой TAG1. Первый синтез кДНК инициируется олигонуклеотидом поли-Т со штрихкодомJ и меткой TAG2 с последующим вторым синтезом кДНК. После процесса объединения и разделения олигонуклеотид со штрихкодомK гибридизируют как с гДНК, так и с кДНК в области метки TAG2 и лигируют посредством лигирования с заполнением гэпа. Метка TAG3 может служить в качестве якоря для следующего цикла индексирования после разделения и объединения. После комбинаторного индексирования на другом конце можно добавлять адаптер ПЦР/библиотеки посредством второй транспозиции.

[0103] В настоящем документе термины «выделенный», «выделять», «выделение», «очищенный», «очищать», «очистка» и их грамматические эквиваленты, используемые в настоящем документе, если не указано иное, относятся к снижению количества по меньшей мере одного загрязняющего вещества (такого как белковая и/или нуклеотидная последовательность) в образце или источнике (например, клетке), из которого выделяют материал. Таким образом, очистка приводит к «обогащению», например увеличению количества необходимого белка и/или нуклеотидной последовательности в образце.

[0104] После лизиса и выделения нуклеиновых кислот можно выполнять амплификацию, например амплификацию с множественным вытеснением (MDA), которая является широко применяемой методикой амплификации малых количеств ДНК, в особенности из одиночных клеток. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты амплифицируют, секвенируют или используют для получения библиотек нуклеиновых кислот. Используемые в настоящем документе термины «амплифицировать» или «амплифицированный», «амплификация» применительно к нуклеиновым кислотам или реакциям нуклеиновых кислот относятся к способам получения in vitro копий конкретной нуклеиновой кислоты, например целевой нуклеиновой кислоты, согласно одному из вариантов осуществления настоящего изобретения. В данной области известно множество способов амплификации нуклеиновых кислот, и реакции амплификации включают в себя полимеразные цепные реакции, лигазные цепные реакции, реакции амплификации с замещением цепей, реакции амплификации по типу катящегося кольца, амплификацию на основе множества циклов отжига и образования петель (MALBAC), способы амплификации, опосредованные транскрипцией, такие как амплификация на основе последовательности нуклеиновой кислоты (NASBA), способы амплификации, опосредованные петлями (например, петлевая изотермическая амплификация (LAMP) с использованием петлеобразующих последовательностей). Амплифицируемая нуклеиновая кислота может представлять собой ДНК, содержащую, состоящую из, или полученную из ДНК, РНК или смеси ДНК и РНК, включая модифицированную ДНК и/или РНК. Продукты, полученные в результате амплификации молекулы или молекул нуклеиновой кислоты (например, «продукты амплификации»), независимо от того, является ли исходная нуклеиновая кислота ДНК, РНК или обеими из них, могут представлять собой либо ДНК, либо РНК, либо смесь нуклеозидов или нуклеотидов и ДНК, и РНК, либо они могут содержать модифицированные нуклеозиды или нуклеотиды ДНК или РНК. Термин «копия» не обязательно означает идеальную комплементарность или идентичность последовательности данной целевой последовательности. Например, копии могут включать в себя нуклеотидные аналоги, такие как дезоксиинозин или дезоксиуридин, намеренные изменения последовательности (такие как изменения последовательности, вводимые через праймер, содержащий последовательность, которая является гибридизируемой, но не комплементарной целевой последовательности, и/или ошибки последовательности, возникающие во время амплификации.

[0105] Захваченные нуклеиновые кислоты можно амплифицировать в соответствии с любой подходящей методологией амплификации, известной в данной области. Следует понимать, что для амплификации нуклеиновых кислот можно использовать любую из методологий амплификации, описанную в настоящем документе или по существу известных в данной области, с универсальными или специфичными для мишени праймерами. Подходящие способы амплификации включают, без ограничений, полимеразную цепную реакцию (ПЦР), амплификацию с замещением цепей (SDA), транскрипционно опосредованную амплификацию (ТМА) и амплификацию на основе последовательности нуклеиновой кислоты (NASBA), как описано в патенте США №8,003,354, который полностью включен в настоящий документ путем ссылки. Вышеуказанные способы амплификации можно использовать для амплификации одной или более интересующих нуклеиновых кислот. Например, для амплификации нуклеиновых кислот можно использовать ПЦР, включая мультиплексную ПЦР, SDA, ТМА, NASBA и т.п.В некоторых вариантах осуществления в реакцию амплификации включены праймеры, специфично нацеленные на интересующую нуклеиновую кислоту.

[0106] Другие подходящие способы амплификации нуклеиновых кислот могут включать удлинение и лигирование олигонуклеотидов, амплификацию по типу катящегося кольца (RCA) (Lizardi et al., Nat. Genet. 19:225-232 (1998), который включен в настоящий документ путем ссылки) и технологии метода лигирования олигонуклеотидных зондов (OLA) (см. в основном патенты США №7,582,420, 5,185,243, 5,679,524 и 5,573,907; ЕР 0 320 308В1; ЕР 0 336 731В1; ЕР 0 439 182В1; WO 90/01069; WO 89/12696; и WO 89/09835, все из которых включены в настоящий документ путем ссылки). Следует понимать, что данные методологии амплификации могут быть выполнены с возможностью амплификации нуклеиновых кислот. Например, в некоторых вариантах осуществления способ амплификации может включать реакции амплификации с лигирующим зондом или метода лигирования олигонуклеотидных зондов (OLA), которые включают праймеры, конкретно нацеленные на интересующую нуклеиновую кислоту. В некоторых вариантах осуществления способ амплификации может включать реакцию удлинения и лигирования праймеров, которая включает праймеры, направленные конкретно на интересующую нуклеиновую кислоту и способные проходить через поры гидрогеля. В качестве не имеющего ограничительного характера примера праймеров для удлинения и лигирования праймера, которые могут быть специально выполнены с возможностью амплификации интересующей нуклеиновой кислоты, амплификация может включать праймеры, используемые для анализа GoldenGate (Illumina, Inc., г. Сан-Диего, штат Калифорния, США), как показано в патентах США №7,582,420 и 7,611,869, каждый из которых полностью включен в настоящий документ путем ссылки.

[0107] В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты амплифицируют с использованием методологий кластерной амплификации, представленных в описаниях патентов США №7,985,565 и 7,115,400, содержание которых полностью включено в настоящий документ путем ссылки. Включенные материалы патентов США №7,985,565 и 7,115,400 описывают способы амплификации нуклеиновых кислот, обеспечивающие иммобилизацию продуктов амплификации на твердой подложке для формирования матриц, состоящих из кластеров или «колоний» иммобилизованных молекул нуклеиновых кислот. Каждый кластер или колония на такой матрице формируется из множества идентичных иммобилизованных полинуклеотидных цепей и множества идентичных иммобилизованных комплементарных полинуклеотидных цепей. Сформированные таким образом матрицы в настоящем документе по существу называются «кластерными матрицами». Продукты реакций твердофазной амплификации, такие как описанные в патентах США №7,985,565 и 7,115,400, представляют собой так называемые «мостиковые» структуры, образованные путем отжига пар иммобилизованных полинуклеотидных цепей и иммобилизованных комплементарных цепей, причем обе цепи иммобилизованы на твердой подложке на 5'-конце, предпочтительно посредством ковалентного присоединения. Методологии кластерной амплификации представляют собой примеры способов, в которых для получения иммобилизованных ампликонов используют матрицу иммобилизованных нуклеиновых кислот. Для получения иммобилизованных ампликонов из иммобилизованных фрагментов ДНК, полученных в соответствии со способами, предложенными в настоящем документе, также можно использовать другие приемлемые методологии. Например, посредством твердофазной ПЦР можно сформировать один или более кластеров или колоний, где иммобилизованы один или оба праймера каждой пары праймеров для амплификации.

[0108] Дополнительные способы амплификации включают изотермическую амплификацию. Примеры способов изотермической амплификации, которые можно использовать, включают, без ограничений, амплификацию с множественным вытеснением (MDA), как показано, например, в Dean et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:5261-66 (2002), или амплификацию нуклеиновых кислот с изотермическим замещением цепей, пример которой приведен в патенте США №6,214,587, каждый из которых полностью включен в настоящий документ путем ссылки. Другие способы, не основанные на ПЦР, которые можно использовать в настоящем описании, включают, например, амплификацию с замещением цепей (SDA), описанную, например, в Walker et al., Molecular Methods for Virus Detection, Academic Press, Inc., 1995; патентах США №5,455,166 и 5,130,238, и Walker et al., Nucl. Acids Res. 20:1691-96 (1992), или амплификацию с замещением гиперразветвленных цепей, описанную, например, в Lage et al., Genome Research 13:294-307 (2003), каждый из которых полностью включен в настоящий документ путем ссылки. Для амплификации геномной ДНК со случайным праймером можно применять способы изотермической амплификации с полимеразой Phi 29, которая замещает цепи, или крупным фрагментом ДНК-полимеразы Bst, 5' ->3' экзо- Использование данных полимераз обеспечивает преимущество, заключающееся в их высокой процессивности и активности замещения цепей. Высокая процессивность позволяет полимеразам производить фрагменты длиной 10-20 т. п. н. Как указано выше, более мелкие фрагменты могут быть получены в изотермических условиях с использованием полимераз, обладающих низкой процессивностью и активностью замещения цепей, например полимеразы Кленова. Дополнительное описание реакций, условий и компонентов амплификации подробно изложено в описании патента США №7,670,810, который полностью включен в настоящий документ путем ссылки. В некоторых вариантах осуществления случайные гексамеры отжигают с денатурированной ДНК с последующим синтезом с замещением цепи при постоянной температуре в присутствии катализирующего фермента Phi 29. Это приводит к амплификации ДНК, что подтверждается увеличением интенсивности флуоресценции (ДНК, окрашенной SYTOX) после MDA. Независимо от этого можно также выполнять тагментацию на основе NEXTERA® после лизиса и очистки и последующую амплификацию гДНК посредством ПЦР, на что указывает значительное увеличение интенсивности флуоресценции после тагментации NEXTERA® и ПЦР.

[0109] Другим способом амплификации нуклеиновых кислот, используемым в настоящем описании, является ПЦР с мечением, в которой используют популяцию двухдоменных праймеров, имеющих константную область 5'-области, за которой следует случайная 3'-область, как описано, например, в публикации Grothues, et al. Nucleic Acids Res. 21(5): 1321-2 (1993), которая полностью включена в настоящий документ путем ссылки. Первые циклы амплификации выполняют для обеспечения множества инициаций на денатурированной нагреванием ДНК на основе индивидуальной гибридизации из случайным образом синтезированной 3'-области. Ввиду природы 3'-области сайты инициации полагают случайными по всему геному. После этого несвязанные праймеры можно удалять и проводить дальнейшую репликацию с использованием праймеров, комплементарных константной 5'-области.

[0110] В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты полностью или частично секвенируют. Нуклеиновые кислоты можно секвенировать в соответствии с любой подходящей методикой секвенирования, такой как прямое секвенирование, включая секвенирование посредством синтеза, секвенирование посредством лигирования, секвенирование посредством гибридизации, секвенирование через нанопоры и т.п.

[0111] Одной из методик секвенирования является секвенирование путем синтеза (SBS). В SBS отслеживают удлинение праймера нуклеиновой кислоты вдоль матрицы нуклеиновой кислоты (например, целевой нуклеиновой кислоты или ее ампликона) для определения последовательности нуклеотидов в матрице. Лежащим в основе химическим процессом может быть полимеризация (например, катализируемая ферментом полимеразой). В конкретном варианте осуществления SBS на основе полимеразы к праймеру добавляют флуоресцентно-меченые нуклеотиды (посредством чего праймер удлиняется) зависимым от матрицы образом, так чтобы для определения последовательности матрицы можно было использовать обнаружение порядка и типа нуклеотидов, добавляемых к праймеру.

[0112] Одну или более амплифицированных нуклеиновых кислот можно подвергать воздействию SBS или другой методики обнаружения, которая включает повторную доставку реагентов по циклам. Например, для запуска первого цикла SBS, один или более меченых нуклеотидов, ДНК-полимеразу и т.п.можно подать в или пропустить через каплю с одной или более амплифицированных молекул нуклеиновой кислоты. Можно выявлять те сайты, где удлинение праймера приводит к встраиванию меченого нуклеотида. Нуклеотиды могут дополнительно обладать свойством обратимой терминации, которое завершает дополнительное удлинение праймера после добавления нуклеотида к праймеру. Например, в праймер можно добавлять нуклеотидный аналог, имеющий фрагмент обратимого терминатора, так чтобы последующее удлинение не могло происходить до тех пор, пока не будет доставлен блокирующий агент для удаления фрагмента. Таким образом, для вариантов осуществления с обратимой терминацией в проточную кювету можно подавать разблокирующий реагент (до или после обнаружения). В промежутке между различными стадиями доставки можно проводить промывки. Затем цикл можно повторять n раз для удлинения праймера на n нуклеотидов, тем самым устанавливая последовательность длиной n. Примерные процедуры SBS, жидкостные системы и платформы обнаружения, которые можно без особенных усилий адаптировать для использования с ампликонами, полученными способами настоящего описания, приведены, например, в Bentley et al., Nature 456:53-59 (2008), WO 04/018497; патенте США №7,057,026; WO 91/06678; WO 07/123744; патенте США №7,329,492; патенте США №7,211,414; патенте США №7,315,019; патенте США №7,405,281 и US 2008/0108082; каждый из которых включен в настоящий документ путем ссылки.

[0113] Можно использовать и другие процедуры секвенирования, в которых применяют циклические реакции, например пиросеквенирование. В ходе пиросеквенирования обнаруживают высвобождение неорганического пирофосфата (PPi) по мере включения конкретных нуклеотидов в растущую цепь нуклеиновой кислоты (Ronaghi, et al., Analytical Biochemistry 242(1), 84-9 (1996); Ronaghi, Genome Res. 11(1), 3-11 (2001); Ronaghi et al. Science 281(5375), 363 (1998); патенте США №6,210,891; патенте США №6,258,568 и патенте США №6,274,320, каждый из которых включен в настоящий документ путем ссылки). В процессе пиросеквенирования высвобождающийся PPi может обнаруживать при его немедленном превращении в аденозинтрифосфат (АТФ) под действием АТФ-сульфурилазы, а уровень образующегося АТФ можно обнаруживать по фотонам, испускаемым люциферазой. Таким образом, реакцию секвенирования можно отслеживать с помощью системы обнаружения люминесценции. Для процедур пиросеквенирования нет необходимости использовать источники возбуждающего излучения, применяемые в системах обнаружения флуоресценции. Подходящие жидкостные системы, детекторы и процедуры, которые могут быть адаптированы для применения пиросеквенирования к ампликонам, полученным в соответствии с настоящим описанием, приведены, например, в заявке на патент WIPO №PCT/US11/57111, US 2005/0191698 A1, патенте США №7,595,883 и патенте США №7,244,559, каждый из которых включен в настоящий документ путем ссылки.

[0114] В некоторых вариантах осуществления могут использоваться способы, включающие мониторинг активности ДНК-полимеразы в реальном времени. Например, включение нуклеотидов может быть обнаружено за счет взаимодействий по механизму резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET) между содержащей флуорофор полимеразой и нуклеотидами с γ-фосфатной меткой или с помощью волноводов с нулевой модой (ZMW). Методики и реагенты для секвенирования на основе FRET описаны, например, в публикации Levene et al. Science 299, 682-686 (2003); Lundquist et al. Opt. Lett. 33, 1026-1028 (2008); Korlach et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105, 1176-1181 (2008), описания которых полностью включены в настоящий документ путем ссылки.

[0115] Некоторые варианты осуществления SBS включают обнаружение протона, высвобождаемого при встраивании нуклеотида в продукт удлинения. Например, для секвенирования на основе обнаружения высвобождаемых протонов можно использовать электрический детектор и связанные с этим имеющиеся на рынке методики. Примерами таких систем секвенирования являются пиросеквенирование (например, имеющаяся на рынке платформа производства компании 454 Life Sciences, дочерней компании Roche), секвенирование с использованием нуклеотидов с γ-фосфатной меткой (например, имеющаяся на рынке платформа производства компании Pacific Biosciences) и секвенирование с обнаружением протонов (например, имеющаяся на рынке платформа производства компании Ion Torrent, дочерней компании Life Technologies) или способы и системы секвенирования, описанные в US 2009/0026082 A1; US 2009/0127589 A1; US 2010/0137143 A1; US 2010/0282617 A1, каждый из которых включен в настоящий документ путем ссылки. Описанные в настоящем документе способы амплификации целевых нуклеиновых кислот с использованием кинетического исключения можно с легкостью применять к субстратам, используемым для обнаружения протонов. В частности, описанные в настоящем документе способы можно применять для получения клональных популяций ампликонов, которые используют для обнаружения протонов.

[0116] Другой методикой секвенирования является секвенирование через нанопоры (см., например, Deamer et al. Trends Biotechnol. 18, 147-151 (2000); Deamer etal. Acc. Chem. Res. 35:817-825 (2002); Liet al. Nat. Mater. 2:611-615 (2003), описания которых включены в настоящий документ путем ссылки). В некоторых вариантах осуществления с нанопорами целевая нуклеиновая кислота или отдельные нуклеотиды удаляются при прохождении целевой нуклеиновой кислоты через нанопору. По мере прохождения нуклеиновой кислоты или нуклеотида через нанопору каждый тип нуклеотида можно идентифицировать путем измерения колебаний электрической проводимости поры. (Патент США №7,001,792; Soni et al. Clin. Chem. 53, 1996-2001 (2007); Healy, Nanomed. 2, 459-481 (2007); Cockroft et al. J. Am. Chem. Soc. 130, 818-820 (2008), описания которых включены в настоящий документ путем ссылки).

[0117] Примеры способов экспрессии на основе матрицы и анализа генотипированием, которые можно применять для обнаружения в соответствии с настоящим описанием, описаны в патенте США №7,582,420; 6,890,741; 6,913,884 или 6,355,431 или патентной публикации США №2005/0053980 А1; 2009/0186349 А1 или US 2005/0181440 A1, каждый из которых включен в настоящий документ путем ссылки.

[0118] В описанных в настоящем документе способах выделения нуклеиновых кислот, амплификации и секвенирования для выделения и получения нуклеиновых кислот используют различные реагенты. К таким реагентам могут относиться, например, лизоцим, протеиназа K, статистические гексамеры, полимераза (например, ДНК-полимераза Ф29, Taq-полимераза, Bsu-полимераза), транспозаза (например, Tn5), праймеры (например, адаптерные последовательности Р5 и Р7), лигаза, катализирующий фермент, дезоксинуклеотидтрифосфаты, буферы или двухвалентные катионы.

[0119] Адаптеры могут включать в себя сайты праймеров для секвенирования, сайты праймеров для амплификации и индексы. При использовании в настоящем документе термин «индекс» может включать в себя последовательность нуклеотидов, которую можно использовать в качестве молекулярного идентификатора и/или штрихкода для метки нуклеиновой кислоты и/или для идентификации источника нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления индекс можно использовать для идентификации одиночной нуклеиновой кислоты или субпопуляции нуклеиновых кислот. В некоторых вариантах осуществления для комбинаторного индексирования можно использовать одиночную клетку, например, с использованием подхода транспозиции с сохранением смежности (CPT-seq).

[0120] Индексы можно использовать для идентификации источника молекулы нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления адаптер может быть модифицирован во избежание образования конкатемеров, например, за счет введения блокирующих групп, которые препятствуют удлинению адаптера, на одном или обоих концах. К примерам 3'-блокирующих групп относятся 3'-спейсер С3, а дидеоксинуклеотид и закрепление на подложке. К примерам 5'-блокирующих групп относятся дефосфорилированный 5'-нуклеотид и закрепление на подложке.

[0121] Пример способа включает дефосфорилирование 5'-концов целевых нуклеиновых кислот для предотвращения образования конкатемеров на последующих стадиях лигирования; лигирование первых адаптеров с 3'-концами дефосфорилированных мишеней с помощью лигазы, в которой заблокированы 3'-концы первых адаптеров; повторное фосфорилирование 5'-концов лигированных мишеней; лигирование второго адаптера с 5'-концами дефосфорилированных мишеней с помощью одноцепочечной лигазы, в которой 5'-концы вторых адаптеров не фосфорилированы.

[0122] Другой пример включает частичное расщепление нуклеиновой кислоты 5'-экзонуклеазой с образованием двухцепочечной нуклеиновой кислоты с одноцепочечными 3'-липкими концами. Адаптер, содержащий блокирующую 3'-группу, может быть лигирован с 3'-концами двухцепочечной нуклеиновой кислоты с 3'-липкими концами. Двухцепочечная нуклеиновая кислота с 3'-липкими концами с лигированными адаптерами может быть дегибридизирована с образованием одноцепочечных нуклеиновых кислот. Адаптер, содержащий нефосфорилированный 5'-конец, может быть лигирован с 5'-концом одноцепочечной нуклеиновой кислоты.

[0123] Способы дефосфорилирования нуклеиновых кислот, например 5'-нуклеотида нуклеиновой кислоты, включают приведение нуклеиновой кислоты в контакт с фосфатазой. К примерам фосфатаз относятся фосфатаза кишечника теленка, щелочная фосфатаза креветки, антарктическая фосфатаза и щелочная фосфатаза APEX (Epicentre).

[0124] Способы лигирования нуклеиновых кислот включают приведение нуклеиновых кислот в контакт с лигазой. К примерам лигаз относятся Т4 РНК-лигаза 1, Т4 RPHK-лигаза 2, RtcB-лигаза, метано бактериальная РНК-лигаза и TS2126 РНК-лигаза (CIRCLIGASE).

[0125] Способы фосфорилирования нуклеиновых кислот, например 5'-нуклеотида нуклеиновой кислоты, включают приведение нуклеиновой кислоты в контакт с киназой. К примерам киназ относится Т4 полинуклеотидкиназа.

[0126] Варианты осуществления систем и способов, предложенные в настоящем документе, включают в себя наборы, содержащие реагенты для транспонирования, а также первый зонд, комплементарный первой метке, и второй зонд, комплементарный второй метке, причем первый и второй зонды иммобилизованы на твердой подложке. В некоторых вариантах осуществления первый зонд и второй зонд содержат штрихкод. В некоторых вариантах осуществления первый зонд и второй зонд представляют собой зонд поли-Т. В некоторых вариантах осуществления твердая подложка представляет собой протравленную поверхность, лунку, матрицу, устройство проточной кюветы, микрожидкостный канал, гранулу, магнитную гранулу, колонку, каплю или микрочастицу.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Получение библиотеки ДНК и РНК из клеточной массы

[0127] Следующий пример демонстрирует вариант осуществления одновременного анализа ДНК и РНК в образце клеточной массы.

[0128] Клетки получали и лизировали для выделения клеточных ядер, как показано на Фиг. 6А. Полную геномную ДНК (гДНК) тагментировали транспозонами поли-А с помощью транспосом. Транспосомы проникают в ядра и тагментируют открытый хроматин (гДНК, не связанная с гистонами).

[0129] После тагментации как гДНК, так и РНК содержали 3'-хвосты поли-А. Как гДНК, так и РНК захватывали с помощью зондов захвата с поли-Т, которые гибридизировались с хвостами поли А на 3'-конце гДНК и РНК. Зонды захвата содержали первую общую последовательность (CS1) для амплификации в направлении 3'-конца и молекулярного индексирования образцов, клеток или для демультиплексирования молекул. Для преобразования РНК в ДНК зонды захвата использовали в качестве праймеров для синтеза кДНК обратной транскриптазой.

[0130] гДНК и полученную кДНК очищали от ядра с помощью очистки на колонке (ZYMO), как показано на Фиг. 6В. Получение библиотеки с помощью анализа доступного хроматина с использованием секвенирования (АТАС) проводили с помощью реакции удлинения/лигирования, а получение библиотеки РНК проводили с помощью синтеза второй цепи кДНК. Второй цикл тагментации использовали для включения второй общей последовательности (CS2) и молекулярных индексов. Для удаления Tn5 выполняли очистку образца, и создавали окончательную библиотеку секвенирования с помощью ПЦР с использованием праймеров, комплементарных CS1 и CS2.

[0131] Аналогичные методологии также использовали для одновременного анализа ДНК и РНК на гранулах. Как показано на Фиг. 7А и 7В, для улучшения обработки образцов и/или для обеспечения полноразмерных библиотек РНК можно выполнять анализ. Как показано на схемах, представленных на Фиг. 7А и 7В, для выделения ядер получали и лизировали клетки. гДНК тагментировали двумя транспосомами, содержащими транспозоны поли-А и общую последовательность (CS2). Транспосомы проникают в ядра и тагментируют открытый хроматин (гДНК, не связанная с гистонами). Зонды захвата с хвостами поли-Т, содержащими общую последовательность (CS1), гибридизировали с хвостом поли-А библиотек как ДНК, так и РНК. Для завершения получения библиотек РНК использовали зонды гибридизации для праймирования синтеза кДНК. К библиотекам РНК добавляли вторую общую последовательность (CS2) с использованием активности переключения шаблона обратной транскриптазы и переключающего шаблон олигонуклеотида (TSO), что позволяет получать полноразмерную РНК. Для улучшения обработки образцов использовали биотинилированный зонд захвата для соединения библиотек РНК и ДНК с магнитными гранулами стрептавидина. Для связанных с гранулами молекул легко проводили промывки, замены буфера и обработку.

[0132] На Фиг. 8 представлены результаты получения библиотек АТАС и РНК. Фрагмент библиотеки АТАС имеет сигнатурную последовательность ME, транспозон-специфичную последовательность (на Фиг. 8 обведена рамкой). Как показано на Фиг. 9, во фрагментах АТАС наблюдается типичное обогащение вокруг промоторных областей (панель А), а во фрагментах РНК, отсчитываемых с 3'-направления, наблюдается накопление считываний вокруг конца гена (панель В). В таблицах 1 и 2 обобщены измеренные параметры ATAC-seq и РНК для одновременного анализа ДНК и РНК.

Пример 2. ATAC-seq одиночной клетки

[0133] В следующем примере показан вариант осуществления выполнения ATAC-seq одиночной клетки в компартментах.

[0134] Транспозицию в хроматин выполняли, как показано на Фиг. 5В. После транспозиции одиночные клетки или одиночные ядра разделяли между компартментами, в данном случае между каплями. Транспозаза удерживает все отдельные ДНК/фрагменты библиотек вместе, тем самым позволяя инкапсулировать все материалы из одной клетки в одной капле. Все фрагменты клетки в одной капле индексировали посредством ПЦР с использованием штрихкодированных праймеров.

[0135] Чтобы обеспечить правильное разделение одиночных клеток на одиночные капли, в процессе использовали смешанные человеческие и мышиные клетки. Образец включал 500 000 человеческих клеток и 500 000 мышиных клеток. В каждом анализе участвовали 34 000 ядер, которые объединяли для получения одного чипа для ПЦР на капле, содержащего около 300 000 капель. В анализе участвовало 140 000 гранул (3200 гранул по 11 мкл на канал). Проводили четыре цикла ПЦР на капле, с последующими десятью циклами в массе. Пример рабочего процесса секвенирования представлен на Фиг. 12, на которой показана последовательность со вставленными в нее штрихкодами. Было отмечено, что увеличение транспозазы Tn5 увеличивало выход, чувствительность и процент сайтов инициации транскрипции (TSS), как показано на Фиг. 13.

[0136] Считывали штрихкоды, идентифицирующие чтения последовательностей либо как мышиные, либо как человеческие, и, как показано на Фиг. 14, результаты указывают, что чтения идентифицировались либо как мышиные, либо как человеческие, что свидетельствует о том, что одиночная клетка была инкапсулирована в одиночную каплю, таким образом позволяя разделять одиночные клетки, что позволяет анализировать одиночную клетку. Как и ожидалось, результаты чтений АТАС распределялись вокруг сайтов инициации транскрипции.

[0137] Используемый настоящем документе термин «содержащий» является синонимом терминов «включая», «включающий» или «характеризуется» и имеет включающий, а не ограничительный характер, и не исключает дополнительные неуказанные элементы или этапы способа.

[0138] В описании выше приведены несколько способов и материалов настоящего изобретения. Настоящее изобретение может подвергаться модификациям в части способов и материалов, а также изменениям в части способов изготовления и оборудования. Такие модификации будут очевидны специалистам в данной области после изучения настоящего описания или реализации изобретения, описанного в настоящем документе, на практике. Следовательно, не предполагается, что настоящее изобретение ограничено конкретными вариантами осуществления, описанными в настоящем документе, но предполагается, что оно охватывает все модификации и альтернативные варианты в пределах истинного объема и сущности изобретения.

[0139] Все источники, процитированные в настоящем документе, включая, без ограничений, опубликованные и неопубликованные заявки, патенты и ссылки на литературу, полностью включены в настоящий документ путем ссылки и, следовательно, являются частью настоящего описания. В тех случаях, когда публикации, патенты или заявки на патенты, включенные путем ссылки, противоречат изложению, приведенному в настоящем описании, предполагается, что настоящее описание заменяет и/или имеет приоритет над любым таким противоречащим материалом.

Claims

1. Библиотека нуклеиновых кислот для анализа ДНК и РНК из образца, созданная одновременно из РНК и ДНК в одном компартменте, содержащая:

библиотеку молекул второй цепи комплементарной ДНК (кДНК), полученную из молекул мРНК и содержащую нуклеиновые кислоты, имеющие первую метку; и

библиотеку геномной ДНК (гДНК), полученную из геномной ДНК, тагментированной второй меткой и 3’ поли-А хвостом с применением транспосом с поли-А транспозонами, и

при этом указанные библиотеки кДНК и гДНК совместно компартментированы и получены в одной и той же среде.

2. Библиотека нуклеиновых кислот по п. 1, причем указанная библиотека гДНК получена с применением реагентов для тагментации.

3. Библиотека нуклеиновых кислот по п. 2, причем реагенты для тагментации присоединяют 3’ поли-А хвост к гДНК.

4. Библиотека нуклеиновых кислот по п. 1, в которой первая метка присоединена ко второй цепи кДНК посредством обратной транскрипции молекул мРНК с получением первой цепи кДНК с последующей тагментацией или переключением шаблона, и причем указанный 3’ поли-А хвост присоединен к гДНК посредством тагментации.

5. Библиотека нуклеиновых кислот по п. 1, которая присоединена к твердой подложке.

6. Библиотека нуклеиновых кислот по п. 5, причем твердая подложка представляет собой субстрат, протравленную поверхность, лунку, покрытую лунку, герметичную лунку, матрицу, устройство проточной кюветы, микрожидкостный канал, гранулу, магнитную гранулу, колонку, каплю или микрочастицу.

7. Библиотека нуклеиновых кислот по п. 1, в которой первая и вторая метки дополнительно содержат последовательность распознавания субстрата.

8. Библиотека нуклеиновых кислот по п. 7, в которой последовательность распознавания субстрата первой метки является такой же, что и последовательность распознавания субстрата второй метки.

9. Библиотека нуклеиновых кислот по п. 1, в которой первая и вторая метки являются одинаковыми.

10. Библиотека нуклеиновых кислот по п. 1, которую создают из популяции клеток, одиночной клетки, популяции клеточных ядер или ядра одиночной клетки.

11. Библиотека нуклеиновых кислот по п. 1, в которой первая метка представляет собой метку поли-А.

12. Библиотека нуклеиновых кислот по п. 1, в которой 3’ поли-А хвост гДНК содержит специфичный для транспозазы элемент.

13. Устройство проточной кюветы для одновременного получения библиотек РНК и ДНК в одном компартменте, содержащее:

зонд захвата на основе поли-Т, выполненный с возможностью гибридизации с 3’ поли-А хвостом РНК, причем зонд захвата содержит первую общую последовательность (CS1);

зонд захвата на основе поли-Т, выполненный с возможностью гибридизации с 3’ поли-А хвостом ДНК, причем зонд захвата содержит CS1;

при этом каждый зонд захвата выполнен с возможностью одновременного анализа РНК и ДНК из образца в одном компартменте.

14. Устройство проточной кюветы по п. 13, в котором зонды захвата иммобилизованы на устройстве проточной кюветы.

15. Способ одновременного анализа ДНК и РНК из образца в одном компартменте, включающий:

обеспечение образца, содержащего ДНК и РНК, причем РНК содержит 3’ поли-А хвост;

тагментирование ДНК 3’ поли-А хвостом с применением транспосом с поли-А транспозонами;

приведение образца в одном компартменте в контакт с зондом захвата на основе поли-Т, выполненным с возможностью гибридизации с 3’ поли-А хвостом РНК и ДНК, причем зонд захвата содержит первую общую последовательность (CS1);

гибридизацию зонда захвата на основе поли-Т с РНК и с ДНК, таким образом одновременно захватывая ДНК и РНК; и

анализ ДНК и РНК.

16. Способ по п. 15, в котором зонд захвата иммобилизован на твердой подложке.

17. Способ по п. 15, в котором зонд захвата дополнительно содержит последовательность распознавания субстрата.

18. Способ по п. 15, в котором образец представляет собой популяцию клеток, одиночную клетку, популяцию клеточных ядер или ядро клетки.

19. Способ по п. 15, в котором CS1 применяют для дальнейшей апмлификации, молекулярного индексирования или для демультиплексирования молекул.

20. Способ по п. 15, в котором РНК конвертируют в первую цепь кДНК посредством обратной транскриптазы.

21. Способ по п. 15, дополнительно включающий выделение кДНК и гДНК из ядра клетки с применением выделения на колонке.

22. Способ по п. 21, дополнительно включающий тагментирование кДНК и гДНК для включения второй общей последовательности (CS2).

23. Способ по п. 16, в котором твердая подложка представляет собой субстрат, протравленную поверхность, лунку, покрытую лунку, герметичную лунку, матрицу, устройство проточной кюветы, микрожидкостный канал, гранулу, магнитную гранулу, колонку, каплю или микрочастицу.

24. Способ по п. 15, в котором анализ включает анализ ДНК, анализ РНК, анализ белков, тагментацию, амплификацию нуклеиновых кислот, секвенирование нуклеиновых кислот, получение библиотеки нуклеиновых кислот, анализ доступного для транспозазы хроматина с использованием секвенирования (ATAC-seq), транспозицию с сохранением смежности (CPT-seq), комбинаторное индексированное секвенирование одиночной клетки (SCI-seq) или амплификацию генома одиночной клетки или любую их комбинацию.

25. Способ по п. 15, в котором анализ включает одновременное создание библиотеки кДНК и библиотеки гДНК.

26. Способ по п. 15, дополнительно включающий одновременный анализ белка в одном компартменте, причем указанный белок помечен.

27. Способ по п. 15, в котором образец содержит клетку, и при этом клетка зафиксирована при помощи фиксатора.

28. Способ по п. 27, в котором фиксатор содержит спирт, такой как метанол или этанол, или альдегид, такой как параформальдегид.

29. Способ одновременного создания в одном компартменте библиотеки нуклеиновых кислот, содержащей гДНК и кДНК, включающий:

гибридизацию зонда захвата с РНК и с ДНК, таким образом одновременно захватывая ДНК и РНК;

конвертацию РНК в первую и/или вторую цепь кДНК; и

одновременное создание библиотеки кДНК и библиотеки гДНК из гибридизированных РНК и ДНК.

30. Способ по п. 29, в котором зонд захвата иммобилизован на твердой подложке.

31. Способ по п. 29, в котором зонд захвата дополнительно содержит последовательность распознавания субстрата.

32. Способ по п. 29, в котором CS1 применяют для дальнейшей апмлификации, молекулярного индексирования или для демультиплексирования молекул.

33. Способ по п. 29, в котором образец представляет собой популяцию клеток, одиночную клетку, популяцию клеточных ядер или ядро клетки.

34. Способ по п. 29, в котором РНК конвертируют в первую цепь кДНК посредством обратной транскриптазы.

35. Способ по п. 29, дополнительно включающий выделение кДНК и гДНК из ядра клетки с применением выделения на колонке.

36. Способ по п. 29, дополнительно включающий тагментирование кДНК и ДНК для включения второй общей последовательности (CS2).

37. Способ по п. 30, в котором твердая подложка представляет собой субстрат, протравленную поверхность, лунку, покрытую лунку, герметичную лунку, матрицу, устройство проточной кюветы, микрожидкостный канал, гранулу, магнитную гранулу, колонку, каплю или микрочастицу.

38. Способ по п. 29, в котором образец содержит клетку, и при этом клетка зафиксирована при помощи фиксатора.

39. Способ по п. 29, в котором фиксатор содержит спирт, такой как метанол или этанол, или альдегид, такой как параформальдегид.

40. Набор для одновременного анализа ДНК и РНК из образца в одном компартменте, содержащий:

реагенты для транспозиции; и

зонд захвата на основе поли-Т, выполненный с возможностью гибридизации с 3’ поли-А хвостом РНК и 3’ поли-А хвостом ДНК, причем указанный зонд захвата содержит первую общую последовательность (CS1).

41. Набор по п. 40, в котором зонд захвата содержит последовательность распознавания субстрата.

42. Набор по п. 40, в котором зонд захвата иммобилизован на твердой подложке.

43. Набор по п. 42, в котором твердая подложка представляет собой субстрат, протравленную поверхность, лунку, покрытую лунку, герметичную лунку, матрицу, устройство проточной кюветы, микрожидкостный канал, гранулу, магнитную гранулу, колонку, каплю или микрочастицу.