RU2821923C1 - METHOD FOR GENOTYPING POLYMORPHIC LOCUS rs7155973 (A>G) OF HSP90AA1 GENE IN HUMAN BY REAL-TIME PCR USING ALLELE-SPECIFIC FLUORESCENT PROBES - Google Patents
METHOD FOR GENOTYPING POLYMORPHIC LOCUS rs7155973 (A>G) OF HSP90AA1 GENE IN HUMAN BY REAL-TIME PCR USING ALLELE-SPECIFIC FLUORESCENT PROBES Download PDFInfo
- Publication number
- RU2821923C1 RU2821923C1 RU2024110877A RU2024110877A RU2821923C1 RU 2821923 C1 RU2821923 C1 RU 2821923C1 RU 2024110877 A RU2024110877 A RU 2024110877A RU 2024110877 A RU2024110877 A RU 2024110877A RU 2821923 C1 RU2821923 C1 RU 2821923C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- allele
- insdseq
- insdqualifier
- seq
- hsp90aa1
- Prior art date
Links
- 101150101510 Hsp90aa1 gene Proteins 0.000 title claims abstract description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 title claims abstract description 10
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 title claims abstract description 10
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 28
- 101001016865 Homo sapiens Heat shock protein HSP 90-alpha Proteins 0.000 abstract description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 abstract 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 21
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 102100034051 Heat shock protein HSP 90-alpha Human genes 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000007614 genetic variation Effects 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 238000000816 matrix-assisted laser desorption--ionisation Methods 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 2
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100507655 Canis lupus familiaris HSPA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100036988 Cyclin-dependent kinase 2-interacting protein Human genes 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 1
- 101000961318 Homo sapiens Ankyrin repeat domain-containing protein 9 Proteins 0.000 description 1
- 101000737869 Homo sapiens Cyclin-dependent kinase 2-interacting protein Proteins 0.000 description 1
- 101000648395 Homo sapiens Mitochondrial import receptor subunit TOM70 Proteins 0.000 description 1
- 101000782317 Homo sapiens Zinc finger protein 839 Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102100028811 Mitochondrial import receptor subunit TOM70 Human genes 0.000 description 1
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 1
- 102000005431 Molecular Chaperones Human genes 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 102100028642 Prostaglandin E synthase 3 Human genes 0.000 description 1
- 101710103638 Prostaglandin E synthase 3 Proteins 0.000 description 1
- 101001028753 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) Mitochondrial phosphate carrier protein Proteins 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 108010040002 Tumor Suppressor Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000001742 Tumor Suppressor Proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008676 import Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000012846 protein folding Effects 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000022983 regulation of cell cycle Effects 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
Abstract
Description
Область техники, к которой относится изобретение. Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярно-генетической диагностики, в частности к оценке однонуклеотидного полиморфизма rs7155973 (A>G) гена HSP90AA1 молекулярно-генетическим методом исследования.The technical field to which the invention relates. The invention relates to the field of biotechnology, molecular genetic diagnostics, in particular to the assessment of single nucleotide polymorphism rs7155973 (A>G) of the HSP90AA1 gene using a molecular genetic research method.
Уровень техники. Ген HSP90AA1 кодирует молекулярный шаперон, который способствует созреванию, поддержанию структуры и правильной регуляции специфических белков-мишеней, участвующих в контроле клеточного цикла и сигналинге. Динамически взаимодействует с различными ко-шаперонами, которые модулируют распознавание его субстрата [Woodford M. R. et al. The FNIP co-chaperones decelerate the Hsp90 chaperone cycle and enhance drug binding //Nature communications. - 2016. - Vol. 7. - №. 1. - P. 12037; Woodford M. R. et al. Tumor suppressor Tsc1 is a new Hsp90 co‐chaperone that facilitates folding of kinase and non‐kinase clients //The EMBO journal. - 2017. - Vol. 36. - №. 24. - P. 3650-3665]. Взаимодействует с рядом классов белков-клиентов. Играет решающую роль в импорте митохондрий [Young J. C., Hoogenraad N. J., Hartl F. U. Molecular chaperones Hsp90 and Hsp70 deliver preproteins to the mitochondrial import receptor Tom70 //Cell. - 2003. - Vol. 112. - №. 1. - P. 41-50]. Помимо своей шаперонной активности, он также играет роль в регуляции транскрипционного аппарата [Khurana N., Bhattacharyya S. Hsp90, the concertmaster: tuning transcription //Frontiers in oncology. - 2015. - Vol. 5. - P. 100.]. Таким образом, значимая роль данного гена в регуляции множества клеточных функций обусловливает проведение молекулярно-генетических исследований ассоциаций полиморфных вариантов HSP90AA1 в аспекте связи с заболеваниями человека, связанных с повреждением и неправильной регуляцией белков-мишеней.State of the art. The HSP90AA1 gene encodes a molecular chaperone that promotes the maturation, structure maintenance, and proper regulation of specific target proteins involved in cell cycle control and signaling. Dynamically interacts with various co-chaperones that modulate the recognition of its substrate [Woodford M. R. et al. The FNIP co-chaperones decelerate the Hsp90 chaperone cycle and enhance drug binding //Nature communications. - 2016. - Vol. 7. - No. 1. - P. 12037; Woodford M. R. et al. Tumor suppressor Tsc1 is a new Hsp90 co-chaperone that facilitates folding of kinase and non-kinase clients //The EMBO journal. - 2017. - Vol. 36. - No. 24. - P. 3650-3665]. Interacts with a number of classes of client proteins. Plays a crucial role in mitochondrial import [Young J. C., Hoogenraad N. J., Hartl F. U. Molecular chaperones Hsp90 and Hsp70 deliver preproteins to the mitochondrial import receptor Tom70 // Cell. - 2003. - Vol. 112. - No. 1. - P. 41-50]. In addition to its chaperone activity, it also plays a role in the regulation of the transcription apparatus [Khurana N., Bhattacharyya S. Hsp90, the concertmaster: tuning transcription //Frontiers in oncology. - 2015. - Vol. 5. - P. 100.]. Thus, the significant role of this gene in the regulation of many cellular functions determines the conduct of molecular genetic studies of associations of HSP90AA1 polymorphic variants in terms of connections with human diseases associated with damage and improper regulation of target proteins.
Ген HSP90AA1 (Gene ID: 3320) локализован на хромосоме 14q32.31. Согласно SNPinfo Web Server/ LD TAG SNP Selection [https://snpinfo.niehs.nih.gov/snpinfo/snptag.html] полиморфный вариант rs7155973 гена HSP90AA1 является таргетным (то есть репрезентативным однонуклеотидным полиморфизмом в геномной области с высокой степенью неравновесия по сцеплению с группами других полиморфных локусов, составляющих гаплотип). Однонуклеотидный полиморфизм rs7155973, позиция chr14:102083502 (GRCh38.p14) [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/rs7155973] локализован в интроне и характеризуется заменой A>C,G,T. Однако, аллели C и Т встречается с частотой <0.0000001 в европейских популяциях и также характеризуется низкой частотой в других популяциях мира, в связи с чем именно замена A>G является актуальной для исследований многофакторных болезней человека. С использованием биоинформатического ресурса SNPinfo Web Server/ Согласно биоинформатическому ресурсу GTEx Portal, генетический вариант rs7155973 (A>G) влияет на экспрессию генов HSP90AA1, ZNF839 в различных органах и тканях посредством eQTL-эффектов [https://gtexportal.org/home/snp/rs7155973]. Ресурс eQTLGen также показал cis-eQTL-опосредованное влияние rs7155973 на уровень экспрессии генов HSP90AA1, CINP, ANKRD9 в периферической крови [https://www.eqtlgen.org/]. Кроме того, обнаружена значительная связь rs7155973 с модификациями гистонов, маркирующими промоторы и энхансеры в различных тканях [https://pubs.broadinstitute.org/mammals/haploreg/detail_v4.2.php?query=&id=rs7155973]; влияние данного генетического варианта на связывание с транскрипционными факторами [http://atsnp.biostat.wisc.edu/search]. Это создает потребность в создании простого в исполнении, недорого и доступного исследователям, работающим в области генетической эпидемиологии, метода идентификации однонуклеотидного полиморфизма rs7155973 гена HSP90AA1.The HSP90AA1 gene (Gene ID: 3320) is localized on chromosome 14q32.31. According to SNPinfo Web Server/LD TAG SNP Selection [https://snpinfo.niehs.nih.gov/snpinfo/snptag.html], the polymorphic variant rs7155973 of the HSP90AA1 gene is a target (that is, a representative single nucleotide polymorphism in a genomic region with a high degree of linkage disequilibrium with groups of other polymorphic loci that make up the haplotype). Single nucleotide polymorphism rs7155973, position chr14:102083502 (GRCh38.p14) [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/rs7155973] is localized in the intron and is characterized by the substitution A>C,G,T. However, alleles C and T occur with a frequency of <0.0000001 in European populations and are also characterized by low frequency in other populations of the world, and therefore the A>G substitution is relevant for studies of multifactorial human diseases. Using the bioinformatics resource SNPinfo Web Server/ According to the bioinformatics resource GTEx Portal, the genetic variant rs7155973 (A>G) affects the expression of the HSP90AA1, ZNF839 genes in various organs and tissues through eQTL effects [https://gtexportal.org/home/snp /rs7155973]. The eQTLGen resource also showed a cis-eQTL-mediated effect of rs7155973 on the expression level of the HSP90AA1, CINP, ANKRD9 genes in peripheral blood [ https://www.eqtlgen.org/ ]. In addition, a significant association of rs7155973 with histone modifications marking promoters and enhancers in various tissues was found [https://pubs.broadinstitute.org/mammals/haploreg/detail_v4.2.php?query=&id=rs7155973]; the effect of this genetic variant on binding to transcription factors [http://atsnp.biostat.wisc.edu/search]. This creates a need to create a method for identifying the rs7155973 single nucleotide polymorphism of the HSP90AA1 gene that is simple to implement, inexpensive, and accessible to researchers working in the field of genetic epidemiology.
Известен способ анализа генетических вариаций в геноме человека методом секвенирования амплифицированных участков ДНК [Mardis E. R. DNA sequencing technologies: 2006-2016 //Nature protocols. - 2017. - Vol. 12. - №. 2. - P. 213-218]. Недостатками метода являются высокая стоимость оборудования и реагентов, что исключает широкое внедрение метода в экспериментальные исследования, особенно изучение многофакторных заболеваний, которые требуют большого размера выборок для обеспечения высокой мощности исследований.There is a known method for analyzing genetic variations in the human genome by sequencing amplified sections of DNA [Mardis E. R. DNA sequencing technologies: 2006-2016 //Nature protocols. - 2017. - Vol. 12. - No. 2. - P. 213-218]. The disadvantages of the method are the high cost of equipment and reagents, which excludes the widespread implementation of the method in experimental studies, especially the study of multifactorial diseases that require large sample sizes to ensure high power of studies.
Известен способ анализа генетических вариаций в геноме человека методом матричноактивированной лазерной десорбционно-ионизационной масс-спектрометрии (MALDI). Метод заключается в том, анализируемая ДНК переносится на подложку, где она кристаллизуется с матрицей. Затем кристаллизованные аналиты переносят, облучают лазером, вызывая десорбцию и ионизацию молекул в вакуумной камере. Положительно заряженные ионы ДНК ускоряются и мигрируют через вакуумную трубку к высокочувствительному детектору с разной скоростью в зависимости от массы ионов, что приводит к различному времени пролета. Используя время пролета отдельных ионизированных ДНК-аналитов, система определяет массу и отображает масс-спектр, идентифицирующий различные генетические мишени [Li D. et al. MALDI-TOF mass spectrometry in clinical analysis and research //ACS Measurement Science Au. - 2022. - Vol. 2. - №. 5. - P. 385-404]. Недостатками метода являются трудоемкость, высокая стоимость оборудования, высокая стоимость эксперимента, наличие высококвалифицированного персонала.There is a known method for analyzing genetic variations in the human genome using matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry (MALDI). The method involves transferring the DNA to be analyzed onto a substrate, where it crystallizes with a matrix. The crystallized analytes are then transferred and irradiated with a laser, causing desorption and ionization of the molecules in a vacuum chamber. Positively charged DNA ions are accelerated and migrate through a vacuum tube to a highly sensitive detector at different speeds depending on the mass of the ions, resulting in different times of flight. Using the time of flight of individual ionized DNA analytes, the system determines mass and displays a mass spectrum identifying various genetic targets [Li D. et al. MALDI-TOF mass spectrometry in clinical analysis and research //ACS Measurement Science Au. - 2022. - Vol. 2. - No. 5. - P. 385-404]. The disadvantages of the method are labor intensity, high cost of equipment, high cost of the experiment, and the presence of highly qualified personnel.
За прототип выбран коммерческий набор по генотипированию rs7155973 (A/G) HSP90AA1 (Assay C__29078186_20; каталог 4351379) компании ThermoFisher. Однако, генотипирование с использованием коммерческих наборов характеризуется высокой стоимостью, а информация о структуре необходимых для проведения ПЦР праймеров и аллель-специфических зондов является закрытой для исследователей, в связи с чем он не может быть воспроизведен при наличии стандартного набора оборудования и реактивов.The commercial genotyping kit rs7155973 (A/G) HSP90AA1 (Assay C__29078186_20; catalog 4351379) from ThermoFisher was selected as the prototype. However, genotyping using commercial kits is characterized by high cost, and information about the structure of primers and allele-specific probes necessary for PCR is closed to researchers, and therefore it cannot be reproduced with a standard set of equipment and reagents.
Таким образом, существует реальная потребность в создании быстрого, недорогого и легко воспроизводимого способа идентификации полиморфизма rs7155973 (A>G) гена HSP90AA1, с доступной всем исследователям структурой праймеров и аллель-специфических зондов, который мог бы использоваться в качестве «рутинного» метода генотипирования в любой ПЦР-лаборатории.Thus, there is a real need to create a fast, inexpensive and easily reproducible method for identifying the rs7155973 (A>G) polymorphism of the HSP90AA1 gene, with a structure of primers and allele-specific probes available to all researchers, which could be used as a “routine” genotyping method in any PCR laboratory.
Раскрытие сущности изобретения. Техническим результатом данного изобретения является разработка простого в исполнении и экономически целесообразного способа генотипирования однонуклеотидного полиморфизма rs7155973 (A>G), локализованного в позиции chr14:102083502 (GRCh38.p14) гена HSP90AA1 (Gene ID: 3320) методом полимеразной цепной реакции в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических сигнальных зондов, содержащие флуорофоры FAM и ROX.Disclosure of the invention. The technical result of this invention is the development of an easy-to-use and economically feasible method for genotyping the single nucleotide polymorphism rs7155973 (A>G), localized at position chr14:102083502 (GRCh38.p14) of the HSP90AA1 gene (Gene ID: 3320) using the polymerase chain reaction method in “real” mode time" using allele-specific signal probes containing FAM and ROX fluorophores.
Технический результат достигается тем, что идентификацию аллельных вариантов rs7155973 (A>G) гена HSP90AA1 осуществляют с использованием прямого праймера rs7155973 5′- ATCTTGCCTAGATCAATACCAGTTG-3′ (SEQ ID NO 1), обратного праймера rs7155973 5′-TGAAGGAGAACCAGAAACATATC-3′ (SEQ ID NO 2), rs7155973-A-аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда 5′-(FAM)CCTACAAGATTGTAAGAAC(RTQ1)-3′(SEQ ID NO 3),The technical result is achieved by the fact that the identification of allelic variants rs7155973 (A>G) of the HSP90AA1 gene is carried out using the forward primer rs7155973 5′- ATCTTGCCTAGATCAATACCAGTTG-3′ (SEQ ID NO 1), reverse primer rs7155973 5′-TGAAGGAGAACCAGAAACATATC-3′ ID NO 2), rs7155973-A-allele-specific fluorescently labeled probe 5′-(FAM)CCTACAAGATTGTAAGAAC(RTQ1)-3′(SEQ ID NO 3),
rs7155973 -G-аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда 5′-(ROX) CCTACAAGGTTGTAAGAAC(BHQ2)-3′ (SEQ ID NO 4). rs7155973 -G allele-specific fluorescently labeled probe 5′-(ROX) CCTACAAGGTTGTAAGAAC(BHQ2)-3′ (SEQ ID NO 4).
Изобретение поясняется следующей фигурой: дискриминация аллелей по локусу rs7155973 гена HSP90AA1 при генотипировании методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов по данным величин RFU (относительные единицы флуоресценции) на амплификаторе CFX96: генотипы rs7155973-A/A показаны оранжевыми кругами, генотипы rs7155973-A/G показаны зелеными треугольниками, генотипы rs7155973-G/G показаны голубыми квадратами; черным ромбом отмечен отрицательный контроль.The invention is illustrated by the following figure: discrimination of alleles at the rs7155973 locus of the HSP90AA1 gene when genotyping by real-time PCR using allele-specific fluorescent probes according to RFU values (relative fluorescence units) on a CFX96 amplifier: rs7155973-A/A genotypes are shown in orange circles, rs7155973-A/G genotypes are shown as green triangles, rs7155973-G/G genotypes are shown as blue squares; The black diamond indicates the negative control.
Работа над дизайном олигонуклеотидов включала несколько этапов:Work on the design of oligonucleotides included several stages:
1) С применением открытой базы данных Ensembl genome browser 109 [https://www.ensembl.org/index.html] выбран синвенс, фланкирующий искомую однонуклеотидную замену [A/G] rs7155973 HSP90AA1, и затем с помощью доступного онлайн программного обеспечения Primer3web version 4.1.0 [https://primer3.ut.ee/] подобрана последовательность олигонуклеотидов, используемых для проведения ПЦР-реакции: 1) Using the open database Ensembl genome browser 109 [https://www.ensembl.org/index.html], a synvenge flanking the desired single nucleotide substitution [A/G] rs7155973 HSP90AA1 was selected, and then using the available online software Primer3web version 4.1.0 [https://primer3.ut.ee/] the sequence of oligonucleotides used to carry out the PCR reaction has been selected:
прямой общий праймер rs7155973 5′-ATCTTGCCTAGATCAATACCAGTTG-3′ (SEQ ID NO 1), forward general primer rs7155973 5′-ATCTTGCCTAGATCAATACCAGTTG-3′ (SEQ ID NO 1),
обратный общий праймер rs7155973 5′-TGAAGGAGAACCAGAAACATATC-3′ (SEQ ID NO 2).reverse general primer rs7155973 5′-TGAAGGAGAACCAGAAACATATC-3′ (SEQ ID NO 2).
Размер амплифицируемого в ходе ПЦР фрагмента гена HSP90AA1 составляет 150 пар нуклеотидов: ATCTTGCCTAGATCAATACCAGTTGTAACAGTGCTACCTGAGTAGAAAACACACCCACAGAGCCTACAAG[A/G]TTGTAAGAACGACGTGTATGACTGTAACATAGTGTTCTCTTACCTGTGATATAATAGATATGTTTCTGGTTCTCCTTCA.The size of the HSP90AA1 gene fragment amplified during PCR is 150 nucleotide pairs: ATCTTGCCTAGATCAATACCAGTTGTAACAGTGCTACCTGAGTAGAAAACACACCCACAGAGCCTACAAG[A/G]TTGTAAGAACGACGTGTATGACTGTAACATAGTGTTCTCTTACCTGTGATATAATAGATATGTTTCTGGTTCTCCTTCA.
2). Для дизайна зондов пользовались практическими рекомендациями [Basu C. (ed.). PCR primer design. - New york : Humana Press, 2015]. В реакции использовались гидролизные зонды. Последовательность зонда подбирали таким образом, чтобы он отжигался на матрицу между прямым и обратным праймерами. Каждый зонд снабжали флуорофором и гасителем флуоресценции, спектр поглощения которого соответствует длинам волн спектра флуорофора. Для гашения флуоресценции FAM пользовались гасителем RTQ1; для гашения флуоресценции ROX - гасителем BHQ2. 2). For probe design, practical recommendations were used [Basu C. (ed.). PCR primer design. - New york: Humana Press, 2015]. Hydrolysis probes were used in the reaction. The probe sequence was selected so that it would anneal to the template between the forward and reverse primers. Each probe was equipped with a fluorophore and a fluorescence quencher whose absorption spectrum corresponded to the wavelengths of the fluorophore spectrum. To quench FAM fluorescence, we used the RTQ1 quencher; for ROX fluorescence quenching - BHQ2 quencher.
На основании изложенных критериев и практических рекомендаций были подобраны зонды со следующей структурой:Based on the stated criteria and practical recommendations, probes with the following structure were selected:
rs7155973-A-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5′-(FAM)CCTACAAGATTGTAAGAAC(RTQ1)-3′(SEQ ID NO 3), rs7155973-A-allele-specific fluorescently labeled probe 5′-(FAM)CCTACAAGATTGTAAGAAC(RTQ1)-3′(SEQ ID NO 3),
rs7155973-G-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5′-(ROX) CCTACAAGGTTGTAAGAAC(BHQ2)-3′ (SEQ ID NO 4). rs7155973-G allele-specific fluorescently labeled probe 5′-(ROX) CCTACAAGGTTGTAAGAAC(BHQ2)-3′ (SEQ ID NO 4).
3) Изготовление праймеров и зондов осуществлялось в сервисном центре НПК «Синтол», Москва.3) The production of primers and probes was carried out at the service center of NPK Syntol, Moscow.
4) С помощью практических экспериментов подобраны оптимальные условия для проведения генотипирования, которые включают следующие этапы: 50°C в течение 2 минут, 95°C в течение 10 минут, затем 39 циклов [95°C в течение 10 секунд и 52°C в течение 1 минуты].4) Using practical experiments, optimal conditions for genotyping were selected, which included the following steps: 50°C for 2 minutes, 95°C for 10 minutes, then 39 cycles [95°C for 10 seconds and 52°C for for 1 minute].
5) Разработанный способ был апробирован в лаборатории геномных исследований на 95 образцах ДНК здоровых индивидуумов биобанка НИИ генетической и молекулярной эпидемиологии КГМУ. Генотипирование осуществляли по данным величин RFU (относительные единицы флуоресценции) зондов с флуоресцентными красителями. По результатам генотипирования rs7155973 1 человек (1,05%) оказался гомозиготой по аллелю A (генотип A/A); 11 человек (11,58%) являлись гетерозиготами (генотип A/G), 83 человека (87,37%) индивидуумов оказались гомозиготами по аллелю G (генотип G/G).5) The developed method was tested in the laboratory of genomic research on 95 DNA samples of healthy individuals in the biobank of the Research Institute of Genetic and Molecular Epidemiology of KSMU. Genotyping was carried out according to the RFU (relative fluorescence units) values of probes with fluorescent dyes. According to the results of genotyping rs7155973, 1 person (1.05%) turned out to be homozygous for allele A (genotype A/A); 11 people (11.58%) were heterozygotes (genotype A/G), 83 people (87.37%) individuals were homozygous for the G allele (genotype G/G).
6) Валидацию способа проводили методом масс-спектрометрического анализа на геномном времяпролетном масс-спектрометре MassArray analyzer 4 (Agena Bioscience). Результаты обоих способов генотипирования полностью (100% генотипов) совпали. Однако патентуемый способ генотипирования полиморфного локуса rs7155973 (A>G) гена HSP90AA1 методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических зондов позволяет значительно (на 6 часов) сократить время проведения анализа, а также снижает себестоимость анализа (в 4-5 раз).6) Validation of the method was carried out by mass spectrometric analysis on a genomic time-of-flight mass spectrometer MassArray analyzer 4 (Agena Bioscience). The results of both genotyping methods completely coincided (100% of genotypes). However, a patented method for genotyping the polymorphic locus rs7155973 (A>G) of the HSP90AA1 gene using real-time PCR using allele-specific probes can significantly (by 6 hours) reduce the time of analysis, and also reduces the cost of analysis (by 4-5 once).
Осуществление изобретения.Implementation of the invention.
Способ осуществляют следующим образом:The method is carried out as follows:
1. Выделение ДНК из периферической венозной крови. На первом этапе к 0,5 мл крови добавляли 0,5 мл PBS и центрифугировали 10 мин при 12 тыс. об/мин. Надосадочную жидкость сливали, добавляли 1 мл PBS и вновь центрифугировали при тех же условиях. Надосадочную жидкость сливали, добавляли 200 мкл ТЕ-буфера, пипетировали до растворения осадка и затем последовательно добавляли 10 мкл 1% раствора додецилсульфата натрия SDS и 5 мкл протеиназы К. Пробирки инкубировали в термостате при t=37°C 12 ч. В ходе второго этапа проводили четыре последовательных центрифугирования с фенолом и хлороформом согласно протоколу методики (10 мин, 8 тыс. об/мин), после чего ДНК осаждали ледяным раствором 95% этилового спирта и центрифугировали 10 мин при 14,3 тыс. об/мин. По испарении спирта ДНК растворяли в 100 мкл деионизированной дистиллированной воды. Получаемый раствор ДНК в воде имел чистоту в диапазоне А260/280=1,5-2,0 и среднюю концентрацию около 180-200 нг/мкл.1. Isolation of DNA from peripheral venous blood. At the first stage, 0.5 ml of PBS was added to 0.5 ml of blood and centrifuged for 10 min at 12 thousand rpm. The supernatant was discarded, 1 ml of PBS was added and centrifuged again under the same conditions. The supernatant was discarded, 200 μl of TE buffer was added, pipetted until the sediment dissolved, and then 10 μl of 1% sodium dodecyl sulfate SDS and 5 μl of proteinase K were sequentially added. The tubes were incubated in a thermostat at t=37°C for 12 hours. During the second stage Four successive centrifugations with phenol and chloroform were performed according to the protocol (10 min, 8 thousand rpm), after which the DNA was precipitated with an ice-cold solution of 95% ethyl alcohol and centrifuged for 10 min at 14.3 thousand rpm. After the alcohol had evaporated, the DNA was dissolved in 100 μl of deionized distilled water. The resulting DNA solution in water had a purity in the range A260/280=1.5-2.0 and an average concentration of about 180-200 ng/μl.
2. Подготовка образцов ДНК к генотипированию. Качество выделенной ДНК оценивали по степени чистоты и концентрации раствора на спектрофотометре NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, США). Все анализируемые образцы ДНК были разведены деионизированной водой до концентрации 15-20 нг/мкл при А260/280=1,5-2,0.2. Preparation of DNA samples for genotyping. The quality of the isolated DNA was assessed by the degree of purity and concentration of the solution using a NanoDrop spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific, USA). All analyzed DNA samples were diluted with deionized water to a concentration of 15-20 ng/μl at A260/280=1.5-2.0.
3. Анализ полиморфизма rs7155973 (A>G) гена HSP90AA1 с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени с использованием аллель-специфических зондов. Для генотипирования использовали два фланкирующих праймера, прямой (SEQ ID NO 1) и обратный (SEQ ID NO 2), а также аллель-специфические зонды: A-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд (SEQ ID NO 3), G-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд (SEQ ID NO 4).3. Real-time polymerase chain reaction analysis of the rs7155973 (A>G) polymorphism of the HSP90AA1 gene using allele-specific probes. For genotyping, two flanking primers were used, forward (SEQ ID NO 1) and reverse (SEQ ID NO 2), as well as allele-specific probes: A-allele-specific fluorescently labeled probe (SEQ ID NO 3), G-allele- specific fluorescently labeled probe (SEQ ID NO 4).
ПЦР в «реальном времени» проводили в 25 мл реакционной смеси, содержащей 1,25 ЕД ДНК-полимеразы Hot Start Taq («Биолабмикс», Новосибирск, Россия), 20 нг ДНК, по 10 мкМ каждого праймера, по 5 мкМ каждого зонда, 0.03 мМ каждого dNTP, 2,5 мМ MgCl2; 1хПЦР-буфер [67 мМ Tris-HCl, pH 8,8, 16,6 мМ (NH4)2SO4, 0,01% Tween-20]. Реакция амплификации состояла из стадии нагревания до 50°C в течение 2 минут, 95°C в течение 10 минут, затем 39 циклов [95°C в течение 10 секунд и 52°C в течение 1 минуты].Real-time PCR was carried out in 25 ml of a reaction mixture containing 1.25 U of Hot Start Taq DNA polymerase (Biolabmix, Novosibirsk, Russia), 20 ng of DNA, 10 μM of each primer, 5 μM of each probe, 0.03 mM each dNTP, 2.5 mM MgCl2; 1xPCR buffer [67 mM Tris-HCl, pH 8.8, 16.6 mM (NH4)2SO4, 0.01% Tween-20]. The amplification reaction consisted of a heating step of 50°C for 2 minutes, 95°C for 10 minutes, then 39 cycles [95°C for 10 seconds and 52°C for 1 minute].
4. Генотипирование. При проведении ПЦР в амплификаторе с флуоресцентной детекцией (Bio-Rad CFX96 или аналогичном амплификаторе) генотипирование осуществляют по данным величин RFU (относительных единиц флуоресценции). Для rs7155973 (A>G) гена HSP90AA1 зонд с флуоресцентным красителем FAM соответствует аллелю A, зонд с красителем ROX - аллелю G (фиг. 1). На фигуре видно четкое разделение образцов на кластеры, где черный ромб соответствуют отрицательному контролю, кластер оранжевых кругов - соответствует зонду с флуоресцентным красителем FAM и позволяет идентифицировать гомозигот A/A. Кластер синих квадратов соответствует зонду с красителем ROX и позволяет идентифицировать гомозигот G/G. Кластер зеленых треугольников соответствует накоплению уровня флуоресценции по обоим зондам и позволяет идентифицировать гетерозигот A/G.4. Genotyping. When performing PCR in a cycler with fluorescent detection (Bio-Rad CFX96 or similar cycler), genotyping is carried out according to RFU (relative fluorescence units) values. For rs7155973 (A>G) of the HSP90AA1 gene, the probe with the fluorescent dye FAM corresponds to the A allele, and the probe with the ROX dye corresponds to the G allele (Fig. 1). The figure shows a clear division of the samples into clusters, where the black diamond corresponds to the negative control, the cluster of orange circles corresponds to the probe with the fluorescent dye FAM and allows the identification of A/A homozygotes. The cluster of blue squares corresponds to the ROX dye probe and allows the identification of G/G homozygotes. The cluster of green triangles corresponds to the accumulation of fluorescence levels for both probes and allows the identification of A/G heterozygotes.
Резюме.Summary.
Таким образом, разработан эффективный и недорогой способ для экспресс-идентификации полиморфного варианта rs7155973 (A>G) гена HSP90AA1 у человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов, который может быть использован в медицине при определении наследственной предрасположенности к развитию заболеваний, ассоциированных с носительством полиморфизмов гена HSP90AA1, а также в научных целях.Thus, an effective and inexpensive method has been developed for the rapid identification of the polymorphic variant rs7155973 (A>G) of the HSP90AA1 gene in humans using real-time PCR using allele-specific fluorescent probes, which can be used in medicine to determine hereditary predisposition to the development of diseases associated with carriage of HSP90AA1 gene polymorphisms, as well as for scientific purposes.
--->--->
<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?><?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>
<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing <!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing
1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">
<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Способ <ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Method
генотипирования полиморфного локуса rs7155973 (A G) гена HSP90AA1 у genotyping of the polymorphic locus rs7155973 (A G) of the HSP90AA1 gene in
человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением human by real-time PCR using
аллель-специфических флуоресцентных зондов.xml" softwareName="WIPO allele-specific fluorescent probes.xml" softwareName="WIPO
Sequence" softwareVersion="2.3.0" productionDate="2024-02-26">Sequence" softwareVersion="2.3.0" productionDate="2024-02-26">
<ApplicationIdentification> <ApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode> <IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText></ApplicationNumberText> <ApplicationNumberText></ApplicationNumberText>
<FilingDate></FilingDate> <FilingDate></FilingDate>
</ApplicationIdentification> </ApplicationIdentification>
<ApplicantFileReference>1879</ApplicantFileReference> <ApplicantFileReference>1879</ApplicantFileReference>
<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное <ApplicantName languageCode="ru">Federal state
бюджетное образовательное учреждение высшего образования;budgetary educational institution of higher education;
Курский государственный медицинский университет; Kursk State Medical University;
Министерства здравоохранения Российской Федерации,</ApplicantName>Ministry of Health of the Russian Federation,</ApplicantName>
<ApplicantNameLatin>Kursk State Medical <ApplicantNameLatin>Kursk State Medical
University</ApplicantNameLatin>University</ApplicantNameLatin>
<InventionTitle languageCode="ru">Способ генотипирования <InventionTitle languageCode="en">Genotyping method
полиморфного локуса rs7155973 (A>G) гена HSP90AA1 у человека polymorphic locus rs7155973 (A>G) of the HSP90AA1 gene in humans
методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением real-time PCR method using
аллель-специфических флуоресцентных зондов</InventionTitle>allele-specific fluorescent probes</InventionTitle>
<SequenceTotalQuantity>4</SequenceTotalQuantity> <SequenceTotalQuantity>4</SequenceTotalQuantity>
<SequenceData sequenceIDNumber="1"> <SequenceData sequenceIDNumber="1">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>25</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>25</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..25</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..25</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q2"> <INSDQualifier id="q2">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>atcttgcctagatcaataccagttg</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>atcttgcctagatcaataccagttg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="2"> <SequenceData sequenceIDNumber="2">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>23</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q4"> <INSDQualifier id="q4">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tgaaggagaaccagaaacatatc</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>tgaaggagaaccagaaacatatc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="3"> <SequenceData sequenceIDNumber="3">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q6"> <INSDQualifier id="q6">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>cctacaagattgtaagaac</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>cctacaagattgtaagaac</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="4"> <SequenceData sequenceIDNumber="4">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q8"> <INSDQualifier id="q8">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>cctacaaggttgtaagaac</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>cctacaaggttgtaagaac</INSDSeq_sequence>
</SequenceData></SequenceData>
</ST26SequenceListing></ST26SequenceListing>
</INSDSeq></INSDSeq>
<---<---
Claims (1)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2821923C1 true RU2821923C1 (en) | 2024-06-27 |
Family
ID=
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| НЕХАЕВ Е.С. и др., Функциональное аннотирование однонуклеотидных вариантов белков теплового шока: результаты биоинформатического анализа, Молодежная наука и современность: Материалы 87-ой Международной научной конференции студентов и молодых ученых, Курск, 2022, том 1, стр. 123-125. ENDER COSKUNPINAR et al., The significance of HSP90AA1, HSP90AB1 and HSP90B1 gene polymorphisms in a Turkish population with non-small cell lung cancer, Anticancer Res., 2014, vol. 34, no 2, pp. 753-757. YAMEI XUE et al., The association of rs11457523 in HSP90AA1 with idiopathic male infertility in the Chinese population, Andrologia., 2021, vol. 53, no 1, article number e13888. YAN-FENG ZOU et al., Single nucleotide polymorphisms of HSP90AA1 gene influence response of SLE patients to glucocorticoids treatment, Springerplus., 2016, vol. 5, article number 222. FLORA ZAGOURI et al., HSP90, HSPA8, HIF-1 alpha and HSP70-2 polymorphisms in breast cancer: a case-control study, Mol Biol Rep., 2012, vol. 39, no 12, * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2821923C1 (en) | METHOD FOR GENOTYPING POLYMORPHIC LOCUS rs7155973 (A>G) OF HSP90AA1 GENE IN HUMAN BY REAL-TIME PCR USING ALLELE-SPECIFIC FLUORESCENT PROBES | |
| RU2810474C1 (en) | METHOD OF GENOTYPING rs2901077 (C>T) POLYMORPHIC LOCUS OF C19orf53 GENE IN HUMANS BY REAL-TIME PCR USING ALLELE-SPECIFIC FLUORESCENT PROBES | |
| RU2829225C1 (en) | METHOD FOR GENOTYPING POLYMORPHIC LOCUS rs4926222 (G>A) OF DNAJB1 GENE IN HUMAN BY REAL-TIME PCR USING ALLELE-SPECIFIC FLUORESCENT PROBES | |
| RU2819835C1 (en) | METHOD FOR GENOTYPING POLYMORPHIC LOCUS rs7951676 (GT) OF C11orf58 GENE IN PERSON BY REAL-TIME PCR USING ALLELE-SPECIFIC FLUORESCENT PROBES | |
| RU2830245C1 (en) | METHOD FOR GENOTYPING POLYMORPHIC LOCUS rs6457452 (C>T) OF HSPA1B GENE IN HUMAN BY REAL-TIME PCR USING ALLELE-SPECIFIC FLUORESCENT PROBES | |
| RU2821905C1 (en) | METHOD FOR GENOTYPING POLYMORPHIC LOCUS rs706121 (C>T) OF THE BAG1 GENE IN HUMAN BY REAL-TIME PCR USING ALLELE-SPECIFIC FLUORESCENT PROBES | |
| RU2830244C1 (en) | METHOD FOR GENOTYPING POLYMORPHIC LOCUS rs4279640 (T>C) OF HSF1 GENE IN HUMAN BY REAL-TIME PCR USING ALLELE-SPECIFIC FLUORESCENT PROBES | |
| RU2819936C1 (en) | METHOD FOR GENOTYPING POLYMORPHIC LOCUS rs3802963 (CG) OF C11orf58 GENE IN HUMANS BY REAL-TIME PCR USING ALLELE-SPECIFIC FLUORESCENT PROBES | |
| RU2828867C1 (en) | METHOD FOR GENOTYPING POLYMORPHIC LOCUS rs910652 (T>C) OF HSPA12B GENE IN PERSON BY REAL-TIME PCR USING ALLELE-SPECIFIC FLUORESCENT PROBES | |
| RU2819930C1 (en) | METHOD FOR GENOTYPING POLYMORPHIC LOCUS rs10832676 (A>G) OF C11orf58 GENE IN HUMANS BY REAL-TIME PCR USING ALLELE-SPECIFIC FLUORESCENT PROBES | |
| RU2824973C1 (en) | METHOD FOR GENOTYPING POLYMORPHIC LOCUS rs4757429 (C>T) OF C11orf58 GENE IN HUMAN BY REAL-TIME PCR USING ALLELE-SPECIFIC FLUORESCENT PROBES | |
| RU2820349C1 (en) | METHOD FOR GENOTYPING POLYMORPHIC LOCUS rs10766342 (GA) OF C11orf58 GENE IN HUMAN BY REAL-TIME PCR USING ALLELE-SPECIFIC FLUORESCENT PROBES | |
| RU2820348C1 (en) | METHOD FOR GENOTYPING POLYMORPHIC LOCUS rs11024032 (CT) OF C11orf58 GENE IN HUMANS BY REAL-TIME PCR USING ALLELE-SPECIFIC FLUORESCENT PROBES | |
| RU2825464C1 (en) | METHOD FOR GENOTYPING POLYMORPHIC LOCUS rs648595 (T>G) OF GCLC GENE IN HUMAN BY REAL-TIME PCR USING ALLELE-SPECIFIC FLUORESCENT PROBES | |
| RU2810472C1 (en) | METHOD OF GENOTYPING rs11666524 (G>A) POLYMORPHIC LOCUS OF C19orf53 GENE IN HUMANS BY REAL-TIME PCR USING ALLELE-SPECIFIC FLUORESCENT PROBES | |
| RU2819255C1 (en) | Method for genotyping a polymorphic locus rs11024030 (t>c) of the c11orf58 gene in a human by real-time pcr using allele-specific fluorescent probes | |
| RU2828869C1 (en) | METHOD FOR GENOTYPING POLYMORPHIC LOCUS rs1043618 (G>C) OF HSPA1A GENE IN HUMAN BY REAL-TIME PCR USING ALLELE-SPECIFIC FLUORESCENT PROBES | |
| RU2831059C1 (en) | METHOD FOR GENOTYPING POLYMORPHIC LOCUS rs111837807 (T>C) OF CCHCR1 GENE IN HUMAN BY REAL-TIME PCR USING ALLELE-SPECIFIC FLUORESCENT PROBES | |
| RU2828035C1 (en) | METHOD FOR GENOTYPING POLYMORPHIC LOCUS rs862832 (CT) OF HSPA12B GENE IN HUMAN BY REAL-TIME PCR USING ALLELE-SPECIFIC FLUORESCENT PROBES | |
| RU2825466C1 (en) | METHOD FOR GENOTYPING POLYMORPHIC LOCUS rs7928675 (A>C) OF C11orf58 GENE IN HUMAN BY REAL-TIME PCR USING ALLELE-SPECIFIC FLUORESCENT PROBES | |
| RU2808846C1 (en) | METHOD OF GENOTYPING rs8107914 (CT) POLYMORPHIC LOCUS OF C19orf53 GENE IN HUMANS BY REAL-TIME PCR USING ALLELE-SPECIFIC FLUORESCENT PROBES | |
| RU2824979C1 (en) | METHOD FOR GENOTYPING POLYMORPHIC LOCUS rs4757430 (A>G) OF C11orf58 GENE IN HUMAN BY REAL-TIME PCR USING ALLELE-SPECIFIC FLUORESCENT PROBES | |
| RU2819840C1 (en) | METHOD FOR GENOTYPING POLYMORPHIC LOCUS rs6677 (T>G) OF C11orf58 GENE IN HUMAN BY REAL-TIME PCR USING ALLELE-SPECIFIC FLUORESCENT PROBES | |
| RU2832336C1 (en) | METHOD FOR GENOTYPING POLYMORPHIC LOCUS rs3203295 (A>C) OF C11orf58 GENE IN HUMAN BY REAL-TIME PCR USING ALLELE-SPECIFIC FLUORESCENT PROBES | |
| RU2828034C1 (en) | METHOD FOR GENOTYPING POLYMORPHIC LOCUS rs196329 (AG) OF THE BAG3 GENE IN HUMAN BY REAL-TIME PCR USING ALLELE-SPECIFIC FLUORESCENT PROBES |