RU2821568C1 - Рекомбинантная генетическая конструкция, аденоассоциированный вирус для терапии метахроматической лейкодистрофии - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии. Заявлена рекомбинантная генетическая конструкция для сверхэкспрессии фермента арилсульфатазы А, содержащая промотор гибридного энхансера CMV/куриного β-актина и кодон-оптимизированную последовательность гена ARSA, представленная SEQ ID NO: 1. Также заявлен аденоассоциированный вирус серотипа Olig001 для терапии метахроматической лейкодистрофии, содержащий рекомбинантную генетическую конструкцию по п. 1. Изобретение позволяет осуществлять терапию метахроматической лейкодистрофии. 2 н.п. ф-лы, 5 ил., 3 пр.

Description

Заявленная группа изобретений в целом относится к области медицины, более точно - к генной терапии болезни, неизлечимой на дату представления заявочных материалов - метахроматической лейкодистрофии (МЛД), представляющей собой тяжелое наследственное нейродегенеративное заболевание, возникающее вследствие дефицита лизосомного фермента арилсульфатазы A (ARSA). В результате дефицит ARSA приводит к поражению миелиновой оболочки нервных волокон центральной (ЦНС) и периферической нервной системы (ПНС), покрывающей большинство нервных волокон центральной (ЦНС) и периферической нервной системы (ПНС). В заявленном техническом решении разработана рекомбинантная генетическая конструкция, содержащая промотор гибридного энхансера CMV/куриного β-актина (CMVenCBh) и кодон-оптимизированную последовательность гена ARSA, на базе которой получен аденоассоциированный вирус серотипа Olig001 (AAVOlig001-CMVenCBh-coARSA).

Рекомбинантная генетическая конструкция, содержащая промотор гибридного энхансера CMV/куриного β-актина и кодон-оптимизированную последовательность гена ARSA,

Способ лечения метахроматической лейкодистрофии позволяет восстановить дефицит фермента ARSA в нервной системе пациента с МЛД, способствуя прекращению прогрессии МЛД, вследствие чего наступает излечение от данной болезни.

Далее в целях исключения неоднозначного понимания текста заявителем приведены использованные в заявочном материале термины и их расшифровка:

ГСК - гемопоэические стволовые клетки;

ГЭБ - гемато-энцефалический барьер;

кДНК - комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота;

КМ - костный мозг;

МЛД - метахроматическая лейкодистрофия;

мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота;

ПНС - периферическая нервная система;

СМЖ - спинномозговая жидкость;

ЦНС - центральная нервная система;

pAAV -CMVenCBh-ARSA - плазмидный вектор, кодирующий кодон оптимизированную последовательность гена ARSA, содержащий промотр CMVenCBh;

AAV - аденоассоциированный вирус;

AAVOlig001-CMVenCBh-coARSA - аденоассоциированный вирус серотипа Olig001, содержащий уникальную последовательность кодон-оптимизированного гена ARSA, содержащий промотр CMVenCBh;

ARSA - фермент арилсульфаза А;

ARSA - ген, кодирующий арилсульфатазу А;

CMVenCBh - промотор гибридного энхансера CMV/куриного β-актина (CBh);

ИГХ - иммуногистохимический анализ.

Индекс адаптации кодонов (CAI) - это наиболее распространенный метод анализа систематической ошибки использования кодонов. CAI измеряет отклонение кодирования белка, последовательность гена по отношению к эталонному набору генов. CAI используется в качестве количественного метода прогнозирования уровня экспрессии гена на основе его кодоновой последовательности.

GC состав - доля гуанина (G) и цитозина (C) среди всех нуклеотидов рассматриваемой нуклеотидной последовательности.

Шпилька - нуклеиновые кислоты, которые образуются, когда две последовательности комплементарны друг к другу и соединяются друг с другом, перегибаясь одна к другой и образуя на конце неспаренный участок - петлю.

Метахроматическая лейкодистрофия - это редкое наследственное заболевание из группы лизосомных болезней накопления с аутосомно-рецессивным механизмом наследования нарушения обмена веществ. На дату представления заявленного технического решения лекарства для лечения МЛД из исследованного уровня техники не выявлены. Терапия сводится к купированию болевого синдрома и симптомов заболевания. В случае мягких форм болезни, характеризующихся умеренными проявлениями клинической картины, существует возможность трансплантации костного мозга. Однако эти методики только разрабатываются и проходят клинические испытания, в результате которых будет выяснена возможность замедления прогрессирования болезни, а также возможность полной остановки развития патологического процесса на уровне клеток центральной нервной системы.

Краткая суть заболевания заключается в накоплении сульфатидов, содержащихся в миелине, а также в различных клетках и тканях организма, но преимущественно в клетках ЦНС и ПНС. Накопление возникает из-за дефицита лизосомного фермента ARSA. Нарушения в функционировании или недостаточность фермента ARSA возникает из-за мутаций генов ARSA.

При МЛД сульфатиды накапливаются в олигодендроцитах, микроглии, некоторых нейронах ЦНС, шванновских клетках, макрофагах ПНС, а также в клетках внутренних органов, например, желчного пузыря, из-за чего повышается вероятность возникновения злокачественных новообразований данного органа [McFadden K., Ranganathan S., Pathology of the gallbladder in a child with metachromatic leukodystrophy. Pediatr Dev Pathol, 2015. 18(3): p. 228-230]. Клинические проявления и степень нейродегенерации при МЛД разнообразны и зависят от типа (вида) мутации и степени дефицита фермента. МЛД подразделяют на позднюю инфантильную, ювенильную и взрослую формы [Brown T.M., et al., Development of the Impact of Juvenile Metachromatic Leukodystrophy on Physical Activities scale, 2017. 2(1): p. 15.]. Клиническая манифестация при поздней инфантильной форме МЛД начинается до 3 лет. Эта форма считается самой тяжелой и характеризуется серьезным дефицитом ARSA, что влечет за собой быструю нейродегенерацию. Кроме поражения ЦНС, выявляется периферическая невропатия. Ювенильная форма развивается в возрасте 3-16 лет и характеризуется менее выраженным клиническим проявлением в сравнении с поздней инфантильной формой. При поздней инфантильной и ранней ювенильной формах наблюдаются быстрая прогрессия заболевания и при отсутствии терапии смерть наступает в течение нескольких лет от начала заболевания. Клиническая манифестация при взрослой форме МЛД начинается обычно после 16 лет. Взрослая форма МЛД прогрессирует медленно, часто ошибочно диагностируется как деменция с ранним началом или шизофрения.

Заявленное техническое решение основывается на идее того, что доставка фермента ARSA в ЦНС пациентов с МЛД позволяет остановить прогрессирование заболевания за счет восстановления метаболизма сульфатидов, накопление которых приводит к развитию нейродегенерации у пациентов с МЛД. Заявленное техническое решение заключается в обеспечении возможности доставки ARSA с использованием известных как таковых методов генной терапии. Известно, что AAV используют для терапии ряда генетических заболеваний. При этом серотип Olig001 пользуется преимущественным тропизмом к клеточной поверхности олигодендроцитов, а олигодендроциты особенно сенситивны к патологическому лизосомальному накоплению, что ведет к демиелинизации и прогрессирующей дисфункции нервной системы. Промотор гибридного энхансера CMV/куриного β-актина (CBh) (CMVenCBh) обеспечивает более долгую и сильную экспрессию фермента. Таким образом, для экспрессии трансгена, используя серотип нацеленного на олигодендроциты и сильный промотор, достижение максимального эффекта генной терапии становится возможным. Указанный технический результат становится возможным вследствие интратекального введения AAVOlig001-CMVenCBh-coARSA, который позволяет предотвратить развитие МЛД. Заявленное техническое решение обеспечивает возможность восполнения дефицита фермента ARSA в ЦНС и ПНС и, как следствие, обеспечивает возможность излечения наследственной болезни.

Заявленное техническое решение предоставляет возможность решения технической проблемы восстановления ферментативной активности ARSA в организме человека и, как следствие, улучшения качества жизни пациентов с МЛД c помощью AAVOlig001-CMVenCBh-coARSA, что соответствует условиям патентоспособности, предъявляемым к изобретениям, а именно - мировая новизна и изобретательский уровень.

Полученный AAV, полученный на основе рекомбинантной генетической конструкции, обеспечивает возможность доставки недостающего фермента ARSA в ЦНС и ПНС, вследствие чего, по мнению заявителя, обеспечивается возможность остановки нейродегенерации и улучшения качества жизни пациентов.

Таким образом, из исследованного заявителем уровня техники выявлено, что МЛД представляет собой тяжелое наследственное нейродегенеративное заболевание, обусловленное дефицитом фермента ARSA, вследствие которого происходит накопление сульфатидов содержащихся в миелине, в результате демиелинизации развивается тяжелая нейродегенерация и нейровоспаление нервной системы человека. Решение указанной проблемы представляется актуальной ввиду отсутствия на дату представления заявленного технического решения эффективных способов терапии МЛД.

На дату представления заявочных материалов выявлено, что для лечения используется преимущественно симптоматическая терапия, при этом также активно исследуются новые подходы к терапии этих заболеваний.

Известно лекарственное средство, а именно - препарат Libmeldy на основе гемопоэтических стволовых клеток, трасдуцированных лентивирусом [https://www.libmeldy.eu/], характеризуется высокой стоимостью - 2,8 млн долларов, однако при лечении указанным препаратом у пациентов, у которых уже были симптомы заболевания на момент терапии, лечение не оказывает благоприятного и эффективного воздействия на двигательную активность человека.

Кроме того, выявлены находящиеся на стадии разработки перспективные терапевтические стратегии, которые активно исследуются на дату представления заявочных материалов, а именно:

- трансплантация костного мозга или гемопоэтических стволовых клеток [Hematopoietic Stem Cell Transplantation with Mesenchymal Stromal Cells in Children with Metachromatic Leukodystrophy, Karin Melanie Cabanillas Stanchi et al., 2022],

- фермент-заместительная терапия [Efficacy of enzyme replacement therapy in an aggravated mouse model of metachromatic leukodystrophy declines with age, Frank Matthes, et al., 2012]

- восстановление экспрессии функционального фермента с использованием методов генной терапии [https://www.libmeldy.eu/].

Однако эти методы терапии не показывают необходимого уровня эффективности.

По мнению заявителя, недостаточная эффективность известных подходов, таких как фермент-заместительная терапия, связана с тем, что при внутривенном введении лекарственные средства плохо преодолевают ГЭБ. При этом, по мнению заявителя, повышению эффективности лечения может способствовать прямая инъекция в головной мозг рекомбинантного фермента ARSA, в силу отсутствия необходимости преодоления ГЭБ. Однако такие подходы трудно применимы к человеку, поскольку существуют достаточно серьёзные проблемы:

- необходимость серьезного хирургического вмешательства,

- плохое биораспределение терапевтического препарата и, как следствие, необходимость во множественных инъекциях.

Тем не менее, такие подходы активно исследуются и проходят на дату представления заявочных материалов клинические испытания.

Таким образом, по мнению заявителя, генная терапия с использованием вирусных векторов, способных преодолевать ГЭБ, может оказаться весьма эффективной для лечения МЛД.

Одной из самых безопасных и эффективных стратегий генной терапии, по мнению заявителя, является применение препаратов на основе рекомбинантных AAV, которые являются наиболее эффективными (перспективными) векторами для доставки ARSA в нервную систему человека.

При этом следует акцентировать внимание на то, что AAV могут транссинаптически инфицировать нейроны в широком диапазоне от места инъекции через антероградный транспорт [Zingg, B. et al. AAV-Mediated Anterograde Transsynaptic Tagging: Mapping Corticocollicular Input-Defined Neural Pathways for Defense Behaviors. Neuron 2017, 93, 33-47]. Доказательством такого утверждения является то, что введение AAV5-ARSA в мозг мышей с моделью МЛД позволило добиться продолжительной экспрессии гена ARSA в головном мозге [Sevin, C. et al. Intracerebral adeno-associated virus-mediated gene transfer in rapidly progressive forms of metachromatic leukodystrophy].

Перспективные результаты были также получены с использованием AAV9, кодирующего ARSA и репортерный ген зеленого флуоресцентного белка. А именно, введение AAVrh.10-ARSA в мозг восьмимесячных мышей с моделью МЛД привело к коррекции накопления определенных видов сульфатидов в олигодендроцитах. В фазе I/II клинического исследования данного вируса (см. исследование NCT01801709) подопытные животные получали 12 инъекций трансдуцирующих единиц AAVrh.10-ARSA в белое вещество головного мозга. При этом у подопытных животных с ранней стадией симптомы продолжали ухудшаться. Однократное внутривенное введение мышам с моделью МЛД AAVPHP.eB-hARSA-HA привело к устойчивой экспрессии фермента ARSA в головном и спинном мозге и показало полную коррекцию накопления сульфатидов в спинном мозге модельных животных.

Трансплантация костного мозга (КМ) и гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) также часто используется для терапии МЛД и других ЛБН, поскольку клетки здорового донора синтезируют нормальный фермент на физиологическом уровне и в некоторых случаях, как правило при менее агрессивных формах заболевания, данная процедура помогает увеличивать активность фермента и смягчать симптомы заболевания. Однако трансплантация КМ и ГСК без дополнительной генетической модификации не всегда имеет достаточно высокий и стойкий терапевтический эффект при лечении ЛБН в целом.

Таким образом, вышеописанные методы лечения МЛД являются недостаточно эффективными, вследствие чего является актуальной проблема поиска новых препаратов и методов лечения.

Заявителем проведен анализ выявленного уровня техники по научной и патентной информации в области терапии МЛД и выявлен ряд аналогов, которые используются в настоящее время для облегчения симптомов и для остановки усугубления нейродегенерации.

Из исследованного уровня техники выявлен ряд функциональных (по назначению) и структурных аналогов, применяющихся для лечения известных в мире лизосомных болезней накопления, практически неизлечимых на дату представления заявочных материалов.

Известно изобретение по патенту WO2023133584 «Композиции, полезные для лечения метахроматической лейкодистрофии». Сущностью является рекомбинантный аденоассоциированный вирус с дефектом репликации (rAAV), который можно использовать для лечения заболевания, связанного с мутацией гена арилсульфатазы А (ARSA) rAAV содержит векторный геном, содержащий инвертированные концевые повторы (ITR) и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую функциональную арилсульфатазу А человека (hARSA) под контролем регуляторных последовательностей, которые направляют экспрессию hARSA в клетке-мишени. Формула изобретения: 1. Фармацевтическая композиция для применения при лечении метахроматической лейкодистрофии или заболевания, связанного с мутацией гена арилсульфатазы А (ARSA), причем указанная композиция содержит рекомбинантный аденоассоциированный вирус (rAAV), содержащий капсид AAVhu68; и векторный геном), содержащий: 5'-инвертированные концевые повторы AAV (ITR), промотор CB7, содержащий энхансер CMV IE и промотор CB, и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую функциональную арилсульфатазу А человека (hARSA), функционально связанную с регуляторной последовательности, содержащие промотор CB7, который направляет экспрессию hARSA, сигнал полиА и 3'-AAV ITR, где кодирующая последовательность hARSA содержит последовательность от нуклеотида (nt) 1 до nt 1521 SEQ ID NO: 1 или последовательность, по меньшей мере, от 95% до 99,9% идентичен ему, который кодирует функциональный hARSA; и по меньшей мере один водный буфер, по меньшей мере один носитель, по меньшей мере один наполнитель и/или по меньшей мере один консервант,указанная композиция доставляется в виде однократной терапевтической дозы путем интратекального введения. 2. Фармацевтическая композиция по п.1, где регуляторные элементы дополнительно содержат одно или более из последовательности Козака, интрона, дополнительного энхансера и/или сигнала ТАТА. 3. Фармацевтическая композиция по п. 1 или 2, где последовательность, кодирующая hARSA, представляет собой SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3. 4. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-3, где векторный геном содержит 5'-AAV ITR, кассету экспрессии, имеющую последовательность SEQ ID NO: 28, и 3'-AAV ITR. 5. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 1-4, где 5'-ITR AAV имеет последовательность SEQ ID NO: 25 и/или 3'-ITR AAV имеет последовательность SEQ ID NO: 26. 6. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-5, где векторный геном содержит нт 1-нт 3883 SEQ ID NO: 5 (SEQ ID NO: 27). 7. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 1-6, где капсид AAVhu68 получен из последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7. 8. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-5, где композиция содержит искусственную спинномозговую жидкость, содержащую забуференный физиологический раствор и один или более из натрия, кальция, магния, калия или их смесей; и поверхностно-активное вещество, причем поверхностно-активное вещество необязательно присутствует в количестве от 0,0005% до примерно 0,001% фармацевтической композиции и/или где композиция имеет pH в диапазоне от 6,5 до 8,5. 9. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-8, где композиция пригодна для инъекции в большую цистему (ICM) или интрацеребровентрикулярного введения. 10. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-8, где разовая доза содержит от 3×10 10 копий генома (GC)/грамм массы мозга до 3,5×10 11 GC/грамм массы мозга. 11. Фармацевтическая композиция по п.10, где доза составляет: (а) около 3,3×10 10 копий генома (GC)/грамм массы мозга; (б) около 1,1×10 11 копий генома (GC)/грамм массы мозга; или (в) около 3,3×10 11 копий генома (GC)/грамм массы мозга. 12. Использование rAAV.hARSA в производстве лекарственного средства для терапевтического лечения метахроматической лейкодистрофии или заболевания, связанного с мутацией гена арилсульфатазы А (ARSA), причем указанное лекарственное средство полезно после интратекального введения разовой дозы, содержащей 3×10. От 10 копий генома (GC)/грамм массы мозга до 3,5 x 10 11 GC/грамм массы мозга у пациента. 13. Применение по п.12, где доза составляет: (а) около 3,3×10 10 копий генома (GC)/грамм массы мозга; (б) около 1,1×10 11 копий генома (GC)/грамм массы мозга; или (в) около 3,3×10 11 копий генома (GC)/грамм массы мозга. 14. Применение по п.11 или 12, где rAAV содержит капсид AAVhu68 и векторный геном, причем указанный векторный геном содержит: 5'-инвертированные концевые повторы AAV (ITR), промотор CB7, содержащий энхансер CMV IE и промотор CB. и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую функциональную арилсульфатазу А человека (hARSA), функционально связанную с регуляторными последовательностями, содержащими промотор CB7, который направляет экспрессию hARSA, сигнал полиА и 3'-AAV ITR, где последовательность, кодирующая hARSA, содержит последовательность нуклеотидов (nt) от 1 до nt 1521 SEQ ID NO: 1 или последовательность, по меньшей мере, на 95-99,9% идентичную ей, которая кодирует функциональный hARSA. 15. Способ лечения субъекта, страдающего метахроматической лейкодистрофией или заболеванием, связанным с мутацией гена арилсульфатазы А (ARSA), причем способ включает введение субъекту однократной дозы рекомбинантного AAV путем инъекции ICM, при этом рекомбинантный AAV содержит AAVhu68. капсид и векторный геном, упакованный в него, причем указанный векторный геном содержит ITR AAV, последовательность, кодирующую hARSA, содержащую SEQ ID NO: 1, или последовательность, по меньшей мере, на 95% идентичную ей, которая кодирует функциональный hARSA, и регуляторные последовательности, которые направляют экспрессию функционального hARSA в клетке-мишени, где однократная доза представляет собой (i) примерно 3,3×10 10 копий генома (GC)/грамм массы мозга; (ii) около 1,1×10 11 GC/грамм массы мозга; или (iii) около 3,3×10 11 GC/грамм массы мозга. 16. Способ по п.15, где rAAV содержит капсид AAVhu68; и векторный геном, содержащий: 5'-инвертированные концевые повторы AAV (ITR), промотор CB7, содержащий энхансер CMV IE и промотор CB, и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую функциональную арилсульфатазу А человека (hARSA), функционально связанную с регуляторными последовательностями, содержащими промотор CB7, который управляет экспрессией hARSA, сигналом полиА и 3'-AAV ITR, где кодирующая последовательность hARSA содержит последовательность от нуклеотида (nt) 1 до nt 1521 SEQ ID NO: 1 или последовательность, по меньшей мере, 95% на 99,9% идентичен ему, который кодирует функциональный hARSA.

Применение вектора, описанного в известном техническом решении, имеет недостаток - нейротропность AAVhu68. ARSA должен быть доставлен в олигодендроциты головного мозга пациентов МЛД, однако AAVhu68 не имеет таких свойств, что уменьшает эффективность препарата при использовании по назначению.

Для решения указанной проблемы необходима разработка более эффективного способа - доставка гена недостающего фермента. AAVOlig001-CMVenCBh-coARSA имеет способность трасдуцировать олигодендроциты, что позволит остановить нейродегенерацию и восстановить уровень фермента ARSA.

Из исследованного уровня техники выявлено изобретение по патенту RU2692251C2 «Опосредованный аденоассоциированным вирусом перенос генов в центральную нервную систему». Краткой сущностью известного технического решения является способ предотвращения или лечения мукополисахаридоза типа I у человека, заключающийся в интратекальном введении композиции, на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV) 9 и rh10 серотипов, содержащего открытую рамку считывания, кодирующую альфа-L-идуронидазу, сущностью является Способ предотвращения, ингибирования или лечения одного или нескольких симптомов мукополисахаридоза типа I (MPS I) у человека, включающий интратекальное введение нуждающемуся в этом человеку композиции, содержащей эффективное количество вектора на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV), содержащего открытую рамку считывания, кодирующую альфа-L-идуронидазу для предотвращения, ингибирования или лечения одого или нескольких симптомов MPS I, причем rAAV представляет собой rAAV9 или rAAVrh10. 2. Способ по п. 1, в котором человек представляет собой взрослого человека. 3. Способ по п. 1, дополнительно включающий введение человеку эффективного количества усилителя проницаемости. 4. Способ по п. 3, при котором композиция содержит усилитель проницаемости. 5. Способ по п. 3 или 4, при котором усилитель проницаемости содержит маннитол, гликохолат натрия, таурохолат натрия, дезоксихолат натрия, салицилат натрия, каприлат натрия, капрат натрия, лаурилсульфат натрия, полиоксиэтилен-9-лауриловый эфир или ЭДТА. 6. Способ по п. 1, дополнительно включающий введение человеку иммунносупрессанта. 7. Способ по п. 6, при котором иммунносупрессант содержит циклофосфамид. 8. Способ по п. 6, при котором иммунносупрессант содержит глюкокортикоид, цитостатические средства, включающие в себя алкилирующее средство, антиметаболит, цитотоксический антибиотик, антитело или активное к иммунофилину средство. 9. Способ по п. 7 или 8, при котором иммунносупрессант содержит азотистый иприт, нитрозомочевину, соединение платины, метотрексат, азатиоприн, меркаптопурин, фторурацил, дактиномицин, антрациклин, митомицин С, блеомицин, митрамицин, направленные на рецептор ИЛ-2 (CD25-) или CD3- антитела, антитела к ИЛ-2, циклоспорин, такролимус, сиролимус, IFN-β, IFN-γ, опиоид или связывающее TNF-α (фактор некроза опухоли-альфа) средство. 10. Способ по п. 6, при котором rAAV и иммунносупрессант вводят совместно или иммунносупрессант вводят после введения rAAV. 11. Способ по п. 6, при котором иммунносупрессант вводят интратекально. 12. Способ по п. 6, при котором иммунносупрессант вводят интрацеребровентрикулярно. 13. Способ по п. 1, в котором человек является иммунологически толерантным к альфа-L-идуронидазе. 14. Способ по любому из пп. 1-13, при котором альфа-L-идуронидаза повреждена или находится в дефиците у человека, в результате чего развивается лизосомная болезнь накопления. 15. Способ по любому из пп. 1-13, при котором человек представляет собой иммунокомпетентное взрослое млекопитающее. 16. Способ по любому из пп. 1-13, при котором вектор rAAV представляет собой вектор rAAV-9. 17. Способ по любому из пп. 1-13, при котором вектор rAAV представляет собой вектор rAAV rh10.

Таким образом, в известном изобретении описывается интратекальная доставка rAAV9 и вектор rAAVrh10 для предотвращения, ингибирования или лечения одного или нескольких симптомов MPS I, имеющего отсутствие или недостаток связанного с накоплениями лизосомального фермента.

Однако не исследовался терапевтический эффект векторов, содержащих эти капсиды конкретно для терапии МЛД. Для решения такой проблемы необходима разработка и исследование специфичных векторов, содержащих именно ген ARSA, а также способы, позволяющие безопасно модифицировать клетки всей нервной системы на долговременную экспрессию здорового гена.

Использование AAVOlig001-CMVenCBh-coARSA позволяет добиться высокого уровня трансдукции клеток нервной системы, за счет способности данных векторов к нейротропизму и эффективно трансдуцировать клетки ЦНС, тем самым обеспечивая доставку фермента и увеличивая его активность.

Из исследованного уровня техники выявлено изобретение по патенту RU2671503C2 «Способы и композиции для доставки в ЦНС арилсульфатазы А». Сущностью является способ интратекального введения композиции, содержащего белок арилсульфатазу A (ARSA), полисорбат и фосфат, для лечения болезни метахроматической лейкодистрофии. При этом указанный фосфат содержится в количестве не более 10 мМ. Группа изобретений обеспечивает успешное интратекальное введение состава без возникновения значительной токсичности и иммунного ответа. Сущностью является Стабильный состав для интратекального введения, содержащий белок арилсульфатазу A (ASA) в концентрации от по меньшей мере 5 до 50 мг/мл, полисорбат и фосфат, при этом указанный фосфат содержится в количестве не более 10 мМ. 2. Стабильный состав по п. 1, отличающийся тем, что белок ASA присутствует в концентрации, выбранной из 10, 30 или 50 мг/мл. 3. Стабильный состав по п. 1, отличающийся тем, что указанный стабильный состав дополнительно содержит NaCl. 4. Стабильный состав по п. 1, отличающийся тем, что белок ASA содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1. 5. Стабильный состав по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что белок ASA получен из линии клеток человека. 6. Стабильный состав по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что белок ASA получен из клеток СНО. 7. Стабильный состав по п. 3, отличающийся тем, что NaCl присутствует в концентрации до 300 мМ. 8. Стабильный состав по п. 3, отличающийся тем, что NaCl присутствует в диапазоне концентраций приблизительно 137-154 мМ. 9. Стабильный состав по п. 8, отличающийся тем, что NaCl присутствует в концентрации приблизительно 154 мМ. 10. Стабильный состав по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что указанное полисорбатное поверхностно-активное вещество выбрано из группы, состоящей из полисорбата 20, полисорбата 40, полисорбата 60, полисорбата 80 и их комбинаций. 11. Стабильный состав по п. 10, отличающийся тем, что указанное полисорбатное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат 20. 12. Стабильный состав по п. 11, отличающийся тем, что полисорбат 20 присутствует в концентрации до 0,2%. 13. Стабильный состав по п. 12, отличающийся тем, что полисорбат 20 присутствует в концентрации приблизительно 0,005%. 14. Стабильный состав по п. 1, дополнительно содержащий буферный агент, выбранный из группы, состоящей из ацетата, гистидина, сукцината, цитрата, «Трис» и их комбинаций. 15. Стабильный состав по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что стабильный состав имеет рН приблизительно 3-8,0. 16. Стабильный состав по п. 15, отличающийся тем, что стабильный состав имеет рН приблизительно 6,0-6,5. 17. Стабильный состав по п. 16, отличающийся тем, что указанный стабильный состав имеет рН приблизительно 6,0. 18. Стабильный состав по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что указанный состав представляет собой жидкий состав. 19. Стабильный состав по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что указанный состав выполнен в форме лиофилизированного сухого порошка. 20. Стабильный состав по п. 1, отличающийся тем, что указанный состав дополнительно содержит стабилизирующий агент. 21. Стабильный состав по п. 20, отличающийся тем, что указанный стабилизирующий агент выбран из группы, состоящей из сахарозы, глюкозы, маннитола, сорбитола, ПЭГ 4000, гистидина, аргинина, лизина, фосфолипидов и их комбинаций. 22. Способ лечения болезни метахроматической лейкодистрофии (МЛД), включающий этап интратекального введения нуждающемуся в этом субъекту состава по любому из пп. 1-21. 23. Способ по п. 22, отличающийся тем, что интратекальное введение осуществляют раз в две недели. 24. Способ по п. 22, отличающийся тем, что интратекальное введение осуществляют раз в месяц. 25. Способ по п. 22, отличающийся тем, что интратекальное введение осуществляют раз в два месяца. 26. Способ по п. 22, отличающийся тем, что интратекальное введение применяют в сочетании с внутривенным введением. 27. Способ по п. 26, отличающийся тем, что внутривенное введение осуществляют не чаще чем один раз в месяц. 28. Способ по п. 26, отличающийся тем, что внутривенное введение осуществляют не чаще чем раз в два месяца. 29. Способ по п. 22, отличающийся тем, что интратекальное введение применяют в отсутствие внутривенного введения. 30. Способ по п. 22, отличающийся тем, что интратекальное введение применяют в отсутствие сопутствующей иммуносупрессорной терапии.

Таким образом, в изобретении описывается способ доставки композиции состоящего из белка ARSA, полисорбат и фосфат в ЦНС путем интратекального введения без возникновения значительной токсичности и иммунного ответа.

Недостатками известного технического решения является то, что, во-первых, при введении фермента в СМЖ есть риск осложнений. Во-вторых, возникает сложность в достижении равномерного распределения фермента по нервной системе. Также предыдущие клинические испытания подобных препаратов на пациентах с другими ЛБН, затрагивающими ЦНС, не показали ожидаемой эффективности, неврологические нарушения продолжались, что не даёт оснований полагать, что препарат будет эффективен при использовании по назначению.

Наиболее близким аналогом по технической сущности и достигаемому техническому результату является изобретение по патенту RU 2769577 «Препарат для лечения метахроматической лейкодистрофии и способ ее лечения». Сущностью является генный и генно-клеточный препарат для терапии МЛД, заключающийся во внутривенном или интратекальном введении препарата, содержащего рекомбинантный аденоассоциированный вирус 9 серотипа, с уникальной последовательностью кодон-оптимизированного гена ARSA (AAV9-coARSA) или в трансплантации мезенхимных стволовых клеток (МСК) человека, генетически модифицированных AAV9-coARSA (МСК-ARSA). Формула изобретения: Препарат для лечения метахроматической лейкодистрофии, включающий рекомбинантный аденоассоциированный вирус 9 серотипа, содержащий кодон-оптимизированную последовательность гена ARSA, представленную SEQ ID NO:1 Препарат для лечения метахроматической лейкодистрофии, состоящий из мезенхимных стволовых клеток, генетически модифицированных рекомбинантным аденоассоциированным вирусом 9 серотипа, содержащим кодон-оптимизированную последовательность гена ARSA, представленную в SEQ ID NO: 1. Способ лечения метахроматической лейкодистрофии, заключающийся в однократном внутривенном введении препарата по п.1 или 2 или в однократном интратекальном введении препарата по п.1.

Недостатком известного технического решения является недолговременная экспрессия трансгена, что приводит в дальнейшем к прогрессированию заболевания. Также 9-ый серотип не нацелен на тансдуцирования олигодендроцитов, что уменьшает эффективность препарата при использовании по назначению.

При этом использование AAVOlig001-CMVenCBh-coARSA по заявленному техническому решению позволяет добиться высокого и долгого уровня трансдукции клеток нервной системы человека за счет способности данного вектора к тропизму олигодентроциров, тем самым обеспечивая доставку фермента в ЦНС и увеличивая его активность.

Для решения описанных выше технических проблем необходима разработка способа, позволяющего исправить клетки нервной системы, а именно - модифицировать на долговременную экспрессию здорового гена.

При интратекальном введении AAVOlig001-CMVenCBh-coARSA будут трансдуцироваться олигодендроциты, промотер CMVenCBh обеспечит сильную и долгую экспрессию. Это позволит достичь долговременной экспрессии ARSA.

Техническим результатом заявленного технического решения является:

- разработка рекомбинантной генетической конструкции, содержащей промотор гибридного энхансера CMV/куриного β-актина и кодон-оптимизированную последовательность гена ARSA, представленную SEQ ID NO:1;

– разработкааденоассоциированного вируса – AAVOlig001-CMVenCBh-coARSA, обеспечивающего возможность терапии МЛД.

Сущностью заявленного технического решения являютсярекомбинантная генетическая конструкция для сверхэкспрессии фермента арилсульфатазы А, содержащая промотор гибридного энхансера CMV/куриного β-актина и кодон-оптимизированную последовательность гена ARSA, представленная SEQ ID NO:1. Аденоассоциированный вирус серотипа Olig001 для терапии метахроматической лейкодистрофии, содержащий рекомбинантную генетическую конструкцию по п. 1.

Заявленное техническое решение иллюстрируется Фиг. 1 – Фиг.5.

На Фиг. 1представлены диаграммы, на которыхпоказан уровень ферментативной активности ARSA в гомогенатах органов ЦНС свиней на 35 сутки после введения AAVOlig001-CMVenCBh-coARSA,по оси Х указаны образцы гомогенатов органов группы интактных свиней (обозначение контроль), образцы гомогенатов органов свиней, которым интратекально ввели рекомбинантный AAVOlig001-CMVenCBh-coARSA: 1а –правая лобная доля, 1б – теменная доля, 1в – затылочная доля коры головного мозга, 1г – ствол мозга, 1д – мозжечок, 1е – шейный отдел спинного мозга, 1ж – грудной отдел спинного мозга, 1з – поясничный отдел спинного мозга.

На Фиг. 2представлены диаграммы, на которых показана динамика ферментативной активности ARSA до введения, на 7, и 28 сутки. По оси Х указаны образцы СМЖ и плазмы свиней № 1 – №3, которым интратекально ввели рекомбинантный AAVOlig001-CMVenCBh-coARSA.: 2а – в спинномозговой жидкости (СМЖ),2б – в плазме свиней

На Фиг. 3представлены диаграммы, на которых показано количество копий мРНК гена ARSA в органах нервной системы свиней на 35 сутки после введения AAVOlig001-CMVenCBh-coARSA. По оси Х указаны образцы РНК.По оси У указано число копий мРНК гена ARSA на 1 мкг общей РНК. Данные получены с помощью количественной ПЦР. 3а – образцы РНК правой лобной доли, теменной доли, затылочной доли головного мозга, 3б – мозжечка, мозгового ствола, подкожного нерва, 3в – шейного отдела спинного мозга (СМ), грудного отдела спинного мозга (СМ), поясничного отдела спинного мозга (СМ), 3г – ганглии задних корешков (ГЗК) шейного отдела спинного мозга (СМ), ганглии задних корешков (ГЗК) грудного отдела спинного мозга (СМ), ганглии задних корешков (ГЗК) поясничного отдела спинного мозга (СМ).

На Фиг. 4 представлены диаграммы, на которых показаны данные анализа уровней: 4а - аланинаминотрансферазы (АЛТ), 4б - аспартатаминотрансферазы (АСТ), 4в - креатинина-J, 4г - общего билирубина в сыворотке крови свиней. По оси Х указаны образцы сыворотки экспериментальной группы свиней с интратекальным введением рекомбинантного AAVOlig001-CMVenCBh-coARSA. Данные получены с помощью иммуноферментного анализа (ИФА).

На Фиг. 5 представлены изображения срезов органов (полученных методом конфокальной микроскопии), на которых показан анализ экспрессии ARSA путем иммуногистохимического анализа криостатных срезов органов ЦНС - контрольной группы свиней без введения (контроль) и образцы срезов органов экспериментальной группы свиней интратекальным AAVOlig001-CMVenCBh-coARSA: 5а - срез коры мозжечка, срез коры затылочной доли, срез поясничного отдела спинного мозга, 5б - срез спинномозговой ганглии шейного отдела спинного мозга, срез спинномозговой ганглии грудного отдела спинного мозга, срез спинномозговой ганглии поясничного отдела спинного мозга.

Далее заявителем приведено описание заявленного технического решения.

Выявленная проблема и заявленный технический результат достигаются путем интратекального введения аденоассоциированного вируса с серотипом Olig001, содержащего рекомбинантную генетическую конструкцию с промотором CMVenCBh, с уникальной кодон-оптимизированной последовательностью гена ARSA - AAVOlig001-CMVenCBh-coARSA (далее - AAVOlig001-CMVenCBh-coARSA). Последовательность, представленная SEQ ID NO:1, приведена в Приложении.

Идея заявленного технического решения в целом основана на том, что благодаря способности серотипа Olig001 эффективно трансдуцировать олигодендроциты, участвующие в патогенезе МЛД, промотр CMVenCBh инициирует долгую и сильную экспрессию трансгена. Это позволяет достичь терапевтического эффекта. В результате разработки получен AAVOlig001-CMVenCBh-coARSA, обладающий неизвестными из исследованного уровня техники терапевтическим эффектом, обеспечивающим возможность лечения ранее неизлечимого заболевания МЛД.

Практическая реализация заявленного изобретения осуществляется в 3 этапа в нижеприведённой последовательности, а именно:

1 этап: Получение и анализ рекомбинантной генетической конструкции, содержащей промотор гибридного энхансера CMV/куриного β-актина и кодон-оптимизированную последовательность гена ARSA, представленную SEQ ID NO:1.

2 этап: Получение и анализ функциональности аденоассоциированного вируса серотипа Olig001 - AAVOlig001-CMVenCBh-coARSA, содержащего рекомбинантную генетическую конструкцию, полученную на 1 этапе.

3 этап: Изучение эффективности и безопасности AAVOlig001-CMVenCBh-coARSA при интратекальном введении крупным лабораторным животным.

Далее заявителем приведено подробное описание этапов осуществления заявленного технического решения.

Пример 1 . Проведение 1 этапа - получение и анализ рекомбинантной генетической конструкции, содержащей промотор гибридного энхансера CMV/куриного β-актина и кодон-оптимизированную последовательность гена ARSA , представленную SEQ ID NO:1 .

Производят кодонную оптимизацию нуклеотидной последовательности гена. Для оптимизации кодонного состава гена ARSA используют известные алгоритмы с применением программы OptimumGene (GeneScript, США). На уровень экспрессии генов влияет множество факторов, алгоритм учитывает как можно больше из них, создавая единственный ген, способный достичь максимально возможного уровня экспрессии. При этом в нативном гене используются тандемные редкие кодоны, которые могут снижать эффективность трансляции или даже отключать трансляционный механизм. Смещение кодонов в гене повысило индекс адаптации кодонов с 0,83 до 0,90, что считается желаемым для наиболее высокого уровня экспрессии гена. Изменение GC состава было оптимизировано для увеличения периода полураспада мРНК. Были разрушены структуры шпилек, влияющие на связывание с рибосомами и стабильность мРНК. Кроме того, в процессе оптимизации были проверены и успешно модифицированы негативные цис-сайты.

Синтез и клонирование оптимизированной по кодонному составу кДНК гена ARSA в плазмидный вектор pAAV-MCS (Addgene, США) осуществляет компания GenScript (США). Правильность сборки рекомбинантной генетической конструкции pAAV-CMVenCBh-coARSA подтверждают рестрикционным анализом.

Для подтверждения функциональности генетической рекомбинантной конструкции, содержащей промотор гибридного энхансера CMV/куриного β-актина и кодон-оптимизированную последовательность гена ARSA (CMVenCBh-ARSA) им трансфицируют (генетически модифицируют) иммортализированую линию первичных человеческих эмбриональных клеток почки HEK293T. Для этого используют трансфекционный агент TurboFect (Thermo Fisher Scientific Inc., США) в соответствии с методикой, рекомендуемой производителем. Для оценки эффективности трансфекции в качестве положительного контроля используют плазмидный вектор pAAV-CMVenCBh-Katushka2S, кодирующий дальне-красный флуоресцентный белок.

Эффективность экспрессии рекомбинантного белка in vitro с помощью полученной плазмидной конструкции подтверждают путем теста на активность и вестрн-блот анализа.

Активность фермента ARSA определяют в лизате HEK293T через 24 часа после трансфекции. Концентрацию общего белка в образцах определяют с помощью набора Pierce™ BCA Protein Assay Kit (ThermoFisher Scientific, США). Образцы нормализовывают относительно концентрации общего белка. Для определения активности ARSA 50 мкл образца лизата клеток инкубируют с раствором субстрата нитрокатехол сульфата (0.01М p-Nitrocatechol sulfate dipotassium salt (#N7251, Sigma), 0,5 M ацетат натрия, 0,5 мМ Na₄P₂O₇, 10 % хлорид натрия, pH=5) в течение 1 часа при 37°C, после чего останавливают реакцию добавлением 1 Н гидроксида натрия. В качестве стандартов используют разведения сульфатазы (#S9626, Sigma). Оптическую плотность измеряют при длине волны 515 нм.

Вестерн-блот анализ проводят с использованием первичных поликлональных антител кролика к ARSA (Кат. № PAG619Hu01, Cloud-Clone Corp., США) разведение 1:500 в блокирующем буфере.

По результатам анализа заявителем в образцах лизатов клеток НЕК293Т, трансфицированных pAAV-CMVenCBh-coARSA, получены ожидаемые размеры около 33 кДа.

Пример 2 . Проведение 2 этапа - получение и анализ функциональности аденоассоциированного вируса серотипа Olig001 - AAVOlig001-CMVenCBh-coARSA, содержащего рекомбинантную генетическую конструкцию по Примеру 1.

На основе рекомбинантной генетической конструкции pAAV-CMVenCBh-coARSA получают AAVOlig001-CMVenCBh-coARSA. Для получения AAVOlig001-CMVenCBh-coARSA используют AAV Helper free system. Клетки AAV293 сеют в количестве 1,5 млн., монослой составляет 70-80%. На следующий день проводят ко-трансфекцию с использованием кальций-фосфатного метода тремя плазмидами (векторная плазмида, pAAV-RC и pHelper). AAVOlig001-CMVenCBh-coARSA собирают через 72 часа после трансфекции. Клетки собирают скребком, проводят криолиз, центрифугируют при 10000 × g в течение 10 минут для избавления от клеточного дебриса. Вирусный сток хранят при минус 80°C. AAVOlig001-CMVenCBh-coARSA концентрируют с использованием AAV Purification Mega Kit (Cell Biolabs, Inc., США) в соответствии с методикой, рекомендуемой производителем.

Пример 3 . Проведение 3 этапа - изучение эффективности и безопасности AAVOlig001-CMVenCBh-coARSA при интратекальном введении крупным лабораторным животным.

Эффективность и безопасность полученного AAVOlig001-CMVenCBh-coARSA проверили на крупных лабораторных животных.

В работе использовали свиней в возрасте 4 месяцев (весом 5 кг), которые случайным образом распределяют на 2 группы, в каждой группе по три особи - контрольная группа и экспериментальная группа. Свиньям интратекально (т.е. введением AAVOlig001-CMVenCBh-coARSA в спинной мозг) вводили заявленный AAVOlig001-CMVenCBh-coARSA (n=3) в количестве 2 х 10¹³ геномных копий/кг, при этом контрольной группе ничего не вводили:

1) Контрольная группа интактных свиней без введения AAVOlig001-CMVenCBh-coARSA.

2) Экспериментальная группа свиней, которым интратекально вводят AAVOlig001-CMVenCBh-coARSA, в дозе 2 х 10¹³ геномных копий/кг.

Животных содержали в специализированных помещениях Казанской государственной академии ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана (КГАВМ) под наблюдением квалифицированного персонала. Все эксперименты проводили в соответствии с этическими стандартами и действующим законодательством.

Эксперимент проводили следующим образом.

До введения у свиней забирали образцы СМЖ, цельной крови в пробирки, содержащие антикоагулянт NaC и гель, активатор (у всех подопытных животных), далее выделяли плазму и сыворотку из цельной крови с помощью центрифугирования в течение 20 минут при 1900 об/мин, хранили СМЖ, плазму и сыворотку при минус 80°С.

Далее у всех экспериментальных животных повторно, т.е. через 7 и 28 суток после введения AAVOlig001-CMVenCBh-coARSA забирали цельную кровь и СМЖ.

Далее образцы плазмы цельной крови и СМЖ использовали для определения ферментативной активности ARSA.

Далее на 35 сутки после введения AAVOlig001-CMVenCBh-coARSA свиней подвергают эвтаназии с использованием методов, которые соответствуют принципам, изложенным в Рекомендациях Европейской комиссии по эвтаназии экспериментальных животных.

Далее извлекали спинной мозг (шейный, грудной, поясничные отделы), ганглии задних корешков (шейный, грудной, поясничные отделы), мозжечок, кору затылочной доли, скрытый нерв, мозговой ствол, правую лобную долю, теменную долю.

Далее все органы гомогенизировали для проведения теста на активность и ПЦР-РВ или препарировали для проведения ИГХ анализа.

Далее на основании полученных экспериментальных данных строили графики. приведенные на Фиг. 1-5, которые иллюстрируют результаты, описанные на Этапах 1-3.

Графические материалы на Фиг.1 - Фиг.5, экспериментально доказали возможность достижения заявленных технических результатов.

Из данных, приведенных на Фиг. 1, видно, что ферментативная активность ARSA в гомогенатах органов ЦНС увеличивается после введения AAVOlig001-CMVenCBh-coARSA. В гомогенате затылочной доли коры головного мозга активности ARSA увеличивается у 1 свиньи на 150%. В гомогенате мозжечка детектировано увеличение активности у одной свиньи на 318%. В гомогенате ствола мозга детектировано увеличение активности у одной свиньи 117%. В шейном отделе спинного мозга детектировано увеличение активности ARSA у 1 и 3 свиньи на 193% и на 137%, соответственно. В грудном отделе спинного мозга детектировано увеличение активности ARSA у всех свиней на 105%, 127% и 116%, соответственно. В поясничном отделе спинного мозга детектировано увеличение активности ARSA у 1 и 2 свиньи на 176% и на 123%, соответственно. Такие результаты показывают, что после генетической модификации полученным AAVOlig001-CMVenCBh-coARSA клетки нервной системы начинают экспрессировать функционально активный фермент in vivo.

Из данных, приведенных на Фиг. 2, видно, что после интратекального введения AAVOlig001-CMVenCBh-coARSA активность ARSA увеличивается в СМЖ на 28 сутки. В плазме на 7 сутки. Такие результаты показывают, что интратекальное введение AAVOlig001-CMVenCBh-coARSA крупным лабораторным животным приводит к трансдукции клеток, которые после чего начинают экспрессировать и секретировать функционально активный фермент, обнаруживаемый в плазме и СМЖ животных.

Из данных, приведенных на Фиг. 3, видно наличие сверхэкспрессии кодон-оптимизированного гена ARSA в органах ЦНС свиней, которым интратекально вводили AAVOlig001-CMVenCBh-coARSA. В мозжечке, в подкожном нерве, в шейном, грудном, поясничном отделах спинного мозга, в ганглиях задних корешков грудного, поясничного отделов спинного мозга свиньи №1 детектировано 4215, 462, 947, 854716, 93228, 2922, 411 копий мРНК гена ARSA на мкг общей РНК, соответственно. В мозжечке, мозговом стволе, подкожном нерве, теменной доле, затылочной доле, в шейном, грудном, поясничном отделах спинного мозга, в ганглиях задних корешков шейного, грудного отделов спинного мозга свиньи №2 детектировано 5480, 346, 300, 974, 139, 871, 4965, 1501, 1129, 1039 копий мРНК гена ARSA на мкг общей РНК, соответственно. В мозговом стволе, подкожном нерве, теменной доле, затылочной доле, в шейном, грудном, поясничном отделах спинного мозга, в ганглиях задних корешков шейного, грудного, поясничного отделов спинного мозга свиньи №3 детектировано 88, 973, 5472, 205, 761, 1627, 1700, 1957, 1016, 579 копий мРНК гена ARSA на мкг общей РНК, соответственно.

Из данных, приведенных на Фиг. 4, видно, что биохимические показатели в сыворотке крови свиней после интратекального введения AAVOlig001-CMVenCBh-coARSA показали увеличение уровней АСТ, креатинина-J и билирубина на 7 сутки у одного животного. У остальных экспериментальных животных показатели остаются неизменными (АСТ, креатинин-J, общий билирубин). Это доказывает, что интратекальное введение AAVOlig001-CMVenCBh-coARSA не приводит к иммунологическим изменениям в организме испытуемых животных, что в свою очередь подтверждает потенциальную безопасность доставки генетического материала, кодирующего фермент ARSA.

Из данных, приведенных на Фиг. 5, видно, что анализ экспрессии ARSA в криостатных срезах органов нервной системы свиней путем иммуногистохимического анализа подтверждает успешную генетическую модификацию клеток нервной системы подопытных животных после интратекального введения AAVOlig001-CMVenCBh-coARSA. В коре мозжечка были обнаружены сверхэкспрессирующие ARSA нейроны Пуркинье, по сравнению с контрольной группой. Анализ затылочной доли головного мозга показал значимое увеличение экспрессии ARSA в нейронах верхних слоев коры головного мозга. Анализ поперечных срезов шейного и грудного отделов спинного мозга не показал достоверных различий в экспрессии ARSA в сером веществе животных экспериментальной и контрольной групп. Однако единичные сверхэкспрессирующие ARSA нейроны в передних и задних рогах поясничного отдела спинного мозга были обнаружены. Анализ спинномозговых ганглиев (СМГ) на уровне шейного, грудного и поясничного отделов спинного мозга выявило сверхэкспрессирующие ARSA нейроны. Анализ корешков спинномозговых нервов и седалищного нерва не выявил различий в экспрессии ARSA у животных экспериментальной и контрольной групп.

Из описанного выше можно сделать вывод о том, что заявителем решены выявленные технические проблемы и достигнут заявленный технический результат, а именно:

- разработана рекомбинантная генетическая конструкция (см. Пример 1);

- разработан аденоассоциированный вирус серотипа Olig001 содержащий указанную рекомбинантную генетическую конструкцию - AAVOlig001-CMVenCBh-coARSA, обеспечивающий возможность терапии МЛД (см. Примеры 2, 3, Фиг. 1-5).

Заявленное техническое решение удовлетворяет условию патентоспособности «новизна», предъявляемому к изобретениям, так как из исследованного уровня техники не выявлены источники, в которых описаны признаки, совпадающие по исполняемой ими функции и форме выполнения этих признаков, перечисленные в формуле изобретения, включая характеристику назначения.

Заявленное техническое решение удовлетворяет условию патентоспособности «изобретательский уровень», предъявляемому к изобретениям, поскольку из исследованного уровня техники заявителем не выявлены технические решения, характеризующиеся использованием способа терапии МЛД, подразумевающего интратекальное введение рекомбинантного AAVOlig001-CMVenCBh-coARSA. Кроме того, заявленное техническое решение, по мнению заявителя, не является очевидным для специалиста, так как обеспечивает реализацию задачи по остановке нейродегенерации и значительному облегчению симптомов МЛД, практически неизлечимой на дату представления заявочных материалов.

Заявленное техническое решение удовлетворяет условию патентоспособности «промышленная применимость», предъявляемому к изобретениям, так как оно может быть использовано в промышленных масштабах для создания препаратов, предназначенных для лечения МЛД.

--->

Sequence Listing Information:

DTD Version: V1_3

File Name: pAAV-ARSA1.xml

Software Name: WIPO Sequence

Software Version: 2.3.0

Production Date: 2023-10-24

General Information:

Current application / IP Office: RU

Current application / Application number: 2023126473/20(058552)

Current application / Filing date: 2023-10-16

Current application / Applicant file reference: -

Earliest priority application / IP Office: RU

Earliest priority application / Application number:

2023126473/20(058552)

Earliest priority application / Filing date: 2023-10-16

Applicant name: Федеральное государственное автономное

образовательное учреждение высшего образования "Казанский

(Приволжский) федеральный университет" (ФГАОУ ВО КФУ), RU

Applicant name / Language: ru

Applicant name / Name Latin: Federalnoye gosudarstvennoye

avtonomnoye obrazovatelnoye uchrezhdeniye vysshego obrazovaniya

Kazanskiy (Privolzhskiy) federalnyy universitet (FGAOU VO KFU), RU

Inventor name: Муллагулова Айсылу Илдаровна

Inventor name / Language: ru

Inventor name / Name Latin: Mullagulova Aisylu Ildarovna

Invention title: Рекомбинантная генетическая конструкция,

аденоассоциированный вирус для терапии метахроматической

лейкодистрофии ( ru )

Sequence Total Quantity: 1

Sequences:

Sequence Number (ID): 1

Length: 6282

Molecule Type: DNA

Features Location/Qualifiers:

- source, 1..6282

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

Residues:

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcgtcg

ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa

ctccatcact 120

aggggttcct gcggccgcac gcgtctagtt attaatagta atcaattacg

gggtcattag 180

ttcatagccc atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc

ccgcctggct 240

gaccgcccaa cgacccccgc ccattgacgt caatagtaac gccaataggg

actttccatt 300

gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat

caagtgtatc 360

atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc

tggcatttgc 420

ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat

tagtcatcgc 480

tattaccatg gtcgaggtga gccccacgtt ctgcttcact ctccccatct

cccccccctc 540

cccaccccca attttgtatt tatttatttt ttaattattt tgtgcagcga

tgggggcggg 600

gggggggggg gggcgcgcgc caggcggggc ggggcggggc gaggggcggg

gcggggcgag 660

gcggagaggt gcggcggcag ccaatcagag cggcgcgctc cgaaagtttc

cttttatggc 720

gaggcggcgg cggcggcggc cctataaaaa gcgaagcgcg cggcgggcgc

gtttagtgaa 780

ccgtcagatc gcctggagac gccatccacg ctgttttgac ctccatagaa

gacaccggga 840

ccgatccagc ctccgcggat tcgaatcccg gccgggaacg gtgcattgga

acgcggattc 900

cccgtgccaa gagtgacgta agtaccgcct atagagtcta taggcccaca

aaaaatgctt 960

tcttctttta atatactttt ttgtttatct tatttctaat actttcccta

atctctttct 1020

ttcagggcaa taatgataca atgtatcatg cctctttgca ccattctaaa

gaataacagt 1080

gataatttct gggttaaggc aatagcaata tttctgcata taaatatttc

tgcatataaa 1140

ttgtaactga tgtaagaggt ttcatattgc taatagcagc tacaatccag

ctaccattct 1200

gcttttattt tatggttggg ataaggctgg attattctga gtccaagcta

ggcccttttg 1260

ctaatcatgt tcatacctct tatcttcctc ccacagctcc tgggcaacgt

gctggtctgt 1320

gtgctggccc atcactttgg caaagaattg ggattcgaac atcgattgaa

ttcacaagtt 1380

tgtacaaaaa agcaggctga attcaccatg tccatgggcg ccccccggtc

tctgctgctg 1440

gcactggcag caggactggc agtggccaga ccccctaaca tcgtgctgat

cttcgcagac 1500

gatctgggat acggcgacct gggctgctat ggccacccaa gctccaccac

acccaatctg 1560

gaccagctgg cagcaggagg actgaggttc accgattttt acgtgccagt

gagcctgtgt 1620

accccatcca gggcagcact gctgacaggc aggctgccag tgcgcatggg

catgtatcct 1680

ggcgtgctgg tgccatctag caggggagga ctgccactgg aggaggtgac

cgtggcagag 1740

gtgctggcag ccagaggcta cctgacagga atggccggca agtggcacct

gggagtggga 1800

cctgagggcg ccttcctgcc accccaccag ggcttccacc ggtttctggg

catcccttat 1860

tcccacgacc agggcccatg ccagaacctg acctgttttc ctccagcaac

accatgcgac 1920

ggaggatgtg atcagggact ggtgcctatc ccactgctgg ccaatctgtc

tgtggaggca 1980

cagccacctt ggctgcctgg actggaggca aggtacatgg cattcgcaca

cgacctgatg 2040

gcagatgcac agcggcagga tagacctttc tttctgtact atgcctccca

ccacacccac 2100

tatccacagt tcagcggcca gtcctttgca gagaggagcg gaaggggacc

attcggcgac 2160

tccctgatgg agctggatgc cgccgtgggc accctgatga cagcaatcgg

cgacctggga 2220

ctgctggagg agaccctggt catcttcacc gccgataacg gccccgagac

aatgcggatg 2280

tctagaggag gatgcagcgg actgctgaga tgtggcaagg gaaccacata

cgagggaggc 2340

gtgcgcgagc ctgcactggc attttggcca ggacacatcg cacctggagt

gacccacgag 2400

ctggcatcct ctctggacct gctgccaaca ctggcagcac tggcaggagc

accactgcct 2460

aatgtgaccc tggacggctt cgatctgtct ccactgctgc tgggcaccgg

caagtccccc 2520

agacagtctc tgttctttta ccccagctat cctgatgagg tgcggggcgt

gtttgccgtg 2580

agaaccggca agtacaaggc ccacttcttt acacagggct ctgcccacag

cgacaccaca 2640

gccgatcctg catgccacgc aagctcctct ctgaccgcac acgagccacc

actgctgtac 2700

gacctgtcca aggaccccgg cgagaactat aatctgctgg gaggagtggc

aggagcaacc 2760

cctgaggtgc tgcaggccct gaagcagctg cagctgctga aggcacagct

ggacgcagca 2820

gtgacattcg gaccaagcca ggtggcaagg ggagaggacc ccgcactgca

gatctgctgt 2880

caccctggat gcaccccaag gccagcatgc tgtcactgtc ctgatccaca

cgcctgagga 2940

tccacccagc tttcttgtac aaagtggtgg atcctctaga gtcgacctgc

agaagcttgc 3000

ctcgagcagc gctgctcgag agatctacgg gtggcatccc tgtgacccct

ccccagtgcc 3060

tctcctggcc ctggaagttg ccactccagt gcccaccagc cttgtcctaa

taaaattaag 3120

ttgcatcatt ttgtctgact aggtgtcctt ctataatatt atggggtgga

ggggggtggt 3180

atggagcaag gggcaagttg ggaagacaac ctgtagggcc tgcggggtct

attgggaacc 3240

aagctggagt gcagtggcac aatcttggct cactgcaatc tccgcctcct

gggttcaagc 3300

gattctcctg cctcagcctc ccgagttgtt gggattccag gcatgcatga

ccaggctcag 3360

ctaatttttg tttttttggt agagacgggg tttcaccata ttggccaggc

tggtctccaa 3420

ctcctaatct caggtgatct acccaccttg gcctcccaaa ttgctgggat

tacaggcgtg 3480

aaccactgct cccttccctg tccttctgat tttgtaggta accacgtgcg

gaccgagcgg 3540

ccgcaggaac ccctagtgat ggagttggcc actccctctc tgcgcgctcg

ctcgctcact 3600

gaggccgggc gaccaaaggt cgcccgacgc ccgggctttg cccgggcggc

ctcagtgagc 3660

gagcgagcgc gcagctgcct gcaggggcgc ctgatgcggt attttctcct

tacgcatctg 3720

tgcggtattt cacaccgcat acgtcaaagc aaccatagta cgcgccctgt

agcggcgcat 3780

taagcgcggc gggtgtggtg gttacgcgca gcgtgaccgc tacacttgcc

agcgccctag 3840

cgcccgctcc tttcgctttc ttcccttcct ttctcgccac gttcgccggc

tttccccgtc 3900

aagctctaaa tcgggggctc cctttagggt tccgatttag tgctttacgg

cacctcgacc 3960

ccaaaaaact tgatttgggt gatggttcac gtagtgggcc atcgccctga

tagacggttt 4020

ttcgcccttt gacgttggag tccacgttct ttaatagtgg actcttgttc

caaactggaa 4080

caacactcaa ccctatctcg ggctattctt ttgatttata agggattttg

ccgatttcgg 4140

cctattggtt aaaaaatgag ctgatttaac aaaaatttaa cgcgaatttt

aacaaaatat 4200

taacgtttac aattttatgg tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc

gcatagttaa 4260

gccagccccg acacccgcca acacccgctg acgcgccctg acgggcttgt

ctgctcccgg 4320

catccgctta cagacaagct gtgaccgtct ccgggagctg catgtgtcag

aggttttcac 4380

cgtcatcacc gaaacgcgcg agacgaaagg gcctcgtgat acgcctattt

ttataggtta 4440

atgtcatgat aataatggtt tcttagacgt caggtggcac ttttcgggga

aatgtgcgcg 4500

gaacccctat ttgtttattt ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc

atgagacaat 4560

aaccctgata aatgcttcaa taatattgaa aaaggaagag tatgagtatt

caacatttcc 4620

gtgtcgccct tattcccttt tttgcggcat tttgccttcc tgtttttgct

cacccagaaa 4680

cgctggtgaa agtaaaagat gctgaagatc agttgggtgc acgagtgggt

tacatcgaac 4740

tggatctcaa cagcggtaag atccttgaga gttttcgccc cgaagaacgt

tttccaatga 4800

tgagcacttt taaagttctg ctatgtggcg cggtattatc ccgtattgac

gccgggcaag 4860

agcaactcgg tcgccgcata cactattctc agaatgactt ggttgagtac

tcaccagtca 4920

cagaaaagca tcttacggat ggcatgacag taagagaatt atgcagtgct

gccataacca 4980

tgagtgataa cactgcggcc aacttacttc tgacaacgat cggaggaccg

aaggagctaa 5040

ccgctttttt gcacaacatg ggggatcatg taactcgcct tgatcgttgg

gaaccggagc 5100

tgaatgaagc cataccaaac gacgagcgtg acaccacgat gcctgtagca

atggcaacaa 5160

cgttgcgcaa actattaact ggcgaactac ttactctagc ttcccggcaa

caattaatag 5220

actggatgga ggcggataaa gttgcaggac cacttctgcg ctcggccctt

ccggctggct 5280

ggtttattgc tgataaatct ggagccggtg agcgtgggtc tcgcggtatc

attgcagcac 5340

tggggccaga tggtaagccc tcccgtatcg tagttatcta cacgacgggg

agtcaggcaa 5400

ctatggatga acgaaataga cagatcgctg agataggtgc ctcactgatt

aagcattggt 5460

aactgtcaga ccaagtttac tcatatatac tttagattga tttaaaactt

catttttaat 5520

ttaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg ataatctcat gaccaaaatc

ccttaacgtg 5580

agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct

tcttgagatc 5640

ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa accaccgcta

ccagcggtgg 5700

tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc

ttcagcagag 5760

cgcagatacc aaatactgtc cttctagtgt agccgtagtt aggccaccac

ttcaagaact 5820

ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt accagtggct

gctgccagtg 5880

gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact caagacgata gttaccggat

aaggcgcagc 5940

ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg

acctacaccg 6000

aactgagata cctacagcgt gagctatgag aaagcgccac gcttcccgaa

gggagaaagg 6060

cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg

gagcttccag 6120

ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg ccacctctga

cttgagcgtc 6180

gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc

aacgcggcct 6240

ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat gt

6282

END

<---

Claims (2)

1. Рекомбинантная генетическая конструкция для сверхэкспрессии фермента арилсульфатазы А, содержащая промотор гибридного энхансера CMV/куриного β-актина и кодон-оптимизированную последовательность гена ARSA, представленная SEQ ID NO: 1.

2. Аденоассоциированный вирус серотипа Olig001 для терапии метахроматической лейкодистрофии, содержащий рекомбинантную генетическую конструкцию по п. 1.