RU2820347C1 - Способ генотипирования полиморфного локуса rs9636867 (A>G) гена IFNAR2 у человека методом ПЦР в режиме "реального времени" с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов - Google Patents
Способ генотипирования полиморфного локуса rs9636867 (A>G) гена IFNAR2 у человека методом ПЦР в режиме "реального времени" с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов Download PDFInfo
- Publication number
- RU2820347C1 RU2820347C1 RU2024108807A RU2024108807A RU2820347C1 RU 2820347 C1 RU2820347 C1 RU 2820347C1 RU 2024108807 A RU2024108807 A RU 2024108807A RU 2024108807 A RU2024108807 A RU 2024108807A RU 2820347 C1 RU2820347 C1 RU 2820347C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- allele
- insdseq
- insdqualifier
- insdfeature
- genotyping
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 title claims abstract description 9
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 title claims abstract description 9
- 101000852865 Homo sapiens Interferon alpha/beta receptor 2 Proteins 0.000 title description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 32
- 101150074051 ifnar2 gene Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims abstract description 20
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100036718 Interferon alpha/beta receptor 2 Human genes 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000007614 genetic variation Effects 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 238000000816 matrix-assisted laser desorption--ionisation Methods 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 101001003149 Homo sapiens Interleukin-10 receptor subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 102100020788 Interleukin-10 receptor subunit beta Human genes 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу генотипирования полиморфного локуса rs9636867 (A>G) гена IFNAR2 у человека. Указанный способ осуществляют методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов. Идентификацию аллельных вариантов rs9636867 (A>G) гена IFNAR2 осуществляют с использованием прямого и обратного праймеров с последовательностями SEQ ID NO: 1 и 2, соответственно, а также rs9636867-A-аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда и rs9636867-G-аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда с последовательностями SEQ ID NO: 3 и 4, соответственно. Настоящее изобретение обеспечивает быстрый, недорогой и легко воспроизводимый способ идентификации полиморфизма rs9636867 (A>G) гена IFNAR2. 1 ил.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярно-генетической диагностики, в частности к оценке однонуклеотидного полиморфизма rs9636867 (A>G) гена IFNAR2 молекулярно-генетическим методом исследования.
Уровень техники. Полиморфный маркер rs9636867 (A>G) гена IFNAR2 был установлен широкогеномными исследованиями ассоциаций как вариант, ассоциированный с тяжелым течением COVID-19 [https://www.ebi.ac.uk/gwas/variants/rs9636867]. Ген IFNAR2 (Gene ID: 3455) локализован на хромосоме 21q22.11. Однонуклеотидный полиморфизм rs9636867, позиция chr21:33237639 (GRCh38.p14) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/rs9636867) локализован в интроне и характеризуется заменой A>G. Согласно биоинформатическому ресурсу GTEx Portal, генетический вариант rs9636867 (A>G) влияет на экспрессию генов IFNAR2, IL10RB, IL10RB-AS1 посредством eQTL-эффектов.
Высокая клинико-диагностическая значимость данного генетического варианта относительно тяжелого течения COVID-19 создает потребность в создании простого в исполнении, недорого и доступного исследователям, работающим в области генетической эпидемиологии, метода идентификации однонуклеотидного полиморфизма rs9636867 (A>G) гена IFNAR2.
Известен способ анализа генетических вариаций в геноме человека методом секвенирования амплифицированных участков ДНК [Mardis E. R. DNA sequencing technologies: 2006-2016 //Nature protocols. - 2017. - Vol. 12. - №. 2. - P. 213-218]. Недостатками метода являются высокая стоимость оборудования и реагентов, что исключает широкое внедрение метода в экспериментальные исследования, особенно изучение заболеваний, которые требуют большого размера выборок для обеспечения высокой мощности исследований.
Известен способ анализа генетических вариаций в геноме человека методом матричноактивированной лазерной десорбционно-ионизационной масс-спектрометрии (MALDI). Метод заключается в том, анализируемая ДНК переносится на подложку, где она кристаллизуется с матрицей. Затем кристаллизованные аналиты переносят, облучают лазером, вызывая десорбцию и ионизацию молекул в вакуумной камере. Положительно заряженные ионы ДНК ускоряются и мигрируют через вакуумную трубку к высокочувствительному детектору с разной скоростью в зависимости от массы ионов, что приводит к различному времени пролета. Используя время пролета отдельных ионизированных ДНК-аналитов, система определяет массу и отображает масс-спектр, идентифицирующий различные генетические мишени [Li D. et al. MALDI-TOF mass spectrometry in clinical analysis and research //ACS Measurement Science Au. - 2022. - Vol. 2. - №. 5. - P. 385-404]. Недостатками метода являются трудоемкость, высокая стоимость оборудования, высокая стоимость эксперимента, наличие высококвалифицированного персонала.
За прототип выбран коммерческий набор по генотипированию rs9636867 (A/G) IFNAR2 (C__29551340_10; каталог 4351379) компании ThermoFisher. Однако, генотипирование с использованием коммерческих наборов характеризуется высокой стоимостью, а информация о структуре необходимых для проведения ПЦР праймеров и аллель-специфических зондов является закрытой для исследователей, в связи с чем он не может быть воспроизведен при наличии стандартного набора оборудования и реактивов.
Таким образом, существует реальная потребность в создании быстрого, недорогого и легко воспроизводимого способа идентификации полиморфизма rs9636867 (A>G) гена IFNAR2, с доступной всем исследователям структурой праймеров и аллель-специфических зондов, который мог бы использоваться в качестве «рутинного» метода генотипирования в любой ПЦР-лаборатории.
Раскрытие сущности изобретения. Техническим результатом данного изобретения является разработка простого в исполнении и экономически целесообразного способа генотипирования однонуклеотидного полиморфизма rs9636867 (A>G), локализованного в позиции chr21:33237639 (GRCh38.p14) гена IFNAR2 (Gene ID: 3455) методом полимеразной цепной реакции в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических сигнальных зондов, содержащие флуорофоры FAM и ROX.
Технический результат достигается тем, что идентификацию аллельных вариантов rs9636867 (A>G) гена IFNAR2 осуществляют с использованием прямого праймера rs9636867 5′-TGCCCTTCTACAATCTGGATG-3′ (SEQ ID NO 1), обратного праймера rs9636867 5′-CGACTGCCTGGAACTAATCC-3′ (SEQ ID NO 2),
rs9636867-A-аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда
5′-(FAM)CTTGATGTGTGATGTCATCTCCCATA(RTQ1)-3′(SEQ ID NO 3),
rs9636867-G-аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда
5′-(ROX)CTTGATGTGTGACGTCATCTCCCATA(BHQ2)-3′ (SEQ ID NO 4).
Изобретение поясняется следующей фигурой: дискриминация аллелей по локусу rs9636867 гена IFNAR2 при генотипировании методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов по данным величин RFU (относительные единицы флуоресценции) на амплификаторе CFX96: генотипы rs9636867-A/A показаны оранжевыми кругами, генотипы rs9636867-A/G показаны зелеными треугольниками, генотипы rs9636867-G/G показаны голубыми квадратами; черным ромбом отмечен отрицательный контроль.
Работа над дизайном олигонуклеотидов включала несколько этапов:
1) С применением открытой базы данных Ensembl genome browser 109 [https://www.ensembl.org/index.html] выбран синвенс, фланкирующий искомую однонуклеотидную замену [A/G] rs9636867 гена IFNAR2, и затем с помощью доступного онлайн программного обеспечения Primer3web version 4.1.0 [https://primer3.ut.ee/] подобрана последовательность олигонуклеотидов, используемых для проведения ПЦР-реакции:
прямой общий праймер rs9636867 5′-TGCCCTTCTACAATCTGGATG-3′ (SEQ ID NO 1),
обратный общий праймер rs9636867 5′-CGACTGCCTGGAACTAATCC-3′ (SEQ ID NO 2).
Размер амплифицируемого в ходе ПЦР фрагмента гена IFNAR2 составляет 161 пару нуклеотидов:
(TGCCCTTCTACAATCTGGATGTGGTGGTATCTAGGGGAATGTTCACAACTA
GGCAACGCCTCTGCTGTGGATTGATTATGGGAGATGAC[A/G]TCACACATCA
AGATATCTCAGCAGATGTTTCTCAATGGGTACAGTATTATGGGATTAGTTCC
AGGCAGTCG)
2). Для дизайна зондов пользовались практическими рекомендациями [Basu C. (ed.). PCR primer design. - New york : Humana Press, 2015]. В реакции использовались гидролизные зонды. Последовательность зонда подбирали таким образом, чтобы он отжигался на матрицу между прямым и обратным праймерами. Зонды подбирали на обратную (R) цепь ДНК. Каждый зонд снабжали флуорофором и гасителем флуоресценции, спектр поглощения которого соответствует длинам волн спектра флуорофора. Для гашения флуоресценции FAM пользовались гасителем RTQ1; для гашения флуоресценции ROX - гасителем BHQ2.
На основании изложенных критериев и практических рекомендаций были подобраны зонды со следующей структурой:
rs9636867-A-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд
5′-(FAM)CTTGATGTGTGATGTCATCTCCCATA(RTQ1)-3′(SEQ ID NO 3),
rs9636867-G-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд
5′-(ROX)CTTGATGTGTGACGTCATCTCCCATA(BHQ2)-3′ (SEQ ID NO 4).
3) Изготовление праймеров и зондов осуществлялось в сервисном центре НПК «Синтол», Москва.
4) С помощью практических экспериментов подобраны оптимальные условия для проведения генотипирования, которые включают следующие этапы: 50°C в течение 2 минут, 95°C в течение 10 минут, затем 39 циклов [95°C в течение 10 секунд и 62°C в течение 1 минуты].
5) Разработанный способ был апробирован в лаборатории геномных исследований на 200 образцах ДНК здоровых индивидуумов биобанка НИИ генетической и молекулярной эпидемиологии КГМУ. Генотипирование осуществляли по данным величин RFU (относительные единицы флуоресценции) зондов с флуоресцентными красителями. По результатам генотипирования rs9636867 75 человек (37,5%) оказались гомозиготами по аллелю A (генотип A/A); 98 человек (49%) являлись гетерозиготами (генотип A/G), 27 человек (13,5%) индивидуумов оказались гомозиготами по аллелю G (генотип G/G).
6) Валидацию способа проводили методом масс-спектрометрического анализа на геномном времяпролетном масс-спектрометре MassArray analyzer 4 (Agena Bioscience). Результаты обоих способов генотипирования полностью (100% генотипов) совпали. Однако патентуемый способ генотипирования полиморфного локуса rs9636867 (A>G) гена IFNAR2 методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических зондов позволяет значительно (на 6 часов) сократить время проведения анализа, а также снижает себестоимость анализа (в 4-5 раз).
Осуществление изобретения.
Способ осуществляют следующим образом:
1. Выделение ДНК из периферической венозной крови. На первом этапе к 0,5 мл крови добавляли 0,5 мл PBS и центрифугировали 10 мин при 12 тыс. об/мин. Надосадочную жидкость сливали, добавляли 1 мл PBS и вновь центрифугировали при тех же условиях. Надосадочную жидкость сливали, добавляли 200 мкл ТЕ-буфера, пипетировали до растворения осадка и затем последовательно добавляли 10 мкл 1% раствора додецилсульфата натрия SDS и 5 мкл протеиназы К. Пробирки инкубировали в термостате при t=37°C 12 ч. В ходе второго этапа проводили четыре последовательных центрифугирования с фенолом и хлороформом согласно протоколу методики (10 мин, 8 тыс. об/мин), после чего ДНК осаждали ледяным раствором 95% этилового спирта и центрифугировали 10 мин при 14,3 тыс. об/мин. По испарении спирта ДНК растворяли в 100 мкл деионизированной дистиллированной воды. Получаемый раствор ДНК в воде имел чистоту в диапазоне А260/280=1,5-2,0 и среднюю концентрацию около 180-200 нг/мкл.
2. Подготовка образцов ДНК к генотипированию. Качество выделенной ДНК оценивали по степени чистоты и концентрации раствора на спектрофотометре NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, США). Все анализируемые образцы ДНК были разведены деионизированной водой до концентрации 15-20 нг/мкл при А260/280=1,5-2,0.
3. Анализ полиморфизма rs9636867 (A>G) гена IFNAR2 с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени с использованием аллель-специфических зондов. Для генотипирования использовали два фланкирующих праймера, прямой (SEQ ID NO 1) и обратный (SEQ ID NO 2), а также аллель-специфические зонды: A-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд (SEQ ID NO 3), G-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд (SEQ ID NO 4).
ПЦР в «реальном времени» проводили в 25 мл реакционной смеси, содержащей 1,25 ЕД ДНК-полимеразы Hot Start Taq («Биолабмикс», Новосибирск, Россия), 20 нг ДНК, по 10 мкМ каждого праймера, по 5 мкМ каждого зонда, 0.03 мМ каждого dNTP, 2,5 мМ MgCl2; 1хПЦР-буфер [67 мМ Tris-HCl, pH 8,8, 16,6 мМ (NH4)2SO4, 0,01% Tween-20]. Реакция амплификации состояла из стадии нагревания до 50°C в течение 2 минут, 95°C в течение 10 минут, затем 39 циклов [95°C в течение 10 секунд и 62°C в течение 1 минуты].
4. Генотипирование. При проведении ПЦР в амплификаторе с флуоресцентной детекцией (Bio-Rad CFX96 или аналогичном амплификаторе) генотипирование осуществляют по данным величин RFU (относительных единиц флуоресценции). Для rs9636867 (A>G) гена IFNAR2 зонд с флуоресцентным красителем FAM соответствует аллелю A, зонд с красителем ROX - аллелю G (фиг. 1). На фигуре видно четкое разделение образцов на кластеры, где черный ромб соответствуют отрицательному контролю, кластер оранжевых кругов - соответствует зонду с флуоресцентным красителем FAM и позволяет идентифицировать гомозигот A/A. Кластер синих квадратов соответствует зонду с красителем ROX и позволяет идентифицировать гомозигот G/G. Кластер зеленых треугольников соответствует накоплению уровня флуоресценции по обоим зондам и позволяет идентифицировать гетерозигот A/G.
Резюме.
Таким образом, разработан эффективный и недорогой способ для экспресс-идентификации полиморфного варианта rs9636867 (A>G) гена IFNAR2 у человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов, который может быть использован в медицине при определении предрасположенности к развитию заболеваний, ассоциированных с носительством полиморфизмов гена IFNAR2, а также в научных целях.
--->
<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>
<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing
1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">
<ST26SequenceListing originalFreeTextLanguageCode="ru"
dtdVersion="V1_3" fileName="Способ генотипирования полиморфного
локуса rs9636867 (A G) гена IFNAR2 у человека методом ПЦР в режиме
«реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных
зондов.xml" softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.3.0"
productionDate="2024-02-25">
<ApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText></ApplicationNumberText>
<FilingDate></FilingDate>
</ApplicationIdentification>
<ApplicantFileReference>1865</ApplicantFileReference>
<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное
бюджетное образовательное учреждение высшего образования
"Курский государственный медицинский университет"
Министерства здравоохранения Российской Федерации,</ApplicantName>
<ApplicantNameLatin>Kursk State Medical
University</ApplicantNameLatin>
<InventionTitle languageCode="ru">Способ генотипирования
полиморфного локуса rs9636867 (A>G) гена IFNAR2 у человека методом
ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических
флуоресцентных зондов</InventionTitle>
<SequenceTotalQuantity>4</SequenceTotalQuantity>
<SequenceData sequenceIDNumber="1">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q2">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tgcccttctacaatctggatg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="2">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q4">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>cgactgcctggaactaatcc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="3">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>26</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..26</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q6">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>cttgatgtgtgatgtcatctcccata</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="4">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>26</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..26</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q8">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>cttgatgtgtgacgtcatctcccata</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
</ST26SequenceListing>
<---
Claims (1)
- Способ генотипирования полиморфного локуса rs9636867 (A>G) гена IFNAR2 у человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов, отличающийся тем, что идентификацию аллельных вариантов rs9636867 (A>G) гена IFNAR2 осуществляют с использованием прямого праймера rs9636867 5'-TGCCCTTCTACAATCTGGATG-3' (SEQ ID NO: 1), обратного праймера rs9636867 5'-CGACTGCCTGGAACTAATCC-3' (SEQ ID NO: 2), rs9636867-A-аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда 5'-(FAM)CTTGATGTGTGATGTCATCTCCCATA(RTQ1)-3' (SEQ ID NO: 3), rs9636867-G-аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда 5'-(ROX)CTTGATGTGTGACGTCATCTCCCATA(BHQ2)-3' (SEQ ID NO: 4).
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2820347C1 true RU2820347C1 (ru) | 2024-06-03 |
Family
ID=
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010103292A2 (en) * | 2009-03-12 | 2010-09-16 | Brainco Biopharma S.L. | A genotyping tool for improving the prognostic and clinical management of ms patients |
| RU2808839C1 (ru) * | 2023-10-19 | 2023-12-05 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Курский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ генотипирования полиморфного локуса rs346158 (T>C) гена C19orf53 у человека методом ПЦР в режиме "реального времени" с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010103292A2 (en) * | 2009-03-12 | 2010-09-16 | Brainco Biopharma S.L. | A genotyping tool for improving the prognostic and clinical management of ms patients |
| RU2808839C1 (ru) * | 2023-10-19 | 2023-12-05 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Курский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ генотипирования полиморфного локуса rs346158 (T>C) гена C19orf53 у человека методом ПЦР в режиме "реального времени" с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| FERREIRA, LEONARDO C et al., Genome-wide association studies of COVID-19: Connecting the dots, Infection, genetics and evolution: journal of molecular epidemiology and evolutionary genetics in infectious diseases, 2022, vol. 106: 105379. VOLOGZHANIN D.A. et al., Genetics of COVID-19, Journal of Clinical Practice, 2021, Vol. 12, N. 1, pp. 41-52. * |
| FRICKE-GALINDO, INGRID et al., IFNAR2 relevance in the clinical outcome of individuals with severe COVID-19, Frontiers in immunology, 2022, vol. 13, 949413. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2820347C1 (ru) | Способ генотипирования полиморфного локуса rs9636867 (A>G) гена IFNAR2 у человека методом ПЦР в режиме "реального времени" с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов | |
| RU2821922C1 (ru) | Способ генотипирования полиморфного локуса rs12610495 (A>G) гена DPP9 у человека методом ПЦР в режиме "реального времени" с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов | |
| RU2821925C1 (ru) | Способ генотипирования полиморфного локуса rs67579710 (G>A) гена THBS3 у человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов | |
| RU2821891C1 (ru) | Способ генотипирования полиморфного локуса rs17713054 (G>A) у человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов | |
| RU2822044C1 (ru) | Способ генотипирования полиморфного локуса rs143334143 (G>A) гена CCHCR1 у человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов | |
| RU2821904C1 (ru) | Способ генотипирования полиморфного локуса rs7949972 (C>T) гена ELF5 у человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов | |
| RU2828031C1 (ru) | Способ генотипирования полиморфного локуса rs117245733 (G>A) гена LOC124903162 у человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов | |
| RU2821081C1 (ru) | Способ генотипирования полиморфного локуса rs12585036 (C>T) гена ATP11A у человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов | |
| RU2853229C1 (ru) | Способ генотипирования полиморфного локуса rs66998222 (G>A) гена LOC102723323 у человека методом ПЦР в режиме "реального времени" с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов | |
| RU2826734C1 (ru) | Способ генотипирования полиморфного локуса rs7986407 (A>G) гена FOXO1 у человека методом ПЦР в режиме "реального времени" с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов | |
| RU2821083C1 (ru) | Способ генотипирования полиморфного локуса rs17078346 (A>C) у человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов | |
| RU2831059C1 (ru) | Способ генотипирования полиморфного локуса rs111837807 (T>C) гена CCHCR1 у человека методом ПЦР в режиме "реального времени" с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов | |
| RU2834032C1 (ru) | Способ генотипирования полиморфного локуса rs7907606 (Т>G) у человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов | |
| RU2853227C1 (ru) | Способ генотипирования полиморфного локуса rs10929757 (А>С) гена GREB1 у человека методом ПЦР в режиме реального времени с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов | |
| RU2835194C1 (ru) | Способ генотипирования полиморфного локуса rs547025 (T>C) гена SIRT3 у человека методом ПЦР в режиме "реального времени" с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов | |
| RU2808846C1 (ru) | Способ генотипирования полиморфного локуса rs8107914 (CT) гена C19orf53 у человека методом ПЦР в режиме "реального времени" с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов | |
| RU2853223C1 (ru) | Способ генотипирования полиморфного локуса rs11031731 (GA) у человека методом ПЦР в режиме реального времени с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов | |
| RU2821080C1 (ru) | Способ генотипирования полиморфного локуса rs42202 (A>G) у человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов | |
| RU2828032C1 (ru) | Способ генотипирования полиморфного локуса rs58415480 (C>G) гена SYNE1 у человека методом ПЦР в режиме "реального времени" с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов | |
| RU2850915C1 (ru) | Способ генотипирования полиморфного локуса rs6991952 (A>G) гена EBF2 у человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов | |
| RU2810474C1 (ru) | Способ генотипирования полиморфного локуса rs2901077 (C>T) гена C19orf53 у человека методом ПЦР в режиме "реального времени" с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов | |
| RU2853344C1 (ru) | Способ генотипирования полиморфного локуса rs2553772 (TG) гена LOC105376626 у человека методом ПЦР в режиме "реального времени" с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов | |
| RU2853222C1 (ru) | Способ генотипирования полиморфного локуса rs2235529 (C>T) гена WNT4 у человека методом ПЦР в режиме "реального времени" с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов | |
| RU2850914C1 (ru) | Способ генотипирования полиморфного локуса rs641760 (TC) гена PITPNM2 у человека методом ПЦР в режиме "реального времени" с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов | |
| RU2833707C1 (ru) | Способ генотипирования полиморфного локуса rs3170633 (C>T) гена GCLM у человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов |