RU2819925C1

RU2819925C1 - Novel version of bifunctional transcriptional regulator of pyr/uracil phosphoribosyltransferase operon and method for producing imp

Info

Publication number: RU2819925C1
Application number: RU2023112089A
Authority: RU
Inventors: Нара КВОН; Джи Хе Ли; Чжин А РО; Хи Су КВОН; Хён-Чжу БОН; Сун Кван СОН; Лан ХУ; Херён Ю; Бина КИМ
Original assignee: СиДжей ЧеилДжеданг Корпорейшн
Priority date: 2021-04-29
Filing date: 2021-07-15
Publication date: 2024-05-28

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: disclosed is a polypeptide involved in the production of IMP (5'-inosyl monophosphate), consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, in which proline, which is an amino acid corresponding to position 108 in SEQ ID NO: 3 is replaced by serine. Also disclosed is a polynucleotide coding said polypeptide, a Corynebacterium stationis microorganism producing IMP containing said polypeptide or a polynucleotide coding said polypeptide, a method of producing IMP using said microorganism.

EFFECT: invention enables to obtain IMP with high output.

5 cl, 1 tbl, 2 ex

Description

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯFIELD OF THE INVENTION

Настоящее раскрытие относится к новому варианту бифункционального транскрипционного регулятора оперона pyr/урацилфосфорибозилтрансферазы, штамму Corynebacterium stationis, содержащему данный вариант, и к способу получения ИМФ (5'-инозинмонофосфат) с использованием данного штамма.The present disclosure relates to a new variant of the bifunctional transcriptional regulator of the pyr/uracil phosphoribosyltransferase operon, a Corynebacterium stationis strain containing this variant, and a method for producing IMP (5'-inosine monophosphate) using this strain.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИBACKGROUND ART

Проводятся разные исследования для разработки высокоэффективных микроорганизмов и технологий способов ферментации для производства ИМФ и других полезных веществ. Например, главным образом, используется специфичный подход в отношении целевого вещества, при котором увеличивается экспрессия гена, кодирующего фермент, участвующий в биосинтезе ИМФ, или при котором удаляются гены, не являющиеся необходимыми для биосинтеза (ЕР 3722430 A1, US 2020-0347346 A1). В качестве примера фермента, участвующего в биосинтезе ИМФ, имеется бифункциональный транскрипционный регулятор оперона pyr/урацилфосфорибозилтрансфераза (https://www.uniprot.org/uniprot/A0A0M2NXT1).Various studies are being carried out to develop highly efficient microorganisms and fermentation method technologies for the production of IMP and other useful substances. For example, a target substance specific approach is generally used, in which the expression of the gene encoding the enzyme involved in the biosynthesis of IMP is increased, or in which genes that are not necessary for the biosynthesis are deleted (EP 3722430 A1, US 2020-0347346 A1). An example of an enzyme involved in IMP biosynthesis is the bifunctional transcriptional regulator of the pyr/uracilphosphoribosyltransferase operon (https://www.uniprot.org/uniprot/A0A0M2NXT1).

Однако все еще необходимо проводить исследования для эффективного увеличения способности к продуцированию ИМФ, так как возрастает спрос на ИМФ.However, research is still needed to effectively increase IMP production capacity as the demand for IMP increases.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯDESCRIPTION OF THE INVENTION

Техническая проблемаTechnical problem

Авторы настоящего изобретения разработали новый вариант бифункционального транскрипционного регулятора оперона pyr/урацилфосфорибозилтрансферазы Corynebacterium stationis, содержащий данный вариант, и способ получения ИМФ с использованием данного штамма, посредством этого осуществляя настоящее раскрытие.The present inventors have developed a new variant of a bifunctional transcriptional regulator of the Corynebacterium stationis pyr/uracilphosphoribosyltransferase operon containing this variant, and a method for producing IMP using this strain, thereby implementing the present disclosure.

Техническое решениеTechnical solution

Целью настоящего раскрытия является предоставление варианта бифункционального транскрипционного регулятора оперона pyr/урацилфосфорибозилтрансферазы, состоящего из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 1, в которой пролин, представляющий собой аминокислоту, соответствующую положению 108 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3, заменен серином.The purpose of the present disclosure is to provide a variant bifunctional transcriptional regulator of the pyr/uracil phosphoribosyltransferase operon, consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, in which proline, which is the amino acid corresponding to position 108 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, is replaced by serine.

Другой целью настоящего раскрытия является предоставление полинуклеотида, кодирующего вариант по настоящему раскрытию.Another object of the present disclosure is to provide a polynucleotide encoding a variant of the present disclosure.

Еще одной другой целью настоящего раскрытия является предоставление штамма Corynebacterium stationis, который содержит вариант по настоящему раскрытию, или полинуклеотид, кодирующий данный вариант, и имеет способность к продуцированию ИМФ.It is yet another object of the present disclosure to provide a strain of Corynebacterium stationis that contains a variant of the present disclosure, or a polynucleotide encoding the variant, and has the ability to produce IMP.

Еще одной другой целью настоящего раскрытия является предоставление способа получения ИМФ, который включает культивирование штамма Corynebacterium stationis, который содержит вариант по настоящему раскрытию, или полинуклеотид, кодирующий данный вариант, и имеет способность к продуцированию ИМФ в среде.It is yet another object of the present disclosure to provide a method for producing IMP, which includes cultivating a strain of Corynebacterium stationis that contains a variant of the present disclosure, or a polynucleotide encoding the variant, and has the ability to produce IMP in a medium.

Полезные эффектыBeneficial effects

В случае культивирования штамма Corynebacterium stationis содержащего вариант бифункционального транскрипционного регулятора оперона руг/урацилфосфорибозилтрансферазы по настоящему раскрытию, возможно получать ИМФ с более высоким выходом по сравнению со случаем существующих микроорганизмов, имеющих немодифицированные полипептиды.In the case of cultivating a Corynebacterium stationis strain containing a variant of the bifunctional transcriptional regulator pyr/uracilphosphoribosyltransferase operon of the present disclosure, it is possible to obtain IMP in higher yield compared to the case of existing microorganisms having unmodified polypeptides.

Наилучший способ воплощения изобретенияThe best way to implement the invention

Настоящее раскрытие будет подробно описано следующим образом. Тем временем, каждое из описаний и воплощений, раскрытых в настоящем раскрытии, можно применять к другим описаниям и воплощениям. Другими словами, все комбинации разных элементов, раскрытых в настоящем раскрытии, принадлежат к объему настоящего раскрытия. Кроме того, нельзя считать, что объем настоящего раскрытия ограничивается конкретным описанием, приведенным ниже. Кроме того, во всем настоящем описании изобретения приводятся ссылки целого ряда статей и патентных документов, и указываются их цитирования. Вся полнота содержания, раскрытого в процитированных статьях и патентных документах, включается в настоящее описание изобретения посредством ссылки для того, чтобы более ясно описать уровень технической области, к которой принадлежит настоящее изобретение, и содержание настоящего изобретения.The present disclosure will be described in detail as follows. Meanwhile, each of the descriptions and embodiments disclosed in the present disclosure can be applied to other descriptions and embodiments. In other words, all combinations of different elements disclosed in the present disclosure fall within the scope of the present disclosure. Moreover, the scope of the present disclosure should not be considered to be limited to the specific description below. In addition, throughout this specification, references and citations are made to a number of articles and patent documents. The entirety of the content disclosed in the cited articles and patent documents is incorporated herein by reference in order to more clearly describe the level of technical field to which the present invention belongs and the content of the present invention.

Согласно одному аспекту настоящего раскрытия предложен вариант бифункционального транскрипционного регулятора оперона pyr/урацилфосфорибозилтрансферазы, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 1, в котором пролин, представляющий собой аминокислоту, соответствующую положению 108 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3, заменен серином.According to one aspect of the present disclosure, a variant bifunctional transcriptional regulator of the pyr/uracil phosphoribosyltransferase operon is provided, consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, in which proline, which is the amino acid corresponding to position 108 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, is replaced by serine.

Вариант по настоящему раскрытию может иметь, содержать, состоять или по существу состоять из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 1.A variant of the present disclosure may have, contain, consist of, or essentially consist of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.

В варианте по настоящему раскрытию аминокислота, соответствующая положению 108 на основе аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3 в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 1, представляет собой серии и может содержать аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 70%-ную, 75%-ную, 80%-ную, 85%-ную, 90%-ную, 95%-ную, 96%-ную, 97%-ную, 98%-ную, 99%-ную, 99,5%-ную, 99,7%-ную или 99,9%-ную или большую гомологию или идентичность с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 1. Очевидно то, что варианты, имеющие аминокислотные последовательности, в которых некоторые последовательности удалены, модифицированы, заменены, консервативно заменены или добавлены, также включаются в объем настоящего раскрытия, при условии, что аминокислотные последовательности имеют такую гомологию или идентичность и демонстрируют эффективность, соответствующую эффективности варианта по настоящему раскрытию.In an embodiment of the present disclosure, the amino acid corresponding to position 108 based on the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is a series and may comprise an amino acid sequence having at least 70%, 75% -th, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7% or 99.9% or greater homology or identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. It is apparent that variants having amino acid sequences in which certain sequences are deleted, modified, replaced, are conserved substituted or added are also included within the scope of the present disclosure, provided that the amino acid sequences have such homology or identity and demonstrate effectiveness consistent with that of the variant of the present disclosure.

Его примеры включают варианты, имеющие присоединение или делецию последовательности, которые не изменяют функцию варианта по настоящему раскрытию, на N-конце, С-конце аминокислотной последовательности и/или внутри данной аминокислотной последовательности, встречающуюся в природе мутацию, молчащую мутацию или консервативную замену.Examples thereof include variants having a sequence addition or deletion that does not alter the function of the variant of the present disclosure, at the N-terminus, the C-terminus of an amino acid sequence and/or within a given amino acid sequence, a naturally occurring mutation, a silent mutation, or a conservative substitution.

Термин «консервативная замена» означает замену одной аминокислоты другой аминокислотой, имеющей аналогичные структурные и/или химические свойства. Такая аминокислотная замена обычно может существовать на основе сходства в полярности, заряде, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатической природы остатков. Обычно консервативная замена может слегка влиять или не влияет на активность белков или полипептидов.The term "conservative substitution" means the replacement of one amino acid with another amino acid having similar structural and/or chemical properties. Such an amino acid substitution may generally exist based on similarities in polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity and/or amphipathic nature of the residues. Typically, a conservative substitution may have little or no effect on the activity of proteins or polypeptides.

В настоящем раскрытии термин «вариант» относится к полипептиду, который имеет аминокислотную последовательность отличную от аминокислотной последовательности данного варианта перед изменением посредством консервативной замены и/или модификации одной или более чем одной аминокислоты, но сохраняет функции или свойства. Такой вариант обычно может быть идентифицирован посредством модифицирования одной или более чем одной аминокислоты аминокислотной последовательности данного полипептида и осуществления оценки свойств данного модифицированного полипептида. Другими словами, способность данного варианта может быть увеличена, оставлена неизменной или снижена по сравнению со способностью полипептида перед изменением. Некоторые варианты могут включать варианты, в которых одна или более чем одна часть, такая как N-концевая лидерная последовательность или трансмембранный домен, были удалены. Другие варианты могут включать варианты, в которых была удалена часть N- и/или С-конца от зрелого белка. Термин «вариант» можно использовать взаимозаменяемо с такими терминами, как модификация, модифицированный полипептид, модифицированный белок, мутант, мутеин и дивергент, и не ограничивается ими, при условии, что он представляет собой термин, используемый со значением вариации. В целях настоящего раскрытия данный вариант может представлять собой полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 1, в которой пролин, представляющий собой аминокислоту, соответствующую положению 108 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3, заменен серином.As used herein, the term “variant” refers to a polypeptide that has an amino acid sequence different from the amino acid sequence of the variant before being altered by conservative substitution and/or modification of one or more amino acids, but retains the functions or properties. Such a variant can typically be identified by modifying one or more amino acids of the amino acid sequence of the polypeptide and evaluating the properties of the modified polypeptide. In other words, the ability of a given variant may be increased, unchanged, or decreased compared to the ability of the polypeptide before the change. Some variants may include variants in which one or more than one portion, such as an N-terminal leader sequence or transmembrane domain, has been deleted. Other variants may include variants in which a portion of the N- and/or C-terminus of the mature protein has been removed. The term “variant” may be used interchangeably with, and is not limited to, modification, modified polypeptide, modified protein, mutant, mutein, and divergent, provided that it is a term used with the meaning of variation. For purposes of the present disclosure, the variant may be a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in which proline, which is the amino acid corresponding to position 108 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, is replaced by serine.

Данный вариант может содержать делеции или присоединения аминокислот, которые имеют минимальное влияние на свойства и вторичную структуру полипептида. Например, с N-концом данного варианта может быть конъюгирована сигнальная (или лидерная) последовательность, которая котрансляционно или посттрансляционно участвует в транслокации белка. Данный вариант может быть конъюгирован с другими последовательностями или линкерами таким образом, чтобы его идентифицировать, очистить или синтезировать.This variant may contain deletions or additions of amino acids that have minimal effect on the properties and secondary structure of the polypeptide. For example, a signal (or leader) sequence that is co-translationally or post-translationally involved in protein translocation may be conjugated to the N-terminus of a given variant. The variant may be conjugated to other sequences or linkers so that it can be identified, purified, or synthesized.

В настоящем раскрытии термин «гомология» или «идентичность» означает степень сходства между двумя данными аминокислотными последовательностями или последовательностями оснований и может выражаться в виде процентной доли. Термины «гомология» и «идентичность» часто могут использоваться взаимозаменяемо.As used herein, the term “homology” or “identity” means the degree of similarity between two given amino acid or base sequences and may be expressed as a percentage. The terms homology and identity can often be used interchangeably.

Гомологию или идентичность последовательности консервативного полинуклеотида или полипептида определяют стандартными алгоритмами выравнивания, и можно совместно использовать штраф за пропуск по умолчанию, установленный применяемой программой. По существу гомологичные или идентичные последовательности обычно способны к гибридизации со всей или с частью последовательности при условиях умеренной или высокой жесткости. Очевидно, что гибридизация также включает гибридизацию полинуклеотида с полинуклеотидом, содержащим кодон общего типа или вырожденный кодон.The homology or sequence identity of a conserved polynucleotide or polypeptide is determined by standard alignment algorithms, and a default skip penalty set by the program being used can be used. Substantially homologous or identical sequences are generally capable of hybridizing to all or part of the sequence under moderate to high stringency conditions. It will be appreciated that hybridization also includes hybridization of a polynucleotide with a polynucleotide containing a common codon or a degenerate codon.

Имеют ли любые две последовательности полинуклеотида или полипептида гомологию, сходство или идентичность, можно определять с использованием известных компьютерных алгоритмов, таких как программа «FASTA», например, с использованием параметров по умолчанию как в Pearson et al, (1988) Proc. Natl Acad. Sci. USA 85:2444. В качестве альтернативы, гомология, сходство или идентичность могут быть определены с использованием алгоритма Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol 48:443-153), как осуществляется в программе Нидлмана пакета EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al, 2000, Trends Genet. 16:276-277) (версия 5.0.0 или более поздняя) (включая программный пакет GCG (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12:387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S. F., et al., J MOLEC BIOL 215:403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994; и CARILLO et al (1988) SIAM J Applied Math 48:1073). Например, для определения гомологии, сходства или идентичности можно использовать BLAST Национального центра биотехнологической информации или ClustalW.Whether any two polynucleotide or polypeptide sequences have homology, similarity or identity can be determined using known computer algorithms such as the FASTA program, for example using default parameters as in Pearson et al, (1988) Proc. Natl Acad. Sci. USA 85:2444. Alternatively, homology, similarity or identity can be determined using the Needleman-Wunsch algorithm (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol 48:443-153), as implemented in the Needleman program of the EMBOSS package (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al, 2000, Trends Genet. 16:276-277) (version 5.0.0 or later) (including the GCG software package (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12:387 ( 1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S. F., et al., J MOLEC BIOL 215:403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994; and CARILLO et al (1988) SIAM J Applied Math 48:1073) For example, National Center for Biotechnology Information BLAST or ClustalW can be used to determine homology, similarity, or identity.

Гомологию, сходство или идентичность полинуклеотидов или полипептидов можно определять посредством сравнения информации по последовательности с использованием, например, компьютерной программы GAP, как, например, Needleman (1970), J Mol Biol 48:443, как анонсировано, например, в Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482. В заключение, результат программы GAP может быть определен как значение, полученное делением числа аналогичных выровненных символов (а именно: нуклеотидов или аминокислот) на общее число символов в более короткой из двух последовательностей. Параметры по умолчанию программы GAP могут включать (1) матрицу двоичных сравнений (включающую значения 1 для идентичности и 0 для неидентичности) и матрицу взвешенных сравнений Gribskov et al (1986) Nucl Acids Res. 14:6745 (или матрицу замен EDNAFULL (EMBOSS версии NCBI NUC4.4)), как раскрыто в Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp.353-358 (1979); (2) штраф 3,0 для каждого пропуска и дополнительный штраф 0,10 для каждого символа в каждом пропуске (или штраф 10 за открытие пропуска, штраф 0,5 за удлинение пропуска); и (3) отсутствие штрафа за концевые пропуски.Homology, similarity or identity of polynucleotides or polypeptides can be determined by comparison of sequence information using, for example, the GAP computer program, such as Needleman (1970), J Mol Biol 48:443, as announced, for example, in Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482. In conclusion, the result of a GAP program can be defined as the value obtained by dividing the number of similar aligned characters (namely nucleotides or amino acids) by the total number of characters in the shorter of the two sequences. The default parameters of the GAP program may include (1) a binary comparison matrix (including values of 1 for identity and 0 for non-identity) and a weighted comparison matrix Gribskov et al (1986) Nucl Acids Res. 14:6745 (or the EDNAFULL substitution matrix (EMBOSS version NCBI NUC4.4)), as disclosed in Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979); (2) a 3.0 penalty for each skip and an additional 0.10 penalty for each character in each skip (or a 10 penalty for opening a skip, a 0.5 penalty for extending a skip); and (3) no penalty for end skips.

В качестве примера по настоящему раскрытию, вариант по настоящему раскрытию может демонстрировать активность бифункционального транскрипционного регулятора оперона pyr/урацилфосфорибозилтрансферазы. Вариант по настоящему раскрытию может демонстрировать активность таким образом, чтобы иметь повышенную способность к продуцированию ИМФ по сравнению с полипептидом дикого типа, демонстрирующим активность бифункционального транскрипционного регулятора оперона pyr/урацилфосфорибозилтрансферазы.As an example of the present disclosure, a variant of the present disclosure may demonstrate bifunctional transcriptional regulator activity of the pyr/uracil phosphoribosyltransferase operon. A variant of the present disclosure may exhibit activity such as to have an increased ability to produce IMP compared to a wild-type polypeptide exhibiting bifunctional transcriptional regulator activity of the pyr/uracil phosphoribosyltransferase operon.

В настоящем раскрытии «бифункциональный транскрипционный регулятор оперона pyr/урацилфосфорибозилтрансфераза» регулирует аттенуацию транскрипции оперона пиримидиновых нуклеотидов (pyr) способом, зависимым от уридина. В частности, термин «бифункциональный транскрипционный регулятор оперона pyr/урацилфосфорибозилтрансфераза» по настоящему раскрытию может использоваться взаимозаменяемо с «PyrR». В настоящем раскрытии последовательность бифункционального транскрипционного регулятора оперона pyr/урацилфосфорибозилтрансферазы может быть получена из GenBank NCBI - известной базы данных. В частности, бифункциональный транскрипционный регулятор оперона pyr/урацилфосфорибозилтрансфераза может представлять собой полипептид, имеющий активность бифункционального транскрипционного регулятора оперона руг/урацилфосфорибозилтрансферазы, кодируемой геном pyrR, но не ограничивается им.In the present disclosure, a “bifunctional transcriptional regulator of the pyr operon/uracil phosphoribosyltransferase” regulates transcriptional attenuation of the pyrimidine nucleotide (pyr) operon in a uridine-dependent manner. In particular, the term "bifunctional transcriptional regulator of the pyr operon/uracil phosphoribosyltransferase" as used herein may be used interchangeably with "PyrR". In the present disclosure, the sequence of the bifunctional transcriptional regulator of the pyr/uracilphosphoribosyltransferase operon can be obtained from GenBank NCBI, a well-known database. In particular, the bifunctional transcriptional regulator of the pyr operon/uracil phosphoribosyltransferase may be a polypeptide having, but is not limited to, the bifunctional transcriptional regulator of the pyr/uracil phosphoribosyltransferase operon encoded by the pyrR gene.

В настоящем раскрытии термин «соответствующий» относится к аминокислотным остаткам в положениях, перечисленных в полипептиде, или к аминокислотным остаткам, которые являются аналогичными, идентичными или гомологичными остаткам, перечисленным в данном полипептиде. Идентификация аминокислоты в соответствующем положении может определяться специфической аминокислотой в последовательности, которая относится к специфической последовательности. Термин «соответствующая область» в том виде, в котором онздесь используется, обычно относится к аналогичному или соответствующему положению в родственном белке или эталонном белке.As used herein, the term “corresponding” refers to amino acid residues at positions listed in a polypeptide, or to amino acid residues that are similar, identical, or homologous to residues listed in a given polypeptide. The identity of the amino acid at the corresponding position may be determined by the specific amino acid in the sequence that relates to the specific sequence. The term "corresponding region" as used herein generally refers to a similar or corresponding position in a related protein or reference protein.

Например, произвольная аминокислотная последовательность выравнивается с SEQ ID NO: 3, и, на основе этого, каждый аминокислотный остаток данной аминокислотной последовательности может быть пронумерован по отношению к аминокислотному остатку SEQ ID NO: 3 и числовому положению соответствующего аминокислотного остатка. Например, алгоритм выравнивания последовательности, как описано в настоящем раскрытии, может определять положение аминокислоты или положение, в котором происходит модификация, такая как замена, вставка или делеция, посредством сравнения с положением в запрашиваемой последовательности (также именуемой «эталонная последовательность»).For example, an arbitrary amino acid sequence is aligned to SEQ ID NO: 3, and based on this, each amino acid residue of the amino acid sequence can be numbered with respect to the amino acid residue of SEQ ID NO: 3 and the numerical position of the corresponding amino acid residue. For example, a sequence alignment algorithm, as described in the present disclosure, can determine the position of an amino acid or the position at which a modification, such as a substitution, insertion, or deletion, occurs by comparison with a position in a query sequence (also referred to as a “reference sequence”).

Для таких выравниваний, например, можно использовать алгоритм Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol 48:443-453), программу Нидлмана пакета EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al, 2000, Trends Genet 16:276-277) и тому подобные, но программа и алгоритм не ограничиваются ими, и подходящим образом можно использовать программу выравнивания последовательностей, алгоритм попарного сравнения последовательностей и тому подобное, известные в данной области.For such alignments, for example, you can use the Needleman-Wunsch algorithm (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol 48:443-453), the Needleman program of the EMBOSS package (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al, 2000, Trends Genet 16:276-277) and the like, but the program and algorithm are not limited to them, and a sequence alignment program, a pairwise sequence comparison algorithm, and the like known in the art may be suitably used.

Другим аспектом настоящего раскрытия является предоставление полинуклеотида, кодирующего вариант по настоящему раскрытию.Another aspect of the present disclosure is to provide a polynucleotide encoding a variant of the present disclosure.

В настоящем раскрытии термин «полинуклеотид» представляет собой цепь ДНК или РНК, имеющую определенную или большую длину, в качестве полимера нуклеотидов, в котором нуклеотидные мономеры соединяются в длинную цепь ковалентными связями, и, более конкретно, означает фрагмент полинуклеотида, кодирующий данный вариант.In the present disclosure, the term “polynucleotide” represents a DNA or RNA chain of specified or greater length as a polymer of nucleotides in which nucleotide monomers are linked into a long chain by covalent bonds, and more specifically means a polynucleotide fragment encoding the variant.

Полинуклеотид, кодирующий вариант по настоящему раскрытию, может содержать последовательность оснований, кодирующую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 1. В качестве примера по настоящему раскрытию полинуклеотид по настоящему раскрытию может иметь или содержать последовательность SEQ ID NO: 2. Полинуклеотид по настоящему раскрытию может состоять или по существу состоит из последовательности SEQ ID NO: 2.A polynucleotide encoding a variant of the present disclosure may contain a base sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. As an example of the present disclosure, a polynucleotide of the present disclosure may have or contain the sequence SEQ ID NO: 2. A polynucleotide of the present disclosure may consist of or essentially consist of the sequence SEQ ID NO: 2.

В полинуклеотиде по настоящему раскрытию могут быть сделаны разные модификации в кодирующей области при условии, что аминокислотная последовательность варианта по настоящему раскрытию не изменяется при рассмотрении вырожденности предпочтительных кодонов в организмах, которые предназначены для экспрессии варианта по настоящему раскрытию. В частности, полинуклеотид по настоящему раскрытию имеет или содержит последовательность оснований, имеющую 70%-ную или большую, 75%-ную или большую, 80%-ную или большую, 85%-ную или большую, 90%-ную или большую, 95%-ную или большую, 96%-ную или большую, 97%-ную или большую, 98%-ную или большую, но менее, чем 100%-ную гомологию или идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 2 или может состоять или по существу состоит из последовательности оснований, имеющей 70%-ную или большую, 75%-ную или большую, 80%-ную или большую, 85%-ную или большую, 90%-ную или большую, 95%-ную или большую, 96%-ную или большую, 97%-ную или большую, 98%-ную или большую, но менее, чем 100%-ную гомологию или идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 2, но не ограничиваясь ей. Здесь в последовательности, имеющей гомологию или идентичность, кодон, кодирующий аминокислоту, соответствующую положению 108 в SEQ ID NO: 1, может представлять собой один из кодонов, кодирующих серии.In a polynucleotide of the present disclosure, various modifications may be made in the coding region, provided that the amino acid sequence of the variant of the present disclosure is not altered by consideration of the degeneracy of the preferred codons in organisms that are intended to express the variant of the present disclosure. In particular, a polynucleotide of the present disclosure has or contains a base sequence having 70% or greater, 75% or greater, 80% or greater, 85% or greater, 90% or greater, 95 % or greater, 96% or greater, 97% or greater, 98% or greater, but less than 100% homology or identity with the sequence SEQ ID NO: 2 or may consist of or essentially consists of a sequence of bases having 70% or greater, 75% or greater, 80% or greater, 85% or greater, 90% or greater, 95% or greater, 96 % or greater, 97% or greater, 98% or greater, but less than 100% homology or identity with, but not limited to, the sequence SEQ ID NO: 2. Here, in a sequence having homology or identity, the codon encoding the amino acid corresponding to position 108 in SEQ ID NO: 1 may be one of the codons encoding the series.

Полинуклеотид по настоящему раскрытию может содержать зонд, который может быть получен из последовательности известного гена, например, последовательности без ограничения при условии, что она представляет собой последовательность, которая может гибридизоваться с комплементарной последовательностью всей или части последовательности полинуклеотида по настоящему раскрытию при жестких условиях. «Жесткие условия» означают условия, которые обеспечивают специфичную гибридизацию между полинуклеотидами. Данные условия конкретно описаны в документах (см. J. Sambrook et al, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2^nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, 9.50-9.51, 11.7-11.8). Их примеры включают условия, при которых полинуклеотиды, имеющие более высокую гомологию или идентичность, а именно: полинуклеотиды, имеющие 70%-ную или большую, 75%-ную или большую, 80%-ную или большую, 85%-ную или большую, 90%-ную или большую, 95%-ную или большую, 96%-ную или большую, 97%-ную или большую, 98%-ную или большую, или 99%-ную или большую гомологию или идентичность, гибридизуются друг с другом, тогда как полинуклеотиды, имеющие меньшую гомологию или идентичность, не гибридизуются друг с другом, или условия, при которых промывка осуществляется один раз, в частности, от двух до трех раз при концентрации соли и температуре, эквивалентных 60°С, 1×SSC (раствор цитрата и хлорида натрия), 0,1% SDS (додецилсульфат натрия), в частности, при 60°С, 0,1×SSC, 0,1% SDS, более конкретно, при 68°С, 0,1×SSC, 0,1% SDS, которые представляют собой условия промывки для обычной гибридизации по Саузерну.The polynucleotide of the present disclosure may contain a probe that may be derived from a known gene sequence, for example, a sequence without limitation, provided that it is a sequence that can hybridize to the complementary sequence of all or part of the sequence of the polynucleotide of the present disclosure under stringent conditions. "Stringent conditions" means conditions that provide specific hybridization between polynucleotides. These conditions are specifically described in the documents (see J. Sambrook et al, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, ^2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F. M. Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, 9.50-9.51, 11.7-11.8). Examples thereof include conditions in which polynucleotides having higher homology or identity, namely polynucleotides having 70% or greater, 75% or greater, 80% or greater, 85% or greater, 90% or greater, 95% or greater, 96% or greater, 97% or greater, 98% or greater, or 99% or greater homology or identity, hybridize with each other , while polynucleotides having less homology or identity do not hybridize with each other, or conditions under which washing is carried out once, in particular two to three times at a salt concentration and temperature equivalent to 60°C, 1xSSC ( sodium citrate and chloride solution), 0.1% SDS, in particular at 60°C, 0.1×SSC, 0.1% SDS, more particularly at 68°C, 0.1×SSC , 0.1% SDS, which are the washing conditions for conventional Southern hybridization.

Для гибридизации требуется то, чтобы две нуклеиновые кислоты имели комплементарные последовательности, хотя и допускаются несоответствия между основаниями, в зависимости от жесткости гибридизации. Термин «комплементарный» используется для описания связи между нуклеотидными основаниями, способными к гибридизации друг с другом. Например, в отношении ДНК, аденин является комплементарным тимину, а цитозин является комплементарным гуанину. Следовательно, полинуклеотид по настоящему раскрытию также может содержать по существу аналогичные последовательности нуклеиновой кислоты, а также фрагменты выделенной нуклеиновой кислоты, которые являются комплементарными всей последовательности.Hybridization requires that the two nucleic acids have complementary sequences, although mismatches between bases are allowed, depending on the stringency of hybridization. The term "complementary" is used to describe the relationship between nucleotide bases that are capable of hybridizing with each other. For example, in relation to DNA, adenine is complementary to thymine, and cytosine is complementary to guanine. Therefore, the polynucleotide of the present disclosure may also contain substantially similar nucleic acid sequences, as well as isolated nucleic acid fragments that are complementary to the entire sequence.

В частности, полинуклеотид, имеющий гомологию или идентичность с полинуклеотидом по настоящему раскрытию, может быть выявлен с использованием условий гибридизации, включая стадию гибридизации при значении T_m 55°С и вышеописанных условиях. Значение T_m может составлять 60°С, 63°С или 65°С, но не ограничивается ими, и может подходящим образом корректироваться специалистами в данной области согласно цели.In particular, a polynucleotide having homology or identity with a polynucleotide of the present disclosure can be detected using hybridization conditions, including a hybridization step at a T _m value of 55°C and the conditions described above. The T _m value may be, but is not limited to, 60°C, 63°C, or 65°C, and may be suitably adjusted by those skilled in the art according to purpose.

Подходящая жесткость для гибридизации полинуклеотида зависит от длины и степени комплементарности данного полинуклеотида, и переменные хорошо известны в данной области (например, J. Sambrook et al, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2^nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989).The appropriate stringency for hybridizing a polynucleotide depends on the length and degree of complementarity of the polynucleotide, and the variables are well known in the art (e.g., J. Sambrook et al, Molecular Cloning A Laboratory Manual, ^2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989).

Другим аспектом настоящего раскрытия является предложение вектора, содержащего полинуклеотид по настоящему раскрытию. Данный вектор может представлять собой экспрессионный вектор для осуществления экспрессии полинуклеотида в клетке-хозяине, но не ограничивается им.Another aspect of the present disclosure is to provide a vector containing a polynucleotide of the present disclosure. The vector may be, but is not limited to, an expression vector for expressing a polynucleotide in a host cell.

Вектор по настоящему раскрытию может включать ДНК-конструкцию, содержащую последовательность полинуклеотида, кодирующую интересующий полипептид, связанный функциональным образом с подходящей регуляторной областью экспрессии (или последовательностью контроля экспрессии) таким образом, что интересующий полипептид может экспрессироваться в подходящем хозяине. Регуляторная область экспрессии может содержать промотор, способный инициировать транскрипцию, любую последовательность оператора для осуществления контроля транскрипции, последовательность, кодирующую подходящий сайт связывания мРНК с рибосомой, и последовательность, контролирующую терминацию транскрипции и трансляции. Данный вектор можно трансформировать в подходящую клетку-хозяина, и затем он может реплицироваться или функционировать независимо от генома хозяина, или может сам интегрироваться в геном.A vector of the present disclosure may include a DNA construct containing a polynucleotide sequence encoding a polypeptide of interest operably linked to a suitable expression regulatory region (or expression control sequence) such that the polypeptide of interest can be expressed in a suitable host. The expression regulatory region may comprise a promoter capable of initiating transcription, any operator sequence for controlling transcription, a sequence encoding a suitable mRNA ribosome binding site, and a sequence controlling the termination of transcription and translation. The vector can be transformed into a suitable host cell and can then replicate or function independently of the host genome, or can itself integrate into the genome.

Вектор, используемый в настоящем раскрытии, конкретно не ограничивается, но можно использовать любой вектор, известный в данной области. Примеры обычно используемых векторов включают природные или рекомбинантные плазмиды, космиды, вирусы и бактериофаги. Например, в качестве фагового вектора или космидного вектора можно использовать pWE15, М13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, Charon21A и тому подобные, и в качестве плазмидного вектора можно использовать систему pDZ, систему pBR, систему pUC, систему pBluescript II, систему pGEM, систему pTZ, систему pCL, систему рЕТ и тому подобные. В частности, можно использовать векторы pDZ, pDC, pDCM2, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118 и pCC1BAC, и тому подобные.The vector used in the present disclosure is not particularly limited, but any vector known in the art can be used. Examples of commonly used vectors include natural or recombinant plasmids, cosmids, viruses and bacteriophages. For example, pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, Charon21A and the like can be used as a phage vector or cosmid vector, and pDZ system, pBR system, system pUC, pBluescript II system, pGEM system, pTZ system, pCL system, pET system and the like. In particular, the vectors pDZ, pDC, pDCM2, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118 and pCC1BAC, and the like, can be used.

Например, полинуклеотид, кодирующий интересующий полипептид, можно вставлять в хромосому посредством вектора для внутриклеточной хромосомной вставки. Вставку данного полинуклеотида в хромосому можно осуществлять любым способом, известным в данной области, например, гомологичной рекомбинацией, но не ограничиваясь ей. Данный вектор может дополнительно содержать селективный маркер для подтверждения вставки в хромосому. Данный селективный маркер служит для отбора клеток, трансформированных векторами, то есть, для подтверждения вставки интересующей молекулы нуклеиновой кислоты, и можно использовать маркеры, которые придают селектируемые фенотипы, такие как устойчивость к лекарственным средствам, ауксотрофия, устойчивость к цитотоксическим агентам или экспрессия поверхностных полипептидов. В среде при обработке селективным агентом выживают или демонстрируют другие фенотипические признаки только клетки, экспрессирующие селективный маркер, и, таким образом, могут быть отобраны трансформированные клетки.For example, a polynucleotide encoding a polypeptide of interest can be inserted into a chromosome via an intracellular chromosomal insertion vector. Insertion of a given polynucleotide into a chromosome can be accomplished by any method known in the art, such as, but not limited to, homologous recombination. The vector may additionally contain a selectable marker to confirm insertion into the chromosome. This selectable marker serves to select cells transformed with the vectors, that is, to confirm insertion of a nucleic acid molecule of interest, and markers that confer selectable phenotypes such as drug resistance, auxotrophy, resistance to cytotoxic agents, or expression of surface polypeptides can be used. In the medium, when treated with a selection agent, only cells expressing the selection marker survive or exhibit other phenotypic characteristics, and thus transformed cells can be selected.

В настоящем раскрытии термин «трансформация» означает то, что вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий целевой полипептид, вводится в клетку-хозяина или микроорганизм таким образом, что полипептид, кодируемый данным полинуклеотидом, может экспрессироваться в клетке-хозяине. Трансформированный полинуклеотид может локализоваться посредством вставки в хромосому клетки-хозяина или локализоваться вне хромосомы, при условии, что он может экспрессироваться в данной клетке-хозяине. Данный полинуклеотид содержит ДНК и/или РНК, кодирующую интересующий полипептид. Данный полинуклеотид может быть введен в любой форме, при условии, что он может быть введен в клетку-хозяина и может экспрессироваться. Например, данный полинуклеотид может быть введен в клетку-хозяина в виде экспрессионной кассеты, которая представляет собой генетическую конструкцию, содержащую все элементы, требующиеся для автономной экспрессии. Данная экспрессионная кассета обычно может содержать промотор, связанный функциональным образом с полинуклеотидом, сигнал терминации транскрипции, сайт связывания рибосомы и сигнал терминации трансляции. Данная экспрессионная кассета может находиться в виде экспрессионного вектора, способного к автономной репликации. Полинуклеотид может быть введен в клетку-хозяина сам по себе и связан функциональным образом с последовательностью, требующейся для экспрессии в клетке-хозяине, но не ограничиваясь ей.In the present disclosure, the term “transformation” means that a vector containing a polynucleotide encoding a target polypeptide is introduced into a host cell or microorganism such that the polypeptide encoded by the polynucleotide can be expressed in the host cell. The transformed polynucleotide may be localized by insertion into the chromosome of a host cell or localized off-chromosome, provided that it can be expressed in the host cell. This polynucleotide contains DNA and/or RNA encoding the polypeptide of interest. The polynucleotide may be introduced in any form, provided that it can be introduced into a host cell and can be expressed. For example, a given polynucleotide can be introduced into a host cell in the form of an expression cassette, which is a genetic construct containing all the elements required for autonomous expression. The expression cassette typically may contain a promoter operably linked to the polynucleotide, a transcription termination signal, a ribosome binding site, and a translation termination signal. This expression cassette may be in the form of an expression vector capable of autonomous replication. The polynucleotide may be introduced into a host cell by itself and linked in a functional manner to, but not limited to, a sequence required for expression in the host cell.

В приведенном выше термин «связанный функциональным образом» означает то, что последовательность полинуклеотида функционально связана с последовательностью промотора, которая инициирует и опосредует транскрипцию полинуклеотида, кодирующего интересующий вариант по настоящему раскрытию.As used above, the term “operably linked” means that the polynucleotide sequence is operably linked to a promoter sequence that initiates and mediates transcription of the polynucleotide encoding the variant of interest of the present disclosure.

Еще одним другим аспектом настоящего раскрытия является предложение штамма Corynebacterium stationis, который содержит вариант по настоящему раскрытию или полинуклеотид по настоящему раскрытию.Yet another aspect of the present disclosure is the provision of a Corynebacterium stationis strain that contains a variant of the present disclosure or a polynucleotide of the present disclosure.

Штамм по настоящему раскрытию может содержать модифицированный полипептид по настоящему раскрытию, полинуклеотид, кодирующий данный полипептид, или вектор, содержащий полинуклеотид по настоящему раскрытию.A strain of the present disclosure may comprise a modified polypeptide of the present disclosure, a polynucleotide encoding the polypeptide, or a vector containing a polynucleotide of the present disclosure.

В настоящем раскрытии «штамм (или микроорганизм)» включает все микроорганизмы дикого типа или естественно или искусственно генетически модифицированные микроорганизмы, и он может представлять собой микроорганизм, в котором ослаблен или усилен специфический механизм из-за вставки внешнего гена или усиления активности, или инактивации эндогенного гена, и он может представлять собой микроорганизм, содержащий генетическую модификацию для продуцирования интересующего полипептида, белка или продукта.In the present disclosure, a "strain (or microorganism)" includes all wild-type microorganisms or naturally or artificially genetically modified microorganisms, and may be a microorganism in which a specific mechanism is weakened or enhanced due to the insertion of an external gene or enhancement of activity, or inactivation of an endogenous gene and may be a microorganism containing a genetic modification to produce the polypeptide, protein or product of interest.

Штамм по настоящему раскрытию может представлять собой штамм, содержащий любой один или более чем один вариант по настоящему раскрытию, полинуклеотид по настоящему раскрытию или вектор, содержащий полинуклеотид по настоящему раскрытию; штамм, модифицированный для экспрессии варианта по настоящему раскрытию или полинуклеотида по настоящему раскрытию; штамм (например, рекомбинантный штамм), экспрессирующий вариант по настоящему раскрытию или полинуклеотид по настоящему раскрытию; или штамм (например, рекомбинантный штамм), демонстрирующий активность варианта по настоящему раскрытию, но не ограничивается ими.A strain of the present disclosure may be a strain containing any one or more variants of the present disclosure, a polynucleotide of the present disclosure, or a vector containing a polynucleotide of the present disclosure; a strain modified to express a variant of the present disclosure or a polynucleotide of the present disclosure; a strain (eg, a recombinant strain) expressing a variant of the present disclosure or a polynucleotide of the present disclosure; or a strain (eg, a recombinant strain) exhibiting, but not limited to, activity of a variant of the present disclosure.

Штамм по настоящему раскрытию может представлять собой штамм, имеющий способность к продуцированию 5'-инозинмонофосфата (ИМФ).The strain of the present disclosure may be a strain having the ability to produce 5'-inosine monophosphate (IMP).

Штамм по настоящему раскрытию может представлять собой микроорганизм, имеющий в природе активность бифункционального транскрипционного регулятора оперона руг/урацилфосфорибозилтрансферазы или способность к продуцированию ИМФ, или микроорганизм, в котором вариант по настоящему раскрытию или полинуклеотид, кодирующий данный вариант (или вектор, содержащий данный полинуклеотид), вводят в родительский штамм, который не имеет бифункционального транскрипционного регулятора оперона руг/урацилфосфорибозилтрансферазы или способности к продуцированию ИМФ, и/или в котором способность к продуцированию ИМФ придается родительскому штамму, но не ограничивается им.A strain of the present disclosure may be a microorganism that naturally has bifunctional transcriptional regulator pyr/uracil phosphoribosyltransferase operon activity or the ability to produce IMP, or a microorganism in which a variant of the present disclosure or a polynucleotide encoding the variant (or a vector containing the polynucleotide) introduced into a parent strain that does not have the bifunctional transcriptional regulator pyr/uracilphosphoribosyltransferase operon or the ability to produce IMP, and/or in which the ability to produce IMP is conferred on the parent strain, but is not limited to it.

Например, штамм по настоящему раскрытию представляет собой клетку или микроорганизм, который трансформирован вектором, содержащим полинуклеотид по настоящему раскрытию, или полинуклеотидом, кодирующим вариант по настоящему раскрытию, и экспрессирует вариант по настоящему раскрытию. В целях настоящего раскрытия штамм по настоящему раскрытию может включать все микроорганизмы, которые содержат вариант по настоящему раскрытию и могут продуцировать ИМФ. Например, штамм по настоящему раскрытию может представлять собой рекомбинантный штамм, в котором полинуклеотид, кодирующий вариант по настоящему раскрытию, вводят в природный микроорганизм дикого типа или микроорганизм, продуцирующий ИМФ, для того, чтобы, таким образом, экспрессировать вариант бифункционального транскрипционного регулятора оперона руг/урацилфосфорибозилтрансферазы и иметь повышенную способность к продуцированию ИМФ. Рекомбинантный штамм, имеющий повышенную способность к продуцированию ИМФ, может представлять собой микроорганизм, имеющий повышенную способность к продуцированию ИМФ по сравнению с природным микроорганизмом дикого типа или микроорганизмом, не модифицированным бифункциональным транскрипционным регулятором оперона pyr/урацилфосфорибозилтрансферазы (а именно: микроорганизмом, экспрессирующим бифункциональный транскрипционный регулятор оперона pyr/урацилфосфорибозилтрансферазу дикого типа (SEQ ID NO: 3), или микроорганизмом, который не экспрессирует модифицированный белок (SEQ ID NO: 1), но не ограничивается им. Например, штамм по настоящему раскрытию, имеющий повышенную способность к продуцированию ИМФ, может представлять собой микроорганизм, имеющий повышенную способность к продуцированию ИМФ по сравнению с Corynebacterium stationis, который содержит полипептид SEQ ID NO: 3 или полинуклеотид, кодирующий данный полипептид, но не ограничивается им. В качестве примера, микроорганизм, не модифицированный бифункциональным транскрипционным регулятором оперона руг/урацилфосфорибозилтрансферазой, который представляет собой целевой штамм для сравнения увеличения способности к продуцированию ИМФ, может представлять собой штамм CJI2332 (KCCM12277P, KR 10-1950141 В1), но не ограничивается им.For example, a strain of the present disclosure is a cell or microorganism that is transformed with a vector containing a polynucleotide of the present disclosure, or a polynucleotide encoding a variant of the present disclosure, and expresses the variant of the present disclosure. For purposes of the present disclosure, a strain of the present disclosure may include all microorganisms that contain a variant of the present disclosure and can produce IMP. For example, a strain of the present disclosure may be a recombinant strain in which a polynucleotide encoding a variant of the present disclosure is introduced into a naturally occurring wild-type or IMP-producing microorganism to thereby express a variant of the bifunctional transcriptional regulator operon operon. uracilphosphoribosyltransferase and have an increased ability to produce IMP. The recombinant strain having an increased ability to produce IMP may be a microorganism having an increased ability to produce IMP compared to a naturally occurring wild-type microorganism or a microorganism not modified with the bifunctional transcriptional regulator of the pyr/uracil phosphoribosyltransferase operon (namely, a microorganism expressing the bifunctional transcriptional regulator of the pyr/uracil phosphoribosyltransferase operon) a wild-type pyr/uracil phosphoribosyltransferase operon (SEQ ID NO: 3), or a microorganism that does not express the modified protein (SEQ ID NO: 1), for example, a strain of the present disclosure having an increased ability to produce IMP may. be a microorganism having an increased ability to produce IMP compared to Corynebacterium stationis, which contains, but is not limited to, a polypeptide of SEQ ID NO: 3 or a polynucleotide encoding the polypeptide. As an example, a microorganism not modified by the bifunctional transcriptional regulator of the pyr/ operon. uracilphosphoribosyltransferase, which is a target strain for comparison of increasing the ability to produce IMP, may be, but is not limited to, strain CJI2332 (KCCM12277P, KR 10-1950141 B1).

Например, рекомбинантный штамм, имеющий повышенную способность к продуцированию, может иметь способность к продуцированию ИМФ, повышенную примерно на 1% или более, в частности, примерно на 1% или более, примерно на 2,5% или более, примерно на 5% или более, примерно на 6% или более, примерно на 7% или более, примерно на 8% или более, примерно на 9% или более, примерно на 10% или более, примерно на 11% или более, примерно на 11,5% или более, примерно на 12% или более, примерно на 12,5% или более, примерно на 13% или более, примерно на 13,5% или более, примерно на 14% или более, примерно на 14,5% или более, примерно на 15% или более, примерно на 15,5% или более, примерно на 16% или более, примерно на 16,5% или более, примерно на 17% или более, примерно на 17,5% или более, примерно на 18% или более, примерно на 18,5% или более, примерно на 19% или более, примерно на 19,5% или более, примерно на 20% или более, примерно на 20,5% или более, примерно на 21% или более, примерно на 21,5% или более, примерно на 22% или более, примерно на 22,5% или более, примерно на 23% или более, примерно на 23,5% или более, примерно на 24% или более, примерно на 24,5% или более, примерно на 26% или более, примерно на 27% или более, примерно на 27,5% или более, примерно на 27,6% или более, примерно на 27,7% или более, примерно на 27,8% или более, или примерно на 27,9% (верхняя граница конкретно не ограничивается и может составлять, например, примерно 200% или менее, примерно 150% или менее, примерно 100% или менее, примерно 50% или менее, примерно 40% или менее, или примерно 30% или менее) по сравнению со способностью к продуцированию ИМФ родительского штамма перед изменением или с немодифицированным микроорганизмом, но повышенное значение не ограничивается им, при условии, что способность к продуцированию имеет повышенное значение плюс значения по сравнению со способностью к продуцированию родительского штамма перед изменением или с немодифицированным микроорганизмом. В другом примере рекомбинантный штамм, имеющий повышенную способность к продуцированию, может иметь способность к продуцированию ИМФ, увеличенную примерно в 1,01 раза или более, примерно в 1,02 раза или более, примерно в 1,03 раза или более, примерно в 1,05 раза или более, примерно в 1,06 раза или более, примерно в 1,07 раза или более, примерно в 1,08 раза или более, примерно в 1,09 раза или более, примерно в 1,10 раза или более, примерно в 1,11 раза или более, примерно в 1,12 раза или более, примерно в 1,13 раза или более, примерно в 1,14 раза или более, примерно в 1,15 раза или более, примерно в 1,16 раза или более, примерно в 1,17 раза или более, примерно в 1,18 раза или более, примерно в 1,19 раза или более, примерно в 1,20 раза или более, примерно в 1,21 раза или более, примерно в 1,22 раза или более, примерно в 1,23 раза или более, примерно в 1,24 раза или более, примерно в 1,25 раза или более, примерно в 1,26 раза или более, примерно в 1,27 раза или более, или примерно в 1,28 раза или более (верхняя граница конкретно не ограничивается и может, например, быть примерно в 10 раз или менее, примерно в 5 раз или менее, примерно в 3 раза или менее, или примерно в 2 раза или менее) по сравнению со способностью к продуцированию ИМФ родительского штамма перед изменением или с немодифицированным микроорганизмом, но данный показатель увеличения не ограничивается ими. Термин «примерно» представляет собой интервал, включающий все из плюс/минус 0,5; плюс/минус 0,4; плюс/минус 0,3; плюс/минус 0,2; плюс/минус 0,1 и тому подобных, и включает все значения в интервале, равные или аналогичные значению после термина «примерно», но не ограничивается ими.For example, a recombinant strain having an increased production capacity may have an IMP production capacity increased by about 1% or more, such as by about 1% or more, by about 2.5% or more, by about 5% or more more, about 6% or more, about 7% or more, about 8% or more, about 9% or more, about 10% or more, about 11% or more, about 11.5% or more, about 12% or more, about 12.5% or more, about 13% or more, about 13.5% or more, about 14% or more, about 14.5% or more , about 15% or more, about 15.5% or more, about 16% or more, about 16.5% or more, about 17% or more, about 17.5% or more, about by 18% or more, by about 18.5% or more, by about 19% or more, by about 19.5% or more, by about 20% or more, by about 20.5% or more, by about 21 % or more, about 21.5% or more, about 22% or more, about 22.5% or more, about 23% or more, about 23.5% or more, about 24% or more more, about 24.5% or more, about 26% or more, about 27% or more, about 27.5% or more, about 27.6% or more, about 27.7% or more more, about 27.8% or more, or about 27.9% (the upper limit is not particularly limited and may be, for example, about 200% or less, about 150% or less, about 100% or less, about 50 % or less, about 40% or less, or about 30% or less) compared to, but not limited to, the increased IMP production ability of the parent strain before the modification or the unmodified microorganism, provided that the production ability is increased. plus values compared to the production ability of the parent strain before modification or with an unmodified microorganism. In another example, a recombinant strain having an increased production capacity may have an IMP production capacity increased by about 1.01 times or more, by about 1.02 times or more, by about 1.03 times or more, by about 1 .05 times or more, about 1.06 times or more, about 1.07 times or more, about 1.08 times or more, about 1.09 times or more, about 1.10 times or more , about 1.11 times or more, about 1.12 times or more, about 1.13 times or more, about 1.14 times or more, about 1.15 times or more, about 1, 16 times or more, about 1.17 times or more, about 1.18 times or more, about 1.19 times or more, about 1.20 times or more, about 1.21 times or more, about 1.22 times or more, about 1.23 times or more, about 1.24 times or more, about 1.25 times or more, about 1.26 times or more, about 1.27 times or more, or about 1.28 times or more (the upper limit is not particularly limited and may, for example, be about 10 times or less, about 5 times or less, about 3 times or less, or about 2 times times or less) compared to the IMP-producing ability of the parent strain before the modification or with the unmodified microorganism, but this increase is not limited to them. The term “about” is an interval including all of plus/minus 0.5; plus/minus 0.4; plus/minus 0.3; plus/minus 0.2; plus/minus 0.1 and the like, and includes, but is not limited to, all values in the range equal to or similar to the value after the term “about.”

В настоящем раскрытии «немодифицированный микроорганизм» не исключает штаммы, содержащие мутацию, которая может случаться у микроорганизмов в природе, и может представлять собой штамм дикого типа или сам природный штамм, или может представлять собой штамм перед изменением признака посредством генетической вариации из-за природных или искусственных факторов. Например, данный немодифицированный микроорганизм может представлять собой штамм, в который не вводится или еще не был введен вариант бифункционального транскрипционного регулятора оперона руг/урацилфосфорибозилтрансферазы, описанный в настоящем описании изобретения. Термин «немодифицированный микроорганизм» можно использовать взаимозаменяемо с фразами «штамм перед модификацией», «микроорганизм перед модификацией», «неизмененный штамм», «немодифицированный штамм», «неизмененный микроорганизм» или «эталонный микроорганизм».In the present disclosure, "unmodified microorganism" does not exclude strains containing a mutation that may occur in microorganisms in nature, and may be a wild-type strain or a naturally occurring strain itself, or may be a strain before a trait has been modified by genetic variation due to natural or artificial factors. For example, the unmodified microorganism may be a strain that is not, or has not yet been, introduced into a variant of the bifunctional transcriptional regulator pyr/uracilphosphoribosyltransferase operon described herein. The term "unmodified microorganism" can be used interchangeably with the phrases "strain before modification", "microorganism before modification", "unmodified strain", "unmodified strain", "unmodified microorganism" or "reference microorganism".

В другом примере настоящего раскрытия микроорганизм по настоящему раскрытию может представлять собой Corynebacterium stationis, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium crudilactis, Corynebacterium deserti, Corynebacterium efficiens, Corynebacterium callunae, Corynebacterium singulare, Corynebacterium halotolerans, Corynebacterium striatum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium pollutisoli, Corynebacterium imitans, Corynebacterium testudiniris или Corynebacterium flavescens.In another example of the present disclosure, the microorganism of the present disclosure may be Corynebacterium stationis, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium crudilactis, Corynebacterium deserti, Corynebacterium efficiens, Corynebacterium callunae, Corynebacterium singulare, Corynebacterium halotolerans, Corynebacterium striatum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium pollutisoli, ium imitans, Corynebacterium testudiniris or Corynebacterium flavescens.

В настоящем раскрытии «ослабление» активности полипептида включает оба случая, где активность снижена по сравнению с эндогенной активностью или отсутствует. Термин «ослабление» можно использовать взаимозаменяемо с такими терминами, как инактивация, недостаточность, понижающая регуляция, снижение, уменьшение и аттенюация.In the present disclosure, “attenuation” of the activity of a polypeptide includes both cases where the activity is reduced relative to endogenous activity or absent. The term attenuation can be used interchangeably with terms such as inactivation, failure, down-regulation, decline, reduction, and attenuation.

Ослабление также может включать случай, когда активность самого полипептида снижена или устранена по сравнению с активностью полипептида, которым исходно обладал микроорганизм, посредством изменения полинуклеотида, кодирующего данный полипептид, и тому подобного, случай, где общие уровень активности и/или концентрация (уровень экспрессии) полипептида в клетке ниже по сравнению с уровнем активности или концентрацией природного штамма посредством ингибирования экспрессии гена полинуклеотида, кодирующего полипептид, или ингибирования трансляции в полипептид, случай, где данный полинуклеотид совсем не экспрессируется, и/или случай, где активность полипептида не проявляется даже при экспрессии полинуклеотида. Термин «эндогенная активность» означает активность конкретного полипептида, которой исходно обладал родительский штамм перед изменением признака, или микроорганизм дикого типа или немодифицированный микроорганизм при изменении признака генетической вариацией из-за природных или искусственных факторов. Фразу «эндогенная активность» можно использовать взаимозаменяемо с фразой «активность перед модификацией». Тот факт, что активность полипептида является «инактивированной, недостаточной, пониженной, подвергнувшейся понижающей регуляции, сниженной или ослабленной» по сравнению с эндогенной активностью означает то, что активность полипептида снижается по сравнению с активностью конкретного полипептида, которой исходно обладал родительский штамм перед изменением признака или микроорганизм дикого типа, или немодифицированный микроорганизм.Attenuation may also include the case where the activity of the polypeptide itself is reduced or eliminated compared to the activity of the polypeptide originally possessed by the microorganism, by changing the polynucleotide encoding the polypeptide and the like, a case where the overall activity level and/or concentration (expression level) polypeptide in the cell is lower compared to the level of activity or concentration of the natural strain by inhibiting the expression of the gene of the polynucleotide encoding the polypeptide, or inhibiting translation into the polypeptide, the case where the polynucleotide is not expressed at all, and/or the case where the activity of the polypeptide is not expressed even when expressed polynucleotide. The term "endogenous activity" means the activity of a particular polypeptide that was originally possessed by the parent strain before the trait was changed, or by a wild-type microorganism or an unmodified microorganism when the trait was changed by genetic variation due to natural or artificial factors. The phrase "endogenous activity" can be used interchangeably with the phrase "activity before modification". The fact that the activity of a polypeptide is "inactivated, deficient, reduced, down-regulated, reduced or attenuated" compared to endogenous activity means that the activity of the polypeptide is reduced compared to the activity of the particular polypeptide originally possessed by the parent strain before the change in trait or wild-type microorganism or unmodified microorganism.

Такое ослабление активности полипептида можно осуществлять любым способом, известным в данной области, но данный способ не ограничивается им, и ослабления можно достигнуть применением разных способов, хорошо известных в данной области (например, Nakashima N. et al, Bacterial cellular engineering by genome editing and gene silencing. Int J Mol Sci. 2014; 15(2):2773-2793, Sambrook et al, Molecular Cloning 2012, и тому подобные).Such attenuation of the activity of the polypeptide can be accomplished by any method known in the art, but the method is not limited to it, and attenuation can be achieved using various methods well known in the art (for example, Nakashima N. et al, Bacterial cellular engineering by genome editing and gene silencing. Int J Mol Sci. 2014; 15(2):2773-2793, Sambrook et al, Molecular Cloning 2012, and the like).

В частности, ослабление активности полипептида в настоящем раскрытии может представлять собой:In particular, attenuation of the activity of a polypeptide in the present disclosure may be:

1) делецию всего или части гена, кодирующего полипептид;1) deletion of all or part of the gene encoding the polypeptide;

2) модификацию экспрессии регуляторной области (или экспрессии контрольной последовательности) для уменьшения экспрессии гена, кодирующего полипептид;2) modification of the expression of the regulatory region (or expression of the control sequence) to reduce the expression of the gene encoding the polypeptide;

3) модификацию аминокислотной последовательности, составляющей полипептид, для устранения или ослабления активности полипептида (например, делеции/замены/присоединения одной или более чем одной аминокислоты в аминокислотной последовательности);3) modification of the amino acid sequence constituting the polypeptide to eliminate or weaken the activity of the polypeptide (eg, deletion/substitution/addition of one or more amino acids in the amino acid sequence);

4) модификацию последовательности гена, кодирующей полипептид, для устранения или ослабления активности данного полипептида (например, делеция/замена/присоединение одного или более чем одного основания нуклеиновой кислоты в последовательности оснований нуклеиновой кислоты гена полинуклеотида для кодирования полипептида, который был модифицирован для устранения или ослабления активности данного полипептида);4) modification of the sequence of a gene encoding a polypeptide to eliminate or weaken the activity of that polypeptide (for example, deletion/replacement/addition of one or more nucleic acid bases in the nucleic acid base sequence of a polynucleotide gene for encoding a polypeptide that has been modified to eliminate or weaken activity of this polypeptide);

5) модификацию инициирующего кодона транскрипта гена, кодирующего полипептид, или последовательности оснований, кодирующей 5'-UTR (5'-нетранслируемая область) область;5) modification of the start codon of the transcript of the gene encoding the polypeptide, or the base sequence encoding the 5'-UTR (5'-untranslated region) region;

6) введение антисмыслового олигонуклеотида (например, антисмысловой РНК), который комплементарно связывается с транскриптом гена, кодирующего полипептид;6) introduction of an antisense oligonucleotide (for example, antisense RNA), which complementarily binds to the transcript of the gene encoding the polypeptide;

7) добавление последовательности, комплементарной последовательности Шайна-Дальгарно, перед последовательностью Шайна-Дальгарно гена, кодирующего полипептид, для того, чтобы образовать вторичную структуру, к которой не может присоединяться рибосома;7) adding a sequence complementary to the Shine-Dalgarno sequence before the Shine-Dalgarno sequence of the gene encoding the polypeptide in order to form a secondary structure to which the ribosome cannot attach;

8) добавление промотора, подлежащего транскрипции в противоположном направлении относительно 3'-конца открытой рамки считывания (ORF) последовательности гена, кодирующей полипептид (инженерия обратной транскрипции, RTE); или8) adding a promoter to be transcribed in the opposite direction relative to the 3' end of the open reading frame (ORF) of the gene sequence encoding the polypeptide (reverse transcription engineering, RTE); or

9) комбинацию двух или более чем двух, выбранных из (1) - (8), но, в частности, не ограничивается ими.9) a combination of two or more than two selected from (1) - (8), but in particular is not limited to them.

Например:For example:

1) Делецией части или всего гена, кодирующего полипептид, может быть удаление всего полинуклеотида, кодирующего интересующий эндогенный полипептид в хромосоме, замена полинуклеотидом, в котором некоторые нуклеотиды делетированы, или замена маркерным геном.1) Deletion of part or all of a gene encoding a polypeptide can be the removal of the entire polynucleotide encoding the endogenous polypeptide of interest in the chromosome, replacement with a polynucleotide in which some nucleotides are deleted, or replacement with a marker gene.

2) Модификацией регуляторной области экспрессии (или последовательности контроля экспрессии) может быть делеция, вставка, неконсервативная или консервативная замена, или появление изменения в регуляторной области экспрессии (или последовательности контроля экспрессии) из-за их комбинации, или замена последовательностью, демонстрирующей более слабую активность. Регуляторная область экспрессии содержит промотор, последовательность оператора, последовательность, кодирующую сайт связывания рибосомы, и последовательность, контролирующую терминацию транскрипции и трансляции, но не ограничивается ими.2) Modification of the expression regulatory region (or expression control sequence) may be a deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution, or the occurrence of a change in the expression regulatory region (or expression control sequence) due to a combination thereof, or substitution with a sequence showing weaker activity . The expression regulatory region contains, but is not limited to, a promoter, an operator sequence, a sequence encoding a ribosome binding site, and a sequence that controls transcription and translation termination.

3) и 4) Модификацией аминокислотной последовательности или последовательности полинуклеотида может быть делеция, вставка или неконсервативная, или консервативная замена аминокислотной последовательности полипептида или последовательности полинуклеотида, кодирующего данный полипептид, или появление изменения в последовательности из-за их комбинации, или замена аминокислотной последовательностью или последовательностью полинуклеотида, модифицированной для демонстрации более слабой активности, или аминокислотной последовательностью или последовательностью полинуклеотида, модифицированной для того, чтобы быть неактивной, таким образом, что активность полипептида ослабевает, но не ограничивается ими. Например, экспрессия гена может ингибироваться или ослабевать посредством введения в последовательность полинуклеотида изменения и образования терминирующего кодона, но модификация не ограничивается им.3) and 4) A modification of an amino acid sequence or a polynucleotide sequence may be a deletion, insertion, or non-conservative or conservative substitution of an amino acid sequence of a polypeptide or a sequence of a polynucleotide encoding a given polypeptide, or the occurrence of a change in the sequence due to a combination thereof, or a substitution of an amino acid sequence or sequence a polynucleotide modified to exhibit weaker activity, or an amino acid sequence or polynucleotide sequence modified to be inactive such that the activity of the polypeptide is reduced, but not limited thereto. For example, gene expression may be inhibited or attenuated by introducing a change in the polynucleotide sequence and producing a stop codon, but the modification is not limited to this.

5) Модификацией инициирующего кодона транскрипта гена, кодирующего полипептид, или последовательности оснований, кодирующей 5'-UTR область, может быть, например, замена последовательностью оснований, кодирующей другой инициирующий кодон, имеющий меньшую скорость экспрессии полипептида по сравнению с эндогенным инициирующим кодоном, но не ограничивается ей.5) A modification of the start codon of the transcript of the gene encoding the polypeptide, or the base sequence encoding the 5'-UTR region, can be, for example, replacement with a base sequence encoding a different start codon that has a lower rate of expression of the polypeptide compared to the endogenous start codon, but not limited to it.

6) Для введения антисмыслового олигонуклеотида (например, антисмысловой РНК), который комплементарно связывается с транскриптом гена, кодирующего полипептид, можно сделать ссылку на документы, например, Weintraub, Н. et al, Antisense-RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews- Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986.6) To introduce an antisense oligonucleotide (for example, antisense RNA), which complementarily binds to the transcript of the gene encoding the polypeptide, reference can be made to documents, for example, Weintraub, N. et al, Antisense-RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986.

7) Добавление последовательности, комплементарной последовательности Шайна-Дальгарно, перед последовательностью Шайна-Дальгарно гена, кодирующего полипептид, для того, чтобы образовать вторичную структуру, к которой не может присоединиться рибосома, для того, чтобы сделать невозможной трансляцию мРНК или для замедления скорости трансляции мРНК.7) Addition of a sequence complementary to the Shine-Dalgarno sequence before the Shine-Dalgarno sequence of the gene encoding the polypeptide, in order to form a secondary structure to which the ribosome cannot attach, to make translation of the mRNA impossible, or to slow down the rate of translation of the mRNA .

8) Добавление промотора, подлежащего транскрипции в противоположном направлении относительно 3'-конца открытой рамки считывания (ORF) последовательности гена, кодирующего полипептид (инженерия обратной транскрипции, RTE), может служить для ослабления активности посредством получения антисмыслового нуклеотида, комплементарного транскрипту гена, кодирующего полипептид.8) The addition of a promoter to be transcribed in the opposite direction to the 3' end of the open reading frame (ORF) sequence of the gene encoding the polypeptide (reverse transcription engineering, RTE) can serve to attenuate activity by producing an antisense nucleotide complementary to the transcript of the gene encoding the polypeptide .

В настоящем раскрытии термин «усиление» активности полипептида означает то, что активность полипептида увеличивается по сравнению с эндогенной активностью. Термин «усиление» может использоваться взаимозаменяемо с такими терминами, как активация, повышающая регуляция, сверхэкспрессия и увеличение. Здесь активация, усиление, повышающая регуляция, сверхэкспрессия и увеличение могут включать как демонстрирование активности, которой исходно не обладали, так и демонстрирование улучшенной активности по сравнению с эндогенной активностью или активностью перед модификацией. Термин «эндогенная активность» означает активность конкретного полипептида, которой исходно обладал родительский штамм, перед изменением признака или немодифицированный микроорганизм при изменении признака посредством генетической вариации из-за природных или искусственных факторов. Это можно использовать взаимозаменяемо с «активностью перед модификацией». Тот факт, что активность полипептида «усиливается», «подвергается повышающей регуляции», «сверхэкспрессируется» или «увеличивается» по сравнению с эндогенной активностью означает то, что активность полипептида улучшается по сравнению с активностью и/или концентрацией (уровнем экспрессии) конкретного полипептида, которой исходно обладает родительский штамм перед изменением признака или немодифицированный микроорганизм.As used herein, the term “enhancing” the activity of a polypeptide means that the activity of the polypeptide is increased relative to its endogenous activity. The term "amplification" can be used interchangeably with terms such as activation, up-regulation, overexpression and amplification. Here, activation, enhancement, up-regulation, overexpression and increase may include both demonstrating activity that was not originally possessed and demonstrating improved activity compared to endogenous activity or activity before modification. The term "endogenous activity" means the activity of a particular polypeptide originally possessed by the parent strain before a trait is changed, or by an unmodified microorganism when a trait is changed by genetic variation due to natural or artificial factors. This can be used interchangeably with "activity before modification". The fact that the activity of a polypeptide is "enhanced", "up-regulated", "overexpressed" or "increased" relative to endogenous activity means that the activity of the polypeptide is improved relative to the activity and/or concentration (expression level) of the particular polypeptide, which the parent strain or unmodified microorganism initially possesses before changing the trait.

Данное усиление может достигаться посредством введения чужеродного полипептида или усиления эндогенной активности и/или концентрации (уровня экспрессии) данного полипептида. Усиление активности полипептида может быть подтверждено увеличением степени активности и уровня экспрессии полипептида или количества продукта, продуцируемого из данного полипептида.This enhancement can be achieved by introducing a foreign polypeptide or enhancing the endogenous activity and/or concentration (expression level) of the polypeptide. Increased activity of a polypeptide can be demonstrated by an increase in the degree of activity and level of expression of the polypeptide or the amount of product produced from the polypeptide.

Для усиления активности полипептида можно применять разные способы, хорошо известные в данной области, и данный способ не ограничивается, при условии, что активность интересующего полипептида может быть усилена по сравнению с активностью микроорганизма до модификации. В частности, можно использовать генную инженерию и/или белковую инженерию, хорошо известные специалистам в данной области, которые представляют собой традиционные способы молекулярной биологии, но данный способ не ограничивается ими (например, Sitnicka et al, Functional Analysis of Genes. Advances in Cell Biology 2010, Vol. 2. 1-16; Sambrook et al, Molecular Cloning 2012; и тому подобные).Various methods well known in the art can be used to enhance the activity of a polypeptide, and this method is not limited to, provided that the activity of the polypeptide of interest can be enhanced compared to the activity of the microorganism before modification. In particular, genetic engineering and/or protein engineering may be used, well known to those skilled in the art, which are traditional molecular biology techniques, but are not limited to them (eg, Sitnicka et al, Functional Analysis of Genes. Advances in Cell Biology 2010, Vol. 2. 1-16; Sambrook et al, Molecular Cloning 2012;

В частности, усиление активности полипептида по настоящему раскрытию может представлять собой:In particular, enhancing the activity of a polypeptide of the present disclosure may be:

1) увеличение числа внутриклеточных копий полинуклеотида, кодирующего полипептид;1) an increase in the number of intracellular copies of the polynucleotide encoding the polypeptide;

2) замену регуляторной области экспрессии гена на хромосоме, кодирующей полипептид, последовательностью, демонстрирующей сильную активность;2) replacement of the regulatory region of gene expression on the chromosome encoding the polypeptide with a sequence demonstrating strong activity;

3) модификацию инициирующего кодона транскрипта гена, кодирующего полипептид, или последовательности оснований, кодирующей 5'-UTR область;3) modification of the initiation codon of the transcript of the gene encoding the polypeptide, or the base sequence encoding the 5'-UTR region;

4) модификацию аминокислотной последовательности полипептида для увеличения активности данного полипептида;4) modification of the amino acid sequence of a polypeptide to increase the activity of this polypeptide;

5) модификацию последовательности полинуклеотида, кодирующей полипептид, для усиления активности данного полипептида (например, модификацию последовательности полинуклеотида гена полипептида для кодирования полипептида, который был модифицирован для усиления активности данного полипептида);5) modifying a polynucleotide sequence encoding a polypeptide to enhance the activity of the polypeptide (for example, modifying the polynucleotide sequence of a polypeptide gene to encode a polypeptide that has been modified to enhance the activity of the polypeptide);

6) введение чужеродного полипептида, демонстрирующего активность данного полипептида, или чужеродного полинуклеотида, кодирующего данный полипептид;6) introduction of a foreign polypeptide demonstrating the activity of this polypeptide, or a foreign polynucleotide encoding this polypeptide;

7) оптимизацию кодонов полинуклеотида, кодирующего полипептид;7) optimization of codons of the polynucleotide encoding the polypeptide;

8) анализ третичной структуры полипептида для отбора и модификации или химической модификации экспонированного сайта; или8) analysis of the tertiary structure of the polypeptide for selection and modification or chemical modification of the exposed site; or

9) комбинацию двух или более чем двух, выбранных из 1) - 8), но конкретно не ограничиваясь ими.9) a combination of two or more than two selected from 1) - 8), but not specifically limited to them.

Более конкретно:More specific:

1) Увеличение числа внутриклеточных копий полинуклеотида, кодирующего полипептид, может быть достигнуто посредством введения в клетку-хозяина вектора, который может реплицироваться и функционировать независимо от хозяина, и с которым полинуклеотид, кодирующий данный полипептид, связан функциональным образом. В качестве альтернативы, увеличение может быть достигнуто введением одной копии или двух или более чем двух копий полинуклеотида, кодирующего данный полипептид, в хромосому клетки-хозяина. Введение в хромосому может осуществляться введением вектора, способного вставлять полинуклеотид в хромосому клетки-хозяина, в клетку-хозяина, но не ограничивается им. Данный вектор является таким, как описано выше.1) Increasing the number of intracellular copies of a polynucleotide encoding a polypeptide can be achieved by introducing into a host cell a vector that can replicate and function independently of the host, and to which the polynucleotide encoding the polypeptide is functionally linked. Alternatively, expansion can be achieved by introducing one copy or two or more than two copies of the polynucleotide encoding the polypeptide into the chromosome of the host cell. Introduction into a chromosome can be accomplished by, but is not limited to, introducing a vector capable of inserting a polynucleotide into the chromosome of a host cell into the host cell. This vector is the same as described above.

2) Замена регуляторной области экспрессии гена (или контрольной последовательности экспрессии) на хромосоме, кодирующей полипептид, последовательностью, демонстрирующей сильную активность, может представлять собой, например, делецию, вставку, неконсервативную или консервативную замену или появление изменения в последовательности из-за их комбинации, или замену последовательности, демонстрирующей более сильную активность, таким образом, что активность регуляторной области экспрессии дополнительно усиливается. Регуляторная область экспрессии конкретно не ограничивается ими, но может содержать промотор, последовательность оператора, последовательность, кодирующую сайт связывания рибосомы, последовательность, контролирующую терминацию транскрипции и трансляции и тому подобные. Например, замена может представлять собой замену исходного промотора сильным промотором, но не ограничивается ей.2) Replacement of a gene expression regulatory region (or expression control sequence) on a chromosome encoding a polypeptide with a sequence exhibiting potent activity may be, for example, a deletion, an insertion, a non-conservative or conservative substitution, or the occurrence of a sequence change due to a combination thereof, or replacing a sequence exhibiting stronger activity such that the activity of the expression regulatory region is further enhanced. The expression regulatory region is not particularly limited to these, but may include a promoter, an operator sequence, a sequence encoding a ribosome binding site, a transcription and translation termination control sequence, and the like. For example, the replacement may be, but is not limited to, replacing the original promoter with a strong promoter.

Примеры известных сильных промоторов включают промоторы CJ1-CJ7 (US 7662943 В2), промотор lac, промотор trp, промотор trc, промотор tac, промотор PR фага лямбда, промотор PL, промотор tet, промотор gapA, промотор SPL7, промотор SPL13 (sm3) (US 10584338 В2), промотор O2 (US 10273491 В2), промотор tkt и промотор уссА, но не ограничиваются ими.Examples of known strong promoters include CJ1-CJ7 promoters (US 7662943 B2), lac promoter, trp promoter, trc promoter, tac promoter, lambda phage PR promoter, PL promoter, tet promoter, gapA promoter, SPL7 promoter, SPL13 promoter (sm3) ( US 10584338 B2), O2 promoter (US 10273491 B2), tkt promoter and uscA promoter, but are not limited to.

3) Модификация инициирующего кодона транскрипта гена, кодирующего полипептид, или последовательности оснований, кодирующей область 5'-UTR, может представлять собой, например, замену последовательностью оснований, кодирующей другой инициирующий кодон, имеющий более высокую скорость экспрессии полипептида по сравнению с эндогенным инициирующим кодоном, но не ограничивается ей.3) Modification of the start codon of the transcript of the gene encoding the polypeptide, or the base sequence encoding the 5'-UTR region, may be, for example, substitution with a base sequence encoding a different start codon having a higher rate of expression of the polypeptide compared to the endogenous start codon, but is not limited to it.

4) и 5) Модификация аминокислотной последовательности или последовательности полинуклеотида может представлять собой делецию, вставку, неконсервативную или консервативную замену аминокислотной последовательности полипептида или последовательности полинуклеотида, кодирующей данный полипептид, или появление изменения в данной последовательности из-за их комбинации или замены аминокислотной последовательности или последовательности полинуклеотида, модифицированной для демонстрации более сильной активности, или аминокислотной последовательности или последовательности полинуклеотида, модифицированной для того, чтобы быть более активной, таким образом, что активность данного полипептида усиливается, но не ограничивается ими. Данная замена может конкретно осуществляться посредством вставки полинуклеотида в хромосому гомологичной рекомбинацией, но не ограничивается ей. Используемый здесь вектор может дополнительно содержать селективный маркер для подтверждения вставки в хромосому. Селективный маркер является таким, как описано выше.4) and 5) A modification of an amino acid sequence or a polynucleotide sequence may be a deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution of an amino acid sequence of a polypeptide or a polynucleotide sequence encoding a polypeptide, or the occurrence of a change in a given sequence due to a combination thereof or a substitution of an amino acid sequence or sequence a polynucleotide modified to exhibit greater activity, or an amino acid sequence or polynucleotide sequence modified to be more active such that the activity of the polypeptide is enhanced, but not limited thereto. This replacement may specifically be accomplished by, but is not limited to, the insertion of a polynucleotide into a chromosome by homologous recombination. The vector used here may additionally contain a selectable marker to confirm insertion into the chromosome. The selectable marker is as described above.

6) Введение чужеродного полипептида, демонстрирующего активность полипептида, может представлять собой введение в клетку-хозяина чужеродного полинуклеотида, кодирующего полипептид, демонстрирующий такую же или аналогичную данному полипептиду активность. Данный чужеродный полинуклеотид не ограничивается по его происхождению или последовательности при условии, что он демонстрирует такую же или аналогичную данному полипептиду активность. Введение может осуществляться посредством подходящего выбора способа трансформации, известного специалистам в данной области. Поскольку введенный полинуклеотид экспрессируется в клетке-хозяине, может продуцироваться полипептид и может увеличиваться его активность.6) Introduction of a foreign polypeptide exhibiting the activity of a polypeptide may be the introduction into a host cell of a foreign polynucleotide encoding a polypeptide exhibiting the same or similar activity to the polypeptide. The foreign polynucleotide is not limited in origin or sequence as long as it exhibits the same or similar activity to the polypeptide. Administration can be accomplished through a suitable choice of transformation method known to those skilled in the art. Since the introduced polynucleotide is expressed in the host cell, the polypeptide can be produced and its activity can be increased.

7) Оптимизация кодонов полинуклеотида, кодирующего полипептид, может представлять собой оптимизацию кодонов эндогенного полинуклеотида таким образом, чтобы увеличивать транскрипцию или трансляцию в клетке-хозяине, или оптимизацию кодонов чужеродного полинуклеотида таким образом, чтобы осуществлять оптимизированную транскрипцию и трансляцию в клетке-хозяине.7) Codon optimization of a polynucleotide encoding a polypeptide may be codon optimization of an endogenous polynucleotide so as to enhance transcription or translation in a host cell, or codon optimization of a foreign polynucleotide so as to achieve optimized transcription and translation in a host cell.

8) Анализ третичной структуры полипептида для выбора и модификации или химическая модификация экспонированного сайта могут осуществляться, например, для определения шаблонного белка-кандидата согласно степени сходства последовательности посредством сравнения информации по последовательности полипептида, подлежащего анализу, с хранилищем информации по последовательностям известных белков базы данных для подтверждения структуры на основе этого и для выбора и модификации или химической модификации экспонированной части, подлежащей модификации или химической модификации.8) Analysis of the tertiary structure of the polypeptide for selection and modification or chemical modification of the exposed site can be carried out, for example, to determine the template protein candidate according to the degree of sequence similarity by comparing the sequence information of the polypeptide to be analyzed with a repository of sequence information of known proteins of the database for confirming the structure based on this and for selecting and modifying or chemically modifying the exposed part to be modified or chemically modified.

Такое усиление активности полипептида может представлять собой увеличение активности или концентрации уровня экспрессии соответствующего полипептида на основе активности или концентрации полипептида, экспрессируемого в микробном штамме дикого типа или в микробном штамме перед модификацией, или увеличение количества продукта, продуцируемого из полипептида, но не ограничивается ими.Such an increase in the activity of a polypeptide may be, but is not limited to, an increase in the activity or concentration of the expression level of the corresponding polypeptide based on the activity or concentration of the polypeptide expressed in the wild-type microbial strain or in the microbial strain before modification, or an increase in the amount of product produced from the polypeptide.

В микроорганизме по настоящему раскрытию частичная или полная модификация полинуклеотида может индуцироваться (а) гомологичной рекомбинацией с использованием вектора для вставки в хромосому в микроорганизме или геноме, редактируя с использованием генетически модифицированной нуклеазы (например, CRISPR-Cas9), и/или (б) обработкой светом, таким как ультрафиолетовые лучи и излучение, и/или химическими агентами, но не ограничиваясь ими. Способ осуществления модификации части или всего гена может включать способ с использованием технологии рекомбинантной ДНК. Например, посредством введения в микроорганизм нуклеотидной последовательности или вектора, содержащего нуклеотидную последовательность, гомологичную интересующему гену, для вызова гомологичной рекомбинации можно удалить часть гена или весь данный ген. Введенная нуклеотидная последовательность или вектор может содержать доминантный селективный маркер, но не ограничиваясь им.In a microorganism of the present disclosure, partial or complete modification of a polynucleotide can be induced by (a) homologous recombination using a vector for insertion into a chromosome in the microorganism or genome editing using a genetically modified nuclease (eg, CRISPR-Cas9), and/or (b) treatment light such as, but not limited to, ultraviolet rays and radiation, and/or chemical agents. A method for effecting modification of part or all of a gene may include a method using recombinant DNA technology. For example, by introducing into a microorganism a nucleotide sequence or a vector containing a nucleotide sequence homologous to a gene of interest, part or all of the gene can be deleted to induce homologous recombination. The introduced nucleotide sequence or vector may contain, but is not limited to, a dominant selectable marker.

В микроорганизме по настоящему раскрытию вариант, полинуклеотид, ИМФ и тому подобные являются такими, как описано в других аспектах.In the microorganism of the present disclosure, the variant, polynucleotide, IMP, and the like are as described in other aspects.

Согласно еще одному другому аспекту настоящего раскрытия предложен способ получения ИМФ, который включает культивирование штамма Corynebacterium stationis, содержащего вариант по настоящему раскрытию или полинуклеотид по настоящему раскрытию в среде.According to yet another aspect of the present disclosure, there is provided a method for producing IMP, which includes cultivating a strain of Corynebacterium stationis containing a variant of the present disclosure or a polynucleotide of the present disclosure in a medium.

Способ получения ИМФ по настоящему раскрытию может включать культивирование штамма Corynebacterium stationis, содержащего вариант по настоящему раскрытию или полинуклеотид по настоящему раскрытию, или вектор по настоящему раскрытию, в среде.A method for producing IMP according to the present disclosure may include cultivating a Corynebacterium stationis strain containing a variant according to the present disclosure or a polynucleotide according to the present disclosure or a vector according to the present disclosure in a medium.

В настоящем раскрытии термин «культивирование» означает выращивание штамма Corynebacterium stationis по настоящему раскрытию в условиях среды, контролируемых подходящим образом. Способ культивирования по настоящему раскрытию можно осуществлять в соответствии с подходящей средой и условиями культивирования, известными в данной области. Такой способ культивирования можно легко корректировать и использовать специалистами в данной области согласно выбранному штамму. В частности культивирование может быть периодического типа, непрерывного типа и/или типа с подпиткой, но не ограничивается ими.As used herein, the term “cultivation” means growing the Corynebacterium stationis strain of the present disclosure under suitably controlled environmental conditions. The culture method of the present disclosure can be carried out in accordance with suitable media and culture conditions known in the art. This cultivation method can be easily adjusted and used by those skilled in the art according to the selected strain. In particular, the cultivation may be batch type, continuous type and/or fed-batch type, but is not limited to them.

В настоящем раскрытии термин «среда» означает смешанное вещество, содержащее питательные вещества, требующиеся для культивирования штамма Corynebacterium stationis по настоящему раскрытию в качестве главного компонента, и данная среда поставляет питательные вещества, факторы роста и тому подобное, включая воду, которые являются незаменимыми для выживания и развития. В частности, в качестве среды и других условий культивирования, используемых для культивирования штамма Corynebacterium stationis по настоящему раскрытию, можно использовать любые без конкретного ограничения, при условии, что она представляет собой среду, используемую для обычного культивирования микроорганизмов. Штамм Corynebacterium stationis по настоящему раскрытию можно культивировать в обычной среде, содержащей правильные источники углерода, источники азота, источники фосфора, неорганические соединения, аминокислоты и/или витамины, и тому подобное, при одновременном осуществлении контроля температуры, рН и тому подобного при аэробных условиях.In the present disclosure, the term "medium" means a mixed substance containing nutrients required for cultivating the Corynebacterium stationis strain of the present disclosure as a main component, and the medium supplies nutrients, growth factors and the like, including water, which are essential for survival and development. In particular, the medium and other culture conditions used for cultivating the Corynebacterium stationis strain of the present disclosure can be used without particular limitation, as long as it is the medium used for conventional cultivation of microorganisms. The Corynebacterium stationis strain of the present disclosure can be cultured in a conventional medium containing proper carbon sources, nitrogen sources, phosphorus sources, inorganic compounds, amino acids and/or vitamins, and the like, while controlling temperature, pH, and the like under aerobic conditions.

В частности, культуральную среду для штамма рода Corynebacterium можно найти в документе "Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology (Washington, D.C., USA, 1981).In particular, the culture medium for a strain of the genus Corynebacterium can be found in the document "Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology (Washington, D.C., USA, 1981).

В настоящем раскрытии источники углерода включают углеводы, такие как глюкоза, сахароза, лактоза, фруктоза, сахароза и мальтоза; сахароспирты, такие как маннит и сорбит; органические кислоты, такие как пировиноградная кислота, молочная кислота и лимонная кислота; аминокислоты, такие как глутаминовая кислота, метионин и лизин; и тому подобное. Можно использовать природные органические питательные вещества, такие как гидролизат крахмала, мелассу, сырую мелассу, рисовые отруби, маниок, остаток сахарного тростника и жидкий кукурузный экстракт. В частности, можно использовать углеводы, такие как глюкоза и стерилизованные предобработанные мелассы (а именно: мелассы, превращенные в восстанавливающий сахар), и можно использовать подходящие количества других источников углерода разными способами без ограничения. Данные источники углерода можно использовать одиночно или в комбинации с двумя или более чем двумя, но не ограничиваясь ими.In the present disclosure, carbon sources include carbohydrates such as glucose, sucrose, lactose, fructose, sucrose and maltose; sugar alcohols such as mannitol and sorbitol; organic acids such as pyruvic acid, lactic acid and citric acid; amino acids such as glutamic acid, methionine and lysine; etc. Natural organic nutrients such as hydrolyzed starch, molasses, raw molasses, rice bran, cassava, sugar cane residue and liquid corn extract can be used. In particular, carbohydrates such as glucose and sterilized pre-processed molasses (namely, molasses converted to reducing sugar) can be used, and suitable amounts of other carbon sources can be used in a variety of ways without limitation. These carbon sources can be used alone or in combination with, but not limited to, two or more.

В качестве источников азота можно использовать неорганические источники азота, такие как аммиак, сульфат аммония, хлорид аммония, ацетат аммония, фосфат аммония, карбонат аммония и нитрат аммония; и органические источники азота, такие как аминокислоты, такие как глутаминовая кислота, метионин и глутамин, пептон, NZ-амин, мясной экстракт, дрожжевой экстракт, солодовый экстракт, жидкий кукурузный экстракт, гидролизат казеина, рыба или продукты ее разложения и обезжиренный соевый жмых или продукты его разложения. Данные источники азота можно использовать одиночно или в комбинации двух или более чем двух, но не ограничиваясь ими.As nitrogen sources, inorganic nitrogen sources such as ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium acetate, ammonium phosphate, ammonium carbonate and ammonium nitrate can be used; and organic nitrogen sources such as amino acids such as glutamic acid, methionine and glutamine, peptone, NZ-amine, meat extract, yeast extract, malt extract, liquid corn extract, casein hydrolysate, fish or its breakdown products and defatted soybean meal or products of its decomposition. These nitrogen sources may be used alone or in combination of two or more, but are not limited to.

Источники фосфора могут включать монокалия фосфат, дикалия фосфат или натрийсодержащие соли, соответствующие им. В качестве неорганических соединений можно использовать хлорид натрия, хлорид кальция, хлорид железа, сульфат магния, сульфат железа, сульфат марганца, карбонат кальция и тому подобное. Помимо них могут содержаться аминокислоты, витамины и/или подходящие предшественники, и тому подобное. Данные компоненты или предшественники можно добавлять в среду порционно или непрерывно, но способ добавления не ограничивается ими.Sources of phosphorus may include monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, or sodium salts corresponding thereto. As inorganic compounds, sodium chloride, calcium chloride, ferric chloride, magnesium sulfate, ferrous sulfate, manganese sulfate, calcium carbonate and the like can be used. In addition to these, amino acids, vitamins and/or suitable precursors, and the like may be contained. These components or precursors can be added to the medium in batches or continuously, but the method of addition is not limited to them.

Во время культивирования штамма Corynebacterium stationis по настоящему раскрытию рН среды можно корректировать добавлением в данную среду правильным способом таких соединений, как гидроксид аммония, гидроксид калия, аммиак, фосфорная кислота и серная кислота. Во время культивирования пенообразование можно подавлять посредством применения пеногасителя, такого как сложный полигликолевый эфир жирной кислоты. В среду можно инъецировать кислород или кислородсодержащий газ для поддержания аэробного состояния данной среды, или газ можно не инъецировать, или можно инъецировать газообразный азот, водород или диоксид углерода для того, чтобы поддерживать анаэробное и микроаэробное состояния, но способ поддержания данного состояния не ограничивается ими.During the cultivation of the Corynebacterium stationis strain of the present disclosure, the pH of the medium can be adjusted by adding compounds such as ammonium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia, phosphoric acid and sulfuric acid to the medium in the correct manner. During culture, foaming can be suppressed by the use of an antifoam agent such as a polyglycol fatty acid ester. Oxygen or an oxygen-containing gas may be injected into the medium to maintain the aerobic state of the medium, or no gas may be injected, or nitrogen, hydrogen or carbon dioxide gas may be injected to maintain anaerobic and microaerobic states, but the method of maintaining this state is not limited to them.

При культивировании по настоящему раскрытию можно поддерживать температуру культивирования от 20°С до 45°С, в частности, от 25°С до 40°С, и данный штамм можно культивировать в течение примерно от 10 до 160 часов, но условия культивирования не ограничиваются ими.When culturing according to the present disclosure, the culture temperature can be maintained at 20°C to 45°C, in particular 25°C to 40°C, and the strain can be cultured for about 10 to 160 hours, but the culture conditions are not limited to them .

ИМФ, продуцируемый посредством культивирования по настоящему раскрытию, может секретироваться в среду или может оставаться в клетках.IMP produced by culture of the present disclosure may be secreted into the medium or may remain in the cells.

Способ получения ИМФ по настоящему раскрытию может дополнительно включать стадию получения штамма Corynebacterium stationis по настоящему раскрытию, стадию приготовления среды для культивирования данного штамма или их комбинацию (в любом порядке), например, перед стадией культивирования.The method for producing IMP according to the present disclosure may further include the step of obtaining the Corynebacterium stationis strain of the present disclosure, the step of preparing a medium for culturing the strain, or a combination thereof (in any order), for example, before the culturing step.

Способ получения ИМФ по настоящему раскрытию может дополнительно включать стадию выделения ИМФ из среды в соответствии с культивированием (среда, подвергнувшаяся воздействию культуры) или из штамма Corynebacterium stationis по настоящему раскрытию. Стадия выделения может быть дополнительно включена после стадии культивирования.The method for producing IMP of the present disclosure may further include the step of isolating IMP from a culture medium (culture-impacted medium) or from a Corynebacterium stationis strain of the present disclosure. An isolation step may further be included after the culture step.

Выделение может служить для сбора интересующего ИМФ посредством подходящего способа, известного в данной области, согласно способу культивирования микроорганизма по настоящему раскрытию, например, способу периодического, непрерывного культивирования или культивирования с подпиткой. Например, можно использовать центрифугирование, фильтрование, обработку осадителем кристаллизованного белка (высаливание), экстракцию, ультразвуковое разрушение, ультрафильтрацию, диализ, разные виды хроматографии, такие как хроматография на молекулярных ситах (гель-фильтрация), адсорбционная хроматография, ионообменная хроматография и аффинная хроматография, ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография) или их комбинацию. Интересующий ИМФ можно выделять из среды или микроорганизма посредством подходящего способа, известного в данной области.The isolation may serve to collect the IMP of interest through a suitable method known in the art, according to a method of culturing the microorganism of the present disclosure, for example, a batch, continuous, or fed-batch culture method. For example, you can use centrifugation, filtration, treatment of crystallized protein with a precipitant (salting out), extraction, ultrasonic disruption, ultrafiltration, dialysis, various types of chromatography, such as molecular sieve chromatography (gel filtration), adsorption chromatography, ion exchange chromatography and affinity chromatography, HPLC (high performance liquid chromatography) or a combination of both. The IMP of interest can be isolated from the environment or microorganism by a suitable method known in the art.

Способ получения ИМФ по настоящему раскрытию может дополнительно включать стадию очистки. Очистку можно осуществлять посредством подходящего способа, известного в данной области. В одном примере, когда способ получения ИМФ по настоящему раскрытию включает и стадию выделения, и стадию очистки, данные стадии выделения и очистки можно осуществлять непрерывно или прерывисто, независимо от порядка, или можно осуществлять одновременно, или посредством объединения в одну стадию, но способ осуществления данных стадий не ограничивается ими.The method for producing IMP according to the present disclosure may further include a purification step. Purification can be accomplished by a suitable method known in the art. In one example, when the method for producing IMP according to the present disclosure includes both an isolation step and a purification step, these isolation and purification steps can be carried out continuously or intermittently, regardless of the order, or can be carried out simultaneously, or by combining into one step, but the method of carrying out these stages is not limited to them.

В способе по настоящему раскрытию вариант, полинуклеотид, вектор, штамм, ИМФ и тому подобное являются такими, как описано в других аспектах.In the method of the present disclosure, the variant, polynucleotide, vector, strain, IMP, and the like are as described in other aspects.

Еще одним другим аспектом настоящего раскрытия является предложение композиции для продуцирования ИМФ, которая содержит штамм Corynebacterium stationis, содержащий вариант по настоящему раскрытию, полинуклеотид, кодирующий данный вариант, вектор, содержащий данный полинуклеотид, или полинуклеотид по настоящему раскрытию; среду, в которой культивировали данный штамм Corynebacterium stationis; или комбинации двух или более чем двух из них.Yet another aspect of the present disclosure is to provide a composition for producing IMP that contains a Corynebacterium stationis strain containing a variant of the present disclosure, a polynucleotide encoding the variant, a vector containing the polynucleotide, or a polynucleotide of the present disclosure; the medium in which this strain of Corynebacterium stationis was cultivated; or combinations of two or more than two of them.

Композиция по настоящему раскрытию может дополнительно содержать произвольные подходящие эксципиенты, подлежащие обычному применению в композициях для продуцирования ИМФ. Такие эксципиенты могут представлять собой, например, консервант, увлажнитель, диспергирующий агент, суспендирующий агент, буферизующий агент, стабилизатор или изотоничный агент, но не ограничиваются ими.The composition of the present disclosure may further contain any suitable excipients commonly used in compositions for producing IMP. Such excipients may be, for example, but are not limited to, a preservative, humectant, dispersing agent, suspending agent, buffering agent, stabilizer or isotonic agent.

В композиции по настоящему раскрытию вариант, полинуклеотид, вектор, штамм, среда, ИМФ и тому подобные являются такими, как описано в других аспектах.In the composition of the present disclosure, the variant, polynucleotide, vector, strain, medium, IMP, and the like are as described in other aspects.

Способ осуществления изобретенияMethod for carrying out the invention

Ниже настоящее раскрытие будет более подробно описано посредством Примеров. Однако следующие Примеры являются лишь предпочтительными воплощениями для иллюстрации настоящего раскрытия и, таким образом, не предназначены для ограничения объема настоящего раскрытия ими. Тем не менее, технические вопросы, не описанные в настоящем описании изобретения, могут быть в достаточной степени поняты и легко воплощены специалистами в технической области настоящего раскрытия или в аналогичных технических областях.Below, the present disclosure will be described in more detail by way of Examples. However, the following Examples are only preferred embodiments to illustrate the present disclosure and, thus, are not intended to limit the scope of the present disclosure by them. However, technical issues not described in the present specification may be sufficiently understood and readily accomplished by those skilled in the technical field of the present disclosure or similar technical fields.

Пример 1. Конструирование вектора для осуществления экспрессии варианта бифункционального транскрипционного регулятора оперона pyr/урацилфосфорибозилтрансферазы в микроорганизмеExample 1. Construction of a vector for expressing a variant of the bifunctional transcriptional regulator of the pyr/uracilphosphoribosyltransferase operon in a microorganism

Для того чтобы исследовать влияние на продукцию ИМФ варианта (P108S, SEQ ID NO: 1), в котором пролин в положении 108 в аминокислотной последовательности бифункционального транскрипционного регулятора оперона pyr/урацилфосфорибозилтрансферазы (SEQ ID NO: 3) заменен серином, конструировали вектор для конструирования штамма, экспрессирующего данный вариант, следующим образом с использованием плазмиды pDCM2 (Корейская публикация №10-2020-0136813) для вставки и замены генов в хромосоме Corynebacterium.In order to study the effect on IMP production of the variant (P108S, SEQ ID NO: 1), in which proline at position 108 in the amino acid sequence of the bifunctional transcriptional regulator of the pyr/uracilphosphoribosyltransferase operon (SEQ ID NO: 3) is replaced by serine, a vector for strain construction was constructed , expressing this variant, as follows, using plasmid pDCM2 (Korean Publication No. 10-2020-0136813) to insert and replace genes in the Corynebacterium chromosome.

ПЦР (полимеразная цепная реакция) проводили с использованием гДНК (геномная ДНК) Corynebacterium stationis АТСС6872 дикого типа в качестве матрицы и пары праймеров, имеющих последовательности SEQ ID NO: 5 и 6, и пары праймеров, имеющих последовательности SEQ ID NO: 7 и 8. Вновь проводили ПЦР с перекрывающимися праймерами с использованием смеси двух фрагментов, полученных выше, в качестве матрицы и пары праймеров, имеющих последовательности SEQ ID NO: 5 и 8, для получения фрагмента. ПЦР проводили следующим образом: денатурация при 94°С в течение 5 минут; 30 циклов при 94°С в течение 30 секунд, 55°С в течение 30 секунд, 72°С в течение 1 минуты 30 секунд; и 72°С в течение 5 минут. Вектор pDCM2 обрабатывали SmaI, и ПЦР-продукт, полученный выше, клонировали в него слиянием. Клонирование слиянием проводили с использованием набора для клонирования In-Fusion® HD (Clontech). Полученную плазмиду называли pDCM2-pyrR(P108S).PCR (polymerase chain reaction) was carried out using gDNA (genomic DNA) of wild type Corynebacterium stationis ATCC6872 as a template and a pair of primers having the sequences SEQ ID NOs: 5 and 6, and a pair of primers having the sequences SEQ ID NOs: 7 and 8. PCR was again carried out with overlapping primers using a mixture of the two fragments obtained above as a template and a pair of primers having the sequences SEQ ID NO: 5 and 8 to obtain the fragment. PCR was performed as follows: denaturation at 94°C for 5 minutes; 30 cycles at 94°C for 30 seconds, 55°C for 30 seconds, 72°C for 1 minute 30 seconds; and 72°C for 5 minutes. The pDCM2 vector was digested with SmaI, and the PCR product obtained above was cloned into it by fusion. Fusion cloning was performed using the In-Fusion® HD cloning kit (Clontech). The resulting plasmid was named pDCM2-pyrR(P108S).

Пример 2. Оценка способности к продуцированию ИМФ микроорганизма, экспрессирующего вариант бифункционального транскрипционного регулятора оперона pyr/урацилфосфорибозилтрансферазыExample 2. Assessment of the ability to produce IMP of a microorganism expressing a variant of the bifunctional transcriptional regulator of the pyr/uracilphosphoribosyltransferase operon

2-1. Конструирование штамма для осуществления экспрессии варианта бифункционального транскрипционного регулятора оперона pyr/урацилфосфорибозилтрансферазы2-1. Construction of a strain for expression of a variant of the bifunctional transcriptional regulator of the pyr/uracilphosphoribosyltransferase operon

Вектор, сконструированный в Примере 1, трансформировали в штамм Corynebacterium stationis CJI2332 (KCCM12277P, KR 10-1950141 В1).The vector constructed in Example 1 was transformed into Corynebacterium stationis strain CJI2332 (KCCM12277P, KR 10-1950141 B1).

Штамм, в который был введен данный вариант, отбирали из штаммов, в которых происходила гомологичная рекомбинация с использованием SEQ ID NO: 9 и 10. Отобранный штамм называли CJI2332_pyrR_P108S.The strain into which this variant was introduced was selected from strains in which homologous recombination occurred using SEQ ID NOs: 9 and 10. The selected strain was named CJI2332_pyrR_P108S.

2-2. Сравнение способности к продуцированию ИМФ штаммов, экспрессирующих вариант бифункционального транскрипционного регулятора оперона pyr/урацилфосфорибозилтрансферазы2-2. Comparison of the ability to produce IMP of strains expressing a variant of the bifunctional transcriptional regulator of the pyr/uracilphosphoribosyltransferase operon

Способность к продуцированию ИМФ анализировали посредством оценки титра ферментации в колбе каждого штамма, сконструированного в Примере 2-1, и контрольного родительского штамма.The ability to produce IMP was analyzed by assessing the flask fermentation titer of each strain constructed in Example 2-1 and the control parental strain.

Во-первых, каждый штамм инокулировали в пробирке с диаметром 18 мм, содержащей 2 мл среды для посева, и культивировали со встряхиванием в течение 24 часов при 30°С для применения в качестве раствора среды для посева. В 250 мл колбу с угловыми перегородками, содержащую 29 мл следующей продукционной среды (24 мл главной среды плюс 5 мл отдельной стерилизационной среды) инокулировали 2 мл раствора посевной культуры и культивировали при 170 об/мин в течение 72 часов при 30°С. После завершения культивирования способность к продуцированию ИМФ измеряли посредством ВЭЖХ. Концентрация ИМФ в культуральном растворе для каждого из проанализированных штаммов и скорость увеличения концентрации ИМФ являются такими, как представлено в Таблице 1 ниже.First, each strain was inoculated into an 18 mm tube containing 2 ml of inoculum medium and cultured with shaking for 24 hours at 30°C for use as inoculum solution. A 250 ml corner baffled flask containing 29 ml of the following production medium (24 ml main medium plus 5 ml separate sterilization medium) was inoculated with 2 ml of seed culture solution and cultured at 170 rpm for 72 hours at 30°C. After completion of cultivation, the IMP production capacity was measured by HPLC. The concentration of IMP in the culture solution for each of the strains analyzed and the rate of increase in the concentration of IMP are as presented in Table 1 below.

Среда для посева (рН 7,5)Sowing medium (pH 7.5)

Глюкоза 1%, пептон 1%, мясной экстракт 1%, дрожжевой экстракт 1%, хлорид натрия 0,25%, аденин 100 мг/л и гуанин 100 мг/л (на основе 1 литра дистиллированной воды).Glucose 1%, peptone 1%, meat extract 1%, yeast extract 1%, sodium chloride 0.25%, adenine 100 mg/l and guanine 100 mg/l (based on 1 liter of distilled water).

Продукционная среда - главная среда (рН 7,5)Production medium - main medium (pH 7.5)

Дрожжевой экстракт 0,2%, глутамат натрия 0,1%, сульфат магния 1,2%, хлорид кальция 0,01%, сульфат железа 20 мг/л, сульфат марганца 20 мг/л, сульфат цинка 20 мг/л, сульфат меди 5 мг/л, L-цистеин 23 мг/л, бета-аланин 24 мг/л, никотиновая кислота 8 мг/л, биотин 45 мкг/л, тиамина гидрохлорид 5 мг/л, аденин 30 мг/л, глюкоза 2,55% и фруктоза 1,45% (на основе 1 литра дистиллированной воды).Yeast extract 0.2%, monosodium glutamate 0.1%, magnesium sulfate 1.2%, calcium chloride 0.01%, ferrous sulfate 20 mg/l, manganese sulfate 20 mg/l, zinc sulfate 20 mg/l, sulfate copper 5 mg/l, L-cysteine 23 mg/l, beta-alanine 24 mg/l, nicotinic acid 8 mg/l, biotin 45 μg/l, thiamine hydrochloride 5 mg/l, adenine 30 mg/l, glucose 2 .55% and fructose 1.45% (based on 1 liter of distilled water).

Продукционная среда - отдельная стерилизационная среда (рН 7,5)Production medium - separate sterilization medium (pH 7.5)

Фосфорная кислота (85%) 2,3%, гидроксид калия (45%) 2,55% (на основе 1 литра дистиллированной воды)Phosphoric acid (85%) 2.3%, potassium hydroxide (45%) 2.55% (based on 1 liter of distilled water)

Данный эксперимент повторяли 3 раза, и средние значения его результатов анализа представлены в Таблице 1 ниже.This experiment was repeated 3 times, and the average values of its analysis results are presented in Table 1 below.

Как представлено в Таблице 1, штамм CJI2332_pyrR_P108S демонстрировал способность к продуцированию ИМФ, увеличенную на 27,9% по сравнению со способностью контрольной группы.As presented in Table 1, strain CJI2332_pyrR_P108S exhibited an IMP production capacity increased by 27.9% compared with that of the control group.

Из приведенного выше описания специалистам в технической области, к которой принадлежит настоящее раскрытие, будет понятно то, что настоящее раскрытие можно осуществлять в других конкретных формах без изменения его технической сущности и важных характеристик. В данном отношении следует понимать то, что воплощения, описанные выше, являются во всех отношениях иллюстративными и не ограничивающими. Объем настоящего раскрытия следует истолковывать как включающий все изменения или модифицированные формы, происходящие из значения и объема формулы изобретения, подлежащей описанию ниже, а не из приведенного выше подробного описания и эквивалентных ему идей.From the foregoing description, those skilled in the technical field to which the present disclosure pertains will appreciate that the present disclosure may be embodied in other specific forms without altering its technical substance or essential characteristics. In this regard, it should be understood that the embodiments described above are in all respects illustrative and non-limiting. The scope of the present disclosure should be construed to include all changes or modified forms arising from the meaning and scope of the claims to be described below and not from the foregoing detailed description and equivalent ideas thereof.

--->--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙLIST OF SEQUENCES

<110> CJ CheilJedang Corporation<110>CJ CheilJedang Corporation

<120> НОВЫЙ ВАРИАНТ БИФУНКЦИОНАЛЬНОГО ТРАНСКРИПЦИОННОГО РЕГУЛЯТОРА <120> NEW VARIANT OF BIFUNCTIONAL TRANSCRIPTION REGULATOR

ОПЕРОНА PYR/УРАЦИЛФОСФОРИБОЗИЛТРАНСФЕРАЗЫ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИМФ С PYR/URACYL PHOSPHORIBOSYLTRANSFERASE OPERON AND METHOD FOR PRODUCING IMP C

ЕГО ПРИМЕНЕНИЕМITS APPLICATION

<130> OPA21266<130> OPA21266

<150> KR 10-2021-0055714<150> KR 10-2021-0055714

<151> 2021-04-29<151> 2021-04-29

<160> 10<160> 10

<170> KoPatentIn 3.0<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1<210> 1

<211> 205<211> 205

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223> PyrR_VT<223> PyrR_VT

<400> 1<400> 1

Met Ser Gly Thr Thr Val Pro Asn Asp Gly His Glu Ala Asn Asp AlaMet Ser Gly Thr Thr Val Pro Asn Asp Gly His Glu Ala Asn Asp Ala

1 5 10 15 1 5 10 15

Gln Thr Asn Val Thr Gln Ser Glu Leu Leu Ser Ala Asp Asp Val GluGln Thr Asn Val Thr Gln Ser Glu Leu Leu Ser Ala Asp Asp Val Glu

20 25 30 20 25 30

Arg Thr Thr Ala Arg Ile Ala His Gln Ile Ile Glu Lys Thr Ala LeuArg Thr Thr Ala Arg Ile Ala His Gln Ile Ile Glu Lys Thr Ala Leu

35 40 45 35 40 45

Asp Ser Pro Gly Ala Ala Arg Val Ile Leu Leu Gly Ile Pro Ser GlyAsp Ser Pro Gly Ala Ala Arg Val Ile Leu Leu Gly Ile Pro Ser Gly

50 55 60 50 55 60

Gly Val Pro Leu Ala His Arg Leu Ala Thr Lys Ile Ala Glu Phe SerGly Val Pro Leu Ala His Arg Leu Ala Thr Lys Ile Ala Glu Phe Ser

65 70 75 80 65 70 75 80

Gly Val Asp Ile Pro Ser Gly Ser Leu Asp Ile Thr Leu Tyr Arg AspGly Val Asp Ile Pro Ser Gly Ser Leu Asp Ile Thr Leu Tyr Arg Asp

85 90 95 85 90 95

Asp Leu Arg Asn Lys Pro His Arg Ala Leu Gln Ser Thr Ser Ile ProAsp Leu Arg Asn Lys Pro His Arg Ala Leu Gln Ser Thr Ser Ile Pro

100 105 110 100 105 110

Ala Gly Gly Ile Asp Asn Ala Ile Val Val Leu Val Asp Asp Val LeuAla Gly Gly Ile Asp Asn Ala Ile Val Val Leu Val Asp Asp Val Leu

115 120 125 115 120 125

Phe Ser Gly Arg Thr Ile Arg Ala Ala Leu Asp Ala Ile Gly Asp IlePhe Ser Gly Arg Thr Ile Arg Ala Ala Leu Asp Ala Ile Gly Asp Ile

130 135 140 130 135 140

Gly Arg Pro Gln Ser Ile Gln Leu Ala Val Leu Val Asp Arg Gly HisGly Arg Pro Gln Ser Ile Gln Leu Ala Val Leu Val Asp Arg Gly His

145 150 155 160145 150 155 160

Arg Gln Val Pro Ile Arg Ala Asp Tyr Val Gly Lys Asn Val Pro ThrArg Gln Val Pro Ile Arg Ala Asp Tyr Val Gly Lys Asn Val Pro Thr

165 170 175 165 170 175

Ala Ser Asn Glu Asp Ile Asp Val Leu Ile Ser Asp Ile Asp Gly ArgAla Ser Asn Glu Asp Ile Asp Val Leu Ile Ser Asp Ile Asp Gly Arg

180 185 190 180 185 190

Asp Ala Val Val Leu Thr Arg Gly Ile Thr Ser Thr GlnAsp Ala Val Val Leu Thr Arg Gly Ile Thr Ser Thr Gln

195 200 205 195 200 205

<210> 2<210> 2

<211> 618<211> 618

<212> DNA<212> DNA

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223> pyrR_VT<223> pyrR_VT

<400> 2<400> 2

atgagtggaa caactgtacc caacgacggg cacgaagcaa acgatgcgca gacaaatgtc atgagtggaa caactgtacc caacgacggg cacgaagcaa acgatgcgca gacaaatgtc

60 60

acgcagtcag aattgctcag tgctgacgac gttgaacgta caaccgcacg catcgcgcac acgcagtcag aattgctcag tgctgacgac gttgaacgta caaccgcacg catcgcgcac

120 120

cagattattg aaaagacagc attggattca cccggtgctg cgcgagtaat tttattgggc cagattattg aaaagacagc attggattca cccggtgctg cgcgagtaat tttattgggc

180 180

atcccttcag gtggcgtgcc ccttgcacac cggctagcaa caaagattgc agaattttcc atcccttcag gtggcgtgcc ccttgcacac cggctagcaa caaagattgc agaattttcc

240 240

ggtgtggaca tccccagtgg atccttagat atcacgttgt accgcgatga tttgcgtaat ggtgtggaca tccccagtgg atccttagat atcacgttgt accgcgatga tttgcgtaat

300 300

aaaccgcacc gcgctctgca atcaacatcc atcccagccg gtggcatcga caatgccatt aaaccgcacc gcgctctgca atcaacatcc atcccagccg gtggcatcga caatgccatt

360 360

gtcgttttgg tcgatgacgt cctcttttcc ggccgcacca ttcgtgccgc tttagacgcg gtcgttttgg tcgatgacgt cctcttttcc ggccgcacca ttcgtgccgc tttagacgcg

420 420

atcggcgata ttggtcgccc acagtccatt caattagccg tcttggttga ccgtggccac atcggcgata ttggtcgccc acagtccatt caattagccg tcttggttga ccgtggccac

480 480

cgccaggttc caattcgcgc tgattatgta ggaaagaacg ttccgactgc cagcaatgaa cgccaggttc caattcgcgc tgattatgta ggaaagaacg ttccgactgc cagcaatgaa

540 540

gacattgatg tccttattag cgatattgac ggccgcgacg cggtggtctt gacccgcggc gacattgatg tccttattag cgatattgac ggccgcgacg cggtggtctt gacccgcggc

600 600

atcacatcca cgcaataa atcacatcca cgcaataa

618 618

<210> 3<210> 3

<211> 205<211> 205

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223> PyrR_WT<223> PyrR_WT

<400> 3<400> 3

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 80 65 70 75 80

85 90 95 85 90 95

Asp Leu Arg Asn Lys Pro His Arg Ala Leu Gln Pro Thr Ser Ile ProAsp Leu Arg Asn Lys Pro His Arg Ala Leu Gln Pro Thr Ser Ile Pro

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

<210> 4<210> 4

<211> 618<211> 618

<212> DNA<212> DNA

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223> pyrR_WT<223> pyrR_WT

<400> 4<400> 4

60 60

120 120

180 180

240 240

300 300

aaaccgcacc gcgctctgca accaacatcc atcccagccg gtggcatcga caatgccatt aaaccgcacc gcgctctgca accaacatcc atcccagccg gtggcatcga caatgccatt

360 360

420 420

480 480

540 540

600 600

atcacatcca cgcaataa atcacatcca cgcaataa

618 618

<210> 5<210> 5

<211> 39<211> 39

<212> DNA<212> DNA

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223> Праймер_1F<223> Primer_1F

<400> 5<400> 5

gtgaattcga gctcggtacc ccaactgtac ccaacgacg gtgaattcga gctcggtacc ccaactgtac ccaacgacg

39 39

<210> 6<210> 6

<211> 33<211> 33

<212> DNA<212> DNA

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223> Праймер_2R<223> Primer_2R

<400> 6<400> 6

gctgggatgg atgttgattg cagagcgcgg tgc gctgggatgg atgttgattg cagagcgcgg tgc

33 33

<210> 7<210> 7

<211> 33<211> 33

<212> DNA<212> DNA

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223> Праймер_3F<223> Primer_3F

<400> 7<400> 7

gcaccgcgct ctgcaatcaa catccatccc agc gcaccgcgct ctgcaatcaa catccatccc agc

33 33

<210> 8<210> 8

<211> 38<211> 38

<212> DNA<212> DNA

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223> Праймер_4R<223> Primer_4R

<400> 8<400> 8

ggtcgactct agaggatccc ccaaacgagg cacgcgtg ggtcgactct agaggatccc ccaaacgagg cacgcgtg

38 38

<210> 9<210> 9

<211> 18<211> 18

<212> DNA<212> DNA

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223> Праймер_5F<223> Primer_5F

<400> 9<400> 9

gcgacggtgc gataagtg gcgacggtgc gataagtg

18 18

<210> 10<210> 10

<211> 17<211> 17

<212> DNA<212> DNA

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223> Праймер_6R<223> Primer_6R

<400> 10<400> 10

catccgcgga catccac catccgcgga catccac

17 17

<---<---

Claims

1. A polypeptide involved in the production of IMP (5'-inosyl monophosphate), consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, in which proline, which is the amino acid corresponding to position 108 in SEQ ID NO: 3, is replaced by serine.

2. Polynucleotide encoding the polypeptide according to claim 1.

3. The microorganism Corynebacterium stationis , producing IMP containing the polypeptide according to claim 1 or a polynucleotide encoding this polypeptide.

4. The microorganism according to claim 3, which has an increased ability to produce IMP (5'-inosyl monophosphate) compared to Corynebacterium stationis containing the polypeptide SEQ ID NO: 3 or a polynucleotide encoding this polypeptide.

5. A method for producing IMP, including cultivating in a medium the microorganism Corynebacterium stationis containing the polypeptide according to claim 1 or a polynucleotide encoding this polypeptide.