RU2819186C2

RU2819186C2 - Питательная композиция, содержащая 2'-фукозиллактозу (2'fl), для улучшения барьера желудочно-кишечного тракта

Info

Publication number: RU2819186C2
Application number: RU2021120632A
Authority: RU
Inventors: Клара Лючия ГАРСИА-РОДЕНАС; Джейн Ми М. НАТИВИДАД; Андреас РИЦ; Сами ДАМАК; Норберт ШПРЕНГЕР; Франсис ФОАТА; Флоранс Роша; Клэр Лоранс Люси Мари БУЛАНЖ
Original assignee: Сосьете Де Продюи Нестле С.А.
Priority date: 2018-12-21
Filing date: 2019-12-11
Publication date: 2024-05-15

Abstract

Изобретение относится к питательным композициям для младенца, ребенка младшего возраста или детей в возрасте от 3 лет до 8 лет. Предложено применение питательной композиции, содержащей 2’-фукозиллактозу (2’FL), для улучшения барьера желудочно-кишечного тракта у младенца, который представляет собой ребёнка в возрасте до 12 месяцев, у ребёнка младшего возраста, который представляет собой ребёнка в возрасте от 1 года до менее 3 лет, или у ребёнка в возрасте от 3 лет до менее 8 лет. Причём указанное улучшение барьера желудочно-кишечного тракта представляет собой улучшенную защиту барьера. При этом 2’FL присутствует в количестве 0,25-1,9 г/л или 0,15-1,5 г/100 г композиции в расчёте на массу сухого вещества, предпочтительно в количестве 0,75-1,65 г/л или 0,19-1,5 г/100 г композиции в расчёте на массу сухого вещества. Изобретение позволяет улучшить защиту барьера желудочно-кишечного у младенца, ребенка младшего возраста или детей в возрасте от 3 лет до 8 лет. 12 з.п. ф-лы, 4 ил., 2 табл., 6 пр.

Description

Область применения изобретения

Настоящее изобретение относится к питательным композициям, содержащим 2'-фукозиллактозу (2'FL), для применения при улучшении барьера желудочно-кишечного тракта. В частности, настоящее изобретение относится к улучшению барьера желудочно-кишечного тракта у младенца, ребенка младшего возраста или детей в возрасте от 3 лет до 8 лет.

Предпосылки создания изобретения

Материнское молоко рекомендовано всем младенцам. Однако в некоторых случаях грудное вскармливание является недостаточным или неэффективным по медицинским причинам либо мать решает не кормить грудью. Для этих ситуаций были разработаны детские смеси. Были разработаны также обогатители для витаминизации материнского молока или детской смеси определенными ингредиентами. В таких случаях было бы еще более предпочтительно обеспечить средства для улучшения барьера желудочно-кишечного тракта у младенцев и детей младшего возраста посредством вмешательства в питание, например, посредством сбалансированного питания или питательных добавок.

Во время постнатального развития кишечник новорожденного подвергается процессу созревания, который завершается формированием функционального барьера для макромолекул и патогенных бактерий. Это явление называется закрытием кишечника и, по-видимому, зависит от рациона питания. В этом контексте различные исследования младенцев (JPGN, 1995, 21: 383-6) и животных моделей (Pediatr Res, 1990, 28: 31-7) показывают, что созревание барьера происходит у новорожденных быстрее при грудном вскармливании, чем при вскармливании детской смесью. Это может объяснить более высокую распространенность аллергии и инфекции у младенцев, вскармливаемых смесью, чем у младенцев, вскармливаемых материнским молоком.

Некоторые конкретные группы младенцев и детей младшего возраста особенно нуждаются в композициях, способных обеспечить пользу для здоровья, например, улучшить функцию кишечного барьера. Такими младенцами и детьми младшего возраста являются, например, недоношенные младенцы, младенец с низким весом при рождении и/или младенцы или дети младшего возраста с задержкой роста. Действительно, кишечный барьер более проницаем и более подвержен повреждениям, а его структура и функции у таких младенцев менее зрелые, чем у здорового доношенного младенца. Это, в свою очередь, может приводить к другим проблемам, таким как инфекция или аллергия. Для таких младенцев особенно предпочтительно дополнять фармакологическое лечение питательными композициями, способными улучшать функцию кишечного барьера.

Ранее было исследовано влияние пищевых компонентов, таких как олигосахариды грудного молока, на улучшение барьера желудочно-кишечного тракта.

2'FL, перечисленная среди других олигосахаридов, описана как благоприятная для барьера желудочно-кишечного тракта в WO2013/032674 (функция барьера желудочно-кишечного тракта), WO2017/144062 (поддержание или восстановление проницаемости барьера желудочно-кишечного тракта посредством микробиоты), WO2017/71716 (лечение нарушения барьера слизистой оболочки), WO2017/046711 (лечение нарушения барьера слизистой оболочки), WO2016/91265 (снижение проницаемости кишечника), WO2016/66174 (поддержание целостности слизистой оболочки).

Следовательно, преимуществом будет обладать улучшенная питательная композиция, в частности, преимуществом будет обладать более эффективная и/или надежная питательная композиция для недоношенных детей.

Было бы полезно дополнительно оптимизировать влияние питательных композиций на барьер желудочно-кишечного тракта у всех младенцев и детей.

Существует очевидная потребность в разработке приемлемых способов улучшения барьера желудочно-кишечного тракта у младенцев и детей младшего возраста.

Также существует потребность в обеспечении таких полезных для здоровья эффектов способом, который особенно приемлем для субъектов младшего возраста (младенцев и детей младшего возраста), который не должен включать классическое фармацевтическое вмешательство, поскольку эти младенцы или дети младшего возраста особенно уязвимы.

Существует потребность в обеспечении у этих младенцев или детей младшего возраста таких полезных для здоровья эффектов способом, который не вызывает побочных эффектов и/или который можно легко предоставлять и который приемлем для родителей или медицинских работников.

Также существует потребность в обеспечении таких полезных эффектов способом, который позволит сохранять разумную и доступную для большинства стоимость такого обеспечения.

Таким образом, существует очевидная потребность в разработке альтернативных способов, отличных от классического фармацевтического вмешательства, такого как применение фармацевтических препаратов, по меньшей мере из-за связанного риска возникновения побочных эффектов.

Изложение сущности изобретения

Настоящее изобретение относится к питательным композициям, содержащим 2'-фукозиллактозу (2'FL), для применения при улучшении барьера желудочно-кишечного тракта. Эффект подтверждается результатами исследования in vitro на модели эпителиальных клеток кишечника. Как раскрыто в разделе «Примеры», было обнаружено, что 2'-фукозиллактоза (2'FL) превосходит другие исследованные ОГМ в отношении улучшения барьера желудочно-кишечного тракта, затем следует смесь ОГМ, содержащая 2’FL.

В дополнительных экспериментах были выявлены механизмы, участвующие в улучшении барьера желудочно-кишечного тракта благодаря 2’FL. С одной стороны, авторы настоящего изобретения продемонстрировали, что улучшение кишечного барьера достигается по меньшей мере путем понижения регуляции рецептора ФНО-α на эпителиальных клетках, что, в частности, приводит к улучшению защиты барьера желудочно-кишечного тракта. Такой механизм защиты слизистой оболочки связан с улучшением функции, структуры, восстановления и созревания барьера желудочно-кишечного тракта и, в частности, с улучшением функции и структуры барьера желудочно-кишечного тракта.

С другой стороны, дополнительные эксперименты показали, что 2’FL также была эффективна путем увеличения выработки кинуреновой кислоты микробиотой младенца или ребенка младшего возраста, потребляющего композицию, и посредством последующей активации связанного с G-белком рецептора 35 (GPR35) с помощью кинуреновой кислоты. На самом деле было обнаружено, что кинуреновая кислота способна запускать активацию рецептора GPR35 согласно Wang, et al. 2006. Kynurenic acid as a ligand for orphan G protein-coupled receptor GPR35. J Biol Chem. 281:22021-22028. GPR35 вовлечен в повышенную миграция энтероцитов, которая является важным механизмом после повреждения слизистой оболочки для быстрого восстановления целостности эпителия на площади поверхности оголенных ворсинок. Tsukahara et al обнаружили, что активация GPR35 способствует репарации слизистой оболочки в толстой кишке (Pharmacological Research 123 (2017) 27–39). Такой механизм восстановления слизистой оболочки связан с улучшением функции, структуры, защиты и созревания барьера желудочно-кишечного тракта и, в частности, с улучшением функции, структуры и защиты барьера желудочно-кишечного тракта.

Таким образом, цель настоящего изобретения относится к питательным композициям, которые улучшают барьер желудочно-кишечного тракта, например, улучшают созревание барьера, улучшают защиту барьера, улучшают структуру барьера, улучшают функцию барьера и/или улучшают репарацию барьера. Все такие аспекты барьера желудочно-кишечного тракта являются взаимосвязанными. Надлежащее созревание желудочно-кишечного тракта приводит к надлежащей структуре и функции желудочно-кишечного тракта, которые, в свою очередь, поддерживаются надлежащей защитой барьера и восстанавливаются путем надлежащей репарацией барьера. Таким образом, любой из этих аспектов, рассматриваемых вместе или по отдельности, способствует устойчивому снижению восприимчивости к заболеваниям.

Таким образом, один аспект изобретения относится к питательной композиции, содержащей 2'-фукозиллактозу (2'FL), для применения при улучшении барьера желудочно-кишечного тракта у младенца (ребенка в возрасте до 12 месяцев) или ребенка младшего возраста (от 1 года до менее 3 лет); или к питательной композиции в виде молочной смеси для детей от 1 до 3 лет, содержащая 2'-фукозиллактозу (2'FL), для применения при улучшении барьера желудочно-кишечного тракта у ребенка (в возрасте от 3 лет до менее 8 лет). В конкретном варианте осуществления этот эффект достигается путем увеличения выработки кинуреновой кислоты микробиотой младенца или ребенка младшего возраста, соответственно ребенка в возрасте от 3 лет до менее 8 лет, потребляющего питательную композицию.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанное улучшение барьера желудочно-кишечного тракта представляет собой улучшенную защиту барьера, улучшенную структуру барьера и улучшенную функцию барьера, предпочтительно улучшенную защиту барьера и/или более эффективную репарацию барьера.

Краткое описание графических материалов

Фиг. 1. Эффективность ОГМ в снижении индуцированной воспалением дисфункции эпителиального барьера. Сокультуры обрабатывают с помощью ОГМ, а затем посредством воспаления, опосредованного цитокинами, вызывают дисфункцию эпителиального барьера. Все группы, кроме отрицательного контроля (цельный барьер), подвержены воспалительной провокации. Целостность эпителиального барьера рассчитывают путем анализа перемещения FITC-меченного декстрана (FD4) из апикального компартмента в базолатеральный компартмент в сравнении с отрицательным контролем (произвольно взят за 1) и положительным контролем (произвольно взят за 0) после воспалительной провокации. Планки погрешностей отражают минимальное стандартное отклонение.

Фиг. 2. Устойчивость к вызванному воспалением нарушению функции барьера кишечного эпителия путем понижения экспрессии рецептора ФНО-α. Сокультуры обрабатывают с помощью 2’FL, а затем посредством воспаления, опосредованного цитокинами, вызывают дисфункцию эпителиального барьера. График отражает экспрессию мРНК рецептора ФНО-α (рФНО1) по отношению к отрицательному контролю. Все группы, кроме отрицательного контроля (цельный барьер), подвержены воспалительной провокации. Планки погрешностей отражают СО.

На фиг. 3 показан относительный избыток кинуреновой кислоты в надосадочной жидкости ферментированного кала младенцев в присутствии лактозы (лактозы), 2’FL, 2’FL + LNT или 2’FL, DFL, LNT, LNnT, 3’SL и 6’SL (6 ОГМ), демонстрируя повышенный уровень кинуреновой кислоты в присутствии любой комбинации ОГМ, содержащих 2’FL, по сравнению с лактозой. * p<0,05 в сравнении с лактозой,** p<0,01 (пример 5)

На фиг. 4 показан дозозависимый эффект активации GPR35 в режиме аррестина на эквимолярный 6’SL + LNT с 200 мкМ KYNA или без нее и с 100–200 мкМ KYNA, демонстрирующий аддитивный эффект в концентрациях от 940 мкМ до 2500 мкМ. Этот эксперимент проводили три раза со сравнимыми результатами (пример 6).

Настоящее изобретение будет более подробно описано ниже.

Подробное описание изобретения

Определения

До более подробного описания настоящего изобретения будут приведены определения указанных ниже терминов и условных обозначений.

Термин «младенец» означает ребенка в возрасте до 12 месяцев (<12 месяцев). Выражение «ребенок младшего возраста» означает ребенка в возрасте от одного до менее трех лет (≥1 года до <3 лет), его также называют ребенком, начинающим ходить. Выражение «ребенок» означает ребенка в возрасте от трех до менее восьми лет ((≥ 3 лет до <8 лет).

«Младенец или ребенок младшего возраста, рожденный посредством кесарева сечения» означает младенца или ребенка младшего возраста, рожденного посредством кесарева сечения. Это означает, что младенец или ребенок младшего возраста не был рожден посредством вагинальных родов.

«Младенец или ребенок младшего возраста, рожденный посредством вагинальных родов» означает младенца или ребенка младшего возраста, который был рожден посредством вагинальных родов, а не посредством кесарева сечения.

«Недоношенный» или «преждевременно родившийся» означает младенца или ребенка младшего возраста, который родился раньше срока. По существу, этот термин относится к младенцу или ребенку младшего возраста, рожденному до 37-й недели беременности.

«Младенец с низким весом при рождении» означает новорожденного, имеющего массу тела менее 2500 г (5,5 фунта) по причине либо преждевременных родов, либо ограниченного роста плода. Таким образом, этот термин включает:

- младенца или ребенка младшего возраста, который имеет/имел вес при рождении от 1500 до 2500 г (обычно называемый «низким весом при рождении» или НВР);

- младенца или ребенка младшего возраста, который имеет/имел вес при рождении от 1000 до 1500 г (обычно называемый «очень низким весом при рождении» или ОНВР);

- младенца или ребенка младшего возраста, который имеет/имел массу тела менее 1000 г при рождении (обычно называемую «крайне низкий вес при рождении» или КНВР).

«Младенец, родившийся маленьким для своего гестационного возраста (SGA)» означает ребенка с весом при рождении менее 10-го процентиля для детей того же гестационного возраста.

Выражение «питательная композиция» означает композицию, которой питается субъект. Данная питательная композиция обычно предназначена для перорального применения и обычно включает источник липидов или жира и источник белка.

В конкретном варианте осуществления композиция настоящего изобретения представляет собой гипоаллергенную питательную композицию. Выражение «гипоаллергенная питательная композиция» означает питательную композицию, которая с низкой вероятностью вызовет аллергические реакции.

В конкретном варианте осуществления композиция настоящего изобретения представляет собой «искусственную питательную композицию». Выражение «искусственная питательная композиция» означает смесь, полученную с помощью химических и/или биологических средств, которые могут быть химически идентичны смеси природного происхождения, присутствующей в молоке млекопитающих (т.е. искусственная композиция не является грудным молоком).

Выражение «детская смесь» при использовании в настоящем документе относится к продукту питания, который специально предназначен для употребления в пищу младенцами в течение первых месяцев жизни и сам по себе удовлетворяет потребности в питании этой категории лиц (статья 2(c) Директивы Европейской комиссии 91/321/EEC 2006/141/EC от 22 декабря 2006 г. о детских смесях и смесях для прикармливаемых детей). Оно также относится к питательной композиции, предназначенной для младенцев, как определено в Codex Alimentarius (Codex STAN 72-1981) и Infant Specialities (включая статью Food for Special Medical Purpose). Выражение «детская смесь» охватывает как «начальную детскую смесь», так и «смесь последующего уровня» или «смесь для прикармливаемых детей».

«Смесь последующего уровня» или «смесь для прикармливаемых детей» дают, начиная с 6-го месяца. Она составляет главный жидкий элемент в постепенно увеличивающемся разнообразии рациона питания для данной категории лиц.

Выражение «детское питание» означает продукт питания, специально предназначенный для употребления в пищу младенцами или детьми младшего возраста в течение первых лет жизни.

Выражение «детская композиция на зерновой основе» означает продукт питания, специально предназначенный для употребления в пищу младенцами или детьми младшего возраста в течение первых лет жизни.

Выражение «молочная смесь для детей от 1 до 3 лет» (или GUM) относится к напитку на основе молока, как правило, с добавлением витаминов и минеральных веществ, который предназначен для детей младшего возраста или детей.

Термин «обогатитель» относится к жидким или твердым питательным композициям, подходящим для обогащения или смешивания с грудным молоком, детской смесью, молочной смесью для детей от 1 года до 3 лет или грудным молоком, обогащенным другими питательными веществами. Соответственно, обогатитель по настоящему изобретению можно вводить после растворения в грудном молоке, детской смеси, молочной смеси для детей от 1 года до 3 лет или грудном молоке, обогащенном другими питательными веществами, или в противном случае его можно вводить в виде отдельной композиции. При введении в виде отдельной композиции обогатитель грудного молока по настоящему изобретению можно также определять как «добавку». В одном варианте осуществления обогатитель молока настоящего изобретения представляет собой добавку.

Выражение «период отлучения от груди» означает период, в течение которого в рационе младенца или ребенка младшего возраста материнское молоко заменяют другой пищей.

Выражения «в возрасте дней/недель/месяцев/лет» и «дней/недель/месяцев/лет после рождения» могут использоваться как взаимозаменяемые.

Выражение «улучшенный барьер желудочно-кишечного тракта» может включать в себя одно или более из следующего:

- Более эффективная репарация барьера, такая как (без ограничений) восстановление целостности барьера желудочно-кишечного тракта, такая как репарация разорванного барьера, снижение проницаемости после воспалительной провокации слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта и репарация слизистой оболочки.

- Улучшенное созревание барьера, такое как (без ограничений) созревание и/или развитие барьера у младенца, предпочтительно у недоношенного младенца.

- Улучшенная структура барьера, такая как (без ограничений) укрепление барьера желудочно-кишечного тракта, целостность барьера желудочно-кишечного тракта, структура с плотным соединением клеток и целостность эпителиальной выстилки кишечника.

- Улучшенная барьерная функция, такая как улучшение сопротивляемости барьера желудочно-кишечного тракта, снижение проницаемости барьера желудочно-кишечного тракта, такая как сокращение патогенов, мигрирующих из кишечника через кишечный барьер, такая как сокращение комменсальных бактерий мигрирующих из кишечника через кишечный барьер, сокращение аллергенов, мигрирующих из кишечника через кишечный барьер, сокращение токсичных соединений, мигрирующих из кишечника через кишечный барьер и снижение восприимчивости к заболеваниям.

- Улучшенная защита барьера, такая как (без ограничений) предотвращение дисфункции барьера, предотвращение проницаемости барьера, защита структуры с плотным соединением клеток, защита целостности эпителиальной выстилки кишечника.

В предпочтительном варианте осуществления улучшение барьера желудочно-кишечного тракта относится к созреванию барьера желудочно-кишечного тракта.

Термин «увеличение выработки кинуреновой кислоты» означает увеличение, усиление и/или стимулирование выработки таких видов молекул (и/или их физиологически приемлемых солей или ионов) в результате действия микробиоты младенца и/или ребенка младшего возраста, потребляющего питательные композиции в соответствии с настоящим изобретением. В одном варианте осуществления увеличение выработки кинуреновой кислоты происходит в кишечнике младенца и/или ребенка младшего возраста, потребляющего питательные композиции в соответствии с настоящим изобретением. В одном варианте осуществления термин «увеличение выработки кинуреновой кислоты» означает увеличение выработки таких видов молекул (и/или их физиологически приемлемых солей или ионов) в результате действия микробиоты младенца и/или ребенка младшего возраста, потребляющего питательные композиции в соответствии с настоящим изобретением. В другом варианте осуществления термин «увеличение выработки кинуреновой кислоты» означает стимулирование выработки таких видов молекул (и/или их физиологически приемлемых солей или ионов) в результате действия микробиоты младенца и/или ребенка младшего возраста, потребляющего питательные композиции в соответствии с настоящим изобретением.

Под «материнским молоком» следует понимать грудное молоко или молозиво матери.

«Олигосахарид» представляет собой сахаридный полимер, содержащий небольшое число (как правило, от трех до десяти) простых сахаров (моносахаридов).

Термин «ОГМ» относится к олигосахариду (-ам) грудного молока. Эти углеводы обладают высокой устойчивостью к ферментативному гидролизу, что указывает на то, что они могут проявлять существенные функции, непосредственно не относящиеся к их калорийности. В первую очередь было показано, что они играют жизненно важную роль в раннем развитии младенцев и детей младшего возраста, например, в развитии иммунной системы. В грудном молоке обнаружено много различных видов ОГМ. Каждый отдельный олигосахарид основан на комбинации глюкозы, галактозы, сиаловой кислоты (N-ацетилнейраминовой кислоты), фукозы и/или N-ацетилглюкозамина с образованием многочисленных и разнообразных связей между ними, что обусловливает присутствие огромного числа различных олигосахаридов в грудном молоке — на данный момент было выявлено более 130 таких структур. Почти все они на своем восстанавливающем конце имеют лактозный фрагмент, в то время как сиаловая кислота и/или фукоза (при наличии) занимают концевые положения на невосстанавливающих концах. ОГМ могут быть кислыми (например, содержащий заряженную сиаловую кислоту олигосахарид) или нейтральными (например, фукозилированный олигосахарид).

«Фукозилированный олигосахарид» представляет собой олигосахарид, имеющий остаток фукозы. Он имеет нейтральный характер. Некоторыми примерами являются 2-FL (2’-фукозиллактоза), 3-FL (3-фукозиллактоза), дифукозиллактоза, лакто-N-фукопентаоза (например, лакто-N-фукопентаоза I, лакто-N-фукопентаоза II, лакто-N-фукопентаоза III, лакто-N-фукопентаоза V), лакто-N-фукогексаоза, лакто-N-дифукогексаоза I, фукозиллакто-N-гексаоза, фукозиллакто-N-неогексаоза, дифукозиллакто-N-гексаоза I, дифукозиллакто-N-неогексаоза II и любая их комбинация. Хотя авторы не желают ограничиваться какой-либо теорией, считается, что фукозил-эпитоп фукозилированных олигосахаридов может выступать в качестве «ловушки» на поверхности слизистой оболочки. Посредством конкурентного эффекта он может предотвращать и/или ограничивать действие патогенов, вызывающих инфекции (вирусного или бактериального происхождения), или секретируемых ими компонентов (например, токсинов), в первую очередь исключая их связывание с природными лигандами, и, безотносительно к какой-либо теории, считается, что за счет этого будет снижаться риск возникновения инфекций/воспалений, и в частности риск возникновения инфекций и/или воспалений нижних дыхательных путей (НДП)/уха. Дополнительно принято считать, что фукозилированные олигосахариды стимулируют рост и метаболическую активность специфических симбиотических микробов, снижающих воспалительную реакцию и создающих неблагоприятную среду для патогенов, тем самым обеспечивая колонизационную резистентность.

Выражения «фукозилированные олигосахариды, содержащие 2’-фукозил-эпитоп» и «2-фукозилированные олигосахариды» охватывают фукозилированные олигосахариды с определенной гомологией формы, поскольку они содержат 2’-фукозил-эпитоп; следовательно, можно ожидать определенную гомологию функции. Хотя авторы не желают ограничиваться какой-либо теорией, считается, что 2’-фукозил-эпитоп этих фукозилированных олигосахаридов особо характерен для патогенов (или секретируемых ими компонентов), вызывающих инфекции НДП и/или уха.

Выражение «N-ацетилированный (-ые) олигосахарид (-ы)» охватывает как «N-ацетиллактозамин», так и «олигосахарид (-ы), содержащий (-ие) N-ацетиллактозамин». Они являются нейтральными олигосахаридами, имеющими остаток N-ацетиллактозамина. Подходящими примерами являются LNT (лакто-N-тетраоза), пара-лакто-N-неогексаоза (пара-LNnH), LNnT (лакто-N-неотетраоза) и любые их комбинации. Другими примерами являются лакто-N-гексаоза, лакто-N-неогексаоза, пара-лакто-N-гексаоза, пара-лакто-N-неогексаоза, лакто-N-октаоза, лакто-N-неооктаоза, изо-лакто-N-октаоза, пара-лакто-N-октаоза и лакто-N-декаоза.

Выражения «по меньшей мере один фукозилированный олигосахарид» и «по меньшей мере один N-ацетилированный олигосахарид» означают «по меньшей мере один тип фукозилированного олигосахарида» и «по меньшей мере один тип N-ацетилированного олигосахарида».

«Предшественник ОГМ» представляет собой ключевое соединение, которое включается в выработку ОГМ, такое как сиаловая кислота и/или фукоза.

«Сиалилированный олигосахарид» представляет собой олигосахарид, содержащий заряженную сиаловую кислоту, т.е. олигосахарид, имеющий остаток сиаловой кислоты. Он имеет кислотный характер. Некоторыми примерами являются 3-SL (3’-сиалиллактоза) и 6-SL (6’-сиалиллактоза).

Питательная композиция настоящего изобретения может находиться в твердой форме (например, в форме порошка) или в жидком виде. Количество различных ингредиентов (например, олигосахаридов) может выражаться в г/100 г композиции в расчете на массу сухого вещества, если она представлена в твердой форме, например в порошке, или как концентрация в г/л композиции, если она относится к жидкой форме (последний случай также включает жидкую композицию, которую можно получать из порошка после растворения в жидкости, например в молоке, воде и т.п., например растворенную детскую смесь, или смесь для прикармливаемых детей/смесь последующего уровня, или молочную смесь для детей от 1 до 3 лет, или зерновой продукт для детского питания, или любую другую смесь, предназначенную для детского питания).

Термин «пребиотик» означает неперевариваемые углеводы, которые благоприятно влияют на организм-хозяина, избирательно стимулируя рост и/или активность полезных для здоровья бактерий, например, бифидобактерий, в толстой кишке человека (Gibson GR, Roberfroid MB. Dietary modulation of the human colonic microbiota: introducing the concept of prebiotics. J Nutr. 1995;125:1401–12).

Термин «пробиотик» означает препараты клеток микроорганизмов или компонентов клеток микроорганизмов, которые оказывают благоприятное воздействие на здоровье или самочувствие организма-хозяина. (Salminen S, Ouwehand A. Benno Y. et al. Probiotics: how should they be defined. Trends Food Sci. Technol. 1999:10 107–10). Клетки микроорганизмов, по существу, представляют собой бактерии или дрожжи.

Под термином «КОЕ» следует понимать колониеобразующую единицу.

Если не указано иное, все процентные содержания даны по массе.

Дополнительно в контексте изобретения термины «содержащий» или «содержит» не исключают других возможных элементов. Композиция настоящего изобретения, включая многие варианты осуществления, описанные в настоящем документе, может содержать существенные элементы и ограничения изобретения, описанные в настоящем документе, а также любые дополнительные или необязательные ингредиенты, компоненты или ограничения, описанные в настоящем документе или иным образом, в зависимости от потребностей, состоять или по существу состоять из них.

Любую ссылку на документы предшествующего уровня техники в данном описании не следует рассматривать как признание того, что такой предшествующий уровень техники широко известен или составляет часть общеизвестных знаний в данной области.

Более подробное описание изобретения будет представлено ниже. Следует отметить, что различные аспекты, признаки, примеры и варианты осуществления, описанные в настоящей заявке, могут быть совместимыми и/или скомбинированными друг с другом.

Питательная композиция

Как также указано выше. Настоящее изобретение относится к питательным композициям, содержащим 2'-фукозиллактозу (2'FL), для применения при улучшении барьера желудочно-кишечного тракта. Как раскрыто в разделе «Примеры», было обнаружено, что 2'-фукозиллактоза (2'FL) превосходит другие исследованные ОГМ в отношении улучшения барьера желудочно-кишечного тракта, затем следует смесь ОГМ, содержащая 2’FL. Таким образом, один аспект изобретения относится к питательной композиции, содержащей 2'-фукозиллактозу (2'FL), для применения при улучшении барьера желудочно-кишечного тракта у младенца (ребенка в возрасте до 12 месяцев) или ребенка младшего возраста (от 1 года до менее 3 лет);

или

питательной композиции в виде молочной смеси для детей от 1 до 3 лет, содержащей 2'-фукозиллактозу (2'FL), для применения при улучшении барьера желудочно-кишечного тракта у ребенка (в возрасте от 3 лет до менее 8 лет).

В варианте осуществления указанное улучшение барьера желудочно-кишечного тракта представляет собой улучшенное созревание барьера, улучшенную структуру барьера, улучшенную функцию барьера, улучшенную защиту барьера и/или более эффективную репарацию барьера.

В другом варианте осуществления указанное улучшение барьера желудочно-кишечного тракта представляет собой улучшенную функцию барьера, улучшенную структуру барьера и/или улучшенную защиту барьера.

В еще одном варианте осуществления указанное улучшение барьера желудочно-кишечного тракта представляет собой улучшение защиты барьера.

В еще одном варианте осуществления указанное применение предназначено для улучшения предотвращения дисфункции барьера, предотвращения проницаемости барьера, защиты структуры с плотным соединением клеток и защиты целостности эпителиальной выстилки кишечника. В дополнительном варианте осуществления указанное предотвращение проницаемости барьера представляет собой предотвращение миграции патогенов, аллергенов и/или токсичных соединений из кишечника в организм через кишечный барьер. Как описано в примере 3, было обнаружено, что 2’FL превосходит другие испытуемые ОГМ в отношении улучшения защиты барьера желудочно-кишечного тракта.

Защита барьера желудочно-кишечного тракта приводит к улучшению структуры и функции барьера желудочно-кишечного тракта, поскольку отсутствие надлежащей защиты барьера желудочно-кишечного тракта теряет свою оптимальную структуру и функцию, а именно при воспалительной провокации.

Таким образом, в варианте осуществления указанное применение предназначено для повышения прочности барьера желудочно-кишечного тракта, целостности барьера желудочно-кишечного тракта, структуры с плотным соединением клеток и целостности эпителиальной выстилки кишечника.

В другом варианте осуществления указанное применение предназначено для улучшения устойчивости барьера желудочно-кишечного тракта и для снижения проницаемости барьера желудочно-кишечного тракта. Предпочтительно указанное применение предназначено для уменьшения миграции патогенов из кишечника через кишечный барьер, например, уменьшения миграции синантропных бактерий из кишечника через кишечный барьер, уменьшения миграции аллергенов из кишечника через кишечный барьер, уменьшения миграции токсичных соединений из кишечника через кишечный барьер и снижения восприимчивости к заболеваниям.

В конкретном варианте осуществления упомянутые выше улучшения достигаются путем понижающей регуляции рецептора ФНО-α на эпителиальных клетках. В предпочтительном варианте осуществления питательная композиция предназначена для применения в улучшении защиты барьера желудочно-кишечного тракта путем понижения регуляции рецептора ФНО-α на эпителиальных клетках. В более предпочтительном варианте осуществления питательная композиция предназначена для применения при предотвращении дисфункции барьера, при предотвращении проницаемости барьера, при защите структуры с плотным соединением клеток и/или в защите целостности эпителиальной выстилки кишечника путем понижения регуляции рецептора ФНО-α на эпителиальных клетках.

В другом конкретном варианте осуществления изобретения вышеупомянутые улучшения достигаются за счет увеличения выработки кинуреновой кислоты микробиотой младенца или ребенка младшего возраста, потребляющего питательную композицию. В предпочтительном варианте осуществления питательная композиция предназначена для применения при улучшении репарации барьера желудочно-кишечного тракта путем увеличения выработки кинуреновой кислоты микробиотой младенца или ребенка младшего возраста, потребляющего питательную композицию. В более предпочтительном варианте осуществления питательная композиция предназначена для применения при восстановлении целостности барьера желудочно-кишечного тракта, например, при восстановлении нарушенного барьера, снижении проницаемости после воспалительной провокации слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта и/или при восстановлении слизистой оболочки за счет увеличения выработки кинуреновой кислоты микробиотой младенца или ребенка младшего возраста, потребляющего питательную композицию.

В другом конкретном варианте осуществления изобретения вышеупомянутые улучшения достигаются путем увеличения выработки кинуреновой кислоты микробиотой ребенка в возрасте от трех лет до менее восьми лет, потребляющего питательную композицию. В предпочтительном варианте осуществления питательная композиция в форме молочной смеси для детей от 1 до 3 лет предназначена для применения при улучшении репарации барьера желудочно-кишечного тракта путем увеличения выработки кинуреновой кислоты микробиотой ребенка, потребляющего питательную композицию. В более предпочтительном варианте осуществления питательная композиция в форме молочной смеси для детей от 1 до 3 лет предназначена для применения при восстановлении целостности барьера желудочно-кишечного тракта, например, при восстановлении нарушенного барьера, при снижении проницаемости после воспалительной провокации слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта и/или при восстановлении слизистой оболочки путем увеличения выработки кинуреновой кислоты микробиотой ребенка, потребляющего питательную композицию в форме молочной смеси для детей от 1 до 3 лет.

Вышеописанные эффекты/преимущества предпочтительно достигаются в тонкой кишке.

В еще одном варианте осуществления питательная композиция подобрана по составу для введения младенцу. В другом варианте осуществления указанный младенец выбран из группы, состоящей из преждевременно родившихся, маленьких для своего гестационного возраста и детей с низким весом при рождении, предпочтительно младенец является преждевременно родившимся. Питательные композиции в соответствии с изобретением считаются особенно полезными для этих типов младенцев, поскольку описанные полезные эффекты более важны для этих младенцев, чем для «нормальных» младенцев, поскольку барьер является менее зрелым и более проницаемым по сравнению со здоровым доношенным младенцем.

В некоторых вариантах осуществления 2’FL может присутствовать в количестве 0,005–5 г/л композиции, например 0,01–3 г/л, или 0,02–2 г/л, или 0,1–2,5 г/л, или 0,15–2 г/л, или 0,25–1,9 г/л, или 0,75-1,65 г/л композиции. В конкретном варианте осуществления 2’FL присутствует в количестве 1 г/л композиции. В другом конкретном варианте осуществления 2’FL присутствует в количестве 0,25 или 0,26 г/л композиции. В одном варианте осуществления 2’FL присутствует в количестве более 0,1 г/л и необязательно менее 1 г/л, или более 0,2 и менее 0,8 г/л. В одном варианте осуществления 2’FL присутствует в количестве по меньшей мере 0,1 г/л, по меньшей мере 0,25, по меньшей мере 0,26, по меньшей мере 0,5, по меньшей мере 0,7, по меньшей мере 0,8, по меньшей мере 1, по меньшей мере 1,25, по меньшей мере 1,5 или по меньшей мере 2 г/л.

2’FL может присутствовать в питательной композиции в общем количестве 0,004–3,8 г/100 г композиции в расчете на массу сухого вещества. 2’FL может присутствовать в количестве 0,008–2,3 г/100 г композиции, например 0,015–1,5 г/100 г, или 0,08–1,9 г/100 г, или 0,12–1,5 г/100 г, или 0,15–1,5 г/100 г, или 0,19–1,5 г/100 г композиции. В конкретном варианте осуществления 2’FL присутствует в количестве 0,075 или 0,78 г/100 г композиции. В другом конкретном варианте осуществления 2’FL присутствует в количестве 0,2 г/100 г композиции. В конкретном варианте осуществления 2’FL присутствует в количестве по меньшей мере 0,01 г/100 г, по меньшей мере 0,02 г/100 г, по меньшей мере 0,05 г/100 г, по меньшей мере 0,1 г/100 г, по меньшей мере 0,2 г/100 г, по меньшей мере 0,25 г/100 г, по меньшей мере 0,4 г/100 г, по меньшей мере 0,5 г/100 г, по меньшей мере 0,75 г/100 г, по меньшей мере 0,9 г/100 г, по меньшей мере 1 г/100 г, по меньшей мере 1,5 г/100 г, по меньшей мере 2 г/100 г или по меньшей мере 3 г/100 г композиции.

В другом конкретном варианте осуществления 2’FL присутствует в количестве 5–500 г/л, 10–400 г/л, 40–300 г/л, 60–200 г/л, 80–180 г/л, 100–150 г/л или 110-130 г/л композиции. В конкретном варианте осуществления смесь ОГМ присутствует в количестве 120 г/л. Такие количества особенно достаточны, если питательная композиция находится в форме добавки или обогатителя.

Если добавка или обогатитель находится в форме порошка, 2’FL предпочтительно предусмотрена в питательной композиции по настоящему изобретению в таком количестве, которое составляет 0,05–5 г, 0,1–4,5 г, 0,15–4 г, 0,2–3,5 г, 0,25–3, 0,3–2,5, 0,35–2, 0,4–1,5 г, 0,45–1 г, 0,5–0,75 г, например 0,6 г, на порцию.

В конкретном варианте осуществления 2’FL содержится в питательной композиции по настоящему изобретению в таком количестве, что нормальное потребление питательной композиции будет обеспечено для младенца или ребенка младшего возраста, соответственно ребенка, при потреблении суммарной суточной дозы 0,003–6,5 г, предпочтительно 0,006–3,9 г, например, 0,012–2,6 г, в сутки. Считается, что минимальное количество 2’FL необходимо для достижения измеримого желаемого эффекта.

Для недоношенных, с низким весом при рождении и маленьких для своего гестационного возраста младенцев суточная доза 2’FL предпочтительно составляет от 0,05 до 1 г/кг массы тела в сутки, предпочтительно 0,06–0,9 г, или 0,07–0,8 г, или 0,08–0,7 г, или 0,09–0,6 г, или 0,1–0,5 г, или 0,2–0,4 г, наиболее предпочтительно 0,34 г на кг массы тела в сутки.

В одном варианте осуществления композиция дополнительно содержит один или более дополнительных ОГМ или один или более их предшественников.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения 2’FL комбинируют с 6-SL и LNT. Без ограничений какой-либо теорией, в таком варианте осуществления 2’-FL отвечает за активацию рецептора GPR35 посредством повышенной выработки кинуреновой кислоты микробиотой младенца или детей младшего возраста. В таком варианте осуществления 6SL и LNT также считаются ответственными за активацию GPR35, как описано в международной заявке на патент WO 2019/121929 (одного и того же заявителя).

В одном варианте осуществления изобретения LNT присутствует в питательной композиции или молочной смеси для детей от 1 до 3 лет в количестве 0,005–3 г/л композиции. В некоторых вариантах осуществления LNT может присутствовать в количестве 0,01–1,5 г/л композиции, например 0,04–1,2 г/л, или 0,05–1 г/л, или 0,09–0,8 г/л композиции. В конкретном варианте осуществления LNT присутствует в количестве 0,5 г/л композиции. В другом конкретном варианте осуществления LNT присутствует в количестве 0,1 г/л композиции.

LNT может присутствовать в питательной композиции или молочной смеси для детей от 1 до 3 лет в количестве 0,004–2,3 г/100 г композиции в расчете на массу сухого вещества, LNT может присутствовать в количестве 0,008–1,2 г/100 г композиции, например 0,03–0,9 г/100 г, или 0,04–0,8 г/100 г, или 0,07–0,6 г/100 г композиции. В конкретном варианте осуществления LNT присутствует в количестве 0,38 г/100 г композиции. В другом конкретном варианте осуществления LNT присутствует в количестве 0,08 г/100 г композиции.

LNT можно синтезировать химическим путем с помощью ферментативного переноса сахаридных звеньев с донорных фрагментов на акцепторные фрагменты с использованием гликозилтрансфераз, как описано, например, в патенте США № 5,288,637 и WO 96/10086.

В другом варианте осуществления изобретения питательная композиция или молочная смесь для детей от 1 до 3 лет может содержать 0,005–5 г/л 6’SL, или 0,008–2,5 г/л, или 0,01–1 г/л, или 0,03–0,7 г/л, например, 0,04 или 0,5 г/л.

Питательная композиция или молочная смесь для детей от 1 до 3 лет в соответствии с изобретением может содержать 0,004–3,8 г 6’SL на 100 г композиции в расчете на массу сухого вещества, например 0,006–1,9 г, или 0,008–0,8 г, или 0,023–0,5 г, или 0,031–0,4 г 6’SL на 100 г композиции в расчете на массу сухого вещества, например 0,18 г или 0,04 г на 100 г композиции в расчете на массу сухого вещества.

6’SL может быть выделена из природного источника, такого как молоко животных, методами хроматографии или фильтрации. В альтернативном варианте осуществления ее можно получать с помощью биотехнологических средств с использованием специфических сиалилтрансфераз или сиалидаз, нейраминидаз либо методом ферментации на основе ферментов (рекомбинантных или природных ферментов), путем химического синтеза, либо методом микробиологической ферментации. В последнем случае микроорганизмы могут экспрессировать свои природные ферменты и субстраты, или возможно создание микроорганизмов, вырабатывающих соответствующие субстраты и ферменты. Можно применять культуры из микроорганизмов одного вида или смешанные культуры. Образование 6’SL можно инициировать акцепторными субстратами, начиная с любой степени полимеризации (DP) от DP = 1 и далее. В альтернативном варианте осуществления 6’SL можно получать путем химического синтеза из лактозы и свободной N’-ацетилнейраминовой кислоты (сиаловой кислоты).

В конкретном варианте осуществления 6’SL и LNT, включенные в питательную композицию или молочную смесь для детей от 1 до 3 лет в соответствии с изобретением, как правило, присутствуют в соотношении 6’SL:LNT от 3:1 до 1:3, например, от 2:1 до 1:2 или от 2:1 до 1:1. В особенно преимущественном варианте осуществления такое соотношение составляет 2 : 1 или около 2 : 1, предпочтительно такое соотношение составляет 1 : 1 или около 1 : 1.

В конкретном аспекте изобретения питательная композиция или молочная смесь для детей от 1 до 3 лет содержит 6’SL и LNT, причем:

- 6’SL присутствует в количестве 0,005–5 г/л композиции и/или в количестве 0,004–3,8 г/100 г композиции в расчете на массу сухого вещества; и/или

- LNT присутствует в количестве 0,005–3 г/л композиции и/или в количестве 0,004–2,3 г/100 г композиции в расчете на массу сухого вещества.

- 6’SL присутствует в количестве 0,008–2,5 г/л композиции и/или в количестве 0,006–1,9 г/100 г композиции в расчете на массу сухого вещества; и/или

- LNT присутствует в количестве 0,01–1,5 г/л композиции и/или в количестве 0,008–1,2 г/100 г композиции в расчете на массу сухого вещества.

В другом конкретном варианте осуществления питательная композиция или молочная смесь для детей от 1 до 3 лет настоящего изобретения содержит 6’SL и LNT, причем:

- 6’SL присутствует в количестве 0,01–1 г/л композиции и/или в количестве 0,008–0,8 г/100 г композиции в расчете на массу сухого вещества; и/или

- LNT присутствует в количестве 0,04–1,2 г/л композиции и/или в количестве 0,03–0,9 г/100 г композиции в расчете на массу сухого вещества.

- 6’SL присутствует в количестве 0,03–0,7 г/л композиции и/или в общем количестве 0,023–0,5 г/100 г композиции в расчете на массу сухого вещества; и/или

- LNT присутствует в количестве 0,05–1 г/л композиции и/или в количестве 0,04–0,8 г/100 г композиции в расчете на массу сухого вещества.

- 6’SL присутствует в количестве 0,04–0,5 г/л композиции и/или в количестве 0,031–0,4 г/100 г композиции в расчете на массу сухого вещества; и/или

- LNT присутствует в количестве 0,09–0,8 г/л композиции и/или в количестве 0,07–0,6 г/100 г композиции в расчете на массу сухого вещества.

В конкретном варианте осуществления питательная композиция или молочная смесь для детей от 1 до 3 лет в соответствии с изобретением содержит 6’SL и LNT, причем:

- 6’SL присутствует в количестве 0,24 или 0,05 г/л композиции и/или в количестве 0,18 или 0,04 г/100 г композиции в расчете на массу сухого вещества; и/или

- LNT присутствует в количестве 0,5 г/л или 0,1 г/л композиции и/или в количестве 0,38 г/100 г композиции или 0,08 г/100 г композиции в расчете на массу сухого вещества.

В конкретном варианте осуществления 6’SL содержится в питательной композиции или молочной смеси для детей от 1 до 3 лет настоящего изобретения в таком количестве, что нормальное потребление питательной композиции или молочной смеси для детей от 1 до 3 лет будет обеспечено для младенца или ребенка младшего возраста, соответственно ребенка, при потреблении суммарной суточной дозы 0,003–6,5 г, предпочтительно 0,005–3,3 г, или 0,006–1,3 г, или 0,02–0,9 г, например 0,024–0,7 г, в сутки.

В конкретном варианте осуществления LNT содержится в питательной композиции или молочной смеси для детей от 1 до 3 лет настоящего изобретения в таком количестве, что нормальное потребление питательной композиции или молочной смеси для детей от 1 до 3 лет будет обеспечено для младенца или ребенка младшего возраста, соответственно ребенка, при потреблении суммарной суточной дозы 0,003–3,9 г, предпочтительно 0,006–2 г, или 0,02–1,6 г, или 0,03–1,3 г, например 0,05–1 г, в сутки.

В одном варианте осуществления композиция по изобретению содержит по меньшей мере один N-ацетилированный олигосахарид. N-ацетилированный олигосахарид предпочтительно представляет собой LnNT. Без ограничений, накладываемых теорией, авторы изобретения обнаружили, что LnNT развивает наилучшие взаимодействия с кишечной флорой и усиливает описанный эффект.

В одном варианте осуществления N-ацетилированный олигосахарид представляет собой лакто-N-неотетраозу (LNnT), лакто-N-тетраозу (LNT), пара-лакто-N-неогексаозу (пара-LNnH), дисиалиллакто-N-тетраозу (DSLNT) или любую их комбинацию, предпочтительно лакто-N-неотетраозу (LNnT) и/или лакто-N-тетраозу (LNT).

В одном варианте осуществления N-ацетилированный(-ые) олигосахарид(-ы) присутствует(-ют) в общем количестве 0,025–1,5 г/л композиции, предпочтительно по меньшей мере 0,1 г/л или по меньшей мере 0,25 г/л, и/или в общем количестве 0,003–0,23 г/100 г, предпочтительно по меньшей мере 0,015 г/100 г или по меньшей мере 0,03 г/100 г композиции в расчете на массу сухого вещества.

N-ацетилированный (-ые) олигосахарид (-ы) можно синтезировать химическим путем с помощью ферментативного переноса сахаридных звеньев с донорных фрагментов на акцепторные фрагменты с использованием гликозилтрансфераз, как описано, например, в патенте США № 5,288,637 и WO 96/10086. В альтернативном варианте осуществления LNT и LNnT можно получать путем химического превращения кетогексоз (например, фруктозы), либо свободных, либо связанных с олигосахаридом (например, лактулозой), в N-ацетилгексозамин или N-ацетилгексозамин-содержащий олигосахарид, как описано в Wrodnigg, T.M.; Stutz, A.E. (1999) Angew. Chem. Int. Ed. 38:827–828. Полученный таким образом N-ацетиллактозамин можно затем переносить на лактозу в качестве акцепторного фрагмента.

В особенно благоприятном варианте осуществления настоящего изобретения N-ацетилированный (-ые) олигосахарид (-ы) присутствует (-ют) в питательной композиции в некоторых конкретных количествах. Термин «количество», если не указано иное, относится к общему количеству каждого из таких двух компонентов в питательной композиции. Поэтому он не относится к индивидуальному количеству, кроме случаев, когда речь идет о единственном типе таких компонентов (в этом случае как общее, так и индивидуальное количество будут одинаковыми). То же самое относится ко всем соединениям/ингредиентам изобретения. В качестве иллюстрирующего примера, если в композиции используется только один N-ацетилированный олигосахарид (то есть только один его тип) (например, LNnT), его индивидуальное количество (а потому и суммарное количество N-ацетилированных олигосахаридов) будет находиться в диапазоне 0,75–1,65 г/л. В случае нескольких N-ацетилированных олигосахаридов (то есть нескольких типов) их индивидуальное количество будет меньше (например, в случае 2 различных типов N-ацетилированных олигосахаридов, например LNnT + LNT, каждый из них может присутствовать в индивидуальном количестве 0,5 г/л), но суммарное количество N-ацетилированных олигосахаридов будет находиться в диапазоне 0,75–1,65 г/л.

В конкретном варианте осуществления N-ацетилированный олигосахарид содержится в питательной композиции настоящего изобретения в таком количестве, что нормальное потребление питательной композиции будет обеспечено для младенца или ребенка младшего возраста, соответственно ребенка, при потреблении суммарной суточной дозы 0,003–3,9 г, предпочтительно 0,006–3,25 г, или 0,03–1,95 г, или 0,03–1,3 г, или 0,03–1 г, например 0,05–1 г, в сутки.

Для недоношенных, с низким весом при рождении и маленьких для своего гестационного возраста младенцев суточная доза составляет предпочтительно от 0,005 до 0,1 г/кг массы тела в сутки, предпочтительно 0,006–0,09 г, или 0,007–0,08 г, или 0,008–0,07 г, или 0,009–0,06 г, или 0,01–0,05 г, или 0,02–0,04 г, наиболее предпочтительно 0,034 г на кг массы тела в сутки.

При наличии 2’FL и N-ацетилированных олигосахаридов 2’FL и N-ацетилированный(-ые) олигосахарид(-ы), содержащиеся в питательной композиции по изобретению, как правило, присутствуют в соотношении N-ацетилированный(-ые) олигосахарид(-ы):2’FL от 1:20 до 2:1, предпочтительно от 1:15 до 1:1, наиболее предпочтительно от 1:10 до 1:2. В особенно преимущественном варианте осуществления такое соотношение равно (или приблизительно равно) 1:2, 1:5 или 1:10.

Смеси 2’FL и LNnT считаются особенно преимущественными, поскольку данные указывают на то, что такие смеси обеспечивают значительную пользу уже после 48 часов лечения (и впоследствии эффект сохраняется), тогда как 2’FL без LNnT оказывает большее действие в среднесрочной перспективе. Таким образом, в одном варианте осуществления применения изобретения предназначены для быстрого улучшения барьера желудочно-кишечного тракта, например, в пределах 72 часов, предпочтительно в пределах 48 часов или, например, в пределах 24 часов.

В другом варианте осуществления питательная композиция в соответствии с изобретением может содержать сиалилированный (-е) олигосахарид (-ы). В ней может присутствовать один или несколько сиалилированных олигосахаридов. Сиалилированный(-ые) олигосахарид(-ы) может(-гут) быть выбран(-ы) из группы, включающей 3'-сиалиллактозу (3’SL), 6'-сиалиллактозу (6’SL) и любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления изобретения композиция содержит 3’SL и 6’SL. В некоторых конкретных вариантах осуществления соотношение 3'-сиалиллактозы (3’SL) и 6'-сиалиллактозы (6’SL) может находиться в диапазоне от 5:1 до 1:10, или от 3:1 до 1:1, или от 1:1 до 1:10. В некоторых конкретных вариантах осуществления сиалилированный олигосахарид композиции представляет собой 6'-сиалиллактозу (6’SL).

Сиалилированный (-ые) олигосахарид (-ы) может (-гут) быть выделен (-ы) из природного источника, такого как молоко животных, методами хроматографии или фильтрации. В альтернативном варианте осуществления их можно получать с помощью биотехнологических средств с применением специфических сиалилтрансфераз или сиалилдаз, нейраминидаз либо методом ферментации на основе ферментов (рекомбинантных или природных ферментов), путем химического синтеза либо методом микробиологической ферментации. В последнем случае микроорганизмы могут экспрессировать свои природные ферменты и субстраты, или возможно создание микроорганизмов, вырабатывающих соответствующие субстраты и ферменты. Можно применять культуры из микроорганизмов одного вида или смешанные культуры. Образование сиалилолигосахаридов можно инициировать акцепторными субстратами, начиная с любой степени полимеризации (DP) от DP = 1 и далее. В альтернативном варианте осуществления сиалиллактозы можно получать путем химического синтеза из лактозы и свободной N’-ацетилнейраминовой кислоты (сиаловой кислоты). Сиалиллактозы также доступны в продаже, например, производства Kyowa Hakko Kogyo, Япония.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения питательная композиция может включать 0,005–5 г/л сиалилированных олигосахаридов или 0,008–2,5 г/л, или 0,01–1 г/л, или 0,02–0,7 г/л, например 0,03–0,5 г/л.

Питательная композиция в соответствии с изобретением может включать 0,004–3,8 г сиалилированных олигосахаридов на 100 г композиции в расчете на массу сухого вещества, например 0,006–1,9 г или 0,008–0,8 г, или 0,015–0,5 г, например 0,023–0,4 сиалилированных олигосахаридов на 100 г композиции в расчете на массу сухого вещества.

В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения питательная композиция содержит сиалилированный (-ые) олигосахарид (-ы) в количестве менее 0,1 г/100 г композиции в расчете на массу сухого вещества.

В конкретном варианте осуществления сиалилированный олигосахарид содержится в питательной композиции настоящего изобретения в таком количестве, что нормальное потребление питательной композиции или будет обеспечено для младенца или ребенка младшего возраста, соответственно ребенка, при потреблении суммарной суточной дозы 0,003–6,5 г, предпочтительно 0,005–3,3 г, или 0,006–1,3 г, или 0,01–0,9 г, например 0,018–0,65 г, в сутки.

В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения питательная композиция не содержит никаких (-ого) сиалилированных (-ого) олигосахаридов (-а).

Питательная композиция в соответствии с настоящим изобретением может также необязательно содержать по меньшей мере один предшественник олигосахарида. В нем может присутствовать один или несколько прекурсоров олигосахарида. Например, прекурсором олигосахарида грудного молока является сиаловая кислота, фукоза или их смесь. В некоторых конкретных вариантах осуществления композиция содержит сиаловую кислоту.

В конкретных примерах питательная композиция содержит от 0 до 3 г/л предшественника (-ов) олигосахарида или от 0 до 2 г/л, или от 0 до 1 г/л, или от 0 до 0,7 г/л, или от 0 до 0,5 г/л, или от 0 до 0,3 г/л, или от 0 до 0,2 г/л предшественника (-ов) олигосахарида. Композиция в соответствии с изобретением может включать от 0 до 2,1 г предшественника (-ов) олигосахарида на 100 г композиции в расчете на массу сухого вещества, например от 0 до 1,5 г, или от 0 до 0,8 г, или от 0 до 0,15 г предшественника (-ов) олигосахарида на 100 г композиции в расчете на массу сухого вещества.

Питательная композиция по настоящему изобретению может содержать по меньшей мере один дополнительный фукозилированный олигосахарид в дополнение к 2’FL. В ней может присутствовать один или несколько типов фукозилированного (-ых) олигосахарида (-ов). Фукозилированный(-ые) олигосахарид(-ы) может(-гут) быть выбран(-ы) из перечня, включающего 3’-фукозиллактозу, дифукозиллактозу, лакто-N-фукопентаозу (например, лакто-N-фукопентаозу I, лакто-N-фукопентаозу II, лакто-N-фукопентаозу III, лакто-N-фукопентаозу V), лакто-N-фукогексаозу, лакто-N-дифукогексаозу I, фукозиллакто-N-гексаозу, фукозиллакто-N-неогексаозу (например, фукозиллакто-N-неогексаозу I, фукозиллакто-N-неогексаозу II), дифукозиллакто-N-гексаозу I, дифуко-лакто-N-неогексаозу, дифукозиллакто-N-неогексаозу I, дифукозиллакто-N-неогексаозу II, фукозил-пара-лакто-N-гексаозу, три-фуко-пара-лакто-N-гексаозу I и любую их комбинацию.

В некоторых конкретных вариантах осуществления дополнительный фукозилированный олигосахарид содержит 2’-фукозил-эпитоп. Он может быть, например, выбран из перечня, включающего дифукозиллактозу, лакто-N-фукопентаозу, лакто-N-фукогексаозу, лакто-N-дифукогексаозу, фукозиллакто-N-гексаозу, фукозиллакто-N-неогексаозу, дифукозиллакто-N-гексаозу, дифуко-лакто-N-неогексаозу, дифукозиллакто-N-неогексаозу, фукозил-пара-лакто-N-гексаозу и любую их комбинацию.

В конкретном варианте осуществления не используется никакой другой тип фукозилированного олигосахарида, кроме 2’-фукозиллактозы, т.е. питательная композиция изобретения в качестве фукозилированного олигосахарида содержит только 2’-фукозиллактозу.

Фукозилированный (-ые) олигосахарид (-ы) может (-гут) быть выделен (-ы) из природного источника, такого как молоко животных, методами хроматографии или фильтрации. В альтернативном варианте осуществления его (их) можно получать с помощью биотехнологических средств с использованием специфических фукозилтрансфераз и/или фукозидаз, либо посредством применения метода ферментации на основе ферментов (рекомбинантных или природных ферментов), либо методом микробиологической ферментации. В последнем случае или микроорганизмы могут экспрессировать свои природные ферменты и субстраты, или возможно создание микроорганизмов, вырабатывающих соответствующие субстраты и ферменты. Можно применять культуры из микроорганизмов одного вида и/или смешанные культуры. Образование фукозилированного олигосахарида может быть инициировано акцепторными субстратами, начиная с любой степени полимеризации (DP) от DP = 1 и далее. В альтернативном варианте осуществления фукозилированные олигосахариды можно получать из лактозы и свободной фукозы с помощью химического синтеза. Фукозилированные олигосахариды также доступны, например, от компании Kyowa, Hakko, Kogyo, Япония.

В некоторых вариантах осуществления фукозилированный(-ые) олигосахарид(-ы) (включая 2’FL) может(-гут) присутствовать в общем количестве 0,005–5 г/л композиции, например, 0,01–3 г/л, или 0,02–2 г/л, или 0,1–2,5 г/л, или 0,15–2 г/л, или 0,25–1,9 г/л, или 0,75–1,65 г/л композиции. В конкретном варианте осуществления фукозилированный (-ые) олигосахарид (-ы) присутствует (-ют) в общем количестве 1 г/л композиции. В другом варианте осуществления фукозилированный (-ые) олигосахарид (-ы) присутствует (-ют) в общем количестве 0,25 или 0,26 г/л композиции. В одном варианте осуществления фукозилированный (-ые) олигосахарид (-ы) присутствует (-ют) в общем количестве более 0,1 г/л и необязательно менее 1 г/л, или более 0,2 и менее 0,8 г/л. В одном варианте осуществления фукозилированный (-ые) олигосахарид (-ы) присутствует (-ют) в общем количестве по меньшей мере 0,1 г/л, по меньшей мере 0,25, по меньшей мере 0,26, по меньшей мере 0,5, по меньшей мере 0,7, по меньшей мере 0,8, по меньшей мере 1, по меньшей мере 1,25, по меньшей мере 1,5 или по меньшей мере 2 г/л.

Фукозилированный (-ые) олигосахарид (-ы) может (-гут) присутствовать в питательной композиции в общем количестве 0,004–3,8 г/100 г композиции в расчете на массу сухого вещества. Фукозилированный (-ые) олигосахарид (-ы) может (-гут) присутствовать в общем количестве 0,008–2,3 г/100 г композиции, например 0,015–1,5 г/100 г, или 0,08–1,9 г/100 г, или 0,12–1,5 г/100 г, или 0,15–1,5 г/100 г, или 0,19–1,5 г/100 г композиции. В конкретном варианте осуществления фукозилированный (-ые) олигосахарид (-ы) присутствует (-ют) в суммарном количестве 0,075 или 0,78 г/100 г композиции. В другом конкретном варианте осуществления фукозилированный (-ые) олигосахарид (-ы) присутствует (-ют) в общем количестве 0,2 г/100 г композиции. В конкретном варианте осуществления фукозилированный (-ые) олигосахарид (-ы) присутствует (-ют) в общем количестве по меньшей мере 0,01 г/100 г, по меньшей мере 0,02 г/100 г, по меньшей мере 0,05 г/100 г, по меньшей мере 0,1 г/100 г, по меньшей мере 0,2 г/100 г, по меньшей мере 0,25 г/100 г, по меньшей мере 0,4 г/100 г, по меньшей мере 0,5 г/100 г, по меньшей мере 0,75 г/100 г, по меньшей мере 0,9 г/100 г, по меньшей мере 1 г/100 г, по меньшей мере 1,5 г/100 г, по меньшей мере 2 г/100 г или по меньшей мере 3 г/100 г композиции.

В конкретном варианте осуществления фукозилированный олигосахарид содержится в питательной композиции настоящего изобретения в таком количестве, что нормальное потребление питательной композиции будет обеспечено для младенца или ребенка младшего возраста, соответственно ребенка, при потреблении суммарной суточной дозы 0,003–6,5 г, предпочтительно 0,006–3,9 г, например 0,012–2,6 г, в сутки. Считается, что минимальное количество фукозилированного олигосахарида необходимо для достижения измеримого желаемого эффекта.

Для недоношенных, с низким весом при рождении и маленьких для своего гестационного возраста младенцев суточная доза фукозилированных олигосахаридов предпочтительно составляет от 0,05 до 1 г/кг массы тела в сутки, предпочтительно 0,06–0,9 г, или 0,07–0,8 г, или 0,08–0,7 г, или 0,09–0,6 г, или 0,1–0,5 г, или 0,2–0,4 г, наиболее предпочтительно 0,34 г на кг массы тела в сутки.

В еще одном варианте осуществления композиция дополнительно содержит один или более ОГМ, выбранных из группы, состоящей из LNnT, 2’FL, diFL и 3’SL; например, содержит два или более ОГМ, выбранных из группы, состоящей из LNnT, 2’FL, diFL и 3’S, например, три или более ОГМ, выбранных из группы, состоящей из LNnT, diFL, LNT, 6’SL и 3’SL, например, дополнительно содержит все из LNnT, diFL, LNT, 6’SL и 3’SL. Как упомянуто в примере 3, смесь 2’FL, LNnT, 3’SL и DiFL сохраняет лучший эффект 2’FL.

В конкретном варианте осуществления питательная композиция по настоящему изобретению содержит смесь олигосахаридов, состоящую из 2’FL, 6’SL, LNT, DiFL, LNnT и 3’SL.

В другом конкретном варианте осуществления питательная композиция по настоящему изобретению содержит смесь олигосахаридов, состоящую из 2’FL, 6’SL, LNT, DiFL, LNnT и 3’SL.

В другом конкретном варианте осуществления питательная композиция по настоящему изобретению содержит смесь олигосахаридов, состоящую из 2’FL, 6’SL, LNT, DiFL и 3’SL.

В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения питательная композиция содержит 2’FL и не содержит никакого другого олигосахарида. В отдельном варианте осуществления настоящего изобретения питательная композиция содержит 2’FL и другой олигосахарид, предпочтительно олигосахарид грудного молока, более предпочтительно лакто-N-неотетраозу (LNnT) или LNT (лакто-N-тетраозу).

В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения питательная композиция содержит 2’FL и LNnT.

В конкретном варианте осуществления питательная композиция по настоящему изобретению содержит смесь олигосахаридов, состоящую из 2’FL и LNnT.

Так же может быть предпочтительно, что композиция содержит только один ОГМ. Таким образом, в одном варианте осуществления ОГМ или их предшественники, отличные от 2’FL, отсутствуют в питательной композиции или присутствуют в общем количестве менее 0,1% (масс./масс.), предпочтительно, например, менее 0,01% (масс./масс.) или более предпочтительно, например, менее 0,001%. Как описано в примере 3, композиция, содержащая 2’FL в качестве единственного ОГМ, демонстрировала наибольший эффект.

В родственном варианте осуществления ОГМ, отличные от 2’FL и LNnT, отсутствуют в питательной композиции или присутствуют в общем количестве менее 0,1% (масс./масс.), предпочтительно, например, менее 0,01% (масс./масс.) или более предпочтительно, например, менее 0,001%.

Питательная композиция или молочная смесь для детей от 1 до 3 лет в соответствии с настоящим изобретением может также содержать другие типы олигосахарида (-ов) (т.е. отличающийся (-иеся) от указанных выше олигосахаридов грудного молока) и/или по меньшей мере волокно (-а), и/или по меньшей мере его (их) предшественник (-и). Другой олигосахарид, и/или волокно, и/или их предшественник могут быть выбраны из перечня, включающего галактоолигосахариды (GOS), фруктоолигосахариды (FOS), инулин, ксилоолигосахариды (XOS), полидекстрозу и любую их комбинацию. Они могут присутствовать в количестве от 0 до 10 мас.% композиции. В конкретном варианте осуществления питательная композиция или молочная смесь для детей от 1 до 3 лет может также включать по меньшей мере один олигосахарид коровьего молока (BMO).

Подходящие доступные в продаже продукты, которые можно применять для получения питательных композиций или молочной смеси для детей от 1 до 3 лет в соответствии с изобретением, включают в себя комбинации FOS с инулином, такие как продукт, продаваемый компанией BENEO под товарным знаком Orafti, или полидекстрозу, продаваемую компанией Tate & Lyle под товарным знаком STA-LITE®.

Питательная композиция или молочная смесь для детей от 1 до 3 лет в соответствии с настоящим изобретением может также необязательно включать по меньшей мере один предшественник олигосахарида. В нем может присутствовать один или несколько прекурсоров олигосахарида. Например, прекурсором олигосахарида грудного молока является сиаловая кислота, фукоза или их смесь. В некоторых конкретных вариантах осуществления композиция содержит сиаловую кислоту.

В конкретных примерах питательная композиция или молочная смесь для детей от 1 до 3 лет содержит от 0 до 3 г/л предшественника (-ов) олигосахарида, или от 0 до 2 г/л, или от 0 до 1 г/л, или от 0 до 0,7 г/л, или от 0 до 0,5 г/л, или от 0 до 0,3 г/л, или от 0 до 0,2 г/л предшественника (-ов) олигосахарида. Композиция в соответствии с изобретением может включать от 0 до 2,1 г предшественника (-ов) олигосахарида на 100 г композиции в расчете на массу сухого вещества, например от 0 до 1,5 г, или от 0 до 0,8 г, или от 0 до 0,15 г предшественника (-ов) олигосахарида на 100 г композиции в расчете на массу сухого вещества.

Питательная композиция или молочная смесь для детей от 1 до 3 лет настоящего изобретения может дополнительно включать по меньшей мере один пробиотик (или пробиотический штамм), такой как пробиотический бактериальный штамм.

Чаще всего применяют пробиотические микроорганизмы, которые главным образом представляют собой бактерии и дрожжи следующих родов: Lactobacillus spp., Streptococcus spp., Enterococcus spp., Bifidobacterium spp. и Saccharomyces spp.

В некоторых конкретных вариантах осуществления пробиотик представляет собой пробиотический бактериальный штамм. В некоторых конкретных вариантах осуществления он представляет собой, в частности, штаммы Bifidobacteria и/или Lactobacilli.

Подходящие пробиотические бактериальные штаммы включают Lactobacillus rhamnosus ATCC 53103 производства Valio Oy, Финляндия, под товарным знаком LGG; Lactobacillus rhamnosus CGMCC 1.3724, Lactobacillus paracasei CNCM I-2116, Lactobacillus johnsonii CNCM I-1225, Streptococcus salivarius DSM 13084, продаваемые BLIS Technologies Limited, Новая Зеландия, под названием KI2; Bifidobacterium lactis CNCM 1-3446, продаваемый в числе прочих Christian Hansen, Дания, под товарным знаком Bb 12; Bifidobacterium longum ATCC BAA-999, продаваемый компанией Morinaga Milk Industry Co. Ltd., Япония, под товарным знаком BB536; Bifidobacterium breve, продаваемый Danisco под товарным знаком Bb-03; Bifidobacterium breve, продаваемый Morinaga под товарным знаком M-16V; Bifidobacterium infantis, продаваемый Procter & GambIe Co. под товарным знаком Bifantis; и Bifidobacterium breve, продаваемый Institut Rosell (Lallemand) под товарным знаком R0070.

Питательная композиция или молочная смесь для детей от 1 до 3 лет в соответствии с изобретением может включать от 10e3 до 10e12 КОЕ пробиотического штамма, более предпочтительно от 10e7 до 10e12 КОЕ, например от 10e8 до 10e10 КОЕ, пробиотического штамма на грамм композиции в расчете на массу сухого вещества.

В одном варианте осуществления пробиотики являются жизнеспособными. В другом варианте осуществления пробиотики являются неразмножающимися или инактивированными. В некоторых других вариантах осуществления можно использовать как жизнеспособные пробиотики, так и инактивированные пробиотики. Также можно добавлять пробиотические компоненты и метаболиты.

В одном варианте осуществления питательная композиция по изобретению является полной питательной композицией (удовлетворяющей все или большинство потребностей субъекта в питании). В другом варианте осуществления питательная композиция представляет собой добавку или обогатитель, предназначенные, например, для дополнения человеческого грудного молока или для дополнения детской смеси или смеси для прикармливаемых детей/смеси последующего уровня.

В некоторых конкретных вариантах осуществления композиция изобретения представляет собой детскую смесь, обогатитель или добавку, которые могут предназначаться для первых 4, 6 или 12 месяцев жизни. В предпочтительном варианте осуществления питательная композиция изобретения представляет собой детскую смесь. Действительно, считается, что вмешательство в питание в соответствии с изобретением может быть наиболее эффективным при воздействии на раннюю стадию жизни (например, в возрасте первых 1, 4, 6, 12 месяцев).

Питательная композиция в соответствии с изобретением может, например, представлять собой детскую смесь, начальную детскую смесь, смесь для прикармливаемых детей или смесь последующего уровня, молочную смесь для детей от 1 до 3 лет, детское питание, детскую композицию на зерновой основе, обогатитель, такой как обогатитель человеческого грудного молока, или добавку. В некоторых конкретных вариантах осуществления композиция изобретения представляет собой детскую смесь, обогатитель или добавку, которые могут предназначаться для первых 4 или 6 месяцев жизни. В предпочтительном варианте осуществления питательная композиция изобретения представляет собой детскую смесь.

В некоторых других вариантах осуществления питательная композиция настоящего изобретения представляет собой обогатитель. Обогатитель может представлять собой обогатитель грудного молока (например, обогатитель человеческого грудного молока) или обогатитель смеси, такой как обогатитель детской смеси или обогатитель смеси для прикармливаемых детей/смеси последующего уровня.

Если питательная композиция представляет собой добавку, она может быть обеспечена в форме стандартных доз. В таких случаях особенно полезно определить количество 2’FL и необязательно других олигосахаридов в отношении суточной дозы для введения младенцу или ребенку младшего возраста, как описано выше.

Если питательная композиция представляет собой добавку, она может содержать 2’-FL и никакое другое дополнительное питательное вещество, помимо вспомогательных веществ, необходимых для получения стабильной питательной композиции.

Питательная композиция настоящего изобретения может находиться в твердой (например, в форме порошка), жидкой или клейстеризованной форме.

В конкретном варианте осуществления питательная композиция представляет собой добавку в форме порошка и предложена в пакете-саше, в форме таблеток, капсул, пастилок или жидкости, например жидкости, предназначенной для выдачи в виде капель в грудное молоко, или в питательную композицию, или непосредственно в рот младенца или ребенка младшего возраста.

В другом варианте осуществления добавка может дополнительно содержать носитель, защитные гидроколлоиды (такие как камеди, белки, модифицированные крахмалы), связующие вещества, пленкообразующие агенты, инкапсулирующие агенты/материалы, материалы стенок/оболочек, соединения матриц, покрытия, эмульгаторы, поверхностно-активные вещества, солюбилизирующие агенты (масла, жиры, воски, лецитины и т.п.), адсорбенты, носители, наполнители, вспомогательные соединения, диспергирующие агенты, увлажняющие агенты, технологические добавки (растворители), антислеживающие агенты, маскирующие вкус агенты, утяжеляющие агенты, желирующие агенты и гелеобразующие агенты. Добавка также может содержать традиционные фармацевтические добавки и вспомогательные вещества, эксципиенты и разбавители, включая, без ограничений, воду, желатин любого происхождения, растительные камеди, лигнинсульфонат, тальк, сахара, крахмал, гуммиарабик, растительные масла, полиалкиленгликоли, ароматизирующие агенты, консерванты, стабилизаторы, эмульгирующие агенты, буферы, смазывающие вещества, красители, увлажняющие агенты, наполнители и т.п. Если добавка находится в форме порошка, она может включать носитель. Однако предпочтительно, чтобы носитель в добавке отсутствовал. Если добавка находится в форме сиропа, ОГМ предпочтительно растворяют или суспендируют в воде, подкисленной цитратом.

Дополнительно добавка может содержать витамины, минеральные микроэлементы и другие микроэлементы в соответствии с рекомендациями государственных органов, такими как рекомендуемые нормы потребления (RDA) США.

Питательная композиция настоящего изобретения может находиться в твердой (например, в форме порошка), жидкой или клейстеризованной форме. В конкретном варианте осуществления питательная композиция представляет собой добавку, содержащую 2’FL, причем добавка находится в порошковой форме и предложена в пакете-саше, предпочтительно в пакете-саше с 1–10 г смеси 2’FL на пакет-саше, или в форме сиропа, предпочтительно сиропа с общей концентрацией твердых веществ от 5 до 75 г/100 мл (от 5 до 75% (масс./об.)). Если добавка находится в форме порошка, она может включать носитель. Однако предпочтительно, чтобы носитель в добавке отсутствовал. Если добавка находится в форме сиропа, ОГМ предпочтительно растворяют или суспендируют в воде, подкисленной цитратом.

Питательная композиция или молочная смесь для детей от 1 до 3 лет в соответствии с изобретением обычно содержит источник белка. Белок может содержаться в количестве от 1,6 до 3 г на 100 ккал. В некоторых вариантах осуществления, в частности когда композиция предназначена для преждевременно родившихся младенцев, количество белка может составлять от 2,4 до 4 г/100 ккал или более 3,6 г/100 ккал. В некоторых других вариантах осуществления количество белка может быть ниже 2,0 г на 100 ккал, например от 1,8 до 2 г/100 ккал, или белок может содержаться в количестве ниже 1,8 г на 100 ккал.

Тип белка не считается критическим для настоящего изобретения при условии, что соблюдены минимальные требования по содержанию незаменимых аминокислот и обеспечен удовлетворительный рост. Таким образом, можно применять источники белка на основе молочной сыворотки, казеина и их смесей, а также источники белка на основе сои. Что касается сывороточных белков, источник белка может быть основан на кислой молочной сыворотке или сладкой молочной сыворотке или их смесях и может включать альфа-лактальбумин и бета-лактоглобулин в любых желаемых пропорциях.

В некоторых преимущественных вариантах осуществления в источнике белка преобладает молочная сыворотка (т.е. более 50% белков происходят из сывороточных белков, например, 60% или 70%).

Белки могут быть нативными или гидролизованными, либо они могут представлять собой смесь нативных и гидролизованных белков. Под термином «нативный» подразумевают, что основная часть белков является нативной, т.е. их молекулярная структура не изменена, например, не изменено по меньшей мере 80% белков, например, не изменено по меньшей мере 85% белков, предпочтительно не изменено по меньшей мере 90% белков, еще более предпочтительно не изменено по меньшей мере 95% белков, например, не изменено по меньшей мере 98% белков. В конкретном варианте осуществления не изменено 100% белков.

Термин «гидролизованный» в контексте настоящего изобретения означает белок, который был гидролизован или расщеплен на составляющие его аминокислоты. Белки могут быть полностью или частично гидролизованными. Может быть желательным вводить частично гидролизованные белки (степень гидролиза от 2 до 20%), например, младенцам или детям младшего возраста, предположительно подверженным риску развития аллергии на коровье молоко. При необходимости использования гидролизованных белков процесс гидролиза можно проводить по желанию и способом, известным в данной области. Например, гидролизаты сывороточного белка можно получать ферментативным гидролизом фракции молочной сыворотки в одну или более стадий. Если фракция молочной сыворотки, применяемая в качестве исходного материала, по существу, не содержит лактозы, то установлено, что в процессе гидролиза блокировка лизина белка проявляется в гораздо меньшей степени. Это позволяет снизить степень блокировки лизина с около 15 мас.% общего лизина до менее около 10 мас.% лизина; например до около 7 мас.% лизина, что значительно улучшает питательное качество источника белка.

В одном варианте осуществления изобретения гидролизовано по меньшей мере 70% белков, предпочтительно гидролизовано по меньшей мере 80% белков, например, гидролизовано по меньшей мере 85% белков, еще более предпочтительно гидролизовано по меньшей мере 90% белков, например, гидролизовано по меньшей мере 95% белков, в частности гидролизовано по меньшей мере 98% белков. В конкретном варианте осуществления гидролизовано 100% белков.

В одном конкретном варианте осуществления белки питательной композиции гидролизованы, полностью гидролизованы или частично гидролизованы. Степень гидролиза (DH) белка может составлять от 8 до 40, или от 20 до 60, или от 20 до 80, или более 10, 20, 40, 60, 80 или 90.

В альтернативном варианте осуществления белковый компонент может быть заменен смесью или искусственной аминокислотой, например, для недоношенных младенцев или младенцев с низким весом при рождении.

В конкретном варианте осуществления питательная композиция или молочная смесь для детей от 1 до 3 лет в соответствии с изобретением представляет собой гипоаллергенную композицию. В другом конкретном варианте осуществления композиция в соответствии с изобретением представляет собой гипоаллергенную питательную композицию или молочную смесь для детей от 1 до 3 лет.

Питательная композиция или молочная смесь для детей от 1 до 3 лет в соответствии с настоящим изобретением обычно содержит источник углеводов. Это особенно предпочтительно в том случае, когда питательная композиция изобретения представляет собой детскую смесь. В этом случае можно применять любой источник углеводов, обычно находящийся в детских смесях, такой как лактоза, сахароза, сахароза, мальтодекстрин, крахмал и их смеси, хотя одним из предпочтительных источников углеводов является лактоза.

Питательная композиция или молочная смесь для детей от 1 до 3 лет в соответствии с настоящим изобретением обычно содержит источник липидов. Это особенно важно, если питательная композиция настоящего изобретения представляет собой детскую смесь. В этом случае источником липидов может быть любой липид или жир, который подходит для применения в детских смесях. Некоторые подходящие источники жира включают пальмовое масло, структурированное триглицеридное масло, подсолнечное масло с высоким содержанием олеиновой кислоты и сафлоровое масло с высоким содержанием олеиновой кислоты, масло триглицерида средней цепи. Можно также добавлять незаменимые жирные кислоты — линолевую кислоту и α-линоленовую кислоту, а также небольшие количества масел, содержащих большие количества арахидоновой кислоты и докозагексаеновой кислоты в готовом виде, например, рыбьи жиры или микробные масла. Соотношение n-6 и n-3 жирных кислот в источнике жира может составлять от около 5 : 1 до около 15 : 1; например от около 8 : 1 до около 10 : 1.

Питательная композиция или молочная смесь для детей от 1 до 3 лет изобретения может также содержать все витамины и минеральные вещества, считающиеся обязательными в повседневном рационе питания, в значимых с точки зрения питания количествах. Для некоторых витаминов и минеральных веществ установлены минимальные требования. Примеры минеральных веществ, витаминов и других питательных веществ, которые необязательно присутствуют в композиции изобретения, включают витамин А, витамин В1, витамин В2, витамин В6, витамин В12, витамин Е, витамин К, витамин С, витамин D, фолиевую кислоту, инозит, ниацин, биотин, пантотеновую кислоту, холин, кальций, фосфор, йод, железо, магний, медь, цинк, марганец, хлор, калий, натрий, селен, хром, молибден, таурин и L-карнитин. Минеральные вещества обычно добавляют в форме солей. Присутствие и количества конкретных минеральных веществ и других витаминов будут варьироваться в зависимости от предполагаемой популяции.

Если это необходимо, питательная композиция или молочная смесь для детей от 1 до 3 лет изобретения может содержать эмульгаторы и стабилизаторы, такие как соя, лецитин, моно- и диглицериловые сложные эфиры лимонной кислоты и т.п.

Питательная композиция или молочная смесь для детей от 1 до 3 лет изобретения может также содержать другие вещества, которые могут оказывать благоприятное воздействие, такие как лактоферрин, нуклеотиды, нуклеозиды и т.п.

Питательная композиция или молочная смесь для детей от 1 до 3 лет изобретения может также содержать каротиноид (-ы). В некоторых конкретных вариантах осуществления изобретения питательная композиция изобретения не содержит каротиноидов.

Питательную композицию или молочную смесь для детей от 1 до 3 лет в соответствии с изобретением можно получать любым подходящим способом. Далее композиция будет описана на конкретном примере.

Например, смесь, такую как детская смесь, можно получать путем смешивания источника белка, источника углеводов и источника жира в соответствующих пропорциях. На данном этапе можно включать эмульгаторы в случае их применения. На данном этапе можно добавлять витамины и минеральные вещества, но обычно их добавляют позднее для предотвращения термического разложения. Перед смешиванием в источнике жира можно растворять любые липофильные витамины, эмульгаторы и т.п. Затем можно домешивать воду, предпочтительно очищенную обратным осмосом, с образованием жидкой смеси. Температура воды для удобства находится в диапазоне от около 50°С до около 80°С для облегчения диспергирования ингредиентов. Для образования жидкой смеси можно применять доступные в продаже разжижители.

На данном этапе можно добавлять фукозилированный (-ые) олигосахарид (-ы) и N-ацетилированный (-ые) олигосахарид (-ы), особенно если конечный продукт должен иметь жидкую форму. Если конечный продукт должен представлять собой порошок, эти компоненты при желании также можно добавлять на данной стадии.

Затем жидкую смесь гомогенизируют, например, в две стадии.

Затем жидкую смесь можно термически обрабатывать для снижения бактериальной нагрузки путем быстрого нагрева жидкой смеси, например, до температуры в диапазоне от около 80°C до около 150°C в течение периода времени от около 5 секунд до около 5 минут. Нагревание можно осуществлять путем нагнетания пара с помощью автоклава или теплообменника, например, пластинчатого теплообменника.

Затем жидкую смесь можно охлаждать до температуры от около 60°C до около 85°C, например, путем мгновенного охлаждения. Затем жидкую смесь можно снова гомогенизировать, например, в две стадии: под давлением в диапазоне от около 10 МПа до около 30 МПа на первой стадии и от около 2 МПа до около 10 МПа на второй стадии. Затем гомогенизированную смесь можно дополнительно охлаждать для добавления любых термочувствительных компонентов, таких как витамины и минеральные вещества. На данном этапе для удобства регулируют рН и содержание твердых веществ в гомогенизированной смеси.

Если конечный продукт должен представлять собой порошок, гомогенизированную смесь переносят в подходящий сушильный аппарат, например, в распылительную сушилку или сублимационную сушилку, и превращают в порошок. Влагосодержание порошка должно составлять менее около 5 мас.%. На данном этапе можно также или в качестве альтернативы добавлять фукозилированный (-ые) олигосахарид (-ы) и N-ацетилированный (-ые) олигосахарид (-ы) путем сухого смешивания или путем перемешивания их в форме сиропа из кристаллов вместе с пробиотическим (-ими) штаммом (-ами) (при использовании), и смесь подвергают распылительной сушке или сублимационной сушке.

Если предпочтительна жидкая композиция, гомогенизированную смесь можно стерилизовать, а затем асептически разливать в подходящие контейнеры, либо можно сначала разливать в контейнеры, а затем стерилизовать в автоклаве.

В другом варианте осуществления композиция изобретения может представлять собой добавку. Добавка может быть представлена, например, в форме таблеток, капсул, пастилок или жидкости. Добавка может дополнительно содержать защитные гидроколлоиды (такие как камеди, белки, модифицированные крахмалы), связующие вещества, пленкообразующие агенты, инкапсулирующие агенты/материалы, материалы стенок/оболочек, соединения матриц, покрытия, эмульгаторы, поверхностно-активные вещества, солюбилизирующие агенты (масла, жиры, воски, лецитины и т.п.), адсорбенты, носители, наполнители, вспомогательные соединения, диспергирующие агенты, увлажняющие агенты, технологические добавки (растворители), антислеживающие агенты, маскирующие вкус агенты, утяжеляющие агенты, желирующие агенты и гелеобразующие агенты. Добавка также может содержать традиционные фармацевтические добавки и вспомогательные вещества, эксципиенты и разбавители, включая, без ограничений, воду, желатин любого происхождения, растительные камеди, лигнинсульфонат, тальк, сахара, крахмал, гуммиарабик, растительные масла, полиалкиленгликоли, ароматизирующие агенты, консерванты, стабилизаторы, эмульгирующие агенты, буферы, смазывающие вещества, красители, увлажняющие агенты, наполнители и т.п.

Дополнительно добавка может содержать органический или неорганический материал-носитель, подходящий для перорального или парентерального введения, а также витамины, минеральные микроэлементы и другие микроэлементы в соответствии с рекомендациями государственных органов, такими как рекомендуемые нормы потребления (RDA) США.

Питательная композиция в соответствии с изобретением предназначена для применения у младенцев или детей младшего возраста. Младенцы или дети младшего возраста могут быть рожденными в срок или недоношенными. В конкретном варианте осуществления питательная композиция изобретения предназначена для применения у младенцев или детей младшего возраста, родившихся недоношенными, имеющих низкий вес при рождении и/или родившихся маленькими для своего гестационного возраста (SGA). В конкретном варианте осуществления питательная композиция изобретения предназначена для применения у недоношенных младенцев, младенцев, имеющих низкий вес при рождении, и/или младенцев, родившихся маленькими для своего гестационного возраста (SGA).

Питательную композицию настоящего изобретения можно также применять у младенцев или детей младшего возраста, рожденных посредством кесарева сечения или посредством вагинальных родов.

В некоторых вариантах осуществления композиция в соответствии с изобретением может быть предназначена для применения до и/или во время периода отлучения от груди.

Возраст для введения (или применения) питательной композиции или вскармливания ей, а также продолжительность такого введения зависят от потребностей.

Питательную композицию можно, например, давать младенцам сразу же после рождения. Композицию изобретения также можно давать в течение первой недели жизни младенца, или в течение первых 2 недель жизни, или в течение первых 3 недель жизни, или в течение первого месяца жизни, или в течение первых 2 месяцев жизни, или в течение первых 3 месяцев жизни, или в течение первых 4 месяцев жизни, или в течение первых 6 месяцев жизни, или в течение первых 8 месяцев жизни, или в течение первых 10 месяцев жизни, или в течение первого года жизни, или в течение первых двух лет жизни, или даже дольше. В некоторых особенно преимущественных вариантах осуществления изобретения питательную композицию дают (или вводят) младенцу в течение первых 4, 6 или 12 месяцев после рождения указанного младенца. В некоторых других вариантах осуществления питательную композицию изобретения дают в течение нескольких дней (например, 1, 2, 3, 5, 10, 15, 20 и т.д.), или нескольких недель (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и т.д.), или нескольких месяцев (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и т.д.) после рождения. В первую очередь это может быть актуально, но не обязательно, в том случае, когда младенец родился преждевременно.

В одном варианте осуществления композицию изобретения дают младенцу или ребенку младшего возраста в качестве композиции, добавочной по отношению к материнскому молоку. В некоторых вариантах осуществления изобретения младенец или ребенок младшего возраста получает материнское молоко в течение по меньшей мере первых 2 недель, первых 1, 2, 4 или 6 месяцев. В одном варианте осуществления питательную композицию изобретения дают младенцу или ребенку младшего возраста после такого периода питания материнским молоком или дают во время такого периода питания материнским молоком. В другом варианте осуществления изобретения композицию дают младенцу или ребенку младшего возраста в качестве единственной или основной питательной композиции в течение по меньшей мере одного периода времени, например после 1-го, 2-го или 4-го месяца жизни, в течение по меньшей мере 1, 2, 4 или 6 месяцев.

В одном варианте осуществления питательная композиция изобретения является полной питательной композицией (удовлетворяющей все или большинство потребностей субъекта в питании). В другом варианте осуществления питательная композиция представляет собой добавку или обогатитель, предназначенные, например, для дополнения человеческого грудного молока или для дополнения детской смеси или смеси для прикармливаемых детей/смеси последующего уровня.

Все патентные и непатентные ссылки, цитируемые в настоящей заявке, настоящим полностью включены путем ссылки.

Настоящее изобретение будет дополнительно подробно описано в представленных ниже примерах, не имеющих ограничительного характера.

Примеры

Пример 1

Ниже в таблице 1 приведен пример состава питательной композиции (например, детской смеси) в соответствии с настоящим изобретением. Эта композиция приведена исключительно в качестве иллюстрации.

Таблица 1. Состав детской смеси согласно примеру 1

Питательные вещества		на 100 ккал	на литр
Энергетическая ценность (ккал)		100	670
Белок (г)		1,83	12,3
Жир (г)		5,3	35,7
Линолевая кислота (г)		0,79	5,3
α-Линоленовая кислота (мг)		101	675
Лактоза (г)		11,2	74,7
Минеральные вещества (г)		0,37	2,5
Na (мг)		23	150
K (мг)		89	590
Cl (мг)		64	430
Ca (мг)		62	410
P (мг)		31	210
Mg (мг)		7	50
Mn (мкг)		8	50
Se (мкг)		2	13
Витамин A (мкг РЭ)		105	700
Витамин D (мкг)		1,5	10
Витамин E (мг, ТЭ)		0,8	5,4
Витамин K1 (мкг)		8	54
Витамин С (мг)		10	67
Витамин В1 (мг)		0,07	0,47
Витамин В2 (мг)		0,15	1,0
Ниацин (мг)		1	6,7
Витамин В6 (мг)		0,075	0,50
Фолиевая кислота (мкг)		9	60
Пантотеновая кислота (мг)		0,45	3
Витамин B12 (мкг)		0,3	2
Биотин (мкг)		2,2	15
Холин (мг)		10	67
Fe (мг)		1,2	8
I (мкг)		15	100
Cu (мг)		0,06	0,4
Zn (мг)		0,75	5
Олигосахариды (ОГМ)	2FL (г)	0,075	0,5

Пример 2

Ниже в таблице 2 приведен пример состава питательной композиции (например, детской смеси) в соответствии с настоящим изобретением. Эта композиция приведена исключительно в качестве иллюстрации.

Таблица 2. Состав детской смеси согласно примеру 2

Питательные вещества		на 100 ккал	на литр
Энергетическая ценность (ккал)		100	670
Белок (г)		1,83	12,3
Жир (г)		5,3	35,7
Линолевая кислота (г)		0,79	5,3
α-Линоленовая кислота (мг)		101	675
Лактоза (г)		11,2	74,7
Минеральные вещества (г)		0,37	2,5
Na (мг)		23	150
K (мг)		89	590
Cl (мг)		64	430
Ca (мг)		62	410
P (мг)		31	210
Mg (мг)		7	50
Mn (мкг)		8	50
Se (мкг)		2	13
Витамин A (мкг РЭ)		105	700
Витамин D (мкг)		1,5	10
Витамин E (мг, ТЭ)		0,8	5,4
Витамин K1 (мкг)		8	54
Витамин С (мг)		10	67
Витамин В1 (мг)		0,07	0,47
Витамин В2 (мг)		0,15	1,0
Ниацин (мг)		1	6,7
Витамин В6 (мг)		0,075	0,50
Фолиевая кислота (мкг)		9	60
Пантотеновая кислота (мг)		0,45	3
Витамин B12 (мкг)		0,3	2
Биотин (мкг)		2,2	15
Холин (мг)		10	67
Fe (мг)		1,2	8
I (мкг)		15	100
Cu (мг)		0,06	0,4
Zn (мг)		0,75	5
Олигосахариды (ОГМ)	2FL (г)	0,15	1
	LNnT (г)	0,075	0,5

Пример 3. Прямой эффект ОГМ

Цель исследования

2’FL, LNT, LNnT, 3’SL и DiFL исследовали в отношении их способности непосредственно защищать и усиливать эпителиальный барьер до и после воспалительной провокации в модели клеточной линии совместного культивирования клеток эпителия кишечника, содержащих клетки Caco-2 и HT29-MTX.

Материалы и методы

Клеточные линии Caco-2 и HT29-MTX человека получали из Американской коллекции типовых культур (ATCC) и Европейской коллекции аутентифицированных клеточных культур (ECACC), соответственно. Клетки Caco-2 и HT29-MTX культивировали отдельно в колбах для культивирования при 37°C в увлажненной атмосфере, содержащей 10% CO², в минимальной питательной среде в модификации Дульбекко (DMEM) с добавлением GlutaMAX (Invitrogen), 1% минимальной питательной среды, 100 мкг/мл стрептомицина, 100 МЕ/мл пенициллина и инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (ФБС; 15% для Caco-2 и 10% для HT29-MTX).

Для подготовки сокультивирования для исследований эпителиального барьера каждую клеточную линию размножали в соответствующей колбе до достижения 90% слившихся монослоев. Затем клеточные линии трипсинизировали однократно трипсином. Сокультуру Caco-2 и HT29-MTX высевали с плотностью 6 x 104/см2 на полупроницаемые мембраны из поликарбоната Transwell площадью 1,12 см2 (0,4 мкм) и выращивали в среде DMEM с добавлением GlutaMAX, 1% минимальной питательной среды, 100 мкг/мл стрептомицина, 100 МЕ/мл пенициллина и 10% инактивированной нагреванием ФБС в течение 21 дня.

В день эксперимента среду заменяли свежей средой за по меньшей мере 4 часа до обработки. Сокультуры сначала предварительно обрабатывали 2’FL, LNT, LNnT, 3’SL, DiFL или комбинацией ОГМ (2’FL, 3’SL, 6’SL и LNnT) путем добавления ОГМ в апикальный компартмент Transwell в концентрации 30 мг/мл. После 48 часов предварительной обработки дисфункцию эпителиального барьера вызывали добавлением ФНО-α (2,5 нг/мл) и ИФН-γ (10 нг/мл) в базолатеральный компартмент Transwell в течение дополнительных 48 часов. В конце эксперимента перемещение FITC-меченного декстрана (4000 Да) из апикального компартмента в базолатеральный компартмент количественно определяли в течение 2 часов.

Результаты

Как видно из результатов, представленных на фиг. 1, 2’FL оказывала наибольший эффект на снижение перемещения FITC-меченного декстрана (4000 Да) из апикального компартмента в базолатеральный компартмент. Это служит доказательством того, что 2’FL является наиболее успешным из исследованных ОГМ для защиты барьера желудочно-кишечного тракта и поддержания надлежащей структуры (целостности барьера) и функции (пониженной проницаемости, например, уменьшение патогенов, синантропных бактерий, аллергенов и токсических соединений, мигрирующих из кишечника через кишечный барьер и снижение восприимчивости к заболеванию) желудочно-кишечного барьера до и после воспалительной провокации. Второй наибольший эффект наблюдался при комбинации 2’FL, 3’SL, 6’SL и LNnT.

Заключение

Представленные данные показывают, что 2'-фукозиллактоза (2’FL) превосходит другие исследованные ОГМ в отношении улучшения барьера желудочно-кишечного тракта и, в частности, в отношении улучшения защиты барьера желудочно-кишечного тракта, затем следует смесь ОГМ, содержащая 2’FL, 3’SL, 6’SL и LNnT.

Пример 4. Понижающая регуляция экспрессии рецептора ФНО-α посредством 2'FL

Материалы и методы

Клеточные линии

Клеточную линию колоректальной аденокарциномы человека Caco-2 (HTB-37) получали из Американской коллекции типовых культур (ATCC, Манассас, США) на пассаже 21 и использовали в экспериментах на пассажах с 23 по 33. Клеточная линия аденокарциномы толстой кишки HT29 человека (HTB-38; ATCC), предварительно адаптированная с помощью метотрексата (MTX), была получена из Европейской коллекции аутентифицированных клеточных культур (ECACC, Солсбери, Великобритания) на пассаже 51 и использована в экспериментах на пассажах с 23 по 33. Обе клеточные линии отдельно поддерживали в колбах для культивирования тканей площадью 75 см2 (Fischer Scientific) в увлажненной атмосфере при 37°C и 10% CO2, насыщенной воздухом/водой на 95%.

Модель клеточной культуры

Обе клеточные линии Caco-2 и HT29-MTX поддерживали в минимальной питательной среде в модификации Дульбекко (DMEM; 11965092, Gibco) с добавлением 10% (об./об.) инактивированной нагреванием ФБС (10270-106, Gibco) и 1% (об./об.) раствора пенициллина и стрептомицина (P4333, Sigma). Среду для выращивания заменяли минимум два раза в неделю. Клеточные линии пересевали раз в неделю с предварительно слившимися плотностями с 0,4% трипсин-ЭДТА (T3924, Sigma).

Для экспериментальных исследований клетки Caco-2 и HT29-MTX окрашивали трипановым синим (T8154, Sigma), подсчитывали, ресуспендировали в полной среде для выращивания в соотношениях 76:24 для имитации толстой кишки и высевали с плотностью 6 × 104 клеток на см2 в полупроницаемой мембране из поликарбоната Transwell™ с размером пор 0,4 мкМ и площадью поверхности 1,12 см2 (3460, Corning. Конфлюентность и целостность культуры Caco-2:HT29-MTX оценивали путем измерения вручную трансэпителиального электрического сопротивления каждую неделю с использованием вольтометра MillicellTM ERS-2. Клетки использовали в экспериментах через 21 сутки после посева.

Обработки ОГМ и модель индуцированной воспалением дисфункции эпителиального барьера.

ОГМ, полученные от компании Glycom (Херсхольм, Дания), разводили в стерильной воде в концентрации 250 мг/мл и фильтровали с помощью фильтра с размером пор 0,2 мкМ и выдерживали при -20°C в течение максимум 6 месяцев. В день обработки среду для выращивания клеток заменяли свежей средой со всеми добавками, но без фенолового красного. Смеси 2’FL:3’SL:6’SL:LNnT:LNT:diFL в соотношении 0,55:0,7:0,09:0,05:0,18:0,06 или отдельные ОГМ дополнительно разводили в среде для выращивания и добавляли в апикальный компартмент Transwell™ в различной конечной концентрации за 48 часов до воздействия цитокинов ФНО-α и ИНФ-γ в базолатеральном компартменте в течение дополнительных 48 часов. Контроли представляли собой клетки, не обработанные ОГМ, и клетки, не провоцированные цитокином (отрицательный контроль), и клетки, не обработанные ОГМ, но провоцированные цитокином (положительный контроль). Дополнительные клетки стимулировали лактозой в качестве контроля.

Экстрагирование мРНК

В конце эксперимента среду для выращивания удаляли и клетки дважды промывали фосфатно-солевым буфером Дульбекко (Sigma). Клетки отделяли от мембраны Transwell™ путем суспендирования клеток в буфере RLT (Qiagen) и соскабливания с помощью наконечников для пипетки. Две лунки объединяли и общую РНК экстрагировали с использованием набора для экстрагирования РНК MiniEasy (Qiagen) в соответствии с инструкцией производителя. Качество и количество РНК измеряли с помощью биоанализатора 2100 (Agilent). Для эксперимента использовали только РНК с RIN более 9. кДНК получали с использованием 100 нг РНК и кДНК QuantaBio qScript Supermix в соответствии с инструкцией производителя.

Анализ кПЦР

Анализ количественной ПЦР в реальном времени (кПЦР) в отношении человеческого гена рецептора ФНО-α 1 (рФНО1; NM_001065.3) выполняли с использованием предварительно приготовленного праймера для анализов Taqman® (Thermo Fisher Scientific) в системе ПЦР в реальном времени ABI 7300 (Applied Biosystem). В качестве конститутивного гена использовали предварительно приготовленный праймер для анализа Taqman® для gapdh (NM_001256799.2). Все анализы проводили в трех повторностях и рассчитывали разницу между значениями порогового цикла (CT), полученными для рФНО1 и конститутивного гена gapdh. Для сравнения экспрессии гена рФНО1 среди групп по кратной разности использовали уравнение дельта-дельта-CT.

Статистические анализы

Статистические различия между типами обработки определяли с помощью дисперсионного анализа с последующим применением ретроспективного анализа множественного сравнения. Статистическую значимость определяли как p ≤ 0,05. Значения в тексте представляют собой средние значения ± СО.

Результаты и описание

Рецептор ФНО-α, понижающий регуляцию 2’FL, на эпителиальных клетках

В настоящем примере показан один из механизмов, посредством которых 2’FL оказывает свое благоприятное воздействие на барьер желудочно-кишечного тракта. Было обнаружено, что ИФН-γ нарушает целостность барьера желудочно-кишечного тракта, повышая регуляцию экспресии рецепторов ФНО-α. Это, в свою очередь, позволяет цитокину ФНО-α связываться со своим рецептором (Wang et al., IFN-γ-induced TNFR2 Upregulation is Required for TNF-dependent Intestinal Epithelial Barrier Dysfunction. Gastroenterology. 2006 Oct; 131(4): 1153-1163). Комбинированное действие ФНО-α и ИФН-γ приводит к каскаду сигнальных путей эпителиальных клеток, который в конечном итоге нарушает целостность соединительных белков и повышенную параклеточную проницаемость (Wang et al, 2006). В настоящем примере показано, что 2’FL эффективно ингибирует индуцированное ИФН-γ повышение регуляции экспрессии рецептора ФНО-α эпителиальными клетками, таким образом ослабляя воспалительный процесс и предотвращая выраженные изменения проницаемости. Клетки, обработанные 2’FL, продемонстрировали более низкую экспрессию мРНК рецептора ФНО-α по сравнению с клетками положительного контроля (фиг. 2), что подчеркивает один из механизмов действия 2’FL в отношении снижения воспалительного ответа и последующей защиты эпителиального барьера.

Пример 5

2’FL ОГМ увеличивает количество KYNA (кинуреновой кислоты), вырабатываемой микробиотой

Ферментация кала и количественное определение кинуреновой кислоты

Образцы кала от десяти младенцев в возрасте от 3 до 4 месяцев, семи младенцев на грудном вскармливании (BF) и трех младенцев, находящихся на вскармливании смесью (FF), использовали для инокуляции среды YCFA без углеводов (не содержащих CHO). Схема исследования включала добавление в среду YCFA, не содержащую CHO, различных углеводов в конечной концентрации 0,5%, лактозы (контроль F1) или только 2’FL, комбинации 2’FL и LnNT или комбинации 2’FL, diFL, 3’SL, 6’SL, LNT и LNnT. Для каждого субъекта проводили четыре повтора ферментации (F1–F4), и через 24 часа и 48 часов собирали надосадочные жидкости. YCFA представляет собой сложную среду, содержащую триптон, экстракт из дрожжей и различные минеральные вещества, витамины и короткоцепочечные жирные кислоты; однако в этом случае исключались типичные компоненты CHO (глюкоза, мальтоза и целлобиоза).

Для анализа метаболитов образцы экстрагировали и разделяли на равные части для анализа на платформах ЖХ/МС/МС и полярной ЖХ. Запатентованное программное обеспечение использовалось для сопоставления ионов с внутренней библиотекой стандартов для определения метаболитов и для количественного определения метаболитов путем интеграции площади пика.

Результаты

Мы оценивали влияние на KYNA добавления в среду образцов ферментированного кала младенца in vitro с различными комбинациями ОГМ. Мы обнаружили, что по сравнению с лактозой 2’FL или комбинация 2’FL и LNnT значительно повышали уровень KYNA в надосадочной жидкости в 1,76 раза и 1,61 раза (P<0,01 и p<0,05 соответственно) в ферментированной надосадочной жидкости (фиг. 3). Смесь 6 ОГМ вызывала тенденцию к повышению уровня KYNA (среднее повышение в 1,56 раза по сравнению с лактозой, p=0,07). Нет никаких существенных различий между видами обработки ОГМ, что указывает на то, что повышение уровня KYNA главным образом обусловлено 2’FL.

Пример 6

6’SL+LNT и KYNA оказывают аддитивный эффект на активацию GPR35

Способ

Клеточную линию, стабильно экспрессирующую GPR35, размножали из замороженных маточных растворов в соответствии со стандартными процедурами. Клетки высевали в общем объеме 20 мкл в 384- луночные микропланшеты с белыми стенками и инкубировали при 37°C в течение необходимого времени до тестирования. Все тесты проводили в двух повторностях. В каждый день испытания готовили пятикратное рабочее промежуточное соединение в фосфатно-солевом буферном растворе (ФСБ) для каждой исследуемой концентрации. К клеткам добавляли 5 мкл пятикратного образца и инкубировали при 37°C или при комнатной температуре в течение 90 минут. Аналитический сигнал получали посредством однократного добавления 12,5 или 15 мкл (50% об./об.) смеси проявляющих реагентов PathHunter (DiscoverX) с последующей инкубацией в течение одного часа при комнатной температуре. Показания с микропланшетов регистрировали после получения сигнала на приборе PerkinElmer EnvisionTM для обнаружения хемилюминесцентных сигналов. Активность соединения анализировали с использованием пакета для анализа данных CBIS (ChemInnovation, Калифорния). Активность в процентах рассчитывали по следующей формуле:

Активность в % = 100% x (среднее RLU исследуемой пробы - среднее RLU контроля несущей средой)/(среднее максимальное значение для контрольного лиганда - среднее RLU контроля несущей средой).

Результаты

Стимуляция GPR35 с помощью 6’SL и LNT вместе с 200 мкМ KYNA продемонстрировала аддитивный эффект при концентрациях ОГМ от 940 мкМ до 2500 мкМ.

Claims

1. Применение питательной композиции, содержащей 2’-фукозиллактозу (2’FL), для улучшения барьера желудочно-кишечного тракта у младенца, который представляет собой ребёнка в возрасте до 12 месяцев, у ребёнка младшего возраста, который представляет собой ребёнка в возрасте от 1 года до менее 3 лет, или у ребёнка в возрасте от 3 лет до менее 8 лет,

причём указанное улучшение барьера желудочно-кишечного тракта представляет собой улучшенную защиту барьера, и

при этом 2’FL присутствует в количестве 0,25-1,9 г/л или 0,15-1,5 г/100 г композиции в расчёте на массу сухого вещества, предпочтительно в количестве 0,75-1,65 г/л или 0,19-1,5 г/100 г композиции в расчёте на массу сухого вещества.

2. Применение по п. 1, причём указанное применение предназначено для улучшения предотвращения дисфункции барьера, предотвращения проницаемости барьера, защиты структуры с плотным соединением клеток и защиты целостности эпителиальной выстилки кишечника.

3. Применение по п. 2, причём указанное предотвращение проницаемости барьера представляет собой предотвращение миграции патогенов, аллергенов и/или токсичных соединений из кишечника в организм через кишечный барьер.

4. Применение по любому из предшествующих пунктов, причём указанное улучшение, указанное предотвращение и/или указанная защита достигаются путем понижения регуляции рецептора ФНО-α на эпителиальных клетках.

5. Применение по любому из предшествующих пунктов, причём указанное улучшение, указанное предотвращение и/или указанная защита достигаются посредством увеличения выработки кинуреновой кислоты микробиотой младенца или ребёнка младшего возраста, потребляющего питательную композицию, соответственно ребёнка в возрасте от трех лет до менее восьми лет, потребляющего питательную композицию в форме молочной смеси для детей от 1 до 3 лет.

6. Применение по любому из предшествующих пунктов, причём указанная питательная композиция дополнительно содержит один или более ОГМ и/или их предшественников, например, выбранных из группы, состоящей из лакто-N-неотетраозы (LNnT), лакто-N-тетраозы (LNT), 6’-сиалиллактозы (6’SL), дифукозиллактозы (diFL) и 3’- сиалиллактозы (3’SL).

7. Применение по любому из предшествующих пунктов, причём указанная питательная композиция дополнительно содержит LNnT.

8. Применение по любому из предшествующих пунктов, причём указанная питательная композиция дополнительно содержит 3’SL, 6’SL и LNnT.

9. Применение по любому из пп. 1-3, причём ОГМ или их предшественники, отличные от 2’FL, отсутствуют или присутствуют в указанной питательной композиции в общем количестве менее 0,1% (масс./масс.), предпочтительно, например, менее 0,01% (масс./масс.) или более предпочтительно, например, менее 0,001%.

10. Применение по любому из пп. 6-8, причём ОГМ, отличные от 2’FL и LNnT, отсутствуют или присутствуют в указанной питательной композиции в общем количестве менее 0,1% (масс./масс.), предпочтительно, например, менее 0,01% (масс./масс.) или более предпочтительно, например, менее 0,001%.

11. Применение по любому из предшествующих пунктов, причём указанная питательная композиция подобрана по составу для введения младенцу.

12. Применение по п. 11, причём указанный младенец выбран из группы, состоящей из преждевременно родившихся, маленьких для своего гестационного возраста и детей с низким весом при рождении, предпочтительно младенец является преждевременно родившимся.

13. Применение по любому из предшествующих пунктов, причём указанная питательная композиция представляет собой детскую смесь, начальную детскую смесь, детскую смесь для прикармливаемых детей или детскую смесь последующего уровня, молочную смесь для детей от 1 до 3 лет, детское питание, детскую композицию на зерновой основе, обогатитель или добавку и предназначена для введения младенцу или ребёнку младшего возраста.