RU2818352C1 - Method for evaluating resistance of malignant neoplasms to radiation therapy and set of tests for implementation thereof - Google Patents
Method for evaluating resistance of malignant neoplasms to radiation therapy and set of tests for implementation thereof Download PDFInfo
- Publication number
- RU2818352C1 RU2818352C1 RU2022131099A RU2022131099A RU2818352C1 RU 2818352 C1 RU2818352 C1 RU 2818352C1 RU 2022131099 A RU2022131099 A RU 2022131099A RU 2022131099 A RU2022131099 A RU 2022131099A RU 2818352 C1 RU2818352 C1 RU 2818352C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- tube
- pcr
- radiation therapy
- genes
- resistance
- Prior art date
Links
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 31
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 19
- 230000005855 radiation Effects 0.000 claims abstract description 15
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 13
- 101000915413 Homo sapiens Disheveled-associated activator of morphogenesis 1 Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 101000852865 Homo sapiens Interferon alpha/beta receptor 2 Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 101000735213 Homo sapiens Palladin Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 101000661821 Homo sapiens Serine/threonine-protein kinase 17A Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 102100036718 Interferon alpha/beta receptor 2 Human genes 0.000 claims abstract description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 11
- 102100035031 Palladin Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 102100037955 Serine/threonine-protein kinase 17A Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims abstract description 10
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims abstract description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 5
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 claims abstract description 4
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 claims abstract description 4
- 230000001146 hypoxic effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 claims abstract description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 10
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 6
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 claims description 5
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 claims description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 5
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 5
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 claims description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 230000005865 ionizing radiation Effects 0.000 description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 102100028555 Disheveled-associated activator of morphogenesis 1 Human genes 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 206010071602 Genetic polymorphism Diseases 0.000 description 3
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 102000004360 Cofilin 1 Human genes 0.000 description 2
- 108090000996 Cofilin 1 Proteins 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 2
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 2
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 206010003571 Astrocytoma Diseases 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101100169494 Homo sapiens DAAM1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000008986 Janus Human genes 0.000 description 1
- 108050000950 Janus Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 101150006225 Palld gene Proteins 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 102000006381 STAT1 Transcription Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010044012 STAT1 Transcription Factor Proteins 0.000 description 1
- 101150114310 STK17A gene Proteins 0.000 description 1
- 102000000887 Transcription factor STAT Human genes 0.000 description 1
- 108050007918 Transcription factor STAT Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000001973 epigenetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000003500 gene array Methods 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-O guanidinium Chemical compound NC(N)=[NH2+] ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- 101150074051 ifnar2 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 150000003230 pyrimidines Chemical class 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000006335 response to radiation Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000007390 skin biopsy Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
Abstract
Description
Изобретение относится к области медицины, а именно к медицинской генетике, и может быть использовано в онкологии для определения чувствительности опухоли к воздействию радиотерапии.The invention relates to the field of medicine, namely to medical genetics, and can be used in oncology to determine the sensitivity of a tumor to the effects of radiotherapy.
Эффективность радиотерапии злокачественных новообразований зависит от исходной радиочувствительности клеток опухоли, ассоциированной с их генетическими и эпигенетическими особенностями. Как правило, она значительно варьирует среди опухолей различного происхождения [Барсуков Ю.А., Малихов А.Г., Ткачев С.И., Кузьмичев Д.В. «Радиорезистентность опухоли и пути ее преодоления (обзор литературы)», Тазовая хирургия и онкология, №. 1, 2015, С. 9]. Для решения данной проблемы прибегают к применению корпускулярных излучений, оптимизацией пространственно-временного распределения дозы ионизирующей излучения, физических и химических радиомодификаторов. Однако при этом не учитывают молекулярно-генетические особенности злокачественного новообразования.The effectiveness of radiotherapy for malignant neoplasms depends on the initial radiosensitivity of tumor cells, associated with their genetic and epigenetic characteristics. As a rule, it varies significantly among tumors of different origins [Barsukov Yu.A., Malikhov A.G., Tkachev S.I., Kuzmichev D.V. “Tumor radioresistance and ways to overcome it (literature review)”, Pelvic Surgery and Oncology, no. 1, 2015, p. 9]. To solve this problem, they resort to the use of corpuscular radiation, optimization of the spatiotemporal distribution of the dose of ionizing radiation, and physical and chemical radiomodifiers. However, this does not take into account the molecular genetic features of the malignant neoplasm.
Поэтому при проведении курса радиотерапии, который осуществляется в несколько этапов, основным вопросом остается оценка эффективности очередного этапа облучения. Он позволяет определить последующий план терапии пациента, который заключается в продолжение облучения или применение уже других методов лечения, например химиотерапии или хирургического вмешательства. В настоящее время лишь единичные публикации посвящены исследованию вероятности и поиску различных способов оценки эффективности лечения злокачественных опухолей с помощью радиотерапии.Therefore, when conducting a course of radiotherapy, which is carried out in several stages, the main issue remains assessing the effectiveness of the next stage of irradiation. It allows you to determine the patient's subsequent treatment plan, which consists of continuing radiation or using other treatment methods, such as chemotherapy or surgery. Currently, only a few publications are devoted to the study of probability and the search for various ways to assess the effectiveness of treating malignant tumors using radiotherapy.
Один из способов определения радиорезистентности злокачественных новообразований [Патент РФ №2075078, МПК A61N 5/00, публ. 1997 г.], состоит в осуществлении гипоксической пробы. Перед ее проведением, а также после, выполняют двухкратную биопсию кожи. Обработка биоптатов позволяет обнаружить тканевые базофилы и спрогнозировать радиорезистентность расчетным методом.One of the methods for determining the radioresistance of malignant neoplasms [RF Patent No. 2075078, IPC A61N 5/00, publ. 1997], consists of performing a hypoxic test. Before and after the procedure, a double skin biopsy is performed. Processing of biopsy specimens makes it possible to detect tissue basophils and predict radioresistance using a calculation method.
Недостатком данного способа является продолжительный период времени, отводимый на изготовление гистологических срезов, которые играют ключевую роль в получении результатов исследований.The disadvantage of this method is the long period of time allocated for the preparation of histological sections, which play a key role in obtaining research results.
Другим способом выявления резистентности опухоли к облучению является диагностическое воздействие на ее клетки низкоинтенсивного источника излучения. Проведение фиксации параметров фракции роста до и во время процесса лечения, а также анализ изменений [Патент РФ 2107297, МПК A61N 5/06, публ. 1998 г.]. В данном способе используют воздействие низкоинтенсивного оптического излучения в диапазоне длин волн 0,3-10,6 мкм. Облучение проводят до начала курса терапии, во время и после его окончания в интактной области и в области самой опухоли. Определение in situ по параметрам отраженного излучения величины фракции роста клеток в интактной области и в области опухоли. Также определение ответа опухоли на воздействие облучения основываясь на отношение величины фракции роста клеток в опухоли к фракции роста клеток в интактной области и по скорости изменения фракции роста в опухоли в процессе терапии.Another way to detect tumor resistance to radiation is through diagnostic exposure of its cells to a low-intensity radiation source. Recording the parameters of the growth fraction before and during the treatment process, as well as analyzing changes [RF Patent 2107297, IPC A61N 5/06, publ. 1998]. This method uses exposure to low-intensity optical radiation in the wavelength range of 0.3-10.6 microns. Irradiation is carried out before the start of the course of therapy, during and after its completion in the intact area and in the area of the tumor itself. Determination in situ based on reflected radiation parameters of the cell growth fraction in the intact area and in the tumor area. Also, determining the tumor response to radiation exposure based on the ratio of the size of the cell growth fraction in the tumor to the cell growth fraction in the intact area and the rate of change in the growth fraction in the tumor during therapy.
Недостатком способа является то, что в большинстве случаях одного показателя оказывается недостаточно для построения точного прогноза. В связи с этим данный способ не может быть использован из-за отсутствия высокой точности и достоверности.The disadvantage of this method is that in most cases one indicator is not enough to make an accurate forecast. In this regard, this method cannot be used due to the lack of high accuracy and reliability.
Доказано, что на результат радиотерапии существенное влияние оказывает исходная чувствительность опухоли к облучению, которая опосредована ее генетическими особенностями [Cintra H.S., Pinezi J.C., Machado G.D., de Carvalho G.M., Carvalho A.T., dos Santos Т.Е., Marciano R.D., Soares Rde В. Investigation of genetic polymorphisms related to the outcome of radiotherapy for prostate cancer patients. Dis Markers. 2013;35(6): Р. 702]. Известно, например, что на степень резистентности опухоли к облучению оказывает влияние один из видов генетического полиморфизма, при котором увеличивается или уменьшается число копий некоторых генов, что сопровождается повышением или понижением экспрессии его продукта. [Cintra HS, Pinezi JC, Machado GD, de Carvalho GM, Carvalho AT, dos Santos ТЕ, Marciano RD, Soares Rde B. Investigation of genetic polymorphisms related to the outcome of radiotherapy for prostate cancer patients. Dis Markers. 2013;35(6): Р. 702].It has been proven that the result of radiotherapy is significantly influenced by the initial sensitivity of the tumor to radiation, which is mediated by its genetic characteristics [Cintra H.S., Pinezi J.C., Machado G.D., de Carvalho G.M., Carvalho A.T., dos Santos T.E., Marciano R.D., Soares Rde B Investigation of genetic polymorphisms related to the outcome of radiotherapy for prostate cancer patients. Dis Markers. 2013;35(6): R. 702]. It is known, for example, that the degree of tumor resistance to radiation is influenced by one of the types of genetic polymorphism, in which the copy number of certain genes increases or decreases, which is accompanied by an increase or decrease in the expression of its product. [Cintra HS, Pinezi JC, Machado GD, de Carvalho GM, Carvalho AT, dos Santos TE, Marciano RD, Soares Rde B. Investigation of genetic polymorphisms related to the outcome of radiotherapy for prostate cancer patients. Dis Markers. 2013;35(6): R. 702].
Предлагаемое изобретение направлено на решение задачи повышения точности и достоверности оценки резистентности злокачественных новообразований к воздействию облучения.The present invention is aimed at solving the problem of increasing the accuracy and reliability of assessing the resistance of malignant neoplasms to the effects of radiation.
Сущность заявляемого изобретения заключается в следующем.The essence of the claimed invention is as follows.
Заявляется cпособ оценки резистентности злокачественных новообразований к радиационной терапии, включающий проведение гипоксической пробы, диагностическое воздействие на клетки опухоли низкоинтенсивным источником излучения, гистологическое исследование биоптата, полученного из опухоли по окончанию 4-го сеанса лучевой терапии, отличающийся тем, что для проведения анализа используют метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) с возможностью определения уровня экспрессии генов, который описан протоколами подготовки проведения ПЦР и полученных результатов, причем проведение ПЦР включает приготовление раствора с использованием набора реагентов, включающего пробирку со смесью лиофилизированных 8 праймеров для 4 генов DAAM1, IFNAR2, PALLD, STK17A, пробирку с реакционной смесью, пробирку с MgCl2, пробирку со стерильной водой, пробирку с минеральным маслом, а протокол ПЦР включает в себя программу амплификации: 1 цикл предварительной денатурации ДНК при 95°С, длительностью 300 с; 35 циклов денатурации при 95°С, длительностью 10 с; 35 циклов отжига праймеров при 60°С по 20 с каждый; 35 циклов элонгации при 72°С длительностью 10 с, а протокол полученных результатов включает в себя описание подобранных для 4 ключевых генов DAAM1, IFNAR2, PALLD, STK17A 4 пар праймеров - прямого и обратного, где вывод о наличии резистентности злокачественных новообразований к радиационной терапии делается на основе изменений в экспрессии данных генов.A method is claimed for assessing the resistance of malignant neoplasms to radiation therapy, including a hypoxic test, a diagnostic effect on tumor cells with a low-intensity radiation source, a histological examination of a biopsy obtained from the tumor at the end of the 4th session of radiation therapy, characterized in that the polymerase method is used for analysis. chain reaction (PCR) with the ability to determine the level of gene expression, which is described by the protocols for the preparation of PCR and the results obtained, and the PCR includes the preparation of a solution using a set of reagents, including a tube with a mixture of lyophilized 8 primers for 4 genes DAAM1, IFNAR2, PALLD, STK17A , a test tube with a reaction mixture, a test tube with MgCl 2 , a test tube with sterile water, a test tube with mineral oil, and the PCR protocol includes an amplification program: 1 cycle of preliminary DNA denaturation at 95°C, lasting 300 s; 35 denaturation cycles at 95°C, duration 10 s; 35 cycles of primer annealing at 60°C for 20 s each; 35 elongation cycles at 72°C lasting 10 s, and the protocol of the results obtained includes a description of 4 pairs of primers selected for 4 key genes DAAM1, IFNAR2, PALLD, STK17A - forward and reverse, where a conclusion is made about the presence of resistance of malignant neoplasms to radiation therapy based on changes in the expression of these genes.
2. Набор реагентов для оценки резистентности злокачественных новообразований к радиационной терапии, включающий пробирку со смесью лиофилизированных 8 праймеров для 4 генов DAAM1, IFNAR2, PALLD, STK17A, пробирку с реакционной смесью, пробирку с MgCl2, пробирку со стерильной водой, пробирку с минеральным маслом.2. A set of reagents for assessing the resistance of malignant neoplasms to radiation therapy, including a tube with a mixture of lyophilized 8 primers for 4 genes DAAM1, IFNAR2, PALLD, STK17A, a tube with a reaction mixture, a tube with MgCl 2 , a tube with sterile water, a tube with mineral oil .
Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентам и научно-техническим источникам информации и выявление источников, содержащих сведения об аналогах заявленного изобретения, позволил установить, что заявитель не обнаружил аналог, характеризующийся признаками, тождественными всем существенным признакам заявленного изобретения. Определение из перечня выявленных аналогов прототипа, как наиболее близкого по совокупности существенных признаков аналога, позволило выявить совокупность существенных по отношению к усматриваемому заявителем техническому результату отличительных признаков в заявленном изобретении, изложенных в формуле изобретения.The analysis of the state of the art carried out by the applicant, including a search of patents and scientific and technical sources of information and identification of sources containing information about analogues of the claimed invention, allowed us to establish that the applicant did not find an analogue characterized by features identical to all the essential features of the claimed invention. Determination from the list of identified analogues of the prototype as the closest analogue in terms of the set of essential features made it possible to identify a set of distinctive features in the claimed invention that are essential in relation to the technical result perceived by the applicant, as set out in the claims.
Оценку резистентности злокачественных новообразований к радиационной терапии проводили следующим образом.The resistance of malignant neoplasms to radiation therapy was assessed as follows.
Для проведения анализа используем методом полимеразной цепной реакции, который позволяет обеспечить выделение тотальной РНК из биологического материала пациента. Принцип выделения РНК основан на кислой фенольной экстракции по Хомчинскому (Chomczynski, Piotr & Sacchi, Nicoletta. (1987). Single-Step Method Of RNA Isolation By Acid Guanidinium Thiocyanate-Phenol-Chlorform Extraction. Analytical biochemistry. 162. 156-9. 10.1006/abio.1987.9999). Выделенную тотальную РНК используют в качестве матрицы для синтеза комплементарной ДНК (кДНК) в процессе обратной транскрипции по стандартному протоколу.To carry out the analysis, we use the polymerase chain reaction method, which allows us to isolate total RNA from the patient’s biological material. The principle of RNA isolation is based on acidic phenol extraction according to Chomczynski (Chomczynski, Piotr & Sacchi, Nicoletta. (1987). Single-Step Method Of RNA Isolation By Acid Guanidinium Thiocyanate-Phenol-Chlorform Extraction. Analytical biochemistry. 162. 156-9. 10.1006 /abio.1987.9999). The isolated total RNA is used as a template for the synthesis of complementary DNA (cDNA) in the process of reverse transcription according to a standard protocol.
Приготовление раствора для проведения ПЦР проводится в микроцентрифужной пробирке. Количество пробирок рассчитывается из количества исследуемых образцов плюс один положительный и один отрицательный контроль. Лиофилизорованные праймеры предварительно ресуспендируются в 50 мкл очищенной воды. В пробирке смешиваются 4 мкл 2,5 × реакционной смеси, 0,5 мкл смеси праймеров, 0,4 мкл 25 mM MgCl2, 3 нг исследуемого образца (для положительного контроля добавляется 3 нг образца, для отрицательного контроля в пробирку ничего не добавляется). Раствор доводится до объема 20 мкл очищенной водой после чего добавляют 10 мкл минерального масла. Пробирки с растворами помещаются в ДНК-амплификатор. Для проведения ПЦР разработана следующая программа амплификации: 1 цикл предварительной денатурации ДНК при 95°С, длительностью 300 с; 35 циклов денатурации при 95°С, длительностью 10 с; 35 циклов отжига праймеров при 60°С по 20 с; 35 циклов элонгации при 72°С длительностью 10 с. The solution for PCR is prepared in a microcentrifuge tube. The number of tubes is calculated from the number of test samples plus one positive and one negative control. Lyophilized primers are pre-suspended in 50 µl of purified water. 4 μl of 2.5 × reaction mixture, 0.5 μl of primer mixture, 0.4 μl of 25 mM MgCl 2 , 3 ng of the test sample are mixed in a test tube (for positive control, 3 ng of sample is added, for negative control, nothing is added to the test tube) . The solution is brought to a volume of 20 μl with purified water, after which 10 μl of mineral oil is added. Test tubes with solutions are placed in a DNA amplifier. To carry out PCR, the following amplification program has been developed: 1 cycle of preliminary DNA denaturation at 95°C, lasting 300 s; 35 denaturation cycles at 95°C, duration 10 s; 35 cycles of primer annealing at 60°C for 20 s; 35 elongation cycles at 72°C for 10 s.
Гены отобраны на основе проведенных экспериментов. Доказано, что интенсивность их экспрессии зависит от воздействия облучения ионизирующим излучением и ассоциирована с процессом формирования радиорезистентности опухолевых клеток. Ген DAAM1 участвует в образовании кофилина 1 (CFL1), который значительно активируется в радиорезистентной астроцитоме. Ген IFNAR2 принимает участие в активации рецептора Janus протеинкиназ, который фосфорилирует белки STAT и STAT1. В свою очередь STAT, будучи активатором транскрипции способен блокировать апоптоз, что приводит к радиорезистентности опухолевых клеток. Ген PALLD играет ключевую роль в формировании морфологии, подвижности и адгезии клеток. Однако, адгезия с внеклеточным матриксом в опухолевых клеточных линиях приводит к формированию устойчивости к ионизирующему излучению. Ген STK17A является регулятором АФК в клетке. Их увеличение под воздействием ионизирующего излучения приводит к адаптивным изменениям и играет центральную роль в формировании ее радиорезистентности. Результат опытов по испытанию тест-системы из оригинальных праймеров для 4 ключевых генов (DAAM1, IFNAR2, PALLD, STK17A) позволил определить устойчивость опухолевых клеток нескольких раковых линий (K562, НСТ-116р53 (+/+), НСТ-116р53 (-/-), Ме45) к воздействию облучения ионизирующего излучения.Genes were selected based on the experiments performed. It has been proven that the intensity of their expression depends on exposure to ionizing radiation and is associated with the process of formation of radioresistance of tumor cells. The DAAM1 gene is involved in the formation of cofilin 1 (CFL1), which is significantly upregulated in radioresistant astrocytoma. The IFNAR2 gene is involved in the activation of the Janus receptor protein kinases, which phosphorylates the STAT and STAT1 proteins. In turn, STAT, being a transcription activator, is able to block apoptosis, which leads to radioresistance of tumor cells. The PALLD gene plays a key role in the formation of cell morphology, motility and adhesion. However, adhesion to the extracellular matrix in tumor cell lines leads to the formation of resistance to ionizing radiation. The STK17A gene is a regulator of ROS in the cell. Their increase under the influence of ionizing radiation leads to adaptive changes and plays a central role in the formation of its radioresistance. The result of experiments testing a test system of original primers for 4 key genes (DAAM1, IFNAR2, PALLD, STK17A) made it possible to determine the resistance of tumor cells of several cancer lines (K562, HCT-116p53 (+/+), HCT-116p53 (-/- ), Me45) to the effects of exposure to ionizing radiation.
На основе серий экспериментов для исследуемых генов (DAAM1, PALLD, IFNAR2 и STK17A) подобран индивидуальный порог, который позволяет определить чувствительность к воздействию облучения ионизирующего излучения (ИИ). Для генов DAAM1 и PALLD он составляет 1,7 условных единиц (Для определения значений уровня экспрессии генов использовали матрицу HGU133A. Её сканирование проводили на сканере GeneArray G2500A (“Affimetrix”, США), который выдавал значения уровня экспрессии в условных единицах). Если уровень экспрессии имеет значение меньше 1,7 усл.ед., тогда клетки более устойчивы в отношении воздействия облучения ИИ. Для генов IFNAR2 и STK17A порог составляет 2 условные единицы. Если уровень экспрессии имеет значение больше 2 усл.ед., тогда клетки более устойчивы в отношении воздействия облучения ИИ.Based on a series of experiments, an individual threshold was selected for the genes under study (DAAM1, PALLD, IFNAR2 and STK17A), which allows us to determine sensitivity to the effects of ionizing radiation (IR). For the DAAM1 and PALLD genes, it is 1.7 arbitrary units (To determine the gene expression level values, the HGU133A matrix was used. It was scanned on a GeneArray G2500A scanner (Affimetrix, USA), which provided expression level values in arbitrary units). If the expression level is less than 1.7 conventional units, then the cells are more resistant to the effects of irradiation. For the IFNAR2 and STK17A genes, the threshold is 2 arbitrary units. If the expression level is greater than 2 conventional units, then the cells are more resistant to the effects of irradiation.
Основные требования при синтезе праймеров для тест-системы:Basic requirements for the synthesis of primers for the test system:
1. Отсутствие повторов и протяженных участков из одного типа нуклеотидов (более 4-5 азотистых оснований одного типа подряд, особенно пуринов);1. Absence of repeats and extended sections of one type of nucleotide (more than 4-5 nitrogenous bases of the same type in a row, especially purines);
2. Содержание большого количества пиримидинов и небольшого пуринов;2. Contains a large amount of pyrimidines and small purines;
3. Температура плавления праймеров должна находится в пределах 52-70°С;3. The melting temperature of primers should be in the range of 52-70°C;
4. Длина амплифицируемого фрагмента в пределах от 150 до 1100 п.н.;4. The length of the amplified fragment ranges from 150 to 1100 bp;
5. Длина праймеров должна составлять от 19 до 23 нуклеотидов.5. The length of primers should be between 19 and 23 nucleotides.
Нуклеотидные последовательности исследуемых генов взяты из банка данных нуклеотидных последовательностей Американского Национального Центра Биотехнологической Информации (NCBI, www.ncbi.nlm.nih.gov).The nucleotide sequences of the studied genes were taken from the nucleotide sequence data bank of the American National Center for Biotechnology Information (NCBI, www.ncbi.nlm.nih.gov).
Таким образом, предложенное изобретение обеспечивает возможность проведения генетического анализа резистентности злокачественных новообразований по уровню экспрессии 4 генов (DAAM1, IFNAR2, PALLD, STK17A), используя любой доступный генетический материал в краткие сроки (1-2 дня), с использованием любого доступного метода регистрации результата. Используя тест можно зарегистрировать интенсивность экспрессии ключевых генов, что позволит сказать о наличии/отсутствии устойчивости опухоли к радиотерапии. Тем самым повышается точность и достоверность оценки резистентности злокачественных новообразований к воздействию облучения.Thus, the proposed invention provides the ability to conduct a genetic analysis of the resistance of malignant neoplasms based on the expression level of 4 genes (DAAM1, IFNAR2, PALLD, STK17A), using any available genetic material in a short time (1-2 days), using any available method for recording the result . Using the test, you can register the intensity of expression of key genes, which will allow you to determine the presence/absence of tumor resistance to radiotherapy. This increases the accuracy and reliability of assessing the resistance of malignant neoplasms to the effects of radiation.
Вышеизложенное описание свидетельствует о выполнении при использовании заявленного изобретения следующей совокупности условий:The above description indicates that the following set of conditions are met when using the claimed invention:
- средство, воплощающее заявленное изобретение, при его осуществлении относится к медицине, а именно к медицинской генетике, и может быть использовано в онкологии;- the means embodying the claimed invention, when implemented, relates to medicine, namely medical genetics, and can be used in oncology;
- для заявленного генетического теста в том виде, как он охарактеризован в изложенной формуле изобретения, подтверждена возможность его осуществления с помощью описанных в заявке средств и методов;- for the claimed genetic test in the form as it is characterized in the stated claims, the possibility of its implementation using the means and methods described in the application has been confirmed;
- средство, воплощающее заявленное изобретение при осуществлении, способно обеспечить повышение точности и достоверности оценки резистентности злокачественных новообразований к воздействию облучения.- a means embodying the claimed invention when implemented is capable of increasing the accuracy and reliability of assessing the resistance of malignant neoplasms to the effects of radiation.
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования Российской федерации (проект №0830-2020-0008).The work was carried out with financial support from the Ministry of Science and Higher Education of the Russian Federation (project No. 0830-2020-0008).
Claims (2)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2818352C1 true RU2818352C1 (en) | 2024-05-02 |
Family
ID=
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2754154C1 (en) * | 2020-10-08 | 2021-08-30 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр онкологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method for determining the radiosensitivity of malignant rectal tumours |
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2754154C1 (en) * | 2020-10-08 | 2021-08-30 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр онкологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method for determining the radiosensitivity of malignant rectal tumours |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Погодина Е.С., Расторгуева Е.В., Юрова Е.В., Белобородов Е.А., Сугак Д.Е., Саенко Ю.В., Фомин А.Н., Волков М.А., Костишко Б.М. АНАЛИЗ ВЛИЯНИЯ УРОВНЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ И СЕТЕЙ МЕЖМОЛЕКУЛЯРНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ НА РАЗВИТИЕ РАДИОРЕЗИСТЕНТНОСТИ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК // Ульяновский медико-биологический журнал. 2022. N3. Schwab Melissa. et al. "Targeting Cancer Metabolism Breaks Radioresistance by Impairing the Stress Response" Cancers 13 (2021). * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR101562644B1 (en) | Prediction of Prognosis for Colorectal Cancer | |
| KR101437718B1 (en) | Markers for predicting gastric cancer prognostication and Method for predicting gastric cancer prognostication using the same | |
| US20100184034A1 (en) | Gene Expression Profiling for Identification, Monitoring and Treatment of Lung Cancer | |
| JP6864089B2 (en) | Postoperative prognosis or antineoplastic compatibility prediction system for patients with advanced gastric cancer | |
| WO2010064702A1 (en) | Biomarker for predicting prognosis of cancer | |
| WO2008069881A9 (en) | Gene expression profiling for identification, monitoring and treatment of melanoma | |
| JP2019527544A (en) | Molecular marker, reference gene, and application thereof, detection kit, and detection model construction method | |
| WO2008123867A1 (en) | Gene expression profiling for identification, monitoring, and treatment of breast cancer | |
| US9809859B2 (en) | Biomarkers for subtypes of cervical cancer | |
| Nagahata et al. | Expression profiling to predict postoperative prognosis for estrogen receptor‐negative breast cancers by analysis of 25,344 genes on a cDNA microarray | |
| CN114908171B (en) | Application and kit of human HHIPL2 mRNA in targeted therapy and prognosis assessment of non-small cell lung cancer | |
| GB2616359A (en) | Methods and genomic classifiers for identifying homologous recombination deficiency prostate cancer | |
| WO2014089055A1 (en) | Tivozanib response prediction | |
| RU2714752C2 (en) | Method of measuring change in individual's immune repertoire | |
| CN103911439A (en) | Analyzing method and application of differential expression gene of systemic lupus erythematosus hydroxymethylation status | |
| RU2818352C1 (en) | Method for evaluating resistance of malignant neoplasms to radiation therapy and set of tests for implementation thereof | |
| Green et al. | miR-16 is highly expressed in Paget’s associated osteosarcoma | |
| US20130274127A1 (en) | Gene expression markers for prediction of response to phosphoinositide 3-kinase inhibitors | |
| Hamada et al. | Diagnostic usefulness of PCR profiling of the differentially expressed marker genes in thyroid papillary carcinomas | |
| CN110573629A (en) | Method and kit for diagnosing early pancreatic cancer | |
| US20060234235A1 (en) | Methods and compositions for the diagnosis of neuroendocrine lung cancer | |
| CN114277132B (en) | Application of immune-related lncRNA expression profile in predicting benefit of small cell lung cancer auxiliary chemotherapy and prognosis | |
| CN110331207A (en) | Adenocarcinoma of lung biomarker and related application | |
| US20200041515A1 (en) | Compositions and methods for screening and identifying clinically aggressive prostate cancer | |
| WO2012162049A2 (en) | Methods and compositions for measuring radiation exposure in a subject |