RU2815113C1 - Oligonucleotides for diagnosing epilepsy by quantitative pcr - Google Patents
Oligonucleotides for diagnosing epilepsy by quantitative pcr Download PDFInfo
- Publication number
- RU2815113C1 RU2815113C1 RU2023133824A RU2023133824A RU2815113C1 RU 2815113 C1 RU2815113 C1 RU 2815113C1 RU 2023133824 A RU2023133824 A RU 2023133824A RU 2023133824 A RU2023133824 A RU 2023133824A RU 2815113 C1 RU2815113 C1 RU 2815113C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- insdqualifier
- microrna
- insdseq
- insdfeature
- primer
- Prior art date
Links
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 title claims abstract description 22
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 21
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 title claims description 17
- 206010015037 epilepsy Diseases 0.000 title abstract description 7
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 33
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 claims abstract description 30
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims abstract description 15
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 11
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 11
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 abstract description 52
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 abstract description 47
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 abstract description 10
- 201000008914 temporal lobe epilepsy Diseases 0.000 abstract description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 9
- 108091065165 Homo sapiens miR-106b stem-loop Proteins 0.000 abstract description 8
- 108091069094 Homo sapiens miR-134 stem-loop Proteins 0.000 abstract description 8
- 206010071082 Juvenile myoclonic epilepsy Diseases 0.000 abstract description 7
- 208000034287 idiopathic generalized susceptibility to 7 epilepsy Diseases 0.000 abstract description 7
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 abstract description 5
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 abstract description 4
- 108091068998 Homo sapiens miR-191 stem-loop Proteins 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 27
- 238000000034 method Methods 0.000 description 26
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 16
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 13
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 10
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 6
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 6
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 5
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 4
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 3
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 3
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 3
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 3
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 3
- 108091033433 MiR-191 Proteins 0.000 description 2
- 108091030146 MiRBase Proteins 0.000 description 2
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 2
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 2
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 2
- 102000015623 Polynucleotide Adenylyltransferase Human genes 0.000 description 2
- 108010024055 Polynucleotide adenylyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 108091043597 miR-134 stem-loop Proteins 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000000104 diagnostic biomarker Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000006718 epigenetic regulation Effects 0.000 description 1
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000092 prognostic biomarker Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
Abstract
Description
Изобретение относится к молекулярной биологии и касается набора олигонуклеотидов для определения микроРНК: hsa-miR-134-5р, hsa-miR-106b-5p, hsa-miR-191 и анализа относительной экспрессии данных микроРНК в плазме крови.The invention relates to molecular biology and concerns a set of oligonucleotides for determining microRNAs: hsa-miR-134-5p, hsa-miR-106b-5p, hsa-miR-191 and analysis of the relative expression of these microRNAs in blood plasma.
Данное изобретение предназначено для анализа экспрессии hsa-miR-134-5р, hsa-miR-106b-5p, hsa-miR-191 методом количественной ПЦР в два этапа. Первый этап заключается в проведении обратной транскрипции с матрицы микроРНК. Второй этап заключается в постановке и анализе количественной ПЦР в реальном времени с использованием технологии TaqMan. Экспрессионный анализ может быть использован в качестве метода для поиска биомаркеров заболеваний различной этиологии, в том числе для диагностики неврологических заболеваний, таких как эпилепсия.This invention is intended to analyze the expression of hsa-miR-134-5p, hsa-miR-106b-5p, hsa-miR-191 by quantitative PCR in two stages. The first stage is to perform reverse transcription from the microRNA template. The second stage consists of performing and analyzing quantitative real-time PCR using TaqMan technology. Expression analysis can be used as a method to search for biomarkers of diseases of various etiologies, including for the diagnosis of neurological diseases such as epilepsy.
В настоящее время анализ экспрессии микроРНК применяется в фундаментальных исследованиях эпигенетической регуляции экспрессии ряда таргетных генов, а также для поисковых исследований диагностических и прогностических биомаркеров ряда неврологических заболеваний.Currently, microRNA expression analysis is used in fundamental studies of epigenetic regulation of the expression of a number of target genes, as well as for exploratory studies of diagnostic and prognostic biomarkers of a number of neurological diseases.
Известна разработка набора праймеров и зондов для детекции микроРНК и последующего количественного анализа с использованием ПЦР в реальном времени, представляющая собой набор олигонуклеотидов, в числе которых праймер для обратной транскрипции микроРНК S-oligo(dT) [Патент на изобретение EP2700719A1 «Method and primers for detection of mirna, and application thereof», опубл. 26.02.2014]. В данном методе микроРНК сначала подвергается подиаденилированию для удлинения первоначальной последовательности с использованием фермента поли-А-полимеразы. После чего она обратно транскрибируется с использованием S-Oligo(dT)-праймера. Праймер S-Oligo(dT) для количественного анализа микроРНК состоит из четырех сегментов: в направлении от 5' к 3' концам, от 14 до 20 нуклеотидов последовательности для связывания универсального обратного праймера для ПЦР, от 14 до 20 нуклеотидов последовательности для связывания универсального зонда, от 8 до 30 нуклеотидов последовательности олиго(dT), за которыми следуют от 3 до 8 специфических нуклеотидов, которые комплементарны 3'-концу исследуемой микроРНК. Недостатком данной разработки является необходимости предварительного полиаденилирования микроРНК, что увеличивает время и стоимость реакции. Также к недостаткам можно отнести короткую последовательность специфических нуклеотидов (3-8). Наличие подобной структуры может привести к недостаточной специфичности обратной транскрипции, а также низкой температуре отжига праймера, и, соответственно необходимости проведения процедуры обратной транскрипции в два этапа.It is known to develop a set of primers and probes for microRNA detection and subsequent quantitative analysis using real-time PCR, which is a set of oligonucleotides, including a primer for reverse transcription of microRNA S-oligo(dT) [Invention patent EP2700719A1 “Method and primers for detection of peace, and application thereof,” publ. 02/26/2014]. In this method, the miRNA is first subjected to podiadenylation to extend the original sequence using the enzyme poly-A polymerase. After which it is reverse transcribed using the S-Oligo(dT) primer. The S-Oligo(dT) primer for quantitative analysis of microRNA consists of four segments: in the direction from 5' to 3' ends, from 14 to 20 nucleotides of the sequence for binding the universal reverse primer for PCR, from 14 to 20 nucleotides of the sequence for binding the universal probe , from 8 to 30 nucleotides of the oligo(dT) sequence, followed by 3 to 8 specific nucleotides that are complementary to the 3' end of the microRNA under study. The disadvantage of this development is the need for preliminary polyadenylation of microRNA, which increases the time and cost of the reaction. Another disadvantage is the short sequence of specific nucleotides (3-8). The presence of such a structure can lead to insufficient specificity of reverse transcription, as well as a low temperature of primer annealing, and, accordingly, the need to carry out the reverse transcription procedure in two stages.
Также известна разработка представляющая собой набор олигонуклеотидов для анализа экспрессии микроРНК, представляющая собой набор праймеров для обратной транскрипции, а также прямого и обратного праймера для ПЦР в реальном времени [Патент на изобретение US20160177376A1 «Detection method of micro-rna with high specificity», опубл. 23.06.2016]. В данном методе методе микроРНК сначала подвергается подиаденилированию для удлинения первоначальной последовательности с использованием фермента поли-А-полимеразы. Далее проводится процедура обратной транскрипции с использованием праймера, содержащего последовательность, комплементарную поли-А-хвосту. Последующий анализ проводится с использованием прямого праймера, комплементарного последовательности исследуемой микроРНК и обратного праймера. Анализ проводится с использованием интеркалирующего красителя в режиме плавления. Недостатком данной разработки является необходимости предварительного полиаденилирования микроРНК, что увеличивает время и стоимость реакции. Также к недостаткам можно отнести, отсутствие последовательности, комплементарной последовательности исследуемой микроРНК в составе праймера для обратной транскрипции, что может привести к неспецифичному отжиге в ходе процедуры обратной транскрипции.Also known is a development that is a set of oligonucleotides for analyzing the expression of microRNA, which is a set of primers for reverse transcription, as well as forward and reverse primers for real-time PCR [Patent for invention US20160177376A1 “Detection method of micro-rna with high specificity”, publ. 06/23/2016]. In this method, the microRNA is first subjected to podiadenylation to extend the original sequence using the enzyme poly-A polymerase. Next, a reverse transcription procedure is carried out using a primer containing a sequence complementary to the poly-A tail. Subsequent analysis is carried out using a forward primer, a complementary sequence of the microRNA under study, and a reverse primer. The analysis is carried out using an intercalating dye in melting mode. The disadvantage of this development is the need for preliminary polyadenylation of microRNA, which increases the time and cost of the reaction. Disadvantages also include the lack of a sequence complementary to the sequence of the microRNA under study in the primer for reverse transcription, which can lead to nonspecific annealing during the reverse transcription procedure.
Наиболее близким техническим решением, выбранным в качестве прототипа, является способ количественного определения микроРНК методом ПЦР-РВ с использованием стебель-петля (stem-loop)-праймеров [Chen C, Ridzon DA, Broomer AJ, Zhou Z, Lee DH, Nguyen JT, Barbisin M, Xu NL, Mahuvakar VR, Andersen MR, Lao KQ, Livak KJ, Guegler KJ. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 2005 Nov 27;33(20):e179. doi: 10.1093/nar/gni178. PMID: 16314309; PMCID: PMC1292995.]. В данном методе используется праймер для обратной транскрипции типа стебель-петля, представляющий собой последовательность, комплементарную целевой микроРНК длиной 6 нуклеотидов и петлевой домен длиной до 44 нуклеотидов, формирующий шпилечную структуру ДНК, что удлиняет целевую микроРНК и делает возможным последующее проведение количественной ПЦР.The closest technical solution, chosen as a prototype, is a method for quantitative determination of microRNA by RT-PCR using stem-loop primers [Chen C, Ridzon DA, Broomer AJ, Zhou Z, Lee DH, Nguyen JT, Barbisin M, Xu NL, Mahuvakar VR, Andersen MR, Lao KQ, Livak KJ, Guegler KJ. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 2005 Nov 27;33(20):e179. doi: 10.1093/nar/gni178. PMID: 16314309; PMCID: PMC1292995.]. This method uses a stem-loop reverse transcription primer, which is a sequence complementary to the target microRNA 6 nucleotides long and a loop domain up to 44 nucleotides long, forming a hairpin DNA structure, which elongates the target microRNA and makes subsequent quantitative PCR possible.
Недостатком данного метода является короткий специфический микроРНК фрагмент диной всего 6 нуклеотидов, что может привести к неспецифичности отжига праймера. Также температура отжига специфичного участка варьирует в диапазоне от 10 до 18 градусов Цельсия, что приводит к необходиомти двухэтапной обратной транскрипции: отжиг праймеров при 12-18 градусах и обратная транскрипция при 40 градусах. Так как оптимум работы фермента MMLV-ревертазы приходится на 40 градусов Цельсия.The disadvantage of this method is a short microRNA-specific fragment of only 6 nucleotides, which can lead to nonspecific primer annealing. Also, the annealing temperature of a specific region varies in the range from 10 to 18 degrees Celsius, which leads to the need for two-stage reverse transcription: primer annealing at 12-18 degrees and reverse transcription at 40 degrees. Since the optimum operation of the enzyme MMLV-revertase occurs at 40 degrees Celsius.
Преимуществом нашего изобретения является увеличение комплементарного микроРНК фрагмента до 12 нуклеотидов (фрагменты, выделенные жирным шрифтом), что уменьшает вероятность неспецифического отжига праймеров. Также, преимуществом является повышение температуры отжига праймеров для обратной транскрипции до 38-40 градусов Цельсия, что позволяет провести отжиг праймеров и обратную транскрипцию в одну реакцию.The advantage of our invention is the increase in the complementary microRNA fragment to 12 nucleotides (fragments in bold), which reduces the likelihood of nonspecific annealing of primers. Also, an advantage is the increase in the annealing temperature of primers for reverse transcription to 38-40 degrees Celsius, which allows primer annealing and reverse transcription to be carried out in one reaction.
Технический результат изобретения заключается в повышении специфичности количественного анализа микроРНК, снижению временных затрат на проведение анализа. Таким образом, диагностика эпилепсии становится более точной и достоверной. При этом диагностика является дифференцированной и позволяет определить не только наличие эпилепсии, но и ее вид.The technical result of the invention is to increase the specificity of quantitative analysis of microRNA and reduce the time spent on analysis. Thus, the diagnosis of epilepsy becomes more accurate and reliable. At the same time, the diagnosis is differentiated and makes it possible to determine not only the presence of epilepsy, but also its type.
Технический результат изобретения достигается проведением процедуры обратной транскрипции с использованием входящих в набор stem-loop праймеров для получения комплементарных мирокРНК-134-5р, микроРНК-106b-5p, микроРНК-191 фрагментов ДНК. Новым является нуклеотидный состав синтетических олигонуклеотидов, входящих в состав stem-loop праймера, определяющий специфичность исследования таргетной микроРНК, а также сбалансированность по температурам отжига, находящихся в диапазоне 38-40 градусов Цельсия для проведения обратной транскрипции.The technical result of the invention is achieved by performing a reverse transcription procedure using the primers included in the stem-loop set to obtain complementary miRNA-134-5p, miRNA-106b-5p, miRNA-191 DNA fragments. What is new is the nucleotide composition of synthetic oligonucleotides included in the stem-loop primer, which determines the specificity of the target microRNA study, as well as the balance in annealing temperatures, which are in the range of 38-40 degrees Celsius for reverse transcription.
Анализ экспрессии проводится при помощи метода ПЦР в реальном времени с использованием разработанных прямого и обратного праймера, а также флуоресцентного зонда. Температуры отжига прямого и обратного праймеров для ПЦР находятся в диапазоне 58-60 градусов Цельсия, а также 65 градусов Цельсия для флуоресцентного зонда.Expression analysis is carried out using the real-time PCR method using developed forward and reverse primers, as well as a fluorescent probe. Annealing temperatures for forward and reverse PCR primers are in the range of 58-60 degrees Celsius, as well as 65 degrees Celsius for the fluorescent probe.
МикроРНК-191 является референсным геном, относительно которого анализируется экспрессия микроРНК 134-5р, микроРНК 106b-5р.MicroRNA-191 is the reference gene against which the expression of microRNA 134-5p and microRNA 106b-5p is analyzed.
После окончания проведения ПЦР в реальном времени считываются пороговые циклы для каждой микроРНК (cycle threshold - ct). Расчеты относительной экспрессии таргетных микроРНК проводятся с использованием метода delta ct [Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 2001 Dec;25(4):402-8. doi: 10.1006/meth.2001.1262. PMID: 11846609.], в ходе которого из порогового цикла таргетной микроРНК (микроРНК134-5р и микроРНК106b-5p) вычитается пороговый цикл референсного гена (микроРНК-191).After the completion of real-time PCR, the threshold cycles for each microRNA (cycle threshold - ct) are read. Calculations of the relative expression of target microRNAs are carried out using the delta ct method [Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 2001 Dec;25(4):402-8. doi: 10.1006/meth.2001.1262. PMID: 11846609.], during which the threshold cycle of the reference gene (microRNA-191) is subtracted from the threshold cycle of the target microRNA (microRNA134-5p and microRNA106b-5p).
Прописанные последовательности олигонуклеотидов получены путем анализа депонированных в базе данных MiRBase (https://mirbase.org) последовательностей микроРНК 134-5р, 106b-5р, и 191. Анализ полученных праймеров был проведен с использованием программного обеспечения PrimerSelect (https://bio.tools/primerselect). Температуры плавления были проанализированы с использованием программного обеспечения OligoCalc (http://biotools.nubic.northwestern.edu/OligoCalc.html).The prescribed oligonucleotide sequences were obtained by analyzing the microRNA 134-5p, 106b-5p, and 191 sequences deposited in the MiRBase database (https://mirbase.org). Analysis of the resulting primers was carried out using PrimerSelect software (https://bio.org). tools/primerselect). Melting points were analyzed using OligoCalc software (http://biotools.nubic.northwestern.edu/OligoCalc.html).
Полученные наборы состоят из четырех синтетических олигонуклеотидов каждый:The resulting sets consist of four synthetic oligonucleotides each:
Набор олигонуклеотидов для анализа экспрессии микроРНК-134-5р, состоящий из четырех синтетических последовательностей:A set of oligonucleotides for analyzing the expression of microRNA-134-5p, consisting of four synthetic sequences:
Праймер для обратной транскрипции типа стебель-петля (stem-loop):Primer for stem-loop reverse transcription:
CAGGCGATAGTCCGATGCATGCGCATGCATCGGACTATCGCCTGTT GGTGACTAGGTG CAGGCGATAGTCCGATGCATGCGCATGCATCGGACTATCGCCTGTT GGTGACTAGGTG
F-праймер для ПЦР:F-primer for PCR:
TCCTGTGGGCCACCTAGTCACTCCTGTGGGCCACCTAGTCAC
R-праймер для ПЦР:R-primer for PCR:
CGTACGTAGCCTGATAGCGGACCGTACGTAGCCTGATAGCGGAC
Зонд для ПЦР:PCR probe:
FAM CAACAGGCGATAGTCCGATGCATGC BHQ1.FAM CAACAGGCGATAGTCCGATGCATGC BHQ1.
2) Набор олигонуклеотидов для анализа экспрессии микроРНК-106b-5р, состоящий из четырех синтетических последовательностей:2) A set of oligonucleotides for analyzing the expression of microRNA-106b-5p, consisting of four synthetic sequences:
Праймер для обратной транскрипции типа стебель-петля (stem-loop):Primer for stem-loop reverse transcription:
CAGGCGATAGTCCGATGCATGCGCATGCATCGGACTATCGCCTGAT CTGCACTGTCAGCAGGCGATAGTCCGATGCATGCGCATGCATCGGACTATCGCCTGAT CTGCACTGTCAG
F-праймер для ПЦР:F-primer for PCR:
TGACAGTCGTGAAATAATGTATGTCTGACAGTCGTGAAATAATGTATGTC
R-праймер для ПЦР:R-primer for PCR:
CGTACGTAGCCTGATAGCGGACCGTACGTAGCCTGATAGCGGAC
Зонд для ПЦР:PCR probe:
FAM CAGATGTCGTATCCAGTGCGAATAC BHQ1.FAM CAGATGTCGTATCCAGTGCGAATAC BHQ1.
3) Набор олигонуклеотидов для анализа экспрессии микроРНК-191, состоящий из четырех синтетических последовательностей:3) A set of oligonucleotides for analyzing the expression of microRNA-191, consisting of four synthetic sequences:
Праймер для обратной транскрипции типа стебель-петля (stem-loop):Primer for stem-loop reverse transcription:
CAGGCGATAGTCCGATGCATGCGCATGCATCGGACTATCGCCTG GGGGACGAAATCCAGGCGATAGTCCGATGCATGCGCATGCATCGGACTATCGCCTG GGGGACGAAATC
F-праймер для ПЦР:F-primer for PCR:
GCTTTAGGTTCGCGTCCTGTGCTTTAGGTTCGCGTCCTGT
R-праймер для ПЦР:R-primer for PCR:
CGTACGTAGCCTGATAGCGGAC CGTACGTAGCCTGATAGCGGAC
Зонд для ПЦР:PCR probe:
FAM CCCCGTCGTATCCAGTGCGAATAC BHQ1.FAM CCCCGTCGTATCCAGTGCGAATAC BHQ1.
Осуществление способа. Анализ экспрессии микроРНК проводится следующим образом. Кровь из кубитальной вены (1 вакутейнер 4 мл) исследуемого субъекта центрифугируется в два этапа по стандартному протоколу [Zheng XH, Cui C, Zhou XX, Zeng YX, Jia WH. Centrifugation: an important pre-analytic procedure that influences plasma microRNA quantification during blood processing. Chin J Cancer. 2013 Dec;32(12):667-72.]. Следующим этапом проводится выделение тотальной РНК плазмы с использованием стандартных протоколов для выделения РНК методом аффинной сорбции на силика-частицах [Salvo-Chirnside E, Kane S, Kerr LE. Protocol: high throughput silica-based purification of RNA from Arabidopsis seedlings in a 96-well format. Plant Methods. 2011 Dec 2;7(1):40. doi: 10.1186/1746-4811-7-40. PMID: 22136293; PMCID: PMC3305896].Implementation of the method. MicroRNA expression analysis is carried out as follows. Blood from the cubital vein (1 vacutainer 4 ml) of the study subject is centrifuged in two stages according to a standard protocol [Zheng XH, Cui C, Zhou XX, Zeng YX, Jia WH. Centrifugation: an important pre-analytic procedure that influences plasma microRNA quantification during blood processing. Chin J Cancer. 2013 Dec;32(12):667-72]. The next step is the isolation of total plasma RNA using standard protocols for RNA isolation by affinity sorption on silica particles [Salvo-Chirnside E, Kane S, Kerr LE. Protocol: high throughput silica-based purification of RNA from Arabidopsis seedlings in a 96-well format. Plant Methods. 2011 Dec 2;7(1):40. doi:10.1186/1746-4811-7-40. PMID: 22136293; PMCID: PMC3305896].
Далее проводится процедура обратной транскрипции таргетных микроРНК, в ходе которой выделенная тотальная РНК плазмы инкубируется в буфере для обратной транскрипции, содержащем необходимую концентрацию ионов, смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов, дитиотретил, с добавлением разработанного stem-loop праймера и MMLV-ревертазы в течение 40-60 минут при температуре 40 градусов Цельсия. После этапа синтеза комплементарной ДНК (кДНК), пробирки с полученным раствором прогреваются до 70 градусов Цельсия в течении 10 минут, для денатурации ревертазы.Next, the procedure for reverse transcription of targeted microRNAs is carried out, during which the isolated total plasma RNA is incubated in a reverse transcription buffer containing the required ion concentration, a mixture of deoxynucleoside triphosphates, dithiothretyl, with the addition of a developed stem-loop primer and MMLV-revertase for 40-60 minutes at temperature 40 degrees Celsius. After the stage of complementary DNA (cDNA) synthesis, the tubes with the resulting solution are heated to 70 degrees Celsius for 10 minutes to denature the reversetase.
Анализ экспрессии проводится методом ПЦР в реальном времени. Полученная кДНК добавляется в стандартный буфер для ПЦР в реальном времени, содержащий ионы магния, dNTPS, ddH2O, в который также раскапываются разработанные прямой и обратный праймеры, а также флуоресцентный зонд для ПЦР. ПЦР проводится в режиме: 90 градусов Цельсия - 3 минуты - предварительный прогрев, а далее 40 циклов: 95 градусов Цельсия - 15 секунд - денатураций, 60 градусов Цельсия - 60 секунд - отжиг и элонгация.Expression analysis is carried out using real-time PCR. The resulting cDNA is added to a standard buffer for real-time PCR containing magnesium ions, dNTPS, ddH 2 O, into which the developed forward and reverse primers, as well as a fluorescent probe for PCR, are also added. PCR is carried out in the following mode: 90 degrees Celsius - 3 minutes - preheating, and then 40 cycles: 95 degrees Celsius - 15 seconds - denaturation, 60 degrees Celsius - 60 seconds - annealing and elongation.
Анализ экспрессии проводится с использованием стандартного метода delta-delta ct. После проведения ПЦР в реальном времени мы получаем параметр ct (пороговый цикл) для каждой мироРНК. Для получения параметра delta ct из параметра ct исследуемой микроРНК вычитается параметр ct референсного гена. В качестве референсного гена выступает микроРНК-191, т.к. она является одной из наиболее стабильных плазменных микроРНК [Donati, S.; Ciuffi, S.; Brandi, M.L. Human Circulating miRNAs Real-time qRT-PCR-based Analysis: An Overview of Endogenous Reference Genes Used for Data Normalization. Int. J. Mol. Sci. 2019, 20, 4353].Expression analysis is performed using the standard delta-delta ct method. After real-time PCR, we obtain the ct (threshold cycle) parameter for each miRNA. To obtain the delta ct parameter, the ct parameter of the reference gene is subtracted from the ct parameter of the microRNA under study. MicroRNA-191 acts as a reference gene, because it is one of the most stable plasma microRNAs [Donati, S.; Ciuffi, S.; Brandi, M. L. Human Circulating miRNAs Real-time qRT-PCR-based Analysis: An Overview of Endogenous Reference Genes Used for Data Normalization. Int. J. Mol. Sci. 2019, 20, 4353].
Delta- ct данные по каждой микроРНК для каждого пациента и здорового волонтера сравниваются с использованием критерия Манна-Уитни для определения наличия либо отсутствия статистически значимых различий. Для расчета де Delta-delta- ct, высчитывается среднее Delta- ct для когорты пациентов и когорты контроля, из среднего Delta- ct когорты пациентов отнимается среднее дельта ct когорты контроля. Расчет параметра Fold (кратность изменения) проводится по формуле: 2^delta-delta ct.Delta-ct data for each miRNA for each patient and healthy volunteer are compared using the Mann-Whitney test to determine the presence or absence of statistically significant differences. To calculate de Delta-ct, the average Delta-ct for the patient cohort and the control cohort is calculated, and the average delta-ct of the control cohort is subtracted from the average Delta-ct of the patient cohort. The Fold parameter is calculated using the formula: 2^delta-delta ct.
Изобретение поясняется чертежами.The invention is illustrated by drawings.
На фиг. 1 представлено сравнение экспрессии микроРНК hsa-miR-134-5p у пациентов с мезиальной височной эпилепсией и здоровых волонтеров, проведенное с использованием разработанного набора олигонуклеотидов.In fig. Figure 1 shows a comparison of the expression of microRNA hsa-miR-134-5p in patients with mesial temporal lobe epilepsy and healthy volunteers, carried out using the developed set of oligonucleotides.
Фиг. 1 демонстрирует дискриминацию группы пациентов с ВЭ от группы контроля по параметру delta-delta ct.Fig. Figure 1 demonstrates the discrimination of the group of patients with VE from the control group according to the delta-delta ct parameter.
Для сравнения двух независимых выборок использовался непараметрический критерий Манна-Уитни, расчетный р-критерий равнялся 0.0006, что говорит о значимости различий между выборками. Так как кратность изменения Fold более 1, и в данном случае равна = 14.01, это свидетельствует о значительном повышении экспрессии микроРНК hsa-miR-134-5p у группы пациентов с мезиальной височной эпилепсией по сравнению с группой контроля.To compare two independent samples, the nonparametric Mann-Whitney test was used; the calculated p-test was 0.0006, which indicates the significance of the differences between the samples. Since the fold change in Fold is more than 1, and in this case equals = 14.01, this indicates a significant increase in the expression of microRNA hsa-miR-134-5p in the group of patients with mesial temporal lobe epilepsy compared to the control group.
На Фиг. 1 изображены результаты анализа экспрессии микроРНК-134-5р: экспрессия микроРНК в контрольной группе здоровых волонтеров (I), экспрессия микроРНК в группе пациентов с мезиальной височной эпилепсией(II). Условные обозначения: 1 - 75-й процентиль; 2 - Медианное значение; 3 - 25-й процентиль. Первый квартиль (25-й процентиль) определяется как среднее число между наименьшим числом (минимумом) и значением, находящимся между 25-м и 75-м процентилями выборки (которое отсекает первую четверть всех выборок). Его также называют нижним квартилем, поскольку 25% данных находятся ниже этой точки.In FIG. Figure 1 shows the results of the analysis of microRNA-134-5p expression: microRNA expression in the control group of healthy volunteers (I), microRNA expression in the group of patients with mesial temporal lobe epilepsy (II). Legend: 1 - 75th percentile; 2 - Median value; 3 - 25th percentile. The first quartile (25th percentile) is defined as the average of the number between the smallest number (minimum) and the value between the 25th and 75th percentiles of the sample (which cuts off the first quarter of all samples). It is also called the lower quartile because 25% of the data falls below this point.
Второй квартиль (медианное значение) - это медиана набора данных; таким образом, 50% данных лежат ниже этой точки.The second quartile (median value) is the median of the data set; thus, 50% of the data lies below this point.
Третий квартиль (75-й процентиль) - это среднее значение между значением, отсекающим последнюю четверть выборок, и самым высоким значением (максимумом) набора данных. Он известен как верхний квартиль, поскольку 75% данных находятся ниже этой точки. Таким образом, на графике отображен массив значений экспрессии, полученной для каждой из двух исследуемых групп. Расстояния между различными частями ящика позволяют определить степень разброса данных в исследуемых группах.The third quartile (75th percentile) is the average value between the value cutting off the last quarter of the samples and the highest value (maximum) of the data set. It is known as the top quartile because 75% of the data falls below this point. Thus, the graph displays an array of expression values obtained for each of the two study groups. The distances between different parts of the box make it possible to determine the degree of scattering of data in the study groups.
В группе контроля (I) получены следующие численные значения: 1=1.3; 2=0.1; 3=-0.8.In the control group (I) the following numerical values were obtained: 1=1.3; 2=0.1; 3=-0.8.
В группе пациентов с мВЭ (II) получены следующие численные значения: 1=5.2; 2=1.7; 3=-0.4.In the group of patients with mVE (II), the following numerical values were obtained: 1=5.2; 2=1.7; 3=-0.4.
Полученные в ходе исследования данные свидетельствуют о возможности использования микроРНК hsa-miR-134-5p в качестве биомаркера мезиальной височной эпилепсии, что позволяет его использование в качестве средства дополнительной диагностики.The data obtained during the study indicate the possibility of using microRNA hsa-miR-134-5p as a biomarker of mesial temporal lobe epilepsy, which allows its use as an additional diagnostic tool.
Расчеты проводились с использованием Python numpy, seaborn, matplotlib.Calculations were carried out using Python numpy, seaborn, matplotlib.
На фиг. 2 представлено сравнение экспрессии микроРНК hsa-miR-106b-5p у пациентов с юношеской миоклонической эпилепсией и здоровых волонтеров, проведенное с использованием разработанного набора олигонуклеотидов, Фиг. 1 демонстрирует дискриминацию группы пациентов с ВЭ от группы контроля по параметру delta-delta ct.In fig. Figure 2 shows a comparison of the expression of microRNA hsa-miR-106b-5p in patients with juvenile myoclonic epilepsy and healthy volunteers, carried out using the developed set of oligonucleotides, FIG. Figure 1 demonstrates the discrimination of the group of patients with VE from the control group according to the delta-delta ct parameter.
Для сравнения двух независимых выборок использовался непараметрический критерий Манна-Уитни, расчетный р-критерий равнялся 0.025, что говорит о значимости различий между выборками. Fold = 3.03, что свидетельствует о значительном повышении экспрессии микроРНК hsa-miR-106b-5p у группы пациентов с мезиальной височной эпилепсией по сравнению с группой контроля. На Фиг. 1 изображены результаты анализа экспрессии микроРНК-106b-5p: экспрессия микроРНК в контрольной группе здоровых волонтеров (I), экспрессия микроРНК в группе пациентов с юношеской миоклонической эпилепсией (II). Условные обозначения: 1 - 75-й процентиль; 2 - Среднее значение; 3 - 25-й процентиль.To compare two independent samples, the nonparametric Mann-Whitney test was used; the calculated p-test was 0.025, which indicates the significance of the differences between the samples. Fold = 3.03, indicating a significant increase in the expression of microRNA hsa-miR-106b-5p in the group of patients with mesial temporal lobe epilepsy compared to the control group. In FIG. Figure 1 shows the results of the analysis of microRNA-106b-5p expression: microRNA expression in the control group of healthy volunteers (I), microRNA expression in the group of patients with juvenile myoclonic epilepsy (II). Legend: 1 - 75th percentile; 2 - Average value; 3 - 25th percentile.
В группе контроля (I) получены следующие численные значения: 1=0.8; 2=-0.1; 3=-0.8.In the control group (I) the following numerical values were obtained: 1=0.8; 2=-0.1; 3=-0.8.
В группе пациентов с ЮМЭ (II) получены следующие численные значения: 1=2.8; 2=0.9; 3=-1.In the group of patients with JME (II), the following numerical values were obtained: 1=2.8; 2=0.9; 3=-1.
Полученные в ходе исследования данные свидетельствуют о возможности использования микроРНК hsa-miR-106b-5p в качестве биомаркера юношеской миоклонической эпилепсии, что позволяет его использование в качестве средства дополнительной диагностики.The data obtained during the study indicate the possibility of using microRNA hsa-miR-106b-5p as a biomarker of juvenile myoclonic epilepsy, which allows its use as an additional diagnostic tool.
Расчеты проводились с использованием Python numpy, seaborn, matplotlib.Calculations were carried out using Python numpy, seaborn, matplotlib.
Пример 1. Исследовалась когорта пациентов с мезиальной височной эпилепсией (ВЭ), состоящая из 62 человек, со средним возрастом 36 лет (75%: 42.5; 50%: 36; 25%: 28.5), с 51.6% - женщин и 49.6% - мужчин, а также когорта здоровых волонтеров (Контроль), состоящая из 50 человек, со средним возрастом 31.06 лет (75%: 34.75; 50%: 27; 25%: 26), с 76% - женщин и 24 % - мужчин. Кровь из кубитальной вены (1 вакутейнер 4 мл) исследуемого субъекта центрифугируется в два этапа по стандартному протоколу. Следующим этапом проводится выделение тотальной РНК плазмы с использованием стандартных протоколов для выделения РНК методом аффинной сорбции на силика-частицах. Далее проводится процедура обратной транскрипции таргетных микроРНК, в ходе которой выделенная тотальная РНК плазмы инкубируется в буфере для обратной транскрипции, содержащего необходимую концентрацию ионов, смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов, дитиотретил, с добавлением разработанного stem-loop праймера для hsa-miR-134-5p, а также has-miR-191, использованный в качестве референсного гена и MMLV-ревертазы в течении 40-60 минут при температуре 40 градусов Цельсия. После этапа синтеза комплементарной ДНК (кДНК), пробирки с полученным раствором прогреваются до 70 градусов Цельсия в течении 10 минут, для денатурации ревертазы.Example 1. A cohort of patients with mesial temporal lobe epilepsy (TLE) was studied, consisting of 62 people, with a mean age of 36 years (75%: 42.5; 50%: 36; 25%: 28.5), with 51.6% women and 49.6% - men, as well as a cohort of healthy volunteers (Control), consisting of 50 people, with an average age of 31.06 years (75%: 34.75; 50%: 27; 25%: 26), with 76% women and 24% men. Blood from the cubital vein (1 vacutainer 4 ml) of the study subject is centrifuged in two stages according to a standard protocol. The next step is the isolation of total plasma RNA using standard protocols for RNA isolation by affinity sorption on silica particles. Next, the procedure for reverse transcription of targeted microRNAs is carried out, during which the isolated total plasma RNA is incubated in a reverse transcription buffer containing the required ion concentration, a mixture of deoxynucleoside triphosphates, dithiothretyl, with the addition of a developed stem-loop primer for hsa-miR-134-5p, as well as has-miR-191, used as a reference gene and MMLV reversease for 40-60 minutes at 40 degrees Celsius. After the stage of complementary DNA (cDNA) synthesis, the tubes with the resulting solution are heated to 70 degrees Celsius for 10 minutes to denature the reversetase.
Далее проводится ПЦР в реальном времени, для чего раствор, содержащий кДНК, раскапывается в стандартный буфер для ПЦР в реальном времени, содержащий Taq-полимеразу и ионы магния. В ПЦР-микс добавляются разработанные прямой и обратный праймеры, а также флуоресцентный зонд для ПЦР. ПЦР проводится в режиме: 90 градусов Цельсия - 3 минуты - предварительный прогрев, а далее 40 циклов: 95 градусов Цельсия - 15 секунд - денатурация, 60 градусов Цельсия - 60 секунд - отжиг и элонгация. Анализ экспрессии проводится методом delta-delta ct. Полученные результаты позволяют дискриминировать пациентов с височной эпилепсией от здорового контроля (Фиг. 1).Next, real-time PCR is carried out, for which the solution containing cDNA is dispensed into a standard real-time PCR buffer containing Taq polymerase and magnesium ions. The developed forward and reverse primers, as well as a fluorescent probe for PCR, are added to the PCR mix. PCR is carried out in the following mode: 90 degrees Celsius - 3 minutes - preheating, and then 40 cycles: 95 degrees Celsius - 15 seconds - denaturation, 60 degrees Celsius - 60 seconds - annealing and elongation. Expression analysis is carried out using the delta-delta ct method. The results obtained allow us to discriminate patients with temporal lobe epilepsy from healthy controls (Fig. 1).
Анализ экспрессии проводится с использованием стандартного метода delta-delta ct. Delta- ct данные по микроРНК-134-5р и микроРНК-191 для каждого пациента и здорового волонтера сравниваются с использованием критерия Манна-Уитни для определения наличия либо отсутствия статистически значимых различий. Для расчета де Delta-delta- ct, высчитывается среднее Delta- ct для когорты пациентов и когорты контроля, из среднего Delta- ct когорты пациентов отнимается среднее дельта ct когорты контроля. Расчет параметра Fold (кратность изменения) проводится по формуле: 2^delta-delta ct. И составляет 14.01.Expression analysis is performed using the standard delta-delta ct method. Delta-ct data for miR-134-5p and miR-191 for each patient and healthy volunteer are compared using the Mann-Whitney test to determine the presence or absence of statistically significant differences. To calculate de Delta-ct, the average Delta-ct for the patient cohort and the control cohort is calculated, and the average delta-ct of the control cohort is subtracted from the average Delta-ct of the patient cohort. The Fold parameter is calculated using the formula: 2^delta-delta ct. And it is 14.01.
Пример 2. Исследовалась когорта пациентов с юношеской миоклонической эпилепсией (ЮМЭ), состоящая из 47человек, со средним возрастом 28.04 (75%: 33; 50%: 26; 25%:20), с 68.08% - женщин и 31.9 % - мужчин, а также когорта здоровых волонтеров (Контроль), а также когорта здоровых волонтеров (Контроль), состоящая из 50 человек, со средним возрастом 31.06 лет (75%: 34.75; 50%: 27; 25%: 26), с 76% - женщин и 24 % - мужчин. Кровь из кубитальной вены исследуемого субъекта центрифугируется в два этапа Кровь из кубитальной вены (1 вакутейнер 4 мл) исследуемого субъекта центрифугируется в два этапа по стандартному протоколу. Следующий этапом проводится выделение тотальной РНК плазмы с использованием стандартных протоколов для выделения РНК методом аффинной сорбции на силика-частицах. Далее проводится процедура обратной транскрипции таргетных микроРНК, в ходе которой выделенная тотальная РНК плазмы инкубируется в буфере для обратной транскрипции, содержащего необходимую концентрацию ионов, смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов, дитиотретил, с добавлением разработанного stem-loop праймера для hsa-miR-106b-5p, а также has-miR-191, использованный в качестве референсного гена и MMLV-ревертазы в течении 40-60 минут при температуре 40 градусов Цельсия.Example 2. A cohort of patients with juvenile myoclonic epilepsy (JME) was studied, consisting of 47 people, with a mean age of 28.04 (75%: 33; 50%: 26; 25%: 20), with 68.08% women and 31.9% men, as well as a cohort of healthy volunteers (Control), as well as a cohort of healthy volunteers (Control), consisting of 50 people, with an average age of 31.06 years (75%: 34.75; 50%: 27; 25%: 26), with 76% women and 24% - men. Blood from the cubital vein of the study subject is centrifuged in two stages. Blood from the cubital vein (1 vacutainer 4 ml) of the study subject is centrifuged in two stages according to the standard protocol. The next step is the isolation of total plasma RNA using standard protocols for RNA isolation by affinity sorption on silica particles. Next, a reverse transcription procedure for targeted microRNAs is carried out, during which the isolated total plasma RNA is incubated in a reverse transcription buffer containing the required ion concentration, a mixture of deoxynucleoside triphosphates, dithiothretyl, with the addition of a developed stem-loop primer for hsa-miR-106b-5p, as well as has-miR-191, used as a reference gene and MMLV reversease for 40-60 minutes at 40 degrees Celsius.
Далее проводится ПЦР в реальном времени для чего раствор, содержащий к ДНК раскапывается в стандартный буфер для ПЦР в реальном времени, содержащий Taq-полимеразу и ионы магния. В ПЦР-микс добавляются разработанные прямой и обратный праймеры, а также флуоресцентный зонд для ПЦР. ПЦР проводится в режиме: 90 градусов Цельсия - 3 минуты - предварительный прогрев, а далее 40 циклов: 95 градусов Цельсия - 15 секунд - денатурация, 60 градусов Цельсия - 60 секунд - отжиг и элонгация. Анализ экспрессии проводится методом delta-delta ct. Полученные результаты позволяют дискриминировать пациентов с височной эпилепсией от здорового контроля (Фиг. 1).Next, real-time PCR is carried out, for which the solution containing DNA is dispensed into a standard real-time PCR buffer containing Taq polymerase and magnesium ions. The developed forward and reverse primers, as well as a fluorescent probe for PCR, are added to the PCR mix. PCR is carried out in the following mode: 90 degrees Celsius - 3 minutes - preheating, and then 40 cycles: 95 degrees Celsius - 15 seconds - denaturation, 60 degrees Celsius - 60 seconds - annealing and elongation. Expression analysis is carried out using the delta-delta ct method. The results obtained allow us to discriminate patients with temporal lobe epilepsy from healthy controls (Fig. 1).
Анализ экспрессии проводится с использованием стандартного метода delta-delta ct. Delta- ct данные по микроРНК-134-5р и микроРНК-191 для каждого пациента и здорового волонтера сравниваются с использованием критерия Манна-Уитни для определения наличия либо отсутствия статистически значимых различий. Для расчета де Delta-delta- ct, высчитывается среднее Delta- ct для когорты пациентов и когорты контроля, из среднего Delta- ct когорты пациентов отнимается среднее дельта ct когорты контроля. Расчет параметра Fold (кратность изменения) проводится по формуле: 2^delta-delta ct. И составляет: 3.803.Expression analysis is performed using the standard delta-delta ct method. Delta-ct data for miR-134-5p and miR-191 for each patient and healthy volunteer are compared using the Mann-Whitney test to determine the presence or absence of statistically significant differences. To calculate de Delta-ct, the average Delta-ct for the patient cohort and the control cohort is calculated, and the average delta-ct of the control cohort is subtracted from the average Delta-ct of the patient cohort. The Fold parameter is calculated using the formula: 2^delta-delta ct. And it is: 3.803.
--->--->
<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?><?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>
<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing <!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing
1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">
<ST26SequenceListing originalFreeTextLanguageCode="ru" <ST26SequenceListing originalFreeTextLanguageCode="en"
nonEnglishFreeTextLanguageCode="ru" dtdVersion="V1_3" nonEnglishFreeTextLanguageCode="ru" dtdVersion="V1_3"
fileName="Олигонуклеотиды для диагностики эпилепсии методом fileName="Oligonucleotides for diagnosing epilepsy using the
количественной ПЦР.xml" softwareName="WIPO Sequence" quantitative PCR.xml" softwareName="WIPO Sequence"
softwareVersion="2.3.0" productionDate="2023-12-19">softwareVersion="2.3.0" productionDate="2023-12-19">
<ApplicationIdentification><ApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode><IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText></ApplicationNumberText><ApplicationNumberText></ApplicationNumberText>
<FilingDate>2023-12-19</FilingDate><FilingDate>2023-12-19</FilingDate>
</ApplicationIdentification></ApplicationIdentification>
<ApplicantFileReference>1</ApplicantFileReference><ApplicantFileReference>1</ApplicantFileReference>
<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное <ApplicantName languageCode="ru">Federal state
бюджетное образовательное учреждение высшего образования budgetary educational institution of higher education
"Красноярский государственный медицинский университет им. проф. "Krasnoyarsk State Medical University named after. prof.
В.Ф. Войно-Ясенецкого" Министерства здравоохранения Российской V.F. Voino-Yasenetsky" Ministry of Health of the Russian
Федерации</ApplicantName>Federation</ApplicantName>
<ApplicantNameLatin>Federal State Budgetary Educational Institution <ApplicantNameLatin>Federal State Budgetary Educational Institution
of Higher Education "Prof. V.F. Voino-Yasenetsky Krasnoyarsk of Higher Education "Prof. V.F. Voino-Yasenetsky Krasnoyarsk
State Medical University" of Healthcare of the Russian State Medical University" of Healthcare of the Russian
Federation</ApplicantNameLatin>Federation</ApplicantNameLatin>
<InventorName languageCode="ru">Тимечко Елена <InventorName languageCode="ru">Timechko Elena
Евгеньевна</InventorName>Evgenievna</InventorName>
<InventorNameLatin>Timechko Elena Evgenyevna</InventorNameLatin><InventorNameLatin>Timechko Elena Evgenyevna</InventorNameLatin>
<InventionTitle languageCode="ru">Олигонуклеотиды для диагностики <InventionTitle languageCode="en">Oligonucleotides for diagnostics
эпилепсии методом количественной ПЦР</InventionTitle>epilepsy using quantitative PCR</InventionTitle>
<SequenceTotalQuantity>12</SequenceTotalQuantity><SequenceTotalQuantity>12</SequenceTotalQuantity>
<SequenceData sequenceIDNumber="1"><SequenceData sequenceIDNumber="1">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>58</INSDSeq_length><INSDSeq_length>58</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype><INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division><INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..58</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..58</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q2"> <INSDQualifier id="q2">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>caggcgatagtccgatgcatgcgcatgcatcggactatcgcctgttggt<INSDSeq_sequence>caggcgatagtccgatgcatgcgcatgcatcggactatcgcctgttggt
gactaggtg</INSDSeq_sequence>gactaggtg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="2"><SequenceData sequenceIDNumber="2">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length><INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype><INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division><INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q4"> <INSDQualifier id="q4">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tcctgtgggccacctagtcac</INSDSeq_sequence><INSDSeq_sequence>tcctgtgggccacctagtcac</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="3"><SequenceData sequenceIDNumber="3">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length><INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype><INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division><INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q6"> <INSDQualifier id="q6">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>cgtacgtagcctgatagcggac</INSDSeq_sequence><INSDSeq_sequence>cgtacgtagcctgatagcggac</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="4"><SequenceData sequenceIDNumber="4">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>25</INSDSeq_length><INSDSeq_length>25</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype><INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division><INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..25</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..25</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q8"> <INSDQualifier id="q8">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>modified_base</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>modified_base</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mod_base</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mod_base</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>OTHER</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>OTHER</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q9"> <INSDQualifier id="q9">
<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>6-Carboxyfluorescein</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>6-Carboxyfluorescein</INSDQualifier_value>
<NonEnglishQualifier_value>6-Карбоксифлуоресцеин</NonEnglishQua <NonEnglishQualifier_value>6-Carboxyfluorescein</NonEnglishQua
lifier_value>lifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>modified_base</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>modified_base</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>25</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>25</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mod_base</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mod_base</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>OTHER</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>OTHER</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q10"> <INSDQualifier id="q10">
<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Black Hole Quencher <INSDQualifier_value>Black Hole Quencher
1</INSDQualifier_value>1</INSDQualifier_value>
<NonEnglishQualifier_value>Black Hole Quencher <NonEnglishQualifier_value>Black Hole Quencher
1</NonEnglishQualifier_value>1</NonEnglishQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>caacaggcgatagtccgatgcatgc</INSDSeq_sequence><INSDSeq_sequence>caacaggcgatagtccgatgcatgc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="5"><SequenceData sequenceIDNumber="5">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>58</INSDSeq_length><INSDSeq_length>58</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype><INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division><INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..58</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..58</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q12"> <INSDQualifier id="q12">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>caggcgatagtccgatgcatgcgcatgcatcggactatcgcctgatctg<INSDSeq_sequence>caggcgatagtccgatgcatgcgcatgcatcggactatcgcctgatctg
cactgtcag</INSDSeq_sequence>cactgtcag</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="6"><SequenceData sequenceIDNumber="6">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>25</INSDSeq_length><INSDSeq_length>25</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype><INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division><INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..25</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..25</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q14"> <INSDQualifier id="q14">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tgacagtcgtgaaataatgtatgtc</INSDSeq_sequence><INSDSeq_sequence>tgacagtcgtgaaataatgtatgtc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="7"><SequenceData sequenceIDNumber="7">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length><INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype><INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division><INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q16"> <INSDQualifier id="q16">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>cgtacgtagcctgatagcggac</INSDSeq_sequence><INSDSeq_sequence>cgtacgtagcctgatagcggac</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="8"><SequenceData sequenceIDNumber="8">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>25</INSDSeq_length><INSDSeq_length>25</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype><INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division><INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..25</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..25</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q18"> <INSDQualifier id="q18">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>modified_base</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>modified_base</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mod_base</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mod_base</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>OTHER</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>OTHER</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q19"> <INSDQualifier id="q19">
<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>6-Carboxyfluorescein</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>6-Carboxyfluorescein</INSDQualifier_value>
<NonEnglishQualifier_value>6-Карбоксифлуоресцеин</NonEnglishQua <NonEnglishQualifier_value>6-Carboxyfluorescein</NonEnglishQua
lifier_value>lifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>modified_base</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>modified_base</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>25</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>25</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mod_base</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mod_base</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>OTHER</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>OTHER</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q20"> <INSDQualifier id="q20">
<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Black Hole Quencher <INSDQualifier_value>Black Hole Quencher
1</INSDQualifier_value>1</INSDQualifier_value>
<NonEnglishQualifier_value>Black Hole Quencher <NonEnglishQualifier_value>Black Hole Quencher
1</NonEnglishQualifier_value>1</NonEnglishQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>cagatgtcgtatccagtgcgaatac</INSDSeq_sequence><INSDSeq_sequence>cagatgtcgtatccagtgcgaatac</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="9"><SequenceData sequenceIDNumber="9">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>56</INSDSeq_length><INSDSeq_length>56</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype><INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division><INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..56</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..56</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q22"> <INSDQualifier id="q22">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>caggcgatagtccgatgcatgcgcatgcatcggactatcgcctggggga<INSDSeq_sequence>caggcgatagtccgatgcatgcgcatgcatcggactatcgcctggggga
cgaaatc</INSDSeq_sequence>cgaaatc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="10"><SequenceData sequenceIDNumber="10">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length><INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype><INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division><INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q24"> <INSDQualifier id="q24">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gctttaggttcgcgtcctgt</INSDSeq_sequence><INSDSeq_sequence>gctttaggttcgcgtcctgt</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="11"><SequenceData sequenceIDNumber="11">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length><INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype><INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division><INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q26"> <INSDQualifier id="q26">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>cgtacgtagcctgatagcggac</INSDSeq_sequence><INSDSeq_sequence>cgtacgtagcctgatagcggac</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="12"><SequenceData sequenceIDNumber="12">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>24</INSDSeq_length><INSDSeq_length>24</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype><INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division><INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..24</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..24</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q28"> <INSDQualifier id="q28">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>modified_base</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>modified_base</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mod_base</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mod_base</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>OTHER</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>OTHER</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q29"> <INSDQualifier id="q29">
<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>6-Carboxyfluorescein</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>6-Carboxyfluorescein</INSDQualifier_value>
<NonEnglishQualifier_value>6-Карбоксифлуоресцеин</NonEnglishQua <NonEnglishQualifier_value>6-Carboxyfluorescein</NonEnglishQua
lifier_value>lifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>modified_base</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>modified_base</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>24</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>24</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mod_base</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mod_base</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>OTHER</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>OTHER</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q30"> <INSDQualifier id="q30">
<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Black Hole Quencher <INSDQualifier_value>Black Hole Quencher
1</INSDQualifier_value>1</INSDQualifier_value>
<NonEnglishQualifier_value>Black Hole Quencher <NonEnglishQualifier_value>Black Hole Quencher
1</NonEnglishQualifier_value>1</NonEnglishQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ccccgtcgtatccagtgcgaatac</INSDSeq_sequence><INSDSeq_sequence>ccccgtcgtatccagtgcgaatac</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
</ST26SequenceListing></ST26SequenceListing>
<---<---
Claims (19)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2815113C1 true RU2815113C1 (en) | 2024-03-11 |
Family
ID=
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB201223244D0 (en) * | 2012-12-21 | 2013-02-06 | Ucb Pharma Gmbh | Micrornas as therapeutics and biomarkers for epilepsy |
| EP2700719A4 (en) * | 2011-04-20 | 2014-12-03 | Univ Shenzhen | METHOD AND PRIMERS FOR miRNA DETECTION AND THEIR APPLICATION |
| US20160177376A1 (en) * | 2011-03-08 | 2016-06-23 | Biovue Technology Ltd | Detection method of micro-rna with high specificity |
| RU2652967C1 (en) * | 2017-07-17 | 2018-05-03 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Детский научно-клинический центр инфекционных болезней Федерального медико-биологического агентства" | Method of prediction of the risk of development of symptomatic epilepsy in neuroinfections in children |
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20160177376A1 (en) * | 2011-03-08 | 2016-06-23 | Biovue Technology Ltd | Detection method of micro-rna with high specificity |
| EP2700719A4 (en) * | 2011-04-20 | 2014-12-03 | Univ Shenzhen | METHOD AND PRIMERS FOR miRNA DETECTION AND THEIR APPLICATION |
| GB201223244D0 (en) * | 2012-12-21 | 2013-02-06 | Ucb Pharma Gmbh | Micrornas as therapeutics and biomarkers for epilepsy |
| RU2652967C1 (en) * | 2017-07-17 | 2018-05-03 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Детский научно-клинический центр инфекционных болезней Федерального медико-биологического агентства" | Method of prediction of the risk of development of symptomatic epilepsy in neuroinfections in children |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Chen C., Ridzon D.A., Broomer A.J., Zhou Z., Lee D.H., Nguyen J.T., Barbisin M., Xu N.L., Mahuvakar V.R., Andersen M.R., Lao K.Q., Livak K.J., Guegler K.J. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 2005 Nov 27;33(20):e179. * |
| Livak K.J., Schmittgen T.D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 2001, 25(4):402-8. Donati S., Ciuffi S., Brandi M.L. Human Circulating miRNAs Real-time qRT-PCR-based Analysis: An Overview of Endogenous Reference Genes Used for Data Normalization. Int. J. Mol. Sci. 2019, 20, 4353. Vasilieva A.A., Timechko E.E., Lysova K.D., Paramonova A.I., Yakimov A.M., Kantimirova E.A., Dmitrenko D.V. MicroRNAs as Potential Biomarkers of Post-Traumatic Epileptogenesis: A Systematic Review. Int J Mol Sci. 19.10.2023, 24(20):15366. Yakimov A.M., Timechko E.E., Areshkina I.G., Usoltseva A.A., Yakovleva K.D., Kantimirova E.A., Utyashev N., Ivin N., Dmitrenko D.V. MicroRNAs as Biomarkers of Surgical Outcome in Mesial Temporal Lobe Epilepsy: A Systematic Review. Int J Mol Sci. 16.03.2023, 24(6):5694. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7252976B2 (en) | Quantitative RT-PCR to AC133 to diagnose cancer and monitor angiogenic activity in a cell sample | |
| Keller et al. | Can circulating miRNAs live up to the promise of being minimal invasive biomarkers in clinical settings? | |
| US12421542B2 (en) | Advanced Dumbell PCR for isomiR detection | |
| WO2007053491A2 (en) | Method and kit for evaluating rna quality | |
| Luo et al. | Design strategies and advanced applications of primer exchange reactions in biosensing: A review | |
| EP1930446A2 (en) | Method for obtaining information regarding quantity of DNA after non-methylated cytosine converting treatment in analysis of DNA methylation | |
| RU2815113C1 (en) | Oligonucleotides for diagnosing epilepsy by quantitative pcr | |
| US11639521B2 (en) | Method for determining the copy number of a tandem repeat sequence | |
| US12404546B2 (en) | Detection of methylation status of a DNA sample | |
| US11542559B2 (en) | Methylation-based biomarkers in breast cancer screening, diagnosis, or prognosis | |
| CA2568537C (en) | Method for quantitative and/or comparative measurement of mrna expression levels in small biological samples | |
| CN117187440A (en) | Composition, kit and detection method for detecting SARS-CoV-2 virus nucleic acid by isothermal amplification one-pot method based on Tttago | |
| KR102722089B1 (en) | Method for analyzing telomere length | |
| US20220372574A1 (en) | Method for determining global bisulfite conversion efficiency | |
| JP7335871B2 (en) | Multiplex detection of short nucleic acids | |
| CN101495649A (en) | Nucleic acid detection | |
| KR102486630B1 (en) | Method of detecting of target point mutations based on polymerase chain reaction | |
| US11913062B2 (en) | System and method for isolation and qualification of nucleic acids | |
| JP2025523920A (en) | Compositions, kits, uses of compositions, uses of kits and methods | |
| Sowndarya et al. | Basic Guide to Real Time PCR in the Current Scenario | |
| Barra et al. | B-212 Laboratory Performance in Molecular Detection of Mycobacterium tuberculosis Through Analysis of External Quality Assessment Program Results: WHO-Recommended Tests Outperform Others | |
| CN117187269A (en) | Internal reference sequence for quantitative detection of oligonucleotides in mice and application thereof | |
| HK40090888B (en) | Advanced dumbbell pcr for isomir detection | |
| HK40090888A (en) | Advanced dumbbell pcr for isomir detection | |
| CN120464786A (en) | A rapid detection system for specific SNP sites based on (RT)RPA-CRISPR/Cas12a, its construction method and application |