RU2815047C1 - Method of testing medicinal substances for belonging to substrates of polypeptide transporting organic anions 1b1 - Google Patents
Method of testing medicinal substances for belonging to substrates of polypeptide transporting organic anions 1b1 Download PDFInfo
- Publication number
- RU2815047C1 RU2815047C1 RU2023119583A RU2023119583A RU2815047C1 RU 2815047 C1 RU2815047 C1 RU 2815047C1 RU 2023119583 A RU2023119583 A RU 2023119583A RU 2023119583 A RU2023119583 A RU 2023119583A RU 2815047 C1 RU2815047 C1 RU 2815047C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- polypeptide
- organic anions
- concentration
- human embryonic
- embryonic kidney
- Prior art date
Links
- 239000000126 substance Substances 0.000 title claims abstract description 32
- 239000000758 substrate Substances 0.000 title claims abstract description 26
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 21
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 21
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 21
- 150000002891 organic anions Chemical class 0.000 title claims abstract description 20
- 238000010998 test method Methods 0.000 title abstract 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 43
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 23
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 19
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 claims abstract description 19
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims abstract description 14
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 claims abstract description 13
- 241001135569 Human adenovirus 5 Species 0.000 claims abstract description 10
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 claims abstract description 8
- 230000032258 transport Effects 0.000 claims abstract description 7
- 239000006163 transport media Substances 0.000 claims abstract description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 5
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 claims description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 abstract 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 10
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 4
- JKKFKPJIXZFSSB-UHFFFAOYSA-N 1,3,5(10)-estratrien-17-one 3-sulfate Natural products OS(=O)(=O)OC1=CC=C2C3CCC(C)(C(CC4)=O)C4C3CCC2=C1 JKKFKPJIXZFSSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FGLDCGQYLSYYMO-UHFFFAOYSA-N 4-ethyl-3-methyl-1h-pyridin-2-one Chemical compound CCC=1C=CNC(=O)C=1C FGLDCGQYLSYYMO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010013710 Drug interaction Diseases 0.000 description 3
- 101150018278 SLCO1B1 gene Proteins 0.000 description 3
- JKKFKPJIXZFSSB-CBZIJGRNSA-M estrone 3-sulfate(1-) Chemical compound [O-]S(=O)(=O)OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)(C(CC4)=O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JKKFKPJIXZFSSB-CBZIJGRNSA-M 0.000 description 3
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- XUKUURHRXDUEBC-KAYWLYCHSA-N Atorvastatin Chemical compound C=1C=CC=CC=1C1=C(C=2C=CC(F)=CC=2)N(CC[C@@H](O)C[C@@H](O)CC(O)=O)C(C(C)C)=C1C(=O)NC1=CC=CC=C1 XUKUURHRXDUEBC-KAYWLYCHSA-N 0.000 description 2
- XUKUURHRXDUEBC-UHFFFAOYSA-N Atorvastatin Natural products C=1C=CC=CC=1C1=C(C=2C=CC(F)=CC=2)N(CCC(O)CC(O)CC(O)=O)C(C(C)C)=C1C(=O)NC1=CC=CC=C1 XUKUURHRXDUEBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 2
- 101000836282 Mus musculus Solute carrier organic anion transporter family member 1C1 Proteins 0.000 description 2
- 108091006172 SLC21 Proteins 0.000 description 2
- 101150074837 Slco1b2 gene Proteins 0.000 description 2
- 102100027233 Solute carrier organic anion transporter family member 1B1 Human genes 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 229960005370 atorvastatin Drugs 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000008406 drug-drug interaction Effects 0.000 description 2
- RWTNPBWLLIMQHL-UHFFFAOYSA-N fexofenadine Chemical compound C1=CC(C(C)(C(O)=O)C)=CC=C1C(O)CCCN1CCC(C(O)(C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC=CC=2)CC1 RWTNPBWLLIMQHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960003592 fexofenadine Drugs 0.000 description 2
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- BRZYSWJRSDMWLG-DJWUNRQOSA-N (2r,3r,4r,5r)-2-[(1s,2s,3r,4s,6r)-4,6-diamino-3-[(2s,3r,4r,5s,6r)-3-amino-4,5-dihydroxy-6-[(1r)-1-hydroxyethyl]oxan-2-yl]oxy-2-hydroxycyclohexyl]oxy-5-methyl-4-(methylamino)oxane-3,5-diol Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]([C@@H](C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-DJWUNRQOSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 101150066002 GFP gene Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 229940121710 HMGCoA reductase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 108010089503 Organic Anion Transporters Proteins 0.000 description 1
- 102000007990 Organic Anion Transporters Human genes 0.000 description 1
- NCDNCNXCDXHOMX-UHFFFAOYSA-N Ritonavir Natural products C=1C=CC=CC=1CC(NC(=O)OCC=1SC=NC=1)C(O)CC(CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)N(C)CC1=CSC(C(C)C)=N1 NCDNCNXCDXHOMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010063829 Solute Carrier Organic Anion Transporter Family Member 1B3 Proteins 0.000 description 1
- 102100027239 Solute carrier organic anion transporter family member 1B3 Human genes 0.000 description 1
- 239000003613 bile acid Substances 0.000 description 1
- 239000003858 bile acid conjugate Substances 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- SEERZIQQUAZTOL-ANMDKAQQSA-N cerivastatin Chemical compound COCC1=C(C(C)C)N=C(C(C)C)C(\C=C\[C@@H](O)C[C@@H](O)CC(O)=O)=C1C1=CC=C(F)C=C1 SEERZIQQUAZTOL-ANMDKAQQSA-N 0.000 description 1
- 229960005110 cerivastatin Drugs 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 238000000589 high-performance liquid chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000010874 in vitro model Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229960002797 pitavastatin Drugs 0.000 description 1
- VGYFMXBACGZSIL-MCBHFWOFSA-N pitavastatin Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)\C=C\C1=C(C2CC2)N=C2C=CC=CC2=C1C1=CC=C(F)C=C1 VGYFMXBACGZSIL-MCBHFWOFSA-N 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 229960000311 ritonavir Drugs 0.000 description 1
- NCDNCNXCDXHOMX-XGKFQTDJSA-N ritonavir Chemical compound N([C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C[C@H](O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)OCC=1SC=NC=1)CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N(C)CC1=CSC(C(C)C)=N1 NCDNCNXCDXHOMX-XGKFQTDJSA-N 0.000 description 1
- 229960001852 saquinavir Drugs 0.000 description 1
- QWAXKHKRTORLEM-UGJKXSETSA-N saquinavir Chemical compound C([C@@H]([C@H](O)CN1C[C@H]2CCCC[C@H]2C[C@H]1C(=O)NC(C)(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)C=1N=C2C=CC=CC2=CC=1)C1=CC=CC=C1 QWAXKHKRTORLEM-UGJKXSETSA-N 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- XWLXKKNPFMNSFA-HGQWONQESA-N simvastatin hydroxy acid Chemical compound C1=C[C@H](C)[C@H](CC[C@@H](O)C[C@@H](O)CC(O)=O)[C@H]2[C@@H](OC(=O)C(C)(C)CC)C[C@@H](C)C=C21 XWLXKKNPFMNSFA-HGQWONQESA-N 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Abstract
Description
Изобретение относится к фармакологии и может быть использовано для тестирования лекарственных веществ на принадлежность к субстратам полипептида, транспортирующего органические анионы 1В1 (organic anion-transporting polypeptides 1В1, ОАТР1В1), кодируемого геном SLCO1B1.The invention relates to pharmacology and can be used for testing medicinal substances for belonging to substrates of the polypeptide transporting organic anions 1B1 (organic anion-transporting polypeptides 1B1, OATP1B1), encoded by the SLCO1B1 gene.
Разработанный способ можно рекомендовать для изучения фармакокинетики лекарственных веществ и прогнозирования развития межлекарственных взаимодействий на уровне данного белка-транспортера.The developed method can be recommended for studying the pharmacokinetics of drugs and predicting the development of drug-drug interactions at the level of a given transporter protein.
Уровень техникиState of the art
В качестве модели in vivo для тестирования новых лекарственных препаратов на принадлежность к субстратам, индукторам и ингибиторам ОАТР1В1 были предложены мыши с нокаутом по гену Oatp1b2, имеющим сходство по локализации, структуре и субстратной специфичности с ОАТР1В1 и ОАТР1В3. Степень гомологии с ОАТР1В1 составляет 65%, и модель хорошо себя показала при исследованиях поглощения известных субстратов ОАТР1В. Однако возможны межвидовые отличия, например, нокаут гена не влиял на соотношение концентраций церивастатина и симвастатиновой кислоты в печени и плазме животных, что может указывать на разницу в субстратной специфичности и требует дальнейшего изучения [Chen, C., Stock, J. L., Liu, X., Shi, J., Van Deusen, J. W., et al. (2008) Utility of a novel Oatplb2 knockout mouse model for evaluating the role of Oatp1b2 in the hepatic uptake of model compounds, Drug Metab Dispos, 36, 1840-5, doi: 10.1124/dmd.108.020594]. Кроме того, на уровне целого организма сложнее оценить вклад взаимодействия препарата с конкретным транспортером из-за большого числа других факторов, и, как правило, модели in vivo и in vitro дополняют друг друга. Mice with a knockout of the Oatp1b2 gene, which is similar in localization, structure and substrate specificity to OATP1B1 and OATP1B3, were proposed as an in vivo model for testing new drugs for being substrates, inducers and inhibitors of OATP1B1. The homology to OATP1B1 is 65% and the model has performed well in uptake studies of known OATP1B substrates. However, interspecific differences are possible, for example, gene knockout did not affect the ratio of concentrations of cerivastatin and simvastatin acid in the liver and plasma of animals, which may indicate a difference in substrate specificity and requires further study [Chen, C., Stock, JL, Liu, X. , Shi, J., Van Deusen, J. W., et al. (2008) Utility of a novel Oatplb2 knockout mouse model for evaluating the role of Oatp1b2 in the hepatic uptake of model compounds, Drug Metab Dispos , 36 , 1840-5, doi: 10.1124/dmd.108.020594]. Additionally, at the whole-organism level, it is more difficult to assess the contribution of drug interactions with a specific transporter due to the large number of other factors involved, and in vivo and in vitro models tend to be complementary.
Согласно международным рекомендациям управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (The U.S. Food and Drug Administration, FDA), Европейского агентства по лекарственным средствам (European Medicines Agency, EMA) и Международного консорциума по транспортерам (The International Transporter Consortium, ITC) тестирование лекарственных веществ на принадлежность к субстратам ОАТР1В1 проводят на первичных гепатоцитах или клеточных линиях гепатоцитарного происхождения. Однако клеточные линии гепатоцитарного происхождения обычно экспрессируют сразу несколько транспортеров, что затрудняет проведение анализа [Hirano, M., Maeda, K., Shitara, Y., Sugiyama, Y. (2004) Contribution of OATP2 (OATP1B1) and OATP8 (OATP1B3) to the Hepatic Uptake of Pitavastatin in Humans, J Pharmacol Exp Ther, 311, 139–46, doi: 10.1124/jpet.104.068056; Sudsakorn, S., Bahadduri, P., Fretland, J., Lu, C. (2020) 2020 FDA Drug-drug Interaction Guidance: A Comparison Analysis and Action Plan by Pharmaceutical Industrial Scientists, Curr Drug Metab, 6, 403-426, doi: 10.2174/1389200221666200620210522.; Drug interaction studies, 2022 https://www.ema.europa.eu/en/documents/scientific-guideline/draft-ich-guideline-m12-drug-interaction-studies-step-2b_en.pdf].According to international recommendations of the US Food and Drug Administration (FDA), European Medicines Agency (EMA) and The International Transporter Consortium (ITC) testing of medicinal substances for belonging to OATP1B1 substrates is carried out on primary hepatocytes or cell lines of hepatocyte origin. However, cell lines of hepatocyte origin usually express multiple transporters, making analysis difficult [Hirano, M., Maeda, K., Shitara, Y., Sugiyama, Y. (2004) Contribution of OATP2 (OATP1B1) and OATP8 (OATP1B3) to the Hepatic Uptake of Pitavastatin in Humans, J Pharmacol Exp Ther , 311 , 139–46, doi: 10.1124/jpet.104.068056; Sudsakorn, S., Bahadduri, P., Fretland, J., Lu, C. (2020) 2020 FDA Drug-Drug Interaction Guidance: A Comparison Analysis and Action Plan by Pharmaceutical Industrial Scientists, Curr Drug Metab, 6 , 403-426 , doi: 10.2174/1389200221666200620210522. ; Drug interaction studies, 2022 https://www.ema.europa.eu/en/documents/scientific-guideline/draft-ich-guideline-m12-drug-interaction-studies-step-2b_en.pdf].
В ряде работ использовались клеточные линии, селективно гиперэкспрессирующие ОАТР1В1 [Zhang X, Scialis RJ, Feng B, Leach K. Detection of statin cytotoxicity is increased in cells expressing the OATP1B1 transporter. Toxicol Sci. 2013 Jul;134(1):73-82. doi: 10.1093/toxsci/kft085. Epub 2013 Apr 5. PMID: 23564645; Shitara Y, Takeuchi K, Horie T. Long-lasting inhibitory effects of saquinavir and ritonavir on OATP1B1-mediated uptake. J Pharm Sci. 2013 Sep;102(9):3427-35. doi: 10.1002/jps.23477. Epub 2013 Feb 25. PMID: 23440887; Suga T, Yamaguchi H, Sato T, Maekawa M, Goto J, Mano N. Preference of Conjugated Bile Acids over Unconjugated Bile Acids as Substrates for OATP1B1 and OATP1B3. PLoS One. 2017 Jan 6;12(1):e0169719. doi: 10.1371/journal.pone.0169719. PMID: 28060902; PMCID: PMC5218478], однако в данных исследованиях использовался ОАТР1В1, не связанный с зеленым флуоресцентным белком (GFP), что затрудняет контроль экспрессии ОАТР1В1 в клетках, а также сильно варьировали сроки инкубации и концентрации тестируемых субстратов. Также не использовался четкий критерий оценки принадлежности лекарственных веществ к субстратам ОАТР1В1, то есть во сколько раз должен усиливаться транспорт вещества под действием ОАТР1В1, если вещество является его субстратом.A number of studies have used cell lines that selectively overexpress OATP1B1 [Zhang X, Scialis RJ, Feng B, Leach K. Detection of statin cytotoxicity is increased in cells expressing the OATP1B1 transporter. Toxicol Sci. 2013 Jul;134(1):73-82. doi: 10.1093/toxsci/kft085. Epub 2013 Apr 5. PMID: 23564645; Shitara Y, Takeuchi K, Horie T. Long-lasting inhibitory effects of saquinavir and ritonavir on OATP1B1-mediated uptake. J Pharm Sci. 2013 Sep;102(9):3427-35. doi: 10.1002/jps.23477. Epub 2013 Feb 25. PMID: 23440887; Suga T, Yamaguchi H, Sato T, Maekawa M, Goto J, Mano N. Preference of Conjugated Bile Acids over Unconjugated Bile Acids as Substrates for OATP1B1 and OATP1B3. PLoS One. 2017 Jan 6;12(1):e0169719. doi: 10.1371/journal.pone.0169719. PMID: 28060902; PMCID: PMC5218478], however, these studies used OATP1B1 that is not associated with green fluorescent protein (GFP), which makes it difficult to control OATP1B1 expression in cells, and the incubation times and concentrations of the tested substrates varied greatly. Also, no clear criterion was used to assess whether drugs belong to OATP1B1 substrates, that is, how many times should the transport of a substance increase under the influence of OATP1B1 if the substance is its substrate.
Техническим результатом изобретения является разработка доступного и эффективного способа оценки принадлежности лекарственных веществ к субстратам полипептида, транспортирующего органические анионы 1B1 (ОАТР1В1). The technical result of the invention is the development of an accessible and effective method for assessing the identity of medicinal substances as substrates of the polypeptide transporting organic anions 1B1 (OATP1B1).
Изобретение заключается в сравнении проникновения тестируемых веществ в клетки эмбриональной почки человека, трансформированных аденовирусом 5 типа, вариант 293 (Human embryonic kidney 293 cells, HEK293) и клетки эмбриональной почки человека трансформированных аденовирусом 5 типа, вариант 293, которые были дополнительно трансфицированы геном, кодирующим полипептид, транспортирующий органические анионы 1B1, искусственно сцепленный с зеленым флуоресцентным белком (GFP), и гиперэкспрессирующие данный полипептид (HEK293-OATP1B1), в концентрации 1 мкМ и длительностью эксперимента 5 мин. Если концентрация тестируемого вещества в лизате клеток HEK293-OATP1B1 более чем в 2 раза превышает концентрацию в лизате клеток HEK293, делается вывод о том, что тестируемое вещество является субстратом ОАТР1В1.The invention consists in comparing the penetration of test substances into human embryonic kidney cells transformed with adenovirus type 5, variant 293 (Human embryonic kidney 293 cells, HEK293) and human embryonic kidney cells transformed with adenovirus type 5, variant 293, which were additionally transfected with a gene encoding a polypeptide that transports organic anions 1B1, artificially linked to green fluorescent protein (GFP), and overexpressing this polypeptide (HEK293-OATP1B1), in concentration 1 µM and experiment duration 5 min. If the concentration of the test substance in the HEK293-OATP1B1 cell lysate is more than 2 times the concentration in the HEK293 cell lysate, the test substance is concluded to be an OATP1B1 substrate.
Для этого:For this:
- используются трансфицированные геном, кодирующим полипептид, транспортирующий органические анионы 1B1, клетки эмбриональной почки человека, трансформированные аденовирусом 5 типа, вариант 293 (HEK293-OATP1B1); - transfected with the gene encoding the polypeptide transporting organic anions 1B1, human embryonic kidney cells transformed with adenovirus type 5, variant 293 (HEK293-OATP1B1) are used;
- полипептид, транспортирующий органические анионы 1B1 искусственно сцеплен с зеленым флуоресцентным белком (GFP), что позволяет постоянно контролировать его экспрессию в клетках; - polypeptide transporting organic anions 1B1 is artificially linked to green fluorescent protein (GFP), which allows constant control of its expression in cells;
- тестируемые вещества используются в концентрации 1 мкМ; - test substances are used in a concentration of 1 µM;
- длительность транспортного эксперимента составляет 5 мин;- the duration of the transport experiment is 5 minutes;
- концентрация тестируемого вещества в лизате клеток HEK293-OATP1B1 должна быть выше его концентрации в лизате клеток HEK293 в 2 и более раз, тогда делается вывод о том, что тестируемое вещество является субстратом полипептида, транспортирующего органические анионы 1B1.- the concentration of the test substance in the lysate of HEK293-OATP1B1 cells must be 2 or more times higher than its concentration in the lysate of HEK293 cells, then it is concluded that the test substance is a substrate of the polypeptide transporting organic anions 1B1.
Осуществление изобретенияCarrying out the invention
На первом этапе создавалась клеточная линия НЕК293-ОАТР1В1 - клетки эмбриональной почки человека, трансформированные аденовирусом 5 типа, вариант 293, которые были дополнительно трансфицированы геном, кодирующим полипептид, транспортирующий органические анионы 1B1. При этом к полипептиду, транспортирующему органические анионы 1B1, к С-концу присоединялся зеленый флуоресцентный белок (GFP). At the first stage, the HEK293-OATP1B1 cell line was created - human embryonic kidney cells transformed with adenovirus type 5, variant 293, which were additionally transfected with a gene encoding a polypeptide transporting organic anions 1B1. In this case, green fluorescent protein (GFP) was attached to the C-terminus of the polypeptide transporting organic anions 1B1.
Получение плазмиды с геном, кодирующим полипептид, транспортирующий органические анионы 1B1, сцепленный на С-конце с зеленым флуоресцентным белком (pEGFP-SLCO1B1). Preparation of a plasmid with a gene encoding a polypeptide transporting organic anions 1B1 linked at the C-terminus to green fluorescent protein ( pEGFP-SLCO1B1 ).
Ген SLCO1B1, кодирующий полипептид, транспортирующий органические анионы 1B1 (Gene ID:10599, NCBI Reference Sequence: NM_006446.5) был получен путем синтеза и клонирован в линеаризованный по сайтам XhoI и HindIII вектор pEGFP-N1 («Clontech»), путем безлигазного клонирования с T4 ДНК-полимеразой, в результате чего была получена плазмида pEGFP-SLCO1B1. Адекватность последовательности клонированного гена проверялось секвенированием. Целевой ген клонирован в вектор в одной рамке считывания с геном, кодирующим зеленый флуоресцентный белок (GFP) на С-конце. Поскольку ген GFP находится в той же рамке считывания, что и целевой ген SLCO1B1, флуоресценция в трансфицированной клетке указывает на экспрессию полипептида, транспортирующего органические анионы 1B1 (ОАТР1В1).The SLCO1B1 gene encoding the organic anion transport polypeptide 1B1 (Gene ID:10599, NCBI Reference Sequence: NM_006446.5) was obtained by synthesis and cloned into the vector pEGFP-N1 (Clontech), linearized at the XhoI and HindIII sites, by ligase-free cloning with T4 DNA polymerase, resulting in the plasmid pEGFP-SLCO1B1. The adequacy of the sequence of the cloned gene was verified by sequencing. The target gene is cloned into the vector in the same reading frame with the gene encoding green fluorescent protein (GFP) at the C-terminus. Because the GFP gene is in the same reading frame as the target geneSLCO1B1, fluorescence in the transfected cell indicates the expression of organic anion transporting polypeptide 1B1 (OATP1B1).
Трансфекция клеток HEK293 (клетки эмбриональной почки человека, трансформированных аденовирусом 5 типа, вариант 293)Transfection of HEK293 cells (human embryonic kidney cells transformed with adenovirus type 5, variant 293)
Клетки линии НЕК293 высевались в 96-луночный планшет в количестве 104 клеток на лунку планшета. По достижении 70% конфлюентности клетки подвергались трансфекции плазмидой pEGFP-SLCO1B1 методом липофекции с использованием реагента Lipofectamine 3000 Reagent («Invitrogen», США). Все манипуляции производились в соответствии с инструкцией производителя. Через 48 часов экспрессию GFP оценивали с помощью флуоресцентного микроскопа Olympus СКХ53 («Olympus», Япония). Для получения стабильных клонов HEK293-ОАТР1В1, экспрессирующих ОАТР1В1, проводили селекцию с использованием антибиотика G-418 («Promega», США) в концентрации 500 мкг/мл. Было отобрано четыре стабильных клона, которые в свою очередь подвергли клональной селекции методом предельных разведений. Через две недели культивирования клоны с сохраненной флуоресценцией перестали получать антибиотик и подверглись вторичному клонированию. Целевые клоны отбирали по интенсивности флуоресценции, размножали и использовали для дальнейшей работы.HEK293 cells were seeded into a 96-well plate at a rate of 10 4 cells per well of the plate. Upon reaching 70% confluence, the cells were transfected with the pEGFP-SLCO1B1 plasmid by lipofection using Lipofectamine 3000 Reagent (Invitrogen, USA). All manipulations were carried out in accordance with the manufacturer's instructions. After 48 hours, GFP expression was assessed using an Olympus SKX53 fluorescence microscope (Olympus, Japan). To obtain stable HEK293-OATP1B1 clones expressing OATP1B1, selection was performed using the antibiotic G-418 (Promega, USA) at a concentration of 500 μg/ml. Four stable clones were selected, which in turn were subjected to clonal selection using the limiting dilution method. After two weeks of cultivation, clones with preserved fluorescence stopped receiving the antibiotic and underwent secondary cloning. Target clones were selected based on fluorescence intensity, multiplied, and used for further work.
Экспрессия гена SLCO1B1 в полученной клеточной линии HEK293-ОАТР1В1, была подтверждена методом ПЦР в реальном времени. Синтез белка ОАТР1В1 в полученной клеточной линии HEK293-SLCO1B1 был подтвержден методом вестерн-блот, (OATP2 Polyclonal Antibody, «Invitrogen», США, в разведении 1:2000; Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, HRP, «Invitrogen», США).The expression of the SLCO1B1 gene in the resulting HEK293-OATP1B1 cell line was confirmed by real-time PCR. The synthesis of the OATP1B1 protein in the resulting HEK293-SLCO1B1 cell line was confirmed by Western blot (OATP2 Polyclonal Antibody, Invitrogen, USA, diluted 1:2000; Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, HRP, Invitrogen, USA).
Если в процессе культивирования полученной клеточной линии HEK293-ОАТР1В1, клетки теряли флуоресценцию, это свидетельствовало о снижении экспрессии OATP1B1, что было подтверждено методом ПЦР и вестерн-блот.If during the cultivation of the resulting HEK293-OATP1B1 cell line, the cells lost fluorescence, this indicated a decrease in OATP1B1 expression, which was confirmed by PCR and Western blot.
Оценку принадлежности лекарственных веществ к субстратам ОАТР1В1 оценивали следующим образом.The identification of medicinal substances as OATP1B1 substrates was assessed as follows.
Клетки линии НЕК293 и полученные рекомбинантные клетки HEK293-ОАТР1В1, обладающие интенсивной флуоресценцией за счет GFP, культивировали в Дульбекко-модифицированной среде Игла («ПанЭко», Россия) с высоким содержанием глюкозы (4,5 г/л) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки («Sigma-Aldrich», Германия) и 2 мМ L-глутамина («Sigma-Aldrich», Германия) при 37 °C и 5% содержании СО2 в инкубаторе WS-189C («World Science», Южная Корея) в 24 луночных планшетах до достижения монослоя. Каждый эксперимент выполнялся в трёх повторах. Cells of the HEK293 line and the resulting recombinant HEK293-OATP1B1 cells, which have intense fluorescence due to GFP, were cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium (PanEco, Russia) with a high glucose content (4.5 g/l) with the addition of 10% fetal bovine serum (Sigma-Aldrich, Germany) and 2 mM L-glutamine (Sigma-Aldrich, Germany) at 37 °C and 5% CO 2 in a WS-189C incubator (World Science, South Korea) in 24 well plates until a monolayer is reached. Each experiment was performed in triplicate.
Экспрессию ОАТР1В1 в клетках HEK293-ОАТР1В1 оценивали по зеленой флуоресценции за счет наличия зеленого флуоресцентного белка (GFP).OATP1B1 expression in HEK293-OATP1B1 cells was assessed by green fluorescence due to the presence of green fluorescent protein (GFP).
Непосредственно перед проведением транспортного эксперимента клетки однократно промывали нагретой до 37 °C транспортной средой, представляющей собой сбалансированный солевой раствор Хэнкса («Sigma-Aldrich», Германия), с содержанием буфера хепес 25 мМ с рН=7,4 («Sigma-Aldrich», Германия) и 1% диметилсульфоксида («ПанЭко», Россия)). Затем к клеткам добавляли ту же транспортную среду, содержащую тестируемое вещество в конечной концентрации 1 мкМ. Immediately before the transport experiment, the cells were washed once with a transport medium heated to 37 °C, which was Hanks' balanced salt solution (Sigma-Aldrich, Germany), containing 25 mM Hepes buffer with pH = 7.4 (Sigma-Aldrich , Germany) and 1% dimethyl sulfoxide (PanEko, Russia)). The same transport medium containing the test substance at a final concentration of 1 μM was then added to the cells.
Клетки инкубировали с транспортной средой, содержащей тестируемое вещество, в течение 5 минут. Реакцию останавливали удалением транспортной среды, содержащей тестируемое вещество, и немедленной промывкой клеток 500 мкл охлажденной транспортной средой. После этого клетки трижды промывали 500 мкл холодного фосфатного буфера («ПанЭко», Россия). Лизис клеток осуществляли трёхкратным циклом замораживания-размораживания (клетки замораживали при -80 °C, затем размораживали при комнатной температуре). Концентрацию общего белка в пробах анализировали по методу Бредфорд с помощью коммерческого набора Pierce Coomassie Plus Bradford Assay Kit («ThermoFisher», США). The cells were incubated with transport medium containing the test substance for 5 minutes. The reaction was stopped by removing the transport medium containing the test substance and immediately washing the cells with 500 μl of chilled transport medium. After this, the cells were washed three times with 500 μl of cold phosphate buffer (PanEko, Russia). Cell lysis was carried out by a three-time freeze-thaw cycle (cells were frozen at -80°C and then thawed at room temperature). The concentration of total protein in the samples was analyzed according to the Bradford method using a commercial Pierce Coomassie Plus Bradford Assay Kit (ThermoFisher, USA).
Концентрацию тестируемого вещества в лизате клеток оценивают методом ВЭЖХ-МС/МС. Оценивают концентрацию тестируемого вещества в лизате клеток HEK293 и HEK293-ОАТР1В1.The concentration of the test substance in the cell lysate is assessed by HPLC-MS/MS. The concentration of the test substance in the lysate of HEK293 and HEK293-OATP1B1 cells is assessed.
Для подтверждения работы способа тестировались известные субстраты.To confirm the operation of the method, known substrates were tested.
Оценивали проникновение эстрон-3-сультфата – известного субстрата ОАТР1В1 в концентрации 1 мкМ внутрь клеток HEK293 и HEK293-OATP1B1 в течение 5 мин инкубации. Концентрация эстрон-3-сультфата в лизате клеток HEK293-OATP1B1 составила 12,01 пМ/мг белка, в лизате клеток HEK293 - 5,9 пМ/мг белка. Концентрация эстрон-3-сультфата в HEK293-OATP1B1 выше концентрации HEK293 в 2 раза. The penetration of estrone-3-sulfate, a known OATP1B1 substrate, at a concentration of 1 μM into HEK293 and HEK293-OATP1B1 cells was assessed during 5 min of incubation. The concentration of estrone-3-sulfate in the lysate of HEK293-OATP1B1 cells was 12.01 pM/mg protein, in the lysate of HEK293 cells it was 5.9 pM/mg protein. The concentration of estrone-3-sulfate in HEK293-OATP1B1 is 2 times higher than the concentration of HEK293.
Концентрация аторвастатина – другого субстрата ОАТР1В1 в лизате клеток HEK293-OATP1B1 при добавлении к клеткам в концентрации 1 мкМ и длительности эксперимента 5 минут составила 16,19 пМ/мг белка, в лизате клеток HEK293 - 7,34 пМ/мг белка. Концентрация аторвастатина в HEK293-OATP1B1 выше концентрации HEK293 в 2,2 раза. The concentration of atorvastatin, another OATP1B1 substrate, in the lysate of HEK293-OATP1B1 cells when added to the cells at a concentration of 1 μM and an experiment duration of 5 minutes was 16.19 pM/mg protein, in the lysate of HEK293 cells - 7.34 pM/mg protein. The concentration of atorvastatin in HEK293-OATP1B1 is 2.2 times higher than the concentration of HEK293.
Так же анализировали проникновение фексофенадина – не субстрата ОАТР1В1 в концентрации 1 мкМ внутрь клеток HEK293 и HEK293-OATP1B1 в течение 5 мин инкубации. Концентрация фексофенадина в лизате клеток HEK293-OATP1B1 составила 4,45 пМ/мг белка, в лизате клеток HEK293 - 4,35 пМ/мг белка. We also analyzed the penetration of fexofenadine, a non-OATP1B1 substrate, at a concentration of 1 μM into HEK293 and HEK293-OATP1B1 cells during 5 min of incubation. The concentration of fexofenadine in the lysate of HEK293-OATP1B1 cells was 4.45 pM/mg protein, in the lysate of HEK293 cells - 4.35 pM/mg protein.
Таким образом, концентрация тестируемого вещества в лизате клеток HEK293-OATP1B1 должна быть выше его концентрации в лизате клеток HEK293 в 2 и более раз, при этом тестируемое вещество является субстратом полипептида, транспортирующего органические анионы 1B1.Thus, the concentration of the test substance in the lysate of HEK293-OATP1B1 cells should be 2 or more times higher than its concentration in the lysate of HEK293 cells, and the test substance is a substrate of the polypeptide that transports organic anions 1B1.
Пример. Example.
Оценивали проникновение этилметилгидроксипиридина в концентрации 1 мкМ внутрь клеток HEK293 и HEK293-OATP1B1 в течение 5 мин инкубации. Концентрация этилметилгидроксипиридина в лизате клеток HEK293-OATP1B1 составила 8,8 пМ/мг белка, в лизате клеток HEK293 – 7,28 пМ/мг белка. Полученные результаты свидетельствуют о том, что этилметилгидроксипиридин не является субстратом OATP1B1. The penetration of ethylmethylhydroxypyridine at a concentration of 1 μM into HEK293 and HEK293-OATP1B1 cells was assessed during 5 min of incubation. The concentration of ethylmethylhydroxypyridine in the HEK293-OATP1B1 cell lysate was 8.8 pM/mg protein, in the HEK293 cell lysate it was 7.28 pM/mg protein. The results obtained indicate that ethylmethylhydroxypyridine is not a substrate of OATP1B1.
Claims (1)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2815047C1 true RU2815047C1 (en) | 2024-03-11 |
Family
ID=
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2017106753A1 (en) * | 2015-12-16 | 2017-06-22 | Corning Incorporated | Assay-ready recombinant cells transiently overexpressing genes encoding drug transporter proteins and/or drug metabolizing enzymes |
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2017106753A1 (en) * | 2015-12-16 | 2017-06-22 | Corning Incorporated | Assay-ready recombinant cells transiently overexpressing genes encoding drug transporter proteins and/or drug metabolizing enzymes |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| PATIK I. et al. Identification of novel cell-impermeant fluorescent substrates for testing the function and drug interaction of Organic Anion-Transporting Polypeptides, OATP1B1/1B3 and 2B1 // SCIENTIFIC REPORTS, 2018, V.8, pp.1-12. ЕРОХИНА П.Д. и др. Линия клеток HepG2 как модель для изучения проникновения статинов в гепатоциты // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология, 2022, N.206 (10), стр.70-76. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Yang et al. | P68 RNA helicase mediates PDGF-induced epithelial mesenchymal transition by displacing Axin from β-catenin | |
| Lempiäinen et al. | Sfp1 interaction with TORC1 and Mrs6 reveals feedback regulation on TOR signaling | |
| Bai et al. | Heterodimerization of human apelin and bradykinin 1 receptors: novel signal transduction characteristics | |
| US20250084453A1 (en) | Systems, compositions and methods for identifying e3 ligase substrates by ubiquitin biotinylation | |
| Xu et al. | In vivo analysis of human nucleoporin repeat domain interactions | |
| US20150010932A1 (en) | Methods for assaying protein-protein interactions | |
| Mochizuki et al. | Functional investigation of solute carrier family 35, member F2, in three cellular models of the primate blood-brain barrier | |
| Matsumoto et al. | Proton pumping V-ATPase inhibitor bafilomycin A1 affects Rab7 lysosomal localization and abolishes anterograde trafficking of osteoclast secretory lysosomes | |
| WO2020043812A1 (en) | Method for detecting a modulator compound for chemical targeting of protein-protein interactions | |
| Spagnol et al. | The E3 ubiquitin ligase SCF (Fbxo7) mediates proteasomal degradation of UXT isoform 2 (UXT-V2) to inhibit the NF-κB signaling pathway | |
| Woodrow et al. | Ras-induced serine phosphorylation of the focal adhesion protein paxillin is mediated by the Raf→ MEK→ ERK pathway | |
| Cai et al. | A novel phosphorylation site on orexin receptor 1 regulating orexinA-induced GRK2-biased signaling | |
| Urushihara et al. | DNA-PK inhibition causes a low level of H2AX phosphorylation and homologous recombination repair in Medaka (Oryzias latipes) cells | |
| RU2815047C1 (en) | Method of testing medicinal substances for belonging to substrates of polypeptide transporting organic anions 1b1 | |
| Li et al. | RalA and RalB function as the critical GTP sensors for GTP-dependent exocytosis | |
| Bourdeau et al. | PML links aberrant cytokine signaling and oncogenic stress to cellular senescence | |
| Xie et al. | The relative composition of actin isoforms regulates cell surface biophysical features and cellular behaviors | |
| Gururaj et al. | Protein kinase A–induced internalization of Slack channels from the neuronal membrane occurs by adaptor protein-2/clathrin–mediated endocytosis | |
| Morgenstern et al. | Controlling ion channel trafficking by targeted ubiquitination and deubiquitination | |
| Li et al. | A robust split-luciferase-based cell fusion screening for discovering myogenesis-promoting molecules | |
| Filipczak et al. | Lamin chromatin binding is modulated by interactions of different LAP2α domains with lamins and chromatin | |
| Huang et al. | A quantitative assay for mitochondrial fusion using Renilla luciferase complementation | |
| Geurink et al. | A small-molecule activity-based probe for monitoring ubiquitin C-terminal hydrolase L1 (UCHL1) activity in live cells and zebrafish embryos | |
| Seo et al. | Axin-independent phosphorylation of APC controls β-catenin signaling via cytoplasmic retention of β-catenin | |
| Shenoy | Deubiquitinases and their emerging roles in β-arrestin-mediated signaling |