RU2812733C1 - Bone-plastic material with controlled properties, a method of its production and use - Google Patents
Bone-plastic material with controlled properties, a method of its production and use Download PDFInfo
- Publication number
- RU2812733C1 RU2812733C1 RU2023115319A RU2023115319A RU2812733C1 RU 2812733 C1 RU2812733 C1 RU 2812733C1 RU 2023115319 A RU2023115319 A RU 2023115319A RU 2023115319 A RU2023115319 A RU 2023115319A RU 2812733 C1 RU2812733 C1 RU 2812733C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- collagen
- bone chips
- bone
- cpm
- solution
- Prior art date
Links
- 239000000463 material Substances 0.000 title claims abstract description 59
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 31
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 239000004033 plastic Substances 0.000 title claims abstract description 18
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 title claims abstract description 18
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims abstract description 176
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims abstract description 176
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 claims abstract description 176
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 claims abstract description 162
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 75
- 238000009826 distribution Methods 0.000 claims abstract description 35
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 33
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 claims abstract description 29
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 claims abstract description 21
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims abstract description 21
- 230000007547 defect Effects 0.000 claims abstract description 20
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims abstract description 18
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 16
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 claims abstract description 12
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims abstract description 12
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 11
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims abstract description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims abstract description 4
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 claims abstract description 4
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 claims abstract description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 94
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 41
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 11
- 239000000644 isotonic solution Substances 0.000 claims description 4
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 claims description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 abstract description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 8
- 241000446313 Lamella Species 0.000 abstract description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 41
- 238000001297 coherence probe microscopy Methods 0.000 description 24
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 21
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 19
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 16
- 239000000047 product Substances 0.000 description 15
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 14
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 13
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 11
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 11
- 210000004623 platelet-rich plasma Anatomy 0.000 description 10
- 238000006065 biodegradation reaction Methods 0.000 description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 8
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 8
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 7
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 230000011164 ossification Effects 0.000 description 6
- 206010017076 Fracture Diseases 0.000 description 5
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 5
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 5
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 238000002144 chemical decomposition reaction Methods 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 4
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 4
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 3
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 3
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 3
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 3
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 3
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 3
- -1 synthetic Substances 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 2
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 230000001054 cortical effect Effects 0.000 description 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 239000008240 homogeneous mixture Substances 0.000 description 2
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 2
- 238000004900 laundering Methods 0.000 description 2
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 2
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 2
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 2
- 230000000278 osteoconductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000002188 osteogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002138 osteoinductive effect Effects 0.000 description 2
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 210000004739 secretory vesicle Anatomy 0.000 description 2
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000012876 topography Methods 0.000 description 2
- 230000006444 vascular growth Effects 0.000 description 2
- KKAJSJJFBSOMGS-UHFFFAOYSA-N 3,6-diamino-10-methylacridinium chloride Chemical compound [Cl-].C1=C(N)C=C2[N+](C)=C(C=C(N)C=C3)C3=CC2=C1 KKAJSJJFBSOMGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 1
- 208000027502 Ankle fracture Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108090000932 Calcitonin Gene-Related Peptide Proteins 0.000 description 1
- 102000004414 Calcitonin Gene-Related Peptide Human genes 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 208000024779 Comminuted Fractures Diseases 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 208000004221 Multiple Trauma Diseases 0.000 description 1
- 208000023637 Multiple injury Diseases 0.000 description 1
- 206010031264 Osteonecrosis Diseases 0.000 description 1
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N acridine orange free base Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3C=C21 DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N benzoquinolinylidene Natural products C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000000515 collagen sponge Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 210000003104 cytoplasmic structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 210000001840 diploid cell Anatomy 0.000 description 1
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000001125 extrusion Methods 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 210000002683 foot Anatomy 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 231100000171 higher toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 210000002758 humerus Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000012785 packaging film Substances 0.000 description 1
- 229920006280 packaging film Polymers 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 210000001137 tarsal bone Anatomy 0.000 description 1
- 230000008719 thickening Effects 0.000 description 1
- 238000003136 vital staining of cell Methods 0.000 description 1
Abstract
Description
Область техники, к которой относится изобретениеField of technology to which the invention relates
Изобретение относится к области медицины, а именно регенеративной медицины, и может быть использовано для стимуляции репаративных процессов в дефектах костной ткани, при заполнении диастазов в процессе проведения реконструкции костной ткани.The invention relates to the field of medicine, namely regenerative medicine, and can be used to stimulate reparative processes in bone tissue defects, when filling diastases during bone tissue reconstruction.
Уровень техникиState of the art
В настоящее время ведется активная разработка имплантов и биологических конструкций для стимуляции остеогенеза и регенерации костной ткани. Для обозначения таких изделий часто используют термин «костнопластический материал» (КПМ). По своему химическому составу образцы КПМ разделяют на биоорганические, керамические, синтетические, композиционные, КПМ могут включать диплоидные клетки, а также факторы роста, факторы дифференцировки, цитокины [Кирилова ИА, Подорожная ВТ, Ардашев ИП, Черницов СВ. Различные виды костнопластических материалов для восстановления костной структуры. Политравма. 2008; 4: 60-64]. Показано, что коллаген значительно повышает биокондуктивные свойства трансплантатов, стимулирует миграцию собственных клеток пациента, может быть использован ими в качестве субстрата для формирования собственной кости [Walsh W., Oliver R.A., Christou C., Lovric V., Walsh E.R., Prado G.R., Haider T. Critical Size Bone Defect Healing Using Collagen–Calcium Phosphate Bone Graft Materials. PLoS ONE. 2017; 12(1): e0168883. doi: 10.1371/journal.pone.0168883]. При использовании костного материала в виде дисперсных структур (костной крошки) появляется возможность получения пластичных трансплантатов заданного размера и формы. Раствор коллагена способствует инкорпорированию костных гранул, уменьшая риск их смещения или выдавливания при механических нагрузках [Fan Q., Zeng H., Fan W., Wu T., Sun J., Yan Q., Shi B. Ridge preservation of a novel extraction socket applying Bio-Oss® collagen: An experimental study in dogs. J. Dent. Sci. 2021;16(3): 831–839. doi: 10.1016/j.jds.2021.03.005]. Костная крошка обладает остеогенными и остеоиндуктивными свойствами и широко используется в клинической практике, изделия на основе костной крошки и коллагена считаются очень перспективными при лечении дефектов губчатой и кортикальной кости. Однако при комбинации костной крошки и коллагена с различными характеристиками образуется материал с различными свойствами, как физико-химического, так и биологического характера, которые не учитываются при использовании материала в лечении тканевых дефектов. Эффективность репаративного процесса может зависеть от таких параметров КПМ, как размер костной крошки, концентрация коллагена в исходном растворе, качество коллагеновых волокон, характер распределения гранул костной крошки и др. На сегодняшний день не показано, как биологические параметры КПМ влияют на скорость репарации и регенерации, жизнеспособность клеток, их миграцию, адгезию и пролиферацию. При разных патологиях необходимо стимулировать разные биологические процессы, в связи с чем актуальным является разработка КПМ с определенным набором биологических свойств, наиболее оптимальных для решения той или иной клинической задачи.Currently, active development of implants and biological structures is underway to stimulate osteogenesis and bone tissue regeneration. The term “osteoplastic material” (OBM) is often used to refer to such products. According to their chemical composition, CPM samples are divided into bioorganic, ceramic, synthetic, composite; CPM can include diploid cells, as well as growth factors, differentiation factors, cytokines [Kirilova IA, Podorozhnaya VT, Ardashev IP, Chernitsov SV. Various types of osteoplastic materials for restoring bone structure. Polytrauma. 2008; 4: 60-64]. It has been shown that collagen significantly increases the bioconductive properties of grafts, stimulates the migration of the patient’s own cells, and can be used by them as a substrate for the formation of their own bone [Walsh W., Oliver RA, Christou C., Lovric V., Walsh ER, Prado GR, Haider T. Critical Size Bone Defect Healing Using Collagen–Calcium Phosphate Bone Graft Materials. PLoS ONE. 2017; 12(1): e0168883. doi: 10.1371/journal.pone.0168883]. When using bone material in the form of dispersed structures (bone chips), it becomes possible to obtain plastic grafts of a given size and shape. The collagen solution promotes the incorporation of bone granules, reducing the risk of their displacement or extrusion under mechanical loads [Fan Q., Zeng H., Fan W., Wu T., Sun J., Yan Q., Shi B. Ridge preservation of a novel extraction socket applying Bio-Oss® collagen: An experimental study in dogs. J.Dent. Sci. 2021;16(3): 831–839. doi:10.1016/j.jds.2021.03.005]. Bone chips have osteogenic and osteoinductive properties and are widely used in clinical practice; products based on bone chips and collagen are considered very promising in the treatment of cancellous and cortical bone defects. However, when combining bone chips and collagen with different characteristics, a material is formed with different properties, both physicochemical and biological, which are not taken into account when using the material in the treatment of tissue defects. The effectiveness of the reparative process may depend on such parameters of the CPM as the size of the bone chips, the concentration of collagen in the initial solution, the quality of collagen fibers, the nature of the distribution of bone chip granules, etc. To date, it has not been shown how the biological parameters of the CPM affect the rate of repair and regeneration, cell viability, migration, adhesion and proliferation. For different pathologies, it is necessary to stimulate different biological processes, and therefore it is relevant to develop CPMs with a certain set of biological properties that are most optimal for solving a particular clinical problem.
Из уровня техники известен костно-пластический материал и способ получения такого материала с регулярной структурой волокон на основе коллагена, стабилизированного 0,25% глутаровым альдегидом, наночастиц гидроксиапатита, который может быть дополнительно стабилизирован микрочастицами магния с целью повышения структурной целостности трансплантата [Antoniac I., Antoniac A., Vasile E., Tecu C., Fosca M., Yankova V., Rau J. In vitro characterization of novel nanostructured collagen-hydroxyapatite composite scaffolds doped with magnesium with improved biodegradation rate for hard tissue regeneration // Bioact Mater. 2021 Mar 19;6(10):3383-3395. doi: 10.1016/j.bioactmat.2021.02.30]. Однако получение КПМ связано с использованием специального инструментария для работы с наночастицами, отсутствует указание на биологический источник используемого коллагена, что затрудняет получение стандартизированного изделия, может вызывать развитие иммунологических реакций у пациента, не указана возможность использования в составе КПМ ростовых факторов. Кроме того, при получении КПМ используют глутаровый альдегид, который является токсичным для клеток.The prior art knows a bone-plastic material and a method for producing such a material with a regular fiber structure based on collagen, stabilized with 0.25% glutaraldehyde, hydroxyapatite nanoparticles, which can be additionally stabilized with magnesium microparticles in order to increase the structural integrity of the graft [Antoniac I., Antoniac A., Vasile E., Tecu C., Fosca M., Yankova V., Rau J. In vitro characterization of novel nanostructured collagen-hydroxyapatite composite scaffolds doped with magnesium with improved biodegradation rate for hard tissue regeneration // Bioact Mater. 2021 Mar 19;6(10):3383-3395. doi: 10.1016/j.bioactmat.2021.02.30]. However, obtaining CPM is associated with the use of special tools for working with nanoparticles; there is no indication of the biological source of the collagen used, which makes it difficult to obtain a standardized product and can cause the development of immunological reactions in the patient; the possibility of using growth factors in CPM is not indicated. In addition, when producing CPM, glutaraldehyde is used, which is toxic to cells.
Известно получение костно-пластического материала Bio-Oss® на основе гранул губчатой кости и коллагена 1 типа, который может быть дополнительно наполнен остеогенными факторами [Li Y., Yang L., Zheng Z., Li Z., Deng T., Ren W., Wu C., Guo L. Bio-Oss® modified by calcitonin gene-related peptide promotes osteogenesis in vitro. Exp Ther Med. 2017 Nov;14(5):4001-4008]. Однако при производстве КПМ используют ксеногенные источники коллагена и кости, при этом в публикации отсутствуют данные об адгезивных свойствах получаемого материала и скорости его биодеградации.It is known to produce bone-plastic material Bio-Oss® based on spongy bone granules and type 1 collagen, which can be additionally filled with osteogenic factors [Li Y., Yang L., Zheng Z., Li Z., Deng T., Ren W ., Wu C., Guo L. Bio-Oss® modified by calcitonin gene-related peptide promotes osteogenesis in vitro. Exp Ther Med. 2017 Nov;14(5):4001-4008]. However, in the production of CPM, xenogeneic sources of collagen and bone are used, and the publication does not contain data on the adhesive properties of the resulting material and the rate of its biodegradation.
Наиболее близким к заявляемому является костно-пластический материал InterOss® Collagen и способ его получения [Jain G., Blaauw D., Chang S.J. A Comparative Study of Two Bone Graft Substitutes-InterOss® Collagen and OCS-B Collagen® // Funct Biomater. 2022. Vol.13, N 1. P. 28. doi: 10.3390/jfb13010028]. Для изготовления КПМ используют гранулы костной крошки крупного рогатого скота и коллаген 1 типа, выделенный из свиной кожи. В конечном изделии соотношение гранул костной крошки и коллагена составляет 9:1 по массе. Смесь костной крошки и раствора коллагена замораживают при -40°C в течение 4 часов, проводят 2 цикла лиофилизации – 33 часа при −10°C и 4 часа при 10°C, затем отжигают при температуре 120°C для получения композитных каркасов кубовидной формы (называемых блоками) с последующим дегидротермическим сшиванием. Полученный материал является прочным, эластичным и биосовместимым, не вызывает выраженной воспалительной реакции, стимулирует рост костной ткани у экспериментальных животных, замещается собственной костной тканью в процессе регенерации. Однако данный способ использует ксеногенные источники коллагена и костной крошки, способные вызывать воспалительные и иммунологические осложнения, не содержит данных о размере костной крошки, что затрудняет выбор исходных компонентов для получения смеси раствора коллагена и костной крошки, не позволяет прогнозировать механические свойства готового изделия, не указывает оптимальную концентрацию коллагена в исходном растворе, что затрудняет подготовку раствора коллагена для изготовления материала, не содержит данных об адгезивных свойствах материала и возможности его насыщения ростовыми факторами, усиливающими остеогенез, не учитывает возможные деформации коллагена в процессе получения КПМ и не позволяет оценить структурную целостность коллагена в составе готовых изделий.The closest to the claimed is the bone plastic material InterOss® Collagen and the method for its preparation [Jain G., Blaauw D., Chang S.J. A Comparative Study of Two Bone Graft Substitutes-InterOss® Collagen and OCS-B Collagen® // Funct Biomater. 2022. Vol.13, N 1. P. 28. doi: 10.3390/jfb13010028]. To produce CPM, bovine bone granules and type 1 collagen isolated from pig skin are used. In the final product, the ratio of bone chips and collagen granules is 9:1 by weight. A mixture of bone chips and collagen solution is frozen at -40°C for 4 hours, 2 cycles of lyophilization are carried out - 33 hours at -10°C and 4 hours at 10°C, then annealed at a temperature of 120°C to obtain cuboid-shaped composite scaffolds (called blocks) followed by dehydrothermal cross-linking. The resulting material is durable, elastic and biocompatible, does not cause a pronounced inflammatory reaction, stimulates the growth of bone tissue in experimental animals, and is replaced by its own bone tissue during the regeneration process. However, this method uses xenogeneic sources of collagen and bone chips, which can cause inflammatory and immunological complications, does not contain data on the size of bone chips, which makes it difficult to select the starting components for obtaining a mixture of collagen and bone chips solution, does not allow predicting the mechanical properties of the finished product, does not indicate the optimal concentration of collagen in the initial solution, which complicates the preparation of a collagen solution for the manufacture of the material, does not contain data on the adhesive properties of the material and the possibility of its saturation with growth factors that enhance osteogenesis, does not take into account possible deformations of collagen in the process of obtaining CPM and does not allow assessing the structural integrity of collagen in composition of finished products.
Технической проблемой, решаемой заявленным изобретением, является разработка состава и способа получения костно-пластического материала (КПМ) на основе аллогенной кости и коллагена с определенными биологическими свойствами (нетоксичность для клеток in vitro, способность стимулировать адгезию и пролиферацию клеток, отсутствие деформированных коллагеновых волокон в составе КПМ), предназначенного для использования в лечении дефектов костной ткани.The technical problem solved by the claimed invention is the development of a composition and method for producing bone plastic material (BPM) based on allogeneic bone and collagen with certain biological properties (non-toxicity to cells in vitro, the ability to stimulate cell adhesion and proliferation, the absence of deformed collagen fibers in the composition KPM), intended for use in the treatment of bone tissue defects.
Раскрытие изобретенияDisclosure of the Invention
Техническим результатом, на достижение которого направлено заявленное изобретение, является получение трансплантата КПМ на основе материала тканевых доноров, с возможностью изменения биологических свойств на этапе производства КПМ посредством изменения состава КПМ, а именно, параметров используемых компонентов - размера костной крошки и процентного содержания коллагена 1 типа, с получением высокоадгезивного для клеток человека КПМ, характеризующегося плотностью клеток на поверхности КПМ 4 тыс. на см2 и выше, наличием распластанных клеток и клеток с широкой ламеллой, или низкоадгезивного для клеток человека КПМ, характеризующегося плотностью клеток на поверхности КПМ не более 2 тыс. на см2, отсутствием распластанных клеток и клеток с широкой ламеллой, при этом с заданной гомогенностью распределения костной крошки (высокой, средней или низкой).The technical result to which the claimed invention is aimed is to obtain a CPM graft based on tissue donor material, with the possibility of changing the biological properties at the stage of CPM production by changing the composition of the CPM, namely, the parameters of the components used - the size of bone chips and the percentage of type 1 collagen , with the production of a highly adhesive CPM for human cells, characterized by a cell density on the surface of the CPM of 4 thousand per cm 2 and higher, the presence of spread cells and cells with a wide lamella, or a low adhesive CPM for human cells, characterized by a cell density on the surface of the CPM of no more than 2 thousand per cm 2 , the absence of spread out cells and cells with a wide lamella, while with a given homogeneity of the distribution of bone chips (high, medium or low).
Высокоадгезивный КПМ может найти применение при остеоиндуктивном остеогенезе, при лечении дефектов костной ткани с низкой активностью остеобластов, низкой активностью роста сосудов и малым регенеративным потенциалом ткани. Низкоадгезивный КПМ может найти применение при остеокондуктивном остеогенезе, при лечении дефектов костной ткани с высокой активностью остеобластов, высокой активностью роста сосудов и большим регенеративным потенциалом ткани. КПМ с высокой гомогенностью распределения материала может найти применение при лечении дефектов костной ткани с постоянной высокой механической нагрузкой. КПМ с низкой гомогенностью может быть использован при лечении дефектов кости, где постоянная механическая нагрузка отсутствует. КПМ со средней гомогенностью распределения костной крошки является промежуточным вариантом между двумя упомянутыми материалами, который может быть принят в качестве универсального, позволяющего его использовать при лечении дефектов кости как с высокой, так и низкой механической нагрузкой.Highly adhesive CPM can be used in osteoinductive osteogenesis, in the treatment of bone tissue defects with low osteoblast activity, low vascular growth activity and low tissue regenerative potential. Low-adhesive CPM can find application in osteoconductive osteogenesis, in the treatment of bone tissue defects with high osteoblast activity, high vascular growth activity and high tissue regenerative potential. CPM with high homogeneity of material distribution can be used in the treatment of bone tissue defects with constant high mechanical load. CPM with low homogeneity can be used in the treatment of bone defects where there is no constant mechanical load. CPM with average homogeneity of bone chip distribution is an intermediate option between the two mentioned materials, which can be accepted as universal, allowing it to be used in the treatment of bone defects with both high and low mechanical load.
Технический результат достигается способом получения костно-пластического материала (КПМ) для стимуляции репаративных процессов в дефектах костной ткани, который включает смешивание раствора коллагена 1 типа человека, выделенного из сухожилий тканевых доноров путем кислотной экстракции, и костной крошки, полученной из кости тканевых доноров, с последующей лиофилизацией и стерилизацией, при этом для получения высокоадгезивного для клеток человека материала (характеризующегося плотностью клеток на поверхности КПМ 4 тыс. на см2 и выше, наличием распластанных клеток и клеток с широкой ламеллой) с высокой гомогенностью распределения костной крошки используют 0,8% раствор коллагена и костную крошку размером 500-630 мкм, для получения высокоадгезивного для клеток человека материала со средней гомогенностью распределения костной крошки используют 0,8% раствор коллагена и костную крошку размером 250-315 мкм, для получения высокоадгезивного для клеток человека материала с низкой гомогенностью распределения костной крошки используют 0,8% раствор коллагена и костную крошку размером 80 -180 мкм, для получения низкоадгезивного материала (характеризующегося плотностью клеток на поверхности КПМ не более 2 тыс. на см2, отсутствием распластанных клеток и клеток с широкой ламеллой) с высокой гомогенностью распределения костной крошки используют 0,8% раствор коллагена и костную крошку размером 700-800 мкм или 1,1% раствор коллагена и костную крошку размером 80-180 мкм, для получения низкоадгезивного материала с низкой гомогенностью распределения костной крошки используют 1,1% раствор коллагена и костную крошку размером 250-800 мкм. При этом смесь костной крошки и коллагена обладает: низкой гомогенностью в случае, если происходит образование сгустков крошки и коллагена во всем объеме смеси и если полностью размешать сгустки не удается; средней гомогенностью – если при смешивании со скоростью 50-60 оборотов в минуту образуются отдельные сгустки, а при смешивании со скоростью 70-90 оборотов в минуту сгустки исчезают; высокой гомогенностью – если при смешивании со скоростью 50-60 оборотов в минуту сгустки не образуются. Значения перечисленных параметров могут отличаться от указанных выше, на величину погрешности, не более чем на 10%.The technical result is achieved by a method for producing bone plastic material (BPM) to stimulate reparative processes in bone tissue defects, which includes mixing a solution of human type 1 collagen isolated from the tendons of tissue donors by acid extraction, and bone chips obtained from the bones of tissue donors, with subsequent lyophilization and sterilization, while to obtain a highly adhesive material for human cells (characterized by a cell density on the surface of the CPM of 4 thousand per cm 2 and higher, the presence of spread cells and cells with a wide lamella) with a highly homogeneous distribution of bone chips, 0.8% is used a collagen solution and bone chips with a size of 500-630 microns, to obtain a material highly adhesive for human cells with an average homogeneity of distribution of bone chips, use a 0.8% collagen solution and bone chips with a size of 250-315 microns, to obtain a material highly adhesive for human cells with low homogeneity distribution of bone chips using a 0.8% collagen solution and bone chips with a size of 80-180 microns to obtain a low-adhesive material (characterized by a cell density on the surface of the CPM of no more than 2 thousand per cm2, the absence of spread cells and cells with a wide lamella) with high homogeneity distribution of bone chips use a 0.8% solution of collagen and bone chips with a size of 700-800 microns or a 1.1% solution of collagen and bone chips with a size of 80-180 microns; to obtain a low-adhesive material with low homogeneity of distribution of bone chips, a 1.1% solution is used collagen and bone chips measuring 250-800 microns. At the same time, the mixture of bone chips and collagen has: low homogeneity if clots of crumbs and collagen are formed throughout the entire volume of the mixture and if the clots cannot be completely mixed; medium homogeneity - if, when mixing at a speed of 50-60 rpm, individual clots are formed, and when mixing at a speed of 70-90 rpm, the clots disappear; high homogeneity - if no clots are formed when mixing at a speed of 50-60 rpm. The values of the listed parameters may differ from those indicated above by an error of no more than 10%.
Перед применением КПМ (лиофилизированный трансплантат) вымачивают в изотоническом растворе хлорида натрия (0,9%) в течение 30-60 мин.Before use, the CPM (lyophilized graft) is soaked in an isotonic solution of sodium chloride (0.9%) for 30-60 minutes.
Контроль качества коллагеновых волокон проводят посредством регистрации автофлуоресценции коллагена с помощью флуоресцентной микроскопии [Макаров М.С., Сторожева М.В., Боровкова Н.В. Значение автофлюоресценции коллагеновых волокон для оценки биологических свойств тканевых трансплантатов // Современные технологии в медицине. –2017. –Т.9, №2. С. 83–90]. При получении значения уровня автофлуоресценции 30 FC и менее для КПМ с использованием 0,8% раствора коллагена, или 40 FC и менее для КПМ с использованием 1,1% раствора коллагена, КПМ считают пригодным для последующего использования для стимуляции репаративных процессов в дефектах костной тканиQuality control of collagen fibers is carried out by recording the autofluorescence of collagen using fluorescence microscopy [Makarov M.S., Storozheva M.V., Borovkova N.V. The importance of autofluorescence of collagen fibers for assessing the biological properties of tissue grafts // Modern technologies in medicine. –2017. –T.9, No. 2. pp. 83–90]. When an autofluorescence level of 30 FC or less is obtained for CPM using a 0.8% collagen solution, or 40 FC or less for CPM using a 1.1% collagen solution, the CPM is considered suitable for subsequent use to stimulate reparative processes in bone tissue defects
Лиофилизация может быть проведена под вакуумом сначала при температуре -35°С в течение 20-40 мин, затем температуру постепенно поднимают до +36°С и лиофилизируют КПМ в течение 18-24 часов. Lyophilization can be carried out under vacuum, first at a temperature of -35°C for 20-40 minutes, then the temperature is gradually raised to +36°C and the CPM is lyophilized for 18-24 hours.
Перед применением полученный КПМ вымачивают в изотоническом растворе хлорида натрия - 0,9% NaCl, в течение не менее 30 мин.Before use, the resulting CPM is soaked in an isotonic solution of sodium chloride - 0.9% NaCl, for at least 30 minutes.
Рост-стимулирующие свойства КПМ могут быть повышены посредством добавления лизата бедной или богатой тромбоцитами плазмы, содержащей факторы роста, из расчета 40-50 мкл на 1 см2 трансплантата после вымачивания в изотоническом растворе хлорида натрия. Изготовление тромбоцитных препаратов может быть проведено по известной методике [Макаров М.С., Сторожева М.В., Боровкова Н.В., Пономарев И.Н. Ростстимулирующий эффект тромбоцитарных препаратов, полученных разными способами, в культуре фибробластов человека. Клеточные технологии в биологии и медицине. 2022;(3):183-188. https://doi.org/10.47056/1814-3490-2022-3-183-188].The growth-stimulating properties of CPM can be increased by adding a lysate of platelet-poor or platelet-rich plasma containing growth factors at the rate of 40-50 μl per 1 cm 2 of graft after soaking in an isotonic sodium chloride solution. The production of platelet preparations can be carried out using a well-known method [Makarov M.S., Storozheva M.V., Borovkova N.V., Ponomarev I.N. Growth-stimulating effect of platelet preparations obtained by different methods in human fibroblast culture. Cell technologies in biology and medicine. 2022;(3):183-188. https://doi.org/10.47056/1814-3490-2022-3-183-188].
Краткое описание чертежейBrief description of drawings
Изобретение поясняется чертежами, где на фиг 1 представлены образцы костно-пластического материала, приготовленного с использованием 0,8% раствора коллагена, в виде уплощенной губки (А) и кубической губки (Б); на фиг. 2 представлена автофлуоресценция коллагена в составе костно-пластического материала с высокой (а) и низкой (б) гомогенностью, увеличение х40; на фиг. 3 представлена фотография витально окрашенных (трипафлавином и акридиновым оранжевым) клеток линии М-22 на коллагеновых матрицах, полученных из 0,8% раствора коллагена, через 3 суток культивирования. Увеличение х100. Окраска трипафлавином-акридиновым оранжевым. а – коллагеновая повязка (без костной крошки); б – КПМ из 0,8% коллагена и костной крошки без вымачивания. в – КПМ из 0,8% коллагена и костной крошки, предварительно вымоченный в изотоничном физрастворе в течение 40 минут; на фиг. 4 показана плотность клеток линии М-22 через 3 суток культивирования на поверхности предварительно вымоченного костно-пластического материала (КПМ), полученного с использованием 0,8% раствора коллагена (а) и 1,1% коллагена (б); на фиг. 5 показана автофлуоресценция коллагена в составе коллагеновых повязок (а) и костно-пластического материала (КПМ) с разным качеством коллагеновых волокон (б-3). Увеличение х40. а – коллагеновая повязка, полученная из 0,8% раствора коллагена; б – КПМ, полученный из 0,8% раствора коллагена; в, г – КПМ, полученный из 1,1% раствора коллагена (в – нормальное качество волокон, г – высокое содержание деформированных волокон); д – КПМ, полученный из 0,8% раствора коллагена, после экспозиции в культуральной среде в течение 4 недель (химическая деградация волокон слабо выражена); е, ж, з – КПМ, полученный из 1,1% раствора коллагена, после экспозиции в культуральной среде в течение 4 недель (е – химическая деградация волокон слабо выражена, ж – очень сильная деградация волокон, з – декомпактизация волокон); на фиг. 6 показана пролиферативная активность фибробластов линии М-22 в составе костно-пластического материала через 3 суток культивирования. Витальное окрашивание трипафлавином-акридиновым оранжевым. Увеличение х200. а – КПМ без тромбоцитных препаратов; б – КПМ + богатая тромбоцитами плазма; в – КПМ + лизат богатой тромбоцитами плазмы.The invention is illustrated by drawings, where Fig. 1 shows samples of bone-plastic material prepared using a 0.8% collagen solution in the form of a flattened sponge (A) and a cubic sponge (B); in fig. Figure 2 shows autofluorescence of collagen in the composition of bone plastic material with high (a) and low (b) homogeneity, magnification x40; in fig. Figure 3 shows a photograph of vitally stained (trypaflavin and acridine orange) cells of the M-22 line on collagen matrices obtained from a 0.8% collagen solution after 3 days of cultivation. Magnification x100. Stained with trypaflavin-acridine orange. a – collagen bandage (without bone chips); b – CPM made from 0.8% collagen and bone chips without soaking. c – CPM made of 0.8% collagen and bone chips, pre-soaked in isotonic saline solution for 40 minutes; in fig. Figure 4 shows the density of M-22 cells after 3 days of cultivation on the surface of pre-soaked bone plastic material (BPM), obtained using a 0.8% collagen solution (a) and 1.1% collagen (b); in fig. Figure 5 shows autofluorescence of collagen in the composition of collagen bandages (a) and bone plastic material (BPM) with different quality of collagen fibers (b-3). Magnification x40. a – collagen bandage obtained from a 0.8% collagen solution; b – CPM obtained from a 0.8% collagen solution; c, d – CPM obtained from a 1.1% collagen solution (c – normal fiber quality, d – high content of deformed fibers); e – CPM obtained from a 0.8% collagen solution after exposure to a culture medium for 4 weeks (chemical degradation of the fibers is weak); f, g, h – CPM obtained from a 1.1% collagen solution after exposure to a culture medium for 4 weeks (f – chemical degradation of fibers is weakly expressed, g – very strong degradation of fibers, h – decompactization of fibers); in fig. Figure 6 shows the proliferative activity of fibroblasts of the M-22 line in the composition of bone-plastic material after 3 days of cultivation. Vital staining with trypaflavin-acridine orange. Magnification x200. a – CPM without platelet preparations; b – CPM + platelet-rich plasma; c – CPM + platelet-rich plasma lysate.
Осуществление изобретенияCarrying out the invention
Способ приготовления заявленного костно-пластического материала включает следующие этапы:The method of preparing the claimed osteoplastic material includes the following steps:
1. Выделение коллагена 1 типа человека из сухожилий тканевых доноров путем кислотной экстракции в 0,01 М уксусной кислоты, которое может быть реализовано известными из уровня техники способами [Ермолов А.С., Смирнов С.В., Хватов В.Б., Истранов Л.П., Конюшко О.И., Колокольчикова Е.Г. и др. Применение биологически активных раневых покрытий, стимулирующих регенерацию эпителия ожоговых ран IIIа степени. Клеточные технологии в биологии и медицине. 2008;(3):166-170].1. Isolation of human type 1 collagen from the tendons of tissue donors by acid extraction in 0.01 M acetic acid, which can be carried out using methods known from the prior art [Ermolov A.S., Smirnov S.V., Khvatov V.B., Istranov L.P., Konyushko O.I., Kolokolchikova E.G. and others. The use of biologically active wound coverings that stimulate the regeneration of the epithelium of third-degree burn wounds. Cell technologies in biology and medicine. 2008;(3):166-170].
2. Получение костной крошки из губчатой кости тканевых доноров размером 80-800 мкм [Хватов В.Б., Свищев А.В., Ваза А.Ю., Боровкова Н.В., Миронов А.С., Похитонов Д.Ю. и др. Способ изготовления лиофилизированного аллотрансплантата кости. Трансплантология. 2016;(1):13-18].2. Obtaining bone chips from cancellous bone of tissue donors with a size of 80-800 microns [Khvatov V.B., Svishchev A.V., Vaza A.Yu., Borovkova N.V., Mironov A.S., Pokhitonov D.Yu. . etc. Method for producing lyophilized bone allograft. Transplantology. 2016;(1):13-18].
3. Смешивание раствора коллагена, полученного на первом этапе, и костной крошки, полученной на втором этапе, для получения КПМ с заданными свойствами.3. Mixing the collagen solution obtained at the first stage and bone chips obtained at the second stage, to obtain a CPM with the specified properties.
3.1. Например, смешивание 100 мл раствора 0,8% коллагена и 6 грамм костной крошки размером 500-630 мкм для получения высокоадгезивного материала c высокой гомогенностью распределения костной крошки или 100 мл раствора 0,8% коллагена и 6 грамм костной крошки размером 250-315 мкм для получения высокоадгезивного материала c средней гомогенностью распределения костной крошки или 100 мл раствора 0,8% коллагена и 6 грамм костной крошки размером 80-180 мкм для получения высокоадгезивного материала низкой гомогенностью распределения костной крошки.3.1. For example, mixing 100 ml of a solution of 0.8% collagen and 6 grams of bone chips measuring 500-630 microns to obtain a highly adhesive material with highly homogeneous distribution of bone chips or 100 ml of a solution of 0.8% collagen and 6 grams of bone chips measuring 250-315 microns to obtain a highly adhesive material with an average homogeneity of distribution of bone chips or 100 ml of a solution of 0.8% collagen and 6 grams of bone chips measuring 80-180 microns to obtain a highly adhesive material with a low homogeneity of distribution of bone chips.
3.2. Смешивание раствора коллагена и костной крошки 100 мл раствора 0,8% коллагена и 6 грамм костной крошки размером 700-800 мкм или 1,1% раствора коллагена и 6 грамм костной крошки диаметром 80-180 мкм для получения низкоадгезивного материала с высокой гомогенностью распределения костной крошки или 1,1% раствора коллагена и 6 грамм костной крошки диаметром 250-800 мкм для получения низкоадгезивного материала с низкой гомогенностью распределения костной крошки.3.2. Mixing a solution of collagen and bone chips 100 ml of a solution of 0.8% collagen and 6 grams of bone chips with a size of 700-800 microns or a 1.1% solution of collagen and 6 grams of bone chips with a diameter of 80-180 microns to obtain a low-adhesive material with high homogeneity of bone distribution crumbs or 1.1% collagen solution and 6 grams of bone chips with a diameter of 250-800 microns to obtain a low-adhesive material with low homogeneity of distribution of bone chips.
4. Лиофилизация смеси жидкого коллагена и костной крошки: сначала лиофилизацию проводят под вакуумом при -35°С в течение 20-40 мин, после этого температуру постепенно поднимают со скоростью 1°С в минуту до +36°С и лиофилизируют КПМ в течение 18-24 часов до получение конечного продукта с остаточным содержанием влаги по массе не более 4%. Лиофилизация смеси жидкого коллагена и костной крошки может быть выполнена по известной из уровня техники методике [см. например, Патент РФ на изобретение 2721873 «Аллогенный комбинированный костный трансплантат для лечения сложных переломов проксимального отдела плечевой кости, способ его получения»]. Полученный КПМ представляет собой губчатую структуру, которая может производиться в виде гранул, пластин, а также с заданной формой для конкретного применения, например, может иметь уплощенную форму (малая высота относительно длины и ширины), цилиндрическую или кубическую форму. Форма изделия, как правило, зависит от линейных размеров емкости, в которую заливается смесь раствора коллагена и костной крошки перед лиофилизацией. 4. Lyophilization of a mixture of liquid collagen and bone chips: first, lyophilization is carried out under vacuum at -35°C for 20-40 minutes, after which the temperature is gradually raised at a speed of 1°C per minute to +36°C and the CPM is lyophilized for 18 -24 hours until the final product is obtained with a residual moisture content by weight of no more than 4%. Lyophilization of a mixture of liquid collagen and bone chips can be performed using a technique known from the prior art [see. for example, RF Patent for invention 2721873 “Allogeneic combined bone graft for the treatment of complex fractures of the proximal humerus, method of its preparation”]. The resulting CPM is a spongy structure that can be produced in the form of granules, plates, and also with a given shape for a specific application, for example, it can have a flattened shape (small height relative to length and width), cylindrical or cubic shape. The shape of the product, as a rule, depends on the linear dimensions of the container into which a mixture of collagen solution and bone chips is poured before lyophilization.
1. Упаковка готовых КПМ в двойные полипропиленовые пакеты или полиэтиленовую медицинскую упаковывающую пленку, используя электрический запаиватель для вакуумной упаковки. Размер упаковок может варьироваться от 5×5 до 10×20 см.1. Packing of finished CPMs in double polypropylene bags or polyethylene medical packaging film using an electric vacuum sealer. The size of the packages can vary from 5x5 to 10x20 cm.
2. Стерилизация КПМ, например, путем радиационной обработкой с дозой 25кГр.2. Sterilization of CPM, for example, by radiation treatment with a dose of 25 kGy.
Подготовка КПМ к клиническому использованию включает следующие этапы:Preparation of CPM for clinical use includes the following steps:
3. Оценка структурной целостности коллагеновых волокон КПМ путем регистрации автофлуоресценции коллагена. Оценка структурной целостности коллагеновых волокон КПМ может быть приведена с помощью известных методик [Макаров М.С., Сторожева М.В., Боровкова Н.В. Значение автофлюоресценции коллагеновых волокон для оценки биологических свойств тканевых трансплантатов // Современные технологии в медицине. –2017. –Т.9, №2. –С. 83–90]. В КПМ без дефектных коллагеновых волокон уровень автофлуоресценции составляет не более 30 фут-кандел для КПМ, полученных с использованием 0,8% раствора коллагена, и не более 40 фут-кандел для КПМ, полученных с использованием 1,1% раствора коллагена.3. Assessment of the structural integrity of the collagen fibers of the CPM by recording collagen autofluorescence. Assessment of the structural integrity of the collagen fibers of the CPM can be done using well-known methods [Makarov M.S., Storozheva M.V., Borovkova N.V. The importance of autofluorescence of collagen fibers for assessing the biological properties of tissue grafts // Modern technologies in medicine. –2017. –T.9, No. 2. -WITH. 83–90]. In CPMs without defective collagen fibers, the autofluorescence level is no more than 30 foot-candles for CPMs obtained using a 0.8% collagen solution, and no more than 40 foot-candles for CPMs obtained using a 1.1% collagen solution.
4. Вымачивание КПМ с нормальной структурой коллагеновых волокон (без содержания дефектных волокон) в изотоническом физрастворе (0,9% хлорид натрия) не менее 30 минут. 4. Soaking CPM with normal collagen fiber structure (without defective fibers) in isotonic saline solution (0.9% sodium chloride) for at least 30 minutes.
5. Насыщение КПМ тромбоцитными препаратами при необходимости (богатая и бедная тромбоцитами плазма, лизат богатой и бедной тромбоцитами плазмы) из расчета 40-50 мкл тромбоцитного препарата на 1 см2 КПМ. Тромбоцитные препараты могут быть нанесены на поверхность КПМ любыми известными из уровня техники средствами, например, с помощью пипетки или шприца в стерильных условиях непосредственно перед операцией или интраоперационно. Изготовление тромбоцитных препаратов может быть реализовано по известной методике [Макаров М.С., Сторожева М.В., Боровкова Н.В., Пономарев И.Н. Ростстимулирующий эффект тромбоцитарных препаратов, полученных разными способами, в культуре фибробластов человека. Клеточные технологии в биологии и медицине. 2022;(3):183-188. https://doi.org/10.47056/1814-3490-2022-3-183-188].5. Saturation of the CPM with platelet preparations, if necessary (platelet-rich and platelet-poor plasma, lysate of platelet-rich and platelet-poor plasma) at the rate of 40-50 μl of platelet preparation per 1 cm 2 of CPM. Platelet preparations can be applied to the surface of the CPM by any means known from the prior art, for example, using a pipette or syringe under sterile conditions immediately before surgery or intraoperatively. The production of platelet preparations can be carried out using a well-known method [Makarov M.S., Storozheva M.V., Borovkova N.V., Ponomarev I.N. Growth-stimulating effect of platelet preparations obtained by different methods in human fibroblast culture. Cell technologies in biology and medicine. 2022;(3):183-188. https://doi.org/10.47056/1814-3490-2022-3-183-188].
В зависимости от типа патологии могут быть использованы КПМ с разными биологическими характеристиками (Табл. 1). Линейные размеры КПМ можно задавать с учетом клинических потребностей (Фиг. 1).Depending on the type of pathology, CPMs with different biological characteristics can be used (Table 1). The linear dimensions of the CPM can be set taking into account clinical needs (Fig. 1).
Таблица 1. Примеры применения костно-пластического материала в зависимости от заданных биологических характеристикTable 1. Examples of the use of bone plastic material depending on the specified biological characteristics
Аутотрансплантат КПМ на основе материала тканевых доноров с перечисленными биологическими свойствами был разработан по результатам проведения исследований.A CPM autograft based on material from tissue donors with the listed biological properties was developed based on the results of research.
На первом этапе решения поставленной задачи по разработке КПМ с заданными свойствами определяли оптимальное соотношение раствора коллагена и костной крошки, а также биосовместимость готовых изделий. В процессе разработки КПМ был получен цельный трансплантат с гомогенным распределением компонентов. Гомогенность распределения крошки влияет на интенсивность контакта гидроксиапатита в составе крошки с карбоксильными и аминогруппами в составе коллагена. При высокой гомогенности распределения формируется упорядоченная внутренняя структура, которая повышает механические характеристики КПМ, сохранность его компонентов и их биосовместимость [Chitosan-collagen-hydroxyapatite membranes for tissue engineering. Becerra J, Rodriguez M, Leal D, Noris-Suarez K, Gonzalez G. J Mater Sci Mater Med. 2022 Jan 24;33(2):18. doi: 10.1007/s10856-022-06643-w]. В процессе разработки КПМ необходимо было добиться максимального насыщения раствора коллагена костной крошкой, чтобы при этом гранулы крошки равномерно распределялись по объему и не высыпались из готового трансплантата после лиофилизации. Экспериментально было установлено, что в 100 мл раствора коллагена удается гомогенно распределить от 5,5 до 6,5 грамм костной крошки. Если масса костной крошки была меньше 5,5 грамм, в готовом изделии формировались обширные зоны коллагена без костной крошки. Если масса костной крошки превышала 6,5 грамм, полученная смесь теряла гомогенность, образовывались конгломераты, а после лиофилизации трансплантат фрагментировался. Таким образом, при производстве КПМ было выявлено, что оптимальным соотношением костной крошки с раствором коллагена является 5,5-6,5 грамм на 100 мл. При оценке КПМ, полученных с использованием крошки разного размера и двух концентраций коллагена, было показано, что при использовании 0,8% раствора коллагена наиболее гомогенную смесь удается получить в случае замешивания относительно крупной костной крошки (500-800 мкм). В опытах с растворами 1,1% коллагена, напротив, наиболее гомогенная смесь образовывалась с использованием крошки диаметром 80-180 мкм (табл. 2). После лиофилизации все образцы были стабильными и не фрагментировались. В опытах in vitro параллельно оценивали образцы КПМ и коллагеновые повязки, полученные из раствора с той же концентрацией коллагена (0,8% и 1,1%).At the first stage of solving the problem of developing CPM with specified properties, the optimal ratio of collagen solution and bone chips, as well as the biocompatibility of finished products, were determined. During the development of the CPM, a solid graft with a homogeneous distribution of components was obtained. The homogeneity of crumb distribution affects the intensity of contact of hydroxyapatite in the crumb composition with carboxyl and amino groups in the collagen composition. With a high homogeneity of distribution, an ordered internal structure is formed, which increases the mechanical characteristics of the CPM, the safety of its components and their biocompatibility [Chitosan-collagen-hydroxyapatite membranes for tissue engineering. Becerra J, Rodriguez M, Leal D, Noris-Suarez K, Gonzalez G. J Mater Sci Mater Med. 2022 Jan 24;33(2):18. doi:10.1007/s10856-022-06643-w]. In the process of developing the CPM, it was necessary to achieve maximum saturation of the collagen solution with bone chips, so that the crumb granules were evenly distributed throughout the volume and did not spill out of the finished graft after lyophilization. It was experimentally established that in 100 ml of collagen solution it is possible to homogeneously distribute from 5.5 to 6.5 grams of bone chips. If the mass of bone chips was less than 5.5 grams, large areas of collagen without bone chips were formed in the finished product. If the mass of bone chips exceeded 6.5 grams, the resulting mixture lost homogeneity, conglomerates formed, and after lyophilization the graft fragmented. Thus, during the production of CPM, it was found that the optimal ratio of bone chips to collagen solution is 5.5-6.5 grams per 100 ml. When evaluating CBMs obtained using crumbs of different sizes and two collagen concentrations, it was shown that when using a 0.8% collagen solution, the most homogeneous mixture can be obtained when mixing relatively large bone chips (500-800 µm). In experiments with solutions of 1.1% collagen, on the contrary, the most homogeneous mixture was formed using crumbs with a diameter of 80-180 μm (Table 2). After lyophilization, all samples were stable and did not fragment. In in vitro experiments, CPM samples and collagen dressings obtained from a solution with the same collagen concentration (0.8% and 1.1%) were simultaneously evaluated.
Таблица 2. Оценка степени гомогенности смеси костной крошки и раствора коллагенаTable 2. Assessment of the degree of homogeneity of the mixture of bone chips and collagen solution
Смешивание может осуществляться с использованием механической мешалки, например, с диаметром лопастей 12-15 см и шириной лопастей 0,5-1 см.High homogeneity - when mixing at a speed of 50-60 rpm, no clots are formed.
Mixing can be carried out using a mechanical stirrer, for example, with a blade diameter of 12-15 cm and a blade width of 0.5-1 cm.
Низкая гомогенность распределения материала в КПМ отчетливо наблюдается в процессе регистрации автофлуоресценции коллагена. При высокой гомогенности в КПМ коллаген равномерно заполняет все пространство изделия, зоны с очень слабым свечением (признак резко сниженной концентрации коллагена) не выявляются или выявляются очень редко, контуры отдельных гранул выявляются нечетко (Фиг. 2а). Напротив, в КПМ с низкой гомогенностью материала видны зоны сгущения коллагеновых волокон, видны участки с очень низким содержанием коллагена, удается четко наблюдать контуры гранул костной крошки на поверхности КПМ (Фиг. 2б). Таким образом, гомогенность готового изделия можно оценить в процессе анализа автофлуоресценции коллагена с помощью флуоресцентной микроскопии.Low homogeneity of material distribution in the CPM is clearly observed during the recording of collagen autofluorescence. With high homogeneity in the CPM, collagen evenly fills the entire space of the product, zones with very weak luminescence (a sign of a sharply reduced collagen concentration) are not detected or are detected very rarely, the contours of individual granules are not clearly visible (Fig. 2a). On the contrary, in CPM with low homogeneity of the material, zones of thickening of collagen fibers are visible, areas with a very low collagen content are visible, and it is possible to clearly observe the contours of bone chip granules on the surface of the CPM (Fig. 2b). Thus, the homogeneity of the finished product can be assessed by analyzing the autofluorescence of collagen using fluorescence microscopy.
Для оценки биосовместимости готовых изделий in vitro использовали образцы КПМ, изготовленные на основе 0,8% раствора коллагена 1 типа и костной крошки размером 315-630 мкм. Оценку биосовместимости проводили на примере культуры фибробластов человека линии М-22. В лунки 4-луночного планшета с площадью ростовой поверхности 1,9 см2 вносили по 10 тыс. клеток в среде ДМЭМ, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки. В контрольные лунки вносили суспензию клеток без КПМ, в опытные лунки помещали готовые лиофилизированные образцы КПМ, не подвергавшиеся дополнительным обработкам, затем вносили суспензию клеток. Клетки инкубировали 3 суток при температуре 37°С и 5% концентрации СО2 в атмосфере. Оценивали количество клеток на дне лунок, и на поверхности трансплантатов, общую структурную целостность клеток и их морфологию. Для этого клетки окрашивали витальным (прижизненным) флуорохромным красителем на основе трипафлавина-акридинового оранжевого или трипафлавина-родамина С и исследовали в конфокальный люминесцентный микроскоп Nikon 80i (Nikon, Япония). Уже через 1 час после помещения КПМ в культуральную среду отмечалось изменение окраски индикатора питательной среды, смещение pH среды в кислую сторону (ацидогенность), которое не было связано с контаминацией образцов патогенной флорой. Через 3 суток культивирования на дне лунок с КПМ число клеток было очень низким и не превышало в среднем 1 тыс. на см2. В то же время в контрольных лунках содержание клеток составляло 14-15 тыс. на 1 см2. В составе КПМ клетки не выявлялись (Фиг. 3), таким образом, заметное снижение числа клеток на дне лунок не было связано с их миграцией внутрь трансплантата. Одновременно с этим в опытных лунках в культуральной среде отмечали большое количество ошаренных клеток, с характерными апоптотическими изменениями. Таким образом, лиофилизированные образцы КПМ, не подвергавшиеся предварительной подготовке/обработке для работы с клетками, обладали выраженной ацидогенностью и токсичностью, что приводило к массовой гибели клеток в культуре.To assess the biocompatibility of finished products in vitro, CPM samples made on the basis of a 0.8% solution of type 1 collagen and bone chips with a size of 315-630 microns were used. Biocompatibility was assessed using the example of a culture of human fibroblasts line M-22. 10 thousand cells were added into the wells of a 4-well plate with a growth surface area of 1.9 cm2 in DMEM medium containing 10% fetal bovine serum. A cell suspension without CPM was added to the control wells, ready-made lyophilized samples of CPM that were not subjected to additional treatments were placed into the experimental wells, then the cell suspension was added. The cells were incubated for 3 days at a temperature of 37°C and 5% CO2 concentration in the atmosphere. The number of cells at the bottom of the wells and on the surface of the grafts, the overall structural integrity of the cells and their morphology were assessed. For this purpose, cells were stained with a vital (vital) fluorochrome dye based on trypaflavin-acridine orange or trypaflavin-rhodamine C and examined using a Nikon 80i confocal fluorescent microscope (Nikon, Japan). Already 1 hour after placing the CPM in the culture medium, there was a change in the color of the nutrient medium indicator, a shift in the pH of the medium to the acidic side (acidogenicity), which was not associated with contamination of the samples with pathogenic flora. After 3 days of cultivation at the bottom of the wells with CPM, the number of cells was very low and did not exceed an average of 1 thousand per cm 2 . At the same time, in the control wells the cell content was 14-15 thousand per 1 cm2 . No cells were detected within the CPM (Fig. 3), thus, a noticeable decrease in the number of cells at the bottom of the wells was not associated with their migration into the graft. At the same time, in the experimental wells in the culture medium, a large number of enlarged cells with characteristic apoptotic changes were noted. Thus, lyophilized samples of CPM, which were not subjected to preliminary preparation/processing for working with cells, had pronounced acidogenicity and toxicity, which led to massive cell death in culture.
Для снижения ацидогенности и токсичности КПМ было предложено два способа. В первой серии экспериментов трансплантаты готовили по указанной выше методике, затем образцы замачивали в 0,9% растворе хлорида натрия (NaCl) в течение 10, 20, 30, 40, 50 или 60 минут, после этого образцы КПМ помещали в культуру клеток. Во второй серии экспериментов смесь раствора коллагена и костной крошки до замораживания отмывали в дистиллированной воде. Один цикл отмывания включал центрифугирование смеси костной крошки и коллагена в пробирке типа Falcon с ускорением 3000 g 20 минут, полное замещение супернатанта эквивалентным объемом стерильной дистиллированной воды, ресуспендирование содержимого в пробирке. Число циклов отмывания варьировало от 1 до 4. После отмывания смесь коллагена и костной крошки замораживали, лиофилизировали, перед помещением в культуру клеток замачивания в физрастворе не проводили. В контрольных лунках (без КПМ) число клеток после 3 суток культивирования на дне лунок составляло 23-24 тыс./см2, тогда как в опытах с исходным КПМ этот параметр не превышал 0,9-1,0 тыс./см2, на поверхности КПМ клетки полностью отсутствовали (табл. 3). В лунках, где образцы КПМ предварительно вымачивали в изотоничном растворе NaCl, количество клеток на дне составляло от 3,0±0,5 до 17,5±0,8 тыс./см2 и увеличивалось по мере роста длительности вымачивания изделия с 10 до 50 минут. Параллельно увеличивалось число клеток на трансплантате: после вымачивания 20 минут их количество составляло 1,0±0,2 тыс./см2, а после 50 минут достигало 4,5±0,7 тыс./см2. Стоит особо подчеркнуть, что в опытах, где вымачивание КПМ продолжалось 10-20 минут, многие клетки на дне лунок и на поверхности трансплантата имели ошаренный или измененный вид, плохо контактировали с пластиком. Витальное окрашивание клеток показало заметное снижение яркости наружной мембраны, резкое снижение количества секреторных везикул в составе клеток, свидетельствующие о деформации клеток, разрушении их вакуолярных структур, нарушении контактных взаимодействий, что в совокупности можно расценить как токсический эффект. В опытах, где вымачивание составляло 30-50 мин, ошаренные клетки отсутствовали, соответственно, морфология клеток была нормальной или близкой к норме. В случае вымачивания КПМ 60 минут число клеток и их морфология значимо не отличались от опытов, где вымачивание составило 50 мин. В серии экспериментов, где проводили отмывание смеси коллагена и костной крошки до лиофилизации, отмечалось поэтапное изменение её pH с 3,3 до 6,1 по мере увеличения количества циклов обработки до 4. При исследовании in vitro количество клеток на дне лунок, в которые помещали КПМ, прошедшие разное количество циклов дополнительной обработки, составляло от 5,0 до 7,5 тыс./см2 (р>0,05). В то же время плотность клеток на поверхности трансплантата после 3-4 отмываний коллагена была выше, чем после 1-2 отмываний. Однако абсолютные значения были во всех случаях очень низкими, не превышали 2 тыс./см2 и были ниже, чем в опытах с вымачиванием трансплантатов в течение 30-60 мин (табл. 3). Таким образом, вымачивание готовых лиофилизированных трансплантатов КПМ в физрастворе более эффективно снижает их токсичность, продолжительность вымачивания должна составлять не менее 30 минут.Two methods have been proposed to reduce the acidogenicity and toxicity of CPM. In the first series of experiments, grafts were prepared according to the above method, then the samples were soaked in 0.9% sodium chloride (NaCl) solution for 10, 20, 30, 40, 50 or 60 minutes, after which the CPM samples were placed in cell culture. In the second series of experiments, a mixture of collagen solution and bone chips was washed in distilled water before freezing. One washing cycle included centrifugation of a mixture of bone chips and collagen in a Falcon tube at 3000 g for 20 minutes, complete replacement of the supernatant with an equivalent volume of sterile distilled water, and resuspension of the contents in the tube. The number of washing cycles varied from 1 to 4. After washing, the mixture of collagen and bone chips was frozen and lyophilized, and no soaking in saline was carried out before placing it into the cell culture. In control wells (without CPM), the number of cells after 3 days of cultivation at the bottom of the wells was 23-24 thousand/ cm2 , whereas in experiments with the original CPM this parameter did not exceed 0.9-1.0 thousand/ cm2 . On the surface of the CPM, cells were completely absent (Table 3). In the wells where CPM samples were pre-soaked in an isotonic NaCl solution, the number of cells at the bottom ranged from 3.0±0.5 to 17.5±0.8 thousand/ cm2 and increased as the duration of soaking of the product increased from 10 to 50 minutes. At the same time, the number of cells on the graft increased: after soaking for 20 minutes, their number was 1.0±0.2 thousand/ cm2 , and after 50 minutes it reached 4.5±0.7 thousand/ cm2 . It is worth emphasizing that in experiments where the soaking of the CPM lasted 10-20 minutes, many cells at the bottom of the wells and on the surface of the graft had a stubby or altered appearance and were in poor contact with the plastic. Vital staining of cells showed a noticeable decrease in the brightness of the outer membrane, a sharp decrease in the number of secretory vesicles in the cells, indicating deformation of cells, destruction of their vacuolar structures, disruption of contact interactions, which together can be regarded as a toxic effect. In experiments where soaking lasted 30-50 minutes, there were no enlarged cells; accordingly, the morphology of the cells was normal or close to normal. In the case of soaking the CPM for 60 minutes, the number of cells and their morphology did not differ significantly from the experiments where the soaking was 50 minutes. In a series of experiments where a mixture of collagen and bone chips was washed before lyophilization, a gradual change in its pH was noted from 3.3 to 6.1 as the number of treatment cycles increased to 4. In an in vitro study, the number of cells at the bottom of the wells in which CPM that underwent different numbers of additional processing cycles ranged from 5.0 to 7.5 thousand/cm 2 (p>0.05). At the same time, the cell density on the surface of the graft after 3-4 washings of collagen was higher than after 1-2 washings. However, the absolute values were very low in all cases, did not exceed 2 thousand/cm2 and were lower than in experiments with soaking grafts for 30-60 minutes (Table 3). Thus, soaking ready-made lyophilized CPM grafts in saline solution more effectively reduces their toxicity; the duration of soaking should be at least 30 minutes.
Таблица 3. Оценка биосовместимости трансплантатов костно-пластического материала, подготовленных разными способамиTable 3. Assessment of the biocompatibility of bone-plastic material grafts prepared in different ways
в изотоническом физраствореCPM exposure time
in isotonic saline
На втором этапе исследовали адгезивные свойства КПМ, полученные с использованием костной крошки разного диаметра и раствора коллагена в двух концентрациях, параллельно исследовали коллагеновые губки, полученные из раствора с той же концентрацией коллагена без использования костной крошки. В работе использовали 8 типов КПМ, полученных из 0,8% или 1,1% раствора коллагена 1 типа человека и костной крошки одного из размеров: 80-180 мкм, 250-315 мкм, 500-630 мкм, 700-800 мкм. После совмещения компонентов оценивали характер распределения костной крошки в коллагене (гомогенность), после лиофилизации оценивали стабильность готового изделия, характер распределения коллагена и структурную целостность волокон. Помимо этого, в культуре клеток оценивали токсичность образцов КПМ и возможность ее редукции путем отмывания в физиологическом растворе хлорида натрия в течение 30 минут. Структурную целостность коллагена оценивали по уровню автофлуоресценции коллагеновых волокон в составе КПМ. Регистрацию автофлуоресценции коллагена в образцах КПМ проводили при синем светофильтре (λ возбуждения=380-420 нм, λ эмиссии – от 450 нм, время экспозиции – 1сек). Для количественной характеристики автофлуоресценции коллагена использовали параметр средней интенсивности свечения (в фут-канделах, foot candle, FC). Для сравнения оценивали свечения коллагеновых волокон в составе коллагеновых повязок, приготовленных с использованием того же раствора коллагена по известной методике. Химическая деградация коллагена сопровождается резким увеличением автофлуоресценции волокон и превышает 60 FC [Макаров М.С., Сторожева М.В., Боровкова Н.В. Значение автофлюоресценции коллагеновых волокон для оценки биологических свойств тканевых трансплантатов // Современные технологии в медицине. –2017. –Т.9, №2. –С. 83–90].At the second stage, the adhesive properties of CPMs obtained using bone chips of different diameters and a collagen solution in two concentrations were studied; in parallel, collagen sponges obtained from a solution with the same collagen concentration without the use of bone chips were studied. In the work, we used 8 types of CPM obtained from a 0.8% or 1.1% solution of human type 1 collagen and bone chips of one of the sizes: 80-180 µm, 250-315 µm, 500-630 µm, 700-800 µm. After combining the components, the distribution of bone chips in collagen (homogeneity) was assessed; after lyophilization, the stability of the finished product, the distribution of collagen and the structural integrity of the fibers were assessed. In addition, the toxicity of CPM samples and the possibility of its reduction in cell culture were assessed by washing in physiological sodium chloride solution for 30 minutes. The structural integrity of collagen was assessed by the level of autofluorescence of collagen fibers in the composition of the CPM. Registration of autofluorescence of collagen in CPM samples was carried out with a blue filter (λ excitation = 380-420 nm, λ emission - from 450 nm, exposure time - 1 sec). To quantitatively characterize the autofluorescence of collagen, the parameter of average luminescence intensity (in foot candles, FC) was used. For comparison, the luminescence of collagen fibers in the composition of collagen bandages prepared using the same collagen solution according to a known method was assessed. Chemical degradation of collagen is accompanied by a sharp increase in autofluorescence of fibers and exceeds 60 FC [Makarov M.S., Storozheva M.V., Borovkova N.V. The importance of autofluorescence of collagen fibers for assessing the biological properties of tissue grafts // Modern technologies in medicine. –2017. –T.9, No. 2. -WITH. 83–90].
После лиофилизации все образцы были стабильными и не фрагментировались. В опытах in vitro параллельно оценивали образцы КПМ и коллагеновые повязки, полученные из раствора с той же концентрацией коллагена (0,8% и 1,1%). В присутствии коллагеновых повязок не наблюдалось деформации клеток на дне лунок и в составе трансплантатов, клетки адгезировали на поверхности повязок (Фиг. 3а). Все образцы КПМ без предварительного вымачивания были токсичными и препятствовали росту клеток (Фиг. 1б). В опытах, где КПМ предварительно вымачивали в изотоническом физрастворе в течение 30-50 минут, не наблюдалось выраженной деформации клеток. В КПМ, полученных из 0,8% раствора коллагена, образцы КПМ с костной крошкой диаметром 80-630 мкм через 3 суток культивирования имели сходную плотность клеток на своей поверхности (Фиг. 3в) и значимо не отличались от коллагеновых трансплантатов без костной крошки, тогда как в КПМ с костной крошкой диаметром 700-800 мкм число клеток было ниже в 3-4 раза (Фиг. 4а). Число клеток на дне лунок было наибольшим в опытах, где диаметр костной крошки составлял 80-180 мкм, что может быть с менее активной миграцией клеток в КПМ из-за низкой гомогенности материала в его составе. В КПМ, полученных из 1,1% раствора коллагена, адгезия клеток на поверхности КПМ была гораздо менее выраженной, чем на коллагене без костной крошки и в КПМ, приготовленном с использованием 0,8% раствора коллагена и костной крошки диаметром 80-630 мкм и не превышала 2 тыс. на см2 (Фиг. 4б). В целом, можно заключить, что 0,8% раствор коллагена более предпочтителен для изготовления КПМ, чем 1,1% раствор. КПМ, приготовленные с использованием 0,8% раствора коллагена и костной крошки диаметром 80-630 мкм после предварительного вымачивания являются высокоадгезивными для клеток, КПМ, приготовленные с использованием 0,8% раствора коллагена и костной крошки диаметром 700-800 мкм или 1,1% раствора коллагена и костной крошки диаметром 80-800 мкм после предварительного вымачивания являются низкоадгезивными для клеток.After lyophilization, all samples were stable and did not fragment. In in vitro experiments, CPM samples and collagen dressings obtained from a solution with the same collagen concentration (0.8% and 1.1%) were simultaneously evaluated. In the presence of collagen bandages, no deformation of cells was observed at the bottom of the wells or in the grafts; the cells adhered to the surface of the bandages (Fig. 3a). All CPM samples without pre-soaking were toxic and inhibited cell growth (Fig. 1b). In experiments where the CPM was pre-soaked in an isotonic saline solution for 30-50 minutes, no pronounced cell deformation was observed. In CPMs obtained from a 0.8% collagen solution, samples of CPMs with bone chips with a diameter of 80-630 μm after 3 days of cultivation had a similar density of cells on their surface (Fig. 3c) and did not differ significantly from collagen grafts without bone chips, then as in CPM with bone chips with a diameter of 700-800 μm, the number of cells was 3-4 times lower (Fig. 4a). The number of cells at the bottom of the wells was greatest in experiments where the diameter of the bone chips was 80-180 µm, which may be due to less active migration of cells into the CPM due to the low homogeneity of the material in its composition. In CPMs obtained from a 1.1% collagen solution, cell adhesion on the surface of CPMs was much less pronounced than on collagen without bone chips and in CPMs prepared using a 0.8% solution of collagen and bone chips with a diameter of 80-630 μm and did not exceed 2 thousand per cm 2 (Fig. 4b). In general, it can be concluded that a 0.8% collagen solution is more preferable for the production of CPM than a 1.1% solution. CPMs prepared using a 0.8% solution of collagen and bone chips with a diameter of 80-630 microns after pre-soaking are highly adhesive for cells, CPMs prepared using a 0.8% solution of collagen and bone chips with a diameter of 700-800 microns or 1.1 % solution of collagen and bone chips with a diameter of 80-800 microns after pre-soaking are low-adhesive for cells.
На третьем этапе оценивали структурную целостность коллагена в готовых трансплантатах, их устойчивость к биодеградации и возможность насыщения ростовыми факторами. Для оценки качества коллагена оценивали автофлуоресценцию коллагеновых волокон в КПМ и в коллагеновых повязках, полученных из раствора с той же концентрацией коллагена, которая использовалась при изготовлении КПМ (0,8% и 1,1%). При анализе автофлуоресценции коллагена в коллагеновых повязках отчетливо выявлялись зоны с диффузным расположением коллагена и зоны с коллагеновыми волокнами (Фиг. 5а). В образцах КПМ коллагеновые волокна выявлялись гораздо реже, основная область была заполнена диффузным слоем коллагена (Фиг. 5б,в). В большинстве случаев средняя интенсивность автофлуоресценции коллагена в повязках и КПМ с 0,8% коллагена значимо не отличалась и составляла в среднем 28±1 FC. Тем не менее, среди образцов КПМ встречались образцы, где уровень автофлуоресценции составлял от 40 до 50 FC из-за высокого содержания дефектных волокон. В таких образах КПМ при малом увеличении (х40) выявляется не меньше 1-2 зон с волокнами яркостью 60 FC и выше в каждом поле зрения (Фиг. 5г). Доля КПМ с высоким уровнем дефектных волокон не превышала 10% от всего числа КПМ, тем не менее, мониторинг качества коллагена является актуальным. КПМ с высоким содержанием дефектных волокон может обладать повышенной токсичностью и склонностью к биодеградации, в связи с этим такие образцы КПМ необходимо элиминировать еще до стадии клинического использования.At the third stage, the structural integrity of collagen in the finished grafts, their resistance to biodegradation and the possibility of saturation with growth factors were assessed. To assess the quality of collagen, we assessed the autofluorescence of collagen fibers in CPM and in collagen dressings obtained from a solution with the same collagen concentration that was used in the manufacture of CPM (0.8% and 1.1%). When analyzing the autofluorescence of collagen in collagen bandages, zones with a diffuse arrangement of collagen and zones with collagen fibers were clearly identified (Fig. 5a). In the CPM samples, collagen fibers were detected much less frequently; the main area was filled with a diffuse layer of collagen (Fig. 5b, c). In most cases, the average autofluorescence intensity of collagen in dressings and CPM with 0.8% collagen was not significantly different and averaged 28 ± 1 FC. However, among the CPM samples there were samples where the autofluorescence level ranged from 40 to 50 FC due to the high content of defective fibers. In such CPM images at low magnification (x40), at least 1-2 zones with fibers with a brightness of 60 FC and higher are detected in each field of view (Fig. 5d). The proportion of CPMs with a high level of defective fibers did not exceed 10% of the total number of CPMs; however, monitoring the quality of collagen is relevant. CPM with a high content of defective fibers may have increased toxicity and a tendency to biodegradation; therefore, such samples of CPM must be eliminated before the stage of clinical use.
Для оценки биодеградации КПМ in vitro изначально отбирали образцы, не содержащие деградирующих волокон (яркостью 60 фут-кандел и выше), с высокой гомогенностью распределения костной крошки. В исходных образцах КПМ, приготовленных с помощью 0,8% раствора коллагена (1 группа), уровень автофлуоресценции коллагеновых волокон составлял 27±1 фут-кандел, в КПМ, приготовленных с помощью 1,1% раствора коллагена (2 группа) – 32±1 фут-кандел. Исследуемые образцы экспонировали в течение 4 недель в культуральной среде ДМЭМ и в изотоническом физрастворе (0,9% NaCl). Экспозицию в среде ДМЭМ проводили без клеток, в присутствии клеток линии М-22, в присутствии клеток с предварительным вымачиванием КПМ в лизате бедной тромбоцитами плазмы. Оценивали структурную целостность волокон коллагена и массу КПМ. Через 2 недели экспозиции уровень автофлуоресценции во всех образах КПМ 2 группы значимо не менялся, в 1 группе уровень автофлуоресценции в образцах, экспонированных в изотоническом физрастворе (0,9% NaCl), был незначительно снижен и достоверно не отличался от исходных образцов, рисунок распределения волокон также не менялся. Напротив, через 4 недели в обеих группах топография волокон заметно изменялась, во многих участках КПМ коллагеновые волокна не выявлялись, вместо них можно было видеть диффузное распределение коллагена с низкой интенсивностью свечения (15-18 фут-кандел), что указывает на деконденсацию коллагена. Одновременно с этим выявлялись участки, где уровень автофлуоресценции превышал 60 фут-кандел. В опытах, где образцы КПМ экспонировались в культуральной среде, фрагменты волокон с яркостью 60 фут-кандел были немногочисленными (Фиг. 5д,е). Напротив, в опытах, где КПМ экспонировали в изотоническом физрастворе, волокна с яркостью 60 фут-кандел занимали обширные зоны, чаще всего были тесно ассоциированы с костной крошкой и давали гомогенную картину свечения (Фиг. 5ж). Стоит отметить, что в КПМ 2 группы (полученные с использованием 1,1% раствора коллагена) химическая деградация волокон была выражен сильнее, чем в КПМ 1 группы. В обеих группах предварительное вымачивание КПМ в лизате бедной тромбоцитами плазмы не влияло на интенсивность изменения топографии волокон через 4 недели. Оценка массы образцов КПМ до и после экспозиции показала, что КПМ, полученные с использованием 1,1% раствора коллагена, теряли больше материала по сравнению с КПМ, приготовленными с использованием 0,8% раствора коллагена, при этом в изотоническом физрастворе процесс биодеградации шел гораздо быстрее, чем в культуральной среде (табл. 4). С учетом того, что условия культуральной среды более приближены к среде организма, можно заключить, что разработанный материал в течение 4 недель будет иметь низкую интенсивность биодеградации, при этом сохранность структуры и объема коллагена является более высокой при использовании КПМ, полученные с использованием 0,8% раствора коллагена. To assess the biodegradation of CPM in vitro, samples were initially selected that did not contain degrading fibers (with a brightness of 60 foot-candles and above), with a highly homogeneous distribution of bone chips. In the initial CPM samples prepared using a 0.8% collagen solution (group 1), the level of autofluorescence of collagen fibers was 27±1 foot-candles, in CPM prepared using a 1.1% collagen solution (group 2) – 32± 1 footcandle. The studied samples were exposed for 4 weeks in the DMEM culture medium and in isotonic saline solution (0.9% NaCl). Exposure to DMEM medium was carried out without cells, in the presence of M-22 cells, in the presence of cells with preliminary soaking of the CPM in platelet-poor plasma lysate. The structural integrity of the collagen fibers and the mass of the CPM were assessed. After 2 weeks of exposure, the level of autofluorescence in all samples of CPM of group 2 did not change significantly; in group 1, the level of autofluorescence in samples exposed in isotonic saline solution (0.9% NaCl) was slightly reduced and did not differ significantly from the original samples, fiber distribution pattern also didn't change. In contrast, after 4 weeks in both groups, the topography of the fibers noticeably changed; in many areas of the CPM, collagen fibers were not detected, but instead a diffuse distribution of collagen with low luminescence intensity (15-18 foot-candles) could be seen, indicating collagen decondensation. At the same time, areas were identified where the level of autofluorescence exceeded 60 foot-candles. In experiments where CPM samples were exposed in culture medium, fiber fragments with a brightness of 60 foot-candles were few in number (Fig. 5e, f). On the contrary, in experiments where CPMs were exposed in isotonic saline, fibers with a brightness of 60 foot-candles occupied large areas, were most often closely associated with bone chips and gave a homogeneous luminescence pattern (Fig. 5g). It is worth noting that in the CPM of group 2 (obtained using a 1.1% collagen solution), the chemical degradation of the fibers was more pronounced than in the CPM of group 1. In both groups, pre-soaking the CPM in platelet-poor plasma lysate did not affect the intensity of changes in fiber topography after 4 weeks. An assessment of the mass of CPM samples before and after exposure showed that CPM obtained using a 1.1% collagen solution lost more material compared to CPM prepared using a 0.8% collagen solution, while in an isotonic saline solution the process of biodegradation was much faster faster than in the culture medium (Table 4). Taking into account the fact that the conditions of the cultural environment are closer to the environment of the body, we can conclude that the developed material will have a low intensity of biodegradation within 4 weeks, while the preservation of the structure and volume of collagen is higher when using CPM obtained using 0.8 % collagen solution.
Таблица 4. Снижение массы образцов КПМ (в % от исходной) после экспозиции в культуральной средеTable 4. Reduction in the weight of CPM samples (in% of the original) after exposure to a culture medium
С учетом полученных данных, для насыщения тромбоцитными препаратами использовали образцы КПМ, предварительно вымоченные в изотоническом физрастворе. Было установлено, что 1 см2 КПМ после вымачивания в изотоническом физрастворе нормально адсорбирует 40-50 мл тромбоцитных препаратов. При этом может быть использована богатая и бедная тромбоцитами плазма, а также лизат богатой и бедной тромбоцитами плазмы, полученный путем криодеструкции тромбоцитов.Taking into account the data obtained, CPM samples pre-soaked in isotonic saline were used to saturate them with platelet preparations. It was found that 1 cm 2 of CPM after soaking in an isotonic saline solution normally adsorbs 40-50 ml of platelet preparations. In this case, platelet-rich and platelet-poor plasma can be used, as well as a lysate of platelet-rich and platelet-poor plasma obtained by cryodestruction of platelets.
Были проведены исследования в культуре клеток М-22 с использованием богатой тромбоцитами плазмы (БоТП) и лизата БоТП. Объем внесенных тромбоцитных препаратов исходно содержал 100-125 млн тромбоцитов с гранулами, содержание тромбоцитарного фактора PDGF составляло 150-200 пг/мл, что является оптимальным в расчете на 100 тыс. высеянных клеток. Добавление тромбоцитных препаратов в КПМ с высокой адгезивностью заметно увеличивало пролиферативную активность фибробластов культуры М-22 в их составе: через 3 суток плотность клеток на поверхности КПМ с лизатом БоТП была выше в среднем в 2,1 раза, на поверхности КПМ с БоТП – в 1,6 раз по сравнению с КПМ без тромбоцитных препаратов (Фиг. 6). В составе КПМ с БоТП и лизатом БоТП клетки имели нормальную структуру ядра и цитоплазмы, содержали большое число секреторных везикул. Таким образом, насыщение КПМ тромбоцитными препаратами дополнительно усиливает биокондуктивные свойства этих трансплантатов. Studies were conducted in M-22 cell culture using platelet-rich plasma (PRP) and PRP lysate. The volume of platelet preparations introduced initially contained 100-125 million platelets with granules, the content of the platelet factor PDGF was 150-200 pg/ml, which is optimal per 100 thousand seeded cells. The addition of platelet preparations to CPMs with high adhesiveness significantly increased the proliferative activity of fibroblasts from the M-22 culture in their composition: after 3 days, the cell density on the surface of CPMs with PRP lysate was on average 2.1 times higher, on the surface of CPMs with PRP - 1 times higher .6 times compared to CPM without platelet preparations (Fig. 6). As part of CPM with PRP and PRP lysate, the cells had a normal nuclear and cytoplasmic structure and contained a large number of secretory vesicles. Thus, saturation of the CPM with platelet preparations further enhances the bioconductive properties of these grafts.
Таким образом, костно-пластический материал (КПМ) на основе костной крошки и коллагена тканевых доноров не вызывает иммунологических реакций в тканях человека, может быть дополнительно насыщен ростовыми факторами, выделенными из собственной крови пациента. В зависимости от поставленной клинической задачи, в рамках предлагаемого способа могут быть получены изделия КПМ с разными биологическими характеристиками. Критически значимым является вымачивание изделий перед клиническим применением в изотоническом растворе хлорида натрия (0,9% NaCl) с целью снижения их ацидогенности и повышения биосовместимости. КПМ, полученные с использованием 0,8% раствора коллагена, более удобны для получения высокоадгезивного материала с гомогенным распределением костной крошки, менее подвержены биодеградации. КПМ, полученные с использованием 1,1% раствора коллагена, могут быть использованы для стимуляции остеокондуктивного остеогенеза в тканях с высокой репаративной активностью, КПМ с низкой адгезивностью и высокой гомогенностью могут быть использованы при лечении дефектов костной ткани с постоянной высокой механической нагрузкой, КПМ с низкой адгезивностью и с низкой гомогенностью могут быть использованы при лечении дефектов кости, где постоянная механическая нагрузка отсутствует.Thus, bone plastic material (BPM) based on bone chips and collagen from tissue donors does not cause immunological reactions in human tissues and can be additionally saturated with growth factors isolated from the patient’s own blood. Depending on the clinical task, the proposed method can produce CPM products with different biological characteristics. It is critical to soak products before clinical use in an isotonic solution of sodium chloride (0.9% NaCl) in order to reduce their acidogenicity and increase biocompatibility. CPMs obtained using a 0.8% collagen solution are more convenient for obtaining a highly adhesive material with a homogeneous distribution of bone chips and are less susceptible to biodegradation. CPMs obtained using a 1.1% collagen solution can be used to stimulate osteoconductive osteogenesis in tissues with high reparative activity, CPMs with low adhesiveness and high homogeneity can be used in the treatment of bone tissue defects with constant high mechanical load, CPMs with low adhesiveness and low homogeneity can be used in the treatment of bone defects where there is no constant mechanical load.
Claims (4)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2812733C1 true RU2812733C1 (en) | 2024-02-01 |
Family
ID=
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2344826C1 (en) * | 2007-04-24 | 2009-01-27 | ФГУ Новосибирский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии (ФГУ ННИИТО Росздрава) | Method of orgamax bioactive osteoplastic material preparation |
| RU2524618C1 (en) * | 2013-07-04 | 2014-07-27 | Государственное бюджетное учреждение здравоохранения города Москвы Научно-исследовательский институт скорой помощи имени Н.В. Склифосовского Департамента здравоохранения г. Москвы | Combined bone allograft and method for preparing it |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2344826C1 (en) * | 2007-04-24 | 2009-01-27 | ФГУ Новосибирский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии (ФГУ ННИИТО Росздрава) | Method of orgamax bioactive osteoplastic material preparation |
| RU2524618C1 (en) * | 2013-07-04 | 2014-07-27 | Государственное бюджетное учреждение здравоохранения города Москвы Научно-исследовательский институт скорой помощи имени Н.В. Склифосовского Департамента здравоохранения г. Москвы | Combined bone allograft and method for preparing it |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| A.Yu.Vaza. et al., Analysis of the application of different bone grafting procedures in patients with intra-articular fractures / Transplantologiya, 2015. N.4., pp.6-12. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1296726B1 (en) | Osteogenic implants derived from bone | |
| US11786634B2 (en) | Demineralized bone matrix having improved handling characteristics | |
| KR102248576B1 (en) | Solid substrates for promoting cell and tissue growth | |
| Gao et al. | Hydrogel composite scaffolds with an attenuated immunogenicity component for bone tissue engineering applications | |
| Zheng et al. | Effect of a β‐TCP collagen composite bone substitute on healing of drilled bone voids in the distal femoral condyle of rabbits | |
| KR20030036620A (en) | Osteoimplant and method of making same | |
| Viateau et al. | Comparative study of the osteogenic ability of four different ceramic constructs in an ectopic large animal model | |
| Jungbluth et al. | Platelet‐rich plasma on calcium phosphate granules promotes metaphyseal bone healing in mini‐pigs | |
| Dias et al. | Osseous regeneration in the presence of oxidized cellulose and collagen | |
| AU2016304809A1 (en) | Rapid allograft treatment systems and methods | |
| Liu et al. | Three-dimensionally presented anti-fouling zwitterionic motifs sequester and enable high-efficiency delivery of therapeutic proteins | |
| US8784908B1 (en) | Composition of a bone repair mixture | |
| US20250375483A1 (en) | Fibrous birth tissue composition and method of use | |
| Balaguer et al. | Combination of blood and biphasic calcium phosphate microparticles for the reconstruction of large bone defects in dog: A pilot study | |
| US8962044B2 (en) | Radiopaque bone repair mixture and method of use | |
| Hutchens et al. | Efficacy of silicate-substituted calcium phosphate with enhanced strut porosity as a standalone bone graft substitute and autograft extender in an ovine distal femoral critical defect model | |
| RU2627844C1 (en) | Method for obtaining suspensional form of a ruled decellularized extracellular matrix | |
| RU2812733C1 (en) | Bone-plastic material with controlled properties, a method of its production and use | |
| De Paula et al. | Hydroxyapatite-alginate biocomposite promotes bone mineralization in different length scales in vivo | |
| RU2813134C1 (en) | Bone plastic material with controlled properties, method of its production and use | |
| RU2813132C1 (en) | Bone plastic material with controlled properties, method of its production and use | |
| RU2524618C1 (en) | Combined bone allograft and method for preparing it | |
| Le Guehennec et al. | Influence of calcium chloride and aprotinin in the in vivo biological performance of a composite combining biphasic calcium phosphate granules and fibrin sealant | |
| CN118662701A (en) | A multi-layer biological bone repair material and its preparation method and application | |
| Xie et al. | The effect of platelet-rich plasma with mineralized collagen-based scaffold on mandible defect repair in rabbits |