RU2812147C1 - Способ дифференциации Listeria monocytogenes от других видов Listeria spp. методом дот-блоттинга с использованием конъюгированных антител против фактора патогенности InlB - Google Patents
Способ дифференциации Listeria monocytogenes от других видов Listeria spp. методом дот-блоттинга с использованием конъюгированных антител против фактора патогенности InlB Download PDFInfo
- Publication number
- RU2812147C1 RU2812147C1 RU2023109311A RU2023109311A RU2812147C1 RU 2812147 C1 RU2812147 C1 RU 2812147C1 RU 2023109311 A RU2023109311 A RU 2023109311A RU 2023109311 A RU2023109311 A RU 2023109311A RU 2812147 C1 RU2812147 C1 RU 2812147C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- monocytogenes
- listeria
- inlb
- listeria monocytogenes
- differentiating
- Prior art date
Links
- 241000186779 Listeria monocytogenes Species 0.000 title claims abstract description 56
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 49
- 241000186781 Listeria Species 0.000 title claims abstract description 23
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 title description 5
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 23
- 101710148893 Internalin B Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 19
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims abstract description 16
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims abstract description 10
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 claims abstract description 6
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 claims abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 5
- 238000011109 contamination Methods 0.000 claims abstract description 3
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims description 10
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 10
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 8
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 5
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 3
- 238000012800 visualization Methods 0.000 claims description 3
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 abstract description 13
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 abstract description 12
- 239000008272 agar Substances 0.000 abstract description 12
- 244000005700 microbiome Species 0.000 abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 13
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 12
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 11
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 10
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 10
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 8
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 241000186805 Listeria innocua Species 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 5
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 5
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 5
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 5
- 230000000521 hyperimmunizing effect Effects 0.000 description 5
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 5
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 5
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 5
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000440393 Listeria monocytogenes EGD-e Species 0.000 description 4
- 206010024641 Listeriosis Diseases 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 4
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 4
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 4
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 3
- 101150082952 ACTA1 gene Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 3
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 3
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 3
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 240000003291 Armoracia rusticana Species 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 208000019331 Foodborne disease Diseases 0.000 description 2
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 2
- 240000009298 Zingiber montanum Species 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000003610 charcoal Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 2
- 101150046348 inlB gene Proteins 0.000 description 2
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 2
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 235000020185 raw untreated milk Nutrition 0.000 description 2
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010000234 Abortion spontaneous Diseases 0.000 description 1
- 235000011330 Armoracia rusticana Nutrition 0.000 description 1
- 208000031729 Bacteremia Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000700112 Chinchilla Species 0.000 description 1
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 241000186780 Listeria ivanovii Species 0.000 description 1
- 101710164436 Listeriolysin O Proteins 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 1
- 208000006816 Neonatal Sepsis Diseases 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 description 1
- 102000015439 Phospholipases Human genes 0.000 description 1
- 108010064785 Phospholipases Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 208000034809 Product contamination Diseases 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 230000008952 bacterial invasion Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 239000007621 bhi medium Substances 0.000 description 1
- 238000010876 biochemical test Methods 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 235000010633 broth Nutrition 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 235000013345 egg yolk Nutrition 0.000 description 1
- 210000002969 egg yolk Anatomy 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000002949 hemolytic effect Effects 0.000 description 1
- 101150021605 hlyA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 238000007834 ligase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 201000011475 meningoencephalitis Diseases 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013048 microbiological method Methods 0.000 description 1
- 208000015994 miscarriage Diseases 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 150000002978 peroxides Chemical class 0.000 description 1
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000004094 preconcentration Methods 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000007320 rich medium Substances 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 235000008983 soft cheese Nutrition 0.000 description 1
- 208000000995 spontaneous abortion Diseases 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 239000003656 tris buffered saline Substances 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии и микробиологии. Описан способ идентификации и дифференциации Listeria monocytogenes. Выращивают микроорганизмы на агаризованной питательной среде, содержащей 0,02% активированного угля. Получают отпечатки колоний на нитроцеллюлозной мембране. Визуализируют отпечатки колоний с использованием поликлональных моноспецифических антител против интерналина В, конъюгированных с пероксидазой хрена. Изобретение может быть использовано для санитарно-эпидемиологического контроля зараженности продуктов. Изобретение позволяет дифференцировать колонии Listeria monocytogenes от других микроорганизмов и представителей рода Listeria. 2 н. и 5 з.п. ф-лы, 5 ил, 1 табл., 6 пр.
Description
Область техники
Изобретение относится к области биотехнологии и микробиологии и касается способа идентификации Listeria monocytogenes методом дот-блоттинга. Изобретение позволяет дифференцировать колонии Listeria monocytogenes от других микроорганизмов и представителей рода Listeria и может быть использовано для санитарно-эпидемиологического контроля зараженности продуктов.
Уровень техники
Тема микробиологической безопасности пищевых продуктов активно изучается на протяжении нескольких десятков лет. В последние годы, стандарты пищевой безопасности стали значительно строже во многих странах (Van Kreijl et al., 2006). Среди многих патогенных и потенциально патогенных бактерий, вызывающих пищевые токсикоинфекции, особое внимание привлекают грамотрицательные микроорганизмы Yersiniaspp., Salmonelaspp., Shigellaspp., а из грамположительных бактерий - Listeria spp.
Род Listeria состоит из семнадцати видов, среди которых толькоштаммы вида L. monocytogenes являются патогенными для человека, в частности для людей с ослабленной иммунной системой, а также для пожилых людей и беременных женщин(Vázquez-Boland et al., 2001). Клинически генерализованный листериоз, чаще всего проявляется бактериемией, менингитом или менингоэнцефалитом, а также инфекциями, связанными с беременностью, проявляющимися выкидышем или неонатальным сепсисом. Инвазивный листериоз опасен для жизни и является основной причиной болезней пищевого происхождения, приводящих к госпитализации в европейских странах (Koopmans et al., 2022). Заражение листериозом часто вызывается употреблением контаминированных пищевых продуктов, в частности,мягких сыров, мяса и овощей.
Поскольку вид Listeria monocytogenes является единственным патогенным для человека представителем рода Listeria, необходимо четко дифференцировать этот вид от близкородственных. Известно о разнообразных способах обнаружения L. monocytogenes. Традиционные методы обнаружения L. monocytogenes включают предварительное концентрирование и последующее выделение колоний на селективных средах (Lovettetal., 1987; McClainandLee, 1988). Отдельные колонии исследуют на предмет их морфологии, с последующей биохимической или серологическойидентификацией. Анализ может занимать до 6-8 дней. В настоящее время традиционным методом обнаружения L. monocytogenes в продуктах является метод культивирования, который включает: (1) добавление первичного и вторичного обогащения к образцу; (2) серию биохимических тестов, которые различают различные виды листерий. При этом многочисленные сходства L. monocytogenes с L. innocua и другими непатогенными видами листерий делают обнаружение L. monocytogenes в образцах пищевых продуктов очень сложной задачей. Селективные среды, такие как PALCAM или Оксфорд агар, не являются специфичными для L. monocytogenes, поскольку они также поддерживают рост других видов Listeria и некоторых других родов бактерий. Известен способ дифференциации L. monocytogenesc (RU 2196827 C1), заключающийся в определении гидролиза лецитина на питательной среде, с добавлением и без добавления активированного угля. В 100 мл среды ГРМ-1 (Оболенск) добавляют 5 мл 10% суспензии желтка яичного яйца в физиологическом растворе и определяют гидролиз лецитина без дополнительных добавок и в присутствии 0,5% активированного угля. L. monocytogenes показывает гидролитическую активность в отношении лецитина только в присутствии активированного угля в отличие от других видов листерий Несмотря на относительную быстроту и дешевизну, данный метод требует выделения чистой культуры с последующим пересевом на специфическую среду и инкубацией в течение 48 часов для получения результата. Известен более быстрый метод (RU 2444567 C1), который также основан на лецитиназной активности и занимает 16-18 часов, однако также требует предварительного выделения чистой культуры микроорганизмов. Поскольку легко портящиеся пищевые продукты часто контаминируются L. monocytogenes, возникла необходимость в разработке экспресс-методов обнаружения L. monocytogenes. Среди существующих техник известны методы, основанные на ПЦР и MALDI-TOF, которые обеспечивают наилучший вариант для дифференциации Listeria spp. Однако эти методы являются дорогостоящими и требуют специализированного оборудования. Существуют методы идентификации L. Monocytogenes с использованием олигонуклеотидных зондов, при этом детекцию осуществляют путем прямой гибридизации зондов со специфичной для микроба ДНК или РНК (Datta et al., 1987), (RU2730658). Недостатком этих методов является низкая чувствительность, поскольку требуется по меньшей мере 105 - 106 копий целевой нуклеиновой кислоты. Это может быть компенсировано комбинацией с амплификацией последовательности-мишени, например, с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР). Множество методов ПЦР для выявления L. monocytogenes были описаны в литературе (Norton, 2002) (патенты US4683195; US4683202 и US4965188). Кроме того, лигазная цепная реакция (патент WO 89/09835), самоподдерживающаяся репликация последовательностей (ЕР 329822), система амплификации на основе транскрипции (ЕР 310229). Однако все эти методы требуют специфического оборудования, а также наличие нуклеиновых кислот в образцах не всегда соответствуют наличию жизнеспособных возбудителей.
Еще одним подходом для идентификации L. monocytogenes от близкородственных видов является использование иммунологических методов, основанных на реакции антиген-антитело. Иммунологические методы обнаружения, описанные для L. monocytogenes, основаны, главным образом, на тех мишенях, которые играют роль в патогенности L. monocytogenes. Известно, что некоторые из этих генов расположены на хромосоме рядом друг с другом в островках патогенности. Поскольку листериолизин О (ген hlyA) был впервые описан как необходимый для патогенности, то большинство методов генотипической детекции основаны на этом гене. Также использованы антитела против p60 в разных форматах ИФА-тест систем (Yu et al., 2004) (CN105527441A, CN104099299A), дот-блоттинга (Wi̧ckowska -Szakiel et al., 2002; Yu et al., 2004) и ПЦР (Патент US5932415). Некоторые тест-наборы для выявления с помощью антител уже имеются в продаже. Однако большинство из этих тестов демонстрируют низкую чувствительность и специфичность. В обзоре (BanadaandBhunia, 2008) (Banada&Bhunia, 2008) описаны некоторые из них. Известно использование антител против белка InlB и ActA в комбинации с иммуномагнитными шариками (CN114574448A) или в иммуноблотинге (Lathrop et al., 2008).Однако при выращивании в стандартных средах, InlB и ActA продуцируется на низком уровне, поэтому использующие антитела против InlB наборы имеют низкую чувствительность. Другие иммунологические методы, часто ограничены разделением антигенов клеточной поверхности с другими видами Listeriaspp., что не позволяет дифференцировать L. monocytogenes от непатогенных видов, часто встречающихся в образцах пищевых продуктов.
Таким образом в уровне техники существует потребность в разработке нового экспресс-метода идентификации L. monocytogenes, который будет лишен указанных недостатков. Новый метод идентификации направлен на устранение этапов накопления и выделения чистой культуры, которые занимают несколько дней, характеризуется относительной дешевизной, а также обеспечивает чувствительность и специфичности по отношению к штаммам L. Monocytogenes. В предлагаемом методе дифференциации традиционные микробиологические методы, характеризующиеся надежностью, сочетаются с иммунологическим анализом, предоставляющем специфичность. При этом мишенями для иммунологического анализа являются поверхностные белки, отсутствующие у других видов Listeria spp. Специфические поверхностные белки L. monocytogenes, отсутствующие у других видов Listeria, в основном представлены факторами вирулентности. Поверхностный белок интерналин В (InlB), является фактором вирулентности, опосредующим бактериальную инвазию в непрофессиональные фагоциты, и отсутствует у других видов Listeria. InlB представляет собой секретируемый белок, который может быть закреплен на поверхности клетки посредством нековалентных взаимодействий его С-концевые GW-доменов с тейхоевыми кислотами клеточной стенки (Braun et al., 1997). Как и многие другие факторы вирулентности L. monocytogenes, ген InlB, является частью островка патогенности, контролируемого главным регулятором PrfA(delasHerasetal., 2011). Активность PrfA снижается при культивировании L. monocytogenes на богатой среде, если только среда не дополнена активированным углем или другим гидрофобным адсорбентом. Гидрофобные адсорбенты активируют PrfA и индуцируют экспрессию PrfA-контролируемых факторов вирулентности, включая InlB (Ermolaevaetal., 2004; Krypotouetal., 2019).
Раскрытие сущности изобретения
Технической задачей заявленного изобретения недорого и быстрого способа идентификации L. Monocytogenes.
Технический результат заключается в создании способа дифференциации L. monocytogenes от других видов Listeria spp. методом дот-блоттинга, который позволяет получить результат через 12-26 часов от поступления образцов продуктов питания в лабораторию и не требует предварительного накопления и выделения чистой культуры и примени.
Указанный технический результат достигается тем, что создан способ дифференциации культуры Listeria monocytogenes от других видов Listeria spp., включающий в себя выращивание испытуемых бактерий на твердой питательной среде, содержащей активированный уголь, получение отпечатка колоний на нитроцеллюлозную мембрану, последующую фиксацию мембраны в хлороформе, инкубацию с поликлональными моноспецифическими антителами против интерналина В, конъюгированными с пероксидазой и визуализацию активности в присутствии субстрата. При этом в твердую питательную среду сердечно-мозгового экстракта для выращивания бактерий добавлено 0,02% активированного угля. Кроме того качестве пероксидазы использована пероксидаза хрена (HRP).
Кроме того указанный технический результат достигается тем, что разработано применение способа дифференциации культуры Listeria monocytogenes от от других видов Listeria spp. для оценки обсемененности продуктов питания и клинических образцов.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 схема получения поликлональных моноспецифичных антител против InlB, конъюгированных с пероксидазой хрена.
На фиг. 2 представлена схема определения Listeria monocytogenes в пищевых образцах методом дот-блоттинга.
На фиг.3 представлен дот-иммуноанализ с конъюгатом a-InlB-IgG-HRP (очищенные InlB-специфические IgG, конъюгированные HRP).
А - отпечатки мембран колоний L. monocytogenes EGDe, выращенных на агаре BHI (с добавлением 0,2 % угля);
Б - дот-иммуноанализ мембраны с конъюгатом a-InlB-IgG-HRP.
На фиг. 4 представлена проверка результатов дот-блоттинга.
L. monocytogenes EGDe и L. innocua SLCC 3379 взяты в соотношении 1:1 и выращены на агаре BHIC в течение 24 ч. Отпечатанные колонии отбирали перед отмывкой, затем мембрану обрабатывали конъюгатом a-InlB-IgG-HRP, как описано выше. Для идентификации L. monocytogenes была проведена ПЦР с использованием праймеров, специфичных к гену inlB.
А - отпечатки колоний, выращенных на BHIC-агаре;
Б - результаты дот-иммуноанализа перед отпечатыванием на мембране;
В - продукты ПЦР были разделены на 1 % агарозном геле, фрагмент гена inlB имеет размер 872 п.н. Цифрами обозначены отдельные колонии.
На фиг. 5 представлено обнаружение L. monocytogenes в образцах искусственно инокулированного молока.
Образцы сырого молока инокулировали L. Monocytogenes EGDe до указанных концентраций. Образцы объемом 100 мкл наносили на селективный среду PALCAM и неселективный BHIC-агар.
Принадлежность к виду L. monocytogenes была подтверждена методом ПЦР для бактерий, выращенных на агаре PALCAM, и разработанным методом дот-блот-иммуноанализа для бактерий, выращенных на агаре BHIC.
Реализация изобретения
Предлагаемый авторами способ дифференциации L. monocytogenes в пищевых продуктах заключается в следующем:
1. Производят высевы из образцов продуктов питания на твердую питательную средусердечно-мозгового экстракта, содержащую 0,02% активированного угля, что позволяет увеличить экспрессию InlB в среду и таким образом отличить патогенный вид листерий L.monocytogenes не только от бактерий другого рода, но и от непатогенных листерий, таких например, как Listeriainnocua и Listeriaivanovii.
2. Далее с твердой питательной среды делается отпечаток колоний на нитроцеллюлозную мембрану, с последующей фиксацией в хлороформе.
3. Затем нитроцеллюлозную мембрану инкубируют с поликлональными моноспецифичными антителами против InlB, конъюгированными с пероксидазой хрена (HRP).
4. Далее проводят серию отмывок для удаления избытка антител и визуализацию с использованием субстрата для пероксидары хрена (TMB).
Дот-блот с одной стороны совмещает технику иммуноблоттинга (использование мембраны в качестве носителя антигена и возможность оценить все колонии на твердой питательной среде), с другой стороны простоту иммуноферментного анализа, так как исчезает необходимость специальной подготовки образца, проведения белкового электрофореза и последующего блотирования анализируемых белковых смесей. Таким образом, применяемый метод упростит как пробоподготовку образцов, так как есть возможность анализировать сразу все колонии на твердой питательной среде, так и последующие процедуры скрининга.
Предлагаемый способ дифференциации может быть использован как независимый метод для идентификации и дифференциации Listeria monocytogenes, так и в сочетании с другими методами идентификации, например в сочетании с методами ПЦР или биохимической идентификацией.
Изобретение может быть выполнено в виде тест-системы, содержащей, специфические конъюгированные с HRP антитела против InlB.
Осуществление изобретения подтверждается примерами
Пример 1. Получение гипериммунных сывороток.
Для получения гиппериммунных сывороток в качестве антигена использовался рекомбинантный idInlB (аминокислотные остатки 36-321). Иммунизировали трех кроликов породы «Советская шиншилла» с массой порядка 3-4 кг. Первую иммунизацию проводили внутривенно (0,25 мг антигена), подкожно (0,375 мг + 0,5 мл полного адъюванта Фрейнда (ПАФ), внутримышечно в лапки (0,375 мг + 0,5 мл неполного адъюванта Фрейнда (НАФ)). Через месяц и две недели повторяли цикл иммунизации, но без внутримышечной инъекции. Через два месяца осуществляли внутривенную и внутримышечную инъекцию. Оценивали титр сывороток в иммуноферментном анализе. Схема иммунизации кроликов для получения гипериммунных сывороток с указанием количества антигена представлена в таблице 1.
| Таблица 1. Схема иммунизации кроликов для получения гипериммунной сыворотки к InlB. ПАФ - полный адъювант Фрейнда; НАФ - неполный адъювант Фрейнда; в/в - внутривенно; в/м - внутримышечно в лапку, п/к-подкожно по боковым поверхностям тела в 5 точек с одной стороны. | |||||
| время, недели | № | Объем, мл | масса белка, мг | Адъювант | способ введения |
| 0 | 1-я иммунизация | 1 | 0,25 | - | в/в |
| 1 | 0,375 | 0,5 мл ПАФ | п/к | ||
| 1 | 0,375 | 0,5 мл НАФ | в/м | ||
| 4 | 2-я иммунизация | 1 | 0,25 | - | в/в |
| 1 | 0,75 | 0,5 мл НАФ | п/к | ||
| 6 | 3-я иммунизация | 1 | 0,25 | - | в/в |
| 1 | 0,75 | 0,5 мл НАФ | п/к | ||
| 8 | 4-я иммунизация | 1 | 0,25 | - | в/в |
| 1 | 0,375 | 0,5 мл НАФ | в/м | ||
Пример 2. Получение поликлональных моноспецифичных антител против InlB.
Для получения специфического иммуносорбента очищенный белок, соответствующий области интерналинового домена интерналина В(idInlB), иммобилизовали на BrCN-сефарозе ® 4B. Гипериммунную сыворотку кролика наносилина колонку симмуносорбентом. Колонку промывали фосфатно-солевым буфером с 0,3 М NaCl для удаления несвязанных примесей. InlB-специфические антитела элюировали 4,5 М MgCl2 и подвергали диализу в фосфатно-солевом буфере,рН 7,4 (PBS). Очищенные InlB-специфичные IgG-антитела растворяли до концентрации 5 мг/мл в PBS и хранили в 50% глицерине при -20°C. Схема получения отражена на фиг. 1.
Пример 3. Получение конъюгата анти-InlB IgGHRP.
В дальнейшем анти-InlB IgG конъюгировали пероксидазой хрена с использованием двухстадийного метода и глутарового альдегида в качестве сшивающего агента. 1 стадия. Связывание пероксидазы хрена с глутаровым альдегидом. 10 мг пероксидазы хрена растворяли в 0,2 мл 0,1 М фосфатного буфера, содержащего 0,15 М NaCl и 1,25% глутарового альдегида, рН 6,8, путем перемешивания в течение ночи при комнатной температуре. Избыток глутарового альдегида удаляли диализом против 0,15 М NaCl. 2 стадия. Связывание конъюгатапероксидазы хрена-глутаровый альдегид с IgG. Полученный раствор пероксидазы хрена разбавляли до 1 мл с использованием 0,15 М NaCl. Затем добавляли 1 мл раствора IgG (5 мг/мл), содержащего 0,15 М NaCl и 0,1 мл 1 М карбонатного буфера, рН 9,5. Смесь инкубировали при 4 °C в течение 24 часов, затем добавляли 0,1 мл 0,2 М раствора лизина для остановки реакции. Смесь инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре и диализовалив течение ночи против PBS. Конъюгат a-InlB-IgG - пероксидазы хрена (a-InlB-IgG-HRP) осаждали эквивалентным объемом насыщенного раствора NH4(SO4)2 и растворяли в 1 мл фосфатного буфера. Раствор подвергали диализу против фосфатно-солевого буфера (PBS). Отдиализованный раствор центрифугировали при 10000 g в течение 30 мин, удаляли осадок, добавляли БСА доконцентрации 1% и фильтровали через фильтр с диаметром пор 0,2 мкм. Полученный конъюгат a-InlB-IgG - HRP хранят при -20 °C.
Пример 4. Определение Listeria monocytogenes методом дот-блоттинга.
С чашки с чистой культурой L. monocytogenes петлейпересевают единичную колонию в жидкую среду BHI. Инкубируют при 37 °С в термостатируемом шейкере при 180 об/мин 18 ч. Из полученных ночных культур делают десятикратные разведения. Высевают 100 мкл шестого, седьмого и восьмого разведения на чашках с агаром BHI, содержащий 0,2 % активированный уголь (BHIC) в течение 24 ч. Отпечатывают выращенные колонии на нитроцеллюлозной мембране (Bio-Rad, США). Мембрану высушивают, после погружают в хлороформ на 15 минут для фиксации. Затем мембрану высушивают от остатков хлороформа и инкубируют в течение 30 минут в блокирующем буфере, который содержит 2% бычий сывороточный альбумин в фосфатно-солевом буфере, pH 7.4 (PBS) при комнатной температуре. Разработанный конъюгат a-InlB-IgG-HRP разбавляют 1:4000 в трис-буферном физиологическом растворе с добавлением 0,05% неионогенного ПАВ Твин-20 (TTBS) и инкубируют в нем мембрану при комнатной температуре в течение 1 часа, используя шейкер со скоростью 150 оборотов в минуту. Мембрану промывают 3 раза, каждый в течение 5 минут с помощью TTBS. Колонии обнаруживаются с помощью TMB-субстрата. Реакцию останавливают промыванием мембран дистиллированной водой. Общая схема определения представлена на фиг. 2. Изменение цвета от светло- до темно-фиолетового указывает на положительную реакцию и наличие колоний вида L. monocytogenes (фиг. 3).
Пример 5. Оценка эффективности предлагаемого метода в смешанных культурах.
Наиболее близким к L. monocytogenes видом является L. innocua, который также часто встречается в молочных продуктах. Чтобы оценить потенциал InlB в качестве маркера для дифференциации L. monocytogenes от L. innocua в смешанной культуре, мы брали ночные культуры L. monocytogenesEGDe и L. innocua SLCC3379 в соотношениях 1:1, 1:5, 1:10 и наносили смешанные культуры на BHI-агар, содержащие 0,02 % уголь. Колонии двух видов были морфологически неразличимы, но дот-иммуноанализ с конъюгатом a-InlB-IgG-HRP, нанесенным на отпечатки колоний, позволил однозначно идентифицировать колонии как положительные. Доля положительных колоний соответствовала процентному содержанию L. monocytogenes в смешанной культуре. Для подтверждения результатов положительные и отрицательные колонии были протестированы при помощи ПЦР с праймерами InlBF (5'-aca-agc-gga-tcc-tat-cac-tgt-gcc-3') и InlBR (5'-tgt-aaa-gct-ttt-tca-gtg-gtt-ggg-3'). Только колонии, которые были положительными в дот-иммуноанализе, давали сигнал в ПЦР-анализе, что подтверждает специфичность анализа (фиг. 4).
Пример 6. Оценка эффективности предлагаемого подхода с использованием искусственно инокулированного молока.
Ночную культуру штамма L. monocytogenesEGDe концентрируют центрифугированием, промывают и ресуспендируют в фосфатно-солевом буфере (PBS). Суспензию, взятую в концентрации 109 КОЕ/мл в соответствии со стандартом Макфарланда, разбавляли до 103 и 104 КОЕ/мл в PBS. Бактериальные суспензии смешивали с образцами сырого молока в соотношении 1:9 (бактериальная суспензия:молоко). Образцы пересевают на агар BHI, содержащий 0,2 % уголь. Дот-иммуноанализ проводят, как описано в примере 4. В качестве контроля используются образцы неинокулированного молока. Отсутствие в молоке L. monocytogenes подтверждаются высевом на среду PALCAM-агар (фиг. 5).
Промышленная применимость
Все приведенные примеры подтверждают эффективность предложенного способа дифференциации L. monocytogenes и его промышленную применимость.
Литература:
1. Egor V. Kalinin, Yaroslava M. Chalenko, Parfait Kezimana, Yaroslav M. Stanishevskyi, Svetlana A. Ermolaeva. Combination of growth conditions and InlB-specific dot-immunoassay for rapid detection of Listeria monocytogenes in raw milk. Journal of Dairy Science,2023, https://doi.org/10.3168/jds.2022-21997.
2. Banada, P. P., and Bhunia, A. K. (2008). Antibodies and Immunoassays for Detection of Bacterial Pathogens. Princ. Bact. Detect. Biosensors, Recognit. Recept. Microsystems, 567–602. doi:10.1007/978-0-387-75113-9_21.
3. Braun, L., Dramsi, S., Dehoux, P., Bierne, H., Lindahl, G., and Cossart, P. (1997). InlB: an invasion protein of Listeria monocytogenes with a novel type of surface association. Mol. Microbiol. 25, 285–294. doi:10.1046/J.1365-2958.1997.4621825.X.
4. Datta, A. R., Wentz, B. A., and Hill, W. E. (1987). Detection of hemolytic Listeria monocytogenes by using DNA colony hybridization. Appl. Environ. Microbiol. 53, 2256–2259. doi:10.1128/AEM.53.9.2256-2259.1987.
5. de las Heras, A., Cain, R. J., Bielecka, M. K., and Vázquez-Boland, J. A. (2011). Regulation of Listeria virulence: PrfA master and commander. Curr. Opin. Microbiol. 14, 118–127. doi:10.1016/J.MIB.2011.01.005.
6. Ermolaeva, S., Novella, S., Vega, Y., Ripio, M.-T., Scortti, M., and Vázquez-Boland, J. A. (2004). Negative control of Listeria monocytogenes virulence genes by a diffusible autorepressor. Mol. Microbiol. 52, 601–611. doi:10.1111/J.1365-2958.2004.04003.X.
7. Koopmans, M. M., Brouwer, M. C., Vázquez-Boland, J. A., and van de Beek, D. (2022). Human Listeriosis. Clin. Microbiol. Rev. doi:10.1128/CMR.00060-19.
8. Krypotou, E., Scortti, M., Grundström, C., Oelker, M., Luisi, B. F., Sauer-Eriksson, A. E., et al. (2019). Control of Bacterial Virulence through the Peptide Signature of the Habitat. Cell Rep.26, 1815-1827.e5. doi:10.1016/J.CELREP.2019.01.073.
9. Lathrop, A. A., Banada, P. P., and Bhunia, A. K. (2008). Differential expression of InlB and ActA in Listeria monocytogenes in selective and nonselective enrichment broths. J. Appl. Microbiol. 104, 627–639. doi:10.1111/J.1365-2672.2007.03574.X.
10. Lovett, J., Francis, D. W., and Hunt, J. M. (1987). Listeria monocytogenes in Raw Milk: Detection, Incidence, and Pathogenicity. J. Food Prot. 50, 188–192. Available at: http://meridian.allenpress.com/jfp/article-pdf/50/3/188/1654024/0362-028x-50_3_188.pdf [Accessed January 17, 2023].
11. McClain, D., and Lee, W. (1988). Development of USDA-FSIS method for isolation of Listeria monocytogenes from raw meat and poultry - PubMed. Available at: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/3134339/ [Accessed January 17, 2023].
12. Norton, D. (2002). Polymerase chain reaction-based methods for detection of Listeria monocytogenes: toward real-time screening for food and environmental samples - PubMed. Available at: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/11990039/ [Accessed January 18, 2023].
13. Van Kreijl, C., Knaap, A., and Van Raaij, J. (2006). Our food, our health-Healthy diet and safe food in the Netherlands. Available at: https://www.researchgate.net/publication/27451618_Our_food_our_health-Healthy_diet_and_safe_food_in_the_Netherlands [Accessed January 16, 2023].
14. Vázquez-Boland, J. A., Kuhn, M., Berche, P., Chakraborty, T., Domínguez-Bernal, G., Goebel, W., et al. (2001). Listeria pathogenesis and molecular virulence determinants. Clin. Microbiol. Rev. 14, 584–640. doi:10.1128/CMR.14.3.584-640.2001.
15. Wįçkowska-Szakiel, M., Bubert, A., Róalski, M., Krajewska, U., Rudnicka, W., and Róalska, B. (2002). Colony-blot assay with anti-p60 antibodies as a method for quick identification of Listeria in food. Int. J. Food Microbiol. 72, 63–71. doi:10.1016/S0168-1605(01)00606-7.
16. Yu, K. Y., Noh, Y., Chung, M., Park, H. J., Lee, N., Youn, M., et al. (2004). Use of monoclonal antibodies that recognize p60 for identification of Listeria monocytogenes. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 11, 446–451. doi:10.1128/CDLI.11.3.446-451.2004.
Claims (7)
1. Способ дифференциации культуры Listeria monocytogenes от других видов Listeria spp., включающий в себя выращивание испытуемых бактерий на твердой питательной среде, содержащей активированный уголь, получение отпечатка колоний на мембрану, последующую фиксацию мембраны в хлороформе, инкубацию с поликлональными моноспецифическими антителами и визуализацию активности HRP в присутствии субстрата.
2. Способ дифференциации по п.1, отличающийся тем, что включает в себя рост Listeria monocytogenes на твердой питательной среде сердечно-мозгового экстракта с добавлением 0,02% активированного угля.
3. Способ дифференциации по п.2, отличающийся тем, что для идентификации Listeria monocytogenes производятся отпечатки на нитроцеллюлозную мембрану.
4. Способ дифференциации по п.3, отличающийся тем, что при инкубации с поликлональными моноспецифическими антителами происходит реакция антиген-антитело.
5. Способ дифференциации по п.4, отличающийся тем, что выполнен с использованием антител против интерналина В.
6. Способ дифференциации по п.5, отличающийся тем, выполнен с использованием конъюгированных с HRP поликлональных моноспецифичных антител против интерналина В.
7. Применение способа дифференциации по п.1 для оценки обсемененности продуктов питания.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2812147C1 true RU2812147C1 (ru) | 2024-01-23 |
Family
ID=
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2154106C2 (ru) * | 1994-06-24 | 2000-08-10 | Иннодженетикс Н.В. | Одновременное определение, идентификация и дифференциация эубактериальных таксонов с помощью гибридизационного анализа |
| RU2196827C1 (ru) * | 2001-05-03 | 2003-01-20 | Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика Н.Ф. Гамалеи РАМН | Способ дифференциации культуры listeria monocytogenes |
| WO2017084754A1 (de) * | 2015-11-20 | 2017-05-26 | Sinamira AG | Verfahren und vorrichtung zum nachweis von bakterien |
| RU2716115C1 (ru) * | 2018-09-24 | 2020-03-05 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Воронежский государственный университет" (ФГБОУ ВО "ВГУ") | Способ идентификации и количественной оценки патогенных и условно-патогенных бактерий в пищевых субстратах с использованием высокопроизводительного секвенирования |
| WO2020223259A1 (en) * | 2019-04-29 | 2020-11-05 | Illumina, Inc. | Identification and analysis of microbial samples by rapid incubation and nucleic acid enrichment |
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2154106C2 (ru) * | 1994-06-24 | 2000-08-10 | Иннодженетикс Н.В. | Одновременное определение, идентификация и дифференциация эубактериальных таксонов с помощью гибридизационного анализа |
| RU2196827C1 (ru) * | 2001-05-03 | 2003-01-20 | Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика Н.Ф. Гамалеи РАМН | Способ дифференциации культуры listeria monocytogenes |
| WO2017084754A1 (de) * | 2015-11-20 | 2017-05-26 | Sinamira AG | Verfahren und vorrichtung zum nachweis von bakterien |
| RU2716115C1 (ru) * | 2018-09-24 | 2020-03-05 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Воронежский государственный университет" (ФГБОУ ВО "ВГУ") | Способ идентификации и количественной оценки патогенных и условно-патогенных бактерий в пищевых субстратах с использованием высокопроизводительного секвенирования |
| WO2020223259A1 (en) * | 2019-04-29 | 2020-11-05 | Illumina, Inc. | Identification and analysis of microbial samples by rapid incubation and nucleic acid enrichment |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Feng | Commercial assay systems for detecting foodborne Salmonella: a review | |
| Kim et al. | Dipstick immunoassay to detect enterohemorrhagic Escherichia coli O157: H7 in retail ground beef | |
| EP0494293A1 (en) | Monoclonal antibody to enterohemorrhagic escherichia coli 0157:h7 and 026:h11 and method for detection | |
| CN102687019B (zh) | 检测属于肺炎支原体和/或生殖支原体的微生物的方法 | |
| US5374551A (en) | Methods for detection, identification and speciation of members of the genus Listeria | |
| JP4588879B2 (ja) | 近縁な抗原エピトープを有する微生物の特異性を調節するための組成物、その製法、装置及び方法 | |
| Pongsunk et al. | Rapid identification of Burkholderia pseudomallei in blood cultures by a monoclonal antibody assay | |
| WO1994028163A1 (en) | Method for the determination of salmonella | |
| Kalinin et al. | Combination of growth conditions and InlB-specific dot-immunoassay for rapid detection of Listeria monocytogenes in raw milk | |
| JP3773633B2 (ja) | 大腸菌ｏ１５７の分析方法及び分析用試薬 | |
| Clotilde et al. | Microbead-based immunoassay for simultaneous detection of Shiga toxins and isolation of Escherichia coli O157 in foods | |
| RU2812147C1 (ru) | Способ дифференциации Listeria monocytogenes от других видов Listeria spp. методом дот-блоттинга с использованием конъюгированных антител против фактора патогенности InlB | |
| JP5331285B2 (ja) | マイコプラズマ・ニューモニア検出用抗体 | |
| US5807694A (en) | Detection of salmonella enteritidis and other pathogenic microorganisms and monoclonal antibody useful therefor | |
| US9470684B2 (en) | Outer membrane protein 18 as a diagnostic marker for campylobacter | |
| Khan et al. | Cultural and immunological methods for the detection of Campylobacter jejuni: A review | |
| CA2078162A1 (en) | Specific anti-salmonella monoclonal reagents, and unique serological approach for the detection of different common serotypes of salmonella and the like | |
| RU2808590C1 (ru) | Способ дифференциации вирулентных штаммов Listeria monocytogenes от авирулентных штаммов с использованием поликлональных антител против факторов патогенности интерналина А (InlA) и интерналина В (InlB). | |
| KR101094974B1 (ko) | 크론씨 병의 혈청학적 진단을 위한 신규한 바이오마커 | |
| Austin | Detection by Cultural and Modern Techniques | |
| RU2800470C1 (ru) | Способ получения моноклонального пероксидазного конъюгата для идентификации типичных и атипичных штаммов Vibrio cholerae O1, включая и R-варианты в дот-ИФА | |
| JPWO2002065131A1 (ja) | ビブリオ属細菌の検出法および検出用試薬ならびにこれらに使用する抗体 | |
| KR101105168B1 (ko) | 크론씨 병의 혈청학적 진단을 위한 신규한 바이오마커 | |
| JP2005029501A (ja) | モノクローナル抗体、ハイブリドーマ、腸管毒素の検査方法及びその除去方法 | |
| Hunt et al. | Isolation of Aeromonas sp from faecal specimens |