RU2812015C1 - Способ получения и применения сфероидов мезенхимальных стволовых клеток для лечения травм кожи - Google Patents
Способ получения и применения сфероидов мезенхимальных стволовых клеток для лечения травм кожи Download PDFInfo
- Publication number
- RU2812015C1 RU2812015C1 RU2022124888A RU2022124888A RU2812015C1 RU 2812015 C1 RU2812015 C1 RU 2812015C1 RU 2022124888 A RU2022124888 A RU 2022124888A RU 2022124888 A RU2022124888 A RU 2022124888A RU 2812015 C1 RU2812015 C1 RU 2812015C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- spheroids
- mesenchymal stem
- treatment
- cells
- stem cells
- Prior art date
Links
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 35
- 238000011282 treatment Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 208000028990 Skin injury Diseases 0.000 title claims abstract description 9
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 claims abstract description 20
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims abstract description 15
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 claims abstract description 14
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 claims abstract description 8
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 35
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 claims description 33
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 claims description 13
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 claims description 13
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 claims description 13
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 claims description 8
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 7
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 claims description 5
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 5
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 5
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 claims description 4
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 claims description 3
- 239000000512 collagen gel Substances 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 230000001146 hypoxic effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 claims description 2
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 claims description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 9
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 6
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 6
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 5
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 5
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 5
- 108010000685 platelet-derived growth factor AB Proteins 0.000 description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 4
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 4
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 4
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 4
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 3
- ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N D-erythro-ascorbic acid Natural products OCC1OC(=O)C(O)=C1O ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229930003268 Vitamin C Natural products 0.000 description 3
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 3
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 3
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 3
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 3
- 235000019154 vitamin C Nutrition 0.000 description 3
- 239000011718 vitamin C Substances 0.000 description 3
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 3
- 238000000035 BCA protein assay Methods 0.000 description 2
- 208000032544 Cicatrix Diseases 0.000 description 2
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 2
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 2
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 2
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000037387 scars Effects 0.000 description 2
- 206010040882 skin lesion Diseases 0.000 description 2
- 231100000444 skin lesion Toxicity 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012604 3D cell culture Methods 0.000 description 1
- 102100022464 5'-nucleotidase Human genes 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 102100037241 Endoglin Human genes 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 1
- 101000678236 Homo sapiens 5'-nucleotidase Proteins 0.000 description 1
- 101000881679 Homo sapiens Endoglin Proteins 0.000 description 1
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 1
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 1
- 101000800116 Homo sapiens Thy-1 membrane glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 101001033286 Mus musculus Interleukin-1 beta Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 206010073713 Musculoskeletal injury Diseases 0.000 description 1
- 206010029113 Neovascularisation Diseases 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 208000019155 Radiation injury Diseases 0.000 description 1
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 1
- 206010039509 Scab Diseases 0.000 description 1
- 102000013530 TOR Serine-Threonine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108010065917 TOR Serine-Threonine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 102100033523 Thy-1 membrane glycoprotein Human genes 0.000 description 1
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 1
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 1
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 206010000891 acute myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 206010002026 amyotrophic lateral sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000001772 anti-angiogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 230000032677 cell aging Effects 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 210000002236 cellular spheroid Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 208000018631 connective tissue disease Diseases 0.000 description 1
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000013118 diabetic mouse model Methods 0.000 description 1
- XEYBRNLFEZDVAW-ARSRFYASSA-N dinoprostone Chemical compound CCCCC[C@H](O)\C=C\[C@H]1[C@H](O)CC(=O)[C@@H]1C\C=C/CCCC(O)=O XEYBRNLFEZDVAW-ARSRFYASSA-N 0.000 description 1
- 229960002986 dinoprostone Drugs 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 238000002695 general anesthesia Methods 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000008611 intercellular interaction Effects 0.000 description 1
- 238000005305 interferometry Methods 0.000 description 1
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 description 1
- 210000005067 joint tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000003127 knee Anatomy 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 201000002818 limb ischemia Diseases 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000037311 normal skin Effects 0.000 description 1
- 230000000399 orthopedic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004409 osteocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- XEYBRNLFEZDVAW-UHFFFAOYSA-N prostaglandin E2 Natural products CCCCCC(O)C=CC1C(O)CC(=O)C1CC=CCCCC(O)=O XEYBRNLFEZDVAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000008943 replicative senescence Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000009758 senescence Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 208000020431 spinal cord injury Diseases 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 1
- 230000010388 wound contraction Effects 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу получения и применения сфероидов мезенхимальных стволовых клеток для лечения травм кожи. Способ предусматривает культивирование мезенхимальных стволовых клеток красного костного мозга в питательной среде до получения сфероидов. Изобретение эффективно для приготовления суспензии и ее введения подкожно по периметру раны из расчета от 5 до 30 сфероидов на 1 см2. 3 з.п. ф-лы, 2 пр.
Description
Изобретение относится к медицине, а именно к биотехнологии, и применяется как способ получения и применения сфероидов мезенхимальных стволовых клеток для лечения травм кожи.
Заживление глубоких повреждений кожи, возникающих при серьезных ранениях, зачастую происходит с нарушениями. В результате образуются рубцы или рана переходит из острой в хроническую, возможен летальный исход. Традиционные методы лечения преимущественно основываются на борьбе с инфекцией и поддержании благоприятной среды для заживления [1]. Клеточная терапия предоставляет дополнительные терапевтические возможности: стимулирует восстановление нормальной структуры кожи. Технология создана с целью разработки способа лечения, предотвращающего возникновение рубцов, хронической раны, а также для ускорения процессов заживления и сокращения сроков лечения пациента.
Мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки (ММСК) являются самообновляющимися и доступными клеточными популяциями. Они могут быть выделены из широкого спектра источников, таких как красный костный мозг, жировая ткань и др. Ключевой терапевтический эффект ММСК обеспечивается их способностью секретировать широкий спектр цитокинов, факторов роста и хемокинов, которые модулируют функции клеток и способствуют восстановлению тканей [2]. Например, клетки секретируют фактор роста эндотелия сосудов (VEGFA), участвующий в процессе ангиогенеза и неоваскуляризации, трансформирующий фактор роста бета, регулирующий пролиферацию, дифференцировку и миграцию клеток, и др. ММСК также секретируют медиаторы иммуносупрессии, в частности, простагландин E2, который подавляет действие различных иммунных клеток [3].
Культивирование ММСК в виде сфероидов обеспечивает повышение секреторной активности клеток, а также увеличивает их жизнеспособность после инъекции [4]. Сохранение жизнеспособности и высокое содержание секретируемых белков в тканях после трансплантации способствует повышению лечебного эффекта клеточной терапии.
Согласно базе данных alliancerm.org на мировом рынке доступно 20 коммерческих продуктов для клеточной терапии, 8 из которых содержат ММСК: Stemirac (Nipro Corp, Япония), предназначен для лечения травмы спинного мозга; Neuronata-R (Corestem, Ю. Корея) для терапии бокового амиотрофического склероза; Cellgram-AMI (FCB Pharmicell, Ю. Корея) для лечения острого инфаркта миокарда; TEMCELL (JCR Pharmaceuticals SO LTD, Япония) для лечения диабета I типа, острого лучевого поражения и других заболеваний; Queencell и Cupistem (Anterogen, Ю. Корея) для лечения заболеваний соединительной ткани и восстановления поврежденных тканей суставов соответственно; Stempeucel (Stempeutics Research PVT, Индия) для лечения ишемии конечностей; Cartistem (Medipost, Южная Корея) для терапии дефектов коленного хряща.
Для лечения травм и дефектов кожи разработаны несколько способов применения мезенхимальных стволовых клеток в составе суспензий для внутрикожного введения [пат. 2271818, 2004; пат. 2526814, 2013; пат 2671642, 2018]. Все они подразумевают введение единичных клеток вокруг и внутрь ишемизированных тканей. Ключевой недостаток такого способа – гибель более 90 % клеток после трансплантации, что значительно снижает терапевтическую эффективность [5]. Существуют различные подходы для повышения эффективности лечения на основе ММСК. Одним из методов оптимизации является получение клеточных сфероидов. Культура сфероидов является многообещающим подходом, способствующим созданию динамических трехмерных сред, которые сохраняют межклеточное взаимодействие и межклеточных матрикс. Сфероиды мезенхимальных стволовых клеток демонстрируют повышенную противовоспалительную и ангиогенную активность, улучшенную выживаемость и замедленное репликативное старение [6-7].
На сегодняшний день применение сфероидов в первую очередь рассматривается для восстановления дефектов костной ткани [пат. 2721532, 2017; пат. 2747087, 2020; пат. 2744756, 2020; пат. 2744664, 2020].
Ключевое отличие заявляемого способа от аналогов: использование клеточных сфероидов ММСК для терапии травм и дефектов кожи. Кроме того, в данном изобретении предложено прекондиционирование (добавление в питательную среду во время культивирования сфероидов) клеток аскорбиновой кислотой, выполняющей роль антиоксиданта, что увеличивает секреторную активность клеток и повышает выживаемость клеток после трансплантации в ткани.
Ключевым сырьем является первичная клеточная культура ММСК. Получение первичной культуры осуществляется путем аспирации красного костного мозга или жировой ткани. ММСК должны быть отделены от других клеток путем культивирования на пластике с адгезивным покрытием на «нулевом» пассаже до достижения конфлюэнтности. Клетки должны отвечать требованиям, установленным Комитетом по мезенхимальным и стромальным стволовым клеткам Международного общества клеточной терапии:
- клетки должны обладать адгезией к культуральному пластику in vitro;
- клеточная популяция экспрессирует специфические поверхностные маркеры CD105, CD90, CD73 (более 95 %) и не экспрессирует CD45, CD34 (допустима положительная экспрессия менее 2 %);
- клетки должны обладать способностью к дифференцировке в остеоциты, хондроциты и адипоциты.
Способ получения и применения сфероидов мезенхимальных стволовых клеток для лечения травм кожи наглядным образом демонстрируются с помощью следующих иллюстраций:
Фиг. 1. Внешний вид ММСК мыши при культивировании в 2D, (А, монослой) и 3D (Б, сфероид), масштабная черточка – 200 мкм.
Фиг. 2. Содержание VEGFA (А) и PDGF AB+BB (Б) в лизатах клеток, культивируемых в монослое и в сфероидах без и с добавлением аскорбиновой кислоты, * p < 0,05.
Фиг. 3. Динамика стягивания раны после снятия повязки, * p < 0,05.
Фиг. 4. Содержание PDGF АВ+ВВ (А) и провоспалительного IL-1β (Б)
в лизатах тканей. * p < 0,05.
Для получения сфероидов ММСК для лечения повреждений кожи могут быть использованы клетки самого пациента (аутологичные), так и клетки донора (аллогенные).
1. Клетки культивируют в стандартной питательной среде, поддерживающей активную пролиферацию ММСК. Может быть использована культуральная среда αMEM, DMEM или DMEM/F12 (в соотношении 3 к 1 по объему). В качестве дополнительных компонентов могут быть использованы: фетальная бычья сыворотка, L-глутамин, заменимые аминокислоты, антибиотик (стрептомицин и пенициллин, гентамицин). Культивирование клеток может проводиться в нормоксических (5 % СО2, 21 % О2) или гипоксических (5 % СО2, 2-7 % О2) условиях. Все описанные варианты питательных сред и условия культивирования широко используются для культивирования ММСК из различных источников, поддерживают жизнеспособность и пролиферативную активность клеток [8, 9].
2. Для получения клеточных сфероидов культивируемые ММСК снимают с помощью раствора протеолитических ферментов с флакона согласно стандартной процедуре и переносят в агарозные подложки, помещенные в культуральную среду аналогичного состава (п.1). Как вариант осуществления изобретения, для получения сфероидов могут быть использованы 96-луночные планшеты с неадгезивной поверхностью. Также как и агарозные подложки, 96-луночные планшеты позволяют получить строго определенное количество сфероидов приблизительно одинаковых размеров.
Как вариант осуществления изобретения, в питательную среду может быть добавлена аскорбиновая кислота. Витамин С (аскорбиновая кислота) участвует в синтезе коллагена, а также обладает антиоксидантными свойствами [10]. При культивировании ММСК в монослое добавление аскорбиновой кислоты способствует увеличению пролиферации клеток, а также задерживает старение клеток [11, 12]. Ключевые свойства витамина С обуславливают его применения для заживления ран [13]. Добавление аскорбиновой кислоты способствует увеличению секреторной активности клеточных сфероидов (пример 1), а также значительно снижает воспалительные процессы, происходящие в ране (пример 2).
3. Культивирование клеток в агарозных подложках может быть осуществлено в течение от 12 часов до 4 суток. Для формирования клеточных сфероидов необходимо не менее 12 часов. Жизнеспособность 3D-структур (сохранение формы) сохраняется в течение 4 суток, при замене питательной среды 1 раз в 2 дня.
4. После формирования сфероидов их собирают вместе с питательной средой и центрифугируют на низких оборотах (не более 2000 об/мин). К осадку сфероидов добавляют фосфатно-буферный раствор из расчета от 20 до 500 сфероидов на 1 мл и ресуспендируют. Суспензию фосфатно-буферного раствора используют для инъекционного введения клеточных агрегатов по периметру раны. Для нанесения сфероидов непосредственно на рану к осадку сфероидов добавляют коллагеновый гель из расчета от 20 до 500 сфероидов на 1 мл.
Пример 1
С целью оценки секреторной активности были получены сфероиды ММСК жировой ткани (фиг. 1), культивируемые в стандартных условиях и с добавлением аскорбиновой кислоты (50 мкг/мл). Полученные сфероиды были собраны и перенесены в лунки 12-луночного планшета из расчета 60-70 сфероидов на лунку. Параллельно в отдельные лунки высеяны клетки в максимальной плотности (контрольная группа). Через 8 часов, после адгезии клеток и сфероидов на дне лунки, проводилась замена питательной среды (для сфероидов, полученный при добавлении аскорбиновой кислоты, питательная среда также содержала аскорбиновую кислоту в той же концентрации). Время культивирования после замены среды составило 48 часов. После этого кондиционированная питательная среда была собрана, а клетки лизировали с помощью лизирующего буферного раствора в течение 20 минут при комнатной температуре и постоянном перемешивании. Количество белка в лизатах определяли с помощью набора Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific, Германия) в соответствии с инструкцией производителя.
Определение VEGFA (фиг. 2А) в кондиционированной питательной среде проводили с использованием метода интерферометрии слоя биомолекул по разработанной ранее методике [14]. Определение PDGF (фиг. 2Б) проводили методом иммунноблоттинга. Таким образом, секреция PDGF AB+BB и VEGFA при 3D-культивировании клеток увеличивается в 2 и 3 раза соответственно.
Пример 2
В качестве тест-системы использованы мыши линии Balb/c, самки в возрасте 5-6 месяцев. Животные были поделены на 5 групп (4 экспериментальные и 1 контрольная). Все процедуры проводили под общим наркозом в соответствии с требованиями по гуманному обращению с лабораторными животными.
Предварительно со спины животного удаляли шерсть. Травму наносили путем вырезания полнослойного лоскута кожи диаметром 1,5 см. Затем проводили инъекцию фосфатно-буферного раствора (контроль) или суспензии сфероидов ММСК (90-100 сфероидов) в объеме 200 мкл по периметру раны. Поверх травмы накладывали непроницаемую клеящуюся повязку. Через 2 суток повязку снимали, после удаления пленки место травмы фотографировали каждые 2-3 дня. Измерение площади раны по мере заживления проводили с помощью программы ImageJ v1.43. Установлено значительное уменьшение площади раны на раннем этапе в 3 из 4 экспериментальных групп по сравнению с контрольной (фиг. 3).
Гистологический анализ проводили по стандартной методике [15], срезы окрашивали гематоксилином и эозином. Процесс заживления во всех препаратах охарактеризован как заживление под струпом. Плотной рубцовой ткани не сформировано ни в одном из образцов, воспалительный инфильтрат присутствует в слабой или умеренной степени.
Для оценки уровня факторов роста и цитокинов в тканях после инъекции сфероидов ММСК образцы тканей были механически гомогенизированы в лизирующем буферном растворе с последующим центрифугированием. Количество белка в лизатах определяли с помощью набора Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific, Германия) в соответствии с инструкцией производителя. Определение IL-1β проводили методом иммуноферментного анализа с использованием коммерческого набора Mouse IL-1 beta ELISA Kit (ab100705, Abcam, Великобритания), содержание PDGF AB+BB проводили методом иммуноблоттинга.
Установлено значительное увеличение PDGF AB+BB (фиг. 4А) в экспериментальной группе, получившей инъекцию сфероидов ММСК красного костного мозга, по сравнению с контрольной группой, а также отмечено достоверное снижение воспалительного цитокина IL-1β (фиг. 4Б) в тканях животных, получивших инъекцию выращенных в присутствии аскорбиновой кислоты сфероидов ММСК красного костного мозга, по сравнению с контрольными животными.
Для способа получения и применения сфероидов мезенхимальных стволовых клеток для лечения травм кожи необходимы мезенхимальные стволовые (стромальные) клетки красного костного мозга, которые культивируют в питательной среде. При достижении конфлюэнтности 80 % и более клетки снимают по стандартной процедуре, центрифугируют и переносят в агарозные подложки, препятствующие адгезии клеток. Клетки в агарозных подложках культивируют до получения сфероидов. Сфероиды собирают вместе с питательной средой и центрифугируют. Супернатант удаляют, осадок сфероидов аккуратно ресуспендируют в фосфатно-буферном растворе из расчета от 20 до 150 сфероидов на 1 мл. Введение суспензии клеток осуществляют подкожно по периметру раны из расчета от 5 до 30 сфероидов на 1 см2. При этом возможно использование мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани. При этом возможно использование гипоксических условий культивирования – 37 оС, 5 % СО2, от 2 до 7 % О2 и относительная влажность 90-98 %. При этом вместо фосфатно-буферного раствора может быть использован коллагеновый гель, который наносят на поверхность раневого ложа из расчета от 5 до 30 сфероидов на 1 см2. При этом в питательную среду во время культивирования сфероидов может быть добавлена аскорбиновая кислота в концентрации от 10 до 100 мкг/мл.
Список использованной литературы
[1] Dash B. C. et al. Stem cells and engineered scaffolds for regenerative wound healing //Bioengineering. – 2018. – Т. 5. – №. 1. – С. 23.
[2] Song N., Scholtemeijer M., Shah K. Mesenchymal stem cell immunomodulation: mechanisms and therapeutic potential //Trends in Pharmacological Sciences. – 2020. – Т. 41. – №. 9. – С. 653-664.
[3] Han Y. et al. Mesenchymal stem cells for regenerative medicine //Cells. – 2019. – Т. 8. – №. 8. – С. 886.
[4] Han H. W., Asano S., Hsu S. Cellular spheroids of mesenchymal stem cells and their perspectives in future healthcare //Applied Sciences. – 2019. – Т. 9. – №. 4. – С. 627.
[5] Bhang S. H. et al. Angiogenesis in ischemic tissue produced by spheroid grafting of human adipose-derived stromal cells //Biomaterials. – 2011. – Т. 32. – №. 11. – С. 2734-2747.
[6] Cesarz Z., Tamama K. Spheroid culture of mesenchymal stem cells // Stem cells international. – 2016. – Т. 2016.
[7] Bauman E. et al. Xeno-free pre-vascularized spheroids for therapeutic applications // Scientific reports. – 2018. – Т. 8. – №. 1. – С. 1-13.
[8] Both S. K. et al. A rapid and efficient method for expansion of human mesenchymal stem cells //Tissue engineering. – 2007. – Т. 13. – №. 1. – С. 3-9.
[9] Dhanasekaran M. et al. A comprehensive study on optimization of proliferation and differentiation potency of bone marrow derived mesenchymal stem cells under prolonged culture condition //Cytotechnology. – 2013. – Т. 65. – №. 2. – С. 187-197.
[10] DePhillipo N. N. et al. Efficacy of vitamin C supplementation on collagen synthesis and oxidative stress after musculoskeletal injuries: a systematic review //Orthopaedic journal of sports medicine. – 2018. – Т. 6. – №. 10. – С. 2325967118804544.
[11] Fujisawa K. et al. Evaluation of the effects of ascorbic acid on metabolism of human mesenchymal stem cells //Stem cell research & therapy. – 2018. – Т. 9. – №. 1. – С. 1-12.
[12] Yang M. et al. Ascorbic acid inhibits senescence in mesenchymal stem cells through ROS and AKT/mTOR signaling //Cytotechnology. – 2018. – Т. 70. – №. 5. – С. 1301-1313.
[13] Chokesuwattanaskul S. et al. High dose oral vitamin C and mesenchymal stem cells aid wound healing in a diabetic mouse model //Journal of Wound Care. – 2018. – Т. 27. – №. 5. – С. 334-339.
[14] Волкова М. В. и др. Адаптация метода интерферометрии слоя биомолекул для количественной оценки содержания фактора роста эндотелия сосудов в кондиционированной клеточной среде //Биофизика. – 2020. – Т. 65. – №. 6. – С. 1099-1106.
[15] Ham A. W. Histology. – JB Lippincott, 1953.
Claims (4)
1. Способ получения и применения сфероидов мезенхимальных стволовых клеток для лечения травм кожи, который включает в себя культивирование мезенхимальных стволовых клеток красного костного мозга до конфлюэнтности 80% и более, затем клетки снимают по стандартной процедуре, центрифугируют и переносят в агарозные подложки, препятствующие адгезии клеток, далее клетки в агарозных подложках культивируют в питательной среде, содержащей аскорбиновую кислоту в концентрации от 10 до 100 мкг/мл, до получения сфероидов, сфероиды собирают вместе с питательной средой из агарозных подложек и центрифугируют, супернатант удаляют, а сфероиды ресуспендируют в фосфатно-буферном растворе из расчета от 20 до 150 сфероидов на 1 мл и осуществляют введение суспензии подкожно по периметру раны из расчета от 5 до 30 сфероидов на 1 см2.
2. Способ получения сфероидов мезенхимальных стволовых клеток для лечения травм кожи по п.1, отличающийся тем, что используются мезенхимальные стволовые клетки жировой ткани.
3. Способ получения сфероидов мезенхимальных стволовых клеток для лечения травм кожи по п.1, отличающийся тем, что возможно использование гипоксических условий культивирования – 37°С, 5% СО2, от 2 до 7% О2 и относительная влажность 90-98%.
4. Способ применения сфероидов мезенхимальных стволовых клеток для лечения травм кожи по п.1, отличающийся тем, что вместо фосфатно-буферного раствора используют коллагеновый гель, который наносят на поверхность раневого ложа из расчета от 5 до 30 сфероидов на 1 см2.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2812015C1 true RU2812015C1 (ru) | 2024-01-22 |
Family
ID=
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20210062152A1 (en) * | 2019-09-04 | 2021-03-04 | Metatech (Ap) Inc. | Three-dimensional cell spheroid with high proliferation activity, and producing method and use therefor |
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20210062152A1 (en) * | 2019-09-04 | 2021-03-04 | Metatech (Ap) Inc. | Three-dimensional cell spheroid with high proliferation activity, and producing method and use therefor |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| БОЯРИНЦЕВ В.В. и др. Оценка перспективности использования культур мезенхимальных стволовых клеток для лечения ожогов и обморожений, Сборник статей II Всероссийской научно-технической конференции, Состояние и перспективы развития современной науки по направлению "Биотехнические системы и технологии", 2020. ДУРЫМАНОВ М.О. и др. Возможные стратегии использования мезенхимальных стволовых клеток для лечения обморожений, Известия российской военно-медицинской академии, 2020, 2. CESARZ Z. et al. Spheroid culture of mesenchymal stem cells, Stem cells international., 2016. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20230405180A1 (en) | Mesenchymal stem cell-hydrogel-biodegradable or mesenchymal stem cell-hydrogel-undegradable support composition for skin regeneration or wound healing | |
| Raghuram et al. | Role of stem cell therapies in treating chronic wounds: A systematic review | |
| Strong et al. | Stem cells and tissue engineering: regeneration of the skin and its contents | |
| Andia et al. | Biological therapies in regenerative sports medicine | |
| Yang et al. | Vitamin C plus hydrogel facilitates bone marrow stromal cell-mediated endometrium regeneration in rats | |
| Hassan et al. | Role of adipose‐derived stem cells in wound healing | |
| Yang et al. | Comparison of mesenchymal stem cells derived from gingival tissue and periodontal ligament in different incubation conditions | |
| Gimble et al. | Adipose-derived adult stem cells: isolation, characterization, and differentiation potential | |
| Kuhbier et al. | Isolation, characterization, differentiation, and application of adipose-derived stem cells | |
| Deptuła et al. | Adipose‐derived stromal cells for nonhealing wounds: emerging opportunities and challenges | |
| Smolinska et al. | Current status of the applications of conditioned media derived from mesenchymal stem cells for regenerative medicine | |
| KR102473820B1 (ko) | 중간엽줄기세포-하이드로겔을 함유하는 주사형 조성물 및 이의 제조, 동결 및 해동방법 | |
| Tamari et al. | Acceleration of wound healing with stem cell-derived growth factors. | |
| Debuc et al. | Improving autologous fat grafting in regenerative surgery through stem cell-assisted lipotransfer | |
| CN108348555B (zh) | 细胞扩增方法和治疗组合物 | |
| Hodgkinson et al. | Adult stem cells in tissue engineering | |
| Zahorec et al. | Autologous mesenchymal stem cells application in post-burn scars treatment: a preliminary study | |
| Yang et al. | Platelet poor plasma gel combined with amnion improves the therapeutic effects of human umbilical cord‑derived mesenchymal stem cells on wound healing in rats | |
| Brouard et al. | G-CSF increases mesenchymal precursor cell numbers in the bone marrow via an indirect mechanism involving osteoclast-mediated bone resorption | |
| Yang et al. | The therapeutic application of stem cells and their derived exosomes in the treatment of radiation-induced skin injury | |
| Zupan | Tissue Injury and Regeneration, and Age-Related Degeneration | |
| García-Guerrero et al. | How to enhance MSCs therapeutic properties? An insight on potentiation methods | |
| KR20180072644A (ko) | 면역 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 중간엽줄기세포 배양액 및 이의 제조방법 | |
| RU2812015C1 (ru) | Способ получения и применения сфероидов мезенхимальных стволовых клеток для лечения травм кожи | |
| KR20210145705A (ko) | 염증성 질환의 예방 또는 치료용 중간엽줄기세포 배양액 및 이의 제조방법 |