RU2812053C1 - Способ повышения уровня аутологичных т-регуляторных лимфоцитов в культурах клеток крови человека - Google Patents
Способ повышения уровня аутологичных т-регуляторных лимфоцитов в культурах клеток крови человека Download PDFInfo
- Publication number
- RU2812053C1 RU2812053C1 RU2023104583A RU2023104583A RU2812053C1 RU 2812053 C1 RU2812053 C1 RU 2812053C1 RU 2023104583 A RU2023104583 A RU 2023104583A RU 2023104583 A RU2023104583 A RU 2023104583A RU 2812053 C1 RU2812053 C1 RU 2812053C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- treg
- peptides
- lymphocytes
- yqce
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 title claims description 14
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 title claims description 4
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 title 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 40
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 31
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 29
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 15
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 9
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 8
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims abstract description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 12
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 7
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 claims description 6
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 claims description 6
- 229940126530 T cell activator Drugs 0.000 claims description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 5
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 claims description 4
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 claims description 4
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 claims description 4
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 3
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 claims description 3
- 108010093965 Polymyxin B Proteins 0.000 claims description 3
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 claims description 3
- 229940009444 amphotericin Drugs 0.000 claims description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 3
- 229920000024 polymyxin B Polymers 0.000 claims description 3
- 229960005266 polymyxin b Drugs 0.000 claims description 3
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims description 2
- 210000004976 peripheral blood cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 abstract description 27
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 8
- 230000010287 polarization Effects 0.000 abstract description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 2
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 abstract 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 abstract 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 108050005493 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Proteins 0.000 description 9
- 102100028709 Thyroxine-binding globulin Human genes 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- 238000009343 monoculture Methods 0.000 description 6
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 5
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 description 4
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 4
- 101000617720 Homo sapiens Pregnancy-specific beta-1-glycoprotein 5 Proteins 0.000 description 4
- 101000934346 Homo sapiens T-cell surface antigen CD2 Proteins 0.000 description 4
- 102100026878 Interleukin-2 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 4
- 102100022025 Pregnancy-specific beta-1-glycoprotein 5 Human genes 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 3
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 238000007885 magnetic separation Methods 0.000 description 3
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- YXHLJMWYDTXDHS-IRFLANFNSA-N 7-aminoactinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=C(N)C=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 YXHLJMWYDTXDHS-IRFLANFNSA-N 0.000 description 2
- 108700012813 7-aminoactinomycin D Proteins 0.000 description 2
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 description 2
- 108010035746 Pregnancy Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000008217 Pregnancy Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010085648 Pregnancy-Specific beta 1-Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000007502 Pregnancy-Specific beta 1-Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 102100025237 T-cell surface antigen CD2 Human genes 0.000 description 2
- 238000001793 Wilcoxon signed-rank test Methods 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000004957 immunoregulator effect Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 2
- 238000002826 magnetic-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000011325 microbead Substances 0.000 description 2
- 238000011338 personalized therapy Methods 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- XPCFTKFZXHTYIP-PMACEKPBSA-N Benazepril Chemical compound C([C@@H](C(=O)OCC)N[C@@H]1C(N(CC(O)=O)C2=CC=CC=C2CC1)=O)CC1=CC=CC=C1 XPCFTKFZXHTYIP-PMACEKPBSA-N 0.000 description 1
- ZBNZXTGUTAYRHI-UHFFFAOYSA-N Dasatinib Chemical compound C=1C(N2CCN(CCO)CC2)=NC(C)=NC=1NC(S1)=NC=C1C(=O)NC1=C(C)C=CC=C1Cl ZBNZXTGUTAYRHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010066671 Enalaprilat Proteins 0.000 description 1
- 101100005713 Homo sapiens CD4 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000005517 L01XE01 - Imatinib Substances 0.000 description 1
- 229940077422 accupril Drugs 0.000 description 1
- MKUXAQIIEYXACX-UHFFFAOYSA-N aciclovir Chemical compound N1C(N)=NC(=O)C2=C1N(COCCO)C=N2 MKUXAQIIEYXACX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000004721 adaptive immunity Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 1
- OYFJQPXVCSSHAI-QFPUQLAESA-N enalapril maleate Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O.C([C@@H](C(=O)OCC)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 OYFJQPXVCSSHAI-QFPUQLAESA-N 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000011013 endotoxin removal Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 229940080856 gleevec Drugs 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- KTUFNOKKBVMGRW-UHFFFAOYSA-N imatinib Chemical compound C1CN(C)CCN1CC1=CC=C(C(=O)NC=2C=C(NC=3N=C(C=CN=3)C=3C=NC=CC=3)C(C)=CC=2)C=C1 KTUFNOKKBVMGRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 229940080268 lotensin Drugs 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 1
- 230000004983 pleiotropic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 1
- IBBLRJGOOANPTQ-JKVLGAQCSA-N quinapril hydrochloride Chemical compound Cl.C([C@@H](C(=O)OCC)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CC2=CC=CC=C2C1)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 IBBLRJGOOANPTQ-JKVLGAQCSA-N 0.000 description 1
- HDACQVRGBOVJII-JBDAPHQKSA-N ramipril Chemical compound C([C@@H](C(=O)OCC)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](C[C@@H]2CCC[C@@H]21)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 HDACQVRGBOVJII-JBDAPHQKSA-N 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000002993 trophoblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000001573 trophoblastic effect Effects 0.000 description 1
- 229940099270 vasotec Drugs 0.000 description 1
- 229940107931 zovirax Drugs 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу усиления генерации Treg в системе in vitro, которая заключается в поляризации сепарированных Т-хелперов в фенотип Treg при помощи цитокинов и активации Т-клеточного рецептора. Изобретение заключается в культивировании клеток в среде, в которую добавляли комплекс пептидов YECE, YQCE, YVCS и YACS, в равном соотношении, что приводило к более эффективной генерации Treg. Изобретение способствует разработке способа поляризации Т-хелперов в фенотип Treg, что позволяет достигать существенное увеличения количества данных клеток в культуре. 3 ил., 1 табл., 2 пр.
Description
Изобретение относится к области клеточной биотехнологии и может применяться в клеточной терапии для адоптивного переноса клеток при аутоиммунных патологиях. Изобретение также может найти применение в масштабировании Т-регуляторных клеток для научных исследований. Изобретение направлено на разработку нового способа индукции Т-регуляторных клеток из лимфоцитов периферической крови доноров в условиях in vitro при помощи коротких пептидов YECE, YQCE, YVCS и YACS.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Т-регуляторные клетки выполняют чрезвычайно важную роль в супрессии иммунного ответа на уровне врожденного и адаптивного иммунитета. При аутоиммунных патологиях количество и функциональная активность этих клеток имеет принципиальное значение для пациента [Fehervari Z. & Sakaguchi S. Peacekeepers of the Immune System // Scientific American. 2006. V.295, №4. P. 56-63].
Получение Т-регуляторных клеток (Treg) необходимо для решения двух принципиально разных задач: первая задача связана с индукцией Treg в системе in vitro из аутологичных лимфоцитов с целью их адоптивного переноса пациенту с аутоиммунной патологией. Вторая задача связана с масштабированием количества этих клеток для изучения их активности и также возможностей модуляции при помощи новых фармакологических препаратов. Для решения этой задачи необходимо иметь технологии, позволяющие получить и нарастить Treg из периферических лимфоцитов здоровых доноров. Сложность исполнения задачи связана с тем, что у здоровых доноров уровень Treg не превышает 1% от всех лимфоцитов. Именно поэтому важно иметь технологии, позволяющие индуцировать дифференцировку Treg в культуре.
К настоящему времени известно два способа получения Treg: первый связан с использованием сортировки по поверхностным маркерам и получением клеток с фенотипом CD4+CD25+hi из мононуклеарных клеток донора без дальнейшего выращивания. Второй способ связан с культивированием лимфоцитов в условиях индукции их в фенотип Treg при помощи набора биологических активных веществ.
Очевидно, что получение достаточного количества Treg из периферической крови доноров без этапа культивирования практически невозможно, ни для научных целей, ни для адоптивного переноса. Именно потому, получение этой субпопуляции in vitro, практически единственный способ получить Treg в достаточном количестве.
Одна из самых распространенных методик получения Treg - это иммуномагнитная сепарация Т-хелперньгх клеток из периферической крови донора и дальнейшая их конверсия в фенотип Treg при помощи цитокинов IL-2 и TGF-(3, а также с Т-клеточным активатором, имитирующим присутствие антигенпрезентирующих клеток в культуре. Именно такой вариант генерации Treg самый рациональный, так как позволяет получить эти клетки в достаточном количестве для персонифицированной терапии [Патент RU 2437933, опубл. 27.12.2011, МПК: C12N 5/071]. Принципиальное отличие заявляемого способа получения Treg заключается во внесении в инкубационную среду композиции из коротких пептидов, присутствие которых приводит к повышению количества этих клеток.
Обоснование выбора пептидов
Трофобластический бета-1-гликопротеин (ТБГ, PSG) - белок с плейотропными биологическими эффектами, который продуцируется клетками плаценты в период беременности. Концентрация ТБГ в сыворотке к III триместру достигает 200-400 мкг/мл, что значительно превышает концентрации других белков плаценты [Посисеева Л.В., Назаров С.Б., Татаринов Ю.С. Трофобласт-специфический бета-гликопротеин в акушерстве и гинекологии. Иваново: Иваново, 2004. 240 с.]. ТБГ обладает выраженным иммунорегуляторным потенциалом, регулируя активность основных эффекторов иммунного ответа [Тимганова В.П., Бочкова М.С., Раев М.Б., Храмцов П.В., Заморина С.А. Иммунорегуляторный потенциал трофобластического pi-гликопротеина // Медицинская иммунология. 2021, V. 23(3). С. 455-468.]. Нашими исследованиями показано, что нативный препарат ТБГ, полученный из сыворотки крови беременных женщин, оказывал стимулирующий эффект на генерацию Treg в условиях in vitro [5.
Заморина S.A., Rayev М.В. Human trophoblastic β1-glycoprotein as a differentiation factor of minor regulatory T-lymphocyte subsets (Treg, Th17). The involvement of CD9 // Biochemistry (Moscow), Supplement Series A: Membrane and Cell Biology. 2016. V. 10. N 4. P. 319-327]. Однако, практическое применение белков беременности как в нативной, так и в рекомбинантной форме связано с массой сложностей этического и экономического характера. В последнее время поиск биологических эффектов коротких линейных пептидов (мотивов) (SLiMs) является новой стратегией создания фармакологических препаратов («drug-design») [Persico М., Di Dato A., Orteca N., Fattorusso С, Novellino E., Andreoli M. and Ferlini C. From Protein Communication to Drug Discovery // Current Topics in Medicinal Chemistry 2015, V. 15(20), P.00.]. SLiMs являются высококонсервативными пептидными участками белковой молекулы длиной 3-10 аминокислот, которые разграничивают подлинные синтаксические и семантические единицы в белке. В перспективе они представляют собой новый класс препаратов, способных модулировать внутримолекулярные и межмолекулярные связи белков. Например, уже существует целый ряд препаратов, на основе SLiMs, которые имитируют или блокируют конкретное белок-белковое взаимодействие: Tritace®, Vasotec®, Accupril®, Lotensin® Zovirax®, Stutnet® Gleevec® Sprycel®. [en.wikipedia.org/wiki/Short_linear_motif]. Важно отметить, что в последние годы половина всех одобренных пептидных препаратов были пептидами [Angell Y., Holford М., Moos W.H. Building on success: a bright future for peptide therapeutics // Protein. Pept. Lett., 2018, V. 25, №12, P. 1044-1050.].
В первичной структуре различных PSG выявлены тетрапептидные участки: YQCE (присутствует во всех PSG), YECE и YACS (присутствуют в большинстве типов PSG), являющиеся консенсусньш мотивом YxCx (в данном случае, SLiMs), у которого выявлена иммуномодулирующая активность [Moldogazieva, N.T., Mokhosoev, I.M., and Terentiev, A.A. Pregnancy-Specific pi-Glycoproteins: Combined Biomarker Roles, Structure/Function Relationships and Implications for Drug Design // Curr. Med. Chemistry, 2016, V. 23, P. 1-23.].
Известен способ использования комплекса пептидов для повышения пролиферативной активности лимфоцитов человека в культурах, что свидетельствует об их эффективности в отношении регулирования активности клеток иммунной системы [Патент RU 2465001, опубл. 27.10.2012, МПК: А61К 38/03, А61Р 37/02, А61Р 37/04].
Наиболее близким к заявляемому решению по технической сущности и достигаемому результату является способ, предложенный Быковской и соавт. [Патент RU 2437933, опубл. 27.12.2011, МПК: C12N 5/071]. Данная методика предполагает выделение мононуклеарных клеток периферической крови, из которых методом позитивной селекции получают монокультуру СO4+ - клеток, которые поляризуют в фенотип Treg при помощи цитокинов - IL-2, TGF-β и антител к CD2, CD3 и CD28. Затем клетки инкубируют в СО2-инкубаторе в условиях содержания 5% СО2 при 37°С в течение 7-12 суток. Смена среды производится каждые 3-4 суток. В итоге можно получить популяцию CD4+CD25+Foxp3+ Т-лимфоцитов человека.
С позиции критики необходимо отметить, что, несмотря на эффективность схемы, в культурах, помимо регуляторных клеток (Treg) возникают и эффекторные субпопуляции клеток, непосредственно реализующие иммунный ответ, однако это общая проблема всех способов получения Treg.
РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является разработка более эффективного способа получения регуляторных Т-лимфоцитов (Treg) в условиях in vitro для дальнейшего применения в клеточной терапии или научных целях.
Достигаемый технический результат заключается в повышении уровня аутологичных Т-регуляторных лимфоцитов (Treg) в культуре клеток при помощи композиции пептидов, добавленных к стандартной среде.
Достигается технический результат при помощи заявляемого способа в котором осуществляют магнитную сепарацию Т-хелперов из периферической крови человека (пациента), для их дальнейшего культивирования в условиях обработки смесью цитокинов, антител и пептидов (YACS, YQCE, YVCS, YECE) с целью последующего введения аутологичных клеток, обогащенных регуляторными Т-лимфоцитами, этому же пациенту.
В работе применяли пептиды ТБГ (YACS - A, YQCE - Q, YVCS - V, YECE - Е), синтезированные на заказ ООО «Рашн пептайд» (Россия), которые перед внесением в культуры были очищены от эндотоксина при помощи колонок Pierce™ High Capacity Endotoxin Removal Spin Columns производства Thermo Scientific (США). В культуры вносили композицию из пептидов YACS, YQCE. YVCS, YECE в фармакологических концентрациях 5 и 50 мкг/мл, где каждый пептид был представлен в равных весовых пропорциях. Таким образом, каждый пептид был представлен в концентрации 1,25 и 12,5 мкг/мл, соответственно.
Способ повышения уровня аутологичных Т-регуляторных лимфоцитов (Treg) в культурах клеток периферической крови человека, заключается в иммуномагнитной сепарации CD4+ Т-хелперов с последующим культивированием клеток in vitro в полной питательной среде и стандартных условиях, предусматривающих концентрацию СО2 - 5% и температуру - 37°С, в присутствии моноклональньтх антител против CD3, CD28 в качестве Т-клеточного активатора и цитокинов, поляризующих Т-хелперы в фенотип Treg, а именно, IL-2 и TGF-β, при этом в среду культивирования клеток вносят композицию пептидов YECE, YQCE, YVCS и YACS в концентрации 5-50 мкг/мл, что активирует поляризацию Т-хелперов в Treg, сопровождающуюся достоверным увеличением числа культивируемых клеток.
Исследование выполнено при финансовой поддержке правительства Пермского края в рамках научного проекта №С-26/509.
Сущность изобретения.
Из периферической крови, полученной венепункцией, выделяют мононуклеарные клетки периферической крови (МПК) путем ее наслаивания на градиенте плотности фиколл-урографина (ρ=1,077). После чего из МПК клеток методом магнитной сепарации выделяют CD4+ Т-лимфоциты. Затем монокультуры Т-хелперов культивируют 72 ч (3 сут.) в полной питательной среде в присутствии цитокинов (IL-2, TGF-β) и Т-клеточного активатора (моноклональные антитела к CD2, CD3, CD28), что является стандартным способом поляризации Т-хелперов в Treg. Для индукции Treg в культуру вносят смесь синтетических пептидов YECE, YQCE, YVCS и YACS в фармакологической концентрации (5 и 50 мкг/мл), при этом генерация Treg-клеток осуществляется в достаточном для персонифицированной терапии количестве.
Признаки способа, отвечающие критерию новизны, состоят в том, что в культуральную среду вносят пептиды YECE, YQCE, YVCS и YACS в фармакологической концентрации (от 5 до 50 мкг/мл), дополнительно к базовым компонентам полной питательной среды (цитокины и Т-клеточный активатор). Результатом является более высокий достоверно значимый прирост клеток в культуре (на 22-31%) целевой субпопуляции Treg. Данная технология позволяет получить более высокое содержания Treg для адоптивного переноса или исследований in vitro.
ПРИМЕРЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ ПРИМЕР 1
Образцы венозной крови были взяты у здоровых доноров (небеременные женщины, n=5, возраст 25-39 лет) путем венопункции. Мононуклеарные клетки периферической крови (МПК) выделяли центрифугированием в градиенте плотности фиаколл-верографина (Diacoll 1077, "Dia-M", Россия, ρ=1.077 г/см3). Монокультуры СD4+ - клеток (Т-хелперы) получали методом иммуномагнитной сепарации с использованием магнитных частиц MACS® MicroBeads ("Miltenyi Biotec", Германия). Чистота выделения Т-хелперов составила 96.7±1.7%. Полученные монокультуры Т-хелперов в концентрации 1×106 клеток инкубировали в 96-луночном планшете в полной питательной среде (RPMI-1640 (Sigma Aldrich, США), 10% FBS ("ВI״, Израиль), 10 мМ Hepes ("ICN Ph.", США), 2 мМ L-глутамина ("ICN Ph.", США), 100 мкг/мл пенициллина-стрептомицина-амфотерицина ("BI", Израиль)) и 30 мкг/мл полимиксина В с активационными частицами (#130-091-441, "Miltenyi Biotec", Германия), содержащими антитела против CD2, CD3, CD28 и цитокинами TGF-p (5 нг/мл) и IL-2 (166 нг/мл) ("Miltenyi Biotec", Германия). Пептидную композицию (YECE, YQCE, YVCS и YACS) вносили в культуры до конечной концентрации 5 мкг/мл, в равном количественном соотношении между каждым из четырех пептидов.
После культивирования 72 ч при 5% С02 и 37С производили окрашивание клеток с использованием панели идентификации Treg (#362251, "Biolegend", США), включающей витальный краситель 7-AAD и антитела к поверхностным антигенам (APC-CD25, APC/Cyanine7-CD3, PE/Cyanine7-CD127 (IL 7Rα), FTTC-CD4). Тактика гейтирования включала в себя следующие этапы: на графике FSC/SSC выделяли общий пул лимфоцитов, затем живые Т-лимфоциты (7-AAD-CD3+), из них гейтировали Т-хелперы (CD4+), внутри популяции которых оценивали процент Treg (CD25high CD127-/low) (рис. 1А). Итоговый фенотип Treg: 7-AAD-CD3+CD4+CD25highCD127-/low. Измерения проводили на проточном цитофлуориметре CytoFlex S ("Beckman Coulter", США). Далее файлы данных были обработаны в программе "KALUZA Analysis Software" (Beckman Coulter, США). Статистическую обработку полученных результатов данных проводили в программе Graph Pad Prism 6 при помощи критерия Вилкоксона. Результаты представлены в виде медианы, нижнего и верхнего квартилей (Me (Q1-Q3)). Различия считались достоверными при р<0.5.
Приведенный пример иллюстрируется следующими графическими материалами: таблица 1, Фиг 1. Фиг. 2а.
ПРИМЕР 2
Образцы венозной крови были взяты у здоровых доноров (небеременные женщины, n=5, возраст 25-39 лет) путем венопункции. Мононуклеарные клетки периферической крови (МПК) выделяли центрифугированием в градиенте плотности фиаколл-верографина (Diacoil 1077, "Dia-M", Россия, ρ=1.077 г/см3). Монокультуры СБ4+-клеток (Т-хелперы) получали методом иммуномагнитной сепарации с использованием магнитных частиц MACS® MicroBeads ("Miltenyi Biotec", Германия). Чистота выделения Т-хелперов составила 96.7±1.7%. Полученные монокультуры Т-хелперов в концентрации 1 × 106 клеток инкубировали в 96-луночном планшете в полной питательной среде (RPMI-1640 (Sigma Aldrich, США), 10% FBS ("BI", Израиль), 10 мМ Hepes ("ICN Ph.", США), 2 мМ L-глутамина ("ICN Ph.", США), 100 мкг/мл пенициллина-стрептомицина-амфотерицина ("BI", Израиль)) и 30 мкг/мл полимиксина В с активационными частицами (#130-091-441, "Miltenyi Biotec", Германия), содержащими антитела против CD2, CD3, CD28 и цитокинами TGF-P (5 нг/мл) и IL-2 (166 нг/мл) ("Miltenyi Biotec", Германия). Пептидную композицию (YECE, YQCE, YVCS и YACS) вносили в культуры до конечной концентрации 50 мкг/мл, в равном количественном соотношении между каждым из четырех пептидов.
После культивирования 72 ч при 5% С02 и 37°С производили окрашивание клеток с использованием панели идентификации Treg (#362251, "Biolegend", США), включающей витальный краситель 7-AAD и антитела к поверхностным антигенам (APC-CD25, APC/Cyanine7-CD3, PE/Cyanine7-CD127 (IL 7Rα), FITC-CD4). Тактика гейтирования включала в себя следующие этапы: на графике FSC/SSC выделяли общий пул лимфоцитов, затем живые Т-лимфоциты (7-AAD-CD3+), из них гейтировали Т-хелперы (CD4+), внутри популяции которых оценивали процент Treg (CD25high CD127-/low) (рис. 1А). Итоговый фенотип Treg: 7-AAD-CD3+CD4+CD25highCD127-/low. Измерения проводили на проточном цитофлуориметре CytoFlex S ("Beckman Coulter", США). Далее файлы данных были обработаны в программе "KALUZA Analysis Software" (Beckman Coulter, США). Статистическую обработку полученных результатов данных проводили в программе Graph Pad Prism 6 при помощи критерия Вилкоксона. Результаты представлены в виде медианы, нижнего и верхнего квартилей (Me (Q1-Q3)). Различия считались достоверными при р<0.5
Приведенный пример иллюстрируется следующими графическими материалами: таблица 1, Фиг 1, Фиг. 2б.
КРЛ ТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРА ФИЧЕСКИХ МА ТЕРИАЛОВ
Сущность заявляемого изобретения поясняется следующими графическими материалами. На фиг 1 представлены гистограммы гейтирования Treg в популяции клеток, выделенных методом магнитной сепарации до начала культивирования клеток.
Фиг. 1а - гистограмма прямого (FSC) и бокового (SSC) светорассеяния. Выделен гейт лимфоцитов (32,43%).
Фиг. 1б - гистограмма жизнеспособных лимфоцитов, несущих маркер CD3 (CD3+7-AAD-, Т-лимфоциты) - 96,69%.
Фиг. 1в - гистограмма общего пула жизнеспособных Т-лимфоцитов, несущих маркер CD4 (CD3+CD4+, Т-хелперы) - 98,22%.
Фиг. 1 г - график четырех популяций Т-хелперов, основанных на экспрессии молекул CD25 и CD127. Таргетная субпопуляция представлена на правом нижнем квадранте -регуляторньте Т-лимфоциты (CD3+CD4+CD25+CD127-) - 45,16%.
На фиг. 2 представлены репрезентативные графики экспрессии маркеров Treg, после трех суток культивирования клеток с добавлением смеси пептидов YECE, YQCE, YVCS и YACS. Тактика гейтирования аналогична представленной на фиг. 1.
Фиг. 2а - число Treg под воздействием пептидов в концентрации 5 мкг/мл, Фиг. 2б - то же, но в концентрации пептидов 50 мкг/мл.
На фиг. 3 показано, что применение пептидов по отдельности в тех же концентрациях (5 и 50 мкг/мл) продемонстрировало стимулирующий эффект на уровень Treg, который проявлялся для пептидов YQCE и YECE в высокой концентрации (50 мкг/мл), в то время как низкая концентрация пептидов (5 мкг/мл) не оказывали достоверных эффектов (Фиг. 3). В то же время, при использовании композиции из пептидов достоверный эффект наблюдался при использовании низкой фармакологической концентрации - 5 мкг/мл. Таким образом, композиция из пептидов YECE, YQCE, YVCS и YACS показала себя более эффективной для получения Treg, чем пептиды по отдельности. По-видимому, это связано с наличием эффекта имитации активных центров ТБГ, поскольку используемые в работе пептиды являются фрагментами активных центров этого фетоплацентарного белка. На графике в фиг. 3 отображены данные в виде медианы, нижнего и верхнего квартилей (Me (Q1-Q3), отмечены достоверны в w-критерию различия с контролем (* - между контролями, #-между эффектами пептидов и контролем), пептиды обозначены как YACS - A, YQCE - Q, YVCS - V, YECE - Е.
Заявляемое изобретение иллюстрируется следующей таблицей:
После трех суток культивирования CD4+- лимфоцитов с пептидами YECE, YQCE, YVCS и YACS в концентрации 5 и 50 мкг/мл, количество Treg увеличивается на 22 и 31%, соответственно (табл. 1). Таким образом, применение коротких пептидов ТБГ в качестве дополнительного индуктора способствует генерации Treg. При этом две концентрации пептидов достоверно увеличивают уровень Treg в культуре, но не обнаружено различий между низкой и высокой концентрацией пептидов, что позволяет использование данных пептидов в диапазоне выбранных концентраций.
В целом, предложенный способ направленной дифференцировки CD4+-клеток в фенотип регуляторных Т-лимфоцитов позволяет получить значимое с позиции практического применения количество Treg за счет добавления в культуру коротких пептидов ТБГ.
Claims (1)
- Способ повышения уровня аутологичных Т-регуляторных лимфоцитов (Treg) в культурах клеток периферической крови человека, заключающийся в иммуномагнитной сепарации CD4+ Т-хелперов с последующим культивированием клеток in vitro в среде RPMI-1640, 10% FBS, с добавлением 10 мМ Hepes, 2 мМ L-глутамина, 100 мкг/мл пенициллина-стрептомицина-амфотерицина и 30 мкг/мл полимиксина В с активационными частицами и условиях, предусматривающих концентрацию СО2 – 5% и температуру 37°С, в присутствии моноклональных антител против CD3, CD28 в качестве Т-клеточного активатора и цитокинов, поляризующих Т-хелперы в фенотип Treg, а именно, IL-2 и TGF-β, отличающийся тем, что в среду культивирования клеток вносят смесь пептидов YECE, YQCE, YVCS и YACS в конечной концентрации 5–50 мкг/мл.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2812053C1 true RU2812053C1 (ru) | 2024-01-22 |
Family
ID=
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011146910A1 (en) * | 2010-05-20 | 2011-11-24 | Round June L | Antigen specific tregs and related compositions, methods and systems |
| WO2016007653A2 (en) * | 2014-07-08 | 2016-01-14 | Sanford-Burnham Medical Research Institute | Psgl-1 modulators and uses thereof |
| CA3100247A1 (en) * | 2018-05-17 | 2019-11-21 | Regents Of The Univesity Of Minnesota | Drug-resistant immune cells and methods of use thereof |
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011146910A1 (en) * | 2010-05-20 | 2011-11-24 | Round June L | Antigen specific tregs and related compositions, methods and systems |
| WO2016007653A2 (en) * | 2014-07-08 | 2016-01-14 | Sanford-Burnham Medical Research Institute | Psgl-1 modulators and uses thereof |
| CA3100247A1 (en) * | 2018-05-17 | 2019-11-21 | Regents Of The Univesity Of Minnesota | Drug-resistant immune cells and methods of use thereof |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ТИМГАНОВА В.П., БОЧКОВА М.С., РАЕВ М.Б., ХРАМЦОВ П.В., ЗАМОРИНА С.А. Иммунорегуляторный потенциал трофобластического pi-гликопротеина // Медицинская иммунология. 2021, V. 23 (3). С. 455-468. ZAMORINA S.A., RAYEV М.В. Human trophoblastic β1-glycoprotein as a differentiation factor of minor regulatory T-lymphocyte subsets (Treg, Th17). The involvement of CD9 // Biochemistry (Moscow), Supplement Series A: Membrane and Cell Biology. 2016. V. 10. N 4. P. 319-327. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Klangsinsirikul et al. | Peripheral blood stem cell harvests from G-CSF–stimulated donors contain a skewed Th2 CD4 phenotype and a predominance of type 2 dendritic cells | |
| Xing et al. | Isolation, identification, and purification of murine thymic epithelial cells | |
| Dons et al. | Induced regulatory T cells: mechanisms of conversion and suppressive potential | |
| US9481866B2 (en) | Methods of producing T cell populations enriched for stable regulatory T-cells | |
| CN107475192B (zh) | 一种以记忆干t细胞为主要成分的淋巴细胞群及其体外高效扩增方法 | |
| Kawai et al. | IL-33 drives the production of mouse regulatory T cells with enhanced in vivo suppressive activity in skin transplantation | |
| CA3048831C (en) | Method for obtaining monocytes or nk cells | |
| Mathern et al. | Absence of recipient C3aR1 signaling limits expansion and differentiation of alloreactive CD8+ T cell immunity and prolongs murine cardiac allograft survival | |
| Shen et al. | CD39hi identifies an exhausted tumor-reactive CD8+ T cell population associated with tumor progression in human gastric cancer | |
| Burt et al. | Circulating HLA-DR+ natural killer cells have potent lytic ability and weak antigen-presenting cell function | |
| RU2812053C1 (ru) | Способ повышения уровня аутологичных т-регуляторных лимфоцитов в культурах клеток крови человека | |
| US20230015932A1 (en) | Method of generation of lympho-myeloid niches | |
| CA2767970C (en) | Method for using directing cells for specific stem/progenitor cell activation and differentiation | |
| Tajima et al. | Promoting 3-D Aggregation of FACS Purified Thymic Epithelial Cells with EAK 16-II/EAKIIH6 Self-assembling Hydrogel | |
| WO2023216799A1 (zh) | 一种人nkt细胞系及其应用 | |
| Shardina et al. | The role of recombinant glycodelin in the differentiation of regulatory t-lymphocytes | |
| CN108251370A (zh) | 非细胞来源的多肽致敏的dc-cik细胞、其构建方法及应用 | |
| Berglund et al. | Isolation, expansion and functional assessment of CD4+ CD25+ FoxP3+ regulatory T cells and Tr1 cells from uremic patients awaiting kidney transplantation | |
| JP2016505249A (ja) | 多分化能細胞を作製する方法 | |
| US20210371821A1 (en) | Induced regulatory t cells, methods of production, and uses thereof | |
| RU2791738C1 (ru) | Способ получения аутологичных регуляторных Т-лимфоцитов путем культивирования ex vivo в присутствии хорионического гонадотропина | |
| Ma et al. | Improved identification of tumor-specific TCRs from circulating lymphocytes using autologous colorectal tumor organoids | |
| Orlova et al. | Leptin as an immunocorrecting agent during normal pregnancy | |
| Santopolo et al. | In vitro ILC differentiation from human HSCs | |
| JP7277255B2 (ja) | インビトロでの制御性ｔ細胞の特異性評価方法 |