RU2811477C2 - Мультиспецифические антитела и способы их получения и применения - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к тетраспецифическому мономеру антитела, который связывается с CD19, CD3, 4-1BB и PD-L1, а также к антителу, его содержащему. Также раскрыты выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая вышеуказанное антитело, а также клетка и вектор, ее содержащие. Изобретение также относится к способу получения тетраспецифического антитела, включающему культивирование вышеуказанной клетки-хозяина, а также к композиции, содержащей вышеуказанное антитело. Изобретение эффективно для лечения рака, связанного с CD19, CD3, 4-1BB и PD-L1. 10 н. и 11 з.п. ф-лы, 8 ил., 2 пр.

Description

Перекрестная ссылка на родственные заявки

Настоящая заявка заявляет приоритет предварительной заявки на патент США № 62524558, поданной 25 июня 2017 г., которая в полном объеме включена здесь посредством ссылки.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение, в общем, относится к области биологических лекарственных средств и, более конкретно, относится к получению и применению мультиспецифических антител.

Уровень техники

У опухолевых клеток развиваются различные механизмы, чтобы уклониться от надзора иммунной системы. Одним из основных механизмов избегания надзора иммунной системы является снижение распознавания опухолевых клеток иммунной системой. Дефектная презентация опухолеспецифических антигенов или ее отсутствие приводит к иммунной толерантности и прогрессированию рака. Однако даже при наличии эффективного иммунологического распознавания в опухолях развиваются другие механизмы, позволяющие избежать элиминации под действием иммунной системы. Иммунокомпетентные опухоли создают супрессивную микросреду для подавления иммунного ответа. В формирование супрессивной опухолевой микросреды вовлекаются несколько «игроков», включая опухолевые клетки, регуляторные Т-клетки, миелоидные супрессорные клетки, стромальные клетки и клетки других типов. Подавление иммунного ответа может осуществляться в формате, зависимом от контактирования с клеткой, а также независимо от контактирования, посредством секреции иммуносупрессивных цитокинов или элиминации важных факторов выживаемости из локальной среды. Подавление, зависимое от контактирования с клеткой, основывается на молекулах, экспрессируемых на клеточной поверхности, например, лиганда 1 белка запрограммированной гибели (PD-L1), T-лимфоцит-ассоциированного белка 4 (CTLA-4) и других [Dunn et al., 2004, Immunity, 21 (2): 137-48; Adachi & Tamada, 2015, Cancer Sci., 106 (8): 945-50].

Поскольку механизмы, с помощью которых опухоли избегают распознавания иммунной системой, продолжают лучше пониматься, недавно появились новые способы лечения, нацеленные на эти механизмы. 25 марта 2011 г. Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) одобрило для применения инъекционный ипилимумаб (Ервой, Bristol-Myers Squibb) для лечения неоперабельной или метастатической меланомы. Ервой связывается с цитотоксическим Т-лимфоцит-ассоциированным белком 4 (CTLA-4), экспрессируемым на активированных T-клетках, и блокирует взаимодействие CTLA-4 с CD80/86 на антигенпрезентирующих клетках, блокируя тем самым негативный или ингибиторный сигнал, доставляемый в T-клетку через CTLA-4, приводя к реактивации антигенспецифических Т-клеток, что, в свою очередь, приводит к ликвидации опухоли у многих пациентов. Несколько лет спустя в 2014 г. FDA одобрило препарат Кейтруда (пембролизумаб, Merck) и препарат Опдиво (ниволумаб, Bristol-Myers Squibb) для лечения меланомы на поздних стадиях. Эти моноклональные антитела связываются с PD-1, который экспрессируется на активированных и/или истощенных Т-клетках, и блокируют взаимодействие PD-1 с PD-L1, который экспрессируется на опухолях, тем самым элиминируя ингибиторный сигнал через PD-1 в Т-клетку, что приводит к реактивации антигенспецифических Т-клеток, приводя, опять же, у многих пациентов к эрадикации опухоли. С тех пор были проведены дальнейшие клинические испытания, с целью сравнения эффективности одного моноклонального антитела Ервой с комбинацией моноклональных антител Ервой и Опдиво в лечении меланомы на поздних стадиях, которые показали повышение общей выживаемости и выживаемости без прогрессирования заболевания у пациентов, получавших комбинацию антител (Hodi et al., 2016, Lancet Oncol. 17 (11): 1558-1568, Hellman et al., 2018, Cancer Cell 33 (5): 853-861). Однако, как показали результаты многих клинических испытаний, существенный положительный эффект лечения больных раком моноклональными антителами, которые специфичны для одной или более молекул иммунных контрольных точек, проявляется только у пациентов с высокой мутационной нагрузкой, в результате которой образуется новый эпитоп(ы) Т-клеток, который распознается антигенспецифическими Т-клетками, и в результате имеет место клинический ответ (Snyder et al., 2014, NEJM, 371: 2189-2199). Те пациенты, которые имеют низкую опухолевую мутационную нагрузку, в основном не демонстрируют объективный клинический ответ (Snyder et al., 2014, NEJM, 371: 2189-2199, Hellman et al., 2018, Cancer Cell, 33 (5): 853-861).

В последние годы другие группы исследователей разработали альтернативный подход, для которого не требуется наличия презентации неоэпитопа антигенпрезентирующими клетками для активации Т-клеток. Одним примером является разработка биспецифического антитела, в котором связывающий домен антитела, который специфичен для опухоль-ассоциированного антигена, например, CD19, связан со связывающим доменом антитела, специфичным для CD3 на Т-клетках, создавая таким образом биспецифический активатор Т-клеток или молекулу BiTe. В 2014 г. FDA одобрило для применения биспецифическое антитело под названием блинатумомаб для лечения острого лимфобластного лейкоза из предшественников B-клеток. Блинатумомаб связывает scFv, специфичный для CD19, экспрессируемым на лейкозных клетках, с scFv, специфичный для CD3, экспрессируемым на Т-клетках (Bejnjamin and Stein 2016, Ther. Adv. Adv. Hematol., 7 (3): 142-146). Однако, несмотря на начальную частоту ответа у > 50% пациентов с рецидивирующим или рефрактерным ALL, многие пациенты резистентны к терапии блинатумомабом, или у них развиваются рецидивы после успешного лечения блинатумумабом. Появляются доказательства того, что резистентность к блинатумомабу или развитие рецидивов после лечения блинатумомабом обусловлены экспрессией молекул, ингибирующих иммунные контрольные точки, экспрессируемых на опухолевых клетках, таких как PD-L1, который регулирует ингибиторный сигнал через PD-1, экспрессируемый на активированных Т-клетках (Feucht et al. al., 2016, Oncotarget, 7 (47): 76902-76919). В случае пациента, участвующего в исследовании, с резистентностью к терапии блинатумомабом, был выполнен второй раунд терапии блинатумомабом, но с добавлением моноклонального антитела, пембролизумаба (Кейтруда, Merck), который специфичен для PD-1, и блокирует взаимодействие PD-1, экспрессируемого Т-клетками, с PD-L1, который экспрессируется опухолевыми клетками, что приводило к высокому ответу и снижению количества опухолевых клеток в костном мозге до уровня от 45% до менее чем 5% у этого одного пациента (Feucht et al., 2016, Oncotarget, 7 (47): 76902-76919). Эти результаты показывают, что объединение биспецифической молекулы BiTe с одним или более моноклональными антителами может существенно повысить клиническую активность по сравнению с каждым одним агентом.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение обеспечивает, среди прочего, тетраспецифические мономеры антител, антитела, содержащие тетра-специфические мономеры, их антигенсвязывающие фрагменты, мультиспецифические антитела, иммуноконъюгаты, содержащие раскрытые антитела, способы получения раскрытых мономеров, антигенсвязывающих фрагментов и антител, и способы применения раскрытых молекул для лечения рака.

В одном аспекте заявка обеспечивает тетраспецифические мономеры антител. В одном варианте осуществления тетраспецифический мономер антитела имеет N-конец и С-конец, и включает последовательно расположенные от N-конца к С-концу первый домен scFv на N-конце, второй домен scFv, домен Fab, домен Fc, и третий scFv домен на С-конце. Первый домен scFv, домен Fab, второй домен scFv и третий домен scFv каждый обладает специфичностью связывания с различным антигеном.

В одном варианте осуществления антиген включает опухолевый антиген, иммунный сигнальный антиген или их комбинацию. В одном варианте осуществления первый домен scFv, домен Fab, второй домен scFv и третий домен scFv каждый обладает специфичностью связывания с опухолевым антигеном или иммунным сигнальным антигеном. В одном варианте осуществления первый домен scFv обладает специфичностью связывания с опухолевым антигеном. В одном варианте осуществления первый домен scFv обладает специфичностью связывания с иммунным сигнальным антигеном. В одном варианте осуществления второй домен scFv обладает специфичностью связывания с опухолевым антигеном. В одном варианте осуществления второй домен scFv обладает специфичностью связывания с иммунным сигнальным антигеном. В одном варианте осуществления домен Fab обладает специфичностью связывания с опухолевым антигеном. В одном варианте осуществления домен Fab обладает специфичностью связывания с иммунным сигнальным антигеном. В одном варианте осуществления третий домен scFv обладает специфичностью связывания с опухолевым антигеном. В одном варианте осуществления третий домен scFv обладает специфичностью связывания с опухолевым антигеном.

В одном варианте осуществления тетраспецифический мономер включает первый домен scFv, второй домен scFv, домен Fab и третий домен scFv, каждый из которых независимо обладает специфичностью связывания с антигеном, выбранным из CD19, CD3, CD137, 4-1BB, PD-L1, ROR1, CD28, 41BB, CEA, HER2, EGFRvIII, EGFR, LMP1, LMP2A, мезотелина, PSMA, EpCAM, глипимай-3, gpA33, GD2, TROP2, NKG2D, BCMA, CD20, CD33, CD123, CD22, CD30, PD1, OX40, GITR, TIGIT, TIM-3, LAG-3, CTLA4, CD40, VISTA, ICOS, BTLA, LIGHT, HVEM, CSF1R, CD73 и CD39. В одном варианте осуществления домен scFv, второй домен scFv, домен Fab и третий домен scFv каждый независимо обладает специфичностью связывания с опухолеспецифическими антигенами, включая, не ограничиваясь этим, CD19, CD3, CD137, ROR1, CEA, HER2, EGFR, EGFRvIII, LMP1, LMP2A, мезотелин, PSMA, EpCAM, глипикан-3, gpA33, GD2, TROP2, BCMA, CD20, CD33, CD123, CD22, CD30, или модуляторами иммунных контрольных точек, включая, без ограничения, PD-L1, PD1, OX40, 4-1BB, GITR, TIGIT, TIM-3, LAG-3, CTLA4, CD40, VISTA, ICOS, BTLA, Light, HVEM, CD73, CD39 и т. д. В одном варианте осуществления один набор домена scFv может специфически связываться с модуляторами иммунных контрольных точек или опухолевым антигеном. В одном варианте осуществления scFv, специфический для CD3, может находиться на С-конце или N-конце тяжелой цепи или легкой цепей.

В одном варианте осуществления первый домен scFv, второй домен scFv, домен Fab и третий домен scFv каждый независимо обладает специфичностью связывания с антигеном, выбранным из CD19, CD3, CD137M, PD-L1 и 4-1BB. В одном варианте осуществления первый домен scFv обладает специфичностью связывания с CD19. В одном варианте осуществления второй домен scFv обладает специфичностью связывания с CD3. В одном варианте осуществления домен Fab обладает специфичностью связывания с 4-1BB или CD137. В одном варианте осуществления третий домен scFv обладает специфичностью связывания с PD-L1.

В одном варианте осуществления первый домен scFv обладает специфичностью связывания с CD19, второй домен scFv обладает специфичностью связывания с CD3, домен Fab обладает специфичностью связывания с 4-1BB, и третий домен scFv обладает специфичностью связывания с PD-L1. В одном варианте осуществления первый домен scFv обладает специфичностью связывания с CD19, второй домен scFv обладает специфичностью связывания с CD3, домен Fab обладает специфичностью связывания с CD137, и третий домен scFv обладает специфичностью связывания с PD-L1.

Домен scFv может включать линкер, связывающий домен scFv с тяжелой цепью или легкой цепью антитела. В одном варианте осуществления линкер может включать более 10 аминокислот. В одном варианте осуществления линкер может включать более 15 аминокислот. В одном варианте осуществления линкер может включать менее 20 аминокислот.

В одном варианте осуществления линкер может включать линкер gly-gly-gly-ser(G4S)n, и n может быть целым числом от 1 до 20. Например, n может быть равно 2, 4 или 6. В одном варианте осуществления первый домен scFv, второй домен scFv или третий домен scFv могут содержать gly-gly-gly-ser(G4S)n, где n равно 2 или 4.

Fc-домен может быть гуманизированным. В одном варианте осуществления Fc-домен представляет Fc человеческого IgG1.

В одном варианте осуществления заявка обеспечивает тетраспецифические мономеры антител, имеющие аминокислотную последовательность, имеющую процентную гомологию с SEQ ID NO: 38 и 39. Процентная гомология составляет не менее 70%, 80%, 90%, 95%, 98% или 99%.

Заявка также обеспечивает антигенсвязывающие фрагменты. В одном варианте осуществления заявка обеспечивает домены scFv. В одном варианте осуществления домен scFv имеет аминокислотную последовательность, имеющую процентную гомологию с SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 26, 28, 30 и 32, где процентная гомология составляет не менее 70%, 80%, 90%, 95%, 98% или 99%. В одном варианте заявка обеспечивает домены Fab. В одном варианте осуществления домен Fab включает аминокислотную последовательность, имеющую процентную гомологию с SEQ ID NO: 1-12 и 26-32, где процентная гомология составляет не менее 70%, 80%, 90%, 95%, 98% или 99%. Антигенсвязывающие фрагменты, раскрытые здесь, можно использовать для конструирования тетраспецифических мономеров антител или мультиспецифических антител.

В одном аспекте заявка обеспечивает мультиспецифические антитела. В одном варианте осуществления мультиспецифическое антитело включает тетраспецифические мономеры антитела. В одном варианте осуществления мультиспецифическое антитело включает два тетраспецифических мономера антитела, раскрытых здесь. Поскольку каждый тетраспецифический мономер антитела имеет четыре антигенсвязывающих домена, то раскрытое мультиспецифическое антитело может включать 8 антигенсвязывающих доменов. В одном варианте осуществления антигенсвязывающие домены в таком мультиспецифическом антителе каждый независимо обладает специфичностью связывания с разным антигеном, что обеспечивает получение октаспецифического антитела. В одном варианте осуществления мультиспецифическое антитело представляет собой пентаспецифическое антитело. В одном варианте осуществления мультиспецифическое антитело представляет пентаспецифическое антитело. В одном варианте осуществления мультиспецифическое антитело представляет пентаспецифическое антитело и гексаспецифическое антитело. В одном варианте осуществления мультиспецифическое антитело представляет пентаспецифическое антитело и гептаспецифическое антитело.

В одном варианте осуществления мультиспецифическое антитело включает димер тетраспецифического мономера антитела для обеспечения тетраспецифического антитела. В одном варианте осуществления заявка обеспечивает выделенные, очищенные или не существующие в природе мультиспецифичные антитела. В одном варианте осуществления заявка обеспечивает тетраспецифическое антитело, имеющее аминокислотную последовательность, имеющую процентную гомологию с SEQ ID NO: 37-40. Процентная гомология составляет не менее 70%, 80%, 90%, 95%, 98% или 99%.

Заявка также обеспечивает выделенную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую тетраспецифические мономеры антител, мультиспецифические антитела или их антигенсвязывающие фрагменты. В одном варианте осуществления нуклеиновая кислота кодирует аминокислотную последовательность, имеющую процентную гомологию с тетраспецифическим мономером антитела, имеющим SEQ ID NO: 37 и 38. Процентная гомология составляет не менее 70%, 80%, 90%, 95%, 98% или 99%.

Кроме того, заявка обеспечивает векторы экспрессии и клетки-хозяева, содержащие последовательности нуклеиновой кислоты, раскрытые здесь. В одном варианте осуществления клетка-хозяин включает вектор экспрессии. Клетка-хозяин может представлять собой прокариотическую клетку или эукариотическую клетку.

Заявка дополнительно обеспечивает иммуноконъюгаты. В одном варианте осуществления иммуноконъюгат включает цитотоксический агент или визуализирующий агент, связанный с мультиспецифическим антителом, раскрытым здесь, через линкер.

Линкер может быть расщепляемым или нерасщепляемым. Линкер может включать ковалентную связь, такую как сложноэфирная связь, эфирная связь, амидная связь, дисульфидная связь, имидная связь, сульфоновая связь, фосфатная связь, фосфодиэфирная связь, пептидная связь или их комбинацию. В одном варианте осуществления линкер содержит гидрофобный поли(этиленгликолевый)линкер.

Цитотоксический агент может включать химиотерапевтический агент, ингибирующий рост агент, цитотоксический агент из класса калихеамицина, антимитотический агент, токсин, радиоактивный изотоп, терапевтический агент или их комбинацию. В одном варианте осуществления цитотоксический агент включает калихеамицин, озогамицин, монометилауристатин Е, эмтанзин, их производное или комбинацию.

Визуализирующий агент может представлять любое соединение, пригодное для целей визуализации. В одном варианте осуществления визуализирующий агент может представлять радионуклид, флуоресцентный агент, квантовые точки или их комбинацию.

Заявка дополнительно обеспечивает фармацевтическую композицию. В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция содержит фармацевтически приемлемый носитель и тетраспецифический мономер антитела, раскрытый здесь. В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция содержит фармацевтически приемлемый носитель и мультиспецифическое антитело, раскрытое здесь. В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция содержит фармацевтически приемлемый носитель и антигенсвязывающий фрагмент, раскрытый здесь. В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция содержит фармацевтически приемлемый носитель и иммуноконъюгат, раскрытый здесь.

В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция дополнительно включает терапевтический агент. Примеры терапевтических агентов включают, без ограничения, радиоизотоп, радионуклид, токсин, химиотерапевтический агент или их комбинацию. В одном варианте осуществления терапевтический агент включает антитело, фермент или их комбинацию. В одном варианте осуществления терапевтический агент включает антиэстрогенный агент, ингибитор рецепторной тирозинкиназы, ингибитор киназ, ингибитор клеточного цикла, ингибитор синтеза ДНК, РНК или белка, ингибитор RAS или их комбинацию.

В одном варианте осуществления терапевтический агент включает ингибитор иммунных контрольных точек. В одном варианте осуществления терапевтический агент включает ингибитор PD1, PDL1, CTLA4, 4-1BB, OX40, GITR, ICOS, LIGHT, TIM3, LAG3, TIGIT, CD40, CD27, HVEM, BTLA, VISTA, B7H4, CSF1R, NKG2D, CD73, их производное или комбинацию.

В одном варианте осуществления терапевтический агент включает ингибитор иммунных контрольных точек. В одном варианте осуществления терапевтический агент включает ингибитор PD1, PDL1, CTLA4, 4-1BB, OX40, GITR, ICOS, LIGHT, TIM3, LAG3, TIGIT, CD40, CD27, HVEM, BTLA, VISTA, B7H4, CSF1R, NKG2D, CD73, их производное или комбинацию.

В дополнительном аспекте заявка обеспечивает способы получения тетраспецифических мономеров антител, мульти-специфических антител, их антигенсвязывающих фрагментов и их иммуноконъюгатов.

В одном варианте осуществления способ включает стадии культивирования клетки-хозяина, содержащей последовательности нуклеиновой кислоты, раскрытые здесь, так что последовательность ДНК, кодирующая антитело, экспрессируется, и выделения антитела. В одном варианте осуществления антитело представляет собой тетраспецифическое антитело.

В дополнительном аспекте заявка обеспечивает способы применения тетраспецифических мономеров антител, мульти-специфических антител, их антигенсвязывающих фрагментов и их иммуноконъюгатов для лечения рака. В одном варианте осуществления способ включает стадию введения тетраспецифических мономеров антител, мультиспецифических антител, их антигенсвязывающих фрагментов и их иммуноконъюгатов, или их фармацевтической композиции субъекту, нуждающемуся в таком лечении. В одном варианте осуществления способ включает стадию введения субъекту эффективного количества тетраспецифического антитела.

В одном варианте осуществления способ включает прямое введение в место опухоли эффективного количества мультиспецифических мономеров, мультиспецифических антител, иммуноконъюгатов, их антигенсвязывающих фрагментов.

Можно профилактировать или лечить различные типы рака. В одном варианте осуществления злокачественная опухоль может иметь клетки, экспрессирующие ROR1, CEA, HER2, EGFR, EGFR VIII, LMP1, LMP2A, мезотелин, PSMA, EpCAM, глипикан-3, gpA33, GD2, TROP2, NKG2D, BCMA, CD19, CD20, CD33 , CD123, CD22 или CD30. Примеры злокачественных заболеваний включают без ограничения рак молочной железы, колоректальный рак, рак анального канала, рак поджелудочной железы, рак желчного пузыря, рак желчных протоков, рак головы и шеи, рак носоглотки, рак кожи, меланому, рак яичника, рак предстательной железы, рак уретры, рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, мелкоклеточный рак легкого, опухоль головного мозга, глиому, нейробластому, рак пищевода, рак желудка, рак печени, рак почки, рак мочевого пузыря, рак шейки матки, рак эндометрия, рак щитовидной железы, рак глаза, саркому, рак кости, лейкоз, миелому или лимфому.

В одном варианте осуществления способ может дополнительно включать совместное введение эффективного количества терапевтического агента. В одном варианте осуществления терапевтический агент может включать антитело, химиотерапевтический агент, фермент или их комбинацию. В одном варианте осуществления терапевтический агент может включать антиэстрогенный агент, ингибитор рецепторной тирозинкиназы, ингибитор киназ, ингибитор клеточного цикла, ингибитор синтеза ДНК, РНК или белка, ингибитор RAS или их комбинацию. В одном варианте осуществления терапевтический агент может включать ингибитор иммунных контрольных точек. В одном варианте осуществления терапевтический агент может включать ингибитор PD1, PD-L1, CTLA4, 4-1BB, OX40, GITR, ICOS, LIGHT, TIM3, LAG3, TIGIT, CD40, CD27, HVEM, BTLA, VISTA, B7H4, CSF1R, NKG2D, CD73, их производное или комбинацию.

В одном варианте осуществления терапевтический агент может включать капецитабин, цисплатин, циклофосфамид, метотрексат, 5-фторурацил, доксорубицин, циклофосфамид, мустин, винкристин, прокарбазин, преднизолон, блеомицин, винбластин, дакарбазин, этопозид, эпирубицин, пеметрексед, фолиновую кислоту, гемицитабин, оксалиплатин, иринотекан, топотекан, камптотецин, доцетаксел, паклитаксел, фулвестрант, тамоксифен, летрозол, эксеместан, анастрозол, аминоглутетимид, тестолактон, ворозол, форместан, фадрозол, эрлотиниб, лафатиниб, дазатиниб, гефитиниб, осимертиниб, вандетаниб, афатиниб, иматиниб, пазопаниб, лапатиниб, сунитиниб, нилотиниб, сорафениб, наб-палитаксел, эверолимус, темсиролимус, дабрафениб, вемурафениб, траметиниб, винтафолид, апатиниб, кризотиниб, перифорсин, олапариб, бортезомиб, тофацитиниб, трастузумаб, их производное или комбинацию.

Субъект может представлять человека. В одном варианте осуществления субъект может страдать раком. Заявка также обеспечивает растворы, содержащие эффективную концентрацию мультиспецифических антител, мономеров или иммуноконъюгатов, раскрытых здесь. В одном варианте осуществления раствор представляет плазму крови субъекта.

Цели и преимущества раскрытия могут стать очевидными из последующего подробного описания примерных вариантов его осуществления в сочетании с прилагаемыми фигурами. Другие варианты осуществления могут стать легко понятными специалистам в данной области техники из следующего подробного описания, в котором описаны варианты осуществления посредством описания наилучшего предлагаемого способа осуществления. Как можно понять, возможны другие и различные варианты осуществления, и некоторые детали вариантов осуществления могут быть изменены в различных очевидных отношениях, без отклонения от сущности и объема изобретения. Следовательно, фигуры и подробное описание следует рассматривать как иллюстративные по своей природе, а не как ограничивающие.

Краткое описание фигур

Вышеизложенные и другие признаки настоящего раскрытия могут стать более понятными из следующего описания и прилагаемой формулы изобретения, в сочетании с прилагаемыми фигурами. Очевидно, понятно, что эти фигуры иллюстрируют только несколько вариантов осуществления, расположенных в соответствии с раскрытием, и, следовательно, они не должны рассматриваться как ограничивающие его объем, раскрытие может быть описано с дополнительной специфичностью и подробностями посредством использования прилагаемых фигур, на которых:

На фиг. 1 представлена схема общего формата тетра-специфического антитела, управляемого навигационным контролем (GNC).

На фиг. 2 приведены результаты эксперимента, показывающие анализ перенаправленной Т-клеточной цитотоксичности (RTCC) с PBMC (мононуклеарными клетками периферической крови) в качестве эффекторов и клетками линии B-острого лимфобластного лейкоза (B-ALL) Kasumi-2 в качестве мишеней.

На фиг. 3 представлены результаты эксперимента, показывающие пролиферацию CD8+ T-клеток, индуцированную тетраспецифическими антителами GNC.

На фиг. 4 представлены результаты эксперимента, показывающие пролиферацию CD4+ T-клеток, индуцированную тетраспецифическими антителами GNC.

На фиг. 5 представлены результаты эксперимента, показывающие секрецию гамма-интерферона из РВМС, индуцированную тетраспецифическими антителами GNC.

На фиг. 6 представлены результаты эксперимента, показывающие секрецию гранзима B из РВМС, индуцированную тетраспецифическими антителами GNC.

На фиг. 7 показаны примерные тетраспецифические антитела с доменом распознавания опухолевого антигена CD19.

На фиг. 8 представлен список примерных тетраспецифических антител, раскрытых здесь.

Подробное описание изобретения

В последующем подробном описании делается ссылка на прилагаемые фигуры, которые составляют его часть. На фигурах аналогичные символы обычно идентифицируют аналогичные компоненты, если контекст не требует иного. Иллюстративные варианты осуществления, описанные в подробном описании, на фигурах и в формуле изобретения, не предназначены для ограничения. Могут быть использованы другие варианты осуществления и могут быть внесены другие изменения без отклонения от сущности или объема предмета изобретения, представленного в данном документе. Можно легко понять, что аспекты настоящего раскрытия, как, в общем, здесь описано и иллюстрировано на фигурах, могут быть расположены, заменены, объединены, разделены и выполнены в широком разнообразии различных конфигураций, которые все здесь явно предусмотрены.

Раскрытие, среди прочего, обеспечивает выделенные антитела, способы получения таких антител, тетраспецифические или мультиспецифические молекулы, конъюгаты антитело-лекарственное средство и/или иммуноконъюгаты, состоящие из таких антител или антигенсвязывающих фрагментов, фармацевтические композиции, содержащие антитела, тетраспецифические или мультиспецифические молекулы, конъюгаты антитело-лекарственное средство и/или иммуноконъюгаты, способ их получения и способ применения раскрытых молекул или композиции для лечения рака.

Термин «антитело» используется в самом широком смысле и конкретно охватывает отдельные моноклональные антитела (включая антитела-агонисты и антитела-антагонисты), композиции антител с полиэпитопной специфичностью, а также фрагменты антител (например, Fab, F(ab')₂ и Fv), при условии, что они проявляют желаемую биологическую активность. В некоторых вариантах осуществления антитело может представлять моноклональное, поликлональное, химерное, одноцепочечное, тетраспецифическое или биэффективное, симианизированное, человеческое и гуманизированное антитело, а также их активные фрагменты. Примеры активных фрагментов молекул, которые связываются с известными антигенами, включают фрагменты Fab, F(ab')₂, scFv и Fv, включая продукты экспрессии библиотеки Fab иммуноглобулина и фрагменты, связывающие эпитопы любого из антител и фрагментов, указанных выше. В некоторых вариантах осуществления антитело может включать молекулы иммуноглобулина и иммунологически активные участки молекул иммуноглобулина, т. е. молекулы, которые содержат сайт связывания, который иммуноспецифически связывает антиген. Иммуноглобулин может быть любого типа (IgG, IgM, IgD, IgE, IgA и IgY) или класса (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или подклассов молекул иммуноглобулина. В одном варианте осуществления антитело может представлять цельные антитела и любой антигенсвязывающий фрагмент, полученный из цельных антител. Типичное антитело относится к гетеротетрамерному белку, содержащему обычно две тяжелые (Н) цепи и две легкие (L) цепи. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (сокращенно VH) и константной области тяжелой цепи. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (сокращенно VL) и константной области легкой цепи. Области VH и VL могут дополнительно подразделяться на гипервариабельные области, определяющие комплементарность участки (CDR), и более консервативные области, называемые каркасными областями (FR). Каждая вариабельная область (VH или VL) обычно состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 от аминоконца к карбоксиконцу. Внутри вариабельных областей легкой и тяжелой цепей имеются связывающие области, которые взаимодействуют с антигеном.

Как здесь используется, термин «моноклональное антитело» относится к антителу, полученному из популяции по существу гомогенных антител, т. е. отдельные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными, за исключением возможных встречающихся в природе мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифичными и направлены против одного антигенного сайта. Кроме того, в отличие от обычных (поликлональных) препаратов антител, которые обычно включают разные антитела, направленные против разных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против одной детерминанты на антигене. Помимо их специфичности моноклональные антитела обладают тем преимуществом, что они синтезируются культурой гибридомных клеток, не содержащей примесей других иммуноглобулинов. Определение «моноклональный» указывает на характер антитела, как полученного по существу из гомогенной популяции антител, и его не следует истолковывать как требующее получения антитела каким-либо конкретным способом. Например, моноклональные антитела, которые должны использоваться в соответствии с настоящим изобретением, могут быть получены гибридомным методом, впервые описанным Kohler & Milstein, Nature, 256: 495 (1975), или могут быть получены методами рекомбинантной ДНК (см., например, патент США № 4816567).

Моноклональные антитела могут включать «химерные» антитела (иммуноглобулины), в которых часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, полученных из определенного вида или принадлежащих к определенному классу или подклассу антител, тогда как остальная часть цепи(ей) идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, полученных из другого вида или принадлежащих к другому классу или подклассу антител, а также фрагментам таких антител, при условии, что они проявляют желаемую биологическую активность (патент США № 4816567 и Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 [1984]).

Моноклональные антитела могут быть получены с использованием различных способов, включая мышиную гибридому или фаговый дисплей (см. обзор Siegel. Transfus. Clin. Biol., 9: 15-22 (2002)), или посредством молекулярного клонирования антител непосредственно из первичных В-клеток (см. Tiller. New Biotechnol., 28: 453-7 (2011)). В настоящем расркытии антитела были получены иммунизацией кроликов человеческим белком PD-L1 и клетками, транзиентно экспрессирующими человеческий PD-L1, на поверхности клетки. Известно, что кролики продуцируют антитела высокой аффинности, разнообразия и специфичности (Weber et al. Exp. Mol. Med., 49: e305). В-клетки от иммунизированных животных культивировали in vitro и подвергали скринингу на продукцию анти-PD-L1-антител. Гены вариабельных областей антител выделяли с использованием методов рекомбинантной ДНК, и полученные антитела экспрессировали рекомбинантно, и затем подвергали скринингу на наличие желаемых признаков, таких как способность ингибировать связывание PD-L1 с PD-1, способность связываться с PD-L1 приматов, отличных от человека, и способность усиливать активацию Т-клеток человека. Данный общий метод создания антител аналогичен описанному в публикации Seeber et al., PLOS One, 9: e86184 (2014).

Термин «антиген- или эпитопсвязывающий участок или фрагмент» относится к фрагментам антитела, которые способны связываться с антигеном (в данном случае PD-L1). Эти фрагменты могут обладать антигенсвязывающей функцией и дополнительными функциями интактного антитела. Примеры связывающих фрагментов включают, не ограничиваясь этим, одноцепочечный фрагмент Fv (scFv), состоящий из областей VL и VH одного плеча антитела, соединенных в одну полипептидную цепь синтетическим линкером, или фрагмент Fab, который представляет собой моновалентный фрагмент, состоящий из области VL, константной области легко цепи (CL), VH и константной области 1 тяжелой цепи (CH1). Фрагменты антител могут быть даже еще меньшими субфрагментами и могут состоять из доменов, таких же небольших, как один домен CDR, в частности, домен CDR3 из областей VL и/или VH (например, см. Beiboer et al., J. Mol. Biol., 296: 833-49 (2000). Фрагменты антител получают с использованием обычных методов, известных специалистам в данной области. Фрагменты антител могут быть подвергнуты скринингу на применимость с использованием тех же методик, которые применяются для этих целей для интактных антител.

«Антиген- или эпитоп-связывающие фрагменты» можно получить из антитела по настоящему изобретению с помощью ряда методов, известных в данной области техники. Например, очищенные моноклональные антитела можно расщепить ферментом, таким как пепсин, и подвергнуть гель-фильтрации на основе ВЭЖХ. Соответствующую фракцию, содержащую фрагменты Fab, затем собирают и концентрируют мембранной фильтрацией и тому подобное. Дополнительное описание общих методик для выделения активных фрагментов антител см., например, Khaw, B.A. et al. J. Nucl. Med., 23: 1011-1019 (1982); Rousseaux et al. Methods Enzymology, 121:663-69, Academic Press, 1986.

При расщеплении антител папаином образуются два идентичных антигенсвязывающих фрагмента, называемых «Fab-фрагментами», каждый из которых имеет один антигенсвязывающий сайт, и остаточный «Fc-фрагмент», название которого отражает его способность легко кристаллизоваться. Обработка пепсином дает фрагмент F (ab')₂, который имеет два антигенсвязывающих сайта и все еще способен к перекрестному связыванию антигена.

Фрагмент Fab может содержать константную область легкой цепи и первую константную область (CH1) тяжелой цепи. Fab'-фрагменты отличаются от Fab-фрагментов добавлением нескольких остатков на карбоксиконце области CH1 тяжелой цепи, включая один или более цистеинов из шарнирной области антитела. Fab'-SH является здесь обозначением Fab', в котором остаток(и) цистеина константных областей несет свободную тиоловую группу. Фрагменты F(ab')₂ антитела первоначально были получены в виде пар Fab'-фрагментов, которые имеют цистеины шарнирной области между ними. Также известны другие химические соединения фрагментов антител.

«Fv» представляет собой минимальный фрагмент антитела, который содержит полный сайт распознавания и связывания антигена. Эта область состоит из димера вариабельной области одной тяжелой и одной легкой цепи в тесной нековалентной ассоциации. Именно в такой конфигурации три CDR каждой вариабельной области взаимодействуют с образованием антигенсвязывающего сайта на поверхности димера VH-VL. В совокупности шесть CDR придают антителу специфичность связывания антигена. Однако даже одна вариабельная область (или половина Fv, содержащего только три CDR, специфичных для антигена) обладает способностью распознавать и связывать антиген, хотя и с более низкой аффинностью, чем весь сайт связывания.

«Легкие цепи» антител (иммуноглобулинов) из любых видов позвоночных могут быть отнесены к одному из двух четко различимых типов, называемых каппа и лямбда (λ), на основе аминокислотных последовательностей их константных областей.

В зависимости от аминокислотной последовательности их константной области тяжелых цепей иммуноглобулины можно отнести к разным классам. Существует пять основных классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них могут быть дополнительно разделены на подклассы (изотипы), например, IgG-1, IgG-2, IgG-3 и IgG-4; IgA-1 и IgA-2. Константные области тяжелой цепи, которые соответствуют различным классам иммуноглобулинов, называются альфа, дельта, эпсилон, гамма и мю соответственно. Структуры субъединиц и трехмерные конфигурации различных классов иммуноглобулинов хорошо известны.

«Гуманизированное антитело» относится к типу сконструированного антитела, чьи CDR получены из донорного иммуноглобулина, отличного от человеческого, а остальные части, молекулы, полученные из иммуноглобулина, получены из одного (или нескольких) иммуноглобулина(ов) человека. В некоторых вариантах осуществления каркасные поддерживающие остатки могут быть изменены для сохранения аффинности связывания. Способы получения «гуманизированных антител» хорошо известны специалистам в данной области (см., например, Queen et al., Proc. Natl Acad Sci USA, 86: 10029-10032 (1989), Hodgson et al., Bio/Technology, 9: 421 (1991)).

Термины «полипептид», «пептид» и «белок», используемые в данном документе, являются взаимозаменяемыми и определяются как обозначающие биологическую молекулу, состоящую из аминокислот, связанных пептидной связью.

Как здесь используется, термины «а», «an» и «the» означают «один или более» и включают множественное число, если по контексту не следует иное.

Под термином «выделенная» подразумевается биологическая молекула, не содержащая, по меньшей мере, некоторых компонентов, с которыми она встречается в природе. «Выделенный», когда используется для описания различных полипептидов, раскрытых здесь, означает полипептид, который был идентифицирован и отделен и/или выделен из клетки или клеточной культуры, в которой он был экспрессирован. Обычно выделенный полипептид может быть получен, по меньшей мере, одной стадией очистки. «Выделенное антитело» относится к антителу, которое по существу не содержит других антител, имеющих различные антигенные специфичности.

«Рекомбинантный» означает, что антитела получены с использованием методов рекомбинантных нуклеиновых кислот в экзогенных клетках-хозяевах.

Термин «антиген» относится к молекуле или ее фрагменту, которые могут индуцировать иммунный ответ в организме, в частности животного, более конкретно, млекопитающего, включая человека. Термин включает иммуногены и их области, ответственные за антигенность или антигенные детерминанты.

Также, как здесь используется, термин «иммуногенный» относится к веществам, которые вызывают или усиливают выработку антител, Т-клеток или других реактивных иммунных клеток, направленных против иммуногенного агента, и способствуют проявлению иммунного ответа у людей или животных. Иммунный ответ возникает, когда у субъекта продуцируется достаточное количество антител, Т-клеток и других реактивных иммунных клеток против введенных иммуногенных композиций по настоящему изобретению, для изменения течения или ослабления расстройства, которое нужно лечить.

«Специфическое связывание» или «специфически связывается с» или «специфично для» конкретного антигена или эпитопа означает связывание, которое заметно отличается от неспецифического взаимодействия. Специфическое связывание может быть измерено, например, определением связывания молекулы по сравнению со связыванием контрольной молекулы, которая обычно представляет собой молекулу сходной структуры, но которая не обладает активностью связывания. Например, специфическое связывание можно определить посредством конкуренции с контрольной молекулой, которая сходна с мишенью.

Специфическое связывание для конкретного антигена или эпитопа может проявляться, например, антителом, имеющим KD для антигена или эпитопа, по меньшей мере, примерно 10^-4 М, по меньшей мере, примерно 10^-5 М, по меньшей мере, примерно 10^-6 М, по меньшей мере, примерно 10^-7 М, по меньшей мере, примерно 10^-8 М, по меньшей мере, примерно 10^-9 М, альтернативно, по меньшей мере, примерно 10^-10 М, по меньшей мере, примерно 10^-11 М, по меньшей мере, примерно 10^-12 М или более, где KD относится к скорости диссоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген. Как правило, антитело, которое специфически связывается с антигеном, может иметь KD, значение которой в 20, 50, 100, 500, 1000, 5000, 10000 или более раз выше для контрольной молекулы относительно антигена или эпитопа.

Кроме того, специфическое связывание для конкретного антигена или эпитопа может проявляться, например, антителом, имеющим KA или Ka для антигена или эпитопа, по меньшей мере, в 20, 50, 100, 500, 1000, 5000, 10000 раз или более выше для эпитопа по сравнению с контролем, где KA или Ka относится к скорости ассоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген.

«Гомология» между двумя последовательностями определяется идентичностью последовательности. Если две последовательности, которые подлежат сравнению друг с другом, отличаются по длине, то идентичность последовательности предпочтительно относится к проценту нуклеотидных остатков более короткой последовательности, которые идентичны нуклеотидным остаткам более длинной последовательности. Идентичность последовательности можно определить условно с использованием компьютерных программ. Отклонения, возникающие при сравнении между данной последовательностью и вышеописанными последовательностями по изобретению, могут быть вызваны, например, добавлением, делецией, заменой, вставкой или рекомбинацией.

В одном аспекте заявка обеспечивает тетраспецифические мономеры антител, антигенсвязывающие фрагменты и мультиспецифические антитела. В одном варианте осуществления заявка обеспечивает тетраспецифические антитела.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к тетраспецифическим антителам со специфичностью связывания в отношении четырех различных антигенов-мишеней. В одном варианте осуществления антигенами-мишенями являются опухолеспецифичные антигены, компонент CD3 рецептора Т-клеток или молекулы иммунных контрольных точек. Тетраспецифические антитела могут напрямую активировать эндогенные Т-клетки организма для уничтожения опухолевых клеток независимо от презентации опухолевого антигена МНС антигенспецифическим рецепторам Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления компонент, модулирующий иммунные контрольные точки тетраспецифических антител, может преодолевать иммуносупрессивную микросреду опухоли, чтобы полностью активировать истощенные Т-клетки в микросреде опухоли.

В одном варианте осуществления тетраспецифические антитела обладают уникальными свойствами прямой активации Т-клеток, в то же время, модулируя иммунные контрольные точки или ингибируя Treg или другие ингибиторные иммунные клетки или направляя в опухоль компонент против опухолевых антигенов. Это может принести положительный эффект для пациентов, когда лечение BiTE или CAR-T не подходит. В одном варианте осуществления тетраспецифические антитела могут проявлять клиническое преимущество при солидной опухоли, где BiTE-подобная технология или CAR-T лечение еще не продемонстрировали клиническую пользу за счет ограничений, вызванных ингибиторной микросредой опухоли.

В одном варианте осуществления заявка обеспечивает сконструированное антитело с 4 различными связывающими доменами или «тетраспецифическое антитело». Один связывающий домен специфичен для CD3 на Т-клетках, второй связывающий домен специфичен для опухоль-ассоциированного антигена, включая, не ограничиваясь этим, ROR1, CEA, HER2, EGFR, EGFRvIII, LMP1, LMP2A, мезотелин, PSMA, EpCAM, глипикан-3, gpA33, GD2, TROP2, BCMA, CD19, CD20, CD33, CD123, CD22, CD30, и третий и четвертый связывающие домены специфичны для двух различных модуляторов иммунных контрольных точек, таких как PD-L1, PD-1, OX40, 4-1BB, GITR, TIGIT, TIM-3, LAG-3, CTLA4, CD40, VISTA, ICOS, BTLA, Light, HVEM, CD73, CD39 и т. д.

В одном варианте осуществления тетраспецифические молекулы (фиг. 1) нацелены на CD19 человека (SEQ ID NO 25-32) опухоль-ассоциированного антигена. В некоторых вариантах осуществления эти нацеленные тетраспецифические белки несут античеловеческий PD-L1- (SEQ ID NO: 9-12), античеловеческий 4-1BB- (SEQ ID NO: 13-24), античеловеческий CD3-связывающий домен (SEQ ID NO: 1-8). Связывающие домены тетраспецифической молекулы располагаются так, что размещение домена связывания происходит от N-конца до D1, scFv VLVH, за которым следуют D2, scFv VLVH, D3, который находится в положении Fab в данной группе тетраспецифических белков, затем следует Fc человеческого IgG1 и scFv, VHVL, в D4.

В одном варианте осуществления тетраспецифический белок SI-38E34 (SEQ ID NO: 37-40) состоит из античеловеческого scFv CD19 21D4, античеловеческого scFv CD3 284A10, античеловеческого CD137 Fab и клона античеловеческого scFv PD-L1 PL221G5, занимающих положения D1, D2, D3 и D4 соответственно. D1, D2 и D3 генетически связаны посредством (G4S) × 2 линкера из 10 аминокислот, а также С-конец человеческого IgG1 Fc и D4, что приводит к образованию непрерывного мономерного пептида тяжелой цепи ~150 кДа, содержащего вышеописанные специфичности связывания. Все молекулы scFv, описанные здесь, содержат линкер gly-gly-gly-gly-ser(G4S)×4 из 20 аминокислот, который функционально связывает VH и VL, независимо от ориентации V-области (LH или HL). Оставшееся положение в тетраспецифическом белке, домен 3 (D3), состоит из тяжелой цепи IgG1, VH-CH1-шарнирная область-CH2-CH3, и соответствующей ему легкой цепи, VL-CL, которая может быть каппа или лямбда цепью. D1 и D2 генетически связаны посредством (G4S)×2 линкера из 10 аминокислот, так же как и D2, D3 и D4, что приводит к образованию непрерывного мономерного пептида тяжелой цепи ~150 кДа. При котрансфекции с соответствующей легкой цепью конечный симметричный тетраспецифический пептид можно очистить с помощью Fc IgG1 (белок A/белок G) и анализировать для оценки функциональной активности. «Кассеты» генов тяжелой и легкой цепей были сконструированы ранее так, чтобы V-области можно было клонировать с использованием сайтов рестрикции (HindIII/NheI для тяжелой цепи и HindIII/BsiWI для легкой цепи) или «клонирования без рестрикции», такого как Gibson Assembly (SGI-DNA, La Jolla, CA), Infusion (Takara Bio USA) или NEBuilder (NEB, Ipswich, MA), последний из которых использовался здесь.

Тетраспецифические белки получают с помощью способа, который включает конструирование интактной молекулы, синтез и клонирование нуклеотидных последовательностей для каждого домена, экспрессию в клетках млекопитающих и очистку конечного продукта. Нуклеотидные последовательности собирали с использованием пакета программного обеспечения Geneious 10.2.3 (Biomatters, Auckland, NZ) и разбивали на составляющие их домены-компоненты для синтеза генов (Genewiz, South Plainsfield, NJ).

В одном варианте осуществления SI-35E18 (SEQ ID NO: 65 и 67) расщепляли на составляющие его домены, где анти-4-1BB scFv, VLVH, занимает D1, клон античеловеческий PD-L1 PL230C6 занимает D2 (положение Fab), клон антиспецифический Ig 323H7 для домена ROR1 VHVL scFv занимает положение D3, и античеловеческий CD3 scFv, VHVL, занимает С-концевой D4. Используя веб-инструменты NEBuilder, 5' и 3' нуклеотиды были добавлены к каждому из доменов в зависимости от их положения в более крупном белке, так что каждый домен перекрывает свои фланкирующие домены на 20-30 нуклеотидов, которые направляют сайт-специфическую рекомбинацию, тем самым генетически сливая каждый домен на одной стадии сборки гена. За счет большого количества гомологичных областей в тетраспецифической нуклеотидной последовательности N-концевые домены 1 и 2 собираются отдельно от С-концевых D3 и D4. Затем N- и С-концевые фрагменты собирают вместе во второй реакции NEBuilder. Небольшую аликвоту трансформировали в E.coli DH10b (Invitrogen, Carlsbad, CA) и высевали в планшеты со средой TB+ карбенициллин из расчета 100 мкг/мл (Teknova, Hollister, CA) и инкубировали при 37°C в течение ночи. Полученные колонии селектировали и инокулировали 2 мл ночных культур в TB+ карбенициллин среду. ДНК получали (Thermo-Fisher, Carlsbad, CA) из ночных культур и затем секвенировали (Genewiz, South Plainsfield, NJ), используя праймеры для секвенирования (Sigma, St. Louis, MO), фланкирующие каждый домен. В некоторых вариантах осуществления последовательности ДНК собирали и анализировали в Geneious.

В еще одном аспекте заявка обеспечивает фармацевтические композиции, включающие мономеры мультиспецифических антител, мультиспецифические антитела, антигенсвязывающие фрагменты и их иммуноконъюгаты, и способы применения раскрытых антител или фармацевтических композиций для лечения рака.

Преимущества применения раскрытых мультиспецифических мономеров антител, мультиспецифических антител или композиций в целях лечения по сравнению с любыми существующими способами лечения включают, среди прочего, следующее: 1) включение домена Fc IgG может придавать характеристику более длительного периода полураспада в сыворотке крови по сравнению с биспецифической молекулой BiTe; 2) включение двух связывающих доменов, специфичных для модуляторов иммунных контрольных точек, которые могут ингибировать супрессорные пути и одновременно активировать костимуляторные пути; и 3) сшивание CD3 на Т-клетках с опухоль-ассоциированными антигенами, таким образом «перенаправляя» Т-клетки для индукции гибели опухоли без необходимости в удалении Т-клеток у пациента и их генетической модификации, чтобы они были специфичны для опухолевой клетки, прежде чем повторно введение их обратно пациенту, как это делается для Т-клеток химерного рецептора антигена (CAR-T).

Формуляцию фармацевтической композиции можно осуществить в соответствии со стандартной методологией, известной специалистам в данной области.

В одном варианте осуществления антитела и мономеры по настоящему изобретению можно приготовить в физиологически приемлемом составе, и он может содержать фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель и/или эксципиент с использованием известных методик. Например, антитело по изобретению и как здесь описано, включая любое функционально эквивалентное антитело или его функциональные фрагменты, в частности, моноклональное антитело, включающее любое функционально эквивалентное антитело или его функциональные фрагменты, объединяют с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем и/или эксципиентом для формирования терапевтической композиции. Формуляцию фармацевтической композиции по настоящему изобретению можно осуществить в соответствии со стандартной методологией, известной специалистам в данной области.

В отношении формуляции подходящих композиций для введения субъекту, такому как человек-пациент, нуждающийся в лечении, антитела, раскрытые здесь, можно смешать или объединить с фармацевтически приемлемыми носителями, известными в данной области, в зависимости от выбранного пути введения. Отсутствуют конкретные ограничения в отношении способов применения антител, раскрытых здесь, и выбор подходящих путей введения и подходящих композиций известен в данной области без излишнего экспериментирования.

Подходящие фармацевтические носители, разбавители и/или эксципиенты хорошо известны в данной области и включают, например, забуференные фосфатом солевые растворы, воду, эмульсии, такие как эмульсии масло/вода.

«Фармацевтически приемлемый» относится к таким соединениям, материалам, композициям и лекарственным формам, которые в рамках здравого медицинского заключения пригодны для применения в контакте с тканями людей или животных без проявления чрезмерной токсичности, раздражения или других проблем или осложнений, соразмерных с разумным соотношением пользы/риска.

В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция может включать белковые носители, например, такие как сывороточный альбумин или иммуноглобулин, в частности, человеческого происхождения. Дополнительные биологически активные агенты могут присутствовать в фармацевтической композиции по изобретению в зависимости от предлагаемого применения. В одном варианте осуществления белковое фармацевтически активное вещество может присутствовать в количествах от 1 нг до 10 мг на дозу. Обычно режим введения должен находиться в диапазоне от 0,1 мкг до 10 мг антитела по настоящему изобретению, в частности, в диапазоне от 1,0 мкг до 1,0 мг и, более конкретно, в диапазоне от 1,0 мкг до 100 мкг, где все отдельные числа, попадающие в эти диапазоны, также являются частью раскрытия. Если введение осуществляют посредством непрерывной инфузии, то более подходящая дозировка может находиться в диапазоне от 0,01 мкг до 10 мг единиц на килограмм массы тела в час, где все отдельные числа, попадающие в эти диапазоны, также являются частью раскрытия.

Композиции по настоящему изобретению можно вводить субъекту в форме твердого вещества, жидкости или аэрозоля в подходящей фармацевтически эффективной дозе. Примеры твердых композиций включают пилюли, кремы и имплантируемые дозированные единицы. Таблетки можно вводить перорально. Терапевтические кремы можно применять местно. Имплантируемые дозированные единицы могут вводиться локально, например, в место локализации опухоли, или могут быть имплантированы для системного высвобождения терапевтической композиции, например, подкожно. Примеры жидких композиций включают составы, адаптированные для инъекций внутримышечно, подкожно, внутривенно, внутриартериально, и составы для местного и внутриглазного введения. Примеры аэрозольных составов включают ингаляционные составы для введения в легкие.

Специалистам в данной области техники хорошо известно, что дозировка композиции может зависеть от различных факторов, таких как, например, патологическое состояние, которое лечат, конкретная используемая композиция и другие клинические факторы, такие как масса тела, размер, пол и общее состояние здоровья пациента, площадь поверхности тела, конкретное соединение или композиция, которые нужно вводить, другие лекарственные препараты, которые вводят одновременно, и путь введения.

Термин «терапевтически эффективное количество» или «эффективное количество» относится к количеству антитела, которое при введении человеку или животному вызывает ответ, достаточный для того, чтобы привести к терапевтическому эффекту у указанного человека или животного, например, для ослабления заболевания. Специалист с обычной квалификацией в данной области техники легко определит эффективное количество после рутинных процедур. Когда заболевание представляет собой рак, то эффективное количество лекарственного средства может ингибировать (например, замедлять до некоторой степени, подавлять или останавливать) один или более следующих примерных признаков, включая, без ограничения, рост опухолевых клеток, пролиферацию опухолевых клеток, подвижность опухолевых клеток, инфильтрацию опухолевых клеток в периферические органы, метастазирование опухоли и рост опухоли. Когда заболевание представляет болезнь Майера, то эффективное количество лекарственного средства может альтернативно обеспечивать одно или более из следующих действий при введении субъекту: замедлять или останавливать рост опухоли, уменьшать размер опухоли (например, объем или массу), ослаблять до некоторой степени один или более симптомов, связанных с раком, увеличивать выживаемость без прогрессирования заболевания, приводить к объективному ответу (включая, например, частичный ответ или полный ответ) и увеличивать общую выживаемость. В той степени, в которой лекарственное средство может предотвращать рост и/или приводить к гибели существующих опухолевых клеток, оно является цитостатическим и/или цитотоксическим.

Специалист в данной области способен определить эффективное количество или концентрацию антител, раскрытых здесь, для эффективного лечения такого патологического состояния, как рак. Специалист в данной области может определить другие параметры, такие как относительные количества различных компонентов в фармацевтической композиции, способы и частоту введения, без чрезмерного экспериментирования. Например, подходящий раствор для инъекций может содержать, без ограничения, примерно от 1 мг до примерно 20 мг, примерно от 1 мг до примерно 10 мг антител на мл. Примерная доза может составлять, без ограничения, примерно от 0,1 мг/кг до примерно 20 мг/кг, примерно от 1 мг/кг до примерно 5 мг/кг массы тела. Примерная частота введения может составлять, без ограничения, один раз в день или три раза в неделю.

Композиции можно вводить обычными путями введения. Как правило, композицию можно вводить местным, пероральным, ректальным, назальным, внутрикожным, внутрибрюшинным или парентеральным (например, внутривенным, подкожным или внутримышечным) путями. В некоторых вариантах осуществления композицию можно включить в матрицы с замедленным высвобождением, такие как биоразлагаемые полимеры, при этом полимеры имплантируют рядом с местом, в которое желательна доставка, например, в место локализации опухоли. Способ включает введение однократной дозы, введение повторных доз через заранее определенные интервалы времени и продолжительное введение в течение заранее определенного периода времени.

Несмотря на то, что возможны многие формы введения, примерной формой введения может быть раствор для инъекции, в частности для внутривенной или внутриартериальной инъекции. Обычно подходящая фармацевтическая композиция для инъекций может включать фармацевтически подходящие носители или эксципиенты, такие как, без ограничения, буфер, поверхностно-активное вещество или стабилизирующий агент. Примеры буферов могут включать, без ограничения, ацетатный, фосфатный или цитратный буфер. Примеры поверхностно-активных веществ могут включать, без ограничения, полисорбат. Пример стабилизатора может включать, без ограничения, человеческий альбумин.

В одном варианте осуществления введение может быть парентеральным, например, внутривенным. Препараты для парентерального введения включают стерильные водные или неводные растворы, суспензии и эмульсии. Неводные растворители включают, не ограничиваясь этим, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительное масло, такое как оливковое масло, и инъецируемые органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Водные растворители могут быть выбраны из группы, состоящей из воды, спиртовых/водных растворов, эмульсий или суспензий, включая физиологический раствор и забуференные среды. Парентеральные носители включают раствор хлорида натрия, декстрозу Рингера, декстрозу и хлорид натрия, лактат Рингера или нелетучие масла. Носители для внутривенного введения включают пополнители жидкости и питательных веществ, пополнители электролитов (например, основанные на декстрозе Рингера) и другие. Также могут присутствовать консерванты, такие как, например, противомикробные препараты, антиоксиданты, хелатообразующие агенты, инертные газы и т. д.

Мономеры антител, антитела, антигенсвязывающие фрагменты и их иммуноконъюгаты можно использовать в комбинации с терапевтическим агентом или композицией, содержащей терапевтический агент, в целях лечения.

В некоторых вариантах осуществления молекула мультиспецифического антитела используется в комбинации с одним или более дополнительными терапевтическими агентами в их эффективном количестве. Дополнительный терапевтический агент включает антитело, химиотерапевтический агент, фермент или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления дополнительный терапевтический агент может представлять собой антиэстрогенный агент, ингибитор рецепторной тирозинкиназы, ингибитор киназ, ингибитор клеточного цикла, ингибитор синтеза ДНК, РНК или белка, ингибитор RAS или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления дополнительный терапевтический агент может представлять собой ингибитор иммунных контрольных точек. В некоторых вариантах осуществления терапевтический агент включает ингибиторы PD1, PDL1, CTLA4, 4-1BB, OX40, GITR, ICOS, LIGHT, TIM3, LAG3, TIGIT, CD40, CD27, HVEM, BTLA, VISTA, B7H4, CSF1R, NKG2D, CD73 , их производное или комбинацию.

В одном варианте осуществления терапевтический агент может включать капецитабин, цисплатин, трастузумаб, фулвестрант, тамоксифен, летрозол, эксеместан, анастрозол, аминоглутетимид, тестолактон, ворозол, форместан, фадрозол, летрозол, эрлотиниб, лафатиниб, дазатиниб, гефитиниб, иматиниб, пазопаниб, лапатиниб сунитиниб, нилотиниб, сорафениб, наб-палитаксел, их производное или комбинацию. В одном варианте осуществления терапевтический агент может включать капецитабин, цисплатин, циклофосфамид, метотрексат, 5-фторурацил, доксорубицин, циклофосфамид, мустин, винкристин, прокарбазин, преднизолон, блеомицин, винбластин, дакарбазин, этопозид, эпирубицин, пеметрексед, фолиновую кислоту, гемицитабин, оксалиплатин, иринотекан, топотекан, камптотецин, доцетаксел, паклитаксел, фулвестрант, тамоксифен, летрозол, эксеместан, анастрозол, аминоглутетимид, тестолактон, ворозол, форместан, фадрозол, эрлотиниб, лафатиниб, дазатиниб, гефитиниб, осимертиниб, вандетаниб, афатиниб, иматиниб, пазопаниб, лапатиниб, сунитиниб, нилотиниб, сорафениб, наб-палитаксел, эверолимус, темсиролимус, дабрафениб, вемурафениб, траметиниб, винтафолид, апатиниб, кризотиниб, перифорсин, олапариб, бортезомиб, тофацитиниб, трастузумаб, их производное или комбинацию.

Злокачественные опухоли, в том числе рак молочной железы, колоректальный рак, рак поджелудочной железы, рак головы и шеи, меланома, рак яичников, рак предстательной железы, немелкоклеточный рак легких, глиома, рак пищевода, рак носоглотки, рак анального канала, рак прямой кишки, рак желудка, мочевого пузыря рак, рак шейки матки или рак мозга, могут экспрессировать гены, связанные с опухолями. Ингибирование опухоль-ассоциированной активности с помощью специфических моноклональных антител или антигенсвязывающего фрагмента может оказывать терапевтическое действие на рак. Кроме того, введение терапевтически эффективного количества композиции, содержащей моноклональные антитела или антигенсвязывающий фрагмент, специфичные для опухоль-ассоциированного белка, можно излечивать, предотвращать, ослаблять и задерживать развитие или метастазирование злокачественных опухолей благодаря действию цитотоксического агента.

Настоящее раскрытие может быть более легко понятным посредством ссылки на следующее подробное описание конкретных вариантов осуществления и примеров, включенных в настоящий документ. Несмотря на то, что настоящее раскрытие было описано со ссылкой на специфические подробности некоторых его вариантов осуществления, не предполагается, что такие подробности следует рассматривать в качестве ограничений объема раскрытия.

Примеры

Пример 1: анализ перенаправленной Т-клеточной цитотоксичности (RTCC) с PBMC (мононуклеарными клетками периферической крови) в качестве эффекторов и клетками линий B-острого лимфобластного лейкоза (B-ALL) Kasumi-2 и NALM-6 в качестве мишеней

Тетраспецифические антитела, приведенные на Фиг. 7 и 8, тестировали на активность RTCC против клеток линий B-ALL Kasumi-2 и Nalm-6 с использованием PBMC человека в качестве эффекторов. Клетки-мишени Kasumi-2 и Nalm-6 ранее трансфектировали зеленым флуоресцентным белком (GFP) и проводили сортинг FACS для получения популяции клеток, в которых экспрессия GFP превышала 99%. Клетки GFP+ Kasumi-2 и GFP+ Nalm-6 подсчитывали и устанавливали на плотности 100000 клеток/мл в среде для анализа. РВМС человека подсчитывали и устанавливали на плотности 100000 клеток/мл. Антитела готовили в 2× конечной концентрации и титровали 1:10 в 6 лунках 96-луночного планшета в среде для анализа. В конечном 96-луночном планшете клетки-мишени, PBMC и серийные разведения антител объединяли добавлением 50 мкл клеток-мишеней (5000), 50 мкл клеток PBMC (5000) и 100 мкл каждого разведения антитела в каждой лунке планшета для анализа. Планшет для анализа инкубировали при 37°С в течение 8 суток, и затем 100 мкл супернатанта переносили в новый 96-луночный планшет и замораживали при -80°С для последующего анализа. Клетки ресуспендировали пипетированием и переносили в 384-луночный планшет. Клетки окрашивали смесью антител, которая включала коммерческие антитела, непосредственно конъюгированные с анти-CD4 и анти-CD8. Клетки, оставшиеся в лунках, промывали и ресуспендировали аналитическим буфером, содержащим коммерческие антитела с прямым конъюгированием анти-CD4 (Biolegend Cat # 317436) и анти-CD8 (Biolegend Cat # 557746) плюс живое/мертвое пятно 7AAD и подсчет гранул, и затем анализировали на BD LSRIII Fortessa. Определяли количество CD4+, CD8+ и GFP+ клеток-мишеней на лунку. Как показано на фиг.2, тетраспецифические антитела SI-38X34, SI-38X35 и SI-38X36 вызывают гибель под действием Т-клеток большей части клеток-мишеней линии NALM-6 в концентрации 0,05 пМ, что примерно в 10 раз сильнее, чем для биспецифических антител SI-38X19 и HD37ХI2C. Поскольку биспецифическое антитело SI-38X19 имеет связывающие домены 21D4 (CD19) и 284A10 (CD3), как и в тетраспецифических антителах SI-38E34, SI-38E35 и SI-38E36, но тетраспецифические антитела имеют дополнительные домены 420H5, 466F6, 460C3 (41BB) и PL221 (PDL1), свидетельствуя о том, что дополнительные 41BB- и/или PDL1-связывающие домены в тетраспецифических антителах оказывают усиливающее влияние на гибель под действием Т-клеток клетками-мишенями. Кроме того, как показано на фиг.3, биспецифическое антитело 21D4Х284A10 сильно индуцирует пролиферацию CD8+ T-клеток, как и биспецифическое HD37ХI2C при 10-кратной более высокой концентрации, чем биспецифическое антитело для 21D4Х284A10. Однако тетраспецифические антитела SI-38E34, SI-38E35 и SI-38E36 индуцируют гораздо более низкие уровни пролиферации CD8+T-клеток при сходных концентрациях. Эти данные в сочетании с данными RTCC на фиг. 2 позволяют предположить, что тетра-специфические антитела индуцируют дифференцировку CD8+ Т-клеток в конечные цитотоксические Т-клетки эффективнее, чем биспецифические антитела. Как показано на фиг. 4, тестированные биспецифические антитела также индуцируют большую пролиферацию CD4+ Т-клеток, аналогично влиянию на пролиферацию CD8+ Т-клеток, и тетраспецифические антитела индуцируют гораздо более низкие уровни пролиферации CD4+ Т-клеток.

Пример 2: анализ ELISA гамма-интерферона и гранзима B в культуральных супернатантах на сутки 8 RTCC с CD19-специфическими антителами GNC

Супернатанты в лунках, которые хранили при -80°С, оттаивали и анализировали на содержание гамма-интерферона и гранзима B с использованием наборов для анализа g-IFN и GrB производства R&D systems (№ DY285B и № DY2906-05) в соответствии с протоколом, рекомендованным изготовителем. Субстрат QuantaRed^TM Enhanced Chemifluorescent HRP (ThermoFisher Scientific № 15159) добавляли в каждую лунку планшетов для ELISA и использовали в соответствии с инструкциями изготовителя. Как показано на фиг. 6, биспецифическое антитело 21D4Х284A10 индуцировало высокий уровень секреции гамма-интерферона из РВМС при концентрации 50 пМ антитела, почти идентичный для тетраспецифического антитела SI-34E34, тогда как другие тетраспецифические антитела SI-34E35 и SI-34E36, а также биспецифическое антитело HD37ХI2C индуцировало секрецию гамма-интерферона из РВМС, но гораздо на более низком уровне. Как показано на фиг.6, биспецифическое антитело 21D4Х284A10 индуцировало высокий уровень секреции гранзима B из РВМС при концентрации 50 пМ антитела, почти идентичный для тетраспецифического антитела SI-34E34, тогда как другие тетрапецифические антитела SI-34E35 и SI-34E36, а также биспецифическое антитело HD37ХI2C вызывало секрецию гранзима B из РВМС, но на несколько более низких уровнях. Несмотря на то, что гибель опухолевых клеток, опосредованная тетраспецифическими антителами SI-38E34, SI-38E35 и SI-38E36, была довольно сходной, как показано на фиг.3, количество гранзима B, секретированного из РВМС, было самым высоким с тетраспецифическим антителом SI-38E34 примерно в 2 раза более высокими уровнями по сравнению с другими 2 тетраспецифическими антителами SI-38E35 и SI-38E36.

Несмотря на то что настоящее раскрытие было описано со ссылкой на конкретные варианты осуществления или примеры, можно понять, что варианты осуществления являются иллюстративными и что объем раскрытия не ограничен таким образом. Альтернативные варианты осуществления настоящего раскрытия могут стать очевидными для специалистов в данной области техники, к которой относится настоящее раскрытие. Такие альтернативные варианты осуществления включаются в объем настоящего раскрытия. Следовательно, объем настоящего раскрытия определяется прилагаемой формулой изобретения и подтверждается вышеприведенным описанием. Все ссылки, цитированные или упомянутые в этом раскрытии, в полном объеме включены здесь посредством ссылки.

Список последовательностей

Список последовательностей тетраспецифических антител

CDR подчеркнуты в аминокислотных последовательностях

>SEQ ID:01 анти-CD3 284A10 VHv1 нуклеотидная последовательность

GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCATCAGTACCAATGCAATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGGAGTCATTACTGGTCGTGATATCACATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCAGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGCGCGACGGTGGATCATCTGCTATTACTAGTAACAACATTTGGGGCCAAGGAACTCTGGTCACCGTTTCTTCA

>SEQ ID:02 анти-CD3 284A10 VHv1 аминокислотная последовательность

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTISTNAMSWVRQAPGKGLEWIGVITGRDITYYASWAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGGSSAITSNNIWGQGTLVTVSS

>SEQ ID:03 анти-CD3 284A10 VLv1 нуклеотидная последовательность

GACGTCGTGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCAATTGCCAAGCCAGTGAGAGCATTAGCAGTTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGAAGCATCCAAACTGGCATCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTATTACTGCCAAGGCTATTTTTATTTTATTAGTCGTACTTATGTAAATTCTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA

>SEQ ID:04 анти-CD3 284A10 VLv1 аминокислотная последовательность

DVVMTQSPSTLSASVGDRVTINCQASESISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYEASKLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQGYFYFISRTYVNSFGGGTKVEIK

>SEQ ID:05 анти-CD3 I2C VH нуклеотидная последовательность

CAGGTGCAATTGGTGGAAAGCGGAGGGGGACTGGTGCAGCCCGGGGGAAGTCTGAAGCTGTCCTGTGCCGCCAGCGGCTTTACCTTCAACAAGTACGCCATGAATTGGGTCCGACAGGCCCCAGGGAAAGGCCTGGAATGGGTGGCACGGATTCGGTCCAAGTACAACAACTACGCCACCTACTACGCTGACTCCGTGAAGGACAGATTCACCATCAGCCGGGACGACTCTAAGAACACCGCCTATCTGCAGATGAACAACCTGAAAACCGAGGATACAGCTGTGTACTATTGTGTGCGGCACGGCAACTTCGGCAACTCCTACATCTCCTACTGGGCCTATTGGGGACAGGGAACACTGGTCACCGTGTCTAGC

>SEQ ID:06 анти-CD3 I2C VH аминокислотная последовательность

QVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSS

>SEQ ID:07 анти-CD3 I2C VL нуклеотидная последовательность

CAGACCGTGGTCACCCAGGAACCTTCCCTGACCGTCTCCCCAGGCGGCACCGTGACCCTGACCTGTGGCTCCTCTACCGGCGCTGTGACCTCCGGCAACTACCCTAACTGGGTGCAGCAGAAACCCGGACAGGCTCCTAGAGGCCTGATCGGCGGCACCAAGTTTCTGGCCCCTGGCACCCCTGCCAGATTCTCCGGCTCCCTGCTGGGAGGCAAGGCCGCTCTGACCCTGTCTGGCGTGCAGCCTGAGGACGAGGCCGAGTACTACTGTGTGCTGTGGTACTCCAACAGATGGGTGTTCGGAGGCGGCACAAAGCTGACCGTGCTGTCCTCG

>SEQ ID:08 анти-CD3 I2C VL аминокислотная последовательность

QTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLSS

>SEQ ID:09 анти-PD-L1 PL221G5 VHv1 нуклеотидная последовательность

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCTCCTTCAGTAGCGGGTACGACATGTGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGCATGCATTGCTGCTGGTAGTGCTGGTATCACTTACGACGCGAACTGGGCGAAAGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAGATCGGCGTTTTCGTTCGACTACGCCATGGACCTCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC

>SEQ ID:10 анти-PD-L1 PL221G5 VHv1 аминокислотная последовательность

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSSGYDMCWVRQAPGKGLEWIACIAAGSAGITYDANWAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSAFSFDYAMDLWGQGTLVTVSS

>SEQ ID:11 анти-PD-L1 PL221G5 VLv1 нуклеотидная последовательность

GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTAGTTCCCACTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATAAGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTTACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTATTACTGCCAACAGGGTTATAGTTGGGGTAATGTTGATAATGTTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA

>SEQ ID:12 анти-PD-L1 PL221G5 VLv1 аминокислотная последовательность

DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQSISSHLNWYQQKPGKAPKLLIYKASTLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGYSWGNVDNVFGGGTKVEIK

>SEQ ID:13 анти-4-1BB 420H5 VHv3 нуклеотидная последовательность

CAGTCGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCTCCTTCAGTAGCAACTACTGGATATGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGCATGCATTTATGTTGGTAGTAGTGGTGACACTTACTACGCGAGCTCCGCGAAAGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAGAGATAGTAGTAGTTATTATATGTTTAACTTGTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC

>SEQ ID:14 анти-4-1BB 420H5 VHv3 аминокислотная последовательность

QSLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSSNYWICWVRQAPGKGLEWIACIYVGSSGDTYYASSAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDSSSYYMFNLWGQGTLVTVSS

>SEQ ID:15 анти-4-1BB 420H5 VLv3 нуклеотидная последовательность

GCCCTTGTGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCAATTGCCAGGCCAGTGAGGACATTGATACCTATTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTTTTATGCATCCGATCTGGCATCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTATTACTGCCAAGGCGGTTACTATACTAGTAGTGCTGATACGAGGGGTGCTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA

>SEQ ID:16 анти-4-1BB 420H5 VLv3 аминокислотная последовательность

ALVMTQSPSTLSASVGDRVTINCQASEDIDTYLAWYQQKPGKAPKLLIFYASDLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQGGYYTSSADTRGAFGGGTKVEIK

>SEQ ID:17 анти-4-1BB 466F6 VHv2 нуклеотидная последовательность

CGGTCGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTACAGCCTCTGGATTCACCATCAGTAGCTACCACATGCAGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTACATCGGAACCATTAGTAGTGGTGGTAATGTATACTACGCGAGCTCCGCGAGAGGCAGATTCACCATCTCCAGACCCTCGTCCAAGAACACGGTGGATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGACTCTGGTTATAGTGATCCTATGTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC

>SEQ ID:18 анти-4-1BB 466F6 VHv2 аминокислотная последовательность

RSLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTISSYHMQWVRQAPGKGLEYIGTISSGGNVYYASSARGRFTISRPSSKNTVDLQMNSLRAEDTAVYYCARDSGYSDPMWGQGTLVTVSS

>SEQ ID:19 анти-4-1BB 466F6 VLv5 нуклеотидная последовательность

GACGTTGTGATGACCCAGTCTCCATCTTCCGTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACCTGTCAGGCCAGTCAGAACATTAGGACTTACTTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCAGCCAATCTGGCATCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGCCTGGCGATGCTGCAACTTACTATTGTCAGTCTACCTATCTTGGTACTGATTATGTTGGCGGTGCTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA

>SEQ ID:20 анти-4-1BB 466F6 VLv5 аминокислотная последовательность

DVVMTQSPSSVSASVGDRVTITCQASQNIRTYLSWYQQKPGKAPKLLIYAAANLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISDLEPGDAATYYCQSTYLGTDYVGGAFGGGTKVEIK

>SEQ ID:21 анти-4-1BB 460C3 VHv1 нуклеотидная последовательность

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGAATCGACTTCAGTAGGAGATACTACATGTGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGCATGCATATATACTGGTAGCCGCGATACTCCTCACTACGCGAGCTCCGCGAAAGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAGAGAAGGTAGCCTGTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC

>SEQ ID:22 анти-4-1BB 460C3 VHv1 аминокислотная последовательность

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGIDFSRRYYMCWVRQAPGKGLEWIACIYTGSRDTPHYASSAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGSLWGQGTLVTVSS

>SEQ ID:23 анти-4-1BB 460C3 VLv1 нуклеотидная последовательность

GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGTCCAGTCAGAGTGTTTATAGTAACTGGTTCTCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTCTGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTATTACTGCGCAGGCGGTTACAATACTGTTATTGATACTTTTGCTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA

>SEQ ID:24 анти-4-1BB 460C3 VLv1 аминокислотная последовательность

DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQSSQSVYSNWFSWYQQKPGKAPKLLIYSASTLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCAGGYNTVIDTFAFGGGTKVEIK

>SEQ ID:25 анти-CD19 21D4 VH нуклеотидная последовательность

GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCAGAGGTGAAGAAACCAGGAGAGTCTCTGAAGATCTCCTGTAAGGGTTCTGGATACAGCTTTAGCAGTTCATGGATCGGCTGGGTGCGCCAGGCACCTGGGAAAGGCCTGGAATGGATGGGGATCATCTATCCTGATGACTCTGATACCAGATACAGTCCATCCTTCCAAGGCCAGGTCACCATCTCAGCCGACAAGTCCATCAGGACTGCCTACCTGCAGTGGAGTAGCCTGAAGGCCTCGGACACCGCTATGTATTACTGTGCGAGACATGTTACTATGATTTGGGGAGTTATTATTGACTTCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA

>SEQ ID:26 анти-CD19 21D4 VH аминокислотная последовательность

EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFSSSWIGWVRQAPGKGLEWMGIIYPDDSDTRYSPSFQGQVTISADKSIRTAYLQWSSLKASDTAMYYCARHVTMIWGVIIDFWGQGTLVTVSS

>SEQ ID:27 анти-CD19 21D4 VL нуклеотидная последовательность

GCCATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTAGCAGTGCTTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCTCCTAAGCTCCTGATCTATGATGCCTCCAGTTTGGAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGTTTAATAGTTACCCATTCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAA

>SEQ ID:28 анти-CD19 21D4 VL аминокислотная последовательность

AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSALAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYPFTFGPGTKVDIK

>SEQ ID:29 анти-CD19 HD37 VH нуклеотидная последовательность

CAGGTCCAACTCCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGTCCTCAGTGAAGATTTCCTGCAAGGCTTCTGGCTATGCCTTCAGTAGCTACTGGATGAACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAGGGTCTTGAGTGGATTGGACAGATTTGGCCTGGAGATGGTGATACTAACTACAATGGAAAGTTCAAGGGGAAAGCCACTCTGACTGCAGACGAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTCAGCAGCCTAGCATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGACGGGAGACTACGACGGTAGGCCGTTATTACTATGCTATGGACTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCC

>SEQ ID:30 анти-CD19 HD37 VH аминокислотная последовательность

QVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIWPGDGDTNYNGKFKGKATLTADESSSTAYMQLSSLASEDSAVYFCARRETTTVGRYYYAMDYWGQGTTVTVSS

>SEQ ID:31 анти-CD19 HD37 VL нуклеотидная последовательность

GATATCCAGCTGACCCAGTCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCATCTCCTGCAAGGCCAGCCAAAGTGTTGATTATGATGGTGTGAGTTACTTGAACTGGTATCAACAGATTCCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATGATGCTTCCAATCTAGTTTCTGGGATCCCACCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGAAGGTGGATGCTGCAACCTATCACTGTCAGCAAAGTACTGAGGATCCGTGGACGTTCGGTGGAGGGACCAAGCTCGAGATTAAA

>SEQ ID:32 анти-CD19 HD37 VL нуклеотидная последовательность

DIQLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGVSYLNWYQQIPGQPPKLLIYDASNLVSGIPPRFSGSGSGTDFTLNIHPVEKVDAATYHCQQSTEDPWTFGGGTKLEIK

>SEQ ID:33 человеческий IgG1 с нулевой мутацией (G1m-fa с нулевой мутацией ADCC/CDC) нуклеотидная последовательность

GCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGCGGGGGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCGCGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT

>SEQ ID:34 человеческий IgG1 с нулевой мутацией (G1m-fa с нулевой мутацией ADCC/CDC) аминокислотная последовательность ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

>SEQ ID:35 каппа цепь человеческого Ig нуклеотидная последовательность

CGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT

>SEQ ID:36 каппа цепь человеческого Ig аминокислотная последовательность

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

>SEQ ID:37 SI-38E34 (21D4-LH-scFv x 284A10-L1H1-scFv x 420H5-Fab x PL221G5-H1L1-scFv) тяжелая цепь нуклеотидная последовательность

GCCATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTAGCAGTGCTTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCTCCTAAGCTCCTGATCTATGATGCCTCCAGTTTGGAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGTTTAATAGTTACCCATTCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAAGGCGGTGGCGGTAGTGGGGGAGGCGGTTCTGGCGGCGGAGGGTCCGGCGGTGGAGGATCAGAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCAGAGGTGAAGAAACCAGGAGAGTCTCTGAAGATCTCCTGTAAGGGTTCTGGATACAGCTTTAGCAGTTCATGGATCGGCTGGGTGCGCCAGGCACCTGGGAAAGGCCTGGAATGGATGGGGATCATCTATCCTGATGACTCTGATACCAGATACAGTCCATCCTTCCAAGGCCAGGTCACCATCTCAGCCGACAAGTCCATCAGGACTGCCTACCTGCAGTGGAGTAGCCTGAAGGCCTCGGACACCGCTATGTATTACTGTGCGAGACATGTTACTATGATTTGGGGAGTTATTATTGACTTCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGCGGTGGAGGGTCCGGCGGTGGTGGATCCGACGTCGTGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCAATTGCCAAGCCAGTGAGAGCATTAGCAGTTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGAAGCATCCAAACTGGCATCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTATTACTGCCAAGGCTATTTTTATTTTATTAGTCGTACTTATGTAAATTCTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAAGGCGGTGGCGGTAGTGGGGGAGGCGGTTCTGGCGGCGGAGGGTCCGGCGGTGGAGGATCAGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCATCAGTACCAATGCAATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGGAGTCATTACTGGTCGTGATATCACATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCAGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGCGCGACGGTGGATCATCTGCTATTACTAGTAACAACATTTGGGGCCAAGGAACTCTGGTCACCGTTTCTTCAGGCGGTGGAGGGTCCGGAGGTGGTGGCTCCCAGTCGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCTCCTTCAGTAGCAACTACTGGATATGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGCATGCATTTATGTTGGTAGTAGTGGTGACACTTACTACGCGAGCTCCGCGAAAGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAGAGATAGTAGTAGTTATTATATGTTTAACTTGTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGCGGGGGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCGCGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTATACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCTTAAGCCTGTCTCCGGGTGGCGGTGGAGGGTCCGGCGGTGGTGGATCCGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCTCCTTCAGTAGCGGGTACGACATGTGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGCATGCATTGCTGCTGGTAGTGCTGGTATCACTTACGACGCGAACTGGGCGAAAGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAGATCGGCGTTTTCGTTCGACTACGCCATGGACCTCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGGTGGAGGCGGATCTGGCGGAGGTGGTTCCGGCGGTGGCGGCTCCGGTGGAGGCGGCTCTGACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTAGTTCCCACTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATAAGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTTACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTATTACTGCCAACAGGGTTATAGTTGGGGTAATGTTGATAATGTTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA

>SEQ ID:38 SI-38E34 (21D4-LH-scFv x 284A10-L1H1-scFv x 420H5-Fab x PL221G5-H1L1-scFv) тяжелая цепь аминокислотная последовательность

AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSALAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYPFTFGPGTKVDIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFSSSWIGWVRQAPGKGLEWMGIIYPDDSDTRYSPSFQGQVTISADKSIRTAYLQWSSLKASDTAMYYCARHVTMIWGVIIDFWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSDVVMTQSPSTLSASVGDRVTINCQASESISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYEASKLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQGYFYFISRTYVNSFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTISTNAMSWVRQAPGKGLEWIGVITGRDITYYASWAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGGSSAITSNNIWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSQSLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSSNYWICWVRQAPGKGLEWIACIYVGSSGDTYYASSAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDSSSYYMFNLWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSSGYDMCWVRQAPGKGLEWIACIAAGSAGITYDANWAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSAFSFDYAMDLWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQSISSHLNWYQQKPGKAPKLLIYKASTLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGYSWGNVDNVFGGGTKVEIK

>SEQ ID:39 SI-38E34 (21D4-LH-scFv x 284A10-L1H1-scFv x 420H5-Fab x PL221G5-H1L1-scFv) легкая цепь нуклеотидная последовательность

GCCCTTGTGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCAATTGCCAGGCCAGTGAGGACATTGATACCTATTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTTTTATGCATCCGATCTGGCATCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTATTACTGCCAAGGCGGTTACTATACTAGTAGTGCTGATACGAGGGGTGCTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT

>SEQ ID:40 SI-38E34 (21D4-LH-scFv x 284A10-L1H1-scFv x 420H5-Fab x PL221G5-H1L1-scFv) легкая цепь аминокислотная последовательность

ALVMTQSPSTLSASVGDRVTINCQASEDIDTYLAWYQQKPGKAPKLLIFYASDLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQGGYYTSSADTRGAFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

--->

Список последовательностей

<110> SYSTIMMUNE, INC.

SICHUAN BAILI PHARMACEUTICAL CO. LTD.

<120> МУЛЬТИСПЕЦИФИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА И СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ И

ПРИМЕНЕНИЯ

<130> SIBA036PCT

<140> PCT/US2018/039157

<141> 2018-06-22

<150> US62524558

<151> 2017-06-25

<160> 40

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 360

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтезированная

<400> 1

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc

60

tcctgtgcag cctctggatt caccatcagt accaatgcaa tgagctgggt ccgccaggct

120

ccagggaagg ggctggagtg gatcggagtc attactggtc gtgatatcac atactacgcg

180

agctgggcga aaggcagatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctt

240

caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgcg cgacggtgga

300

tcatctgcta ttactagtaa caacatttgg ggccaaggaa ctctggtcac cgtttcttca

360

<210> 2

<211> 120

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтезированная

<400> 2

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Thr Asn

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Val Ile Thr Gly Arg Asp Ile Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Asp Gly Gly Ser Ser Ala Ile Thr Ser Asn Asn Ile Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 3

<211> 336

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтезированная

<400> 3

gacgtcgtga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc

60

atcaattgcc aagccagtga gagcattagc agttggttag cctggtatca gcagaaacca

120

gggaaagccc ctaagctcct gatctatgaa gcatccaaac tggcatctgg ggtcccatca

180

aggttcagcg gcagtggatc tgggacagag ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct

240

gatgattttg caacttatta ctgccaaggc tatttttatt ttattagtcg tacttatgta

300

aattctttcg gcggagggac caaggtggag atcaaa

336

<210> 4

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтезированная

<400> 4

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Ser Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Glu Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Tyr Phe Tyr Phe Ile Ser

85 90 95

Arg Thr Tyr Val Asn Ser Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 5

<211> 375

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтезированная

<400> 5

caggtgcaat tggtggaaag cggaggggga ctggtgcagc ccgggggaag tctgaagctg

60

tcctgtgccg ccagcggctt taccttcaac aagtacgcca tgaattgggt ccgacaggcc

120

ccagggaaag gcctggaatg ggtggcacgg attcggtcca agtacaacaa ctacgccacc

180

tactacgctg actccgtgaa ggacagattc accatcagcc gggacgactc taagaacacc

240

gcctatctgc agatgaacaa cctgaaaacc gaggatacag ctgtgtacta ttgtgtgcgg

300

cacggcaact tcggcaactc ctacatctcc tactgggcct attggggaca gggaacactg

360

gtcaccgtgt ctagc

375

<210> 6

<211> 125

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтезированная

<400> 6

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp

100 105 110

Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 7

<211> 333

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтезированная

<400> 7

cagaccgtgg tcacccagga accttccctg accgtctccc caggcggcac cgtgaccctg

60

acctgtggct cctctaccgg cgctgtgacc tccggcaact accctaactg ggtgcagcag

120

aaacccggac aggctcctag aggcctgatc ggcggcacca agtttctggc ccctggcacc

180

cctgccagat tctccggctc cctgctggga ggcaaggccg ctctgaccct gtctggcgtg

240

cagcctgagg acgaggccga gtactactgt gtgctgtggt actccaacag atgggtgttc

300

ggaggcggca caaagctgac cgtgctgtcc tcg

333

<210> 8

<211> 111

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтезированная

<400> 8

Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly

20 25 30

Asn Tyr Pro Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly

35 40 45

Leu Ile Gly Gly Thr Lys Phe Leu Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val

65 70 75 80

Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn

85 90 95

Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Ser

100 105 110

<210> 9

<211> 366

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтезированная

<400> 9

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc

60

tcctgtgcag cctctggatt ctccttcagt agcgggtacg acatgtgctg ggtccgccag

120

gctccaggga aggggctgga gtggatcgca tgcattgctg ctggtagtgc tggtatcact

180

tacgacgcga actgggcgaa aggccggttc accatctcca gagacaattc caagaacacg

240

ctgtatctgc aaatgaacag cctgagagcc gaggacacgg ccgtatatta ctgtgcgaga

300

tcggcgtttt cgttcgacta cgccatggac ctctggggcc agggaaccct ggtcaccgtc

360

tcgagc

366

<210> 10

<211> 122

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтезированная

<400> 10

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Gly

20 25 30

Tyr Asp Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Ala Cys Ile Ala Ala Gly Ser Ala Gly Ile Thr Tyr Asp Ala Asn

50 55 60

Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Ser Ala Phe Ser Phe Asp Tyr Ala Met Asp Leu Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 11

<211> 330

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтезированная

<400> 11

gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc

60

atcacttgcc aggccagtca gagcattagt tcccacttaa actggtatca gcagaaacca

120

gggaaagccc ctaagctcct gatctataag gcatccactc tggcatctgg ggtcccatca

180

aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa tttactctca ccatcagcag cctgcagcct

240

gatgattttg caacttatta ctgccaacag ggttatagtt ggggtaatgt tgataatgtt

300

ttcggcggag ggaccaaggt ggagatcaaa

330

<210> 12

<211> 110

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтезированная

<400> 12

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser His

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Ser Trp Gly Asn

85 90 95

Val Asp Asn Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 13

<211> 360

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтезированная

<400> 13

cagtcgctgg tggagtctgg gggaggcttg gtacagcctg gggggtccct gagactctcc

60

tgtgcagcct ctggattctc cttcagtagc aactactgga tatgctgggt ccgccaggct

120

ccagggaagg ggctggagtg gatcgcatgc atttatgttg gtagtagtgg tgacacttac

180

tacgcgagct ccgcgaaagg ccggttcacc atctccagag acaattccaa gaacacgctg

240

tatctgcaaa tgaacagcct gagagccgag gacacggccg tatattactg tgcgagagat

300

agtagtagtt attatatgtt taacttgtgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcgagc

360

<210> 14

<211> 120

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтезированная

<400> 14

Gln Ser Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser

1 5 10 15

Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Asn Tyr

20 25 30

Trp Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Ala Cys Ile Tyr Val Gly Ser Ser Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Ser Ser

50 55 60

Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu

65 70 75 80

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Asp Ser Ser Ser Tyr Tyr Met Phe Asn Leu Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 15

<211> 336

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтезированная

<400> 15

gcccttgtga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc

60

atcaattgcc aggccagtga ggacattgat acctatttag cctggtatca gcagaaacca

120

gggaaagccc ctaagctcct gatcttttat gcatccgatc tggcatctgg ggtcccatca

180

aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct

240

gatgattttg caacttatta ctgccaaggc ggttactata ctagtagtgc tgatacgagg

300

ggtgctttcg gcggagggac caaggtggag atcaaa

336

<210> 16

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтезированная

<400> 16

Ala Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Glu Asp Ile Asp Thr Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Phe Tyr Ala Ser Asp Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Gly Tyr Tyr Thr Ser Ser

85 90 95

Ala Asp Thr Arg Gly Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 17

<211> 345

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтезированная

<400> 17

cggtcgctgg tggagtctgg gggaggcttg gtccagcctg gggggtccct gagactctcc

60

tgtacagcct ctggattcac catcagtagc taccacatgc agtgggtccg ccaggctcca

120

gggaaggggc tggagtacat cggaaccatt agtagtggtg gtaatgtata ctacgcgagc

180

tccgcgagag gcagattcac catctccaga ccctcgtcca agaacacggt ggatcttcaa

240

atgaacagcc tgagagccga ggacacggct gtgtattact gtgcgagaga ctctggttat

300

agtgatccta tgtggggcca gggaaccctg gtcaccgtct cgagc

345

<210> 18

<211> 115

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтезированная

<400> 18

Arg Ser Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser

1 5 10 15

Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Ser Tyr His

20 25 30

Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Gly

35 40 45

Thr Ile Ser Ser Gly Gly Asn Val Tyr Tyr Ala Ser Ser Ala Arg Gly

50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Pro Ser Ser Lys Asn Thr Val Asp Leu Gln

65 70 75 80

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

85 90 95

Asp Ser Gly Tyr Ser Asp Pro Met Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 19

<211> 333

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтезированная

<400> 19

gacgttgtga tgacccagtc tccatcttcc gtgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc

60

atcacctgtc aggccagtca gaacattagg acttacttat cctggtatca gcagaaacca

120

gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcagccaatc tggcatctgg ggtcccatca

180

aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcga cctggagcct

240

ggcgatgctg caacttacta ttgtcagtct acctatcttg gtactgatta tgttggcggt

300

gctttcggcg gagggaccaa ggtggagatc aaa

333

<210> 20

<211> 111

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтезированная

<400> 20

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asn Ile Arg Thr Tyr

20 25 30

Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ala Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Pro

65 70 75 80

Gly Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Thr Tyr Leu Gly Thr Asp

85 90 95

Tyr Val Gly Gly Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 21

<211> 345

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтезированная

<400> 21

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc

60

tcctgtgcag cctctggaat cgacttcagt aggagatact acatgtgctg ggtccgccag

120

gctccaggga aggggctgga gtggatcgca tgcatatata ctggtagccg cgatactcct

180

cactacgcga gctccgcgaa aggccggttc accatctcca gagacaattc caagaacacg

240

ctgtatctgc aaatgaacag cctgagagcc gaggacacgg ccgtatatta ctgtgcgaga

300

gaaggtagcc tgtggggcca gggaaccctg gtcaccgtct cgagc

345

<210> 22

<211> 115

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтезированная

<400> 22

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Asp Phe Ser Arg Arg

20 25 30

Tyr Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Ala Cys Ile Tyr Thr Gly Ser Arg Asp Thr Pro His Tyr Ala Ser

50 55 60

Ser Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Ser Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 23

<211> 333

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтезированная

<400> 23

gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc

60

atcacttgcc agtccagtca gagtgtttat agtaactggt tctcctggta tcagcagaaa

120

ccagggaaag cccctaagct cctgatctat tctgcatcca ctctggcatc tggggtccca

180

tcaaggttca gcggcagtgg atctgggaca gaattcactc tcaccatcag cagcctgcag

240

cctgatgatt ttgcaactta ttactgcgca ggcggttaca atactgttat tgatactttt

300

gctttcggcg gagggaccaa ggtggagatc aaa

333

<210> 24

<211> 111

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтезированная

<400> 24

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Tyr Ser Asn

20 25 30

Trp Phe Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

65 70 75 80

Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Gly Tyr Asn Thr Val

85 90 95

Ile Asp Thr Phe Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 25

<211> 363

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтезированная

<400> 25

gaggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaagaaac caggagagtc tctgaagatc

60

tcctgtaagg gttctggata cagctttagc agttcatgga tcggctgggt gcgccaggca

120

cctgggaaag gcctggaatg gatggggatc atctatcctg atgactctga taccagatac

180

agtccatcct tccaaggcca ggtcaccatc tcagccgaca agtccatcag gactgcctac

240

ctgcagtgga gtagcctgaa ggcctcggac accgctatgt attactgtgc gagacatgtt

300

actatgattt ggggagttat tattgacttc tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc

360

tca

363

<210> 26

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтезированная

<400> 26

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Ser Ser

20 25 30

Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Tyr Pro Asp Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe

50 55 60

Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Arg Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg His Val Thr Met Ile Trp Gly Val Ile Ile Asp Phe Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 27

<211> 321

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтезированная

<400> 27

gccatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc

60

atcacttgcc gggcaagtca gggcattagc agtgctttag cctggtatca gcagaaacca

120

gggaaagctc ctaagctcct gatctatgat gcctccagtt tggaaagtgg ggtcccatca

180

aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct

240

gaagattttg caacttatta ctgtcaacag tttaatagtt acccattcac tttcggccct

300

gggaccaaag tggatatcaa a

321

<210> 28

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтезированная

<400> 28

Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys

100 105

<210> 29

<211> 372

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтезированная

<400> 29

caggtccaac tccagcagtc tggggctgag ctggtgaggc ctgggtcctc agtgaagatt

60

tcctgcaagg cttctggcta tgccttcagt agctactgga tgaactgggt gaagcagagg

120

cctggacagg gtcttgagtg gattggacag atttggcctg gagatggtga tactaactac

180

aatggaaagt tcaaggggaa agccactctg actgcagacg aatcctccag cacagcctac

240

atgcaactca gcagcctagc atctgaggac tctgcggtct atttctgtgc aagacgggag

300

actacgacgg taggccgtta ttactatgct atggactact ggggccaagg gaccacggtc

360

accgtctcct cc

372

<210> 30

<211> 124

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтезированная

<400> 30

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 31

<211> 333

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтезированная

<400> 31

gatatccagc tgacccagtc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc

60

atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggtg tgagttactt gaactggtat

120

caacagattc caggacagcc acccaaactc ctcatctatg atgcttccaa tctagtttct

180

gggatcccac ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat

240

cctgtggaga aggtggatgc tgcaacctat cactgtcagc aaagtactga ggatccgtgg

300

acgttcggtg gagggaccaa gctcgagatt aaa

333

<210> 32

<211> 111

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтезированная

<400> 32

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp

20 25 30

Gly Val Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Ile Pro Pro

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln Ser Thr

85 90 95

Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 33

<211> 987

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтезированная

<400> 33

gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg

60

ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg

120

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca

180

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc

240

tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagccc

300

aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaagc cgcgggggca

360

ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct

420

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg

480

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac

540

agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag

600

gagtacaagt gcgcggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc

660

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag

720

ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc

780

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg

840

ctggactccg acggctcctt cttcctctat agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg

900

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg

960

cagaagagcc tctccctgtc tccgggt

987

<210> 34

<211> 329

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтезированная

<400> 34

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Ala Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

325

<210> 35

<211> 321

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтезированная

<400> 35

cgtacggtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct

60

ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag

120

tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac

180

agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag

240

aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag

300

agcttcaaca ggggagagtg t

321

<210> 36

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтезированная

<400> 36

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 37

<211> 3693

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтезированная

<400> 37

gccatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc

60

atcacttgcc gggcaagtca gggcattagc agtgctttag cctggtatca gcagaaacca

120

gggaaagctc ctaagctcct gatctatgat gcctccagtt tggaaagtgg ggtcccatca

180

aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct

240

gaagattttg caacttatta ctgtcaacag tttaatagtt acccattcac tttcggccct

300

gggaccaaag tggatatcaa aggcggtggc ggtagtgggg gaggcggttc tggcggcgga

360

gggtccggcg gtggaggatc agaggtgcag ctggtgcagt ctggagcaga ggtgaagaaa

420

ccaggagagt ctctgaagat ctcctgtaag ggttctggat acagctttag cagttcatgg

480

atcggctggg tgcgccaggc acctgggaaa ggcctggaat ggatggggat catctatcct

540

gatgactctg ataccagata cagtccatcc ttccaaggcc aggtcaccat ctcagccgac

600

aagtccatca ggactgccta cctgcagtgg agtagcctga aggcctcgga caccgctatg

660

tattactgtg cgagacatgt tactatgatt tggggagtta ttattgactt ctggggccag

720

ggaaccctgg tcaccgtctc ctcaggcggt ggagggtccg gcggtggtgg atccgacgtc

780

gtgatgaccc agtctccttc caccctgtct gcatctgtag gagacagagt caccatcaat

840

tgccaagcca gtgagagcat tagcagttgg ttagcctggt atcagcagaa accagggaaa

900

gcccctaagc tcctgatcta tgaagcatcc aaactggcat ctggggtccc atcaaggttc

960

agcggcagtg gatctgggac agagttcact ctcaccatca gcagcctgca gcctgatgat

1020

tttgcaactt attactgcca aggctatttt tattttatta gtcgtactta tgtaaattct

1080

ttcggcggag ggaccaaggt ggagatcaaa ggcggtggcg gtagtggggg aggcggttct

1140

ggcggcggag ggtccggcgg tggaggatca gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc

1200

ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc tcctgtgcag cctctggatt caccatcagt

1260

accaatgcaa tgagctgggt ccgccaggct ccagggaagg ggctggagtg gatcggagtc

1320

attactggtc gtgatatcac atactacgcg agctgggcga aaggcagatt caccatctcc

1380

agagacaatt ccaagaacac gctgtatctt caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg

1440

gctgtgtatt actgtgcgcg cgacggtgga tcatctgcta ttactagtaa caacatttgg

1500

ggccaaggaa ctctggtcac cgtttcttca ggcggtggag ggtccggagg tggtggctcc

1560

cagtcgctgg tggagtctgg gggaggcttg gtacagcctg gggggtccct gagactctcc

1620

tgtgcagcct ctggattctc cttcagtagc aactactgga tatgctgggt ccgccaggct

1680

ccagggaagg ggctggagtg gatcgcatgc atttatgttg gtagtagtgg tgacacttac

1740

tacgcgagct ccgcgaaagg ccggttcacc atctccagag acaattccaa gaacacgctg

1800

tatctgcaaa tgaacagcct gagagccgag gacacggccg tatattactg tgcgagagat

1860

agtagtagtt attatatgtt taacttgtgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcgagc

1920

gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg

1980

ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg

2040

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca

2100

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc

2160

tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagccc

2220

aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaagc cgcgggggca

2280

ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct

2340

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg

2400

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac

2460

agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag

2520

gagtacaagt gcgcggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc

2580

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtataccc tgcccccatc ccgggatgag

2640

ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc

2700

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg

2760

ctggactccg acggctcctt cttcctctat agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg

2820

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg

2880

cagaagagct taagcctgtc tccgggtggc ggtggagggt ccggcggtgg tggatccgag

2940

gtgcagctgt tggagtctgg gggaggcttg gtacagcctg gggggtccct gagactctcc

3000

tgtgcagcct ctggattctc cttcagtagc gggtacgaca tgtgctgggt ccgccaggct

3060

ccagggaagg ggctggagtg gatcgcatgc attgctgctg gtagtgctgg tatcacttac

3120

gacgcgaact gggcgaaagg ccggttcacc atctccagag acaattccaa gaacacgctg

3180

tatctgcaaa tgaacagcct gagagccgag gacacggccg tatattactg tgcgagatcg

3240

gcgttttcgt tcgactacgc catggacctc tggggccagg gaaccctggt caccgtctcg

3300

agcggtggag gcggatctgg cggaggtggt tccggcggtg gcggctccgg tggaggcggc

3360

tctgacatcc agatgaccca gtctccttcc accctgtctg catctgtagg agacagagtc

3420

accatcactt gccaggccag tcagagcatt agttcccact taaactggta tcagcagaaa

3480

ccagggaaag cccctaagct cctgatctat aaggcatcca ctctggcatc tggggtccca

3540

tcaaggttca gcggcagtgg atctgggaca gaatttactc tcaccatcag cagcctgcag

3600

cctgatgatt ttgcaactta ttactgccaa cagggttata gttggggtaa tgttgataat

3660

gttttcggcg gagggaccaa ggtggagatc aaa

3693

<210> 38

<211> 1231

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтезированная

<400> 38

Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu

115 120 125

Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser

130 135 140

Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Ser Ser Trp

145 150 155 160

Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly

165 170 175

Ile Ile Tyr Pro Asp Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln

180 185 190

Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Arg Thr Ala Tyr Leu

195 200 205

Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala

210 215 220

Arg His Val Thr Met Ile Trp Gly Val Ile Ile Asp Phe Trp Gly Gln

225 230 235 240

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

245 250 255

Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser

260 265 270

Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Ser

275 280 285

Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

290 295 300

Leu Ile Tyr Glu Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe

305 310 315 320

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu

325 330 335

Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Tyr Phe Tyr Phe

340 345 350

Ile Ser Arg Thr Tyr Val Asn Ser Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu

355 360 365

Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

370 375 380

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

385 390 395 400

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

405 410 415

Phe Thr Ile Ser Thr Asn Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

420 425 430

Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile Thr Gly Arg Asp Ile Thr Tyr

435 440 445

Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser

450 455 460

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr

465 470 475 480

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Gly Ser Ser Ala Ile Thr Ser

485 490 495

Asn Asn Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly

500 505 510

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Leu Val Glu Ser Gly Gly

515 520 525

Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

530 535 540

Gly Phe Ser Phe Ser Ser Asn Tyr Trp Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala

545 550 555 560

Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Ala Cys Ile Tyr Val Gly Ser Ser

565 570 575

Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Ser Ser Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser

580 585 590

Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg

595 600 605

Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Ser Ser Tyr

610 615 620

Tyr Met Phe Asn Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

625 630 635 640

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

645 650 655

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

660 665 670

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

675 680 685

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

690 695 700

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

705 710 715 720

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

725 730 735

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

740 745 750

Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

755 760 765

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

770 775 780

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

785 790 795 800

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

805 810 815

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

820 825 830

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Ala Val Ser Asn

835 840 845

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

850 855 860

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

865 870 875 880

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

885 890 895

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

900 905 910

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

915 920 925

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

930 935 940

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

945 950 955 960

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

965 970 975

Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

980 985 990

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe

995 1000 1005

Ser Ser Gly Tyr Asp Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys

1010 1015 1020

Gly Leu Glu Trp Ile Ala Cys Ile Ala Ala Gly Ser Ala Gly Ile

1025 1030 1035

Thr Tyr Asp Ala Asn Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg

1040 1045 1050

Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg

1055 1060 1065

Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Ala Phe Ser

1070 1075 1080

Phe Asp Tyr Ala Met Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

1085 1090 1095

Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

1100 1105 1110

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser

1115 1120 1125

Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr

1130 1135 1140

Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser His Leu Asn Trp Tyr Gln

1145 1150 1155

Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser

1160 1165 1170

Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser

1175 1180 1185

Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp

1190 1195 1200

Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Ser Trp Gly Asn Val

1205 1210 1215

Asp Asn Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

1220 1225 1230

<210> 39

<211> 657

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтезированная

<400> 39

gcccttgtga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc

60

atcaattgcc aggccagtga ggacattgat acctatttag cctggtatca gcagaaacca

120

gggaaagccc ctaagctcct gatcttttat gcatccgatc tggcatctgg ggtcccatca

180

aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct

240

gatgattttg caacttatta ctgccaaggc ggttactata ctagtagtgc tgatacgagg

300

ggtgctttcg gcggagggac caaggtggag atcaaacgta cggtggctgc accatctgtc

360

ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg

420

ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa

480

tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc

540

agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa

600

gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgt

657

<210> 40

<211> 219

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтезированная

<400> 40

Ala Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Glu Asp Ile Asp Thr Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Phe Tyr Ala Ser Asp Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Gly Tyr Tyr Thr Ser Ser

85 90 95

Ala Asp Thr Arg Gly Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<---

Claims (27)

1. Тетраспецифический мономер антитела, связывающийся с CD19, CD3, 4-1BB и PD-L1, имеющий N-конец и С-конец, включающий последовательно расположенные от N-конца к С-концу:

первый домен scFv на N-конце,

второй домен scFv,

домен Fab,

домен Fc и

третий домен scFv на С-конце,

где первый домен scFv, второй домен scFv, домен Fab и третий домен scFv, каждый, обладает специфичностью связывания с отличным антигеном и где первый домен scFv, второй домен scFv, домен Fab и третий домен scFv, каждый, независимо обладает специфичностью связывания с антигеном, выбранным из CD19, CD3, 4-1BB и PD-L1.

2. Тетраспецифический мономер антитела по п.1, где первый домен scFv обладает специфичностью связывания с CD19.

3. Тетраспецифический мономер антитела по п.1, где второй домен scFv обладает специфичностью связывания с CD3.

4. Тетраспецифический мономер антитела по п.1, где домен Fab обладает специфичностью связывания с 4-1BB.

5. Тетраспецифический мономер антитела по п.1, где третий домен scFv обладает специфичностью связывания с PD-L1.

6. Тетраспецифический мономер антитела по п.1, где первый домен scFv обладает специфичностью связывания с CD19, где второй домен scFv обладает специфичностью связывания с CD3, где домен Fab обладает специфичностью связывания с 4-1BB и где третий домен scFv обладает специфичностью связывания с PD-L1.

7. Тетраспецифический мономер антитела по п.1, где первый домен scFv, второй домен scFv или третий домен scFv содержит линкер gly-gly-gly-gly-ser(G4S)n, где n равно 2, 3 или 4.

8. Тетраспецифический мономер антитела по п.1, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую процентную гомологию с SEQ ID NO: 38 или 40, где процентная гомология составляет не менее 98%.

9. Тетраспецифический мономер антитела по п.1, отличающийся тем, что мономер тетраспецифического антитела содержит домен scFv, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую процент гомологии с SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 26, 28, 30 или 32, где процент гомологии составляет не менее 98%.

10. Тетраспецифический мономер антитела по п.1, отличающийся тем, что мономер тетраспецифического антитела содержит Fab-домен, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую процент гомологии с SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 26, 28, 30 или 32, где процент гомологии составляет не менее 90%.

11. Тетраспецифический мономер антитела по п.1, где мономер содержит: (i) 3 определяющих комплементарность участка (CDR) SEQ ID NO: 26 и 3 CDR SEQ ID NO: 28; (ii) 3 CDR SEQ ID NO: 2 и 3 CDR SEQ ID NO: 4; (iii) 3 CDR SEQ ID NO: 14 и 3 CDR SEQ ID NO: 16 и/или (iv) 3 CDR SEQ ID NO: 10 и 3 CDR SEQ ID NO: 12.

12. Тетраспецифический мономер антитела по п.11, где мономер содержит: (i) 3 определяющих комплементарность участка (CDR) SEQ ID NO: 26 и 3 CDR SEQ ID NO: 28; (ii) 3 CDR SEQ ID NO: 2 и 3 CDR SEQ ID NO: 4; (iii) 3 CDR SEQ ID NO: 14 и 3 CDR SEQ ID NO: 16 и (iv) 3 CDR SEQ ID NO: 10 и 3 CDR SEQ ID NO: 12.

13. Тетраспецифическое антитело, связывающееся с CD19, CD3, 4-1BB и PD-L1, содержащее тетраспецифический мономер антитела по п.11 или 12.

14. Тетраспецифическое антитело, связывающееся с CD19, CD3, 4-1BB и PD-L1, содержащее тетраспецифический мономер антитела по п.1, где тетраспецифическое антитело содержит аминокислотную последовательность, имеющую 98% гомологию с SEQ ID NO: 38, и аминокислотную последовательность, имеющую 98% гомологию с SEQ ID NO: 40.

15. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая тетраспецифическое антитело по п.14.

16. Вектор экспрессии, содержащий выделенную последовательность нуклеиновой кислоты по п.15.

17. Клетка-хозяин, экспрессирующая тетраспецифическое антитело по п.14, содержащая выделенную последовательность нуклеиновой кислоты по п.15, где клетка-хозяин является прокариотической клеткой или эукариотической клеткой.

18. Способ получения тетраспецифического антитела, включающий культивирование клетки-хозяина по п.17, так что экспрессируется тетраспецифическое антитело по п.14, и очистку указанного тетраспецифического антитела.

19. Фармацевтическая композиция для лечения рака, связанного с CD19, CD3, 4-1BB и PD-L1, у человека, содержащая фармацевтически приемлемый носитель и тетраспецифическое антитело по п.13 или 14 в эффективном количестве.

20. Применение тетраспецифического антитела по п.13 или 14 в производстве лекарственного средства для лечения рака, связанного с CD19, CD3, 4-1BB и PD-L1, у человека, где субъекту вводят эффективное количество указанного тетраспецифического антитела.

21. Применение тетраспецифического антитела по п.13 или 14 и эффективного количества терапевтического агента для комбинированной терапии для лечения рака, связанного с CD19, CD3, 4-1BB и PD-L1, у человека, где эффективное количество терапевтического агента должно быть совместно введено и где терапевтическое средство содержит антитело, химиотерапевтическое средство, фермент, антиэстрогенное средство, ингибитор рецепторной тирозинкиназы, ингибитор киназы, ингибитор клеточного цикла, ингибитор контрольной точки, ингибитор синтеза ДНК, РНК или белка, ингибитор RAS, ингибитор PD1, PD-L1, CTLA4, 4-1BB, OX40, GITR, ICOS, LIGHT, TIM3, LAG3, TIGIT, CD40, CD27, HVEM, BTLA, VISTA, B7H4, CSF1R, NKG2D, CD73, CD3, CD19 или их комбинация.

Images