RU2809520C1 - Method for introducing under the skin of cultivated fish of the salmon family optical microsensors based on microparticles with fluorescent indicator dyes - Google Patents
Method for introducing under the skin of cultivated fish of the salmon family optical microsensors based on microparticles with fluorescent indicator dyes Download PDFInfo
- Publication number
- RU2809520C1 RU2809520C1 RU2022117932A RU2022117932A RU2809520C1 RU 2809520 C1 RU2809520 C1 RU 2809520C1 RU 2022117932 A RU2022117932 A RU 2022117932A RU 2022117932 A RU2022117932 A RU 2022117932A RU 2809520 C1 RU2809520 C1 RU 2809520C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- fish
- skin
- microparticles
- fin
- fluorescent
- Prior art date
Links
- 235000019688 fish Nutrition 0.000 title claims abstract description 58
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 title claims abstract description 55
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 title claims abstract description 30
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 title claims abstract description 21
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 title claims abstract description 17
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 title claims description 9
- 239000000975 dye Substances 0.000 title claims description 6
- 239000003269 fluorescent indicator Substances 0.000 title claims description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims abstract description 32
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims abstract description 32
- 239000000499 gel Substances 0.000 claims abstract description 26
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 claims abstract description 13
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 claims abstract description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 7
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 3
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 abstract description 4
- 238000009372 pisciculture Methods 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 38
- -1 poly(2-hydroxyethyl methacrylate) Polymers 0.000 description 18
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 17
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 17
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 16
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 12
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 9
- 241000277331 Salmonidae Species 0.000 description 8
- 238000009360 aquaculture Methods 0.000 description 8
- 244000144974 aquaculture Species 0.000 description 8
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 8
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 8
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 7
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 7
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 7
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 7
- 238000012552 review Methods 0.000 description 7
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 6
- 241000277275 Oncorhynchus mykiss Species 0.000 description 6
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 241000252212 Danio rerio Species 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 4
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 4
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 4
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 125000004386 diacrylate group Chemical group 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 229920001971 elastomer Polymers 0.000 description 3
- 239000000806 elastomer Substances 0.000 description 3
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 230000000472 traumatic effect Effects 0.000 description 3
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000252229 Carassius auratus Species 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 241000238424 Crustacea Species 0.000 description 2
- 241000252233 Cyprinus carpio Species 0.000 description 2
- 241001510141 Eulimnogammarus verrucosus Species 0.000 description 2
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 2
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 2
- 229920002518 Polyallylamine hydrochloride Polymers 0.000 description 2
- 241000251125 Prionace glauca Species 0.000 description 2
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 2
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N ammonium persulfate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-]S(=O)(=O)OOS([O-])(=O)=O ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003416 augmentation Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 2
- 208000010824 fish disease Diseases 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 2
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000007489 histopathology method Methods 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 2
- 239000000644 isotonic solution Substances 0.000 description 2
- 230000000366 juvenile effect Effects 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 2
- 238000007726 management method Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 2
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 229920001464 poly(sodium 4-styrenesulfonate) Polymers 0.000 description 2
- 229920000867 polyelectrolyte Polymers 0.000 description 2
- 241001507086 salmonid fish Species 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UWTATZPHSA-M (R)-lactate Chemical compound C[C@@H](O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UWTATZPHSA-M 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000239241 Amphipoda Species 0.000 description 1
- 229920001823 Aquamid® Polymers 0.000 description 1
- 241001264766 Callistemon Species 0.000 description 1
- 241000270609 Caretta caretta Species 0.000 description 1
- 241000270617 Cheloniidae Species 0.000 description 1
- 244000163122 Curcuma domestica Species 0.000 description 1
- 235000003392 Curcuma domestica Nutrition 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N D-Lyxoflavin Natural products OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 241000402754 Erythranthe moschata Species 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine Chemical compound CN(C)CCN(C)C KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000277338 Oncorhynchus kisutch Species 0.000 description 1
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 1
- 206010034972 Photosensitivity reaction Diseases 0.000 description 1
- 241000251135 Scyliorhinidae Species 0.000 description 1
- 241000972004 Scyliorhinus stellaris Species 0.000 description 1
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 229910001870 ammonium persulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000036770 blood supply Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 235000010216 calcium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000010634 clove oil Substances 0.000 description 1
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 1
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000000599 controlled substance Substances 0.000 description 1
- 238000002316 cosmetic surgery Methods 0.000 description 1
- 235000003373 curcuma longa Nutrition 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000000378 dietary effect Effects 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 230000009969 flowable effect Effects 0.000 description 1
- 108010006205 fluorescein isothiocyanate bovine serum albumin Proteins 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 244000144980 herd Species 0.000 description 1
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 1
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 230000000622 irritating effect Effects 0.000 description 1
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 230000000116 mitigating effect Effects 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N n,n'-methylenebisacrylamide Chemical compound C=CC(=O)NCNC(=O)C=C ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 230000037311 normal skin Effects 0.000 description 1
- 238000006213 oxygenation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 1
- 210000000006 pectoral fin Anatomy 0.000 description 1
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000005220 pharmaceutical analysis Methods 0.000 description 1
- 208000007578 phototoxic dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000018 phototoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920002338 polyhydroxyethylmethacrylate Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 239000006041 probiotic Substances 0.000 description 1
- 235000018291 probiotics Nutrition 0.000 description 1
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000002278 reconstructive surgery Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 1
- 235000019192 riboflavin Nutrition 0.000 description 1
- 239000002151 riboflavin Substances 0.000 description 1
- 229960002477 riboflavin Drugs 0.000 description 1
- 235000015170 shellfish Nutrition 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 210000003625 skull Anatomy 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000002834 transmittance Methods 0.000 description 1
- 235000013976 turmeric Nutrition 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000007631 vascular surgery Methods 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
Abstract
Description
Изобретение относится к рыбоводству, а именно к отслеживанию и долговременной неинвазивной регистрации различных физиологических параметров организма культивируемых рыб путем введения оптических микросенсоров на основе микрочастиц (микронного размера) с флуоресцентными индикаторными красителями под кожу рыб. Способ может быть применен при искусственном разведении рыбы на рыбных фермах с целью предотвращения заболеваемости рыб.The invention relates to fish farming, namely to tracking and long-term non-invasive recording of various physiological parameters of the body of cultured fish by introducing optical microsensors based on microparticles (micron size) with fluorescent indicator dyes under the skin of fish. The method can be used for artificial breeding of fish on fish farms in order to prevent fish diseases.
Различные имплантируемые оптические микродатчики являются одним из новых инструментов, которые могут обеспечить постоянный мониторинг различных внутренних физиологических параметров организма в режиме реального времени. Использование имплантируемых микродатчиков открывает новые горизонты контроля здоровья не только в медицине, но и в животноводстве, в том числе в аквакультуре. Большинство имплантируемых датчиков содержат электронные компоненты [Bian, S.; Zhu, В.; Rong, G.; Sawan, M. Towards wearable and implantable continuous drug monitoring: A review. Journal of Pharmaceutical Analysis 2021, 11(1), p.1-14; Singh, R.; Bathaei, M.J.; Istif, E.; Beker, L. A Review of Bioresorbable Implantable Medical Devices: Materials, Fabrication, and Implementation. Advanced Healthcare Materials 2020, 9(18), 2000790; Sonmezoglu, S; Fineman, J.R.; Maltepe, E.; Maharbiz, M.M. Monitoring deep-tissue oxygenation with a millimeter-scale ultrasonic implant. Nature Biotechnology 2021, 39, p.855-864], но они, как правило, имеют крупные размеры и сложны в производстве. В предлагаемом изобретении речь идет о более совершенном способе имплантации микродатчиков на основе микрочастиц (микронного размера - размером порядка 1-100 микрон), содержащих флуоресцентные красители, изменяющие свои оптические характеристики в ответ на изменение параметров окружающей среды, в данном случае - внутренней среды организма, иначе говоря, состава жидкостей организма [Rong, G.; Turtle, Е.Е.; Neal Reilly, A.; Clark, H.A. Recent developments in nanosensors for imaging applications in biological systems. Annual Review of Analytical Chemistry 2019, 12, p.109-128; Kaefer, K. et al. Implantable Sensors Based on Gold Nanoparticles for Continuous Long-Term Concentration Monitoring in the Body. Nano Letters 2021, 21(7), p. 3325-3330; Gurkov, A.; Shchapova, E.; Bedulina, D.; Baduev, В.; Borvinskaya, E.; Meglinski, I.; Timofeyev, M. Remote in vivo stress assessment of aquatic animals with microencapsulated biomarkers for environmental monitoring. Scientific Reports 2016, 6(1), p. 1-8]. Изготовление такого сенсора относительно просто и может быть выполнено в большинстве биохимических лабораторий.Various implantable optical microsensors are one of the new tools that can provide continuous monitoring of various internal physiological parameters of the body in real time. The use of implantable microsensors opens up new horizons for health monitoring not only in medicine, but also in animal husbandry, including aquaculture. Most implantable sensors contain electronic components [Bian, S.; Zhu, W.; Rong, G.; Sawan, M. Towards wearable and implantable continuous drug monitoring: A review. Journal of Pharmaceutical Analysis 2021, 11(1), p.1-14; Singh, R.; Bathaei, M. J.; Istif, E.; Beker, L. A Review of Bioresorbable Implantable Medical Devices: Materials, Fabrication, and Implementation. Advanced Healthcare Materials 2020, 9(18), 2000790; Sonmezoglu, S; Fineman, J.R.; Maltepe, E.; Maharbiz, M.M. Monitoring deep-tissue oxygenation with a millimeter-scale ultrasonic implant. Nature Biotechnology 2021, 39, p.855-864], but they are usually large in size and difficult to produce. The proposed invention is about a more advanced method for implanting microsensors based on microparticles (micron-sized - about 1-100 microns in size) containing fluorescent dyes that change their optical characteristics in response to changes in environmental parameters, in this case - the internal environment of the body, in other words, the composition of body fluids [Rong, G.; Turtle, E.E.; Neal Reilly, A.; Clark, H.A. Recent developments in nanosensors for imaging applications in biological systems. Annual Review of Analytical Chemistry 2019, 12, p.109-128; Kaefer, K. et al. Implantable Sensors Based on Gold Nanoparticles for Continuous Long-Term Concentration Monitoring in the Body. Nano Letters 2021, 21(7), p. 3325-3330; Gurkov, A.; Shchapova, E.; Bedulina, D.; Baduev, V.; Borvinskaya, E.; Meglinski, I.; Timofeyev, M. Remote in vivo stress assessment of aquatic animals with microencapsulated biomarkers for environmental monitoring. Scientific Reports 2016, 6(1), p. 1-8]. The fabrication of such a sensor is relatively simple and can be performed in most biochemistry laboratories.
Хотя большинство имплантируемых сенсоров разрабатываются для человека и млекопитающих [Rong, G. et al. Recent developments in nanosensors for imaging applications in biological systems. Annual Review of Analytical Chemistry 2019, 12, p. 109-128], другие животные также заслуживают внимания. Например, аквакультура рыбы производит около половины всего количества рыбы, потребляемой человеком, и этот рынок продолжает расти [Jahangiri, L.; Esteban, М.Á.; Administration of probiotics in the water in finfish aquaculture systems: a review. Fishes 2018, 3(3), p.33; Lulijwa, R. et al. Advances in salmonid fish immunology: A review of methods and techniques for lymphoid tissue and peripheral blood leucocyte isolation and application. Fish & Shellfish Immunology 2019, 95, p.44-80.]. Выращиваемые рыбы страдают от инфекционных заболеваний [Rodger, H.D. Fish disease causing economic impact in global aquaculture. In Fish vaccines. Springer, Basel, 2016, pp.1-34] и плохого качества воды [Hoseini, S.M. et al. Mitigation of transportation stress in common carp, Cyprinus carpio, by dietary administration of turmeric. Aquaculture 2022, 546, 737380], а численность этих животных в стаде слишком велика, чтобы регулярно контролировать состояние каждой особи [Assefa, А.; Abunna, F. Maintenance of fish health in aquaculture: review of epidemiological approaches for prevention and control of infectious disease of fish. Veterinary Medicine International 2018, Article ID 5432497, https://doi.org/10.1155/2018/5432497]. В ближайшем будущем дешевые имплантируемые датчики, регистрирующие физиологические параметры организма, могут стать одним из новых инструментов, которые помогут автоматизировать мониторинг здоровья выращиваемой рыбы на рыбных фермах.Although most implantable sensors are being developed for humans and mammals [Rong, G. et al. Recent developments in nanosensors for imaging applications in biological systems. Annual Review of Analytical Chemistry 2019, 12, p. 109-128], other animals also deserve attention. For example, fish aquaculture produces about half of all fish consumed by humans, and this market continues to grow [Jahangiri, L.; Esteban, M.A.; Administration of probiotics in the water in finfish aquaculture systems: a review. Fishes 2018, 3(3), p.33; Lulijwa, R. et al. Advances in salmonid fish immunology: A review of methods and techniques for lymphoid tissue and peripheral blood leucocyte isolation and application. Fish & Shellfish Immunology 2019, 95, p.44-80.]. Farmed fish suffer from infectious diseases [Rodger, H.D. Fish disease causing economic impact in global aquaculture. In Fish vaccines. Springer, Basel, 2016, pp.1-34] and poor water quality [Hoseini, S.M. et al. Mitigation of transportation stress in common carp, Cyprinus carpio, by dietary administration of turmeric. Aquaculture 2022, 546, 737380], and the number of these animals in the herd is too large to regularly monitor the condition of each individual [Assefa, A.; Abunna, F. Maintenance of fish health in aquaculture: review of epidemiological approaches for prevention and control of infectious disease of fish. Veterinary Medicine International 2018, Article ID 5432497, https://doi.org/10.1155/2018/5432497]. In the near future, low-cost implantable sensors that record physiological parameters of the body may become one of the new tools that will help automate the monitoring of the health of farmed fish in fish farms.
Фундаментальной проблемой при использовании имплантируемых микросенсоров, в том числе на основе микрочастиц с флуоресцентным красителем, является реакция распознавания и отторжения чужеродного тела иммунной системой.A fundamental problem when using implanted microsensors, including those based on microparticles with a fluorescent dye, is the reaction of recognition and rejection of a foreign body by the immune system.
Известен способ введения бионеразлагаемых микрочастиц, содержащих флуоресцентный краситель, в кровоток рыбок Danio rerio путем инъекции в почку рыбы суспензии микрочастиц в изотоническом растворе (0,9% водный раствор NaCl) [Borvinskaya Е., Gurkov A., Shchapova Е., Mutin A., Timofeyev М. 2021. Histopathological analysis of zebrafish after introduction of non-biodegradable polyelectrolyte microcapsules into the circulatory system. PeerJ 9:el 1337 http://doi.org/10.7717/peerj.11337]. Известен также способ введения бионеразлагаемых микрочастиц, содержащих флуоресцентный краситель, в центральный кровеносный сосуд ракообразных на примере амфипод Eulimnogammarus verrucosus, путем инъекции суспензии микрочастиц в изотоническом растворе (0,9% водный раствор NaCl) в центральный гемолимфатический сосуд амфипод [Shchapova Е., Nazarova A., Gurkov А., Borvinskaya Е., Rzhechitskiy Y., Dmitriev I., Meglinski I., Timofeyev M. Application of PEG-Covered Non-Biodegradable Polyelectrolyte Microcapsules in the Crustacean Circulatory System on the Example of the Amphipod Eulimnogammarus verrucosus. Polymers 2019, 11, 1246; doi:10.3390/polym11081246]There is a known method of introducing biodegradable microparticles containing a fluorescent dye into the bloodstream of Danio rerio fish by injecting a suspension of microparticles in an isotonic solution (0.9% aqueous NaCl solution) into the fish kidney [Borvinskaya E., Gurkov A., Shchapova E., Mutin A. , Timofeyev M. 2021. Histopathological analysis of zebrafish after introduction of non-biodegradable polyelectrolyte microcapsules into the circulatory system. PeerJ 9:el 1337 http://doi.org/10.7717/peerj.11337]. There is also a known method of introducing biodegradable microparticles containing a fluorescent dye into the central blood vessel of crustaceans using the example of the amphipod Eulimnogammarus verrucosus, by injecting a suspension of microparticles in an isotonic solution (0.9% aqueous NaCl solution) into the central hemolymphatic vessel of the amphipods [Shchapova E., Nazarova A ., Gurkov A., Borvinskaya E., Rzhechitskiy Y., Dmitriev I., Meglinski I., Timofeyev M. Application of PEG-Covered Non-Biodegradable Polyelectrolyte Microcapsules in the Crustacean Circulatory System on the Example of the Amphipod Eulimnogammarus verrucosus. Polymers 2019, 11, 1246; doi:10.3390/polym11081246]
Гистологические исследования в обоих случаях показали, что микрокапсулы, нагруженные флуоресцентным зондом, распознаются и поглощаются фагоцитирующими клетками в течение первых суток после введения, тем самым теряя свою функциональность. Таким образом, чтобы продлить время работы микросенсора, требуется уменьшить скорость распознавания импланта иммунной системой.Histological studies in both cases showed that microcapsules loaded with a fluorescent probe are recognized and taken up by phagocytic cells within the first day after administration, thereby losing their functionality. Thus, in order to extend the operating time of the microsensor, it is necessary to reduce the rate of recognition of the implant by the immune system.
Известен один из подходов к решению этой проблемы: создание физического барьера между иммунными клетками и микрочастицами с помощью биосовместимых бионеразлагаемых гидрогелей. Гидрогели представляют собой трехмерный полимерный каркас, удерживающий большое количество воды (40-98% объема геля), что позволяет биологическим молекулам свободно проходить через него. При этом размер пор геля можно отрегулировать так, чтобы из него не выходили микрочастицы и в него не проникали иммунные клетки.One of the known approaches to solving this problem is the creation of a physical barrier between immune cells and microparticles using biocompatible, biodegradable hydrogels. Hydrogels are a three-dimensional polymer framework that retains a large amount of water (40-98% of the gel volume), which allows biological molecules to freely pass through it. In this case, the pore size of the gel can be adjusted so that microparticles do not escape from it and immune cells do not penetrate into it.
Ранее многообещающая биосовместимость с сохранением функциональности имплантированных микросенсоров в течение многих лет была показана для гелей на основе поли(2-гидроксиэтилметакрилата), поли(этиленгликоль)диакрилата, и т.д. [например: M.F. Montero-Baker, et al. The First-in-Man "Si Se Puede" Study for the use of micro-oxygen sensors (MOXYs) to determine dynamic relative oxygen indices in the feet of patients with limb-threatening ischemia during endovascular therapy. JOURNAL OF VASCULAR SURGERY. Volume 61, Issue 6, June 2015. Pp.1501-1510, http://dx.doi.org/10.1016/j.jvs.2014.12.060; X. Hu, X. Gong. A new route to fabricate biocompatible hydrogels with controlled drug delivery behavior, Journal of Colloid and Interface Science (2016), doi: http://dx.doi.org/10.1016/j.jcis.2016.02.037; Wisniewski N.A. et al. Tissue-Integrating Oxygen Sensors: Continuous Tracking of Tissue Hypoxia. Adv Exp Med Biol. 2017; 977: 377-383. doi:10.1007/978-3-319-55231-6_49; M.A. Lee et al. Implanted Nanosensors in Marine Organisms for Physiological Biologging: Design, Feasibility, and Species Variability // ACS sensors. - 2018. - T. 4. - №. 1. - C. 32-43, https://doi.org/10.1021/acssensors.8b00538; Kaefer, K. et al. Implantable Sensors Based on Gold Nanoparticles for Continuous Long-Term Concentration Monitoring in the Body. Nano Letters 2021, 21(7), p.3325-3330]. Недостатком этих гелей является то, что после полимеризации они принимают постоянную форму. Соответственно, для их введения под кожу применяют сложные пневматические устройства, толстые транспондерные иглы или хирургическое вмешательство (Montero-Baker et al. 2015; Lee et al., 2019; Kaefer et al., 2021). Такие подходы сложны, травматичны и неприменимы к мелким животным.Previously, promising biocompatibility with maintaining the functionality of implanted microsensors for many years has been shown for gels based on poly(2-hydroxyethyl methacrylate), poly(ethylene glycol) diacrylate, etc. [eg: M.F. Montero-Baker, et al. The First-in-Man "Si Se Puede" Study for the use of micro-oxygen sensors (MOXYs) to determine dynamic relative oxygen indices in the feet of patients with limb-threatening ischemia during endovascular therapy. JOURNAL OF VASCULAR SURGERY. Volume 61, Issue 6, June 2015. Pp.1501-1510, http://dx.doi.org/10.1016/j.jvs.2014.12.060; X. Hu, X. Gong. A new route to fabricate biocompatible hydrogels with controlled drug delivery behavior, Journal of Colloid and Interface Science (2016), doi: http://dx.doi.org/10.1016/j.jcis.2016.02.037; Wisniewski N.A. et al. Tissue-Integrating Oxygen Sensors: Continuous Tracking of Tissue Hypoxia. Adv Exp Med Biol. 2017; 977: 377-383. doi:10.1007/978-3-319-55231-6_49; M.A. Lee et al. Implanted Nanosensors in Marine Organisms for Physiological Biologging: Design, Feasibility, and Species Variability // ACS sensors. - 2018. - T. 4. - No. 1. - pp. 32-43, https://doi.org/10.1021/acssensors.8b00538; Kaefer, K. et al. Implantable Sensors Based on Gold Nanoparticles for Continuous Long-Term Concentration Monitoring in the Body. Nano Letters 2021, 21(7), p.3325-3330]. The disadvantage of these gels is that after polymerization they take a permanent shape. Accordingly, complex pneumatic devices, thick transponder needles, or surgery are used to insert them under the skin (Montero-Baker et al. 2015; Lee et al., 2019; Kaefer et al., 2021). Such approaches are complex, traumatic and inapplicable to small animals.
Также проблемой в использовании микродатчиков на основе микрочастиц, содержащих флуоресцентные красители, является то, что получение сигнала сенсора требует имплантации хотя бы в минимально прозрачные ткани. Выращиваемые в аквакультуре виды рыб, например, семейства лососевых, обладают большими размерами, толстой кожей и зачастую имеют выраженную окраску. Все это мешает прохождению света от имплантированного оптического микросенсора через кожу на поверхность тела, где сигнал может быть зарегистрирован прибором для считывания.Another problem in using microsensors based on microparticles containing fluorescent dyes is that receiving a sensor signal requires implantation into at least minimally transparent tissue. Aquacultured fish species, such as the salmon family, are large, thick-skinned, and often distinctly colored. All this interferes with the passage of light from the implanted optical microsensor through the skin to the surface of the body, where the signal can be recorded by a reading device.
Известен способ применения инъекционного флуоресцентного датчика для отслеживания кислотности тканей рыбок данио (Danio rerio) [Borvinskaya, Е.; Gurkov, А.; Shchapova, Е.; Baduev, В.; Shatilina, Z.; Sadovoy, A.; Meglinski, I.; Timofeyev, M.; Parallel in vivo monitoring of pH in gill capillaries and muscles of fishes using microencapsulated biomarkers. Biology Open 2017, 6(5), 673-677], однако в силу небольших размеров эти рыбы имеют довольно прозрачное тело и тонкую кожу. Таким образом, для имплантации флуоресцентных микросенсоров для иного вида рыб требуется подбор удобных полупрозрачных участков на поверхности тела.There is a known method of using an injection fluorescent sensor to monitor the acidity of tissues of zebrafish (Danio rerio) [Borvinskaya, E.; Gurkov, A.; Shchapova, E.; Baduev, V.; Shatilina, Z.; Sadovoy, A.; Meglinski, I.; Timofeyev, M.; Parallel in vivo monitoring of pH in gill capillaries and muscles of fishes using microencapsulated biomarkers. Biology Open 2017, 6(5), 673-677], however, due to their small size, these fish have a rather transparent body and thin skin. Thus, implantation of fluorescent microsensors for other fish species requires the selection of convenient translucent areas on the body surface.
К примеру, радужная форель, типичный представитель рыб семейства лососевых, демонстрирует значительные различия в окраске в зависимости от генетической линии и условий произрастания [Colihueque, N.; Parraguez, М.; Estay, F.J.; Diaz, N.F. Skin color characterization in rainbow trout by use of computer-based image analysis. North American Journal of Aquaculture 2011, 73(3), p.249-258]. Тем не менее кожу на основном теле этого вида можно разделить на: темную кожу на спинной части, кожу вдоль боковой линии с розовым оттенком и светлую кожу на брюшной части. При этом нами было показано, что вне зависимости от окраски, разные типы кожи на теле форели одинаково плохо пропускают свет (см. фиг 2А, фиг. 2В, фиг. 3А). Наличие или отсутствие чешуи также не влияет на проницаемость для света.For example, rainbow trout, a typical representative of the salmon family, shows significant differences in color depending on the genetic line and growing conditions [Colihueque, N.; Parraguez, M.; Estay, F. J.; Diaz, N.F. Skin color characterization in rainbow trout by use of computer-based image analysis. North American Journal of Aquaculture 2011, 73(3), p.249-258]. However, the skin on the main body of this species can be divided into: dark skin on the dorsal part, skin along the lateral line with a pink tint, and light skin on the ventral part. At the same time, we have shown that, regardless of color, different types of skin on the body of trout transmit light equally poorly (see Fig. 2A, Fig. 2B, Fig. 3A). The presence or absence of scales also does not affect light permeability.
Прозрачные участки кожи на теле форели включают: кожу на голове, окологлазничную область, кожу в основании лучевых плавников, жировой плавник.Transparent areas of skin on a trout's body include: the skin on the head, the periorbital region, the skin at the base of the ray fins, and the adipose fin.
Кожа на голове рыб не эластична и плотно прилегает к костям черепа; поэтому для инъекции в этих местах недостаточно подкожного пространства. Окологлазничная область довольно мясистая, имеет достаточный объем для введения импланта и применяется в рыбоводстве для введения различных меток чипов [Bailey, R.E.; Irvine, J.R.; Dalziel, F.C.; Nelson, T.C. Evaluations of visible implant fluorescent tags for marking coho salmon smolts. North American Journal of Fisheries Management 1998, 18(1), p. 191-196], но интенсивное освещение вблизи рыбьего глаза для возбуждения флуоресценции вызовет дополнительное беспокойство, и, потенциально, повреждение сетчатки, и поэтому не рекомендуется при физиологических измерениях.The skin on the head of fish is not elastic and fits tightly to the bones of the skull; therefore, there is not enough subcutaneous space for injection in these areas. The periorbital region is quite fleshy, has sufficient volume for insertion of an implant and is used in fish farming for the introduction of various chip tags [Bailey, R.E.; Irvine, J.R.; Dalziel, F.C.; Nelson, T.C. Evaluations of visible implant fluorescent tags for marking coho salmon smolts. North American Journal of Fisheries Management 1998, 18(1), p. 191-196], but intense illumination close to the fish's eye to excite fluorescence will cause additional disturbance, and potentially damage to the retina, and is therefore not recommended for physiological measurements.
Основания спинного и грудных плавников довольно мясистые и подходят для введения эластичного геля и также используются для маркировки рыб с помощью инъекций меток. Известен способ маркировки молоди радужной форели с помощью меток из окрашенного эластомера, который вводили под кожу у основания спинного плавника и между лучами хвостового плавника [Leblanc, С.А.; Noakes, D.L. Visible implant elastomer (VIE) tags for marking small rainbow trout. North American Journal of Fisheries Management 2012, 32(4), pp. 716-719.]. Недостатком данного способа является то, что в случае введения флуоресцентного датчика в основание спинного или брюшного плавника, сигнал от него можно будет регистрировать только с одной стороны рыбы (откуда был сделан укол). Также плавник с датчиком внутри, вероятно, придется ампутировать перед продажей, что существенно портит состояние и товарный вид выращиваемой рыбы.The bases of the dorsal and pectoral fins are quite fleshy and suitable for the injection of elastic gel and are also used for marking fish using tag injections. There is a known method for marking juvenile rainbow trout using colored elastomer tags, which are inserted under the skin at the base of the dorsal fin and between the rays of the caudal fin [Leblanc, S.A.; Noakes, D.L. Visible implant elastomer (VIE) tags for marking small rainbow trout. North American Journal of Fisheries Management 2012, 32(4), pp. 716-719.]. The disadvantage of this method is that if a fluorescent sensor is inserted into the base of the dorsal or pelvic fin, the signal from it can only be recorded on one side of the fish (from where the injection was made). Also, the fin with the sensor inside will probably have to be amputated before sale, which significantly spoils the condition and presentation of the farmed fish.
Известен способ применения имплантируемых флуоресцентных наносенсоров для мониторинга физиологических состояний ряда гидробионтов (Lee М.A. et al. Implanted Nanosensors in Marine Organisms for Physiological Biologging: Design, Feasibility, and Species Variability // ACS sensors. - 2018. - T. 4. - №. 1. - C. 32-43), наиболее близкий по технической сущности и достигаемому результату (принят за прототип). В качестве носителя использовали биосовместимый гидрогель на основе поли(этиленгликоль)диакрилата (PEGDA). Датчики применяли на 9 видах гидробионтов, имплантируя их в ткани с различной окраской, чтобы исследовать влияние окраски на видимость флуоресценции, к примеру, золотым рыбкам (Carassius auratus) вводили в мышцу в области спинного плавника, звездчатой кошачьей акуле (Scyliorhinus stellaris) - подкожно в область спины на уровне второго спинного плавника, синей акуле (Prionace glauca) - в различные участки кожи, имеющие окраску от темно-синего до белого цвета, морской черепахе (Caretta caretta) - в участки кожи, покрытые чешуей и лишенные чешуи. Далее визуализировали датчик рибофлавина с флуоресценцией в инфракрасном диапазоне под кожей гидробионтов. Недостатком данного способа-прототипа является, во-первых, возможность визуализации флуоресценции датчика только в определенных типах кожи у определенных видов рыб. Сами авторы исследования отмечают, что темные участки поверхности кожи гидробионтов плохо пропускали излучение от флуоресцентного имплантированного датчика в инфракрасном диапазоне. При этом, учитывая высокое пропускание биологическими тканями света в инфракрасном диапазоне [Golovynskyi, S.; Golovynska, I.; Stepanova, L.I.; Datsenko, О.I.; Liu, L.; Qu, J.; Ohulchanskyy, T.Y. Optical windows for head tissues in near-infrared and short-wave infrared regions: Approaching transcranial light applications. Journal of Biophotonics 2018, 11(12), e201800141], предлагаемые в заявляемом нами способе датчики, испускающие свет в видимом диапазоне, как ожидается, будут неприменимы в тех же условиях. Во-вторых, недостатком способа-прототипа, как уже ранее отмечалось, является то, что в данном исследовании использовали гидрогель на основе поли(этиленгликоль)диакрилата, что потребовало применения толстых транспондерных игл, обычно применяющихся для установки микрочипов (которые предварительно извлекали из игл), что травматично и неприменимо для лососевых рыб.There is a known method of using implanted fluorescent nanosensors for monitoring the physiological states of a number of aquatic organisms (Lee M.A. et al. Implanted Nanosensors in Marine Organisms for Physiological Biologging: Design, Feasibility, and Species Variability // ACS sensors. - 2018. - T. 4. - No. 1. - P. 32-43), the closest in technical essence and achieved result (adopted as a prototype). A biocompatible hydrogel based on poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) was used as a carrier. The sensors were used on 9 species of aquatic organisms, implanting them into tissues with different colors in order to study the effect of color on the visibility of fluorescence, for example, goldfish (Carassius auratus) were injected into the muscle in the dorsal fin area, star cat shark (Scyliorhinus stellaris) - subcutaneously in the area of the back at the level of the second dorsal fin, the blue shark (Prionace glauca) - in various areas of the skin, which are colored from dark blue to white, the sea turtle (Caretta caretta) - in areas of the skin covered with scales and without scales. Next, a riboflavin sensor with infrared fluorescence was visualized under the skin of aquatic organisms. The disadvantage of this prototype method is, firstly, the possibility of visualizing the fluorescence of the sensor only in certain types of skin in certain species of fish. The authors of the study themselves note that dark areas of the surface of the skin of aquatic animals did not transmit radiation from the fluorescent implanted sensor in the infrared range well. At the same time, taking into account the high transmission of light in the infrared range by biological tissues [Golovynskyi, S.; Golovynska, I.; Stepanova, L.I.; Datsenko, O.I.; Liu, L.; Qu, J.; Ohulchanskyy, T.Y. Optical windows for head tissues in near-infrared and short-wave infrared regions: Approaching transcranial light applications. Journal of Biophotonics 2018, 11(12), e201800141], the sensors proposed in our claimed method that emit light in the visible range are expected to be inapplicable under the same conditions. Secondly, the disadvantage of the prototype method, as previously noted, is that in this study a hydrogel based on poly(ethylene glycol) diacrylate was used, which required the use of thick transponder needles, usually used for installing microchips (which were previously removed from the needles) , which is traumatic and inapplicable for salmon fish.
Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа введения под кожу культивируемых рыб семейства лососевых оптических микросенсоров на основе микрочастиц с флуоресцентными индикаторными красителями, с использованием такого биосовместимого бионеразлагаемого гидрогеля, который после застывания не принимает постоянную форму, а остается мягким и гибким, следовательно, не требует применения травматичных для рыб способов введения (например, транспондерных игл), при этом обеспечивает удовлетворительную прозрачность тканей в месте введения для прохождения оптического сигнала от имплантированного микросенсора, а также с выбором такого места введения на теле лососевых рыб, которое обеспечит максимальную видимость и считываемость оптического сигнала от имплантированного микросенсора.The objective of the present invention is to develop a method for introducing under the skin of cultured fish of the salmon family optical microsensors based on microparticles with fluorescent indicator dyes, using such a biocompatible, biodegradable hydrogel, which, after hardening, does not take a permanent shape, but remains soft and flexible, therefore, does not require the use of traumatic for fish, methods of administration (for example, transponder needles), while ensuring satisfactory transparency of the tissue at the injection site for the passage of the optical signal from the implanted microsensor, as well as choosing such an injection site on the body of salmon fish that will ensure maximum visibility and readability of the optical signal from the implanted microsensor microsensor.
Технический результат - улучшение прохождения света от имплантированного флуоресцентного оптического микросенсора через кожу на поверхность тела лососевых рыб.The technical result is an improvement in the transmission of light from an implanted fluorescent optical microsensor through the skin to the body surface of salmon fish.
Поставленная задача достигается тем, что предлагается способ введения под кожу культивируемых рыб семейства лососевых оптических микросенсоров на основе микрочастиц с флуоресцентными индикаторными красителями, изменяющими свои оптические характеристики в ответ на изменение состава жидкостей организма рыб, в котором в качестве носителя флуоресцентных микрочастиц используют биосовместимый бионеразлагаемый гидрогель. В качестве биосовместимого бионеразлагаемого гидрогеля, используют 2,5%-ный полиакриламидный гель. Введение микрочастиц с носителем под кожу рыб выполняют путем инъекции шприцем. В качестве места инъекции используют жировой плавник лососевых рыб.This task is achieved by proposing a method for introducing under the skin of cultured fish a family of salmon optical microsensors based on microparticles with fluorescent indicator dyes that change their optical characteristics in response to changes in the composition of fish body fluids, in which a biocompatible, biodegradable hydrogel is used as a carrier of fluorescent microparticles. A 2.5% polyacrylamide gel is used as a biocompatible, biodegradable hydrogel. The introduction of microparticles with a carrier under the skin of fish is performed by injection with a syringe. The adipose fin of salmon fish is used as the injection site.
Применение полужидких инъекционных гидрогелей, таких как 2,5%-ный полиакриламидный гель (ПАГ), который после полимеризации образует текучие гель-золи, позволяет устранить такой недостаток прототипа, как применение толстой транспондерной иглы, изначально предназначенной для микрочипирования. Данные гели можно многократно набирать и выпускать из шприца без нарушения их структуры. Несмотря на текучесть, гель довольно липкий и при надавливании удерживает заполимеризованные внутри микрочастицы, не давая им выпасть из геля. Более плотные ПАГ (3,3% и выше) при подобном механическом воздействии рушатся на кусочки с неровными рваными краями и могут забивать иглу шприца. На фиг 1. проиллюстрированы физические свойства полиакриламидных гелей, где А - структура 2,5%-ный ПАГ, В - структура 3,3%-ный ПАГ, С - мазок микрокапсул с флуоресцентным красителем в 2,5%-ный ПАГ, 1 - стрелки указывают на границу геля, 2 - головки стрелок указывают на флуоресцентные микрокапсулы, D - увеличенное изображение микрокапсул с флуоресцентным красителем в 2,5%-ный ПАГ, 2 - головки стрелок указывают на флуоресцентные микрокапсулы, 3 - двухсторонняя стрелка указывает границу между краем геля и микрокапсулой.The use of semi-liquid injectable hydrogels, such as 2.5% polyacrylamide gel (PAG), which after polymerization forms flowable gel-sols, eliminates such a drawback of the prototype as the use of a thick transponder needle, originally intended for microchipping. These gels can be drawn up and released from the syringe repeatedly without disturbing their structure. Despite its fluidity, the gel is quite sticky and, when pressed, holds the microparticles polymerized inside, preventing them from falling out of the gel. Denser PAGs (3.3% and higher) under such mechanical influence collapse into pieces with uneven, torn edges and can clog the syringe needle. Figure 1 illustrates the physical properties of polyacrylamide gels, where A is the structure of 2.5% PAG, B is the structure of 3.3% PAG, C is a smear of microcapsules with a fluorescent dye in 2.5% PAG, 1 - arrows indicate the border of the gel, 2 - arrow heads indicate fluorescent microcapsules, D - enlarged image of microcapsules with fluorescent dye in 2.5% PAG, 2 - arrow heads indicate fluorescent microcapsules, 3 - double-sided arrow indicates the border between the edge gel and microcapsule.
2,5%-ный ПАГ имеет историю использования в качестве косметического филлера в 1990-х годах в Китае, Восточной Европе и Южной Америке (торговое название Interfall, Aquamid и др.), соответственно, накоплены данные о долгосрочных осложнениях, связанных с его инъекциями. В основном сообщается о жалобах на долговременные последствия от введения ПАГ, таких как фиброз и воспаление в месте инъекции (Peng H.L., Cheng Y.H., Lin Y.H., Ko С.Н. Unusual presentation of a late complication in a polyacrylamide gel-injected breast. Formos.1 Surg 2017; 50: 77-80; Dashtimoghadam, E., Fahimipour, F., Keith, A.N. et al. Injectable non-leaching tissue-mimetic bottlebrush elastomers as an advanced platform for reconstructive surgery. Nat Commun 12,3961 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-021-23962-8).2.5% PAG has a history of use as a cosmetic filler in the 1990s in China, Eastern Europe and South America (trade name Interfall, Aquamid, etc.), accordingly, evidence has accumulated of long-term complications associated with its injections . Mainly reported complaints about long-term consequences of PAG injection, such as fibrosis and inflammation at the injection site (Peng H.L., Cheng Y.H., Lin Y.H., Ko S.N. Unusual presentation of a late complication in a polyacrylamide gel-injected breast. Formos .1 Surg 2017;50:77-80;Dashtimoghadam, E., Fahimipour, F., Keith, A.N. et al. Injectable non-leaching tissue-mimetic bottlebrush elastomers as an advanced platform for reconstructive surgery. Nat Commun 12.3961 ( 2021).https://doi.org/10.1038/s41467-021-23962-8).
Отмечается, что ПАГ в организме неохотно покрывается толстой фиброзной капсулой (Chen L., Sha L., Huang S.P., Li S.R., Wang Z.X. Treatment for displacement of PAG mixture after injection augmentation mammoplasty. Int J Clin Exp Med. 2015; 8(3): 3360-3370. Published 2015 Mar 15; Peng et al., 2017), что вызывает косметические дефекты из-за миграции геля из места введения. При этом сообщалось, что в метаболически активной мышечной ткани ПАГ инкапсулируется лучше, чем в инертной соединительной ткани кожи и молочных желез (Chen et al., 2015; Peng et al. 2017). В целом, по нашей оценке, на основе литературных данных, учитывая примерное количество выполненных косметических процедур и количество обращений с жалобами на воспаление, частота осложнений на этот имплантат составляет 1-5%. Учитывая то, что в косметологии использовались огромные объемы вводимого материала (до 6% от массы тела), можно говорить об удовлетворительной биосовместимости данного носителя для целей введения 10-100 мкл микроимпланта в животных (не более 0,1% от массы тела для молоди рыб). При этом известно (Christensen L.H., Breiting V.B., Aasted A., Jørgensen A., Kebuladze I. Long-term effects of polyacrylamide hydrogel on human breast tissue. Plast Reconstr Surg. 2003 May; 111(6): 1883-90. doi: 10.1097/01.PRS.0000056873.87165.5A. PMID: 12711948), что незначительные объемы отложений ПАГ не вызывают какой-либо реакции в окружающих тканях у людей.It is noted that PAG in the body is reluctantly covered with a thick fibrous capsule (Chen L., Sha L., Huang S.P., Li S.R., Wang Z.X. Treatment for displacement of PAG mixture after injection augmentation mammoplasty. Int J Clin Exp Med. 2015; 8(3 ): 3360-3370. Published 2015 Mar 15; Peng et al., 2017), which causes cosmetic defects due to migration of the gel from the injection site. It was reported that PAG is better encapsulated in metabolically active muscle tissue than in inert connective tissue of the skin and mammary glands (Chen et al., 2015; Peng et al. 2017). In general, according to our assessment, based on the literature data, taking into account the approximate number of cosmetic procedures performed and the number of complaints of inflammation, the incidence of complications with this implant is 1-5%. Considering that huge volumes of injected material were used in cosmetology (up to 6% of body weight), we can talk about satisfactory biocompatibility of this carrier for the purpose of introducing 10-100 μl of microimplant into animals (no more than 0.1% of body weight for juvenile fish ). It is known (Christensen L.H., Breiting V.B., Aasted A., Jørgensen A., Kebuladze I. Long-term effects of polyacrylamide hydrogel on human breast tissue. Plast Reconstr Surg. 2003 May; 111(6): 1883-90. doi : 10.1097/01.PRS.0000056873.87165.5A. PMID: 12711948) that small amounts of PAG deposits do not cause any reaction in surrounding tissues in humans.
Примечательно, что сообщаемое время от инъекции ПАГ до появления осложнений у человека колеблется от 6 месяцев до десятилетий (DeLuca М. et al., Complications 18 years after polyacrylamide hydrogel augmentation mammoplasty: a case report and histopathological analysis. Journal of Surgical Case Reports, Volume 2021, Issue 6, June 2021, rjab276, https://doi.org/10.1093/jscr/rjab276), что более чем достаточно для проведения исследований с помощью микроимплантов на животных моделях. Есть сообщение (Zhou Z., Ru K-Н. Observation on biologic characterization of polyacrylamide gel and silicon gel infused into mammary gland of domestic musk swine [in Chinese]. 2001; JOURNAL OF PRACTICAL AESTHETIC AND PLASTIC SURGERY 12: 69-71) о том, что через 2 недели после инъекций полиакриламидного геля в грудную ткань свиньи наблюдали образование вокруг него фиброзной ткани, однако в течение 4 месяцев после инъекций капсула постепенно истончалась, и в конечном итоге в ней осталось 3-5 слоев фибробластов. Из этого можно предварительно предположить, что развивающееся вокруг импланта воспаление умеренное, а образующаяся в результате фиброзная оболочка проницаема для метаболитов и не будет мешать работе имплантируемого сенсора при введении его под кожу рыб. Нужно отметить, что авторами заявляемого изобретения не выявлено среди общедоступных источников информации сведений о применении 2,5%-ного ПАГ в качестве носителя оптических микросенсоров на основе микрочастиц с флуоресцентными красителями для имплантации в ткани рыб.It is noteworthy that the reported time from PAG injection to the onset of complications in humans ranges from 6 months to decades (DeLuca M. et al., Complications 18 years after polyacrylamide hydrogel augmentation mammoplasty: a case report and histopathological analysis. Journal of Surgical Case Reports, Vol. 2021, Issue 6, June 2021, rjab276, https://doi.org/10.1093/jscr/rjab276), which is more than enough to conduct research using microimplants in animal models. There is a message (Zhou Z., Ru K-N. Observation on biological characterization of polyacrylamide gel and silicon gel infused into mammary gland of domestic musk swine [in Chinese]. 2001; JOURNAL OF PRACTICAL AESTHETIC AND PLASTIC SURGERY 12: 69-71) that 2 weeks after injection of polyacrylamide gel into the breast tissue of a pig, the formation of fibrous tissue around it was observed, but within 4 months after the injections the capsule gradually thinned, and ultimately 3-5 layers of fibroblasts remained in it. From this we can tentatively assume that the inflammation developing around the implant is moderate, and the resulting fibrous membrane is permeable to metabolites and will not interfere with the operation of the implanted sensor when inserted under the skin of fish. It should be noted that the authors of the claimed invention have not found among publicly available sources of information information about the use of 2.5% PAG as a carrier of optical microsensors based on microparticles with fluorescent dyes for implantation into fish tissue.
Жировой плавник лососевых не содержит эндоскелет [Weisel, G.F. The salmonoid adipose fin. Copeia 1968, 1968(3), p.626-627; Stewart, T.A.; Smith, W.L.; Coates, M.I. The origins of adipose fins: an analysis of homoplasy and the serial homology of vertebrate appendages. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences 2014, 281(1781), 20133120] и лишен всех вышеперечисленных недостатков, характерных для введения имплантируемых меток в кожу на голове рыб, окологлазничную область, кожу в основании лучевых плавников. Он достаточно компактный, чтобы быстро найти датчик с любой стороны тела рыбы и достаточно мясистый для имплантации. Плавник интенсивно иннервируется рядом нервов и, по-видимому, служит механочувствительным органом во время плавания [Buckland-Nicks, J.А. New details of the neural architecture of the salmonid adipose fin. Journal of Fish Biology, 2016, 89(4), 1991-2003], что предполагает хорошее кровоснабжение. Таким образом внутренняя среда внутри жирового плавника рыб оперативно отражает текущее состояние метаболизма рыб в целом. Жировой плавник можно удалить без ущерба для товарного состояния рыбы, как это уже практикуется в некоторых странах для маркировки заводских лососевых [Buckland-Nicks, J.A. New details of the neural architecture of the salmonid adipose fin. Journal of Fish Biology, 2016, 89(4), 1991-2003]. Кожа на жировом плавнике отличается от других типов кожи отсутствием толстого слоя плотных пучков коллагеновых волокон (как показано на фиг. 3В), ориентированных параллельно поверхности тела и, соответственно, препятствующего прохождению вглубь ткани лучу света. Сердцевина жирового плавника в основном состоит из коллагенового матрикса [Weisel, G.F. The salmonoid adipose fin. Copeia 1968, 1968(3), p. 626-627], состоящего из воды, связанной редкими нерегулярными коллагеновыми волокнами, что также делает плавник полупрозрачным в проходящем свете.The adipose fin of salmon does not contain an endoskeleton [Weisel, G.F. The salmonoid adipose fin. Copeia 1968, 1968(3), p.626-627; Stewart, T. A.; Smith, W. L.; Coates, M.I. The origins of adipose fins: an analysis of homoplasy and the serial homology of vertebrate appendages. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences 2014, 281(1781), 20133120] and is free from all of the above-mentioned disadvantages characteristic of introducing implanted tags into the skin on the head of fish, the periorbital region, and the skin at the base of the ray fins. It is small enough to quickly locate the sensor on any side of the fish's body and fleshy enough for implantation. The fin is intensively innervated by a number of nerves and, apparently, serves as a mechanosensitive organ during swimming [Buckland-Nicks, J.A. New details of the neural architecture of the salmonid adipose fin. Journal of Fish Biology, 2016, 89(4), 1991-2003], which implies a good blood supply. Thus, the internal environment inside the adipose fin of fish quickly reflects the current state of metabolism of fish as a whole. The adipose fin can be removed without affecting the marketability of the fish, as is already practiced in some countries for marking hatchery salmon [Buckland-Nicks, J.A. New details of the neural architecture of the salmonid adipose fin. Journal of Fish Biology, 2016, 89(4), 1991-2003]. The skin on the adipose fin differs from other types of skin in the absence of a thick layer of dense bundles of collagen fibers (as shown in Fig. 3B) oriented parallel to the surface of the body and, accordingly, preventing a ray of light from passing deep into the tissue. The core of the adipose fin is mainly composed of a collagen matrix [Weisel, G.F. The salmonoid adipose fin. Copeia 1968, 1968(3), p. 626-627], consisting of water bound by sparse irregular collagen fibers, which also makes the fin translucent in transmitted light.
На фиг. 2А показано общее строение тела радужной форели, где: 4 - жаберная крышка, 5 - грудной плавник, 6 - боковая линия, 7 - спинной плавник, 8 - брюшной плавник, 9 - анальный плавник, 10 - жировой плавник, 11 - хвостовой плавник, а также показано увеличенное изображение жирового плавника (10), а на фиг. 2В представлены графики проницаемости жирового плавника и кожи на спине рыб для света на разных длинах волн, где 12 - график проницаемости жирового плавника, 13 - график проницаемости кожи форели с чешуей.In fig. Figure 2A shows the general body structure of a rainbow trout, where: 4 - gill cover, 5 - pectoral fin, 6 - lateral line, 7 - dorsal fin, 8 - ventral fin, 9 - anal fin, 10 - adipose fin, 11 - caudal fin, and also shows an enlarged view of the adipose fin (10), and FIG. 2B shows graphs of the permeability of the adipose fin and skin on the back of fish to light at different wavelengths, where 12 is a graph of the permeability of the adipose fin, 13 is a graph of the permeability of trout skin with scales.
На фиг. 3А показана оптическая плотность (обозначена на графике как OD) разных типов кожи форели и жирового плавника при 650 нм, на фиг. 3В - поперечный срез жирового плавника, где: 14 - плотный слой регулярных коллагеновых волокон, 15 - чешуя, 16 - эпидермис. Сравнение оптических свойств разных типов кожи форели и жирового плавника показывают, что они имеют одинаковое пропускание в диапазоне от ультрафиолетового до синего (как показано также на графике на фиг. 2В), но в диапазоне 500-1000 нм жировой плавник пропускает свет в три и более раз лучше, чем на других участках кожи. Это позволяет возбуждать флуоресценцию микродатчика в диапазоне длин волн 510-845 нм, обладающих низкой фототоксичностью для кожи. Проведенные авторами изобретения тесты показали, что при подкожном введении фотосигнал от имплантированного датчика с тестовым красителем SNARF-1 (пик испускания 650 нм) успешно измеряется из всех частей тела, но регистрируемая на поверхности интенсивность флуоресценции примерно в 18 раз больше в жировом плавнике, чем в других частях тела с обычным кожным покровом, следовательно, введение в жировой плавник позволяет существенно уменьшить количество дорогостоящего молекулярного зонда. Таким образом, мы проанализировали различные части тела выращиваемой радужной форели (как типичного представителя рыб семейства лососевых) в качестве мест имплантации флуоресцентных датчиков и предлагаем жировой плавник в качестве оптимального выбора места инъекции.In fig. 3A shows the optical density (denoted on the graph as OD) of different types of trout skin and adipose fin at 650 nm, FIG. 3B - cross section of the adipose fin, where: 14 - dense layer of regular collagen fibers, 15 - scales, 16 - epidermis. Comparison of the optical properties of different types of trout skin and adipose fin shows that they have the same transmittance in the range from ultraviolet to blue (as also shown in the graph in Fig. 2B), but in the range of 500-1000 nm the adipose fin transmits light by three or more times better than on other areas of the skin. This makes it possible to excite fluorescence of the microsensor in the wavelength range 510-845 nm, which has low phototoxicity to the skin. Tests carried out by the inventors showed that when administered subcutaneously, the photosignal from the implanted sensor with the test dye SNARF-1 (emission peak 650 nm) was successfully measured from all parts of the body, but the fluorescence intensity recorded on the surface was approximately 18 times greater in the adipose fin than in other parts of the body with normal skin, therefore, injection into the adipose fin can significantly reduce the amount of expensive molecular probe. Therefore, we analyzed various body parts of farmed rainbow trout (as a typical salmonid fish) as implantation sites for fluorescent sensors and propose the adipose fin as an optimal choice of injection site.
ПРИМЕРEXAMPLE
Флуоресцентные микрочастицы готовили согласно ранее апробированной и опубликованной методике (например, Borvinskaya Е, Gurkov A, Shchapova Е, Karnaukhov D, Sadovoy A, Meglinski 1, Timofeyev М. 2018b. Simple and effective administration and visualization of microparticles in the circulatory system of small fishes using kidney injection. Journal of Visualized Experiments 136:e57491 DOI 10.3791/57491).Fluorescent microparticles were prepared according to previously tested and published methods (for example, Borvinskaya E, Gurkov A, Shchapova E, Karnaukhov D, Sadovoy A, Meglinski 1, Timofeyev M. 2018b. Simple and effective administration and visualization of microparticles in the circulatory system of small fishes using kidney injection. Journal of Visualized Experiments 136:e57491 DOI 10.3791/57491).
Для синтеза пористых микроядер СаСО3, содержащих флуоресцентный краситель, смешивали 2 мл раствора флуоресцентного красителя в концентрации около 2 мг/мл (можно использовать любой флуоресцентный краситель, сшитый с полимером, такой как FITC-BSA, FITC-Dextran и т.д.) с 0,6 мл 1 моль/л раствора CaCl2 и 0,6 мл 1 моль/л раствора Na2CO3 при быстром перемешивании. После перемешивания в течение 5-10 с переносили суспензию в микроцентрифужные пробирки и центрифугировали в течение 15 с при 10000-12000 g для осаждения микроядер СаСО3, затем удаляли супернатант, промывали ядра 2 мл деионизированной воды и ресуспендировали осадок путем встряхивания. Затем повторяли процедуру центрифугирования-промывки три раза. После последнего центрифугирования отбрасывали супернатант. Полученные микроядра инкубировали в течение 1 мин в ультразвуковой ванне, чтобы уменьшить их агрегацию.To synthesize porous CaCO 3 micronuclei containing a fluorescent dye, 2 ml of a fluorescent dye solution at a concentration of about 2 mg/ml was mixed (any fluorescent dye cross-linked with a polymer, such as FITC-BSA, FITC-Dextran, etc., can be used) with 0.6 ml of 1 mol/l CaCl 2 solution and 0.6 ml of 1 mol/l Na 2 CO 3 solution with rapid stirring. After stirring for 5-10 s, the suspension was transferred into microcentrifuge tubes and centrifuged for 15 s at 10000-12000 g to sediment CaCO3 micronuclei, then the supernatant was removed, the nuclei were washed with 2 ml of deionized water and the sediment was resuspended by shaking. Then the centrifugation-washing procedure was repeated three times. After the last centrifugation, the supernatant was discarded. The resulting micronuclei were incubated for 1 min in an ultrasonic bath to reduce their aggregation.
Для нанесения первого полимерного слоя ресуспендировали ядра в 2 мл раствора 4 мг/мл поли(аллиламин гидрохлорида) в 1 моль/л NaCl. Выдерживали микроядра в растворе 5 мин при постоянном встряхивании. Через 15 с центрифугирования отбрасывали надосадочную жидкость с не связавшимся полимером. Далее промывали покрытые микроядра деионизированной водой не менее 3 раз с помощью нескольких этапов центрифугирования и промывки. После последнего центрифугирования отбрасывали супернатант и инкубировали микроядра в течение 1 мин в ультразвуковой ванне, чтобы уменьшить их агрегацию. Для нанесения второго полимерного слоя повторяли вышеописанные процедуры с 2 мл раствора 4 мг/мл поли(4-стиролсульфоната натрия) в растворе 1 моль/л NaCl. Далее последовательно наносили слои с поли(аллиламин гидрохлоридом) и поли(4-стиролсульфонатом) натрия по шесть раз, чтобы нанести 12 полимерных слоев. Если применяемый флуоресцентный краситель являлся катионным, первым слоем накладывали поли(4-стиролсульфоната натрия) в 1 моль/л NaCl. Ядра СаСО3 растворяли в 2 мл 0,1 моль/л раствора этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) (доведенный до рН 7,1 с помощью NaOH). После 5 мин инкубации микрокапсулы центрифугировали в течение 45 с и сливали супернатант с ЭДТА. Повторяли процедуру дважды, затем промывали микрокапсулы 0,9%-ным раствором NaCl три раза (путем осаждения-ресуспендирования). После последнего шага центрифугирования отбрасывали супернатант. Исходный раствор капсул доводили до концентрации 1-10 млн/мкл и хранили в растворе антибиотика ампициллина (100 мг/л) при 4°С.To apply the first polymer layer, the nuclei were resuspended in 2 ml of a solution of 4 mg/ml poly(allylamine hydrochloride) in 1 mol/l NaCl. The micronuclei were kept in the solution for 5 min with constant shaking. After 15 s of centrifugation, the supernatant with unbound polymer was discarded. Next, the coated micronuclei were washed with deionized water at least 3 times using several centrifugation and washing steps. After the last centrifugation, the supernatant was discarded and the micronuclei were incubated for 1 min in an ultrasonic bath to reduce their aggregation. To apply the second polymer layer, the above procedures were repeated with 2 ml of a solution of 4 mg/ml poly(sodium 4-styrenesulfonate) in a solution of 1 mol/L NaCl. Next, layers with poly(allylamine hydrochloride) and sodium poly(4-styrene sulfonate) were applied sequentially six times to create 12 polymer layers. If the fluorescent dye used was cationic, the first layer was applied to poly(sodium 4-styrenesulfonate) in 1 mol/L NaCl. CaCO 3 nuclei were dissolved in 2 ml of 0.1 mol/l ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) solution (adjusted to pH 7.1 with NaOH). After 5 min of incubation, the microcapsules were centrifuged for 45 s and the supernatant was poured off with EDTA. The procedure was repeated twice, then the microcapsules were washed with a 0.9% NaCl solution three times (by sedimentation-resuspension). After the last centrifugation step, the supernatant was discarded. The initial capsule solution was adjusted to a concentration of 1-10 million/μl and stored in a solution of the antibiotic ampicillin (100 mg/l) at 4°C.
Смесь для инъекций готовили с соблюдением стерильности в ламинарном шкафу с использованием автоклавного лабораторного пластика. Смешивали в микропробирке 5 мкл 29%-ного раствора акриламида, содержащего 1%-ный N,N'-метиленбисакриламид, с 53,2 мкл стокового раствора микрокапсул. Далее добавляли 0,9 мкл 10%-ного персульфата аммония и 0,9 мкл 10%-ного тетраметилэтилендиамина для инициации полимеризации. Полученную смесь сразу отбирали из пробирки с помощью стерильного инсулинового шприца. Затем шприц устанавливали в орбитальный смеситель и вращали в течение 20 минут со средней скоростью для предотвращения оседания капсул до полной полимеризации геля. Готовый гель хранили при 4°С до процедуры имплантации.The injection mixture was prepared under sterile conditions in a laminar flow hood using autoclaved laboratory plastic. 5 μl of a 29% acrylamide solution containing 1% N,N'-methylenebisacrylamide was mixed in a microtube with 53.2 μl of a stock solution of microcapsules. Next, 0.9 μl of 10% ammonium persulfate and 0.9 μl of 10% tetramethylethylenediamine were added to initiate polymerization. The resulting mixture was immediately taken from the test tube using a sterile insulin syringe. The syringe was then placed in an orbital mixer and rotated for 20 minutes at medium speed to prevent the capsules from settling until the gel was completely polymerized. The finished gel was stored at 4°C until the implantation procedure.
Рыб по отдельности анестезировали в эмульсии гвоздичного масла или MS-222 до переворачивания на бок и прекращения реакции на легкое щипание плавника (около 2 мин). Особей иммобилизовывали на столе, жировой плавник промывали спиртом из поливалки и с помощью инсулинового шприца вводили в сердцевину плавника около 2-10 мкл микрокапсул в 2,5%-ный ПАГ. Для каждой особи использовали индивидуальную одноразовую иглу (29G). Возвращали рыбу в емкость с хорошей аэрацией для восстановления.Fish were individually anesthetized in clove oil emulsion or MS-222 until they turned onto their sides and stopped responding to gentle fin plucking (about 2 min). Individuals were immobilized on a table, the adipose fin was washed with alcohol from a watering bottle, and about 2-10 μl of microcapsules in 2.5% PAG were injected into the fin core using an insulin syringe. An individual disposable needle (29G) was used for each individual. Return the fish to a container with good aeration for recovery.
На фиг. 4 представлен результат гистологического исследования (разрез) места введения ПАГ с микрокапсулами через две недели после инъекции, а также ответная экспрессия генов иммунного ответа в жировом плавнике. При этом:In fig. Figure 4 shows the result of a histological examination (section) of the injection site of PAG with microcapsules two weeks after injection, as well as the response expression of immune response genes in the adipose fin. Wherein:
А - показан инъекционный канал с ПАГ, лежащий в коллагеновом матриксе, где: 17 - стрелки указывают на границу между гелем и тканью, образованную монослоем из моноцитов, 18 - кончики стрелок указывают на места привлечения большего числа макрофагов, где идет слабая воспалительная реакция, g - гель с микрокапсулами, m - коллагеновый матрикс, hd - гиподерма, d - дерма, ed - эпидермис;A - shows an injection channel with PAG lying in a collagen matrix, where: 17 - arrows point to the border between the gel and tissue formed by a monolayer of monocytes, 18 - arrow tips point to places where a larger number of macrophages are attracted, where a weak inflammatory reaction occurs, g - gel with microcapsules, m - collagen matrix, hd - hypodermis, d - dermis, ed - epidermis;
В - показана экспрессия гена TNFa1 и С - экспрессия гена il8 в тканях в месте инъекции при введении микрокапсул (микрочастиц) с флуоресцентным красителем без носителя, с использованием в качестве носителя 2,5%-ный ПАГ и при введении физраствора (0,9%-ный NaCl). Следовательно, собственные гистологические исследования подтверждают, что через 2 недели после инъекции микрочастиц с флуоресцентным красителем с 2,5%-ным ПАГ согласно заявляемому способу в жировой плавник форели воспалительная реакция вокруг него развивается слабо, а многослойная фиброзная оболочка вокруг импланта не формируется. Было показано, что гель устойчив в течение как минимум 2 недель в организме рыб. При этом введение микрочастиц без ПАГ вызывает повышение провоспалительных цитокинов FoxP3B, nlL1, IL-1β, TNF-α и IL-8 в месте инъекции, указывая на воспаление, тогда как в жировом плавнике рыб, которым вводили микрочастицы в 2,5%-ный ПАГ или физраствор, такая реакция отсутствовала. Это подтверждает, что ПАГ замедляет распознавание микрочастиц иммунными клетками. Таким образом, ПАГ показал удовлетворительную устойчивость и биосовместимость в тканях рыб, что позволяет применять его для имплантации микросенсоров или меток. Можно заключить, что ПАГ является перспективным носителем для имплантации микросенсоров с целью долгосрочного непрерывного мониторинга состава жидкостей организма рыб.B - shows the expression of the TNFa1 gene and C - expression of the il8 gene in tissues at the injection site with the introduction of microcapsules (microparticles) with a fluorescent dye without a carrier, using 2.5% PAG as a carrier and with the introduction of saline solution (0.9% -NaCl). Consequently, our own histological studies confirm that 2 weeks after the injection of microparticles with a fluorescent dye with 2.5% PAG according to the claimed method into the adipose fin of a trout, the inflammatory reaction around it develops weakly, and a multilayer fibrous membrane around the implant does not form. The gel has been shown to be stable for at least 2 weeks in fish. Moreover, the administration of microparticles without PAG causes an increase in pro-inflammatory cytokines FoxP3B, nlL1, IL-1β, TNF-α and IL-8 at the injection site, indicating inflammation, whereas in the adipose fin of fish that were injected with microparticles in 2.5% PAG or saline solution, there was no such reaction. This confirms that PAG slows down the recognition of microparticles by immune cells. Thus, PAG has shown satisfactory stability and biocompatibility in fish tissues, which allows its use for implantation of microsensors or tags. It can be concluded that PAG is a promising carrier for implanting microsensors for the purpose of long-term continuous monitoring of the composition of body fluids in fish.
Следует отметить, что 2,5%-ный ПАГ интегрируется в ткани без образования толстой фиброзной капсулы и тем самым не снижает прозрачность тканей в месте имплантации.It should be noted that 2.5% PAG is integrated into tissues without the formation of a thick fibrous capsule and thus does not reduce the transparency of tissues at the implantation site.
Жировой плавник рыб также имеет прозрачную кожу, благодаря тонкому дермальному слою и отсутствию чешуи, коллагеновый матрикс в сердцевине жирового плавника также прозрачен и проницаем для света в видимом диапазоне. Благодаря совокупности данных признаков предлагаемого способа (использование в качестве носителя микрочастиц (микрокапсул) с флуоресцентным красителем 2,5%-ным ПАГ и выбор в качестве места инъекции жирового плавника рыб) достигается технический результат - улучшение прохождения света от имплантированного флуоресцентного оптического микросенсора через кожу на поверхность тела рыб, что повышает эффективность неинвазивного долговременного мониторинга различных физиологических параметров организма культивируемых рыб семейства лососевых.The adipose fin of fish also has transparent skin, due to the thin dermal layer and the absence of scales, the collagen matrix in the core of the adipose fin is also transparent and permeable to light in the visible range. Thanks to the combination of these features of the proposed method (the use of microparticles (microcapsules) with a fluorescent dye 2.5% PAG as a carrier and the choice of the adipose fin of fish as an injection site), a technical result is achieved - improved transmission of light from an implanted fluorescent optical microsensor through the skin on surface of the fish body, which increases the efficiency of non-invasive long-term monitoring of various physiological parameters of the body of cultured fish of the salmon family.
В качестве носителя для имплантируемых микросенсоров 2,5%-ный ПАГ имеет и иные преимущества: гель легко вводится с помощью шприца; плохо проницаем для иммунных клеток и удерживает микрокапсулы; снижает раздражающее действие от вводимого препарата и помогает уменьшить реакцию на инородное тело; не мешает заживлению; мягкий, гибкий, устойчив к сдавливанию; имитирует внеклеточный матрикс; не рассасывается в организме в течение нескольких недель.As a carrier for implantable microsensors, 2.5% PAG has other advantages: the gel is easily injected using a syringe; poorly permeable to immune cells and retains microcapsules; reduces the irritant effect of the administered drug and helps reduce the reaction to a foreign body; does not interfere with healing; soft, flexible, resistant to compression; mimics the extracellular matrix; does not dissolve in the body within several weeks.
Жировой плавник в качестве места для введения имплантируемых микросенсоров имеет также следующие преимущества: благодаря прозрачности плавника снятие оптического сигнала регистратором возможно со всех сторон тела рыбы; в силу компактного размера и отсутствия в нем жизненно важных органов жировой плавник может быть ампутирован перед продажей без потери товарного состояния выращиваемой рыбы.The adipose fin as a place for introducing implanted microsensors also has the following advantages: due to the transparency of the fin, the recording of the optical signal by the recorder is possible from all sides of the fish’s body; Due to its compact size and the absence of vital organs, the adipose fin can be amputated before sale without losing the marketability of the farmed fish.
Работа, в ходе которой было создано предлагаемое изобретение, выполнена по гранту Российского научного фонда (РНФ), соглашение №20-64-47011 от 20.05.2020 г., наименование: «Разработка подходов к использованию D-лактата для раннего определения патологических процессов, ассоциированных с бактериофлорой, у рыб в аквакультуре».The work during which the proposed invention was created was carried out under a grant from the Russian Science Foundation (RSF), agreement No. 20-64-47011 dated May 20, 2020, title: “Development of approaches to the use of D-lactate for early detection of pathological processes, associated with bacterioflora in fish in aquaculture.”
Claims (1)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2809520C1 true RU2809520C1 (en) | 2023-12-12 |
Family
ID=
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| UA7474A (en) * | 1994-08-23 | 1995-09-29 | Отто Миколайович Давидов | Method for assessing physiological condition of fish |
| US9901295B2 (en) * | 2013-09-16 | 2018-02-27 | Massachusetts Institute Of Technology | Near infrared fluorescent single walled carbon nanotubes as tissue localizable biosensors |
| RU2664600C2 (en) * | 2013-02-22 | 2018-08-21 | Конинклейке Филипс Н.В. | Marker with light-emitting area for use in determining information on vital signs |
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| UA7474A (en) * | 1994-08-23 | 1995-09-29 | Отто Миколайович Давидов | Method for assessing physiological condition of fish |
| RU2664600C2 (en) * | 2013-02-22 | 2018-08-21 | Конинклейке Филипс Н.В. | Marker with light-emitting area for use in determining information on vital signs |
| US9901295B2 (en) * | 2013-09-16 | 2018-02-27 | Massachusetts Institute Of Technology | Near infrared fluorescent single walled carbon nanotubes as tissue localizable biosensors |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| LEE М.A. ET AL., Implanted Nanosensors in Marine Organisms for Physiological Biologging: Design, Feasibility, and Species Variability // ACS sensors, 2018, T.4, N.1, p.32-43. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20210403850A1 (en) | Semipermeable membrane and uses thereof | |
| JP2006519659A (en) | Alginate dural sealant compositions and methods of use | |
| AU645620B2 (en) | Ultrasound-mediated administration of compounds into aquatic animals | |
| Craig et al. | An optimized method for delivering flow tracer particles to intravital fluid environments in the developing zebrafish | |
| RU2809520C1 (en) | Method for introducing under the skin of cultivated fish of the salmon family optical microsensors based on microparticles with fluorescent indicator dyes | |
| US10383957B2 (en) | Near-infrared fluorescent surgical dye markers | |
| US20170252304A1 (en) | Encapsulation Methods and Compositions | |
| Bassnett | Three-dimensional reconstruction of cells in the living lens: the relationship between cell length and volume | |
| US20220354998A1 (en) | Hydrogel-filled microneedle arrays and uses thereof | |
| WO2017177184A1 (en) | Removable tattoo ink and method of producing same | |
| Oriá et al. | Polymethylmethacrylate orbital implants with interconnecting channels. A retrospective study following enucleation in dogs and cats | |
| JPH0680502A (en) | Preparation for specimen usable for internal transparent | |
| Shi et al. | Intravital Imaging and Analysis of the Structural Plasticity of Dendritic Spines in Multiple Brain Regions | |
| Borvinskaya et al. | Tissue Reaction to Low-Density Polyacrylamide Gel as a Carrier for Microimplants in the Adipose Fin of Rainbow Trout | |
| Rzhechitskiy et al. | Adipose Fin as a Natural “Optical Window” for Implantation of Fluorescent Sensors into Salmonid Fish | |
| Bisht et al. | Precise brain mapping to perform repetitive in vivo imaging of neuro-immune dynamics in mice | |
| van Beest et al. | Visible Implant Elastomers in gilthead seabream (Sparus aurata L.) for experimental research: Preferred injection sites to optimize tag retention and minimize histological effects | |
| Schoetz | Dynamics and mechanics of zebrafish embryonic tissues | |
| CN107460170A (en) | The foundation and its application of Pituitary adenoma cell system | |
| EP0989825A2 (en) | Method and apparatus for administration of substances by ultrasound | |
| Minnich et al. | Scanning electron microscopy and vascular corrosion casting for the characterization of microvascular networks in human and animal tissues | |
| CN110411992B (en) | Imaging method of thyroid tissue structure | |
| Chang et al. | Histological and histochemical investigation of the compound eye of the whiteleg shrimp (Litopenaeus vannamei) | |
| Shin et al. | Transcranial direct current stimulation transiently increases the blood-brain barrier solute permeability in vivo | |
| Kleinfeld et al. | Two-photon imaging of cortical microcirculation |