RU2809122C2 - Ферментативная продукция углеводов микробными клетками с использованием смешанного сырья - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ ферментативного получения 2’-фукозиллактозы, включающий предоставление клетки E. coli, генетически сконструированной для выработки 2’-фукозиллактозы, культивирование указанной генетически сконструированной клетки E. coli в культуральной среде, пермиссивной в отношении продукции 2’-фукозиллактозы, где основной источник углерода представляет собой смесь моносахаридов, состоящую из глюкозы и фруктозы, полученную гидролизом сахарозы; и выделение 2’-фукозиллактозы. При этом клетка E. coli демонстрирует генотип pfkA ^– , lacZ ^– , fuclK ^– , wcaJ ^– , осуществляет сверхэкспрессию ферментов ManB, ManC, Gmd и WcaG для синтеза de novo ГДФ-фукозы, гена α-1,2-фукозилтрансферазы и гена эффлюксного транспортера сахара yberc0001_9420 из Yersinia bercovieri ATCC 43970. Изобретение обеспечивает увеличение продуктивности 2’-фукозиллактозы. 5 з.п. ф-лы, 13 ил., 3 табл., 4 пр.

Description

Настоящее изобретение относится к ферментативному получению целевого сахарида. Раскрыты микробные клетки, способные продуцировать целевой сахарид, где указанные микробные клетки используют сырье из смеси моносахаридов в качестве основного источника углерода и энергии во время ферментации. Также описаны способы получения целевого сахарида посредством использования указанных микробных клеток.

Предшествующий уровень техники

Человеческое грудное молоко содержит сложную смесь углеводов, жиров, белков, витаминов, минеральных веществ и микроэлементов. Наиболее преобладающая фракция человеческого грудного молока состоит из углеводов. Фракция углеводов в человеческом грудном молоке может быть дополнительно подразделена на (i) лактозу и (ii) олигосахариды (олигосахариды грудного молока, ОГМ). В то время, как дисахарид лактоза (галактозо-β1,4-глюкоза) используется грудным ребенком в качестве источника энергии, олигосахариды не метаболизируются младенцем.

На долю фракции олигосахаридов приходится вплоть до одной десятой суммарной фракции углеводов, и она, вероятно, состоит из более чем 150 структурно разных олигосахаридов. Распространенность и концентрация данных сложных олигосахаридов являются специфичными для человека, и, таким образом, они не могут быть обнаружены в больших количествах в молоке других млекопитающих, включая молочных сельскохозяйственных животных.

Наиболее распространенными олигосахаридами грудного молока являются 2'-фукозиллактоза (2-FL - от англ. 2-fucosyllactose) и 3'-фукозиллактоза (3-FL - от англ. 3-fucosyllactose), которые вместе могут составлять вплоть до 1/3 суммарной фракции ОГМ. Дополнительные распространенные ОГМ представляют собой лакто-N-тетраозу (LNT - от англ. lacto-N-tetraose), лакто-N-неотетраозу (LNnT - от англ. lacto-N-neotetraose) и лакто-N-фукопентаозу I (LNFP-I - от англ. lacto-N-fucopentaose I). Помимо данных нейтральных олигосахаридов, также в человеческом грудном молоке могут быть обнаружены кислые ОГМ, такие как 3'-сиалиллактоза (3'-SL - от англ. 3'-sialyllactose), 6'-сиалиллактоза (6'-SL - от англ. 6'-sialyllactose), 3-фукозил-3'-сиалиллактоза, сиалил-лакто-N-тетраоза и дисиалил-лакто-N-тетраоза.

Примечательно, что значительное большинство ОГМ содержат группировку галактозо-β1,4-глюкозы на своем восстанавливающем конце, которая удлиняется в результате добавления группировок моносахарида, как например, N-ацетилглюкозамин (GlcNAc) и/или фукоза и/или галактоза и/или N-ацетилнейраминовая кислота (NeuNAc). Структуры ОГМ являются близкородственными с эпитопами гликоконъюгатов поверхности эпителиальных клеток, антигенами группы крови Lewis, такими как антиген Lewis × (LeX). Структурное сходство ОГМ с эпителиальными эпитопами обуславливает защитные свойства ОГМ против бактериальных патогенов.

О наличии олигосахаридов в человеческом грудном молоке известно на протяжении длительного времени, и физиологические функции данных олигосахаридов подвергали медицинскому исследованию на протяжении многих десятилетий. Для некоторых из более распространенных олигосахаридов грудного молока уже идентифицированы конкретные функции.

Помимо оказания местного действия в кишечнике, как указано ранее в данном документе, ОГМ, как также было показано, оказывают системное действие у младенцев в результате поступления их в системный кровоток. Кроме того, влияние ОГМ на белок-углеводные взаимодействия, например, связывание селектина и лейкоцита может модулировать иммунные ответы и уменьшать воспалительные реакции. Кроме того, становится все более и более признанным, что ОГМ представляют ключевые субстраты для разработки микробиомов младенцев.

Ввиду хорошо изученных полезных свойств разных углеводов, в общем и в частности, пребиотических олигосахаридов, но из-за их ограниченной доступности из природных источников, эффективный и рентабельный способ получения моносахаридов (например, L-фукозы, N-ацетилнейраминовой кислоты), дисахаридов (например, лакто-N-биозы) и олигосахаридов (например, 2'-FL, LNnT) является весьма требуемым.

Пытаясь добиться крупномасштабного производства функциональных углеводов, разработали химические пути для некоторых из данных углеводов. Однако, такие способы включают применение нескольких вредных химических веществ, которые вызывают риск загрязнения конечного продукта. По меньшей мере крупномасштабные количества, а также качества функциональных углеводов, достаточные для их применения в качестве пищевого продукта, не могли быть обеспечены до сегодняшнего дня с помощью химического синтеза.

Для того, чтобы обойти недостатки, которые связаны с химическим синтезом олигосахаридов грудного молока, разработали несколько ферментативных способов и подходов к ферментации для их продукции. Способы ферментативного получения разработаны для нескольких углеводов, таких как L-фукоза, N-ацетилнейраминовая кислота, 2'-фукозиллактоза, 3-фукозиллактоза, лакто-N-тетраоза, лакто-N-неотетраоза, 3'-сиалил-лактоза и 6'-сиалиллактоза. В данных способах получения обычно используются генетически сконструированные бактериальные клетки, такие как рекомбинантные Escherichia coli.

Обычно, способы ферментативного получения, а также биокаталитические реакции для получения ОГМ основаны на добавляемой извне лактозе в качестве исходного акцепторного субстрата для получаемых ОГМ. В данных способах к лактозе добавляют один или более моносахаридов (США 7521212 В1; Albermann et al., (2001) Carbohydr. Res. 334(2) p 97-103). Добавление моносахаридов к лактозе может катализироваться или гликозилтрансферазами, или гликозидазами, с использованием подходящих активированных моносахаридных субстратов. Кроме того, к лактозе могут быть добавлены дополнительные моносахариды в результате реакций с трансгликозидазой.

В частности, ферментативное получение ОГМ оказалось эффективным, поскольку моносахариды, активированные нуклеотидами, которые требуются, но которые сложно синтезировать, предоставлены за счет метаболизма микробных клеток, которые используются. Путь биосинтеза моносахаридов, активированных нуклеотидами, обычно происходит от первичного метаболизма клетки-хозяина на уровне глюкозо-6-фосфата или фруктозо-6-фосфата. Путь биосинтеза в отношении УДФ (уридиндифосфат)-галактозы (УДФ-Gal) происходит от глюкозо-6-фосфата, в то время как биосинтез ГДФ (гуанозиндифосфат)-фукозы, УДФ-N-ацетилглюкозамина и СМР-N-ацетилнейраминовой кислоты происходит от фукозы-6-фосфата.

Эффективный биосинтез моносахаридов, активированных нуклеотидами в микробной клетке-хозяине и, следовательно, получение требуемых углеводов посредством ферментативных способов явно основаны на непрерывной подаче сахарофосфатов, таких как глюкозо-6-фосфат и/или фруктозо-6-фосфат.

Основной проблемой в указанных ферментативных способах, обычно основанных на потреблении простого и недорогого источника углерода и энергии (например, глицерина, глюкозы, сахарозы) микробной клеткой-хозяином, является ограниченная доступность таких фосфорилированных/активированных сахаридов в указанной клетке-хозяине (например, вследствие конкурирующих реакций), что сильно нарушает поток углевода пути биосинтеза продукта, таким образом, продуктивность данных процессов.

Для преодоления упомянутых выше недостатков разработали улучшенные средства и способы получения ОГМ. Например, в WO 2012/007481 А2 раскрыт сконструированный организм, способный продуцировать сахарид, активированный сахарид, нуклеозид, гликозид, гликолипид и гликопротеин, где указанный сконструированный организм экспрессирует: i) ген, кодирующий гидролазу углевода в комбинации с геном, кодирующим киназу углевода, ii) ген, кодирующий синтазу углевода, или iii) ген, кодирующий фосфорилазу углевода, таким образом, что указанный организм способен расщеплять дисахарид, олигосахарид, полисахарид или их смесь до активированного сахарида и сахарида, и где указанный организм дополнительно генетически модифицирован, таким образом, что по меньшей мере один ген, отличный от любого из вводимых генов указанного организма, сделан менее функциональным или нефункциональным, и где указанный другой ген кодирует фермент, который превращает указанный активированный сахарид в биомассу, и/или биокаталитические ферменты. Указанный сконструированный организм способен образовывать требуемые углеводы, одновременно используя дисахарид, такой как сахароза, олигосахарид, полисахарид или их смесь.

Однако, продукция требуемого соединения указанным сконструированным организмом с использованием сахарозы в качестве единственного источника углерода и энергии, имеет большой недостаток, заключающийся в том, что сложно стерилизовать сахарозу. Наиболее требуемым способом стерилизации является тепловая стерилизация. Однако, тепловая стерилизация сахарозы приводит к значительной степени гидролизации, препятствуя применимости способа, описанного в WO 2012/007481 А2.

В качестве альтернативы тепловой стерилизации может быть использована стерильная фильтрация раствора сахарозы, но стерильная фильтрация имеет высокий риск загрязнения, приводящего к росту нетребуемых бактериальных клеток, в частности, при ферментации промышленного масштаба.

Тем не менее, сахароза представляет наиболее привлекательный источник углерода для биотехнологических применений из-за своей доступности и низкой стоимости.

Следовательно, требуемо обеспечить микробные клетки для ферментативной продукции требуемого углевода, которые были бы способны продуцировать требуемый углевод при культивации в присутствии недорогого сырья в качестве основного источника углерода и энергии, где указанное сырье не должно быть гидролизовано микробной клеткой, используемого в метаболизме клетки, и способ получения целевого углевода посредством ферментации посредством культивирования указанной микробной клетки в присутствии указанного сырья в качестве главного источника углерода и энергии.

Цель достигается тем, что предложены генетически сконструированные микробные клетки, которые способны продуцировать требуемый углевод, при культивировании на сырье из смеси моносахаридов в качестве основного источника углерода и энергии, где указанное сырье из смеси моносахаридов состоит из глюкозы и по меньшей мере одного дополнительного моносахарида, выбранного из группы, состоящей из фруктозы и галактозы, и где микробные клетки обладают повышенной внутриклеточной доступностью по меньшей мере одного сахарофосфата, и посредством предложения способа ферментативной продукции целевого углевода, который включает культивирование указанных генетически сконструированных микробных клеток в присутствии указанного сырья из смеси моносахаридов в качестве основного источника углерода и энергии.

Краткое изложение сущности изобретения

Согласно первому аспекту предложена генетически сконструированная микробная клетка для продукции целевого углевода, где указанная микробная клетка обладает повышенной внутриклеточной доступностью по меньшей мере одного сахарофосфата и способна продуцировать целевой углевод при культивации в присутствии сырья из смеси моносахаридов в качестве основного источника углерода и энергии, где указанное сырье из смеси моносахаридов состоит из глюкозы и по меньшей мере одного дополнительного моносахарида, выбранного из группы, состоящей из фруктозы и галактозы.

Согласно второму аспекту предложено применение генетически сконструированной микробной клетки, как описано в данном документе, для продукции целевого углевода, где указанную микробную клетку культивируют в присутствии смеси моносахаридов, состоящей из глюкозы и по меньшей мере одного дополнительного моносахарида из группы фруктозы и галактозы.

Согласно третьему аспекту предложен способ ферментативного получения целевого углевода, включающий следующие стадии:

a) предоставление генетически сконструированной микробной клетки, которая способна продуцировать целевой углевод, где указанная микробная клетка обладает повышенной внутриклеточной доступностью по меньшей мере одного сахарофосфата;

b) культивирование указанной генетически сконструированной микробной клетки в культуральной среде, которая является пермиссивной в отношении продукции указанного целевого углевода, где культуральная среда содержит сырье из смеси моносахаридов в качестве главного источника углерода и энергии, где указанное сырье из смеси моносахаридов состоит из глюкозы и по меньшей мере одного дополнительного моносахарида, выбранного из группы, состоящей из фруктозы и галактозы; и

с) выделение указанного целевого углевода.

В четвертом аспекте предложено применение целевого углевода, который продуцирован генетически сконструированной микробной клеткой и/или способом, описанным в данном документе, для изготовления фармацевтической и/или пищевой композиции.

Краткое описание графических материалов

На Фиг. 1 показано схематическое представление иллюстративной микробной клетки дикого типа (например, Е. coli), иллюстрирующее встречающиеся в природе метаболические пути, приводящие к и происходящие от сахарофосфатов фруктозо-1-фосфат и глюкозо-6-фосфат.

На Фиг. 2 показано схематическое представление иллюстративной генетически модифицированной микробной клетки по изобретению, где указаны генетические модификации, приводящие к повышенной доступности внутриклеточного глюкозо-6-фосфата.

На Фиг. 3 показано схематичное изображение еще одного иллюстративного воплощения генетически сконструированной микробной клетки по изобретению, где указаны генетические модификации, приводящие к повышенной доступности внутриклеточного глюкозо-6-фосфата.

На Фиг. 4 показано схематичное изображение еще одного иллюстративного воплощения генетически сконструированной микробной клетки по изобретению, где указаны генетические модификации, приводящие к повышенной доступности внутриклеточного глюкозо-6-фосфата.

На Фиг. 5 показано схематичное изображение еще одного иллюстративного воплощения генетически сконструированной микробной клетки по изобретению, где указаны генетические модификации, приводящие к повышенной доступности внутриклеточного глюкозо-6-фосфата и повышенной доступности внутриклеточного фруктозо-6-фосфата.

На Фиг. 6 показано схематичное изображение еще одного иллюстративного воплощения генетически сконструированной микробной клетки по изобретению, где указаны генетические модификации, приводящие к повышенной доступности внутриклеточного глюкозо-6-фосфата и повышенной доступности внутриклеточного фруктозо-6-фосфата.

На Фиг. 7 показано схематичное изображение еще одного иллюстративного воплощения генетически сконструированной микробной клетки по изобретению, где указаны генетические модификации, приводящие к повышенной доступности внутриклеточного глюкозо-6-фосфата и повышенной доступности внутриклеточного фруктозо-6-фосфата.

На Фиг. 8 показано схематичное изображение еще одного иллюстративного воплощения генетически сконструированной микробной клетки по изобретению, где указаны генетические модификации, приводящие к повышенной доступности внутриклеточного глюкозо-6-фосфата и повышенной доступности внутриклеточного фруктозо-6-фосфата.

На Фиг. 9 показано схематичное изображение еще одного иллюстративного воплощения генетически сконструированной микробной клетки по изобретению, где указаны генетические модификации, приводящие к повышенной доступности внутриклеточного глюкозо-6-фосфата и повышенной доступности внутриклеточного фруктозо-6-фосфата.

На Фиг. 10 показано схематичное изображение еще одного иллюстративного воплощения генетически сконструированной микробной клетки по изобретению, где указаны генетические модификации, приводящие к повышенной доступности внутриклеточной глюкозы, глюкозо-6-фосфата и фруктозо-6-фосфата.

На Фиг. 11 показано схематичное изображение еще одного иллюстративного воплощения генетически сконструированной микробной клетки по изобретению, где указаны генетические модификации, приводящие к повышенной доступности внутриклеточной маннозы и/или маннозо-6 фосфата.

На Фиг. 12 показано схематичное изображение еще одного иллюстративного воплощения генетически сконструированной микробной клетки по изобретению, где указаны генетические модификации, приводящие к повышенной доступности галактозо-1-фосфата и фруктозо-6-фосфата.

На Фиг. 13 изображены характеристики роста штаммов Е. coli во время культивирования на глюкозе (А) или на сырье из смеси моносахаридов, состоящем из глюкозы и фруктозы (В) в качестве единственного источника углерода и энергии.

Подробное описание

Согласно первому аспекту предложена генетически сконструированная микробная клетка, которая способна продуцировать целевой углевод. В дополнительном воплощении целевой углевод представляет собой углевод, который не встречается в природе в клетке-предшественнике дикого типа генетически сконструированной микробной клетки.

Микробная клетка обладает повышенной внутриклеточной доступностью по меньшей мере одного сахарофосфата, по сравнению с внутриклеточной доступностью указанного по меньшей мере одного сахарофосфата в соответствующей клетке дикого типа. Генетически сконструированная микробная клетка способна продуцировать указанный целевой углевод и продуцирует указанный целевой углевод при культивировании в культуральной среде, содержащей сырье из смеси моносахаридов в качестве основного источника углерода и энергии для микробной клетки, где сырье из смеси моносахаридов состоит из глюкозы и по меньшей мере одного дополнительного моносахарида, выбранного из группы, состоящей из фруктозы и галактозы.

Генетически сконструированная микробная клетка способна продуцировать целевой углевод благодаря генетическому конструированию. Следовательно, генетически сконструированная микробная клетка экспрессирует один или более гетерологичных генов, где активность полипептида(ов),кодируемого(ых) указанным(и) гетерологичным(и) геном(ами), дает возможность микробной клетке синтезировать целевой углевод.

Термин «функциональный ген», в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, которая кодирует белок или полипептид, и которая также содержит регуляторные последовательности, функционально связанные с указанной нуклеотидной последовательностью, кодирующей белок, таким образом, что нуклеотидная последовательность, которая кодирует данный белок или полипептид, может экспрессироваться в микробной клетке/микробной клеткой, несущей указанный функциональный ген. Таким образом, при культивации в условиях, которые являются пермиссивными в отношении экспрессии функционального гена, указанный функциональный ген экспрессируется, и микробная клетка, экспрессирующая указанный функциональный ген, обычно содержит белок или полипептид, который кодируется областью, кодирующей белок, функционального гена. В том виде, в котором они используются в данном документе, термины «нуклеиновая кислота» и «полинуклеотид» относятся к полимеру из дезоксирибонуклеотидов или рибонуклеотидов или в одно- или двухцепочечной форме и, если не ограничено иным образом, охватывают известные аналоги природных нуклеотидов, которые гибридизуются с нуклеиновыми кислотами образом, похожим на нуклеотиды, встречающиеся в природе. Если не указано иное, конкретная последовательность нуклеиновой кислоты включает ее комплементарную последовательность.

Термин «функционально связанный», в том виде, в котором он используется в данном документе, будет означать функциональную связь между нуклеотидной последовательностью контроля экспрессии (такой как промотор, сигнальная последовательность или ряд сайтов связывания транскрипционных факторов) и второй последовательностью нуклеиновой кислоты, где последовательность контроля экспрессии влияет на транскрипцию и/или трансляцию нуклеиновой кислоты, соответствующей второй последовательности. Соответственно, термин «промотор» обозначает последовательности ДНК, которые обычно «предшествуют» гену в ДНК-полимере и обеспечивают сайт инициации транскрипции в мРНК. «Регуляторные» последовательности ДНК, также обычно расположенные «выше» (то есть, предшествуя) гена в данном ДНК-полимере, связывают белки, которые определяют частоту (или скорость) инициации транскрипции. В совокупности называемые «промоторной/регуляторной» ДНК-последовательностью или ДНК-последовательностью «контроля», данные последовательности, которые предшествуют выбранному гену (или серии генов) в функциональном ДНК-полимере способствуют определению того, будет ли происходить транскрипция (и в конечном итоге экспрессия) гена. Последовательности ДНК, которые «следуют за» геном в ДНК-полимере и обеспечивают сигнал для терминации транскрипции в мРНК, называются последовательностями, «терминирующими» транскрипцию.

Термин «рекомбинантный», в том виде, в котором он используется в данном документе со ссылкой на бактериальную клетку-хозяина, указывает на то, что бактериальная клетка реплицирует гетерологичную нуклеиновую кислоту или экспрессирует пептид или белок, кодируемый гетерологичной нуклеиновой кислотой (а именно, последовательностью, которая является «чужеродной в отношении указанной клетки»). Рекомбинантные клетки могут содержать гены, которые не обнаружены в нативной (нерекомбинантной) форме клетки. Рекомбинантные клетки могут также содержать гены, обнаруженные в нативной форме клетки, где гены модифицированы и повторно введены в клетку искусственными средствами. Термин также охватывает клетки, которые содержат нуклеиновую кислоту, эндогенную в отношении клетки, которая была модифицирована без удаления нуклеиновой кислоты изданной клетки; такие модификации включают модификации, полученные посредством замены генов, сайт-специфичной мутации и родственных методик. Соответственно, «рекомбинантный полипептид» представляет собой полипептид, который получен посредством рекомбинантной клетки. Термин «гетерологичная последовательность» или «гетерологичная нуклеиновая кислота», в том виде, в котором он используется в данном документе, представляет собой последовательность или нуклеиновую кислоту, которая происходит из источника, чужеродного в отношении конкретной клетки-хозяина (например, из отличного вида), или, если из одного и того же источника, модифицирована, по сравнению со своей исходной формой. Таким образом, гетерологичная нуклеиновая кислота, функционально связанная с промотором, происходит из источника, отличного от источника, из которого происходит промотор, или, если из одного и того же источника, модифицирована, по сравнению со своей исходной формой. Гетерологичная последовательность может быть стабильно введена, например, посредством трансфекции, трансформации, конъюгации или трансдукции, в геном клетки микроорганизма - хозяина, где могут применяться методики, которые будут зависеть от клетки-хозяина, в которую должна быть введена данная последовательность. Разные методики известны специалисту в данной области и раскрыты, например, в Sambrook et a/., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989).

Соответственно, под «генетически сконструированной клеткой-хозяином» или «генетически сконструированной микробной клеткой» понимают бактериальную клетку или дрожжевую клетку, которая трансформирована или трансфицирована, или способна к трансформации или трансфекции экзогенной полинуклеотидной последовательностью.

Таким образом, последовательности нуклеиновых кислот, как использовано в настоящем изобретении, могут, например, содержаться в векторе, которым нужно стабильно трансформировать/трансфицировать клетки-хозяев а микроорганизма или который должен быть иным образом в них введен.

Огромное многообразие экспрессионных систем может использоваться для получения полипептидов по изобретению. Такие векторы включают, среди прочих, хромосомные, эписомальные векторы и векторы, происходящие из вирусов, например, векторы, происходящие из бактериальных плазмид, из бактериофага, из транспозонов, из эписом дрожжей, из инсерционных элементов, из хромосомных элементов дрожжей, из вирусов, и векторы, происходящие из их комбинаций, такие как векторы, происходящие из генетических элементов плазмид и бактериофагов, как например, космиды и фагмиды. Конструкции экспрессионных систем могут содержать регуляторные области, которые осуществляют регуляцию, а также вызывают экспрессию. Обычно, любую систему или вектор, подходящий для сохранения, размножения или экспрессии полинуклеотидов и для синтеза полипептида в хозяине, можно использовать для экспрессии в данном отношении. Соответствующая последовательность ДНК может быть вставлена в экспрессионную систему любой из множества хорошо известных и рутинных методик, таких как, например, методики, изложенные в Sambrook et al., см. выше.

Данная область богата патентными и литературными публикациями, относящимся к методам «генной инженерии» для выделения, синтеза, очистки и амплификации генетического материала для применения в трансформации выбранных организмов-хозяев. Таким образом, общеизвестна трансформация организмов-хозяев «гибридной» вирусной или кольцевой плазмидной ДНК, которая включает выбранные экзогенные (то есть, чужеродные или «гетерологичные») ДНК-последовательности. Способы, известные в данной области, прежде всего, включают создание вектора трансформации посредством ферментативного расщепления кольцевой вирусной или плазмидной ДНК с образованием цепей линейной ДНК. Выбранные чужеродные цепи ДНК, обычно включающие последовательности, кодирующие требуемый белковый продукт, получают в линейной форме посредством использования одних и тех же/похожих ферментов. Линейную вирусную или плазмидную ДНК инкубируют с чужеродной ДНК в присутствии лигирующих ферментов, способных воздействовать на процесс восстановления, и образуются «гибридные» векторы, которые включают выбранный экзогенный сегмент ДНК, «сплайсированный» в вирусную или кольцевую ДНК-плазмиду.

Термин «нуклеотидная последовательность, кодирующая...» обычно относится к любому полирибонуклеотиду или полидезоксирибонуклеотиду, который может представлять собой немодифицированную РНК или ДНК или модифицированную РНК или ДНК, и обычно представляет часть гена, которая кодирует определенный полипептид или белок. Термин включает, без ограничения, одно- и двухцепочечную ДНК, ДНК, которая представляет собой смесь одно- и двухцепочечных участков или одно-, двух- и трехцепочечных участков, одно- и двухцепочечную РНК, и РНК, которая представляет собой смесь одно- и двухцеп очечных участков, гибридные молекулы, содержащие ДНК и РНК, которые могут представлять собой одно цепочечные или более типично двухцепочечные или трехцепочечные участки, или смесь одно- и двухцепочечных участков. Термин также охватывает полинуклеотиды, которые включают один единственный непрерывный участок или прерывистые участки, кодирующие полипептид (например, прерывающиеся встроенным фагом или вставкой последовательности или редактированием), вместе с дополнительными участками, которые также могут содержать кодирующие и/или некодирующие последовательности.

Термин «вариант(ы)», в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к полинуклеотиду или полипептиду, который отличается от референсного полинуклеотида или полипептида, соответственно, но сохраняет существенные (ферментативные) свойства референсного полинуклеотида или полипептида. Типичный вариант полинуклеотида отличается по нуклеотидной последовательности от другого, референсного полинуклеотида. Изменения в нуклеотидной последовательности варианта могут менять или могут не менять аминокислотную последовательность полипептида, кодируемого референсным полинуклеотидом. Изменения в нуклеотидах могут приводить к аминокислотным заменам, присоединениям, делециям, слияниям и усечениям в полипептиде, кодируемом референсной последовательностью, как обсуждается ниже. Типичный вариант полинуклеотида отличается по аминокислотной последовательности от другого, референсного полипептида. Обычно, различия ограничены таким образом, что последовательности референсного полипептида и варианта сильно похожи по всей длине и, во многих участках, идентичны. Вариант и референсный полипептид может отличаться в аминокислотной последовательности одной или более заменами, присоединениями, делециями в любой комбинации. Служащий заменой или вставленный остаток аминокислоты может представлять собой или может не представлять собой остаток аминокислоты, кодируемый генетическим кодом. Вариант полинуклеотида или полипептида может являться встречающимся в природе, таким как аллельный вариант, или он может представлять собой вариант, который не известно, чтобы встречался в природе. Варианты полинуклеотидов или полипептидов, не встречающиеся в природе, могут быть созданы методиками мутагенеза посредством прямого синтеза и другими методами генной инженерии, известными специалистам в данной области.

В пределах объема настоящего изобретения, данными терминами также охвачены нуклеотидные/полинуклеотидные и полипептидные полиморфные варианты, аллели, мутанты и межвидовые гомологи, которые имеют аминокислотную последовательность, которая обладает более чем примерно 60%-ной идентичностью аминокислотных последовательностей, 65%-ной, 70%-ной, 75%-ной, 80%-ной, 85%-ной, 90%-ной, предпочтительно 91%-ной, 92%-ной, 93%-ной, 94%-ной, 95%-ной, 96%-ной, 97%-ной, 98%-ной или 99%-ной или более высокой идентичностью аминокислотных последовательностей, предпочтительно, на протяжении участка из по меньшей мере примерно 25, 50, 100, 200, 500, 1000 или более аминокислот, с полипептидом, кодируемым белком дикого типа.

Соответственно, термин «функциональный вариант» любого из генов/белков, раскрытых в данном документе, предназначен для обозначения вариантов последовательностей генов/белков, все еще сохраняющих такую же или несколько меньшую активность гена или белка, из которого происходит соответствующий фрагмент.

Генетически сконструированная микробная клетка обладает по меньшей мере одним транспортером моносахарида для транслокации по меньшей мере одного моносахарида из культуральной среды, в которой указанная микробная клетка культивируется, в ее цитоплазму. Указанный по меньшей мере один транспортер моносахарида транслоцирует моносахарид, выбранный из группы, состоящей из глюкозы, фруктозы и галактозы.

Моносахарид, который транслоцирован через плазматическую мембрану, должен быть фосфорилирован для того, чтобы стать доступным для метаболизма клетки. В зависимости от транспортера моносахарида, который транслоцировал моносахарид через мембрану клетки, моносахарид(ы) или непосредственно фосфорилирован(ы), а именно, при переносе в клетку, или впоследствии фосфорилирован(ы) подходящей киназой. Транслокация моносахарида посредством транспорта, зависимого от фосфоенолпируват:сахарофосфотрансферазы (PEP-PTS - от англ. phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase) приводит к прямому фосфорилированию, тогда как транслокация моносахарида посредством транспорта, независимого от фосфоенолпируват:сахарофосфотрансферазы (независимый от PEP-PTS) требует последующего фосфорилирования моносахарида внутриклеточной киназой.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении микробная клетка содержит систему фосфотрансферазы, транслоцирующую глюкозу (PTsG - от англ. glucose-translocating phosphotransferase system). Система фосфотрансферазы, транслоцирующая глюкозу, катализирует фосфорилирование поступающей глюкозы одновременно с ее транслокацией через клеточную мембрану.

Общий механизм системы Pts заключается в следующем: фосфорильная группа от фосфоренолпирувата (PEP - от англ. phosphoenolpyruvate) переносится посредством пути передачи сигнала к ферменту I (EI - от англ. enzyme I), который, в свою очередь, переносит ее к переносчику фосфорила, белку, богатому гистидином (HPr от англ. histidine protein). Затем фосфо-HPr переносит фосфорильную группу к пермеазе, специфичной в отношении сахара, мембаносвязанному комплексу, известному как фермент 2 (EII - от англ. enzymes II), который транспортирует сахар к клетке. EII состоит по меньшей мере из трех структурно различных доменов IIA, IIB и IIC. Данные домены могут быть либо слиты вместе в одну единственную полипептидную цепь, либо существовать в виде двух или трех взаимосвязанных цепей, ранее называемых ферментами II (EII) и III (EIII).

Первый домен (IIA или EIIA) несет первый сайт фосфорилирования, специфичный в отношении пермеазы, гистидин, который фосфорилируется фосфо-HPr. Второй домен (IIB или EIIB) фосфорилируется фосфо-IIA на остатке цистеинила или гистидила, в зависимости от транспортируемого сахара. Наконец, фосфорильная группа переносится от домена IIB на субстрат-сахар, одновременно с поглощением сахара при участии домена IIC. Данный третий домен (IIC или EIIC) образует канал транслокации и специфичный сайт связывания субстрата.

Таким образом, система PtsG получает глюкозу извне и предоставляет глюкозо-6-фосфат в микробной клетке. Глюкозо-6-фосфат может утилизироваться в пути биосинтеза УДФ-галактозы и/или превращаться во фруктозо-6-фосфат, который, в свою очередь, может быть использован для образования высокоэнергетических трифосфатов в центральном метаболизме и/или, например, в биосинтезе сахаридов, активированных нуклеотидом, таких как ГДФ-фукоза.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически сконструированная микробная клетка содержит транспортер фруктозы для осуществления транслокации фруктозы (Fru - от англ. fructose) из культуральной среды в цитоплазму микробной клетки. Подходящий транспортер фруктозы для поглощения свободной фруктозы представляет собой изоформу (PtsG-F), как описано Kornberg et al. PNAS 97: 1808-1812 (2000)).

Поглощенная фруктоза может быть затем фосфорилирован а фруктокиназой (FrK - от англ. fructokinase) с обеспечением фруктозо-6-фосфата (Fru-6-P). Фруктозо-6-фосфат может быть утилизирован в пути биосинтеза УДФ-галактозы и/или в других метаболических путях, как например, образование высокоэнергетических трифосфатов в центральном метаболизме и/или, например, в биосинтезе сахаридов, активированных нуклеотидом, таких как ГДФ-фукоза.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически сконструированная микробная клетка содержит фосфотрансферазную систему, транслоцирующую фруктозу (PtsF). Фосфотрансферазная система, транслоцирующая фруктозу, катализирует фосфорилирование поступающей фруктозы, одновременно с ее транслокацией через клеточную мембрану.

Таким образом, система PtsF приобретает фруктозу извне и обеспечивает фруктозо-1-фосфат в микробной клетке. Система PtsF содержит трансмембранный белок FruA, 1-фосфофруктокиназу (FruK - от англ. phosphofructose kinase) и белок-переносчик дифосфорила FruB. Фруктоза транслоцируется посредством FruA и FruB с обеспечением фруктозо-1-фосфата в цитоплазме. Фруктозо-1-фосфат может быть дополнительно фосфорилирован фосфофруктокиназой (FruK) с получением фруктозо-1,6-бифосфата, который, в свою очередь, может быть использован микробной клеткой для образования высокоэнергетических трифосфатов в центральном метаболизме.

Еще одна подходящая система PtsF содержит LevD, LevE, LevF и LevG. LevD представляет собой компонент фермента IIA - фосфотрансферазы, специфичной в отношении фруктозы. LevE представляет собой компонент фермента IIB -фосфотрансферазы, специфичной в отношении фруктозы. LevF представляет собой компонент фруктозопермеазы IIC, LevG представляет собой компонент фруктозопермеазы IID. Соответствующие гены levD, levE, levF и levG, как известно, происходят, например, из Bacillus subtilis (штамм 168). Указанная система PtsF обеспечивает фруктозо-1-фосфат в клетке.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении в генетически сконструированной микробной клетке имеется путь биосинтеза УДФ-галактозы для внутриклеточного образования УДФ-галактозы (УДФ-Gal). УДФ-галактоза требуется в качестве субстрата для галактозилтрансфераз, где активность указанных галактозилтрансфераз может приводить к образованию галактозилированных дисахаридов или галактозилированных олигосахаридов.

УДФ-галактоза может обеспечиваться встречающимся в природе метаболизмом микробных клеток, а именно, активностью фосфоглюкомутазы, катализирующей взаимопревращение глюкозо-1-фосфата и глюкозо-6-фосфата, УТФ (уридинтрифосфат)-глюкозо-1-фосфат-уридилтрансферазы, которая катализирует образование УДФ-глюкозы из глюкозо-1-фосфата и УТФ, и УДФ-глюкозо-4-эпимеразы, катализирующей обратимое превращение УДФ-глюкозы в УДФ-галактозу.

Внутриклеточная поставка УДФ-галактозы может быть улучшена посредством генной инженерии в том отношении, что один или более из генов, кодирующих фосфоглюкомутазу, УДФ-глюкозо-1-фосфат-уридилтрансферазу, УДФ-глюкозо-4-эпимеразу и их функциональные варианты, сверхэкспрессируются, и/или в том отношении, что одна или более дополнительных копий одного или более из генов, кодирующих фосфоглюкомутазу, УДФ-глюкозо-1-фосфат-уридилтранферазу, УДФ-глюкозо-4-эпимеразу и их функциональные варианты, экспрессируются в микробной клетке. Примером гена, кодирующего фосфоглюкомутазу, является ген pgm (№доступа NP_415214), обнаруженный в Е. coli K-12, примером гена, кодирующего УДФ-глюкозо-1-фосфат-уридилтранферазу, является ген Е, coli galU (№доступа NP_415752), обнаруженный в Е, coli K-12, и примером гена, кодирующего УДФ-глюкозо-4-эпимеразу, является ген Е, coli galE (NP_415280), обнаруженный в Е, coli K-12.

Термин «сверхэкспрессия» или «сверхэкспрессируемый», в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к уровню экспрессии фермента или полипептида, который выше, чем уровень, который измеряют в клетке-предшественнике дикого типа, а именно клетке того же вида, как и генетически сконструированная микробная клетка и клетка, которая не была генетически изменена.

Дополнительно и/или в качестве альтернативы, внутриклеточная поставка УДФ-галактозы может быть достигнута или улучшена подачей галактозы в микробные клетки посредством культуральной среды, в которой культивируют указанную микробную клетку. Подаваемая извне галактоза поглощается микробной клеткой и впоследствии фосфорилируется до галактозо-1-фосфата, который затем превращается в УДФ-галактозу. В данном пути биосинтеза ГДФ-галактозы гены, кодирующие ферменты, обладающие требуемыми ферментативными активностями, известны в литературе (Groissoird et al., «Characterization, Expression, and Mutation of the Lactococcus lactis galPMKTE Genes, Involved in Galactose Utilization via the Leloir Pathway» (2003) J. Bacteriol. 185(3) 870-878). Ген galP (№доступа NP_417418) кодирует галактозный-протонный симпортер. Ген galM (№доступа NP_415277) кодирует альдозо-1-эпимеразу, ген galK (№доступа NP_415278) - галактокиназу, ген galT (№досптупа NP_415279) - галактозо-1-фосфат-уридилтрансферазу и ген galE -УДФ-галактозо-4-эпимеразу.

Следовательно, биосинтез УДФ-галактозы может быть также восполнен в результате экспрессии генов, кодирующих галактозный-протонный симпортер, галактокиназу и галактозо-1-фосфат-уридилтрансферазу в микробной клетке или улучшен в результате сверхэкспрессии генов, кодирующих галактозно-протонный симпортер, галактокиназу и галактозо-1-фосфат-уридилтрансферазу в микробной клетке.

В еще одном воплощении в генетически сконструированной микробной клетке имеется путь биосинтеза ГДФ-фукозы для внутриклеточного образования ГДФ-L-фукозы (ГДФ-Fuc). ГДФ-Fuc представляет собой субстрат фукозилтрансферазы, и ферментативная активность фукозилтранефераз может приводить к образованию фукозилированных дисахаридов или фукозилированных олигосахаридов.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении в генетически сконструированной микробной клетке имеется путь биосинтеза ГДФ-L-фукозы, содержащий маннозо-6-фосфатизомеразу, фосфоманномутазу, манно-1-фосфат-гуанилилтрансферазу, ГДФ-маннозо-4,6-дегидратазу и ГДФ-L-фукозосинтазу.

Внутриклеточная поставка ГДФ-L-фукозы может быть улучшена посредством генной инженерии в том отношении, что один или более генов, кодирующих моннозо-6-фосфатизомеразу, фосфоманномутазу, маннозо-1-фосфат-гуанилилтрансферазу, ГДФ-маннозо-4,6-дегидратазу или ГДФ-1_-фукозосинтазу, сверхэкспрессируются и/или дополнительные копии одного или более генов, кодирующих маннозо-6-фосфатизомеразу, фосфоманномутазу, манно-1-фосфат-гуанилилтрансферазу, ГДФ-маннозо-4,6-дегидротазу и ГДФ-L-фукозосинтазу или их функциональные варианты, экспрессируются в микробной клетке. Примером гена, кодирующего маннозо-6-фосфатизомеразу, является ген Е. coli тапА (№доступа NP_416130), обнаруженный в Е. coli K-12, примером гена, кодирующего фосфоманномутазу, является ген Е. coli тапВ (№доступа NP_416552), обнаруженный в E.coli K-12, примером гена, кодирующего маннозо-1-фосфат-гуанилилтрансферазу, является ген E.coli тапС (№доступа NP_416553), обнаруженный в Е. coli K-12, примером гена, кодирующего ГДФ-маннозо-4,6-дегидратазу, является ген Е. coli gmd (№доступа NP_416557), обнаруженный в Е. coli K-12, и примером гена, кодирующего ГДФ-L-фукозосинтазу, является ген E.coli wcaG (№доступа NP_416556), обнаруженный в E.coli K-12.

Дополнительно и/или в качестве альтернативы, поставка ГДФ-L-фукозы может быть достигнута или улучшена посредством подачи L-фукозы в микробные клетки посредством культуральной среды, в которой культивируют указанную микробную клетку. Подаваемая извне L-фукоза поглощается микробной клеткой и сначала фосфорилируется до фукозо-1-фосфата под действием фермента фукозокиназа. Фукозо-1-фосфат впоследствии превращается в ГДФ-L-фукозу под действием ферментативной активности фермента фукозо-1-фосфатгуанилилтрансфераза. Гены, кодирующие ферменты, обладающие требуемыми ферментативными активностями, известны специалисту в данной области. Иллюстративно, ген fkp (№доступа WP_010993080), кодирующий бифункциональную L-фукокиназу/L-фукозо-1-фосфатгуанилилтрансферазу Bacteroides fragilis, может сверхэкспрессироваться в генетически сконструированной клетке-хозяине.

В еще одном воплощении в генетически сконструированной микробной клетке имеется путь биосинтеза УДФ-N-ацетилглюкозамина для внутриклеточного образования УДФ-N-ацетилглюкозамина (УДФ-GlcNAc), требуемого для реакций с N-ацетилглюкозаминилтрансферазой, приводящих к образованию N-ацетилглюкозаминилированных ди- или олигосахаридов.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении в генетически сконструированной микробной клетке имеется путь биосинтеза УДФ-N-ацетилглюкозамина, например, включающий L-глутамин:D-фуктозо-6-фосфатаминотрансферазу, фосфоглюкозаминмутазу и N-ацетилглюкозамин-1-фосфатуридилтрансферазу/глюкозамин-1-фосфатацетилтрансферазу.

Внутриклеточная подача УДФ-N-ацетилглюкозамина может быть улучшена посредством генетических модификаций, таких как экспрессия или сверхэкспрессия одного или более генов, кодирующих полипептиды, демонстрирующие L-глутамин:D-фуктозо-6-фосфатаминотрансферазную активность (например, ген Е. coli K-12 glmS (№доступа NP_418185)), фосфоглюкозаминомутазную активность (например, ген Е. coli K-12 glmM (№доступа NP_417643)) и N-ацетилглюкозамин-1-фосфатуридилтрансферазную/глюкозамин-1-фосфатацетилтрансферазную активность (например, ген Е, coli K-12 glmU (номер доступа NP_418186)), или их варианты.

В еще одном воплощении в генетически сконструированной микробной клетке имеется путь биосинтеза СМР-N-ацетилнейраминовой кислоты/СМР-сиаловой кислоты для внутриклеточного образования СМР-N-ацетилнейраминовой кислоты (CMP-Neu5Ac), требуемой для реакций с сиалилтрансферазой, приводящих, например, к образованию сиалилированных ди- или олигосахаридов.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении в генетически сконструированной микробной клетке имеется путь биосинтеза СМР-N-ацетилнейраминовой кислоты, например, включающий L-глутамин:D-фуктозо-6-фосфатаминотрансферазу, фосфоглюкозаминмутазу, N-ацетилглюкозамин-1-фосфатуридилтрансферазу/глюкозамин-1-фосфатацетилтрансферазу, УДФ-N-ацетилглюкозамин-2-эпимеразу, глюкозамин-6-фосфатацетилтрансферазу, N-ацетилглюкозамин-6-фосфатфосфатазу (предпочтительно, HAD-подобную сахарофосфатазу), N-ацетилглюкозамин-2-эпимеразу, синтазу сиаловой кислоты и синтетазу СМР-сиаловой кислоты.

Внутриклеточная подача СМР-N-ацетилнейраминовой кислоты может быть улучшена посредством генетических модификаций, таких как экспрессия или сверхэкспрессия одного или более генов, кодирующих полипептиды, демонстрирующие L-глутамин:D-фуктозо-6-фосфатаминотрансферазную активность (например, ген Е. coli K-12 glmS), фосфоглюкозаминмутазную активность (например, ген Е. coli K-12 glmM), N-ацетилглюкозамин-1-фосфатуридилтрансферазную/ глюкозамин-1-фосфатацетилтрансферазную активность (например, ген E.coli K-12 glmU), УДФ-N-ацетилглюкозамин-2-эпимеразную активность (например, ген Campylobacter jejuni neuC (№доступа AF305571)), глюкозамин-6-фосфатацетилтрансферазную активность (например, ген Saccharomyces cerevisiae дпа1 (№доступа NP_116637)), N-ацетилглюкозамин-6-фосфатфосфатазную активность (например, ген Е. coli K-12 yihX (№доступа NP_418321)), N-ацетилглюкозамин-2-эпимеразную активность (например, ген Synechocystis sp.РСС6803 slr1975 (№доступа BAL35720)), активность синтазы сиаловой кислоты (например, ген Campylobacter jejuni пеиВ (№доступа AF305571)) и активность синтетазы СМР-сиаловой кислоты (например, ген neuA Campylobacter jejuni (№доступа AF305571)), или их варианты.

Генетически сконструированная микробная клетка может дополнительно содержать гликозилтрансферазу. В предпочтительном воплощении по меньшей мере одна гликозилтрансфераза представляет собой фукозилтрансферазу, сиалилтрансферазу, глюкозаминилтрансферазу или галактозилтрансферазу, более предпочтительно, по меньшей мере одна гликозилтрансфераза демонстрирует (β-1,3-галактозилтрансферазную активность, (β-1,4-галактозилтрансферазную активность, β-1,6-галактозилтрансферазную активность, β-1,3-N-ацетилглюкозаминилтрансферазную активность, α-2,3-сиалилтрансферазную активность, α-2,6-сиалилтрансферазную активность, α-1,2-фукозилтрансферазную активность, α-1,3-фукозилтрансферазную активность, α-1,4-фукозилтрансферазную активность. Подходящие гликозилтрансферазы известны специалисту в данной области или могут быть найдены в литературе.

Обычно, и по всему объему настоящего раскрытия, термин «гликозилтрансферазная активность» или «гликозилтрансфераза» обозначает и охватывает ферменты, которые отвечают за биосинтез дисахаридов, олигосахаридов и полисахаридов, и они катализируют перенос группировок моносахарида от моносахарида/сахара, активированного нуклеотидом (например, УДФ-Glc, УДФ-Gal, ГДФ-Fuc, УДФ-GlcNAc, CMP-Neu5Ac), к молекуле - акцептору гликозила (например, моно-, ди- или олигосахаридам).

В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически сконструированная микробная клетка синтезирует больше фосфоенолпирувата (PEP), чем клетка дикого типа. В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически сконструированная микробная клетка генетически сконструирована таким образом, чтобы иметь путь усиленного биосинтеза PEP. Например, генетически сконструированная микробная клетка генетически сконструирована таким образом, чтобы обладать повышенной фосфоенолпируваткарбоксикиназной активностью, например, посредством сверхэкспрессии гена pckA Е. coli K-12 (№доступа NP_417862) или его функционального варианта. Предпочтительно, генетически сконструированная клетка-хозяин генетически сконструирована таким образом, чтобы иметь повышенную фосфоенолпируватсинтазную активность, например, в том отношении, что ген ppsA Е. coli K-12 (№доступа NP_416217), кодирующий фосфоенолпируватсинтазу, сверхэкспрессируется, и/или в том отношении, что не встречающиеся в природе микроорганизмы содержат по меньшей мере одну дополнительную копию нуклеотидной последовательности, делающую возможной экспрессию фосфоенолпируватсинтазы, или ее функциональный вариант. Сверхэкспрессия pckA или ppsA усиливает внутриклеточный синтез PEP таким образом, что доступно больше PEP, например, для продукции сиаловой кислоты

В дополнительном и/или альтернативном воплощении внутриклеточная РЕР-доступность генетически сконструированной клетки-хозяина может быть улучшена посредством уменьшения и/или ослабления активности импортера, зависимого от фосфоенолпируват:сахарофосфотрансферазы, требуемого для переноса определенного сахара (например, глюкозы), используемого в качестве источника углерода и энергии, из культуральной среды и клетку. Следовательно, для поддержания способности генетически сконструированной клетки-хозяина использовать указанный определенный сахар в качестве источника углерода и энергии, импортер, независимый от фосфоенолпируват:сахарофосфотрансферазы, нуждается в экспрессии или сверхэкспрессии. В дополнительном и/или альтернативном воплощении требуется экспрессия или сверхэкспрессия киназы, способной фосфорилировать указанный определенный сахар, или уменьшается и/или ослабляется для осуществления метаболизма указанного сахара или его накопления в нефосфорилированной форме в клетке, соответственно.

Импортер, зависимый от фосфоенолпируват:сахарофосфотрансферазы, или его компоненты, чья экспрессия и/или активность могли быть уменьшены и/или ослаблены в генетически сконструированной микробной клетке (например, Е. coli K-12), содержат по меньшей мере один, выбранный из группы, состоящей из генов глюкозо-PEP-PTS ptsG (№доступа NP_415619), malX (№доступа NP_416138), crr (№доступа NP_416912), bglF (№доступа NP_418178) и/или генов фруктозо-РЕР-PTS fruA (№доступа NP_416672), fruB (№доступа NP_416674), и/или генов маннозо-PEP-PTS тапХ (№доступа NP_416331), many (№доступа NP_416332), manZ (№доступа NP_416333) и/или гена N-ацетилглюкозамин-РЕР-PTS nagE (№доступа NP_415205).

Подходящий транспортер, независимый от PEP-PTS, или его варианты, способные переносить моносахариды (глюкозу и/или фруктозу и/или галактозу и/или N-ацетилглюкозамин и/или N-ацетилнейраминовую кислоту и/или фукозу) в микробную клетку, хорошо известны специалисту в данной области. Неограничивающими примерами генов, кодирующих указанный транспортер, независимый от PEP-PTS, являются galP Escherichia coli K-12 (SEQ ID NO. 1), glf Zymomonas mobilis (SEQ ID NO. 2), cscB Escherichia coli W (SEQ ID NO. 3), fupL Leuconostoc pseudomesenteroides (SEQ ID NO. 4), lacY Escherichia coli K-12 (SEQ ID NO. 5), fucP Escherichia coli K-12 (SEQ ID NO. 6), nanT Escherichia coli K-12 (SEQ ID NO. 7), nagP Xanthomonas campestris (SEQ ID NO. 8), glcP Bifidobacterium longum NCC2705 (SEQ ID NO. 9), glcP Bacillus subtilis (SEQ ID NO. 10), sgIS Vibrio parahaemolyticus (SEQ ID NO. 11), xylE Escherichia coli K-12 (SEQ ID NO. 12), araE Bacillus subtilis 168 (SEQ ID NO. 13). Таким образом, в дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически сконструированная клетка-хозяин содержит и экспрессирует по меньшей мере один ген, содержащий белок-кодирующую область упомянутых выше генов или их функциональных вариантов.

В предпочтительном воплощении подходящий транспортер глюкозы, не зависимый от PEP-PTS, представляет собой белок облегченной диффузии ссахара и/или пермеазу транслокации глюкозы. Подходящий белок облегченой диффузии глюкозы кодируется геном glf Zymomonas mobilis. Подходящая пермеаза транслокации глюкозы кодируется геном galP Е. coli K-12. Пермеаза транслокации глюкозы также известна как симпортер галактозы-протонов или пермеаза галактозы, но также импортирует глюкозу через клеточную мембрану.

В еще одном предпочтительном воплощении подходящий транспортер фруктозы, независимый от PEP-PTS, представляет собой белок облегченной диффузии сахара и/или белок-переносчик фруктозы. Подходящий белок облегченной диффузии фруктозы кодируется геном glf Zymomonas mobilis. Подходящий белок-переносчик фруктозы кодируется геном fupL Leuconostoc pseudomesenteroides.

Обычно, и на протяжении всего настоящего раскрытия, термины «повышенная внутриклеточная доступность сахарофосфата» или «повышенная/улучшенная поставка сахарофосфата» относятся к повышенной способности генетически модифицированной микробной клетки образовывать повышенные внутриклеточные количества указанного сахарофосфата, по сравнению с немодифицированной микробной клеткой, обеспечивающей повышенный поток углерода через путь биосинтеза требуемого углевода. Вследствие этого, повышенная продукция указанного требуемого углевода указанной генетически модифицированной микробной клеткой представляет собой прямой показатель повышенного внутриклеточного количества указанного сахарофосфата. Кроме того, способы, нацеленные на количественную оценку внутриклеточных метаболитов, и/или потока углерода клеток, могут быть найдены в литературе, известной специалисту в данной области (например, Lammerhofer and Weckwerth, «Metabolomics in Practice: Successful Strategies to Generate and Analyze Metabolic Data», Wiley-VCH, Weinheim, Germany (2013)).

В дополнительном и/или альтернативном воплощении экспрессия и/или активность генов и/или белков, соответственно, конкурирующих с биосинтезом требуемого углевода, может быть снижена или ослаблена в генетически сконструированной клетке-хозяине. Неограничивающие примеры таких противодействующих белков/активностей белков включают по меньшей мере один, выбранный из группы, состоящей из нижеследующего: р-галактозидаза (например, LacZ Е. coli K-12 (№доступа NP_414878)), УДФ-глюкозо:ундекапренилфосфатглюкозо-1-фосфаттрансфераза (например, WcaJ E.coli K-12 (№доступа NP_416551)), L-фукозоизомераза (например, Fucl Е. coli K-12), фукулокиназа (например, FucK Е. coli K-12 (№доступа NP_417282)), N-ацетилглюкозамин-6-фосфатдеацетилаза (например, NagA Е. coli K-12 (№доступа NP_415203)), глюкозамин-6-фосфатдезаминаза (например, NagB E.coli K-12 (№доступа NP_415204)), N-ацетилманнозаминкиназа (например, NanK E.coli K-12 (№доступа NP_417689)), N-ацетилманнозамин-6-фосфатэпимераза (например, NanE Е. coli K-12 (№доступа NP_417690)), альдолаза N-ацетилнейраминовой кислоты (например, NanA Е. coli K-12 (№доступа NP_417692)), пермеаза сиаловой кислоты (например, NanT Е. coli K-12 (№доступа NP_417691)).

В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически сконструированная микробная клетка способна метаболизировать сахарозу, таким образом, содержа один или более генов, кодирующих: (i) гетерологичную PTS-зависимую транспортную систему утилизации сахарозы (например, гены Klebsiella pneumoniae scrYAB (SEQ ID NO. 14) или гены scrYAB Salmonella typhimurium (SEQ ID NO. 15), состоящие из порина сахарозы (scrY), субъединицы II PTS транспортера, специфичного в отношении сахарозы (scrA), и сахарозо-6-фосфатгидролазы (scrB), и/или (ii) гетерологичную PTS-зависимую систему транспорта сахарозы (например, гены scrYA Klebsiella pneumoniae или гены scrYA Salmonella typhimurium) в комбинации с геном сахарозофосфатсинтазы (например, ген spsA Anabaena sp.РСС7120 (№доступа AJ302071)) и/или (iii) гетерологичную PTS-независимую систему утилизации сахарозы (например, гены Е. coli W cscBKA (SEQ ID NO. 16), состоящую из фруктокиназы (cscK), сахарозогидролазы (cscA) и сахарозопермеазы (cscB), и/или (iv) гетерологичную систему утилизации сахарозы, состоящую из гена сахарозопермеазы (например, Е. coli W cscB) в комбинации с геном сахарозофосфорилазы (например, ген basP Bifidobacterium adolescentis (№доступа WP_011742626)) или геном сахарозосинтазы (например, ген susA Anabaena sp, (№доступа САА09297)).

В дополнительном и/или альтернативном воплощении микробная клетка содержит белок-экспортер или пермеазу, экспортирующую целевой углевод из клетки, предпочтительно, эффлюксный транспортер сахара.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении клетка-хозяин представляет собой микробную клетку, предпочтительно, бактериальную клетку, выбранную из группы, состоящей из бактерий рода Escherichia, Lactobacillus, Corynebacterium, Bacillus, Streptococcus, Enterococcus, Lactococcus и Clostridium, предпочтительно, бактериальную клетку, которая выбрана из группы бактериальных видов, состоящих из Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum, Clostridium cellulolyticum, Clostridium ljungdahlii, Clostridium autoethanogenum, Clostridium acetobutylicum, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Lactobacillus casei, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii и Lactococcus lactis. В еще одном воплощении микробная клетка представляет собой Escherichia coli. Специалисту в данной области будет известно о дополнительных бактериальных штаммах при чтении настоящего раскрытия.

Согласно второму аспекту предложено применение генетически сконструированной клетки-хозяина, как описано в данном документе, для продукции требуемого углевода, где указанную клетку-хозяина культивируют в присутствии смеси моносахаридов, состоящей из глюкозы и по меньшей мере второго моносахарида группы фруктозы и галактозы. Указанная клетка генетически сконструирована таким образом, чтобы демонстрировать повышенную внутриклеточную доступность по меньшей мере одного сахарофосфата, релевантного в отношении продукции требуемого углевода. Указанный сахарофосфат может быть выбран из группы, состоящей из фосфоенолпирувата (PEP), дигидроксиацетонфосфата, фруктозо-6-фосфата, фруктозо-1-фосфата, фруктозо-1,6-бисфосфата, глюкозо-6-фосфата, глюкозо-1-фосфата, галактозо-1-фосфата, маннозо-1-фосфата, маннозо-6-фофата, глюкозамин-6-фосфата, глюкозамин-1-фосфата, N-ацетилглюкозамин-6-фосфата, N-ацетилглюкозамин-1-фосфата, N-ацетилманнозамин-6-фосфата, УДФ-глюкозы, УДФ-галактозы, СМР-N-ацетилнейраминовой кислоты, ГДФ-маннозы, ГДФ-фукозы и УДФ-N-ацетилглюкозамина.

Согласно третьему аспекту предложен способ ферментативного получения требуемого углевода, включающий следующие стадии:

a) предоставление генетически сконструированного микроорганизма, способного продуцировать требуемый углевод, где указанный микроорганизм демонстрирует повышенную внутриклеточную доступность по меньшей мере одного сахарофосфата за счет сниженной и/или ослабленной экспрессии и/или активности по меньшей мере одного белка, что приводит к потреблению указанного внутриклеточного сахарофосфата в указанном сконструированном микроорганизме;

b) культивирование указанного генетически сконструированного микроорганизма в культуральной среде, пермиссивной в отношении продукции указанного требуемого углевода, где основной источник углерода представляет собой смесь моносахаридов, состоящую из глюкозы и по меньшей мере второго моносахарида группы из фруктозы и галактозы;

c) выделение указанного требуемого сахарида из культурального бульона.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении целевой углевод представляет собой олигосахарид грудного молока или его строительный блок. Список целевых углеводов, которые могут быть продуцированы посредством использования генетически модифицированной микробной клетки и/или способа, как описано в данном документе, раскрыт в таблице 1. Предпочтительно, требуемый углевод выбран из группы, состоящей из 2'-фукозиллактозы, 3-фукозиллактозы, 2',3-дифукозиллактозы, 3'-сиалиллактозы, 6'-сиалиллактозы, 3-фукозил-3'-сиалиллактозы, лакто-N-тетраозы, лакто-N-неотетраозы, лакто-N-фукопентаозы I, лакто-N-фукопентаозы II, лакто-N-фукопентаозы III, лакто-N-фукопентаозы V, лакто-N-дифукозилгексозы I, лакто-N-дифукозилгексаозы II, лакто-N-сиалилпентаозы LSTa, LSTb, LSTc.

Предпочтительно, смесь глюкозы и по меньшей мере одного дополнительного моносахарида представляет собой смешанное сырье из глюкозы и фруктозы, предпочтительно полученное в результате гидролиза сахарозы.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении гидролиз сахарозы является неполным, таким образом, что существенные количества сахарозы остаются в сырье. Таким образом, количество сахарозы в гидролизованном и/или стерилизованном теплом сырье, больше чем 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% или больше чем 80%.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении микробная клетка культивируется без поставки извне акцепторного субстрата, например, N-ацетилглюкозамина или лактозы, в частности, при культивации для продукции целевого олигосахарида.

Настоящее изобретение будет описано относительно конкретных воплощений и со ссылкой на графические материалы, но данное изобретение не ограничивается ими, а только формулой изобретения. Кроме того, термины первый, второй и тому подобное в описании и в формуле изобретения используются для проведения различия между похожими элементами и не обязательно для описания последовательности, во времени, в пространстве, по рангу или любым другим образом. Следует понимать, что термины, используемые таким образом, являются взаимозаменяемыми в соответствующих обстоятельствах, и что воплощения изобретения, описанные в данном документе, способны работать в последовательностях, отличных от описанных или проиллюстрированных в данном документе.

Следует отметить, что термин «содержащий», используемый в формуле изобретения, не следует считать ограничивающимся средствами, перечисленными в дальнейшем; он не исключает других элементов или стадий. Таким образом, его следует считать определяющим наличие заявленных признаков, целых чисел, стадий или компонентов, на которые ссылаются, но он не исключает наличие или добавление одного или более других признаков, целых чисел, стадий или компонентов или их групп. Таким образом, объем выражения «устройство, содержащее средства А и В» не следует ограничивать устройствами, состоящими только из компонентов А и В. Оно означает, что в отношении настоящего изобретения, единственными релевантными компонентами устройства являются А и В.

Ссылка на всем протяжении данного описания изобретения на «одно воплощение» или «воплощение» означает, что конкретный признак, структура или характеристика, описанные в связи с данным воплощением, включены в по меньшей мере одно воплощение настоящего изобретения. Таким образом, появления фраз «в одном воплощении» или «в воплощении» в разных местах по всему объему данного описания изобретения не обязательно все относятся к одному и тому же воплощению, но могут. Кроме того, конкретные признаки, структуры или характеристики могут быть объединены любым подходящим образом, как будет очевидно среднему специалисту в данной области из данного раскрытия, в одном или более воплощениях.

Аналогично, следует понимать, что в описании иллюстративных воплощений изобретения разные признаки изобретения иногда сгруппированы вместе в одном единственном воплощении, фигуре или его описании в целях упрощения раскрытия и помощи в понимании одного или более из разных аспектов изобретения. Данный способ раскрытия, однако, не нужно считать отражающим мысль, что заявленное изобретение требует больше признаков, чем явным образом перечислены в каждом пункте. Скорее, как отражено в приведенной ниже формуле изобретения, аспекты изобретения заключаются меньше чем во всех признаках одного вышеизложенного раскрытого воплощения. Таким образом, формула изобретения после подробного описания явным образом включена тем самым в данное подробное описание, причем каждый пункт отдельно стоит в виде отдельного воплощения данного изобретения.

Кроме того, в то время как некоторые воплощения, описанные в данном документе, включают некоторые, но не все признаки, включенные в другие воплощения, подразумевается, что комбинации признаков разных воплощений находятся в объеме изобретения и образуют разные воплощения, как будет понятно специалистам в данной области. Например, в приведенной ниже формуле изобретения любое из заявленных воплощений можно использовать в любой комбинации.

Кроме того, некоторые из воплощений описаны в данном документе как способ или комбинация элементов способа, которые могут быть реализованы посредством процессора компьютерной системы или с помощью других средств выполнения функции. Таким образом, процессор с необходимыми инструкциями для осуществления такого способа или элемента способа образует средство осуществления способа или элемента способа. Кроме того, описанный в данном документе элемент воплощения аппарата представляет собой пример средства осуществления функции, выполняемой элементом, с целью осуществления изобретения.

В описании и графических материалах, предоставленных в данном документе, изложены многочисленные конкретные подробности. Однако, понятно, что воплощения изобретения можно осуществлять на практике без данных конкретных подробностей. В других примерах хорошо известные способы, структуры и методики не были показаны подробно для того, чтобы не затруднять понимание данного описания.

Сейчас изобретение будет описано посредством подробного описания нескольких воплощений изобретения. Ясно, что другие воплощения изобретения могут быть сконфигурированы в соответствии со знанием специалистов в данной области без отступления от истинной сущности или технической идеи изобретения, причем изобретение ограничивается только прилагаемой формулой изобретения.

В одном воплощении штамм Е. coli, имеющий генотип nagABE^-, manXYZ^-метаболически сконструирован как эффективный продуцент N-ацетилглюкозамина (GlcNAc) с использованием сырья из смеси моносахаридов (например, гидролизованной сахарозы) в качестве основного источника углерода и энергии. Таким образом, гетерологичная экспрессия гена, кодирующего глюкозамин-6-фосфатацетилтрансферазу, способную переносить ацетат с ацетил-СоА на глкозамин-6-фосфат, таким образом, образуя N-ацетилглюкзамин-6-фосфат, является необходимой. В предпочтительном воплощении данный штамм-продуцент дополнительно генетически конструируют посредством уменьшения и/или ослабления экспрессии генов фосфофруктокиназы pfkA и/или pfkB и/или гена глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы zwf. Данная дополнительная генетическая модификация делает возможной культивацию сконструированного штамма-продуцента на сырье из смеси моносахаридов (например, гидролизованной сахарозе) в качестве основного источника углерода и энергии, одновременно предотвращая угнетение метаболизма штамма, но повышая поставку предшественника (фруктозо-6-фосфат) для продукции N-ацетилглюкозамина. В дополнительном воплощении ген, кодирующий глутамин-фруктозо-6-фосфатаминотрансферазу (например, GlmS Е. coli), и/или ген, кодирующий HAD-подобную сахарофосфатазу (например, YihX Е. coli, YqaB Е. coli), способную дефосфорилировать N-ацетилглюкозамин-6-фосфат до N-ацетилглюкозамина, экспрессируется/сверхэкспрессируется для содействия синтезу GlcNAc.

В еще одном воплощении штамм Е. coli, имеющий генотип lacY⁺, lacZ^-, fucIK^-, wcaJ^-, метаболически сконструирован как эффективный продуцент L-фукозы с использованием сырья из смеси моносахаридов (например, гидролизованной сахарозы) в качестве основного источника углерода и энергии, а также лактозы в качестве акцепторного субстрата. Таким образом, необходима сверхэкспрессия по меньшей мере одного из генов Е. coli manA, manC, manB, gmd и wcaG, а также экспрессия гетерологичной α-1,2-фукозилтрансферазы, способной переносить фукозу с ГДФ-фукозы на лактозу, с образованием, таким образом, 2'-фукозиллактозы, и α-1,2-фукозидазы, способной высвобождать свободную L-фукозу из 2'-фукозиллактозы. В одном воплощении данный штамм-продуцент дополнительно конструируют посредством уменьшения и/или ослабления экспрессии генов фосфофруктокиназы pfkA и/или pfkB и/или гена глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы zwf. Данная дополнительная генетическая модификация делает возможной культивацию сконструированного штамма-продуцента на сырье из смеси моносахаридов (например, гидролизованной сахарозе) в качестве основного источника углерода и энергии, одновременно предотвращая угнетение метаболизма штамма, но повышая поставку предшественника (фруктозо-6-фосфат) для продукции L-фукозы.

В еще одном воплощении штамм Е. coli, имеющий генотип nanKETA^-, nagAB^-, метаболически сконструирован как эффективный продуцент N-ацетилнейраминовой кислоты (Neu5Ac) с использованием сырья из смеси моносахаридов (например, гидролизованной сахарозы) в качестве основного источника углерода и энергии. Таким образом, необходима сверхэкспрессия по меньшей мере одного из генов, кодирующих или (i) глюкозамин-6-фосфатацетилтрансферазу и N-ацетилглюкозамин-2-эпимеразу и синтетазу N-ацетилнейраминовой кислоты или (ii) УДФ-N-ацетилглюкозамин-2-эпимеразу и синтетазу N-ацетилнейраминовой кислоты. Поскольку синтез N-ацетилнейраминовой кислоты представляет собой процесс, зависимый от фосфоенолпирувата (PEP), предпочтительно избегать конкурирующих реакций, приводящих к потреблению PEP. Таким образом, в предпочтительном воплощении данный штамм-продуцент дополнительно конструируют посредством уменьшения и/или ослабления импортирования указанного(ых) источника(ов) углерода и энергии за счет механизма, зависимого от фосфоенолпируват:сахарофосфотрансферазы, например, посредством уменьшения и/или ослабления экспрессии гена глюкозо-РЕР-пермеазы ptsG и/или гена фруктозо-РЕР-пермеазы fruA и/или генов маннозо-РЕР-пермеазы manXYZ. Наряду с экспрессией/сверхэкспрессией по меньшей мере одного гена, кодирующего транспортер, независимый от фосфоенолпируват:сахарофосфотрансферазы (независимый от PEP-PTS), обеспечивающий перенос моносахарида(ов) в сконструированную клетку, а также фруктокиназу (например, ген cscK Е. coli W) и глюкокиназу (например, ген glk Е, coli K-12), способную активировать фруктозу до фруктозо-6-фосфата и глюкозу до глюкозо-6-фосфата, соответственно, данная дополнительная генетическая модификация позволяет культивировать сконструированный штамм-продуцент на сырье из смеси моносахаридов (например, гидролизованной сахарозе) в качестве главного источника углерода и энергии, одновременно предотвращая угнетение метаболизма штамма, но увеличивая поставку предшественника (фруктозо-6-фосфата, фосфоенолпирувата) для продукции N-ацетилнейраминовой кислоты.

В еще одном воплощении штамм Е. coli, имеющий генотип nagABE^-, manXYZ^-, lacZ^-, метаболически сконструирован как эффективный продуцент N-ацетиллактозамина (LacNAc) с использованием сырья из смеси моносахаридов (например, гидролизованной сахарозы) в качестве основного источника углерода и энергии, а также GlcNAc в качестве акцепторного субстрата. Таким образом, необходима экспрессия/сверхэкспрессия генов, кодирующих глюкозамин-6-фосфатацетилтрансферазу, транспортер, независимый от фосфоенолпируват:сахарофосфотрансферазы, способный переносить N-ацетил-глюкозамин в клетку, и β-1,4-галактозилтрансферазу, способную переносить галактозу из УДФ-Gal на свободный N-ацетилглюкозамин, с образованием, таким образом, N-ацетиллактозамина. В предпочтительном воплощении данный штамм-продуцент дополнительно генетически конструируют посредством уменьшения и/или ослабления экспрессии генов фосфофруктокиназы pfkA и/или pfkB и/или гена глюкозо-6-фосфатизомеразы pgi и/или гена глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы zwf. Данная дополнительная генетическая модификация обеспечивает культивирование сконструированного штамма-продуцента на сырье из смеси моносахаридов (например, гидролизованной сахарозе) в качестве основного источника углерода и энергии, одновременно предотвращая угнетение метаболизма штамма, но увеличивая поставку предшественника (глюкозо-6-фосфат) для продукции N-ацетиллактозамина. В дополнительном воплощении по меньшей мере один из генов Е. coli pgm, galU и galE сверхэкспрессируется для содействия синтезу УДФ-Gal.

В еще одном воплощении штамм Е. coli, имеющий генотип nagAB^-, метаболически сконструирован как эффективный продуцент лакто-N-биозы (LNB) посредством общей ферментации с использованием сырья из смеси моносахаридов (например, гидролизованной сахарозы) в качестве основного источника углерода и энергии. Таким образом, необходима экспрессия/сверхэкспрессия генов, кодирующих глюкозамин-6-фосфатацетилтрансферазу, способную переносить ацетат с ацетил-КоА на глюкозамин-6-фосфат, таким образом, образуя N-ацетилглюкозамин-6-фосфат, HAD-подобную сахарофосфатазу, способную дефосфорилировать N-ацетилглюкозамин-6-фосфат, таким образом, образуя N-ацетилглюкозамин, и β-1,3-галактозилтрансферазу, способную переносить галактозу с УДФ-Gal на свободный N-ацетилглюкозамин, таким образом, образуя лакто-N-биозу. В одном предпочтительном воплощении данный штамм-продуцент дополнительно генетически сконструирован посредством уменьшения и/или ослабления экспрессии генов фосфофруктокиназы pfkA и/или pfkB и/или гена глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы zwf. Данная дополнительная генетическая модификация позволяет культивировать сконструированный штамм-продуцент на смешанном сырье из моносахаридов (например, гидролизованной сахарозе) в качестве основного источника углерода и энергии, одновременно предотвращая угнетение метаболизма штамма, но увеличивая поставку предшественника (фруктозо-6-фосфата и глюкозо-6-фосфата) для продукции лакто-N-биозы. В дополнительном воплощении по меньшей мере один из генов Е. coli glmS, pgm, galU, galE сверхэкспрессируется для содействия синтезу GlcNAc и/или УДФ-Gal.

В еще одном воплощении штамм Е. coli, имеющий генотип lacY⁺, lacZ^-, nanKETA^-, nagAB^-, метаболически сконструирован как эффективный продуцент 3'-сиалиллактозы с использованием сырья из смеси моносахаридов (например, гидролизованной сахарозы) в качестве основного источника углерода и энергии, а также лактозы в качестве акцепторного субстрата. Таким образом, штамм-продуцент N-ацетилнейраминовой кислоты, как описано, генетически сконструирован посредством экспрессии гетерологичной синтетазы CMP-N-ацетилнейраминовой кислоты, синтазы N-ацетилнейраминовой кислоты и α-2,3-сиалилтрансферазы, способной переносить N-ацетилнейраминовую кислоту с СМР-Neu5Ac на лактозу, образуя, таким образом, 3'-сиалиллактозу. Что касается синтеза N-ацетилнейраминовой кислоты, продукция 3'-SL представляет собой процесс, зависимый от фосфоенолпирувата (PEP). Таким образом, в предпочтительном воплощении указанный штамм-продуцент 3'-SL дополнительно сконструирован посредством уменьшения и/или ослабления импортирования указанного(ых) источника(ов) углерода и энергии за счет механизма, зависимого от фосфоенолпируват:сахарофосфотрансферазы, например, посредством уменьшения и/или ослабления экспрессии гена глюкозо-РЕР-пермеазы ptsG и/или гена фруктозо-РЕР-пермеазы fruA и/или генов маннозо-РЕР-пермеазы manXYZ. Наряду с экспрессией/сверхэкспрессией по меньшей мере одного гена, кодирующего транспортер, независимый от фосфоенолпируват:сахарофосфотрансферазы (независимый от PEP-PTS), обеспечивающий перенос моносахарида(ов) в сконструированную клетку, а также фруктокиназу (например, ген cscK Е. coli W) и глюкокиназу (например, ген glk Е. coli K-12), способную активировать фруктозу до фруктозо-6-фосфата и глюкозу до глюкозо-6-фосфата, соответственно, данная дополнительная генетическая модификация позволяет культивировать сконструированный штамм-продуцент на сырье из смеси моносахаридов (например, гидролизованной сахарозе) в качестве главного источника углерода и энергии, одновременно предотвращая угнетение метаболизма штамма, но увеличивая поставку предшественника (фруктозо-6-фосфата, фосфоенолпирувата) для продукции 3'-сиалиллактозы.

В еще одном воплощении штамм Е. coli, имеющий генотип acY⁺, lacZ^-, fuclK^-, wcaJ^-, метаболически сконструирован как эффективный продуцент 3'-фукозиллактозы с использованием сырья из смеси моносахаридов (например, гидролизованная сахароза) в качестве основного источника углерода и энергии, а также лактозы в качестве акцепторного субстрата. Таким образом, необходима сверхэкспрессия по меньшей мере одного из генов Е. coli manA, manC, manB, gmd и wcaG, а также экспрессия гетерологичной α-1,3-фукозилтрансферазы, способной переносить фукозу с ГДФ-фукозы на лактозу, таким образом, с образованием 3-фукозиллактозы. В одном предпочтительном воплощении данный штамм-продуцент дополнительно генетически сконструирован посредством уменьшения и/или ослабления экспрессии генов фосфофруктокиназы pfkA и/или pfkB и/или гена глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы zwf. Данная дополнительная генетическая модификация позволяет культивировать сконструированный штамм-продуцент на сырье из смеси моносахаридов (например, гидролизованной сахарозе) в качестве основного источника углерода и энергии, одновременно предотвращая угнетение метаболизма штамма, но увеличивая поставку предшественника (фруктозо-6-фосфат) для продукции 3-фукозиллактозы.

В еще одном воплощении штамм Е. coli, имеющий генотип acY⁺, lacZ^-, nagB, wcaJ^-, метаболически сконструирован для эффективной продукции лакто-N-триозы II (LNT-II) с использованием сырья из смеси моносахаридов (например, гидролизованной сахарозы) в качестве основного источника углерода и энергии, а также лактозы в качестве акцепторного субстрата. Таким образом, необходима экспрессия гетерологичной β-1,3-N-ацетилглюкозаминилтрансферазы, способной переносить N-ацетилглюкозамин с УДФ-GlcNAc на лактозу, таким образом, с образованием лакто-N-триозы II. В одном предпочтительном воплощении данный штамм-продуцент дополнительно генетически сконструирован посредством уменьшения и/или ослабления экспрессии генов фосфофруктокиназы pfkA и/или pfkB и/или гена глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы zwf. Данная дополнительная генетическая модификация позволяет культивировать сконструированный штамм-продуцент на сырье из смеси моносахаридов (например, гидролизованной сахарозе) в качестве основного источника углерода и энергии, одновременно предотвращая угнетение метаболизма штамма, но увеличивая поставку предшественника (фруктозо-6-фосфат) для продукции лакто-N-триозы II. В дополнительном воплощении один из генов Е. coli glmS, glmU и glmM сверхэкспрессируется для содействия синтезу УДФ-GlcNAc.

В еще одном воплощении штамм Е. coli, имеющий генотип lacY⁺, lacZ^-, nagB^-, wcaJ^-, метаболически сконструирован в качестве эффективного продуцента лакто-N-тетраозы (LNT) с использованием сырья из смеси моносахаридов (например, гидролизованной сахарозы) в качестве основного источника углерода и энергии, а также лактозы в качестве акцепторного субстрата. Таким образом, необходима экспрессия гетерологичной β-1,3-N-ацетилглюкозаминилтрансферазы, способной переносить N-ацетилглюкозамин с УДФ-GlcNAc на лактозу, и β-1,3-галактозилтрансферазы, способной переносить галактозу с УДФ-галактозы на лакто-N-триозу II, с образованием, таким образом, лакто-N-тетраозы. В одном предпочтительном воплощении данный штамм-продуцент дополнительно генетически сконструирован посредством уменьшения и/или ослабления экспрессии генов фосфофруктокиназы pfkA и/или pfkB и/или гена глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы zwf и/или гена глюкозо-6-фосфатизомеразы pgi. Данная дополнительная генетическая модификация позволяет культивировать сконструированный штамм-продуцент на сырье из смеси моносахаридов (например, гидролизованной сахарозе) в качестве основного источника углерода и энергии, одновременно предотвращая угнетение метаболизма штамма, но увеличивая поставку предшественника (фруктозо-6-фосфат и глюкозо-6-фосфат) для продукции лакто-N-тетраозы. В дополнительном воплощении по меньшей мере один из генов Е. coli glmS, glmU, glmM, pgm, galU и galE сверхэкспрессируется для содействия синтезу УДФ-GlcNAc и/или УДФ-Gal.

В еще одном воплощении штамм Е. coli, имеющий генотип lacY⁺, lacZ^-, nagB^-, wcaJ^-, метаболически сконструирован для эффективной продукции лакто-N-неотетраозы (LNnT) посредством общей ферментации с использованием сырья из смеси моносахаридов (например, гидролизованной сахарозы) в качестве основного источника углерода и энергии. Таким образом, штамм-продуцент LNnT генетически сконструирован посредством уменьшения и/или ослабления импортирования глюкозы за счет механизма, зависимого от фосфоенолпируват:сахарофосфотрансферазы, например, посредством уменьшения и/или ослабления экспрессии гена глюкозо-РЕР-пермеазы ptsG при одновременной экспрессии по меньшей мере одного гена, кодирующего транспортер, независимый от фосфоенолпируват:сахарофосфотрансферазы (независимый от PEP-PTS), обеспечивающий перенос глюкозы в сконструированную клетку. Кроме того, уровень экспрессии гена глюкокиназы glk и/или гена глюкозодегидрогеназы gcd снижен и/или аннулирован. По существу, необходима гетерологичная экспрессия (β-1,4-галктозилтрансферазы, способной переносить галактозу с УДФ-галактозы на глюкозу, с образованием, таким образом, лактозы, и β-1,3-N-ацетилглюкозаминилтрансферазы, способной переносить N-ацетилглюкозамин с УДФ-GlcNAc на лактозу, таким образом, с образованием лакто-N-триозы II, и β-1,4-галактозилтрансферазы, способной переносить галактозу с УДФ-галактозы на лакто-N-триозу II, с образованием, таким образом, лакто-N-неотетраозы. В одном предпочтительном воплощении данный штамм-продуцент дополнительно генетически сконструирован посредством уменьшения и/или ослабления экспрессии генов фосфофруктокиназы pfkA и/или pfkB и/или гена глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы zwf и/или гена глюкозо-6-фосфатизомеразы pgi. Данная дополнительная генетическая модификация позволяет культивировать сконструированный штамм-продуцент на сырье из смеси моносахаридов (например, гидролизованной сахарозе) в качестве основного источника углерода и энергии, одновременно предотвращая угнетение метаболизма штамма, но увеличивая поставку предшественника (глюкоза и фруктозо-6-фосфат и глюкозо-6-фосфат) для продукции лакто-N-неотетраозы посредством общей ферментации. В дополнительном воплощении по меньшей мере один из генов Е. coli glmS, glmU, glmM, pgm, galU и galE сверхэкспрессируется для содействия синтезу УДФ-GlcNAc и/или УДФ-Gal.

В еще одном воплощении штамм Е. coli, имеющий генотип lacY^-, lacZ^-, fuclK^-, wcaJ^-, метаболически сконструирован для эффективной продукции 2'-фукозиллактозы посредством общей ферментации с использованием сырья из смеси моносахаридов (например, гидролизованной сахарозы) в качестве основного источника углерода и энергии. Таким образом, уровень экспрессии гена глюкокиназы glk и/или гена глюкозодегидрогеназы gcd, а также активность механизма, зависимого от фосфоенолпируват:люкозофосфотрансферазы, снижен и/или аннулирован. Кроме того, ген транспортера, независимого от фосфоенолпируват:сахарофосфотрансферазы (независимый от PEP-PTS), экспрессируется или сверхэкспрессируется в указанном штамме Е. coli. Кроме того, по меньшей мере один из генов Е. coli manA, manC, manB, gmd, wcaG, pgm, galU и gale, а также гетерологичная β-1,4-галактозилтранфераза, способная переносить галактозу с УДФ-галактозы на глюкозу, с образованием, таким образом, лактозы, и α-1,2-фукозилтрансфераза, способная переносить фукозу с ГДФ-фукозы на лактозу, с образованием, таким образом, 2'-фукозиллактозы, экспрессируются/сверхэкспрессируются. В предпочтительном воплощении данный штамм-продуцент дополнительно сконструирован посредством уменьшения и/или ослабления экспрессии генов фосфофруктокиназы pfkA и/или pfkB и/или гена глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы zwf и/или гена глюкозо-6-фосфатизомеразы pgi. Данная дополнительная генетическая модификация позволяет культивировать сконструированный штамм-продуцент на сырье из смеси моносахаридов (например, гидролизованной сахарозе) в качестве основного источника углерода и энергии, одновременно предотвращая угнетение метаболизма штамма, но увеличивая поставку предшественника (глюкоза и фруктозо-6-фосфат и глюкозо-6-фосфат) для продукции 2'-фукозиллактозы посредством общей ферментации.

В еще одном воплощении штамм Е. coli, имеющий генотип lacY⁺, lacZ^-, fuclK^-, wcaJ^- manA^-, метаболически сконструирован в качестве эффективного продуцента 2'3-дифукозиллактозы с использованием сырья из смеси моносахаридов (например, гидролизованной сахарозы) в качестве основного источника углерода и энергии, а также лактозы в качестве акцепторного субстрата. Таким образом, необходима экспрессия генов, демонстрирующих фруктокиназную активность (например, ген так Е. coli K-12) и активность механизма, зависимого от фосфоенолпируват:фруктозофосфотрансферазы, снижена и/или аннулирована. Данная клетка дополнительно генетически сконструирована посредством экспрессии/сверхэкспрессии по меньшей мере одного гена, кодирующего транспортер, независимый от фосфоенолпируват:фруктозофосфотрансферазы (независимый от PEP-PTS), обеспечивающий перенос фруктозы в сконструированную клетку, маннозоизомеразу, способную превращать фруктозу в маннозу (например, yihS Е. coli BL21, manl Agrobacterium radiobacter М-1), маннокиназу (например, manK Prevotella bryantii В₁4, manK Arthrobacter sp.штамм KM), способную активировать маннозу до маннозо-6-фосфата, а также по меньшей мере одну гетерологичную фукозилтрансферазу, демонстрирующую α-1,2- и/или α-1,3-фукозилтрансферазную активность, способную переносить фукозу с ГДФ-фукозы на лактозу и/или 2'-фукозиллактозу и/или 3-фукозиллактозу, таким образом, образуя 2'3-дифукозиллактозу. Данные дополнительные генетические модификации делают возможной культивацию сконструированного штамма-продуцента на сырье из смеси моносахаридов (например, гидролизованной сахарозе) в качестве основного источника углерода и энергии, одновременно предотвращая угнетение метаболизма штамма, но увеличивая поставку предшественника (маннозу/маннозо-6-фосфата) для продукции 2'3-дифукозиллактозы. В дополнительном воплощении сверхэкспрессия по меньшей мере одного из генов Е. coli manC, manB, gmd и wcaG сверхэкспрессируется для содействия синтезу ГДФ-Fuc.

Неограничивающие примеры для подходящих белков, демонстрирующих маннозоизомеразную активность (Manl) или маннокиназную активность (ManK), могут быть обнаружены в литературе (Hirose et al., Biosci Biotechnol Biochem. 2001 Mar;65(3):658-61; Hirose et al., Biotechnol Lett. 2003 Feb;25(4):349-52; Patel et al., Appl Environ Microbiol. 2011 May;77(10):3343-50; Hu et al., Int J Biol Macromol. 2016 Aug;89:328-35; Huang et al., Appl Microbiol Biotechnol. 2018 Mar;102(5):2051-2062; Mukai et al., Appl Environ Microbiol. 2003 Jul;69(7):3849-57; Fields and Russel, Microbiology. 2001 Apr;147(Pt 4):1035-43; Kroschewski et al., Mol Biochem Parasitol. 2000 Jan 5;105(1):71-80.).

В еще одном воплощении штамм Е. coli, имеющий генотип nagAB^-, fuclK^-, wcaJ, метаболически сконструирован в качестве эффективного продуцента Н-антигена I типа (НА-Т I) посредством общей ферментации с использованием сырья из смеси моносахаридов (например, смеси гидролизованной сахарозы и гидролизованной лактозы) в качестве основного источника углерода и энергии. Таким образом, штамм-продуцент генетически сконструирован посредством уменьшения и/или ослабления импортирования глюкозы за счет механизма, зависимого от фосфоенолпируват:сахарофосфотрансферазы, одновременно с экспрессией/сверхэкспрессией по меньшей мере одного гена, кодирующего транспортер, независимый от PEP-PTS, а также моносахаридкиназу, делающую возможным перенос глюкозы и/или галактозы в сконструированную клетку, а также активирующую данные моносахариды в фосфорилированную форму, соответственно. Кроме того, по меньшей мере экспрессируется/сверхэкспрессируется один ген, кодирующий глюкозамин-6-фосфатацетилтрансферазу, способную переносить ацетат с ацетил-КоА на глюкозамин-6-фосфат, с образованием, таким образом, N-ацетилглюкозамин-6-фосфата, HAD-подобную сахарофосфатазу, способную дефосфорилировать N-ацетилглюкозамин-6-фосфат, с образованием, таким образом, N-ацетилглюкозамина, гетерологичную β-1,3-галактозилтранферазу, способную переносить галактозу с УДФ-галактозы на N-ацетилглюкозамин, с образованием, таким образом, лакто-N-биозы, и α-1,2-фукозилтрансферазу, способную переносить фукозу с ГДФ-фукозы на лакто-N-биозу, с образованием Н-антигена I типа. В предпочтительном воплощении данный штамм-продуцент дополнительно генетически конструируют посредством уменьшения и/или ослабления экспрессии генов фосфофруктокиназы pfkA и/или pfkB. Данные генетические модификации обеспечивает культивирование сконструированного штамма-продуцента на сырье из смеси моносахаридов (например, смесь гидролизованной сахарозы и гидролизованной лактозы) в качестве основного источника углерода и энергии, одновременно предотвращая угнетение метаболизма штамма, но увеличивая поставку предшественника (N-ацетилглюкозамин, фруктозо-6-фосфат и галактозо-1-фосфат) для продукции Н-антигена I типа. В дополнительном воплощении по меньшей мере один из генов Е. coli glmS, galT, galE, manC, manB, gmd и wcaG сверхэкспрессируется для содействия синтезу GlcNAc и/или УДФ-Gal и/или ГДФ-Fuc.

В отношении Фиг. 1, схематично показана типичная природная микробная клетка. Указанная микробная клетка способна потреблять смешанное сырье, состоящее из глюкозы и фруктозы, что приводит к получению незначительного внутриклеточного пула глюкозо-6-фосфата и фруктозо-6-фосфата. Микробная клетка экспрессирует полинуклеотиды, кодирующие фосфоенолпируват:сахарофосфотрансферазные системы для импортирования глюкозы и фруктозы (PTS) в клетку. Продукты реакции главным образом поступают в гликолиз.

На Фиг. 2 схематично изображена типичная микробная клетка по изобретению, способная поставлять глюкозо-6-фосфат в высокой степени при культивировании на смешанном сырье, состоящем из глюкозы и фруктозы. Поскольку экспрессия глюкозо-6-фосфатизомеразы Pgi и/или глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы Zwf уменьшалась или снизилась в результате делеции, функциональной инактивации или сайленсинга гена(ов) pgi и/или zwf, любой глюкозо-6-фосфат, образованный посредством импортирования глюкозы в клетку, может быть использован микробной клеткой для образования УДФ-Glc и/или УДФ-Gal. В одном варианте микробной клетки (Фиг. 3) фосфоенолпируват:сахарофосфотрансферазная(ые) система(ы) для фруктозы блокирована(ы), например, посредством делеции гена fruA. Вместо этого, фруктоза поступает в клетку посредством транспортера, независимого от фосфоенолпируват:сахарофосфотрансферазы (не зависимый от PEP-PTS), становясь активированной под действием фруктокиназы (например, CscK E.coli W) до фруктозо-6-фосфата. В одном варианте микробной клетки (Фиг. 4) фосфоенолпируват:сахарофосфотрансферазная(ые) система(ы) клетки для глюкозы также блокирована(ы), например, в результате делеции гена ptsG. Вместо этого, глюкоза поступает в клетку через транспортер, независимый от фосфоенолпируват:сахарофосфотрансферазы (независимый от PEP-PTS), активируясь под действием глюкокиназы (например, Glk Е. coli K-12) до глюкозо-6-фосфата.

На Фиг. 5 схематично изображена типичная микробная клетка по изобретению, способная поставлять глюкозо-6-фосфат и фруктозо-6-фосфат в более высокой степени, при культивировании на смешанном сырье, состоящем из глюкозы и фруктозы. Фосфоенолпируват:сахарофосфотрансферазная(ые) система(ы) клетки для фруктозы блокирована(ы), например, в результате делеции гена fruA. Вместо этого, фруктоза поступает в клетку через транспортер, независимый от фосфоенолпируват:сахарофосфотрансферазы (незавсимый от PEP-PTS), активируясь под действием фруктокиназы (например, CscK Е. coli W) до фруктозо-6-фосфата. В одном варианте микробной клетки (Фиг. 6), экспрессия фосфофруктокиназы(аз) Pfk и/или глюкозо-6-фосфатдегирогеназы Zwf уменьшена или ослаблена посредством делеции, функциональной инактивации или сайленсинга гена(ов) pfkA и/или pfkB и/или zwf, что приводит к повышенной доступности глюкозо-6-фосфата и фруктозо-6-фосфата, которые могут использоваться микробной клеткой для образования УДФ-Gal и/или ГДФ-Fuc и/или УДФ-GlcNAc и/или CMP-Neu5Ac. В одном варианте микробной клетки (Фиг. 7), клетка экспрессирует полинуклеотиды, кодирующие фосфоенолпируват:сахарофосфотрансферазные системы для имортирования глюкозы и фруктозы (PTS) в клетку. Экспрессия фосфофруктокиназы(аз) Pfk и/или глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы Zwf уменьшена или ослаблена посредством делеции, функциональной инактивации или сайленсинга гена(ов) pfkA и/или pfkB и/или zwf, что приводит к повышенной доступности глюкозо-6-фосфата и фруктозо-6-фосфата.

На Фиг. 8 схематично изображена типичная микробная клетка по изобретению, способная поставлять глюкозо-6-фосфат и фруктозо-6-фосфат в более высокой степени при культивировании на смешанном сырье, состоящем из глюкозы и фруктозы. Клетка экспрессирует полинуклеотиды, кодирующие фосфоенолпируват:сахарофосфотрансферазные системы для импортирования глюкозы и фруктозы (PTS) в клетку. Экспрессия фосфофруктокиназы(аз) Pfk и/или глюкозо-6-фосфатизомеразы Pgi и/или глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы Zwf уменьшена или ослаблена посредством делеции, функциональной инактивации или сайленсинга гена(ов) pfkA и/или pfkB и/или pgi и/или zwf. Вместе со сверхэкспрессией фруктозо-1,6-бисфосфатазы (например, glpX, fbp) образуется повышенная доступность глюкозо-6-фосфата и фруктозо-6-фосфата, и она может быть использована микробной клеткой для образования УДФ-Gal и/или ГДФ-Fuc и/или УДФ-GlcNAc и/или CMP-Neu5Ac.

На Фиг. 9 схематично изображена типичная микробная клетка по изобретению, способная генерировать высокую доступность глюкозо-6-фосфата и фруктозо-6-фосфата и фосфоенолпирувата при культивации на смешанном сырье, состоящем из глюкозы и фруктозы.

Фосфоенолпируват:сахарофосфотрансферазные системы клетки для глюкозы и фруктозы блокированы, например, посредством делеции генов ptsG и fruA, соответственно. Вместо этого, фруктоза и глюкоза поступают в клетку посредством транспортера, независимого от фосфоенолпируват:сахарофосфотрансферазы (не зависимого от PEP-PTS), активируемые под действием фруктокиназы (например, CscK Е. coli W) и глюкокиназы (например, Glk Е. coli K12), до фруктозо-6-фосфата и глюкозо-6-фосфата, соответственно. Кроме того, обходят потребление PEP фосфоенолпируват:сахарофосфотрансферазными системами. Наряду со сниженной и/или ослабленной экспрессией фосфофруктокиназы(аз) Pfk и/или глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы Zwf, реализуемой посредством делеции, функциональной инактивации или сайленсинга гена(ов) pfkA и/или pfkB и/или zwf, достигается повышенная доступность глюкозо-6-фосфата и фруктозо-6-фосфата и фосфоенолпирувата. Это может быть использовано микробной клеткой для образования УДФ-Gal и/или ГДФ-Fuc и/или УДФ-GlcNAc и/или CMP-Neu5Ac.

На Фиг. 10 схематично изображена еще одна типичная микробная клетка по изобретению, способная образовывать повышенную доступность свободной глюкозы и глюкозо-6-фофата и фруктозо-6-фосфата при культивации на смешанном сырье, состоящем из глюкозы и фруктозы.

Фосфоенолпируват:сахарофосфотрансферазные системы клетки для глюкозы и фруктозы блокированы, например, посредством делеции генов ptsG и fruA, соответственно. Вместо этого, фруктоза и глюкоза поступают в клетку посредством транспортера, независимого от фосфоенолпируват:сахарофосфотрансферазы (не зависимого от PEP-PTS). Наряду с делецией гена glk, микробная клетка генетически сконструирована таким образом, что свободный мономер-глюкоза становится доступным в клетке. Вместо этого, фруктоза активируется фруктокиназой (например, CscK Е. coli W) до фруктозо-6-фосфата. Экспрессия фосфофруктокиназы(аз) Pfk и/или глюкозо-6-фософатдегидрогеназы Zwf уменьшена или снижена посредством делеции, функциональной инактивации или сайленсинга гена(ов) pfkA и/или pfkB и/или zwf. В итоге, это приводит к улучшенной внутриклеточной поставке свободной глюкозы и глюкозо-6-фосфата и фруктозо-6-фосфата. Глюкоза становится доступной в качестве субстрата для различных реакций гликозилирования, тогда как глюкозо-6-фосфат и фруктозо-6-фосфат могут быть использованы микробной клеткой для образования УДФ-Gal и/или ГДФ-Fuc и/или УДФ-GlcNAc и/или CMP-Neu5Ac. Кроме того, обходят потребление PEP фосфоенолпируват:сахарофосфотрансферазными системами.

На Фиг. 11 схематично изображена еще одна типичная микробная клетка по изобретению, способная достигать повышенную внутриклеточную доступность свободной маннозы и/или маннозо-6-фосфата при культивации на смешанном сырье, состоящем из глюкозы и фруктозы.

Фосфоенолпируват:сахарофосфотрансферазные системы клетки для фруктозы блокированы, например, в результате делеции гена fruA и/или генов manXYZ. Вместо этого, фруктоза поступает в клетку посредством сахаропермеазы и/или канала. Наряду с делецией генов, демонтсрирующих фруктокиназную активность (например, так) и/или маннозо-6-фосфатизомеразную активность (например, manA), а также экспрессией/сверхэкспрессией подходящей маннозоизомеразы (ManI) и маннокиназы (ManK), микробная клетка генетически сконструирована таким образом, что маннозо-6-фосфат становится доступным в клетке. Данный маннозо-6-фосфат может быть использован микробной клеткой для образования ГДФ-Мап и/или ГДФ-Fuc.

На Фиг. 12 схематично изображена еще одна типичная микробная клетка по изобретению, способная образовывать более высокую внутриклеточную доступность свободного фруктозо-6-фосфата и/или галактозо-1-фосфата при культивировании на смешанном сырье, состоящем из глюкозы и фруктозы и галактозы. Фосфоенолпируват:сахарофосфотрансферазные системы клетки для глюкозы блокированы, например, посредством делеции гена ptsG. Вместо этого, глюкоза поступает в клетку посредством транспортера, неависимого от фосфоенолпируват:сахарофосфотрансферазы (независимого от PEP-PTS). Экспрессия фосфофруктокиназы(аз) Pfk уменьшена или ослаблена посредством делеции, функциональной инактивации или сайленсинга гена(ов) pfkA и/или pfkB. Наряду с экспрессией/сверхэкспрессией подходящего транспортера, независимого от PEP-PTS, а также моносахаридкиназы, что обеспечивает перенос галактозы в сконструированную клетку, а также ее активацию до галактозо-1-фосфата, соответственно, микробная клетка генетически сконструирована таким образом, что фруктозо-6-фосфат и галактозо-1-фосфат становятся доступными в клетке. Данные фруктозо-6-фосфат и галактозо-1-фосфат могут быть использованы микробной клеткой для образования GlcNAc и/или ГДФ-Fuc и/или УДФ-Gal и/или CMP-Neu5Ac.

Согласно четвертому аспекту предложено применение требуемых углеводов в фармацетивческой и/или пищевой композиции, где целевой углевод предпочтительно получают способом или посредством генетически сконструированной клетки-хозяина согласно изобретению.

Примеры

Пример 1 - Получение сырья из смеси моносахаридов

50%-ный (масс./об.) раствор сахарозы готовили посредством растворения 500 г сахарозы в воде. Конечный объем раствора составлял 1 литр. При температуре 30°С-35°С рН регулировали посредством использования 96%-ной (об./об.) серной кислоты. Затем, раствор стерилизовали в вертикальном автоклаве (Systec VX-65, Linden, Германия) при 121°С в течение 45 минут. Образцы отбирали до и после тепловой стерилизации и хранили замороженными до анализа посредством высоко-эффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). ВЭЖХ осуществляли с использованием рефрактометрического детектора RID-10A (Shimadzu, Германия) и колонки Waters XBridge Amide 3,5 мкм (250×4,6 мм) (Eschborn, Германия), соединенной с системой ВЭЖХ Shimadzu. Изократическое элюирование проводили с помощью 30%-ого растворителя А (50% (об./об.) ацетонитрил в бидистиллированной воде, 0,1%-ого (об./об.) NH₄OH) и 70%-ого растворителя В (80% (об./об.) ацетонитрил в бидистиллированной воде, 0,1% (об./об.) NH₄OH) при 35°С и при скорости потока 1,4 мл мин^-1. Образцы очищали посредством твердофазной экстракции на ионообменной матрице (Strata ABW, Phenomenex). Десять микролитров образца (разведение 1:5) наносили на колонку. Наконец, определяли относительное количество выявляемых сахаров. Как изображено в таблице 2, превращение сахарозы в моносахариды глюкозу и фруктозу увеличивалось со снижением значений рН растворов до тепловой обработки. Полное расщепление сахарозыкисление осуществ можно было наблюдать при значениях рН меньше или равных 3,50, когда подляли серной кислотой.

Пример 2 - Зависимый от сырья рост разных штаммов с делецией генов

Сравнивали поведение роста штамма Е. coli BL21(DE3) (дикий тип), а также мутированных штаммов Е. coli pfkA^- (ApfkA), Е. coli pfkB^- (ΔpfkB), E.coli pfkA^- pfkB^-(ΔpfkA ΔpfkA). Геномные делеции осуществляли в соответствии со способом Datsenko and Wanner (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6640-6645 (2000)). Все штаммы культивировали при 30°C в встряхиваемых колбах, объемом 100 мл, с 20 мл среды на основе минеральных солей, содержащей 7 г⋅л^-1 NH₄H₂PO₄, 7 г⋅л^-1 K₂HPO₄, 2 г⋅л^-1 KOH, 0,3 г⋅л^-1 лимонной кислоты, 2 г⋅л^-1 MgSO₄ × 7⋅H₂O и 0,015 г⋅л^-1 CaCI₂ × 6⋅H₂O, с добавлением 1 мл⋅л^-1 раствора микроэлементов (54,4 г⋅л^-1 цитрат железа (III)-аммония, 9,8 г⋅л^-1 MnCI₂ × 4⋅H₂O, 1,6 г⋅L^-1 CoCI₂ × 6⋅H₂O, 1 г⋅л^-1 CuCI₂ × 2⋅H₂O, 1,9 г⋅л^-1 Н_{3 B}O₃, 9 г⋅л^-1 ZnSO₄ × 7⋅H₂O, 1,1 г⋅л^-1 Na₂MoO₄ × 2⋅H₂O, 1,5 г⋅л^-1 Na₂SeO₃, 1,5 г⋅л^-1 NiSO₄ × 6⋅H₂O), и содержащей или 2% (масс./об.) глюкозы (А) или 1% (масс/об.) глюкозы/1% (масс/об.) фруктозы (В) в качестве источника углерода. Культуры инокулировали до OD (от англ. optical density - оптическая плотность) 0,1, и развитие роста отслеживали на протяжении 26 часов посредством измерения OD₆₀₀. Как показано на Фиг. 2, E.coli pfkA^- pfkB^- лишь незначительно демонстрировали рост, когда глюкозу предоставляли в качестве единственного источника углерода и энергии, тогда как их рост был неотличим от штамма дикого типа, а также мутантов с одной единственной делецией, когда было доступно сырье из смеси моносахаридов.

Пример 3 - Продукция 2'-фукозиллактозы посредством сконструированного штамма E.coli

Штамм Е. coli BL21 (DE3), демонстрирующий генотип lacY⁺, lacZ^-, fuclK^-, wcaJ^-, pfkA^-, дополнительно генетически конструировали посредством сверхэкспрессии ферментов для синтеза de novo ГДФ-фукозы (ManB, ManC, Gmd, WcaG), гена 2'-фукозилтрансферазы wbgL из E.coli: O126, эффлюксного транспортера yberc0001_9420 из Yersinia bercovieri АТСС 43970 и кластера генов esc Е. coli W (№доступа СР002185.1), содержащего гены для сахаропермеазы, фруктокиназы, сахарогидролазы, а также транскрипционного репрессора (гены cscB, cscK, cscA, и cscR, соответственно), обеспечивающего рост штамма на сахарозе в качестве единственного источника углерода. Геномные делеции осуществляли в соответствии со способом Datsenko and Wanner (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6640-6645 (2000)). Геномную интеграцию гетерологичных генов проводили посредством транспозиции. Любую транспозазу EZ-Tn5TM (Epicentre, США) использовали для интеграции фрагментов линейной ДНК, или гиперактивный С9-мутант транспозазы mariner Himar1 (Proc. Natl. Acad. Sci. 1999, США 96:11428-11433) использовали для транспозиции. Гены подвергали оптимизации кодонов для экспрессии в Е. coli и получали синтетически посредством кооперации GenScript. Полученный в результате штамм культивировали при 30°С во встряхиваемых колбах, объемом 100 мл, с 20 мл среды на основе минеральных солей, содержащей 3 г/л KH₂PO₄, 12 г/л K₂HPO₄, 5 г/л (NH₄)₂SO₄, 0,3 г/л лимонной кислоты, 2 г/л MgSO₄ × 7H₂O, 0,1 г/л NaCI и 0,015 г/л CaCI₂ × 6H₂O с 1 мл/л раствора микроэлементов (54,4 г/л цитрата железа (III)-аммония, 9,8 г/л MnCI₂ × 4H₂O, 1,6 г/л CoCI₂ × 6H₂O, 1 г/л CuCI₂ × 2H₂O, 1,9 г/л Н_{3 В}О₃, 9 г/л ZnSO₄ × 7H₂O, 1,1 г/л Na₂MoO₄ 2H₂O, 1,5 г/л Na₂SeO₃, 1,5 г/л NiSO₄ × 6H₂O), и содержащей 2% (об./об.) глицерин, 2% (масс/об.) сахарозу, подвергающуюся стерильной фильтрации, или 2% гидролизат сахарозы в качестве источника углерода. Кроме того, добавляли 15 мМ лактозу, служащую в качестве акцепторного субстрата для продукции 2'-фукозиллактозы. Культуры инокулировали до OD 0,1, и культивацию останавливали, спустя 26 часов. Для количественной оценки 2'-FL в культуральном бульоне ВЭЖХ-анализ проводили, используя рефрактометрический детектор RID-10A (RID-10A) (Shimadzu, Германия) и колонку Waters XBridge Amide 3,5 мкм (250×4,6 мм) (Eschborn, Германия), соединенную с системой ВЭЖХ (Shimadzu, Германия). Элюирование проводили изократически с помощью 30%-ого А: 50% (об./об.) ACN в ddH₂O, 0,1% (об./об.) NH₄OH и 70%-ого В: 80% (об./об.) ACN в ddH₂O, 0,1% (об./об.) NH₄OH (об./об.) в качестве элюента при 35°С и при скорости потока 1,4 мл⋅мин^-1. Культуральный супернатант подвергали стерильной фильтрации (размер пор 0,22 мкм) и чистили посредством твердофазной экстракции на ионообменной матрице (Strata ABW, Phenomenex). 10 мкл образцов наносили на колонку, и концентрацию 2'-фукозиллактозы рассчитывали в соответствии со стандартной кривой. Продуктивность сконструированного штамма во время роста на глицерине имело значение 100%. Как изображено в таблице 3, продукция 2'-FL была самая высокая, когда гидролизат сахарозы был предоставлен в качестве источника углерода и энергии.

Пример 4 - Общая ферментация 2'-фукозиллактозы сконструированным штаммом Е. coli во время роста на сырье из смеси моносахаридов

Штамм Е. coli BL21 (DE3), демонстрирующий генотип pfkA^-, lacZ^-, fuclK^-, wcaJ^-, glk^-, gcd^-, ptsG^-, дополнительно генетически конструировали посредством сверхэкспрессии ферментов для синтеза de novo ГДФ-фукозы (ManB, ManC, Gmd, WcaG), гена 2'-фукозилтрансферазы wbgL из Е. coli: O126, гена эффлюксного транспортера сахара yberc0001_9420 из Yersinia bercovieri АТСС 43970, гена транспортера глюкозы glf из Zymomonas mobilis, гена β-1,4-галактозилтрансферазы ga1Tpm1141 из Pasteurella multocida (GenBank: АЕС04686), а также генов Е. coli galE и pgm, кодирующих УДФ-глюкозо-4-эпимеразу и фосфоглюкомутазу, соответственно. Геномные делеции осуществляли в соответствии со способом Datsenko and Wanner (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6640-6645 (2000)). Геномную интеграцию гетерологичных генов проводили посредством транспозиции. Любую транспозазу EZ-Tn5TM (Epicentre, США) использовали для интеграции фрагментов линейной ДНК, или гиперактивный С9-мутант транспозазы mariner Himar1 (Proc. Natl. Acad. Sci. 1999, USA 96:11428-11433) использовали для транспозиции. Гены подвергали оптимизации кодонов для экспрессии в E.coli и получали синтетически посредством кооперации GenScript.

Полученный штамм E.coli культивировали при 30°С в ферментере, объемом 3 л (New Brunswick, Edison, США), начиная с 1000 мл среды на основе минеральных солей, содержащей 7 г⋅л^-1 NH₄H₂PO₄, 7 г⋅л^-1 KHPO₄, 2 г⋅л^-1 KOH, 0,3 г⋅л^-1 лимонной кислоты, 2 г⋅л^-1 MgSO₄ × 7⋅H₂O и 0,015 г⋅л^-1 CaCI₂ × 6⋅H₂O с добавлением раствора микроэлементов 1 мл⋅л^-1 (54,4 г⋅л^-1 цитрата железа (III)-аммония, 9,8 г⋅л^-1 MnCI₂ × 4⋅H₂O, 1,6 г⋅л^-1 CoCI₂ × 6⋅H₂O, 1 г⋅л^-1 CuCI₂ × 2⋅H₂O, 1,9 г⋅л^-1 Н_{3 B}O₃, 9 г⋅л^-1 ZnSO₄ × 7⋅H₂O, 1,1 г⋅л^-1 Na₂MoO₄ × 2⋅H₂O, 1,5 г⋅л^-1 Na₂SeO₃, 1,5 г⋅л^-1 NiSO₄ × 6⋅H₂O) и содержащей 2% (масс/об.) гидролизованной сахарозы в качестве источника углерода. Культивирование начинали с добавления 2,5% (об./об.) инокулюма из предварительной культуры, растущей на той же среде. Конец фазы периодического процесса характеризовался подъемом уровня растворенного кислорода. Добавку углерода, состоящую из полностью гидролизованной сахарозы с добавлением 2 г⋅л^-1 MgSO₄ × 7⋅H₂O, 0,015 г⋅л^-1 CaCI₂ × 6-H₂O и 1 мл⋅л^-1 раствора микроэлементов, применяли сразу после окончания фазы периодического процесса. Применяли скорость подпитки 12,0-15,0 мл⋅л^-1⋅ч^-1, относительно исходного объема. Аэрацию поддерживали на уровне 3 л⋅мин^-1. Растворенный кислород поддерживали на уровне 20-30% насыщения посредством осуществления контроля над скоростью перемешивания. рН поддерживали на уровне 6,7 посредством добавления 25%-го раствора аммония. Культивирование длилось на протяжении 86 часов и давало существенные количества 2'-FL в супернатанте культуры.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Jennewein Biotechnologie GmbH

<120> ФЕРМЕНТАТИВНАЯ ПРОДУКЦИЯ УГЛЕВОДОВ МИКРОБНЫМИ КЛЕТКАМИ С

ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СМЕШАННОГО СЫРЬЯ

<130> P 1901 WO

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1395

<212> ДНК

<213> Escherichia coli

<400> 1

atgcctgacg ctaaaaaaca ggggcggtca aacaaggcaa tgacgttttt cgtctgcttc

60

cttgccgctc tggcgggatt actctttggc ctggatatcg gtgtaattgc tggcgcactg

120

ccgtttattg cagatgaatt ccagattact tcgcacacgc aagaatgggt cgtaagctcc

180

atgatgttcg gtgcggcagt cggtgcggtg ggcagcggct ggctctcctt taaactcggg

240

cgcaaaaaga gcctgatgat cggcgcaatt ttgtttgttg ccggttcgct gttctctgcg

300

gctgcgccaa acgttgaagt actgattctt tcccgcgttc tactggggct ggcggtgggt

360

gtggcctctt ataccgcacc gctgtacctc tctgaaattg cgccggaaaa aattcgtggc

420

agtatgatct cgatgtatca gttgatgatc actatcggga tcctcggtgc ttatctttct

480

gataccgcct tcagctacac cggtgcatgg cgctggatgc tgggtgtgat tatcatcccg

540

gcaattttgc tgctgattgg tgtcttcttc ctgccagaca gcccacgttg gtttgccgcc

600

aaacgccgtt ttgttgatgc cgaacgcgtg ctgctacgcc tgcgtgacac cagcgcggaa

660

gcgaaacgcg aactggatga aatccgtgaa agtttgcagg ttaaacagag tggctgggcg

720

ctgtttaaag agaacagcaa cttccgccgc gcggtgttcc ttggcgtact gttgcaggta

780

atgcagcaat tcaccgggat gaacgtcatc atgtattacg cgccgaaaat cttcgaactg

840

gcgggttata ccaacactac cgagcaaatg tgggggaccg tgattgtcgg cctgaccaac

900

gtacttgcca cctttatcgc aatcggcctt gttgaccgct ggggacgtaa accaacgcta

960

acgctgggct tcctggtgat ggctgctggc atgggcgtac tcggtacaat gatgcatatc

1020

ggtattcact ctccgtcggc gcagtatttc gccatcgcca tgctgctgat gtttattgtc

1080

ggttttgcca tgagtgccgg tccgctgatt tgggtactgt gctccgaaat tcagccgctg

1140

aaaggccgcg attttggcat cacctgctcc actgccacca actggattgc caacatgatc

1200

gttggcgcaa cgttcctgac catgctcaac acgctgggta acgccaacac cttctgggtg

1260

tatgcggctc tgaacgtact gtttatcctg ctgacattgt ggctggtacc ggaaaccaaa

1320

cacgtttcgc tggaacatat tgaacgtaat ctgatgaaag gtcgtaaact gcgcgaaata

1380

ggcgctcacg attaa

1395

<210> 2

<211> 1422

<212> ДНК

<213> Zymomonas mobilis

<400> 2

atgagttctg aaagtagtca gggtctagtc acgcgactag ccctaatcgc tgctataggc

60

ggcttgcttt tcggttacga ttcagcggtt atcgctgcaa tcggtacacc ggttgatatc

120

cattttattg cccctcgtca cctgtctgct acggctgcgg cttccctttc tgggatggtc

180

gttgttgctg ttttggtcgg ttgtgttacc ggttctttgc tgtctggctg gattggtatt

240

cgcttcggtc gtcgcggcgg attgttgatg agttccattt gtttcgtcgc cgccggtttt

300

ggtgctgcgt taaccgaaaa attatttgga accggtggtt cggctttaca aattttttgc

360

tttttccggt ttcttgccgg tttaggtatc ggtgtcgttt caaccttgac cccaacctat

420

attgctgaaa ttcgtccgcc agacaaacgt ggtcagatgg tttctggtca gcagatggcc

480

attgtgacgg gtgctttaac cggttatatc tttacctggt tactggctca tttcggttct

540

atcgattggg ttaatgccag tggttggtgc tggtctccgg cttcagaagg cctgatcggt

600

attgccttct tattgctgct gttaaccgca ccggatacgc cgcattggtt ggtgatgaag

660

ggacgtcatt ccgaggctag caaaatcctt gctcgtctgg aaccgcaagc cgatcctaat

720

ctgacgattc aaaagattaa agctggcttt gataaagcca tggacaaaag cagcgcaggt

780

ttgtttgctt ttggtatcac cgttgttttt gccggtgtat ccgttgctgc cttccagcag

840

ttagtcggta ttaacgccgt gctgtattat gcaccgcaga tgttccagaa tttaggtttt

900

ggagctgata cggcattatt gcagaccatc tctatcggtg ttgtgaactt catcttcacc

960

atgattgctt cccgtgttgt tgaccgcttc ggccgtaaac ctctgcttat ttggggtgct

1020

ctcggtatgg ctgcaatgat ggctgtttta ggctgctgtt tctggttcaa agtcggtggt

1080

gttttgcctt tggcttctgt gcttctttat attgcagtct ttggtatgtc atggggccct

1140

gtctgctggg ttgttctgtc agaaatgttc ccgagttcca tcaagggcgc agctatgcct

1200

atcgctgtta ccggacaatg gttagctaat atcttggtta acttcctgtt taaggttgcc

1260

gatggttctc cagcattgaa tcagactttc aaccacggtt tctcctatct cgttttcgca

1320

gcattaagta tcttaggtgg cttgattgtt gctcgcttcg tgccggaaac caaaggtcgg

1380

agcctggatg aaatcgagga gatgtggcgc tcccagaagt ag

1422

<210> 3

<211> 1248

<212> ДНК

<213> Escherichia coli

<400> 3

atggcactga atattccatt cagaaatgcg tactatcgtt ttgcatccag ttactcattt

60

ctctttttta tttcctggtc gctgtggtgg tcgttatacg ctatttggct gaaaggacat

120

ctagggttga cagggacgga attaggtaca ctttattcgg tcaaccagtt taccagcatt

180

ctatttatga tgttctacgg catcgttcag gataaactcg gtctgaagaa accgctcatc

240

tggtgtatga gtttcatcct ggtcttgacc ggaccgttta tgatttacgt ttatgaaccg

300

ttactgcaaa gcaatttttc tgtaggtcta attctggggg cgctattttt tggcttgggg

360

tatctggcgg gatgcggttt gcttgatagc ttcaccgaaa aaatggcgcg aaattttcat

420

ttcgaatatg gaacagcgcg cgcctgggga tcttttggct atgctattgg cgcgttcttt

480

gccggcatat tttttagtat cagtccccat atcaacttct ggttggtctc gctatttggc

540

gctgtattta tgatgatcaa catgcgtttt aaagataagg atcaccagtg cgtagcggca

600

gatgcgggag gggtaaaaaa agaggatttt atcgcagttt tcaaggatcg aaacttctgg

660

gttttcgtca tatttattgt ggggacgtgg tctttctata acatttttga tcaacaactt

720

tttcctgtct tttattcagg tttattcgaa tcacacgatg taggaacgcg cctgtatggt

780

tatctcaact cattccaggt ggtactcgaa gcgctgtgca tggcgattat tcctttcttt

840

gtgaatcggg tagggccaaa aaatgcatta cttatcggag ttgtgattat ggcgttgcgt

900

atcctttcct gcgcgctgtt cgttaacccc tggattattt cattagtgaa gttgttacat

960

gccattgagg ttccactttg tgtcatatcc gtcttcaaat acagcgtggc aaactttgat

1020

aagcgcctgt cgtcgacgat ctttctgatt ggttttcaaa ttgccagttc gcttgggatt

1080

gtgctgcttt caacgccgac tgggatactc tttgaccacg caggctacca gacagttttc

1140

ttcgcaattt cgggtattgt ctgcctgatg ttgctatttg gcattttctt cttgagtaaa

1200

aaacgcgagc aaatagttat ggaaacgcct gtaccttcag caatatag

1248

<210> 4

<211> 735

<212> ДНК

<213> Leuconostoc pseudomesenteroides

<400> 4

atggcacaaa acgcgcaaca tcataatccg cgaagcattt caatgagcaa atcacttatg

60

ttttttgcca tctcattgat tttaaatgcg atgggaaatg ttttgacgct cgtcacagct

120

tcacatataa aacccgcttt tttgggatca gcttattgga ctgctgcaga ggctaatcta

180

ggtcaagctt tattaggaaa taattcactt gtcttgtttt gggcattttt agttcttggc

240

atgcttattt cattcctgaa tgcgttatta atgaaaaagt tagattggca tcgtatcatt

300

ggtaatttct tgtttatgtt accattttca atttttattc aatggttttc aaatattttc

360

aatcaaatta tgccaaatgc taattcagtg gcagcaactg tgttatatac agtaattaat

420

tttattggtg ttggcttgat cgccgttgct atttcgattt atcaacgtgt gaatttagtg

480

ttacaccctg ccgatgattt gatgcaaatt ttacgtttca aatattttca cgggtcggct

540

ttcaaggcta tgtgggcgtc ctatattccg ccaacgattt ttgcaattat tgcctttgtg

600

atcactttcc ctaatttgta taatttcggg ttaggaatta tttttgcatt cttattccag

660

ggtggcatca caggaatcgc ggacaagtac gtctttaaga atttaaagca tcaggcaata

720

gatgttggta attaa

735

<210> 5

<211> 1254

<212> ДНК

<213> Escherichia coli

<400> 5

atgtactatt taaaaaacac aaacttttgg atgttcggtt tattcttttt cttttacttt

60

tttatcatgg gagcctactt cccgtttttc ccgatttggc tacatgacat caaccatatc

120

agcaaaagtg atacgggtat tatttttgcc gctatttctc tgttctcgct attattccaa

180

ccgctgtttg gtctgctttc tgacaaactc gggctgcgca aatacctgct gtggattatt

240

accggcatgt tagtgatgtt tgcgccgttc tttattttta tcttcgggcc actgttacaa

300

tacaacattt tagtaggatc gattgttggt ggtatttatc taggcttttg ttttaacgcc

360

ggtgcgccag cagtagaggc atttattgag aaagtcagcc gtcgcagtaa tttcgaattt

420

ggtcgcgcgc ggatgtttgg ctgtgttggc tgggcgctgt gtgcctcgat tgtcggcatc

480

atgttcacca tcaataatca gtttgttttc tggctgggct ctggctgtgc actcatcctc

540

gccgttttac tctttttcgc caaaacggat gcgccctctt ctgccacggt tgccaatgcg

600

gtaggtgcca accattcggc atttagcctt aagctggcac tggaactgtt cagacagcca

660

aaactgtggt ttttgtcact gtatgttatt ggcgtttcct gcacctacga tgtttttgac

720

caacagtttg ctaatttctt tacttcgttc tttgctaccg gtgaacaggg tacgcgggta

780

tttggctacg taacgacaat gggcgaatta cttaacgcct cgattatgtt ctttgcgcca

840

ctgatcatta atcgcatcgg tgggaaaaac gccctgctgc tggctggcac tattatgtct

900

gtacgtatta ttggctcatc gttcgccacc tcagcgctgg aagtggttat tctgaaaacg

960

ctgcatatgt ttgaagtacc gttcctgctg gtgggctgct ttaaatatat taccagccag

1020

tttgaagtgc gtttttcagc gacgatttat ctggtctgtt tctgcttctt taagcaactg

1080

gcgatgattt ttatgtctgt actggcgggc aatatgtatg aaagcatcgg tttccagggc

1140

gcttatctgg tgctgggtct ggtggcgctg ggcttcacct taatttccgt gttcacgctt

1200

agcggccccg gcccgctttc cctgctgcgt cgtcaggtga atgaagtcgc ttaa

1254

<210> 6

<211> 1317

<212> ДНК

<213> Escherichia coli

<400> 6

atgggaaaca catcaataca aacgcagagt taccgtgcgg tagataaaga tgcagggcaa

60

agcagaagtt acattattcc attcgcgctg ctgtgctcac tgttttttct ttgggcggta

120

gccaataacc ttaacgacat tttattacct caattccagc aggcttttac gctgacaaat

180

ttccaggctg gcctgatcca atcggccttt tactttggtt atttcattat cccaatccct

240

gctgggatat tgatgaaaaa actcagttat aaagcaggga ttattaccgg gttattttta

300

tatgccttgg gtgctgcatt attctggccc gccgcagaaa taatgaacta caccttgttt

360

ttagttggcc tatttattat tgcagccgga ttaggttgtc tggaaactgc cgcaaaccct

420

tttgttacgg tattagggcc ggaaagtagt ggtcacttcc gcttaaatct tgcgcaaaca

480

tttaactcgt ttggcgcaat tatcgcggtt gtctttgggc aaagtcttat tttgtctaac

540

gtgccacatc aatcgcaaga cgttctcgat aaaatgtctc cagagcaatt gagtgcgtat

600

aaacacagcc tggtattatc ggtacagaca ccttatatga tcatcgtggc tatcgtgtta

660

ctggtcgccc tgctgatcat gctgacgaaa ttcccggcat tgcagagtga taatcacagt

720

gacgccaaac aaggatcgtt ctccgcatcg ctttctcgcc tggcgcgtat tcgccactgg

780

cgctgggcgg tattagcgca attctgctat gtcggcgcac aaacggcctg ctggagctat

840

ttgattcgct acgctgtaga agaaattcca ggtatgactg caggctttgc cgctaactat

900

ttaaccggaa ccatggtgtg cttctttatt ggtcgtttca ccggtacctg gctcatcagt

960

cgcttcgcac cacacaaagt cctggccgcc tacgcattaa tcgctatggc actgtgcctg

1020

atctcagcct tcgctggcgg tcatgtgggc ttaatagccc tgactttatg cagcgccttt

1080

atgtcgattc agtacccaac aatcttctcg ctgggcatta agaatctcgg ccaggacacc

1140

aaatatggtt cgtccttcat cgttatgacc attattggcg gcggtattgt cactccggtc

1200

atgggttttg tcagtgacgc ggcgggcaac atccccactg ctgaactgat ccccgcactc

1260

tgcttcgcgg tcatctttat ctttgcccgt ttccgttctc aaacggcaac taactga

1317

<210> 7

<211> 1491

<212> ДНК

<213> Escherichia coli

<400> 7

atgagtacta caacccagaa tatcccgtgg tatcgccatc tcaaccgtgc acaatggcgc

60

gcattttccg ctgcctggtt gggatatctg cttgacggtt ttgatttcgt tttaatcgcc

120

ctggtactca ccgaagtaca aggtgaattc gggctgacga cggtgcaggc ggcaagtctg

180

atctctgcag cctttatctc tcgctggttc ggcggcctga tgctcggcgc tatgggtgac

240

cgctacgggc gtcgtctggc aatggtcacc agcatcgttc tcttctcggc cgggacgctg

300

gcctgcggct ttgcgccagg ctacatcacc atgtttatcg ctcgtctggt catcggcatg

360

gggatggcgg gtgaatacgg ttccagcgcc acctatgtca ttgaaagctg gccaaaacat

420

ctgcgtaaca aagccagtgg ttttttgatt tcaggcttct ctgtgggggc cgtcgttgcc

480

gctcaggtct atagcctggt ggttccggtc tggggctggc gtgcgctgtt ctttatcggc

540

attttgccaa tcatctttgc tctctggctg cgtaaaaaca tcccggaagc ggaagactgg

600

aaagagaaac acgcaggtaa agcaccagta cgcacaatgg tggatattct ctaccgtggt

660

gaacatcgca ttgccaatat cgtaatgaca ctggcggcgg ctactgcgct gtggttctgc

720

ttcgccggta acctgcaaaa tgccgcgatc gtcgctgttc ttgggctgtt atgcgccgca

780

atctttatca gctttatggt gcagagtgca ggcaaacgct ggccaacggg cgtaatgctg

840

atggtggtcg tgttgtttgc tttcctctac tcatggccga ttcaggcgct gctgccaacg

900

tatctgaaaa ccgatctggc ttataacccg catactgtag ccaatgtgct gttctttagt

960

ggctttggcg cggcggtggg atgctgcgta ggtggcttcc tcggtgactg gctgggaacc

1020

cgcaaagcgt acgtttgtag cctgctggcc tcgcagctgc tgattattcc ggtatttgcg

1080

attggcggcg caaacgtctg ggtgctcggt ctgttactgt tcttccagca aatgcttgga

1140

caagggatcg ccgggatctt accaaaactg attggcggtt atttcgatac cgaccagcgt

1200

gcagcgggcc tgggctttac ctacaacgtt ggcgcattgg gcggtgcact ggccccaatc

1260

atcggcgcgt tgatcgctca acgtctggat ctgggtactg cgctggcatc gctctcgttc

1320

agtctgacgt tcgtggtgat cctgctgatt gggctggata tgccttctcg cgttcagcgt

1380

tggttgcgcc cggaagcgtt gcgtactcat gacgctatcg acggtaaacc attcagcggt

1440

gccgtgccgt ttggcagcgc caaaaacgat ttagtcaaaa ccaaaagtta a

1491

<210> 8

<211> 1278

<212> ДНК

<213> Xanthomonas campestris

<400> 8

atgactaccg ccaggcccgc aaatcccgtt gtctcgatcg ccatcgtcgg cgtgctgttt

60

ttcatcatcg gctttttcac ctggatcaac gggccgctga tcaccttcgt gcggctggcg

120

ttcgacctca acgaggtcaa tgcgttcctg gtgctgatgg tgttctacct gtcgtacttc

180

ttcctggcgc tgccctcgtc atggatcctc aagcgcaccg gcatgaaaaa aggcctggcg

240

ctgagtctgg tggtgatggc gctgggcgcc gcagcattcg ggcaattcgc tacgcaacgc

300

tggtatccgg gcgcactggc cggcatgttc gtgatcggta gcggcctggc gttgttgcag

360

accgcgatca acccatacat cagtattctc gggccaatcg aaagtgcggc gcggcgcatc

420

gcgctgatgg gcatctgtaa caagattgcc ggcatcctgg cgccgatcct gatcggctcg

480

ctggtgctgc atggcatcgg cgatctctcc acgcaggtgg ccgcggccga tgcggcgacc

540

aagcagcaac tgctcaacgc gtttgccgcc aagatccatg caccatatct ggtgatgtcc

600

ggcgtgttgc tggtgctggc ggtgggcgtg ttgttctcgc cgctgcccga actcaaggcc

660

tccgaagcca atgccacgcc gggcagcggt ggcgcggcgc agaagtccag catcttccag

720

ttcccgcatc tgtggctggg cgtgttgtgc ctgttcgtgt atgtcggtgt ggaagtgatg

780

gccggcgatg ccatcggcac ttacggacac ggcttcaatt tgccgctgga cagcaccaag

840

ctgttcacct cctacacgct gggcgcaatg ttgctgggct atatcgccgg cctggtgctg

900

attccgcggg tgatttcgca ggcgcgctac ctgagcgtgt ctgcgctgct gggcgtgctg

960

ttctcgctgg gggcgctgtt cacccacggc tatgtgtcgg tggggttcgt ggccgcgctc

1020

ggttttgcca acgccatgat gtggccggcg atctttccgc tggccatccg cggcctgggc

1080

cggttcaccg agatcggttc ggcgttgctg gtgatgggca ttgccggcgg cgcgatcatt

1140

ccgcagctgt tcgccattct gaaacagcat tacgacttcc aggtggtgtt cgccgcgctg

1200

atggtgccgt gctacctgta catcctgttc tattcgctgc gcggccaccg tgtggggctg

1260

ccggctcaac cgaaatga

1278

<210> 9

<211> 1554

<212> ДНК

<213> Bifidobacterium longum

<400> 9

atgacgacga caacggcatc acccgtatcg aaacagacgg catccgcggc gcaggaaacc

60

agcgcaaccg gtgcggcggc caccgcaatc gaaaccatcg aaaccggcgt ggccggagtg

120

gcgggcgcgg ccacaaacgc ggcagccaac gcaatcgagg acctcgaagc cgccgaatcg

180

cacggcttct ccacgcgctt cccgctcaac agcgcattca tcttcacctt cggcgcgctc

240

ggcggcatgc tgttcggttt cgacaccggc atcatctccg gcgcctcccc gcttatcgaa

300

tcggacttcg gcctgagcgt ctctcagacc ggcttcatca cctcctcggt gctgatcggc

360

tcgtgcgcag gcgcgctgtc gatcggcgca ctgtctgacc ggttcggccg caagaagctg

420

ctcatcgtct ccgcgctgct gttcctgctc ggctcaggcc tgtgcgcctc ctccaccgga

480

ttcgcgatga tggtgtgcgc ccgcatcatc ctgggtctcg ccgtcggcgc ggcctccgcc

540

ctgaccccgg cgtacttggc cgaactggcg ccgaaggagc gtcgcggctc actgtccacg

600

ctgttccagc tcatggtcac cttcggcatt ctgctggcct acgcctccaa cctcggattc

660

ctgaaccaca acctcttcgg catccgcgac tggcgctgga tgctcggttc ggcgctggtg

720

ccggccgcct tgttgctgct cggcggcctg ttgctgcccg aatccccgcg ttatctggtg

780

aacaagggcg acacccgcaa cgccttcaaa gtgcttacgc tgattcgcaa ggacgtggat

840

cagacccagg tgcagattga gctggacgaa atcaaggccg tggccgcaca ggacaccaag

900

ggtggtgtgc gcgaactgtt ccgtatcgct cgtccggcgc tggtggccgc catcggtatc

960

atgctgttcc agcagctcgt gggcatcaac tcggtgatct acttcctgcc gcaggtgttc

1020

atcaagggct tcggcttccc tgaaggcgac gcgatctggg tgtcggtggg catcggcgtg

1080

gtgaacttcg tgagcaccat cgtggccacg cttatcatgg atcgtttccc gcgcaagggc

1140

atgctgatct tcggttccat cgtgatgacc gtttcgctcg cggtgctcgc cgtgatgaac

1200

ttcgtgggcg acgtggccgt gctggcagtg ccgacgatga ttctcatcgc tttctatatc

1260

ctcggctttg cggtctcgtg gggcccgatc gcctgggtgc ttatcggcga gatcttcccg

1320

ctgagcgtgc gcggcatcgg ctcatccttc ggctcggcgg cgaactggct gggcaacttc

1380

atcgtctccc agttcttcct cgtgctgctc gatgcgttcg gcaacaatgt gggcggcccg

1440

ttcgcgattt tcggcgtgtt ctcggccctg tccatcccgt tcgtgctgcg cttggtgccc

1500

gagaccaagg gcaagtcgct ggaggaaatc gagaaggaaa tgaccaagcg ctag

1554

<210> 10

<211> 1206

<212> ДНК

<213> Bacillus subtilis

<400> 10

atgttaagag ggacatattt atttggatat gctttctttt ttacagtagg tattatccat

60

atatcaacag ggagtttgac accattttta ttagaggctt ttaacaagac aacagatgat

120

atttcggtca taatcttctt ccagtttacc ggatttctaa gcggagtatt aatcgcacct

180

ttaatgatta agaaatacag tcattttagg acacttactt tagctttgac aataatgctt

240

gtagcgttaa gtatcttttt tctaaccaag gattggtatt atattattgt aatggctttt

300

ctcttaggat atggagcagg cacattagaa acgacagttg gttcatttgt tattgctaat

360

ttcgaaagta atgcagaaaa aatgagtaag ctggaagttc tctttggatt aggcgcttta

420

tctttcccat tattaattaa ttccttcata gatatcaata actggttttt accatattac

480

tgtatattca cctttttatt cgtcctattc gtagggtggt taattttctt gtctaagaac

540

cgagagtacg ctaagaatgc taaccaacaa gtgacctttc cagatggagg agcatttcaa

600

tactttatag gagatagaaa aaaatcaaag caattaggct tttttgtatt tttcgctttc

660

ctatatgctg gaattgaaac aaattttgcc aactttttac cttcaatcat gataaaccaa

720

gacaatgaac aaattagtct tataagtgtc tcctttttct gggtagggat catcatagga

780

agaatattga ttggtttcgt aagtagaagg cttgattttt ccaaatacct tctttttagc

840

tgtagttgtt taattgtttt gttgattgcc ttctcttata taagtaaccc aatacttcaa

900

ttgagtggta catttttgat tggcctaagt atagcgggga tatttcccat tgctttaaca

960

ctagcatcaa tcattattca gaagtacgtt gacgaagtta caagtttatt tattgcctcg

1020

gcaagtttcg gaggagcgat catctctttc ttaattggat ggagtttaaa ccaggatacg

1080

atcttattaa ccatgggaat atttacaact atggcggtca ttctagtagg tatttctgta

1140

aagattagga gaactaaaac agaagaccct atttcacttg aaaacaaagc atcaaaaaca

1200

cagtag

1206

<210> 11

<211> 1593

<212> ДНК

<213> Vibrio parahaemolyticus

<400> 11

atggtcttcg ccatttatgt cgcaattatc attggggtcg gactttgggt atctcgtgat

60

aaaaaaggca ctcagaaaag tacggaagat tatttcttgg cgggaaaatc tttgccttgg

120

tgggctgtcg gtgcttcgct aattgctgca aatatttctg cggaacaatt tataggaatg

180

tctggttcag gctattcaat tggcttggct atcgcatctt atgaatggat gtcggcaata

240

acattgatta ttgttggtaa gtactttcta cctattttca ttgaaaaagg aatctatacc

300

attcctgaat ttgttgaaaa acgcttcaat aaaaaactaa aaacaatttt ggccgttttt

360

tggatttcct tgtacatttt tgtaaaccta acttcagtac tgtatttagg tggtttggct

420

ctcgaaacca ttttgggtat tccgttgatg tactcaattc taggtcttgc gctgtttgcg

480

ttggtgtact caatttatgg tggtttatcg gcagtagtat ggaccgatgt catccaagtg

540

ttcttcttag ttttgggtgg ttttatgact acctacatgg cagtgagctt tattggtggt

600

acggacggtt ggttcgctgg ggtgtctaaa atggtcgatg cagctcctgg ccactttgag

660

atgatcttgg atcaaagtaa tccacaatac atgaaccttc ctggtattgc cgtattaatt

720

ggtggtcttt gggtagcaaa cttatattac tggggcttta accagtacat tattcaaaga

780

acgcttgctg caaaatcagt atcggaagct cagaaaggta ttgtttttgc agcgtttttg

840

aaacttatcg ttccgtttct cgtggtattg ccaggtattg ccgcttacgt tattacttcg

900

gacccacaac taatggcaag ccttggtgat attgcagcaa caaaccttcc aagtgctgct

960

aatgcggata aagcataccc ttggctaact cagttcttgc ctgttggtgt taaaggtgtt

1020

gtttttgcgg ctcttgctgc tgcaattgtt tcttcactag catcaatgct taactcaaca

1080

gccactatct tcactatgga tatttacaaa gagtatatct ctcctgactc aggtgaccac

1140

aagttggtga atgttgggcg tactgcagct gtggtggcac taattattgc ttgcctaatt

1200

gccccaatgt taggtggtat tggccaagca ttccaataca tccaagaata tacaggttta

1260

gttagccctg gtattttggc tgtattctta cttggcttat tctggaagaa aacaaccagt

1320

aaaggggcta ttattggtgt agtagcatca ataccatttg ccttgttctt gaaatttatg

1380

ccactttcca tgccatttat ggatcaaatg ctatacacat tattgtttac aatggttgtt

1440

atcgcattta caagtttgag cacatcaatt aatgatgatg atcctaaagg tattagtgtt

1500

acatcatcga tgtttgtaac agatcgaagc tttaatatcg ctgcttacgg cataatgatt

1560

gttttggcag tgttatatac attgttctgg taa

1593

<210> 12

<211> 1476

<212> ДНК

<213> Escherichia coli

<400> 12

atgaataccc agtataattc cagttatata ttttcgatta ccttagtcgc tacattaggt

60

ggtttattat ttggctacga caccgccgtt atttccggta ctgttgagtc actcaatacc

120

gtctttgttg ctccacaaaa cttaagtgaa tccgctgcca actccctgtt agggttttgc

180

gtggccagcg ctctgattgg ttgcatcatc ggcggtgccc tcggtggtta ttgcagtaac

240

cgcttcggtc gtcgtgattc acttaagatt gctgctgtcc tgttttttat ttctggtgta

300

ggttctgcct ggccagaact tggttttacc tctataaacc cggacaacac tgtgcctgtt

360

tatctggcag gttatgtccc ggaatttgtt atttatcgca ttattggcgg tattggcgtt

420

ggtttagcct caatgctctc gccaatgtat attgcggaac tggctccagc tcatattcgc

480

gggaaactgg tctcttttaa ccagtttgcg attattttcg ggcaactttt agtttactgc

540

gtaaactatt ttattgcccg ttccggtgat gccagctggc tgaatactga cggctggcgt

600

tatatgtttg cctcggaatg tatccctgca ctgctgttct taatgctgct gtataccgtg

660

ccagaaagtc ctcgctggct gatgtcgcgc ggcaagcaag aacaggcgga aggtatcctg

720

cgcaaaatta tgggcaacac gcttgcaact caggcagtac aggaaattaa acactccctg

780

gatcatggcc gcaaaaccgg tggtcgtctg ctgatgtttg gcgtgggcgt gattgtaatc

840

ggcgtaatgc tctccatctt ccagcaattt gtcggcatca atgtggtgct gtactacgcg

900

ccggaagtgt tcaaaacgct gggggccagc acggatatcg cgctgttgca gaccattatt

960

gtcggagtta tcaacctcac cttcaccgtt ctggcaatta tgacggtgga taaatttggt

1020

cgtaagccac tgcaaattat cggcgcactc ggaatggcaa tcggtatgtt tagcctcggt

1080

accgcgtttt acactcaggc accgggtatt gtggcgctac tgtcgatgct gttctatgtt

1140

gccgcctttg ccatgtcctg gggtccggta tgctgggtac tgctgtcgga aatcttcccg

1200

aatgctattc gtggtaaagc gctggcaatc gcggtggcgg cccagtggct ggcgaactac

1260

ttcgtctcct ggaccttccc gatgatggac aaaaactcct ggctggtggc ccatttccac

1320

aacggtttct cctactggat ttacggttgt atgggcgttc tggcagcact gtttatgtgg

1380

aaatttgtcc cggaaaccaa aggtaaaacc cttgaggagc tggaagcgct ctgggaaccg

1440

gaaacgaaga aaacacaaca aactgctacg ctgtaa

1476

<210> 13

<211> 1395

<212> ДНК

<213> Bacillus subtilis

<400> 13

atgaagaata ctccaactca attagaacca aatgttcctg taacaagaag ccattcaatg

60

ggatttgtca ttttgatctc atgtgcggcg gggcttggcg gcttattgta tggctatgac

120

acggcagtga tttctggcgc catcggtttt ctgaaagatt tatacagcct gagtccgttt

180

atggagggac ttgtcatttc aagcattatg attggaggag ttgtgggcgt cgggatatcc

240

ggatttttaa gtgacagatt cggccggaga aaaattttaa tgacagccgc tttgttattt

300

gcgatatcag caatcgtttc agcgctttct caagacgtgt ccaccttaat cattgcaagg

360

attatcgggg ggctgggaat cgggatgggc tcatcgctct ctgttacgta tattacagaa

420

gcggcaccgc ccgctatacg cggaagttta tcttcgttat atcagctctt tacgatactg

480

ggtatttccg caacatactt tattaatcta gctgtgcagc ggtccggaac atacgaatgg

540

ggcgtgcaca ccggctggag atggatgctt gcttatggaa tggtgccatc cgtcattttt

600

ttccttgtcc tgctcgtcgt cccggaaagt ccgagatggc tggcgaaagc gggcaaaaca

660

aatgaagctt taaagatcct gacacgtatt aatggagaaa ctgttgcaaa agaagaatta

720

aagaacattg agaactcttt aaaaatagaa caaatggggt cgctctccca gctgtttaag

780

ccgggtctca gaaaggcgct tgtcattgga atcctgctgg cgctgtttaa ccaagtcatc

840

ggcatgaacg cgattactta ctacgggccg gaaatcttta aaatgatggg attcgggcaa

900

aacgccggat ttgtgacgac ttgtatcgtc ggggttgtag aagttatttt taccgttatt

960

gcggtgttgc tgattgataa agtcggacga aaaaaactga tgtccatcgg ttctgctttt

1020

atggctattt ttatgatttt aatcgggacg tcgttttatt ttgagttaac aagcgggatc

1080

atgatgatcg tccttatatt aggttttgtc gctgctttct gtgtctcggt cggaccgatc

1140

acatggatta tgatttctga aatcttcccg aaccatctgc gtgcgcgggc cgcgggcatt

1200

gcgaccatct ttttatgggg agcaaactgg gcgatcggac agtttgtgcc aatgatgatc

1260

gattctttcg ggctcgccta tacattttgg atctttgcgg tgattaacat cctttgtttc

1320

ctgtttgtcg ttacgatctg tccagaaacg aagaacaaat cgctcgagga aattgaaaag

1380

ctttggataa aatga

1395

<210> 14

<211> 4393

<212> ДНК

<213> Klebsiella pneumoniae

<400> 14

atgtataaaa aacggaagtt agccattctt attgctttgc taaccggcac cgccgccgcc

60

catgggcaga cagacctgaa cagcattgaa gcgcgtctcg ccgccctgga aaaacgcctg

120

caggacgccg agacccgcgc cagcactgcc gaaagccgcg ccgcctcagc ggagcagaaa

180

gttcagcagt taacccagca gcagcagcaa acccaggcca ccacccagca ggtggccagg

240

cgcaccactc aactggaaga aaaagccgaa cggcccggcg gctttgagtt ccatggctat

300

gcgcgttccg gggtgatcat gaacgactcg gccgccagta ccaaatccgg cgcttatatg

360

acccccgccg gggagaccgg cggcgccatt ggtcgcctgg gcaaccaggc cgacacctat

420

gtggaaatga acctcgaaca taaacagacc ctggacaacg gggcgaccac ccgtttcaaa

480

gtgatggtgg ccgacggaca gaccacctat aacgactgga cggcaagcag cagcgacctg

540

aacgtacgcc aggcgttcgt cgagctgggc aatctgccga ccttcgaagg cccgttcaaa

600

ggctcgaccc tgtgggccgg gaaacgcttt gaccgcgaca acttcgacat ccactggatt

660

gactcggatg tggtgttcct cgccgggacc ggcggcggga tctacgacgt gaaatggaac

720

gacagcctgc gcagcaactt ctcgttatac ggccgcaact ttggcgatat cgccgacagc

780

agcaacagcg tgcagaacta tatcgtcagc atgaataact ttgccggccc ggtgcagatg

840

atggtcagcg ggatgcgggc gaaagataat gacgaccgcc aggacgcgaa cggcaatctg

900

gtgaaaggcg atgccgctaa caccggggtt catgccctgc tgggcctgca caatgagagc

960

ttctatggcc tgcgcgacgg gaccagcaaa acggccctgc tgtacggcca cgggctgggc

1020

gccgaggtta aaggcatcgg ctccgacggc gcgctgcgcc cgggggccaa tacctggcgc

1080

ttcgccagct atggcactac gccgctgagc gatcgctggt ttattgcccc ggccgtgctg

1140

gcgcagagca gtaaagatcg ttatgtcgat ggcgacagct atcagtgggc caccctcaac

1200

ctgcgtctga ttcaggaagt gacgcagaac ttcgccctcg cctgggaggg cagctatcag

1260

tacatggatc tgcagcctga aggctacaac gatcgccatg cggtcaatgg cagcttctac

1320

aagctgacct tcgccccgac cttcaaggtg ggcagcatcg gcgacttctt ctcgcggccg

1380

gagatccgct tctatacatc gtggatggac tggagcaaaa aactggacaa ctacgccaac

1440

gatgacgcgt taggcagcaa cggattcaaa tcgggcggcg aatggtcgtt cggtatgcaa

1500

atggagacct ggttctgacg gccaccgggg cgacagggta aataacacat aaatataagg

1560

ttcgcggcgc ctgccacggc tggcgccgcc cacgccatat catcatgcat ttagagggta

1620

ctatggattt tgaacagatt tcccgctcac tgcttcccct gctgggcggc aaggaaaata

1680

tcgccagcgc cgcgcactgc gccacccgcc tgcggctggt gctggtcgac gacgcgctcg

1740

ccgatcagca ggcgattggc aaaatcgacg gggtgaaagg ctgctttcgc aatgccggac

1800

agatgcagat catcttcggc accggggtgg tcaataaagt ctatgccgcc tttatccagg

1860

ccgcaggcat cagcgaatcg agcaaatccg aagccgccga cctggcggcg aaaaagctga

1920

acccgttcca gcgcatcgcc cgcctgctgt ccaacatctt cgtgccgatt attccggcca

1980

tcgtcgcctc cggcctgctg atgggcctgc tggggatggt gaaaacctac ggttgggtcg

2040

acccgagcaa cgctctctat atcatgctgg atatgtgcag ttcggcggcg tttatcattc

2100

tgccgatcct gatcggcttt accgccgccc gcgaatttgg cggtaacccc tatctgggcg

2160

cgaccctcgg cgggatcctc acccacccgg cgctgaccaa cgcctggggc gtcgccgccg

2220

gcttccacac catgaatttc ttcggcatcg aagtggcgat gatcggctac cagggcaccg

2280

tcttcccggt gctgctggcg gtgtggttta tgagcatggt cgagaagcgg ctgcgccgcg

2340

tgatccctga cgcgctggac ctgatcctca ctccgttcct gacggtgatt atctccggct

2400

ttatcgccct gctgctgatc ggcccggccg gtcgcgcgct cggcgacggc atttcgttta

2460

tcctcagcac gcttatcagc catgccggct ggctggcggg cctgctgttc ggcggcctct

2520

attcggtgat cgtcattacc ggtatccatc acagcttcca tgccatcgag gccggactgc

2580

tgggcaaccc atcgattggc gtcaacttcc tgctgccgat ctgggcgatg gccaacgtcg

2640

cccagggcgg cgcctgcttt gcggtgtggt ttaaaaccaa agatgccaaa ataaaagcca

2700

tcaccctgcc gtcggcgttt tcggcgatgc tggggatcac cgaggcggca atcttcggga

2760

ttaacctgcg ctttgtgaaa ccgtttatcg ccgcgctggt gggcggtgcc gccggcggcg

2820

cctgggtggt gtcgatgcac gtctacatga ccgcggtggg cctgacggcg atcccgggaa

2880

tggctatcgt gcaggccagc tcgctgctga actacattat cggaatggcg atcgccttcg

2940

ccgtggcctt cgcgctctct ctgacgctga aatacaaaac ggacgctgaa taatgtcatt

3000

accgtcacgt ctgcctgcga tcctgcaggc cgttatgcag ggccagccgc aggcgctggc

3060

cgacagccat tatccgcaat ggcatctggc gccggtcaac ggactgctga acgatcctaa

3120

cggcttttgc caggtcgccg ggcgttacca cctgttttat cagtggaacc cgctcgcctg

3180

cgaccatacc tataagtgct ggggacactg gagctctgcc gatctgctgc actggcggca

3240

cgaacctatc gccctgatgc cggatgaaga gtatgaccgc aacggctgct actctggcag

3300

cgcggtcgag ttcgagggtg ccctgactct gtgctacacc ggcaacgtga aattccccga

3360

cggcgggcgc accgcctggc aatgtctggc gaccgagaat gccgatggca ccttccgcaa

3420

gctggggccg gtgctgccgc tgccagaagg ctataccggc catgtgcgcg accctaaagt

3480

gtggcggcag gacgggcgct ggtacatggt tcttggggcg caggatgtgc aacagcgcgg

3540

caaagtgctg ctgtttaccg ccagcgacct gcgggagtgg cgcctggtgg gcgagatcgc

3600

cgggcacgac gtgaacggcc tggcgaacgc cggctacatg tgggagtgcc cggatctctt

3660

tccgctggcg gacacccacc tgctgatctg ctgcccgcag gggctggccc gcgaagcgca

3720

gcgctttctc aatacctatc cggcggtgtg gatggcaggc cgcttcgacg ccgaacgcgg

3780

gatcttcgac cacggcccgc tgcacgagct ggacagcgga tttgagttct acgcgccgca

3840

gaccatgcag gccgacgatg gccgccgcct gctggtcggc tggatgggcg tccccgacgg

3900

ggacgagatg catcagccca cccgcgcgca gggctggatc catcagatga cctgcgtgcg

3960

tgagctggag tggcaggctg gcactctgta tcagcgtccg ctgcgcgagc tggtcgccct

4020

gcgcggggaa gcccagggct ggtgcggaca gaccctgccc ctcgccccga tggagctggc

4080

ctttgacctt tcccccgaca gcacgctggg gctggacttt gccggcgccc tgcagctcac

4140

cgtcaatcgc gacggcctac gtctgtcgcg ccgcggcctg cagacggcag agatgcatca

4200

ccgctactgg cgcggcgagg cgcgacgcct gcggatcttt atcgaccgct ccagcgtgga

4260

gattttcatc aacgatggcg agggggtgat gagcagccgc ttctttccgg gctatccggg

4320

gcagctcatc ttcagcggtg cgacgccggt ggcattctgc cgctggctgc tgcggccatg

4380

catggtagaa taa

4393

<210> 15

<211> 4423

<212> ДНК

<213> Salmonella typhimurium

<400> 15

atgtacagaa aaagcacact tgcgatgctt atcgctttgc taaccagcgc tgcctcagcc

60

catgcgcaaa cggatataag caccattgaa gcccgactca acgcgctgga aaaacgcctg

120

caggaggcag aaaacagggc gcaaacggcg gaaaaccgcg ccggggcggc ggagaaaaaa

180

gttcagcaac tcaccgcgca gcagcaaaaa aaccagaact cgactcagga agtggctcag

240

cgtaccgcca gacttgagaa aaaagccgat gacaaaagcg gatttgagtt tcacggttac

300

gcccgctccg gcgtgataat gaatgattcc ggcgccagca ccaaatccgg agcctacata

360

acgccggcag gtgaaaccgg cggagctatc ggccgtctgg gaaaccaggc cgatacctat

420

gttgaaatga atcttgaaca taagcagacc ctggataatg gggccacgac ccgctttaag

480

gtgatggtcg ccgacgggca aacctcttat aacgactgga ctgcaagcac cagcgatctg

540

aacgttcgtc aggcctttgt cgaattgggt aacctgccga cgttcgctgg gccatttaag

600

ggctccaccc tgtgggccgg gaaacgtttc gaccgcgaca atttcgatat tcactggatt

660

gactctgatg tcgtgttcct cgccggtacc ggtggtggta tctatgacgt gaagtggaac

720

gacggcctgc ggagtaattt ctccctgtac gggcgtaact tcggcgacat tgatgattcc

780

agcaacagcg tgcagaacta tatcctcacc atgaatcact tcgcaggtcc gctgcagatg

840

atggtcagcg gtctgcgggc gaaggataac gacgagcgta aagatagcaa cggcaatctg

900

gcaaaaggcg atgcggcaaa caccggcgtg catgcgctgc tcggcctgca taacgacagt

960

ttctacggcc tgcgcgacgg tagcagtaaa accgctctgc tttatggtca tggtctgggc

1020

gcagaggtta aaggtatcgg atctgatggc gcacttcgtc cgggagccga cacatggcgc

1080

attgccagtt acggcaccac gccgctcagc gaaaactggt ctgttgcccc ggcaatgctg

1140

gcgcaacgca gtaaagaccg ctatgccgat ggcgacagct atcagtgggc aacattcaac

1200

ctgcgtctga ttcaggcaat caatcagaat ttcgctctcg cctacgaagg cagctaccag

1260

tacatggatc ttaaacccga aggttataac gatcgtcagg cggtgaacgg tagcttctac

1320

aagctcacct tcgccccgac atttaaggtc ggcagtatcg gtgatttctt cagtcgcccg

1380

gagattcgtt tctatacctc ctggatggac tggagcaaaa aactgaataa ttacgccagc

1440

gacgacgccc tgggcagtga cggttttaac tcgggcggcg aatggtcttt cggtgtgcag

1500

atggaaacct ggttctgacg cttacgcctg atgacaggaa tagccggggg tcagagcatc

1560

tttgtcaccc cggactcaac taagacgcag aaaaagcgct cccgtgaacg cgggacgaca

1620

acataaaaat gtttaagcct taagagggta ctatggattt tgaacagatt tcctgctcgc

1680

tgcttccgct tcttggaggc aaagaaaata tcgccagcgc cgcgcactgc gccacgcgcc

1740

tgcgcctggt gctggtcgat gattcgctgg ccgaccagca ggccatcggc aaagttgaag

1800

gggtgaaggg ctgttttcgt aatgccggac agatgcagat tattttcggc accggggtgg

1860

taaataaggt ctacgctgcc tttactcagg cggcgggtat tagcgaatcc agcaaatcgg

1920

aagccgccga catcgcggca aaaaagctca atccgttcca gcgcatcgcc cgcctgctat

1980

caaacatctt cgtgccgata atccctgcca tcgtcgcctc tggtctgctg atgggcctgc

2040

tgggaatggt caaaacatac ggctgggttg acccgggcaa cgccatctac atcatgctgg

2100

atatgtgcag ctcggcggca tttatcattc tgccgattct gattggcttt accgccgccc

2160

gcgaattcgg cggtaatcct tatctcggcg cgacgcttgg cggcattctg actcatccag

2220

cgctgactaa cgcctggggc gtggccgcgg gtttccacac catgaacttt ttcggcttcg

2280

aaattgccat gatcggctat cagggtacgg tgttcccggt actgctggca gtatggttta

2340

tgagcatcgt tgagaagcag ttgcgtcgcg caatccccga tgccctggat ttgatcctga

2400

cgccgttcct gacggtgatt atatccggtt ttatcgccct gttgattatc ggcccggccg

2460

gtcgcgcact gggcgacggt atctcgtttg tcctcagcac cctgattagc cacgccggct

2520

ggctcgccgg gttactgttt ggcggtctct attcagttat cgtcattacc ggtattcatc

2580

acagcttcca tgcggttgaa gccgggttgc tgggcaatcc ctccatcggc gtcaacttcc

2640

tgctgccgat ttgggcgatg gccaacgtcg ctcagggcgg agcctgtctg gcggtgtggt

2700

tcaaaaccaa agatgcaaaa attaaagcca ttactctgcc ctcggcgttt tccgccatgc

2760

tgggcatcac cgaggcggcg atttttggta ttaacctgcg ctttgtgaag ccatttattg

2820

cggcgctgat tggtggtgcg gcgggcggcg catgggtggt atctgtacac gtctacatga

2880

ccgcggtcgg cttgacagcg atccccggca tggccatcgt gcaggccagt tcgctgttga

2940

actacattat cgggatggtt atcgcctttg gcgtcgcctt tacggtctcc ctggttttga

3000

aatacaaaac ggacgctgaa taatgtctct tccatcacga ctgcctgcga ttttgcaggc

3060

cgtaatgcag ggccagccgc gcgcgctggc cgatagccac tatccgcgct ggcaccatgc

3120

gccggtcacc gggctgatga acgaccccaa cggctttatc gaatttgccg gacgctatca

3180

tctgttttat cagtggaacc cgctcgcctg cgatcatacg tttaagtgct gggcgcactg

3240

gagttccatc gatctgctgc actggcagca tgagcccatt gcgctgatgc cggacgaaga

3300

gtatgaccgt aacggctgct actccggcag cgcggtggat aacaacggta cgcttaccct

3360

gtgctatacc ggcaacgtga agtttgccga gggagggcga accgcctggc aatgcctggc

3420

aacggaaaac gctgacggca ccttccgcaa aatcggtccg gtcctgccgc tgccggaggg

3480

ctacaccggc cacgtgcgcg acccaaaagt ctggcgacac gaagacctgt ggtacatggt

3540

gctgggcgcg caggatcggc aaaagcgcgg caaggtgctg ctgttcagct ctgcggatct

3600

ccatcagtgg acgagtatgg gtgaaatcgc cggccacggc atcaatggcc tcgacgacgt

3660

cggctatatg tgggagtgcc cggatctttt tccactcggc gaccagcata ttctaatctg

3720

ctgtccgcag gggattgccc gtgaggaaga gtgctacctg aacacctacc cggcagtatg

3780

gatggcgggc gagtttgatt acgctgctgg cgctttcaga cacggcgaac tgcacgaact

3840

ggacgccggg tttgagttct acgccccgca aaccatgctt accagtgatg gccgtcgtct

3900

gctggtcggc tggatgggcg tgccggaggg cgaagagatg cttcagccga ccctgaacaa

3960

cggctggatc catcagatga cctgcctgcg tgagctggag tttatcaacg gtcagctcta

4020

tcagcgtccg ctacgggaac tgagcgccct gcgcggtgaa gcgaacggct ggtcggggaa

4080

cgccctgccg ctggcaccga tggaaatcga tttgcaaacc cgcgggggcg atatgttgag

4140

cctcgatttt ggcggcgtat taacccttga gtgcgatgcc agcggactcc gcctggcccg

4200

acgcagtctc gccagtgacg agatgcatta tcgttactgg cgcggaaacg tccgctcgct

4260

gcgtgttttc atcgaccagt cgagcgtgga gattttcata aacggcggtg aaggggtgat

4320

gagcagccgc tacttcccgg cctgctccgg tcagctaaca ttctccggca tcacgccgga

4380

cgcattctgc tactggccgc tgcgaacttg catggtagaa taa

4423

<210> 16

<211> 3883

<212> ДНК

<213> Eastern equine encephalomyelitis virus

<400> 16

ctatattgct gaaggtacag gcgtttccat aactatttgc tcgcgttttt tactcaagaa

60

gaaaatgcca aatagcaaca tcaggcagac aatacccgaa attgcgaaga aaactgtctg

120

gtagcctgcg tggtcaaaga gtatcccagt cggcgttgaa agcagcacaa tcccaagcga

180

actggcaatt tgaaaaccaa tcagaaagat cgtcgacgac aggcgcttat caaagtttgc

240

cacgctgtat ttgaagacgg atatgacaca aagtggaacc tcaatggcat gtaacaactt

300

cactaatgaa ataatccagg ggttaacgaa cagcgcgcag gaaaggatac gcaacgccat

360

aatcacaact ccgataagta atgcattttt tggccctacc cgattcacaa agaaaggaat

420

aatcgccatg cacagcgctt cgagtaccac ctggaatgag ttgagataac catacaggcg

480

cgttcctaca tcgtgtgatt cgaataaacc tgaataaaag acaggaaaaa gttgttgatc

540

aaaaatgtta tagaaagacc acgtccccac aataaatatg acgaaaaccc agaagtttcg

600

atccttgaaa actgcgataa aatcctcttt ttttacccct cccgcatctg ccgctacgca

660

ctggtgatcc ttatctttaa aacgcatgtt gatcatcata aatacagcgc caaatagcga

720

gaccaaccag aagttgatat ggggactgat actaaaaaat atgccggcaa agaacgcgcc

780

aatagcatag ccaaaagatc cccaggcgcg cgctgttcca tattcgaaat gaaaatttcg

840

cgccattttt tcggtgaagc tatcaagcaa accgcatccc gccagatacc ccaagccaaa

900

aaatagcgcc cccagaatta gacctacaga aaaattgctt tgcagtaacg gttcataaac

960

gtaaatcata aacggtccgg tcaagaccag gatgaaactc atacaccaga tgagcggttt

1020

cttcagaccg agtttatcct gaacgatgcc gtagaacatc ataaatagaa tgctggtaaa

1080

ctggttgacc gaataaagtg tacctaattc cgtccctgtc aaccctagat gtcctttcag

1140

ccaaatagcg tataacgacc accacagcga ccaggaaata aaaaagagaa atgagtaact

1200

ggatgcaaaa cgatagtacg catttctgaa tggaatattc agtgccataa ttacctgcct

1260

gtcgttaaaa aattcacgtc ctatttagag ataagagcga cttcgccgtt tacttctcac

1320

tattccagtt cttgtcgaca tggcagcgct gtcattgccc ctttcgccgt tactgcaagc

1380

gctccgcaac gttgagcgag atcgataatt cgtcgcattt ctctctcatc tgtagataat

1440

cccgtagagg acagacctgt gagtaacccg gcaacgaacg catctcccgc ccccgtgcta

1500

tcgacacaat tcacagacat tccagcaaaa tggtgaactt gtcctcgata acagaccacc

1560

accccttctg cacctttagt caccaacagc atggcgatct catactcttt tgccagggcg

1620

catatatcct gatcgttctg tgtttttcca ctgataagtc gccattcttc ttccgagagc

1680

ttgacgacat ccgccagttg tagcgcctgc cgcaaacaca agcggagcaa atgctcgtct

1740

tgccatagat cttcacgaat attaggatcg aagctgacaa aacctccggc atgccggatc

1800

gccgtcatcg cagtaaatgc gctggtacgc gaaggctcgg cagacaacgc aattgaacag

1860

agatgtaacc attcgccatg tcgccagcag ggcaagtctg tcgtctctaa aaaaagatcg

1920

gcactggggc ggaccataaa cgtaaatgaa cgttcccctt gatcgttcag atcgacaagc

1980

accgtggatg tccggtgcca ttcatcttgc ttcagatacg tgatatcgac tccctcagtt

2040

agcagcgttc tttgcattaa cgcaccaaaa ggatcatccc ccacccgacc tataaaccca

2100

cttgttccgc ctaatctggc gattcccacc gcaacgttag ctggcgcgcc gccaggacaa

2160

ggcagtaggc gcccgtctga ttctggcaag agatctacga ccgcatcccc taaaacccat

2220

actttggctg acattttttt cccttaaatt catctgagtt acgcatagtg ataaacctct

2280

ttttcgcaaa atcgtcatgg atttactaaa acatgcatat tcgatcacaa aacgtcatag

2340

ttaacgttaa catttgtgat attcatcgca tttatgaaag taagggactt tatttttata

2400

aaagttaacg ttaacaattc accaaatttg cttaaccagg atgattaaaa tgacgcaatc

2460

tcgattgcat gcggcgcaaa acgccctagc aaaacttcat gagcaccggg gtaacacttt

2520

ctatccccat tttcacctcg cgcctcctgc cgggtggatg aacgatccaa acggcctgat

2580

ctggtttaac gatcgttatc acgcgtttta tcaacatcat ccgatgagcg aacactgggg

2640

gccaatgcac tggggacatg ccaccagcga cgatatgatc cactggcagc atgagcctat

2700

tgcgctagcg ccaggagacg ataatgacaa agacgggtgt ttttcaggta gtgctgtcga

2760

tgacaatggt gtcctctcac ttatctacac cggacacgtc tggctcgatg gtgcaggtaa

2820

tgacgatgca attcgcgaag tacaatgtct ggctaccagt cgggatggta ttcatttcga

2880

gaaacagggt gtgatcctca ctccaccaga aggaatcatg cacttccgcg atcctaaagt

2940

gtggcgtgaa gccgacacat ggtggatggt agtcggggcg aaagatccag gcaacacggg

3000

gcagatcctg ctttatcgcg gcagttcgtt gcgtgaatgg accttcgatc gcgtactggc

3060

ccacgctgat gcgggtgaaa gctatatgtg ggaatgtccg gactttttca gccttggcga

3120

tcagcattat ctgatgtttt ccccgcaggg aatgaatgcc gagggataca gttaccgaaa

3180

tcgctttcaa agtggcgtaa tacccggaat gtggtcgcca ggacgacttt ttgcacaatc

3240

cgggcatttt actgaacttg ataacgggca tgacttttat gcaccacaaa gctttttagc

3300

gaaggatggt cggcgtattg ttatcggctg gatggatatg tgggaatcgc caatgccctc

3360

aaaacgtgaa ggatgggcag gctgcatgac gctggcgcgc gagctatcag agagcaatgg

3420

caaacttcta caacgcccgg tacacgaagc tgagtcgtta cgccagcagc atcaatctgt

3480

ctctccccgc acaatcagca ataaatatgt tttgcaggaa aacgcgcaag cagttgagat

3540

tcagttgcag tgggcgctga agaacagtga tgccgaacat tacggattac agctcggcac

3600

tggaatgcgg ctgtatattg ataaccaatc tgagcgactt gttttgtggc ggtattaccc

3660

acacgagaat ttagacggct accgtagtat tcccctcccg cagcgtgaca cgctcgccct

3720

aaggatattt atcgatacat catccgtgga agtatttatt aacgacgggg aagcggtgat

3780

gagtagtcga atctatccgc agccagaaga acgggaactg tcgctttatg cctcccacgg

3840

agtggctgtg ctgcaacatg gagcactctg gctactgggt taa

3883

<---

Claims (9)

1. Способ ферментативного получения 2’-фукозиллактозы, включающий следующие стадии:

а) предоставление клетки E. coli, генетически сконструированной для выработки 2’-фукозиллактозы, где клетка E. coli демонстрирует генотип pfkA ^– , lacZ ^– , fuclK ^– , wcaJ ^– , осуществляет сверхэкспрессию ферментов ManB, ManC, Gmd и WcaG для синтеза de novo ГДФ-фукозы, гена α-1,2-фукозилтрансферазы и гена эффлюксного транспортера сахара yberc0001_9420 из Yersinia bercovieri ATCC 43970;

b) культивирование указанной генетически сконструированной клетки E. coli в культуральной среде, пермиссивной в отношении продукции 2’-фукозиллактозы, где основной источник углерода представляет собой смесь моносахаридов, состоящую из глюкозы и фруктозы, полученную гидролизом сахарозы; и

c) выделение 2’-фукозиллактозы.

2. Способ по п. 1, где в указанной генетически сконструированной клетке E. coli дополнительно содержится путь биосинтеза УДФ-галактозы для внутриклеточного образования УДФ-галактозы, причем путь биосинтеза УДФ-галактозы включает в себя сверхэкспрессию гена galE E. coli, гена pgm E. coli и гена β-1,4-галактозилтрансферазы galTpm1141 из Pasteurella multocida.

3. Способ по п. 1 или 2, где указанная генетически сконструированная клетка E. coli дополнительно содержит по меньшей мере один транспортер моносахарида для транслокации моносахарида из среды в цитоплазму клетки E. coli, предпочтительно, кодируемый геном белка облегченной диффузии глюкозы glf из Zymomonas mobilis.

4. Способ по любому из пп. 1-3, где ген α-1,2-фукозилтрансферазы представляет собой ген 2'-фукозилтрансферазы wbgL из E. coli:O126.

5. Способ по п. 1, где генетически сконструированная E. coli содержит кластер генов csc E. coli W.

6. Способ по п. 1, где генетически сконструированная клетка E. coli дополнительно содержит генотип glk ^– , gcd ^– , ptsG ^– .

Images