RU2804112C1 - Set of oligonucleotide primers for determining methylation of human cxcr4 gene promoter in samples of biological material that has undergone preliminary bisulfite conversion using pyrosequencing - Google Patents
Set of oligonucleotide primers for determining methylation of human cxcr4 gene promoter in samples of biological material that has undergone preliminary bisulfite conversion using pyrosequencing Download PDFInfo
- Publication number
- RU2804112C1 RU2804112C1 RU2022135019A RU2022135019A RU2804112C1 RU 2804112 C1 RU2804112 C1 RU 2804112C1 RU 2022135019 A RU2022135019 A RU 2022135019A RU 2022135019 A RU2022135019 A RU 2022135019A RU 2804112 C1 RU2804112 C1 RU 2804112C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cxcr4
- gene promoter
- pyrosequencing
- seq
- samples
- Prior art date
Links
- 230000011987 methylation Effects 0.000 title claims abstract description 18
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 title claims abstract description 10
- 101100497623 Homo sapiens CXCR4 gene Proteins 0.000 title claims abstract description 10
- 239000012620 biological material Substances 0.000 title claims abstract description 7
- 238000012175 pyrosequencing Methods 0.000 title claims description 22
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 title claims description 15
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 title description 10
- 239000013615 primer Substances 0.000 claims abstract description 34
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims abstract description 10
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 101150066398 CXCR4 gene Proteins 0.000 claims description 20
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 10
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 10
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 claims description 9
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 4
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 claims description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 abstract description 13
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 101150017501 CCR5 gene Proteins 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 19
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- 238000011160 research Methods 0.000 description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 3
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 3
- IRLPACMLTUPBCL-FCIPNVEPSA-N adenosine-5'-phosphosulfate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@@H](CO[P@](O)(=O)OS(O)(=O)=O)[C@H](O)[C@H]1O IRLPACMLTUPBCL-FCIPNVEPSA-N 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 3
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 108010007730 Apyrase Proteins 0.000 description 2
- 102000007347 Apyrase Human genes 0.000 description 2
- 108091029523 CpG island Proteins 0.000 description 2
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 2
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 2
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 2
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 102000004523 Sulfate Adenylyltransferase Human genes 0.000 description 2
- 108010022348 Sulfate adenylyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 2
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 101150059521 AHRR gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004274 CCR5 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010017088 CCR5 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108010061299 CXCR4 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000012000 CXCR4 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 230000007067 DNA methylation Effects 0.000 description 1
- 230000030933 DNA methylation on cytosine Effects 0.000 description 1
- 101150064320 FKBP5 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 1
- 101150042248 Mgmt gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000012568 clinical material Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- LIYGYAHYXQDGEP-UHFFFAOYSA-N firefly oxyluciferin Natural products Oc1csc(n1)-c1nc2ccc(O)cc2s1 LIYGYAHYXQDGEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 101150008380 gstp1 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000006607 hypermethylation Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- JJVOROULKOMTKG-UHFFFAOYSA-N oxidized Photinus luciferin Chemical compound S1C2=CC(O)=CC=C2N=C1C1=NC(=O)CS1 JJVOROULKOMTKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000007420 reactivation Effects 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Abstract
Description
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к определению метилирования промотора гена CXCR4 в образах биологического материала, подвергшегося предварительной бисульфитной конверсии, методом пиросеквенирования. Изобретение предназначено для оценки уровня метилирования промоторных областей гена CXCR4 и может применяться в исследованиях по изучению влияния метилирования генов хозяина на жизненный цикл вируса иммунодефицита человека (ВИЧ).The invention relates to the field of biotechnology, in particular to the determination of methylation of the CXCR4 gene promoter in samples of biological material that has undergone preliminary bisulfite conversion, using the pyrosequencing method. The invention is intended to assess the level of methylation of the promoter regions of the CXCR4 gene and can be used in studies studying the influence of host gene methylation on the life cycle of the human immunodeficiency virus (HIV).
ВИЧ-инфекция длительно текущая инфекционная болезнь, развивающаяся в результате инфицирования ВИЧ, поражающего и вызывающего гибель клеток иммунной системы. Вирус передается от человека к человеку половым путем, при переливании крови или ее компонентов, пересадке органов, парентеральных вмешательствах, а также от инфицированной матери к плоду во время беременности, при прохождении ребенка по родовому пути и грудном вскармливании. Проникновение ВИЧ в клетку регулируется рецепторами CCR5 и CXCR4, располагающихся на поверхности CD4+ клеток. Метилирование цитозина в промоторе гена является одним из механизмов регуляции экспрессии белка. Гиперметилирование определенных локусов в промоторе гена CXCR4 может ингибировать работу данного рецептора.HIV infection is a long-term infectious disease that develops as a result of HIV infection, which affects and causes the death of cells of the immune system. The virus is transmitted from person to person through sexual contact, through transfusion of blood or its components, organ transplantation, parenteral interventions, as well as from an infected mother to the fetus during pregnancy, during the passage of the child through the birth canal and breastfeeding. The penetration of HIV into cells is regulated by the CCR5 and CXCR4 receptors located on the surface of CD4+ cells. Cytosine methylation in the gene promoter is one of the mechanisms for regulating protein expression. Hypermethylation of certain loci in the promoter of the CXCR4 gene can inhibit the functioning of this receptor.
Определение потенциальных мишеней для создания отечественных персонализированных подходов при разработке генотерапевтических препаратов является перспективной задачей. С целью определения таких потенциальных мишеней предложено определить статус метилирования промотора гена CXCR4 методом пиросеквенирования.Determining potential targets for creating domestic personalized approaches to the development of gene therapy drugs is a promising task. In order to identify such potential targets, it was proposed to determine the methylation status of the CXCR4 gene promoter using pyrosequencing.
Известны протоколы исследования направлены на выявление специфических нуклеотидных последовательностей в генах и межгенных промежутках, в частности: для определения уровня метилирования промоторных областей гена SLC01B3 [патент CN110734981, дата подачи 20.07.2018, дата публикации 31.01.2020]; для качественного определения метилированных участков промотора гена MGMT [патент CN108570504, дата подачи 15.06.2018, дата публикации 25.09.2018]; для определения уровня метилирования гена AHRR методом пиросеквенирования [патент CN113604552, дата подачи 23.07.2021, дата публикации 05.11.2021]; для определения уровня метилирования гена FKBP5 методом пиросеквенирования [патент CN113462767, дата подачи 23.07.2021, дата публикации 01.10.2021]; для определения уровня метилирования промоторных участков гена GSTP1 методом пиросеквенирования [патент CN109182518, дата подачи 12.09.2018, дата публикации 11.01.2019]. Решения, описанные в упомянутых изобретениях, не предусматривают определение метилирования промотора гена человека CXCR4.Known research protocols are aimed at identifying specific nucleotide sequences in genes and intergenic spaces, in particular: to determine the level of methylation of the promoter regions of the SLC01B3 gene [patent CN110734981, filing date 07/20/2018, publication date 01/31/2020]; for qualitative determination of methylated regions of the MGMT gene promoter [patent CN108570504, filing date 06/15/2018, publication date 09/25/2018]; to determine the level of methylation of the AHRR gene by pyrosequencing [patent CN113604552, filing date 07/23/2021, publication date 11/05/2021]; to determine the level of methylation of the FKBP5 gene by pyrosequencing [patent CN113462767, filing date 07/23/2021, publication date 10/01/2021]; to determine the level of methylation of the promoter regions of the GSTP1 gene by pyrosequencing [patent CN109182518, filing date 09/12/2018, publication date 01/11/2019]. The solutions described in the mentioned inventions do not involve determining the methylation of the promoter of the human CXCR4 gene.
Технический результат заявляемого изобретения направлен на выявление метилированных участков промотора гена CXCR4 в образцах биологического материала посредством таких олигонуклеотидов - праймеров которые позволяют эффективно определять уровень метилирования промотора гена CXCR4 с использованием метода пиросеквенирования.The technical result of the claimed invention is aimed at identifying methylated regions of the CXCR4 gene promoter in samples of biological material using such oligonucleotide primers that make it possible to effectively determine the level of methylation of the CXCR4 gene promoter using the pyrosequencing method.
Заявленный технический результат достигается за счет применения химически-синтезированных олигонуклеотидов для определения метилированных участков промотора гена CXCR4 имеющих следующий состав:The declared technical result is achieved through the use of chemically synthesized oligonucleotides to determine the methylated regions of the CXCR4 gene promoter having the following composition:
прямой праймер E-CXCR4-F1 - SEQ ID NO: 1,forward primer E-CXCR4-F1 - SEQ ID NO: 1,
обратный праймер E-CXCR4-R1 - SEQ ID NO: 2,reverse primer E-CXCR4-R1 - SEQ ID NO: 2,
секвенирующий праймер E-CXCR4-S - SEQ ID NO: 3.sequencing primer E-CXCR4-S - SEQ ID NO: 3.
Праймеры представляют собой последовательности олигонуклеотидов для амплификации фрагмента, содержащего промотор гена CXCR4 в биологических образцах.Primers are oligonucleotide sequences for amplifying the fragment containing the CXCR4 gene promoter in biological samples.
Олигонуклеотиды, входящие в состав заявляемого набора, разработаны на основе проведенного анализа конвертированных последовательностей промотора гена CXCR4 человека (взятых из базы данных NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)), в результате выбран фрагмент для детекции метилированного участка промотора гена CXCR4 к которому подобраны прямой и обратный праймеры для амплификации фрагмента длиной 168 пар оснований, а также праймер для пиросеквенирования (прямой праймер E-CXCR4-F1 - SEQ ID NO: 1; обратный праймер E-CXCR4-R1 - SEQ ID NO: 2; праймер для пиросеквенирования E-CXCR4-S - SEQ ID NO: 3).The oligonucleotides included in the claimed set were developed based on the analysis of the converted sequences of the human CXCR4 gene promoter (taken from the NCBI database (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)), as a result, a fragment was selected for detection of methylated region of the CXCR4 gene promoter to which forward and reverse primers were selected to amplify a fragment of 168 base pairs in length, as well as a primer for pyrosequencing (forward primer E-CXCR4-F1 - SEQ ID NO: 1; reverse primer E-CXCR4-R1 - SEQ ID NO : 2; pyrosequencing primer E-CXCR4-S - SEQ ID NO: 3).
Для подбора целевых последовательностей - мест посадки олигонуклеотидов, используют фрагменты референсных геномов человека из базы данных NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Для поиска промоторов гена используют данные базы Eukaryotic Promoter database (https://epd.epfl.ch//index.php). Составляют перечень мишеней для детекции метилированных участков промотора гена CXCR4 с помощью базы данных UCSC Genome browser (http://genome.ucsc.edu/) путем наложения последовательности CpG-островков на последовательность промотора гена. Затем подбирают олигонуклеотидные последовательности прямого и обратного праймеров, а также праймера для пиросеквенирования с учетом проведения бисульфитной конверсии исследуемых последовательностей. Упомянутые олигонуклеотидные последовательности приведены в Таблице 1.To select target sequences - oligonucleotide landing sites, fragments of reference human genomes from the NCBI database (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) are used. To search for gene promoters, data from the Eukaryotic Promoter database (https://epd.epfl.ch//index.php) is used. A list of targets is compiled for detection of methylated regions of the CXCR4 gene promoter using the UCSC Genome browser database (http://genome.ucsc.edu/) by superimposing the sequence of CpG islands on the sequence of the gene promoter. Then the oligonucleotide sequences of the forward and reverse primers, as well as the primer for pyrosequencing, are selected taking into account the bisulfite conversion of the sequences under study. The mentioned oligonucleotide sequences are shown in Table 1.
Анализ результатов секвенирования продемонстрировал, что прямой праймер Е-CXCR4-F1 (SEQ ID NO: 1) и обратный праймер E-CXCR4-R1 (SEQ ID NO: 2) в реакции пиросеквенирования с секвенирующим праймером E-CXCR4-S (SEQ ID NO: 3) амплифицируют участок промотора гена человека CXCR4 со 100% специфичностью.Analysis of the sequencing results demonstrated that the forward primer E-CXCR4-F1 (SEQ ID NO: 1) and the reverse primer E-CXCR4-R1 (SEQ ID NO: 2) in the pyrosequencing reaction with the sequencing primer E-CXCR4-S (SEQ ID NO : 3) amplify the promoter region of the human CXCR4 gene with 100% specificity.
где Biotin - модификация олигонуклеотида для иммобилизации на твердых носителях (предназначен для связывания матрицы и сефарозы в реакции пробоподготовки пиросеквенирования).where Biotin is a modification of the oligonucleotide for immobilization on solid supports (intended for binding the matrix and Sepharose in the pyrosequencing sample preparation reaction).
В качестве материала используются обработанная бисульфитом ДНК, экстрагированная из цельной (венозной) крови человека.The material used is bisulfite-treated DNA extracted from human whole (venous) blood.
ПЦР-исследование проводят в соответствии с МУ 1.3.2569-09 «Организация работ лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности». Для экстракции ДНК может быть использован комплект реагентов «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) или любой аналогичный набор/комплект реагентов для выделения ДНК. Оптимальная концентрация ДНК 103-105 копий в 10 мкл. Реакцию бисульфитной конверсии проводят с помощью комплекта реагентов «EpiTect Bisulfite Kit» (QIAGEN, Германия) или аналогичного коммерчески-доступного комплекта реагентов в соответствии с инструкцией производителя.PCR research is carried out in accordance with MU 1.3.2569-09 “Organization of work in laboratories using nucleic acid amplification methods when working with material containing microorganisms of pathogenicity groups I-IV.” For DNA extraction, the RIBO-prep reagent kit (FBUN Central Research Institute of Epidemiology of Rospotrebnadzor, Russia) or any similar kit/reagent kit for DNA extraction can be used. The optimal DNA concentration is 10 3 -10 5 copies in 10 µl. The bisulfite conversion reaction is carried out using the EpiTect Bisulfite Kit (QIAGEN, Germany) or a similar commercially available reagent kit in accordance with the manufacturer's instructions.
Пиросеквенирование - метод определения нуклеотидной последовательности в режиме реального времени, основанный на детекции высвобождающегося пирофосфата после цепочки ферментативных реакций. Определение осуществляется в ходе следующего процесса: в начале проводится наработка ампликона специфического фрагмента последовательности исследуемого гена методом полимеразной цепной реакции.Pyrosequencing is a method for determining the nucleotide sequence in real time, based on the detection of released pyrophosphate after a chain of enzymatic reactions. The determination is carried out during the following process: first, an amplicon of a specific fragment of the sequence of the gene under study is produced using the polymerase chain reaction method.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - это эффективный способ получения in vitro большого числа копий специфических нуклеотидных последовательностей. Их амплификация осуществляется в ходе трехэтапного циклического процесса.Polymerase chain reaction (PCR) is an effective way to obtain large numbers of copies of specific nucleotide sequences in vitro. Their amplification occurs through a three-step cyclic process.
Процесс ПЦР-амплификации заключается в многократном повторении процессов денатурации, ренатурации и синтеза. Денатурация (95°С) - термическое воздействие на молекулу ДНК с целью получения одноцепочечной структуры. Ренатурация (55-60°С) -праймеры, добавленные в реакцию спариваются с разделенными цепями. Синтез (70-75°С) - синтез второй цепи ДНК. Каждый цикл длится 3-5 мин.The PCR amplification process consists of repeated repetitions of the processes of denaturation, renaturation and synthesis. Denaturation (95°C) is a thermal effect on a DNA molecule in order to obtain a single-stranded structure. Renaturation (55-60°C) - primers added to the reaction couple with the separated chains. Synthesis (70-75°C) - synthesis of the second strand of DNA. Each cycle lasts 3-5 minutes.
Затем проводится инкубация праймера и одноцепочечной матрицы в присутствии ДНК-полимер азы, АТФ-сульфурилазы, люциферазы, апиразы, и субстратов: аденозин - 5'-фосфосульфата (APS) и люциферина. Затем проводят добавление первого дезоксирибонуклеотид трифосфата (dNTP) в реакцию. ДНК-полимераза катализирует добавление dNTP к праймеру для секвенирования, если он комплементарен к последовательности матрицы ДНК. Каждое присоединение к цепи сопровождается выделением пирофосфата (PPi) в количестве, эквимолярном количеству встроившихся нуклеотидов. АТФ-сульфурилаза превращает пирофосфат в АТФ в присутствии аденозин-5'-фосфосульфата.Then the primer and single-stranded template are incubated in the presence of DNA polymerase, ATP sulfurylase, luciferase, apyrase, and substrates: adenosine 5'-phosphosulfate (APS) and luciferin. The first deoxyribonucleotide triphosphate (dNTP) is then added to the reaction. DNA polymerase catalyzes the addition of a dNTP to a sequencing primer if it is complementary to the DNA template sequence. Each addition to the chain is accompanied by the release of pyrophosphate (PPi) in an amount equimolar to the amount of inserted nucleotides. ATP sulfurylase converts pyrophosphate to ATP in the presence of adenosine 5'-phosphosulfate.
Образовавшаяся АТФ запускает люциферазо-опосредованную реакцию окисления люциферина в оксилюциферин, в результате чего происходит образование видимого света в количестве, пропорциональном количеству АТФ. Свет детектируется CCD-камерой и отображается на пирограмме в виде пиков. Высота пиков пропорциональна количеству нуклеотидов, встроившихся в матрицу. В течение всей реакции фермент апираза деградирует невстроившиеся нуклеотиды и избыток АТФ. После завершения деградации нуклеотидов, невстроившихся в цепь ДНК, добавляется новый нуклеотид. Добавление нуклеотидов осуществляется последовательно. В течение реакции комплементарная цепь ДНК достраивается, и последовательность нуклеотидов определяется согласно пикам на пирограмме. Процент метилирования искомых CpG-нуклеотидов в анализируемой последовательности определяется программным обеспечением прибора автоматически.The resulting ATP triggers the luciferase-mediated oxidation reaction of luciferin to oxyluciferin, resulting in the production of visible light in an amount proportional to the amount of ATP. The light is detected by a CCD camera and appears as peaks on the pyrogram. The height of the peaks is proportional to the number of nucleotides embedded in the matrix. Throughout the reaction, the apyrase enzyme degrades unincorporated nucleotides and excess ATP. After the degradation of nucleotides that are not integrated into the DNA chain is completed, a new nucleotide is added. The addition of nucleotides is carried out sequentially. During the reaction, the complementary DNA strand is completed, and the nucleotide sequence is determined according to the peaks on the pyrogram. The percentage of methylation of the desired CpG nucleotides in the analyzed sequence is determined automatically by the instrument software.
Для детекции метилированных участков промотора гена человека CXCR4 проводят ПЦР с применением представленных в Таблице 1 олигонуклеотидных праймеров SEQ ID NO: 1,2.To detect methylated regions of the human CXCR4 gene promoter, PCR is performed using the oligonucleotide primers SEQ ID NO: 1,2 presented in Table 1.
ПЦР проводят при следующих условиях: Общий объем реакционной смеси - 25 мкл.PCR is carried out under the following conditions: The total volume of the reaction mixture is 25 µl.
Компоненты ПЦР смешиваются следующим образом:PCR components are mixed as follows:
(a) 5 мкл смеси, содержащей:(a) 5 µl of a mixture containing:
-олигонуклеотидные праймеры SEQ ID NO NO: 1, 2 - по 0,7 мМ; -dNTPs - 0,44 мМ.-oligonucleotide primers SEQ ID NO NO: 1, 2 - 0.7 mM each; -dNTPs - 0.44 mM.
(b) реактив, содержащий рекомбинантный фермент Taq ДНК-полимеразу, например, 0,5 мкл «Полимераза TaqF» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, Россия) или любой аналогичный коммерческий набор в соответствии с инструкцией производителя.(b) a reagent containing recombinant enzyme Taq DNA polymerase, for example, 0.5 μl of “TaqF Polymerase” (FBUN Central Research Institute of Epidemiology of Rospotrebnadzor, Moscow, Russia) or any similar commercial kit in accordance with the manufacturer’s instructions.
(c) ПЦР-буфер, содержащий Сульфат аммония и MgCl2, например, 10,0 мкл ПЦР-буфера «ПЦР-буфер blue» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, Россия) или любого аналогичного коммерческого набора в соответствии с инструкцией производителя.(c) PCR buffer containing ammonium sulfate and MgCl2, for example, 10.0 μl of PCR buffer “PCR buffer blue” (FBUN Central Research Institute of Epidemiology of Rospotrebnadzor, Moscow, Russia) or any similar commercial kit in accordance with the manufacturer’s instructions.
(d) полученная методом бисульфитной конверсии ДНК 10 мкл. Амплификацию проводят на любом амплификаторе в соответствии с инструкцией(d) DNA obtained by bisulfite conversion method, 10 µl. Amplification is carried out using any amplifier in accordance with the instructions
производителя. При постановке реакции амплификации на приборе «Терцик» (НПО «ДНК-технология», Протвино, Россия) перед добавлением образцов необходимо добавить 10 мкл минерального масла для ПЦР.manufacturer. When setting up the amplification reaction on the Tertsik device (NPO DNA Technology, Protvino, Russia), before adding samples, you must add 10 μl of mineral oil for PCR.
Амплификацию проводят по следующей программе: 1 цикл 95°С в течение 15 минут, 45 циклов при температуре 95°С - 10 секунд / 60°С - 20 секунд.Amplification is carried out according to the following program: 1 cycle at 95°C for 15 minutes, 45 cycles at a temperature of 95°C - 10 seconds / 60°C - 20 seconds.
Реакцию пиросеквенирования проводят с применением секвенирующего праймера, представленного в Таблице 1 (SEQ ID NO: 3). Количество реагентов для работы с прибором рассчитывается программным обеспечением прибора автоматически. Пробоподготовку образцов перед реакцией пиросеквенирования проводят на наборе реагентов ПИРО-преп (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, Россия) или любом аналогичном коммерческом наборе в соответствии с инструкцией производителя согласно инструкции производителя.The pyrosequencing reaction is carried out using the sequencing primer shown in Table 1 (SEQ ID NO: 3). The amount of reagents for working with the device is calculated automatically by the device software. Sample preparation of samples before the pyrosequencing reaction is carried out using a PIRO-prep reagent kit (FBUN Central Research Institute of Epidemiology of Rospotrebnadzor, Moscow, Russia) or any similar commercial kit in accordance with the manufacturer’s instructions according to the manufacturer’s instructions.
Заявляемое изобретение является результатом работы в рамках внутреннего гранта «Влияние статуса метилирования ДНК у ВИЧ-1 положительных лиц на реактивацию вирусных резервуаров» ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора (Москва, Россия), номер 122053000056-2.The claimed invention is the result of work within the framework of the internal grant “The influence of DNA methylation status in HIV-1 positive individuals on the reactivation of viral reservoirs” by the Central Research Institute of Epidemiology of Rospotrebnadzor (Moscow, Russia), number 122053000056-2.
Реализация заявляемого изобретения поясняется следующими примерами:The implementation of the claimed invention is illustrated by the following examples:
Пример 1. Получение набора олигонуклеотидных праймеров для определения метилирования промотора гена CXCR4.Example 1. Preparation of a set of oligonucleotide primers to determine methylation of the CXCR4 gene promoter.
Для подбора целевых последовательностей - мест посадки олигонуклеотидов, использовали фрагменты референсных геномов человека из базы данных NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Для поиска промоторов гена применяют данные базы Eukaryotic Promoter database (https://epd.epfl.ch//index.php). Составляют перечень мишеней для детекции метилированных участков промотора гена CXCR4 с помощью базы данных UCSC Genome browser (http://genome.ucsc.edu/) путем наложения последовательности CpG-островков на последовательность промотора гена, на основании которых подбирают олигонуклеотидные последовательности прямого E-CXCR4-F1 и обратного E-CXCR4-R1 праймеров, а также праймер для пиросеквенирования E-CXCR4-S.To select target sequences - sites for landing oligonucleotides, we used fragments of reference human genomes from the NCBI database (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). To search for gene promoters, data from the Eukaryotic Promoter database (https://epd.epfl.ch//index.php) is used. A list of targets for detection of methylated regions of the CXCR4 gene promoter is compiled using the UCSC Genome browser database (http://genome.ucsc.edu/) by superimposing the sequence of CpG islands on the sequence of the gene promoter, on the basis of which oligonucleotide sequences of direct E-CXCR4 are selected -F1 and reverse E-CXCR4-R1 primers, as well as the pyrosequencing primer E-CXCR4-S.
Олигонуклеотиды для определения метилированного участка промотора гена человека CXCR4 - прямой праймер E-CXCR4-F1, обратный праймер E-CXCR4-R1, праймер для пиросеквенирования E-CXCR4-S, представлены уникальными последовательностями SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3 соответственно.Oligonucleotides for determining the methylated region of the human CXCR4 gene promoter - forward primer E-CXCR4-F1, reverse primer E-CXCR4-R1, primer for pyrosequencing E-CXCR4-S, are represented by unique sequences SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3 respectively.
Пример 2. Подтверждение присутствия ампликона, содержащего участок промотора гена CXCR4 методом ПЦР с детекцией в агарозном геле.Example 2. Confirmation of the presence of an amplicon containing the promoter region of the CXCR4 gene by PCR with detection in an agarose gel.
Подтверждение присутствия ампликона, содержащего участок промотора гена CXCR4 проводили методом ПЦР. Общий объем реакционной смеси - 25 мкл.The presence of an amplicon containing the CXCR4 gene promoter region was confirmed by PCR. The total volume of the reaction mixture is 25 µl.
Компоненты ПЦР смешивали следующим образом:PCR components were mixed as follows:
(a) 5 мкл смеси, содержащей:(a) 5 µl of a mixture containing:
- олигонуклеотидные праймеры: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 по 0,7 мМ;- oligonucleotide primers: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, 0.7 mM;
- dNTPs - 0,44 мМ.- dNTPs - 0.44 mM.
(b) 0,5 мкл реактива «Полимераза TaqF» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия), содержащего рекомбинантный фермент Taq ДНК-полимеразу.(b) 0.5 μl of the “TaqF Polymerase” reagent (FBUN Central Research Institute of Epidemiology of Rospotrebnadzor, Russia), containing the recombinant enzyme Taq DNA polymerase.
(c) 10,0 мкл ПЦР-буфера «2.5х ПЦР-буфер blue» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия), содержащего MgCl2.(c) 10.0 μl of PCR buffer “2.5x PCR buffer blue” (FBUN Central Research Institute of Epidemiology of Rospotrebnadzor, Russia) containing MgCl 2 .
(d) 10,0 мкл минерального масла для ПЦР (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия).(d) 10.0 μl of mineral oil for PCR (FBUN Central Research Institute of Epidemiology of Rospotrebnadzor, Russia).
(e) 10,0 мкл ДНК, подвергшейся бисульфитной конверсии.(e) 10.0 µl of bisulfite-converted DNA.
ПЦР проводили с детекцией результата в агарозном геле. Длина получившегося фрагмента соответствовала ожидаемой (168 пар нуклеотидов).PCR was carried out with detection of the result in an agarose gel. The length of the resulting fragment corresponded to the expected length (168 nucleotide pairs).
Подготовленный описанным способом материал, содержащий уникальные олигонуклеотидные последовательности (SEQ ID NO: 1, 2) участка промотора гена CXCR4, использовали для определения метилирования участка промотора гена CXCR4 при помощи пиросеквенирования в образцах биологического материала.The material prepared in the described manner, containing unique oligonucleotide sequences (SEQ ID NO: 1, 2) of the CXCR4 gene promoter region, was used to determine the methylation of the CXCR4 gene promoter region using pyrosequencing in samples of biological material.
Пример 3. Определение метилирования промотора гена CXCR4 методом пиросеквенирования.Example 3. Determination of methylation of the CXCR4 gene promoter by pyrosequencing.
Для определения метилированного участка промотора гена человека CXCR4 выбрано 20 образцов ДНК человека, обработанных методом бисульфитной конверсии.To determine the methylated region of the human CXCR4 gene promoter, 20 human DNA samples were selected, processed by the bisulfite conversion method.
Для исследования использовали клинический материал - цельная венозная кровь человека.Clinical material was used for the study - human venous whole blood.
Выделение ДНК из биологического материала проводили в соответствии с МУ 1.3.2569-09 «Организация работ лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности».Isolation of DNA from biological material was carried out in accordance with MU 1.3.2569-09 “Organization of work in laboratories using nucleic acid amplification methods when working with material containing microorganisms of pathogenicity groups I-IV.”
Выделение ДНК осуществляли методом нуклеопреципитации с применением набора реагентов «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, Россия) в соответствии с инструкцией к набору.DNA extraction was carried out by nucleoprecipitation using the RIBO-prep reagent kit (FBUN Central Research Institute of Epidemiology of Rospotrebnadzor, Moscow, Russia) in accordance with the instructions for the kit.
Бисульфитную обработку проводили с применением набора реагентов «EpiTect Bisulfite Kit» (QIAGEN, Германия) в соответствии с инструкцией производителя.Bisulfite treatment was carried out using the EpiTect Bisulfite Kit reagents (QIAGEN, Germany) in accordance with the manufacturer's instructions.
ПЦР проводили в условиях, описанных в Примере 2, с использованием уникальных о л иго нуклеотидных последовательностей SEQ ID NO: 1,2.PCR was carried out under the conditions described in Example 2, using unique oligonucleotide sequences SEQ ID NO: 1,2.
Амплификацию проводили на приборе «Терцик» («НПО ДНК-Технология», Протвино, Россия) по следующей программе: 1 цикл 95°С в течение 15 минут, 45 циклов при температуре 95°С 10 секунд / 60°С 20 секунд.Amplification was carried out on a Tertsik device (NPO DNA-Technology, Protvino, Russia) according to the following program: 1 cycle at 95°C for 15 minutes, 45 cycles at 95°C for 10 seconds / 60°C for 20 seconds.
Пиросеквенирование проводили на приборе PyroMARK Q24 («Qiagen», Германия) с набором реагентов, рекомендованным производителей (PyroMark Gold Q24 Reagents («Qiagen», Germany)) при инкубации использовался секвенирующий праймер E-CXCR4-S (SEQ ID NO: 3). Прибор запускался по следующей программе:Pyrosequencing was carried out on a PyroMARK Q24 device (Qiagen, Germany) with a set of reagents recommended by the manufacturer (PyroMark Gold Q24 Reagents (Qiagen, Germany)); the sequencing primer E-CXCR4-S (SEQ ID NO: 3) was used during incubation. The device was started according to the following program:
SA: YGYGGTYGGATTTTTATAAAAATAYGTTTYGAGYGYGGYGTATGYGTYGT; DO: GTCAGTCAGTCGATTATAATGTATCAGTTCGATGTCAGTCAGTCGTA.SA: YGYGGTYGGATTTTTATAAAAATAYGTTTYGAGYGYGGYGTATGYGTYGT; DO: GTCAGTCAGTCGATTATAATGTATCAGTTCGATGTCAGTCAGTCGTA.
Расчет количества реагентов автоматически произведен программным обеспечением прибора.The amount of reagents is calculated automatically by the device software.
Во всех образцах при проведении пиросеквенирования последовательность читаема, полученные пики ожидаемой высоты, заданная прибору последовательность совпадает с полученной.In all samples when performing pyrosequencing, the sequence is readable, the resulting peaks are of the expected height, the sequence assigned to the device coincides with the received one.
Таким образом, во всех 20 образцах, содержащих метилированные участки промотора гена человека CXCR4 удается проанализировать результаты и получить при помощи программного обеспечения прибора процент метилирования.Thus, in all 20 samples containing methylated regions of the human CXCR4 gene promoter, it was possible to analyze the results and obtain the percentage of methylation using the device software.
Набор уникальных синтезированных олигонуклеотидных праймеров SEQ ID NO: 1-3 не дает перекрестных реакций с другими последовательностями генома, амлифицирует последовательность, включающую целевые метилированные локусы в промоторе гена CXCR4 со 100% специфичностью, что подтверждено вышеуказанными условиями секвенирования.A set of unique synthesized oligonucleotide primers SEQ ID NO: 1-3 does not cross-react with other genome sequences, and amplifies the sequence including target methylated loci in the CXCR4 gene promoter with 100% specificity, which is confirmed by the above sequencing conditions.
Claims (7)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2804112C1 true RU2804112C1 (en) | 2023-09-26 |
Family
ID=
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2630669C1 (en) * | 2016-07-21 | 2017-09-11 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор") | Method for determination of methylation of colorectal cancer tumor marker genes regulatory regions pucgpy sites by glad-pcr analysis, and set of oligonucleotide primers and fluorescence-labelled probes for implementation of this method |
| CN108570504A (en) * | 2018-06-15 | 2018-09-25 | 上海润达榕嘉生物科技有限公司 | A kind of MGMT promoter methylations detection primer and its detection method |
| CN109182518A (en) * | 2018-09-12 | 2019-01-11 | 黄映辉 | GSTP1 gene promoter methylation detection method based on pyrosequencing techniques |
| CN113462767A (en) * | 2021-07-23 | 2021-10-01 | 新开源晶锐(广州)生物医药科技有限公司 | FKBP5 gene methylation detection primer and kit based on pyrosequencing technology |
| CN113604552A (en) * | 2021-07-23 | 2021-11-05 | 新开源晶锐(广州)生物医药科技有限公司 | AHRR gene methylation detection primer and kit based on pyrosequencing technology |
| RU2760573C1 (en) * | 2021-01-20 | 2021-11-29 | Общество с ограниченной ответственностью "Эс Джи" | Set of oligonucleotide primers and fluorescently labelled probes for identifying the epigenetic markers of cervical cancer |
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2630669C1 (en) * | 2016-07-21 | 2017-09-11 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор") | Method for determination of methylation of colorectal cancer tumor marker genes regulatory regions pucgpy sites by glad-pcr analysis, and set of oligonucleotide primers and fluorescence-labelled probes for implementation of this method |
| CN108570504A (en) * | 2018-06-15 | 2018-09-25 | 上海润达榕嘉生物科技有限公司 | A kind of MGMT promoter methylations detection primer and its detection method |
| CN109182518A (en) * | 2018-09-12 | 2019-01-11 | 黄映辉 | GSTP1 gene promoter methylation detection method based on pyrosequencing techniques |
| RU2760573C1 (en) * | 2021-01-20 | 2021-11-29 | Общество с ограниченной ответственностью "Эс Джи" | Set of oligonucleotide primers and fluorescently labelled probes for identifying the epigenetic markers of cervical cancer |
| CN113462767A (en) * | 2021-07-23 | 2021-10-01 | 新开源晶锐(广州)生物医药科技有限公司 | FKBP5 gene methylation detection primer and kit based on pyrosequencing technology |
| CN113604552A (en) * | 2021-07-23 | 2021-11-05 | 新开源晶锐(广州)生物医药科技有限公司 | AHRR gene methylation detection primer and kit based on pyrosequencing technology |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| СКРЯБИН Н.А и др., Методы исследования метилирования ДНК: возможности и перспективы использования в онкологии, СИБИРСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013, 6 (60), с. 60-64. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Leutenegger et al. | Quantitative real-time PCR for the measurement of feline cytokine mRNA | |
| EP1322782B1 (en) | Method of nucleic acid typing or sequencing | |
| JP2846018B2 (en) | Amplification and detection of nucleic acid sequences | |
| EP3063292B1 (en) | Nucleic acid probe with single fluorophore label bound to internal cytosine for use in loop mediated isothermal amplification | |
| Hadidi et al. | Polymerase chain reaction | |
| JP2018516594A5 (en) | ||
| CN116356075A (en) | A kind of primer probe, primer probe set and application thereof for detection | |
| CN117529560A (en) | Method and kit for detecting microRNA | |
| CN114317690B (en) | Method for preamplifying multi-target nucleic acid combined with fluorescence quantitative PCR detection | |
| EP3004398B1 (en) | Real-time pcr point mutation assays for detecting hiv-1 resistance to antiviral drugs | |
| RU2612137C1 (en) | Method for identification of tularemia pathogen subspecies francisella tularensis subsp tularensis, francisella tularensis subsp mediasiatica and francisella tularensis subsp holarctica | |
| WO2016165591A1 (en) | Mgmt gene promoter methylation detection based on pyrosequencing technology | |
| US20100009412A1 (en) | Novel Oligonucleotide Primers and Methods for DNA Replication | |
| RU2804112C1 (en) | Set of oligonucleotide primers for determining methylation of human cxcr4 gene promoter in samples of biological material that has undergone preliminary bisulfite conversion using pyrosequencing | |
| JP5258760B2 (en) | Method for amplifying methylated or unmethylated nucleic acid | |
| RU2804111C1 (en) | Set of oligonucleotide primers for determining methylation of human ccr5 gene promoter in samples of biological material that has undergone preliminary bisulfite conversion using pyrosequencing | |
| EP1013775A1 (en) | Quantitative polymerase chain reaction using a fluorogenic real-time detection system | |
| US11414698B2 (en) | Method of quantifying mutant allele burden of target gene | |
| KR20200047384A (en) | A primer set for detection of severe fever with thrombocytopenia syndrome (sfts) virus | |
| US20230416824A1 (en) | Systems for the detection of targeted gene variations and viral genomes and methods of producing and using same | |
| CN116411139A (en) | Universal primer group, probe and detection method for detecting multi-subtype HIV-1 | |
| RU2455364C2 (en) | Method of identifying mycobacteria by polymerase chain reaction | |
| RU2806427C1 (en) | Set of oligonucleotide primers and probes for species differentiation of human herpes virus 6a and human herpes virus 6b and method of its use | |
| RU2806428C1 (en) | Set of oligonucleotide primers and probe for detection of human herpes virus 6b | |
| RU2802953C1 (en) | Set of oligonucleotide primers and a probe for the detection of human herpes virus 6b |