RU2848685C2 - Цвиттер-ионный флуоресцентный зонд, модифицированный полиэтиленгликолем (варианты), и содержащий его препарат - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к цвиттер-ионному флуоресцентному зонду, модифицированному полиэтиленгликолем, лиофилизированному препарату, содержащему цвиттер-ионный флуоресцентный зонд. Флуоресцентный зонд настоящего изобретения предназначен для флуоресцентной визуализации в ближнем инфракрасном диапазоне. Благодаря простому методу синтеза, высокой квантовой отдаче флуоресценции, низкому неспецифическому флуоресцентному сигналу и высокому отношению сигнал/шум при обнаружении опухолей, зонд данного изобретения обладает хорошими медико-биологическими свойствами и подходит для промышленного производства и внедрения в клинике. 3 н. и 3 з.п. ф-лы, 11 ил., 1 табл., 5 пр.

Description

ОБДАСТЬ ТЕХНИКИ

[0001] Изобретение относится к технике нового лекарственного препарата, а именно к цвиттер-ионному флуоресцентному зонду, модифицированному полиэтиленгликолем, и содержащему его препарату.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0002] Рак представляет собой серьезную угрозу для здоровья человека, и, несмотря на разработку целого ряда методов лечения, хирургия остается наиболее распространенным и эффективным методом лечения многих опухолей. По статистике, около 50% пациентов, у которых опухолевые очаги были полностью удалены, не выявляют рецидивов опухолей. Поэтому точное обнаружение всех опухолевых очагов и различение границ опухолей, что обеспечивает полное удаление опухолевых очагов, имеет большое значение для повышения эффективности хирургического лечения опухолей. В настоящее время метод клинической идентификации опухолей заключается в основном в наблюдении глазами различий в цвете и твердости опухолевых тканей от нормальных, этот метод обычно эффективен только для более крупных опухолей, но различить малые опухолевые ткани сложно. Чтобы удалить опухолевую ткань как можно тщательнее, в клинике широко применяется массовое удаление, которое не только имеет большие побочные эффекты, но и приводит к анатомической утечке. В связи с этим разработка новых хирургических навигационных технологий, помогающих врачам различать опухолевые ткани, имеет важное значение в клинике.

[0003] В последние годы флуоресцентная визуализация в ближнем инфракрасном диапазоне стала идеальным методом визуализации для хирургической навигации благодаря таким преимуществам, как в реальном масштабе времени, отсутствие ионизирующего излучения, безопасность и удобство. Использование флуоресцентных зондов в ближнем инфракрасном диапазоне для маркировки опухолевых клеток, определения границ опухолей, обнаружения мелких опухолевых очагов, руководства по точному хирургическому удалению и малоинвазивному лечению имеет большое значение для улучшения эффективности хирургического лечения опухолей. По сравнению с флуоресцентной визуализацией в видимой области спектра, флуоресцентная визуализация в ближнем инфракрасном диапазоне (600нм-900нм) обладает такими преимуществами, как высокая высокая проникающая способность в тканях и слабая аутофлуоресценция тканей. Многие клинические эксперименты показали, что флуоресцентная визуализация в ближнем инфракрасном диапазоне обладает значительными преимуществами по сравнению с флуоресцентной визуализацией в видимой области спектра в улучшении процента обнаружения опухолей, улучшении отношения сигнал-шум и снижении дозы зонда.

[0004] В настоящее время индоцианин зеленый (ICG) является единственным флуоресцентным красителем в ближнем инфракрасном диапазоне, который может быть использован в клинике, после подкожной инъекции ICG может возвращаться в сторожевые лимфоузлы, поэтому его можно использовать для определения сторожевых лимфоузлов опухолей. Кроме того, в связи с различиями в скорости метаболизма в тканях рака печени и нормальных тканях печени, ICG также используется в качестве флуоресцентного трассера при хирургической резекции печени. Однако, поскольку ICG не нацелен на опухоль, его трудно использовать для флуоресцентного трассера большинства опухолей, кроме рака печени. В связи с этим разработка высокоспецифичных и высокочувствительных флуоресцентных молекулярных зондов имеет важное значение в клинике.

[0005] В настоящее время наиболее распространенным флуоресцентным красителем в ближнем инфракрасном диапазоне является краситель IRDye800CW производства американской компании LI-COR. Этот краситель характеризуется наличием гептаметиловой цепи, соединенной феноксимостиками с гексагональной жесткой кольцевой структурой в центре. Такая структура придает красителю сильную интенсивность флуоресценции и стабильность флуоресценции в ближнем инфракрасном диапазоне. Кроме того, IRDye800CW содержит карбоксильную группу, что позволяет легко соединяться с различными полипептидами, малыми молекулами, антителами и т.д., обладающими целенаправленностью на опухоль для получения флуоресцентных зондов в ближнем инфракрасном диапазоне с целенаправленными функциями на опухоль. В настоящее время проводятся десятки клинических экспериментов по хирургической навигации в опухоли на основе флуоресцентного зонда IRDye800CW. Однако такая асимметричная структура, как IRDye800CW, также усложняет и дороже синтезирует. Чтобы снизить сложность синтеза, ученые из Университета Пердью (США) изменили положение карбоксильной и сульфонатной групп и сконструировали LMNIR2. Сохраняя хорошие оптические свойства IRDye800CW, симметричная структура этого красителя значительно упрощает синтез. И LMNIR2, и IRDye800CW содержат четыре сульфокислотные группы. Такая структура повышает водорастворимость красителя и предотвращает тушение флуоресценции из-за агрегации красителя. Однако, согласно исследованиям, чрезмерный отрицательный заряд может привести к неспецифической адсорбции красителей в организме, что создает сильный фоновый сигнал в организме. Химические структурные формулы IRDye800CW и LMNIR2 показаны ниже:

[0006] В связи с вышеизложенным предлагается данное изобретение.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0007] Для того, чтобы разрешить проблемы, существующие в предшествующем уровне техники, посредством настоящего изобретения предлагаются цвиттер-ионные флуоресцентные зонды, модифицированные полиэтиленгликолем и лиофилизированный препарат для визуализации опухолей, содержащий такие зонды.

[0008] В первом аспекте настоящего изобретения предложен цвиттер-ионный флуоресцентный зонд, модифицированный полиэтиленгликолем, отличающийся тем, что имеет следующую химическую структурную формулу:

,

где A представляет собой аргинин, лизин или неприродную основную кислоту с положительно заряженной группой на боковой цепи;

D представляет собой O, S, N или отсутствует;

R представляет собой C(CH₃)₂, O, S или Se;

1<x≤3, 1<y≤3, 1<z≤4, 0≤d≤1, 0≤e≤2;

x, y, z, d представляют собой целые числа;

Ligand представляет собой полипептид RGD, нацеленный на рецептор интегрина.

[0009] В одном варианте осуществления неприродная основная кислота содержит одну из 2-амино-4-гуанидинмасляной кислоты, 2-амино-3-гуанидинпропионовой кислоты, 2,4-диаминомасляной кислоты и 2,3-диаминопропионовой кислоты;

x и y представляют собой 3 соответственно, и z представляет собой 4.

[0010] Во втором аспекте настоящего изобретения предложен цвиттер-ионный флуоресцентный зонд, модифицированный полиэтиленгликолем, отличающийся тем, что имеет следующую химическую структурную формулу:

,

где Ligand представляет собой полипептид RGD, нацеленный на рецептор интегрина.

[0011] В одном варианте осуществления цвиттер-ионный флуоресцентный зонд, модифицированный полиэтиленгликолем, имеет следующую химическую структурную формулу:

.

[0012] В третьем аспекте настоящего изобретения предложен лиофилизированный препарат для визуализации опухолей, содержащий вышеуказанный цвиттер-ионный флуоресцентный зонд и лиофилизированный защитный агент.

[0013] В одном варианте осуществления лиофилизированный защитный агент содержит один или более из глюкозы, сахарозы, мальтозы, трегалозы, галактозы, фруктозы, маннита, глутаминовой кислоты, аланина, глицина, саркозина, аргинина, полиэтиленгликоля, декстрана, поливинилового спирта, поливинилпирролидона.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0014] Для того, чтобы сделать варианты осуществления данного изобретения или технические предложения в предшествующем уровне техники более ясными, ниже будут кратко описаны сопроводительные чертежи, используемые при описании вариантов осуществления или предшествующего уровня техники. Очевидно, что сопроводительные чертежи в нижеследующем описании представляют собой только часть вариантов осуществления данного изобретения, все другие варианты реализации смогут полученны специалистами в данной области техники на основе вариантов реализации настоящего изобретения, без творческого труда.

[0015] На фиг. 1 представлен масс-спектр положительных ионов MALDI-TOF PEG-Cy7-RP-RGD настоящего изобретения;

[0016] На фиг. 2 представлен масс-спектр положительных ионов MALDI-TOF PEG-Cy7-RGD настоящего изобретения;

[0017] На фиг. 3 представлен масс-спектр положительных ионов MALDI-TOF PEG-Cy7-R-RGD настоящего изобретения;

[0018] На фиг. 4 представлены абсорбционные спектроскопии (концентрация 1 мкМ) PEG-Cy7-Cl, PEG-Cy7-COOH, PEG-Cy7-RGD, PEG-Cy7-R-RGD и PEG-Cy7-RP-RGD в изобретении в PBS (pH=7.4);

[0019] На фиг. 5 представлены спектры флуоресценции (концентрация 1 мкМ) PEG-Cy7-Cl, PEG-Cy7-COOH, PEG-Cy7-RGD, PEG-Cy7-R-RGD и PEG-Cy7-RP-RGD в изобретении в PBS (pH=7.4);

[0020] На фиг. 6 представлены изображения зондов PEG-Cy7-RGD, PEG-Cy7-R-RGD, PEG-Cy7-RP-RGD и IRDy800CW-RGD в разные моменты времени после введения мышам;

[0021] На фиг. 7 представлены данные о отношении сигнал/шум с течением времени в месте опухоли после введения мышам зондов PEG-Cy7-RGD, PEG-Cy7-R-RGD, PEG-Cy7-RP-RGD и IRDy800CW-RGD;

[0022] На фиг. 8 представлены данные об интенсивности флуоресценции с течением времени после введения мышам зондов PEG-Cy7-RGD, PEG-Cy7-R-RGD, PEG-Cy7-RP-RGD и IRDy800CW-RGD;

[0023] На фиг. 9 представлена диаграмма опухоли в модели мышей с глиомой головного мозга человека U87;

[0024] На фиг. 10 представлена диаграмма опухоли в модели мышей с раком яичников человека SKOV3;

[0025] На фиг. 11 представлены модель метастазирования в легкие рака молочной железы мыши 4T1 и модель метастазирования в легкие рака мочевого пузыря человека MB-49.

ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0026] Для обеспечения большей ясности касательно задач, технических решений и преимуществ вариантов реализации настоящего изобретения, технические решения, согласно вариантами реализации настоящего изобретения, ясно и полно описаны. Безусловно, представленные в нижеследующем описании варианты реализации являются лишь некоторыми, а не всеми вариантами осуществления настоящего изобретения. Все другие варианты реализации, полученные специалистами в данной области техники на основе вариантов реализации настоящего изобретения, без творческого труда будут подпадать под объем защиты настоящего изобретения.

[0027] Вариант осуществления 1

[0028] Флуоресцентный зонд данного варианта представляет собой PEG-Cy7-RP-RGD, в том числе A - аргинин, D - O, R - C(CH3)2, x, y - 3, z - 4, d - 1, e - 2. Маршрут синтеза флуоресцентного зонда в этом варианте выглядит следующим образом:

[0029] В том числе приготовление соединения A3:

[0030] Соль сульфоиндола A1 (15 г) и 1-иод-2-(2-(2-метоксиэтокси)этокси)этан A2 (15 г) реагировали в ацетонитриле при нагревании в течение 24 ч. После ротационного испарения для удаления растворителя продукт растворили в воде, очистили на колонке силикагеля с обращенной фазой C18, и после сушки получали около 9 г (38%) продукта. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.04 (d, J = 1.5 Hz, 1H), 7.91 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.82 (dd, J = 8.4, 1.6 Hz, 1H), 4.72 (t, J = 5.0 Hz, 2H), 3.90 - 3.85 (m, 2H), 3.50 - 3.43 (m, 2H), 3.42 - 3.37 (m, 4H), 3.32 (dd, J = 5.8, 3.4 Hz, 2H), 3.20 (s, 3H), 2.81 (s, 3H), 1.54 (s, 6H). Теоретическая величина MS(ESI) [M+H]+=386.16, экспериментальная величина [M+H]+=386.2.

[0031] Приготовление соединения PEG-Cy7-Cl

[0032] Соединения A3 (8,4 г), A4 (1,8 г), 5,48 мл триэтиламина растворяли в 56 мл этанола и 7,4 мл уксусного ангидрида, и проводили реакцию при 120°C в течение 30 минут, продукт очищали на колонке силикагеля с обращенной фазой C18, и после сушки получали около 4 г продукта (45%). 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.25 (d, J = 14.1 Hz, 2H), 7.80 (d, J = 1.7 Hz, 2H), 7.65 (dd, J = 8.3, 1.6 Hz, 2H), 7.38 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 6.44 (d, J = 14.2 Hz, 2H), 4.42 (t, J = 5.2 Hz, 4H), 3.81 (t, J = 5.1 Hz, 4H), 3.53 - 3.48 (m, 4H), 3.44 - 3.36 (m, 8H), 3.32 - 3.29 (m, 4H), 3.17 (s, 6H), 2.70 (t, J = 6.1 Hz, 4H), 1.85 (p, J = 6.2 Hz, 2H), 1.68 (s, 12H). Теоретическая величина MS(ESI) [M+H]+=907.3, [M-H]-=905.3, экспериментальная величина [M+H]+=907.3, [M-H]-=905.3.

[0033] Приготовление соединения PEG-Cy7-COOH

[0034] 2,67 г п-гидроксифенилпропионовой кислоты (A5) и 12,8 г гидроксида натрия растворяли в 50 мл воды и проводили реакцию в течение 30 мин, добавляли PEG-Cy7-Cl, и проводили реакцию в течение 6 ч при 65°C. Продукт реакции очистили на колонке силикагеля с обращенной фазой C18, и после сушки получали около 1,8 г (43%). 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 7.81 (d, J = 14.1 Hz, 2H), 7.64 (d, J = 1.6 Hz, 2H), 7.60 (dd, J = 8.2, 1.6 Hz, 2H), 7.28 (dd, J = 22.6, 8.3 Hz, 4H), 7.07 - 7.01 (m, 2H), 6.28 (d, J = 14.2 Hz, 2H), 4.33 (t, J = 5.4 Hz, 4H), 3.76 (t, J = 5.1 Hz, 4H), 3.49 (dd, J = 5.8, 3.5 Hz, 4H), 3.43 - 3.37 (m, 8H), 3.32 (dd, J = 5.9, 3.5 Hz, 4H), 3.19 (s, 6H), 2.76 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.69 (t, J = 6.1 Hz, 4H), 2.45 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 1.96 - 1.88 (m, 2H), 1.28 (s, 12H). Теоретическая величина MS(ESI) [M-H]-=1035.4, [M+H]+=1037.4, экспериментальная величина [M-H]-=1035.4, [M+H]+=1037.4.

[0035] Приготовление соединения PEG-Cy7-RP-RGD

[0036] Полипептид RP-RGD был синтезирован способом твердофазного синтеза. После реакции 248 мг PEG-Cy7-COOH, 93 мг HATU и 52 мг N,N -диизопропилэтиламина в 5 мл DMF в течение 30 минут, добавили 205 мг RP-RGD и продолжали реакцию в течение ночи. Продукт осаждали этилацетатом, растворяли в воде, очищали на колонке силикагеля с обращенной фазой C18, и после сушки получали около 250 мг продукта (61%). Теоретическая величина MS(MALDI-TOF) [M+H]+=2042.96, [M-H]-=2040.94, экспериментальная величина [M+H]+=2042.91 (см. фиг. 1), [M-H]-=2040.76. Чистота обнаружения HPLC (210 нм) составляет более 99%.

[0037] Вариант осуществления 2

[0038] Структурная формула флуоресцентного зонда данного варианта осуществления отличается от варианта осуществления 1 тем, что A - лизин, D - N, R - O, x и y - 3, z - 4, d и e - 0.

[0039] Маршрут синтеза флуоресцентного зонда в этом варианте выглядит следующим образом:

[0040] Конкретный метод синтеза адаптируется к соотношению реакторов и параметрам условий реакции в соответствии со вариантом осуществления 1.

[0041] Вариант осуществления 3

[0042] Структурная формула флуоресцентного зонда данного варианта осуществления отличается от варианта осуществления 1 тем, что A - 2-амино-4-гуанидинбутановую кислоту, D отсутствует, R - Se, x и y равны 3, z равно 4, d равно 1, e равно 2.

[0043] Маршрут синтеза флуоресцентного зонда в этом варианте выглядит следующим образом:

[0044] Конкретный метод синтеза адаптируется к соотношению реакторов и параметрам условий реакции в соответствии со вариантом осуществления 1.

[0045] Вариант осуществления 4

[0046] Структурная формула флуоресцентного зонда данного варианта осуществления отличается от варианта осуществления 1 тем, что A - аргинин, D - S, R - S, x и y - 3, z - 4, d - 0, e-2.

[0047] Маршрут синтеза флуоресцентного зонда в этом варианте выглядит следующим образом:

[0048] Конкретный метод синтеза адаптируется к соотношению реакторов и параметрам условий реакции в соответствии со вариантом осуществления 1.

[0049] Вариант осуществления 5

[0050] Структурная формула флуоресцентного зонда данного варианта осуществления отличается от варианта осуществления 1 тем, что Ligand представляет собой дериват мочевины глютаминовой кислоты производное глутамина, направленное на PSMA.

[0051] Маршрут синтеза флуоресцентного зонда в этом варианте выглядит следующим образом:

[0052] Конкретный метод синтеза адаптируется к соотношению реакторов и параметрам условий реакции в соответствии со сравнительным вариантом осуществления 1.

[0053] Сравнительный вариант осуществления 1

[0054] Флуоресцентный зонд настоящего сравнительного варианта осуществления представляет собой PEG-Cy7- -RGD, конкретный маршрут синтеза выглядит следующим образом:

[0055] Синтез полипептида RGD проводился реактивным синтезом в твёрдой фазе. Для этого 248 мг PEG-Cy7-COOH, 93 мг HATU и 52 мг N, N-диизопропилэтиламина реагировали 30 минут в DMF в размере 5 мл, затем добавляли 124 мг RP-RGD и продолжали реакцию на протяжении ночи. Полученный продукт осаждали этилацетатом, растворяли в воде, и проводили очистку на колонке с обратной фазой C18, после сушки получали около 190 мг продукта (выход 58%). Теоретическое значение MS(MALDI-TOF) [M+H]+ = 1638.71 и [M-H]- = 1636.7, экспериментальное значение [M+H]+ = 1638.39 (как показано на фиг. 2), [M-H]- = 1637.1. Высокая степень чистоты (более 99%) была подтверждена методом HPLC (210 nm).

[0056] Сравнительный вариант осуществления 2

[0057] Флуоресцентный зонд настоящего сравнительного варианта осуществления представляет собой PEG-Cy7-R-RGD, конкретный маршрут синтеза выглядит следующим образом:

[0058] Синтез полипептида RGD проводился реактивным синтезом в твёрдой фазе. Для этого 248 мг PEG-Cy7-COOH, 93 мг HATU и 52 мг N, N-диизопропилэтиламина реагировали 30 минут в DMF в размере 5 мл, затем добавляли 124 мг RP-RGD и продолжали реакцию на протяжении ночи. Полученный продукт осаждали этилацетатом, растворяли в воде, и проводили очистку на колонке с обратной фазой C18, после сушки получали около 190 мг продукта (выход 58%). Теоретическое значение MS(MALDI-TOF) [M+H]+ = 1795.82 и [M-H]- = 1795.87, экспериментальное значение [M+H]+ = 1795.87 (как показано на фиг.3), [M-H]- = 1793.61. Высокая степень чистоты (более 99%) была подтверждена методом HPLC (210 nm).

[0059] Вариант опыта 1

[0060] PEG-Cy7-Cl, PEG-Cy7-COOH, PEG-Cy7-RGD (сравнительный вариант осуществления 1), PEG-Cy7-R-RGD (сравнительный вариант осуществления 2) и PEG-Cy7-RP-RGD (вариант осуществления 1) были растворены в PBS по отдельности. Спектр флуоресценции (см. фиг. 5) и спектр поглощения (см. фиг. 4) зондов измеряли отдельно, определяли максимумы пиков поглощения и эмиссии, рассчитывали коэффициенты молярной экстинкции и определяли квантовый выход флуоресценции зондов (см. табл. 1), используя ICG, растворенный в DMSO, в качестве стандартного значения (квантовый выход флуоресценции 13%).

Табл. 1

	Буферный раствор PBS (pH=7.4)					100% фетальная бычья сыворотка
Наименование группы	PEG-Cy7-Cl	PEG-Cy7-COOH	PEG- Cy7-RGD	PEG- Cy7-R-RGD	PEG- Cy7-RP-RGD	PEG-Cy7-RP-RGD
Коэффициент молярной экстинкции (M-1cm-1)	198000	228000	215000	158000	174000	184000
Пик поглощения (nm)	782	772	776	776	776	777
Пик эмиссии (nm)	804	794	794	795	794	795
Стоксов сдвиг (nm)	22	22	18	20	18	18
Квантовый выход флуоресценции (%)	5	8.7	8.5	10.3	11.1	11.2
Яркость (коэффициент молярной экстинкции×квантовый выход флуоресценции)	9970	19800	18300	16300	19300	20700

[0061] Как видно из данных в табл. 1, квантовый выход флуоресценции PEG-Cy7-COOH увеличивается на 3,7%, а яркость флуоресценции увеличивается вдвое по сравнению с PEG-Cy7-Cl, что свидетельствует о важности наличия соединений феноксимостиков. Квантовые выходы флуоресценции и коэффициенты молярной экстинкции PEG-Cy7-RGD и PEG-Cy7-COOH сопоставимы, что указывает на то, что присоединение таргетных молекул не оказывает значительного влияния на флуоресценцию красителей. Значительное увеличение квантовых выходов флуоресценции у PEG-Cy7-R-RGD, PEG-Cy7-RP-RGD по сравнению с PEG-Cy7-RGD и PEG-Cy7-COOH указывает на важность аргининового соединения между красителем и таргетной молекулой для повышения квантового выхода флуоресценции. Однако коэффициент молярной экстинкции и яркость флуоресценции PEG-Cy7-R-RGD значительно снижаются по сравнению с PEG-Cy7-COOH, а PEG-Cy7-RP-RGD значительно увеличиваются по сравнению с PEG-Cy7-R-RGD, что свидетельствует о важности соединения полиэтиленгликолевой цепи цепи между красителем и таргетной молекулой для усиления флуоресценции зонда. Поскольку флуоресцентные свойства зондов значительно изменяются при взаимодействии флуоресцентного зонда с сывороточными белками (например, ICG и IRDye800CW), взаимодействие зонда с сывороткой повышает фоновый сигнал зонда в организме, что приводит к большему поглощению зонда печенью. Изобретатель обнаружил, что флуоресцентные свойства PEG-Cy7-RP-RGD в 100% фетальной бычьей сыворотке существенно не изменились по сравнению с PBS, что свидетельствует о низком взаимодействии PEG-Cy7-RP-RGD с сывороточными белками, а также о лучшей эффективности при визуализации в организме.

[0062] Вариант опыта 2

[0063] В этом варианте были исследованы характеристики трех зондов PEG-Cy7-RGD, PEG-Cy7-R-RGD и PEG-Cy7-RP-RGD в организме и сопоставлены с зондом IRDy800CW (IRDye800CW-RGD из компании LI-COR) с прикрепленным RGD. Модель мышей с подкожной опухоли из клеток рака мочевого пузыря человека была построена путем введения MB-49 клеток рака мочевого пузыря человека в ноги голых мышей Balb/c. После того как опухоль выросла до подходящего размера, четыре флуоресцентных зонда были введены внутривенно (2 нмоль зонда на мышь), а затем мышам производились флуоресцентные визуализации в разные моменты времени после введения. Как показано на фиг. 6, интенсивность флуоресценции четырех зондов в месте расположения опухоли постепенно снижалась с течением времени, и сигналы флуоресценции четырех зондов не имели существенных различий. Однако отношение сигнал/шум (TBR, отношение сигнала опухоли к сигналу флуоресценции окружающей нормальной ткани) PEG-Cy7-RP-RGD в месте опухоли было значительно выше, чем трех других зондов. Как показано на фиг. 7, через 24 часа после введения TBR PEG-Cy7-RP-RGD более чем в два раза превышала TBR трех других зондов. TBR PEG-Cy7-RGD, PEG-Cy7-R-RGD значительно ниже, чем IRDye800CW-RGD, как показано на фиг. 8. Отличные показатели PEG-Cy7-RP-RGD объясняются в первую очередь его сверхнизким неспецифическим сигналом в нормальных тканях, что свидетельствует о важности модификации полиэтиленгликоля и баланса зарядов.

[0064] Вариант опыта 3

[0065] Данный вариант исследовал изображение PEG-Cy7-RP-RGD в различных моделях опухолей. Были установлены опухолевая модель глиомы головного мозга человека U87 у мышей, модель рака яичников человека на месте SKOV3, модель метастазирования в легкие рака молочной железы мыши 4T1 и модель метастазирования в легкие рака мочевого пузыря человека MB-49. Как показано на фиг. 9-11, после внутривенного введения 2 нмоль PEG-Cy7-RP-RGD через 4 часа можно наблюдать сильный сигнал флуоресценции в области опухоли, что указывает на универсальность этого флуоресцентного зонда для различных опухолей.

[0066] В частности, на фиг. 9 показана опухолевая модель глиомы головного мозга человека U87 у мышей, после внутривенного введения 2 нмоль PEG-Cy7-RP-RGD через 4 часа проведена флуоресцентная визуализация в голове мыши с разделением кожи, что получился сильный сигнал флуоресценции в области опухоли, отношение сигнал/шум составило 6,3. Далее, с помощью разделения мозга мыши была выявлена точная локализация опухоли, что было подтверждено дополнительными срезами ткани, где стрелками указано местоположение опухоли.

[0067] На фиг. 10 показана опухолевая модель рака яичников человека SKOV3 у мышей, после внутривенного введения 2 нмоль PEG-Cy7-RP-RGD через 4 часа мышь была разделена, что позволило заметить сильный сигнал флуоресценции в области опухоли яичников. Отношение сигнал/шум составило около 4, где стрелками указано местоположение опухоли.

[0068] На фиг. 11 отдельно показаны модель метастазирования в легкие рака молочной железы мыши 4T1 и модель метастазирования в легкие рака мочевого пузыря человека MB-49, после внутривенного введения 2 нмоль PEG-Cy7-RP-RGD через 4 часа мышь была разделена, что позволило заметить небольшие метастатические очаги в легких, отношение сигнал/шум составило около 4.

[0069] Исследования проводились также на флуоресцентных зондах, синтезированных в соответствии с примерами 2-5. Сравнительно с флуоресцентным зондом, полученным по варианту осуществления 1, эффективность реакции в варианте осуществления 2 оказалась невысокой, и флюоресценция продукта имел синее смещение, но стоксовое смещение увеличилось, но не помешало использованию его для изображения целенаправленной флюоресценцией опухолей. Флуоресцентный зонд, полученный по варианту осуществления 3, имел равную флюоресценцию с продуктом варианта осуществления 1 и также мог использоваться для изображения целенаправленной флюоресценцией опухолей. Сравнительно с продуктом варианта осуществления 1, флуоресцентный зонд, полученный в варианте осуществления 4, флуоресцентный спектр имел красное смещение, но квантовый выход флуоресценции снизился, однако он также был пригоден для изображения целенаправленной флюоресценцией опухолей. Флуоресцентный зонд, полученный в варианте осуществления 5, мог связываться с PSMA, высокоэкспрессирующимся в раке предстательной железы, и обеспечивать изображения флюоресценцией для рака предстательной железы. Экспериментальные данные показали, что результаты, полученные в вариантах осуществления 2-5, схожи с результатами варианта осуществления 1. Из-за ограниченного объема все результаты не приводятся.

[0070] Вышеизложенное описание предпочтительных примеров осуществления изобретения и объем изобретения не обязательно ограничиваются данным описанием, в результате чего все эквивалентные изменения и замены, полученные специалистами в данной области техники на основе вариантов реализации настоящего изобретения, будут подпадать под объем защиты настоящего изобретения.

Claims (17)

1. Цвиттер-ионный флуоресцентный зонд, модифицированный полиэтиленгликолем, отличающийся тем, что имеет следующую химическую структурную формулу:

,

где А представляет собой аргинин, лизин или неприродную основную кислоту с положительно заряженной группой на боковой цепи;

D представляет собой O, S, N или отсутствует;

R представляет собой C(CH₃)₂, O, S или Se;

1<x≤3, 1<y≤3, 1<z≤4, 0≤d≤1, 0≤e≤2;

x, y, z, d представляют собой целые числа;

Ligand представляет собой полипептид RGD, нацеленный на рецептор интегрина.

2. Цвиттер-ионный флуоресцентный зонд по п. 1, отличающийся тем, что неприродная основная кислота содержит одну из 2-амино-4-гуанидинмасляной кислоты, 2-амино-3-гуанидинпропионовой кислоты, 2,4-диаминомасляной кислоты и 2,3-диаминопропионовой кислоты;

x и y представляют собой 3 соответственно, и z представляет собой 4.

3. Цвиттер-ионный флуоресцентный зонд, модифицированный полиэтиленгликолем, отличающийся тем, что имеет следующую химическую структурную формулу:

,

где Ligand представляет собой полипептид RGD, нацеленный на рецептор интегрина.

4. Цвиттер-ионный флуоресцентный зонд по п. 3, отличающийся тем, что имеет следующую химическую структурную формулу:

.

5. Лиофилизированный препарат для визуализации опухолей, содержащий цвиттер-ионный флуоресцентный зонд по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что лиофилизированный препарат также включает лиофилизированный защитный агент.

6. Лиофилизированный препарат по п. 5, отличающийся тем, что лиофилизированный защитный агент содержит один или более из глюкозы, сахарозы, мальтозы, трегалозы, галактозы, фруктозы, маннита, глутаминовой кислоты, аланина, глицина, саркозина, аргинина, полиэтиленгликоля, декстрана, поливинилового спирта, поливинилпирролидона.