RU2848334C2 - Анализ эндонуклеазной активности в реальном времени, связанный с экзонуклеазой - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к субстрату нуклеиновой кислоты для обнаружения активности эндонуклеазы и его применению. Предложен субстрат нуклеиновой кислоты для обнаружения активности эндонуклеазы, содержащий: (а) донорный флуорофор и акцепторный флуорофор, где указанные флуорофоры образуют пару для переноса резонансной энергии флуоресценции (FRET); (b) по меньшей мере одну структуру по меньшей мере на одной цепи нуклеиновой кислоты, ингибирующую расщепление субстрата экзонуклеазой, используемой для обнаружения активности эндонуклеазы, где структура, ингибирующая расщепление субстрата экзонуклеазой, выбрана из шпильки, выступающей цепи и модификации нуклеиновой кислоты, и где указанная структура способна ингибировать активность указанной экзонуклеазы; и (c) последовательность распознавания эндонуклеазы. Также предложены композиция и набор для обнаружения активности эндонуклеазы, способ обнаружения активности эндонуклеазы, способ обнаружения присутствия нуклеиновой кислоты-мишени в образце, набор для проведения диагностической процедуры, способ оптимизации реакций эндонуклеазного расщепления. Изобретение обеспечивает эффективное обнаружение активности эндонуклеазы. 8 н. и 11 з.п. ф-лы, 16 ил., 14 пр.

Description

Перекрестная ссылки на родственные заявки

[001] В настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки США с регистрационным номером 63/272091, поданной 26 октября 2021 г.

Область изобретения

[002] Настоящее изобретение относится к области ферментов, модифицирующих нуклеиновые кислоты, а более конкретно к области получения и тестирования активных эндонуклеаз.

Заявление о федерально спонсируемых исследованиях

[003] Отсутствует.

Список последовательностей

[004] Отмечен специальным значком.

Предпосылки создания изобретения

[005] Эндонуклеазы представляют собой ферменты, широко используемые в лабораторной практике и в области молекулярной диагностики. Процесс конструирования и выделения новых и улучшенных эндонуклеаз требует разработки быстрых и удобных методов оценки эндонуклеазной активности. Наиболее широко используемые анализы на эндонуклеазу являются очень сложными и имеют низкую эффективность. Кроме того, обычно используемые методы не являются количественными. Пока еще не существует общепринятых способов оценки различий в активности между различными источниками, вариантами или партиями эндонуклеаз. Точно так же не существует простых и быстрых способов оценки различных мишеней, позволяющих точно определить специфичность эндонуклеазы.

[006] Многие современные анализы на эндонуклеазу непригодны для их использования в неочищенных клеточных лизатах или частично очищенных белковых препаратах, поскольку нуклеазы хозяина быстро разрушают ДНК-мишень. Существует неудовлетворенная потребность в быстром анализе на эндонуклеазу, который можно было бы проводить с неочищенными лизатами и полуочищенными элюированными фракциями на ранних стадиях процесса очистки. Такой анализ поможет улучшить очистку и производство ферментов, а также ускорить общий процесс конструирования ферментов.

Описание сущности изобретения

[007] Настоящее изобретение относится к способам, композициям и наборам для оценки эндонуклеазной активности. В настоящем изобретении используется двухцепочечный субстрат нуклеиновой кислоты с защищенным концом, меченный репортерным флуорофором и флуорофором-гасителем. Экзонуклеаза гидролизует субстрат и обеспечивает возникновение флуоресценции только после того, как эндонуклеаза будет расщеплять субстрат.

[006] В одном своем варианте, настоящее изобретение относится к субстрату нуклеиновой кислоты для обнаружения активности эндонуклеазы, содержащему: донорный флуорофор и акцепторный флуорофор, где указанные флуорофоры образуют пару для переноса резонансной энергии флуоресценции (FRET); по меньшей мере одну структуру по меньшей мере на одной цепи нуклеиновой кислоты, ингибирующую расщепление субстрата экзонуклеазой; и последовательность распознавания эндонуклеазы. Структура, ингибирующая расщепление субстрата экзонуклеазой, выбрана из структуры на каждом 3'-конце, ингибирующей расщепление 3'-5'-экзонуклеазой, структуры на каждом 5'-конце, ингибирующей расщепление 5'-3'-экзонуклеазой, или той и другой. Экзонуклеаза выбрана из экзонуклеазы I, экзонуклеазы III, экзонуклеазы V, экзонуклеазы VII, экзонуклеазы VIII, экзонуклеазы Т5, экзонуклеазы Т7, экзонуклеазы лямбда, экзонуклеазы Т, экзонуклеазы BAL-31, экзонуклеазы RecJf, РНКазы R, РНКазы II, РНКазы D, РНКазы Т, РНКазв BN, РНКазы РН, экзорибонуклеазы I и экзорибонуклеазы II. В некоторых вариантах осуществления изобретения, акцепторный флуорофор представляет собой флуорофор-гаситель. Донорный флуорофор и акцепторный флуорофор могут быть расположены на расстоянии от 1 до 12 нуклеотидов друг от друга на одной и той же цепи субстрата или на разных цепях субстрата. В некоторых вариантах осуществления изобретения, субстрат образован одной цепью. В некоторых вариантах осуществления изобретения, один из флуорофоров-доноров и флуорофоров-акцепторов расположен на 5'-конце субстрата или рядом с ним. В некоторых вариантах осуществления изобретения, донорный флуорофор выбран из группы, состоящей из 5-карбоксифлуоресцеина (5-FAM), 6-карбоксифлуоресцеина (6-FAM), 2',4',1,4,-тетрахлорфлуоресцеина (ТЕТ), 2',4',5',7',1,4-гексахлорфлуоресцеина (HEX), 2',7'-диметокси-4',5'-дихлор-6-карбоксифлуоресцеина (JOE), кумариновых красителей, красителей Alexa Fluor, IRDye 800CW, каскадного синего, красителей Pacific Blue, Pacific Orange, техасского красного и BODIPY®. В некоторых вариантах осуществления изобретения, акцепторный флуорофор выбран из группы, состоящей из тетраметил-6-карбоксиродамина (TAMRA), тетрапропано-6-карбоксирродамина (ROX), DABSYL, DABCYL (4-[[4-(диметиламино)-фенил]-азо]-бензойной кислоты), Су5 и Су5.5, антрахиноновых красителей, нитротиазольных красителей, нитроимидазольных красителей, LC-Red 610, LC-Red 640, LC-Red 705, JA286, DDQ-I, DDQ-II, QSY-7, QSY-21, IRDye QC1, Iowa Black FQ, Iowa Black RQ, HEX (гексахлорфлуоресцеина), TET (тетрахлорфлуоресцеина), JOE (5'-дихлордиметоксифлуоресцеина), красителей BODIPY®, гасителя Eclipse (4- [[2-хлор-4-нитро-фенил]-азо]анилина, BHQ-1 ([(4-(2-нитро-4-метил-фенил)азо)-ил-((2-метокси-5-метил-фенил)азо)]анилина), BHQ-2 ([(4-(1-нитрофенил)-азо)-ил-((2,5-диметокси-фенил)азо)]анилина) и пиридинил-изохинолин-дионовых красителей. В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза представляет собой никазу. В некоторых вариантах осуществления изобретения, экзонуклеаза выбрана из экзонуклеазы III, экзонуклеазы Т5, экзонуклеазы Т7, экзонуклеазы лямбда и экзонуклеазы BAL31. В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза представляет собой эндонуклеазу, регулируемую нуклеиновой кислотой, например, эндонуклеазу CRISPR класса I (CASCADE). В некоторых вариантах осуществления изобретения, субстрат содержит мотив, смежный с протоспейсером (РАМ). В некоторых вариантах осуществления изобретения, РАМ состоит из последовательности, выбранной из 5'-AAG-3', 5'-AGG-3', 5'-ATG-3', 5'-GAG-3', 5'-CAG-3', 5'-GTG-3', 5'-TAA-3', 5'-TGG-3', 5'-AAA-3', 5'-AAC-3', 5'-AAT-3', 5'-ATA-3', 5'-TAG-3' и 5'-TTG-3'. В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза, регулируемая нуклеиновыми кислотами, представляет собой эндонуклеазу CRISPR класса II. В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза представляет собой эндонуклеазу CRISPR Cas9. В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза представляет собой эндонуклеазу CRISPR Cas12a. В некоторых вариантах осуществления изобретения, РАМ состоит из последовательности, выбранной из 5'-NGG-3', 5'-NGGNG-3', 5'-NNAAAAW-3', 5'-NNNNGATT-3', 5'-GNNNCNNA-3' и 5'-NNNACA-3'. В некоторых вариантах осуществления изобретения, РАМ состоит из последовательности, выбранной из 5'-TTN-3', 5'-TTTN-3' и 5'-TTTV-3'. В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза, регулируемая нуклеиновой кислотой, включает эндонуклеазу и нуклеиновую кислоту, нацеленную на другую нуклеиновую кислоту (NATNA), например, руководяющую РНК CRISPR, выбранную из одноцепочечной руководяющей молекулы и двухцепочечной руководяющей молекулы. В некоторых вариантах осуществления изобретения, NATNA содержит cr-РНК и tracr-PHK. В некоторых вариантах осуществления изобретения, NATNA содержит область нацеливания, способную гибридизоваться с областью субстрата. В некоторых вариантах осуществления изобретения, NATNA способна взаимодействовать с эндонуклеазой. В некоторых вариантах осуществления изобретения, NATNA содержит нуклеотиды ДНК и РНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза выбрана из группы, состоящей из нуклеазы «цинковые пальцы» (ZFN), ZFN, конъюгированной с Fok I, эффекторной нуклеазы, подобной активатору транскрипции (TALEN), одноцепочечной эндонуклеазы Endo ТТ, эндонуклеазы Argonaute, эндонуклеазы Arcus, эндорибонуклеазы, выбранной из РНКазы III, РНКазы А, РНКазы Т1, РНКазы А, РНКазы Н, РНКазы Z и РНКазы Р, Cas3 и Cas7-11, и рестриктирующей эндонуклеазы. В некоторых вариантах осуществления изобретения, структура, ингибирующая расщепление субстрата экзонуклеазой, выбрана из шпильки, выступающей цепи и модификации нуклеиновой кислоты, например, одной или более (5 или более) фосфортиоатных связей. В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза представляет собой дезоксирибонуклеазу, а субстрат содержит ДНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза представляет собой рибонуклеазу, а субстрат содержит РНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения, рибонуклеаза выбрана из рибозима, рибозима типа «головки молотка», ДНК-зима, ПНА-зима или сконструированной эндорибонуклеазы.

[009] В одном своем варианте, настоящее изобретение относится к композиции для обнаружения активности эндонуклеазы, содержащей описанный выше субстрат нуклеиновой кислоты и экзонуклеазу и, необязательно, эндонуклеазу. В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза представляет собой никазу. В некоторых вариантах осуществления изобретения, экзонуклеаза выбрана из экзонуклеазы III, экзонуклеазы Т5, экзонуклеазы Т7, экзонуклеазы лямбда и экзонуклеазы BAL31. В некоторых вариантах осуществления изобретения, экзонуклеаза способна инициировать гидролиз одноцепочесного разрыва. В некоторых вариантах осуществления изобретения, экзонуклеаза выбрана из экзонуклеазы Т5, экзонуклеазы Т7, экзонуклеазы лямбда, экзонуклеазы III и экзонуклеазы Ва131. В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза представляет собой эндонуклеазу, регулируемую нуклеиновой кислотой. В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза, регулируемая нуклеиновой кислотой, представляет собой эндонуклеазу CRISPR класса I (CASCADE), а субстрат содержит мотив, смежный с протоспейсером (РАМ) и состоящий из последовательности, выбранной из 5'-AAG-3', 5'-AGG-3', 5'-ATG-3', 5'-GAG-3', 5'-CAG-3', 5'-GTG-3', 5'-TAA-3', 5'-TGG-3', 5'-AAA-3', 5'-AAC-3', 5'-AAT-3', 5'-ATA-3', 5'-TAG-3' и 5'-TTG-3'. В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза, регулируемая нуклеиновой кислотой, представляет собой эндонуклеазу CRISPR Cas9 или эндонуклеазу CRISPR Cas12a, а субстрат содержит мотив, смежный с протоспейсером (РАМ) и состоящий из последовательности, выбранной из 5'-NGG-3', 5'-NGGNG-3', 5'-NNAAAAW-3', 5'-NNNNGATT-3', 5'-GNNNCNNA-3', 5'-NNNACA-3', 5'-TTN-3', 5'-TTTN-3' и 5'-TTTV-3'. В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза, регулируемая нуклеиновой кислотой, включает эндонуклеазу и нуклеиновую кислоту, нацеленную на другую нуклеиновую кислоту (NATNA), например, руководяющую РНК CRISPR, выбранную из одноцепочечной руководяющей молекулы и двухцепочечной руководяющей молекулы. В некоторых вариантах осуществления изобретения, NATNA содержит сг-РНК и tracr-PHK. В некоторых вариантах осуществления изобретения, NATNA содержит область нацеливания, способную гибридизоваться с областью субстрата. В некоторых вариантах осуществления изобретения, NATNA способна взаимодействовать с эндонуклеазой. В некоторых вариантах осуществления изобретения, NATNA содержит нуклеотиды ДНК и РНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза выбрана из группы, состоящей из нуклеазы «цинковые пальцы» (ZFN), ZFN, конъюгированной с Fok I, эффекторной нуклеазы, подобной активатору транскрипции (TALEN), одноцепочечной эндонуклеазы Endo ТТ, эндонуклеазы Argonaute, эндонуклеазы Arcus, эндорибонуклеазы, выбранной из РНКазы III, РНКазы А, РНКазы Т1, РНКазы А, РНКазы Н, РНКазы Z и РНКазы Р, Cas3 и Cas7-11, и рестриктирующей эндонуклеазы. В некоторых вариантах осуществления изобретения, структура, ингибирующая расщепление субстрата экзонуклеазой, выбрана из шпильки, выступающей цепи и модификации нуклеиновой кислоты, например, одной или более (5 или более) фосфортиоатных связей.

[0010] В одном своем варианте, настоящее изобретение относится к способу обнаружения активности эндонуклеазы, включающему: контактирование эндонуклеазы и экзонуклеазы с реакционной смесью и с субстратом нуклеиновой кислоты, включающим донорный флуорофор и акцепторный флуорофор, где указанные флуорофоры образуют пару для переноса резонансной энергии флуоресценции (FRET); по меньшей мере одну структуру по меньшей мере на одной цепи, ингибирующую расщепление субстрата экзонуклеазой; и последовательность распознавания эндонуклеазы; и оценку флуоресценции, испускаемой реакционной смесью, где изменение флуоресценции указывает на активность эндонуклеазы. В некоторых вариантах осуществления изобретения, по меньшей мере одна структура, ингибирующая расщепление субстрата экзонуклеазой, выбрана из структуры на каждом 3'-конце, ингибирующей расщепление 3'-5'-экзонуклеазой, структуры на каждом 5'-конце, ингибирующей расщепление 5'-3'-экзонуклеазой или обеих этих структур. В некоторых вариантах осуществления изобретения, экзонуклеаза выбрана из экзонуклеазы I, экзонуклеазы III, экзонуклеазы V, экзонуклеазы VII, экзонуклеазы VIII, экзонуклеазы Т5, экзонуклеазы Т7, лямбда-экзонуклеазы, экзонуклеазы Т, экзонуклеазы BAL-31, экзонуклеазы RecJf, РНКазы R, РНКазы II, РНКазы D, РНКазы Т, РНКазы BN, РНКазы РН, экзорибонуклеазы I и экзорибонуклеазы II. В некоторых вариантах осуществления изобретения, реакционную смесь одновременно подвергают контактированию с эндонуклеазой и экзонуклеазой. В некоторых вариантах осуществления изобретения, реакционную смесь сначала подвергают контактированию с эндонуклеазой, а затем с экзонуклеазой. В некоторых вариантах осуществления изобретения, между контактированием реакционной смеси с эндонуклеазой и контактированием реакционной смеси с экзонуклеазой, стадии очистки не проводят.В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза представляет собой эндонуклеазу, регулируемую нуклеиновой кислотой. В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза, регулируемая нуклеиновой кислотой, представляет собой эндонуклеазу CRISPR класса I (CASCADE), а субстрат содержит мотив, смежный с протоспейсером (РАМ) и состоящий из последовательности, выбранной из 5'-AAG-3', 5'-AGG-3', 5'-ATG-3', 5'-GAG-3', 5'-CAG-3', 5'-GTG-3', 5'-ТАА-3', 5'-TGG-3', 5'-ААА-3', 5'-ААС-3', 5'-ААТ-3', 5'-АТА-3', 5'-TAG-3' и 5'-TTG-3'. В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза, регулируемая нуклеиновой кислотой, представляет собой эндонуклеазу CRISPR Cas9 или эндонуклеазу CRISPR Cas12a, а субстрат содержит мотив, смежный с протоспейсером (РАМ) и состоящий из последовательности, выбранной из 5'-NGG-3', 5'-NGGNG- 3', 5'-NNAAAAW-3', 5'-NNNNGATT-3', 5'-GNNNCNNA-3', 5'-NNNACA-3', 5'-TTN-3', 5'-TTTN-3' и 5'-TTTV-3'. В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза, регулируемая нуклеиновой кислотой, включает эндонуклеазу и нуклеиновую кислоту, нацеленную на другую нуклеиновую кислоту (NATNA), например, руководящую РНК CRISPR, выбранную из одноцепочечной РНК и двухцепочечной руководящей РНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения, NATNA содержит cr-РНК и tracr-PHK. В некоторых вариантах осуществления изобретения, NATNA содержит область нацеливания, способную гибридизоваться с областью субстрата. В некоторых вариантах осуществления изобретения, NATNA способна взаимодействовать с эндонуклеазой. В некоторых вариантах осуществления изобретения, NATNA содержит нуклеотиды ДНК и РНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения, контактирование включает контактирование серии реакционных смесей, содержащих одну и ту же NATNA, с серией различных эндонуклеаз. В некоторых вариантах осуществления изобретения, контактирование включает контактирование серии реакционных смесей, содержащих одну и ту же эндонуклеазу, с серией различных NATNA. В некоторых вариантах осуществления изобретения, контактирование включает контактирование серии реакционных смесей, содержащих одни и те же ингредиенты, в различных реакционных условиях. В некоторых вариантах осуществления изобретения, контактирование включает контактирование серии реакционных смесей, содержащих одни и те же ингредиенты, с различными изолятами эндонуклеазы. В некоторых вариантах осуществления изобретения, контактирование включает контактирование серии реакционных смесей, содержащих одну и ту же эндонуклеазу, с серией различных субстратов нуклеиновых кислот, содержащих разные последовательности. В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза выбрана из группы, состоящей из нуклеазы «цинковые пальцы» (ZFN), ZFN, конъюгированной с Fok I, эффекторной нуклеазы, подобной активатору транскрипции (TALEN), одноцепочечной эндонуклеазы Endo ТТ, эндонуклеазы Argonaute, эндонуклеазы Arcus, эндорибонуклеазы, выбранной из РНКазы III, РНКазы А, РНКазы Т1, РНКазы А, РНКазы Н, РНКазы Z и РНКазы Р, Cas3 и Cas7-11, а также рестриктирующей эндонуклеазы. В некоторых вариантах осуществления изобретения, структура, ингибирующая расщепление субстрата экзонуклеазой, выбрана из шпильки, выступающей цепи и модификации нуклеиновой кислоты, например, одной или более (5 или более) фосфоротиоатных связей. В некоторых вариантах осуществления изобретения, субстрат нуклеиновой кислоты или эндонуклеаза присутствуют в неочищенной форме.

[0011] В одном своем варианте, настоящее изобретение относится к набору для обнаружения активности эндонуклеазы, включающему: субстрат нуклеиновой кислоты, содержащий донорный флуорофор и акцепторный флуорофор, где указанные флуорофоры образуют пару для переноса резонансной энергии флуоресценции (FRET); по меньшей мере одну структуру по меньшей мере на одной цепи, ингибирующую расщепление субстрата экзонуклеазой; последовательность распознавания эндонуклеазы и экзонуклеазу. В некоторых вариантах осуществления изобретения, по меньшей мере одна структура, ингибирующая расщепление субстрата экзонуклеазой, выбрана из структуры на каждом 3'-конце, ингибирующей расщепление 3'-5'-экзонуклеазой, структуры на каждом 5'-конце, ингибирующей расщепление 5'-3'-экзонуклеазой или обеих этих структур. В некоторых вариантах осуществления изобретения, экзонуклеаза выбрана из экзонуклеазы I, экзонуклеазы III, экзонуклеазы V, экзонуклеазы VII, экзонуклеазы VIII, экзонуклеазы Т5, экзонуклеазы Т7, лямбда-экзонуклеазы, экзонуклеазы Т, экзонуклеазы BAL-31, экзонуклеазы RecJf, РНКазы R, РНКазы II, РНКазы D, РНКазы Т, РНКазы BN, РНКазы РН, экзорибонуклеазы I и экзорибонуклеазы II. В некоторых вариантах осуществления изобретения, тестируемой эндонуклеазой является эндонуклеаза, регулируемая нуклеиновой кислотой. В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза, регулируемая нуклеиновой кислотой, представляет собой эндонуклеазу CRISPR класса I (CASCADE), а субстрат содержит мотив, смежный с протоспейсером (РАМ) и состоящий из последовательности, выбранной из 5'-AAG-3', 5'-AGG-3', 5'-ATG-3', 5'-GAG-3', 5'-CAG-3', 5'-GTG-3', 5'-TAA-3', 5'-TGG-3 ', 5'-AAA-3 ', 5'-AAC-3 ', 5'-AAT-3', 5'-ATA-3', 5'-TAG-3' и 5'-TTG-3 '. В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза, регулируемая нуклеиновой кислотой, представляет собой эндонуклеазу CRISPR Cas9 или эндонуклеазу CRISPR Cas12a, а субстрат содержит мотив, смежный с протоспейсером (РАМ) и состоящий из последовательности, выбранной из 5'-NGG-3', 5'-NGGNG- 3', 5'-NNAAAAW-3', 5'-NNNNGATT-3', 5'-GNNNCNNA-3', 5'-NNNACA-3', 5'-TTN-3', 5'-TTTN-3' и 5'-TTTV-3'. В некоторых вариантах осуществления изобретения, набор дополнительно включает нуклеиновую кислоту, нацеленную на другую нуклеиновую кислоту (NATNA), и способную образовывать комплекс с тестируемой эндонуклеазой. В некоторых вариантах осуществления изобретения, NATNA представляет собой руководящую РНК CRISPR, выбранную из одноцепочечной руководящей РНК и двухцепочечной руководящей РНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения, NATNA содержит сг-РНК и tracr-PHK. В некоторых вариантах осуществления изобретения, NATNA содержит область нацеливания, способную гибридизоваться с областью субстрата. В некоторых вариантах осуществления изобретения, NATNA способна взаимодействовать с эндонуклеазой. В некоторых вариантах осуществления изобретения, NATNA содержит нуклеотиды ДНК и РНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза выбрана из группы, состоящей из нуклеазы «цинковые пальцы» (ZFN), ZFN, конъюгированной с Fok I, эффекторной нуклеазы, подобной активатору транскрипции (TALEN), одноцепочечной эндонуклеазы Endo ТТ, эндонуклеазы Argonaute, эндонуклеазы Arcus, эндорибонуклеазы, выбранной из РНКазы III, РНКазы А, РНКазы Т1, РНКазы А, РНКазы Н, РНКазы Z и РНКазы Р, Cas3 и Cas7-11, а также рестриктирующей эндонуклеазы. В некоторых вариантах осуществления изобретения, структура, ингибирующая расщепление субстрата экзонуклеазой, выбрана из шпильки, выступающей цепи и модификации нуклеиновой кислоты, например, одной или более (5 или более) фосфортиоатных связей.

[0012] В одном своем варианте, настоящее изобретение относится к устройству для обнаружения активности эндонуклеазы с использованием субстрата по п. 1, содержащему: реакционную камеру для проведения ферментативных реакций и детектор флуоресценции.

[0013] В одном своем варианте, настоящее изобретение относится к способу обнаружения присутствия нуклеиновой кислоты-мишени в образце, где указанный способ включает: контактирование образца с реакционной смесью, содержащей эндонуклеазу, экзонуклеазу и зонд нуклеиновой кислоты, способный гибридизоваться с нуклеиновой кислотой-мишенью, где указанный зонд содержит: донорный флуорофор и акцепторный флуорофор, и где указанные флуорофоры образуют пару для переноса резонансной энергии флуоресценции (FRET); по меньшей мере одну структуру, ингибирующую расщепление зонда экзонуклеазой; и последовательность распознавания эндонуклеазы, и оценку флуоресценции, испускаемой реакционной смесью, где изменение флуоресценции указывает на присутствие нуклеиновой кислоты-мишени в образце. В некоторых вариантах осуществления изобретения, по меньшей мере одна структура, ингибирующая расщепление зонда экзонуклеазой, выбрана из структуры на каждом 3'-конце, ингибирующей расщепление 3'-5'-экзонуклеазой, структуры на каждом 5'-конце, ингибирующей расщепление 5'-3'-экзонуклеазой или обеих этих структур. В некоторых вариантах осуществления изобретения, экзонуклеаза выбрана из экзонуклеазы I, экзонуклеазы III, экзонуклеазы V, экзонуклеазы VII, экзонуклеазы VIII, экзонуклеазы Т5, экзонуклеазы Т7, лямбда-экзонуклеазы, экзонуклеазы Т, экзонуклеазы BAL-31, экзонуклеазы RecJf, РНКазы R, РНКазы II, РНКазы D, РНКазы Т, РНКазы BN, РНКазы РН, экзорибонуклеазы I и экзорибонуклеазы II. В некоторых вариантах осуществления изобретения, нуклеиновая кислота-мишень выбрана из последовательности, характерной для бактерии; последовательности, характерной для вируса; последовательности, характерной для паразита, и последовательности, характерной для заболевания или состояния пациента. В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза представляет собой эндонуклеазу, регулируемую нуклеиновой кислотой. В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза представляет собой эндонуклеазу CRISPR класса I (CASCADE), а зонд содержит мотив, смежный с протоспейсером (РАМ), и состоящий из последовательности, выбранной из 5'-AAG-3', 5'-AGG-3', 5' -ATG-3', 5'-GAG-3', 5'-CAG-3', 5'-GTG-3', 5'-TAA-3', 5'-TGG-3', 5'-AAA-3', 5'-AAC-3', 5'-AAT-3', 5'-ATA-3', 5'-TAG-3' и 5'-TTG-3'. В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза представляет собой эндонуклеазу CRISPR Cas9 или эндонуклеазу CRISPR Cas12a, а зонд содержит мотив, смежный с протоспейсером (РАМ) и состоящий из последовательности, выбранной из 5'-NGG-3', 5'-NGGNG-3', 5'-NNAAAAW-3', 5'-NNNNGATT-3', 5'-GNNNCNNA-3', 5'-NNNACA-3', 5'-TTN-3', 5'-TTTN-3' и 5'-TTTV-3'. В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза, регулируемая нуклеиновой кислотой, включает эндонуклеазу и нуклеиновую кислоту, нацеленную на другую нуклеиновую кислоту (NATNA), например, руководящую РНК CRISPR, выбранную из одноцепочечной руководящей РНК и двухцепочечной руководящей РНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения, NATNA содержит cr-РНК и tracr-PHK. В некоторых вариантах осуществления изобретения, NATNA содержит область нацеливания, способную гибридизоваться с областью зонда. В некоторых вариантах осуществления изобретения, NATNA способна взаимодействовать с эндонуклеазой. В некоторых вариантах осуществления изобретения, NATNA содержит нуклеотиды ДНК и РНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза выбрана из группы, состоящей из нуклеазы «цинковые пальцы» (ZFN), ZFN, конъюгированной с Fok I, эффекторной нуклеазы, подобной активатору транскрипции (TALEN), одноцепочечной эндонуклеазы Endo ТТ, эндонуклеазы Argonaute, эндонуклеаыа Arcus, эндорибонуклеазы, выбранной из РНКазы III, РНКазы А, РНКазы Т1, РНКазы А, РНКазы Н, РНКазы Z и РНКазы Р, Cas3 и Cas7-11, и рестриктирующей эндонуклеазы. В некоторых вариантах осуществления изобретения, структура, ингибирующая расщепление зонда экзонуклеазой, выбрана из шпильки, выступающей цепи и модификации нуклеиновой кислоты, например, одной или более (5 или более) фосфоротиоатных связей. В некоторых вариантах осуществления изобретения, образец содержит неочищенный препарат нуклеиновых кислот.

[0014] В одном своем варианте, настоящее изобретение относится к способу обнаружения присутствия двух или более нуклеиновых кислот-мишеней в образце, включающему: контактирование образца с реакционной смесью, содержащей эндонуклеазу, экзонуклеазу и два или более зонда нуклеиновой кислоты, каждый из которых способен гибридизоваться с двумя или более нуклеиновыми кислотами-мишенями, причем, каждый зонд содержит: донорный флуорофор и акцепторный флуорофор, где указанные флуорофоры образуют пару для переноса резонансной энергии флуоресценции (FRET); по меньшей мере одну структуру, ингибирующую расщепление зондов экзонуклеазой; и последовательность распознавания эндонуклеазы, и оценку флуоресценции, испускаемой реакционной смесью, где изменение флуоресценции указывает на присутствие нуклеиновой кислоты-мишени в образце. В некоторых вариантах осуществления изобретения, два или более зондов нуклеиновой кислоты содержат по меньшей мере один другой флуорофор. В некоторых вариантах осуществления изобретения, все два или более зондов нуклеиновой кислоты содержат один и тот же флуорофор. В некоторых вариантах осуществления изобретения, по меньшей мере одна структура, ингибирующая расщепление зондов экзонуклеазой, выбрана из структуры на каждом 3'-конце, ингибирующей расщепление 3'-5'-экзонуклеазой, структуры на каждом 5'-конце, ингибирующей расщепление 5'-3'-экзонуклеазой или обеих этих структур. В некоторых вариантах осуществления изобретения, экзонуклеаза выбрана из экзонуклеазы I, экзонуклеазы III, экзонуклеазы V, экзонуклеазы VII, экзонуклеазы VIII, экзонуклеазы Т5, экзонуклеазы Т7, лямбда-экзонуклеазы, экзонуклеазы Т, экзонуклеазы BAL-31, экзонуклеазы RecJf, РНКазы R, РНКазы II, РНКазы D, РНКазы Т, РНКазы BN, РНКазы РН, экзорибонуклеазы I и экзорибонуклеазы II. В некоторых вариантах осуществления изобретения, две или более нуклеиновые кислоты-мишени выбраны из последовательности, характерной для бактерии, последовательности, характерной для вируса, последовательности, характерной для паразита, и последовательности, характерной для заболевания или состояния пациента. В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза представляет собой эндонуклеазу, регулируемую нуклеиновой кислотой. В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза представляет собой эндонуклеазу CRISPR класса I (CASCADE), а субстрат содержит мотив, смежный с протоспейсером (РАМ) и состоящий из последовательности, выбранной из 5'-AAG-3', 5'-AGG-3', 5'-ATG-3', 5'-GAG-3', 5'-CAG-3', 5'-GTG-3', 5'-TAA-3', 5'-TGG-3', 5'-AAA-3', 5'-AAC-3', 5'-AAT-3', 5'-ATA-3', 5'-TAG-3' и 5'-TTG-3'. В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза, регулируемая нуклеиновой кислотой, представляет собой эндонуклеазу CRISPR Cas9 или эндонуклеазу CRISPR Cas12a, а субстрат содержит мотив, смежный с протоспейсером (РАМ) и состоящий из последовательности, выбранной из 5'-NGG-3', 5'-NGGNG-3', 5'-NNAAAAW-3', 5'-NNNNGATT-3', 5'-GNNNCNNA-3', 5'-NNNACA-3', 5'-TTN-3', 5'-TTTN-3' и 5'-TTTV-3'. В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза, регулируемая нуклеиновой кислотой, включает эндонуклеазу и нуклеиновую кислоту, нацеленную на другую нуклеиновую кислоту (NATNA), например, руководяющую РНК CRISPR, выбранную из одноцепочечной руководяющей РНК и двухцепочечной руководяющей РНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения, NATNA содержит cr-РНК и tracr-PHK. В некоторых вариантах осуществления изобретения, по меньшей мере одна NATNA используется для каждого из двух или более зондов, и каждая NATNA содержит область нацеливания, способную гибридизоваться с областью по меньшей мере одного зонда. В некоторых вариантах осуществления изобретения, NATNA способна взаимодействовать с эндонуклеазой. В некоторых вариантах осуществления изобретения, NATNA содержит нуклеотиды ДНК и РНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза выбрана из группы, состоящей из нуклеазы «цинковые пальцы» (ZFN), ZFN, конъюгированной с Fok I, эффекторной нуклеазы, подобной активатору транскрипции (TALEN), одноцепочечной эндонуклеазы Endo ТТ, эндонуклеазы Argonaute, эндонуклеазы Arcus, эндорибонуклеазы, выбранной из РНКазы III, РНКазы А, РНКазы Т1, РНКазы А, РНКазы Н, РНКазы Z и РНКазы Р, Cas3 и Cas7-11, и рестриктирующей эндонуклеазы. В некоторых вариантах осуществления изобретения, структура, ингибирующая расщепление зонда экзонуклеазой, выбрана из шпильки, выступающей цепи и модификации нуклеиновой кислоты, например, одной или более (5 или более) фосфоротиоатных связей. В некоторых вариантах осуществления изобретения, образец содержит неочищенный препарат нуклеиновых кислот.

[0015] В одном своем варианте, настоящее изобретение относится к способу обнаружения присутствия нуклеиновой кислоты-мишени в образце, где указанный способ включает: присоединение к нуклеиновой кислоте-мишени в образце: донорного флуорофора и акцепторного флуорофора, где указанные флуорофоры образуют пару для переноса резонансной энергии флуоресценции (FRET); по меньшей мере одной структуры, ингибирующей расщепление экзонуклеазой; и последовательности распознавания эндонуклеазы, с образованием модифицированной нуклеиновой кислоты, и контактирование образца с эндонуклеазой и экзонуклеазой; и оценку флуоресценции, испускаемой реакционной смесью, где изменение флуоресценции указывает на присутствие нуклеиновой кислоты-мишени в образце. В некоторых вариантах осуществления изобретения, по меньшей мере одна структура, ингибирующая расщепление экзонуклеазой, выбрана из структуры на каждом 3'-конце, ингибирующей расщепление 3'-5'-экзонуклеазой, структуры на каждом 5'-конце, ингибирующей расщепление 5'-3'-экзонуклеазой или обеих этих структур. В некоторых вариантах осуществления изобретения, экзонуклеаза выбрана из экзонуклеазы I, экзонуклеазы III, экзонуклеазы V, экзонуклеазы VII, экзонуклеазы VIII, экзонуклеазы Т5, экзонуклеазы Т7, лямбда-экзонуклеазы, экзонуклеазы Т, экзонуклеазы BAL-31, экзонуклеазы RecJf, РНКазы R, РНКазы II, РНКазы D, РНКазы Т, РНКазы BN, РНКазы РН, экзорибонуклеазы I и экзорибонуклеазы II. В некоторых вариантах осуществления изобретения, присоединение осуществляется посредством лигирования адаптеров, включая донорный флуорофор, акцепторный флуорофор и структуру, ингибирующую расщепление экзонуклеазой. В некоторых вариантах осуществления изобретения, перед присоединением, нуклеиновую кислоту-мишень амплифицируют с помощью ПЦР. В некоторых вариантах осуществления изобретения, присоединение осуществляется посредством одного или более раундов удлинения с помощью праймеров для амплификации, содержащих донорный флуорофор и акцепторный флуорофор, где указанные флуорофоры образуют пару для переноса резонансной энергии флуоресценции (FRET); и структуры, ингибирующей расщепление экзонуклеазой. В некоторых вариантах осуществления изобретения, нуклеиновая кислота-мишень выбрана из последовательности, характерной для бактерии; последовательности, характерной для вируса; последовательности, характерной для паразита; и последовательности, характерной для заболевания или состояния пациента. В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза представляет собой эндонуклеазу, регулируемую нуклеиновой кислотой. В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза представляет собой эндонуклеазу CRISPR класса I (CASCADE), а нуклеиновая кислота-мишень или модифицированная нуклеиновая кислота-мишень содержит мотив, смежный с протоспейсером (РАМ) и состоящий из последовательности, выбранной из 5'-AAG-3', 5'-AGG-3', 5'-ATG-3', 5'-GAG-3', 5'-CAG-3', 5'-GTG-3', 5'-TAA-3', 5'-TGG-3', 5'-AAA-3', 5'-AAC-3', 5'-AAT-3', 5'-ATA-3', 5'-TAG-3' и 5'-TTG-3'. В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза представляет собой эндонуклеазу CRISPR Cas9 или эндонуклеазу CRISPR Cas12a, а нуклеиновая кислота-мишень или модифицированная нуклеиновая кислота-мишень содержит мотив, смежный с протоспейсером (РАМ) и состоящий из последовательности, выбранной из 5'-NGG-3', 5'-NGGNG-3', 5'-NNAAAAW-3', 5'-NNNNGATT-3', 5'-GNNNCNNA-3', 5'-NNNACA-3', 5'-TTN-3', 5 '-TTTN-3' и 5'-TTTV-3'. В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза, регулируемая нуклеиновой кислотой, включает эндонуклеазу и нуклеиновую кислоту, нацеленную на другую нуклеиновую кислоту (NATNA), например, руководящую РНК CRISPR, выбранную из одноцепочечной руководящей РНК и двухцепочечной руководящей РНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения, NATNA содержит cr-РНК и tracr-PHK. В некоторых вариантах осуществления изобретения, NATNA содержит область нацеливания, способную гибридизоваться с нуклеиновой кислотой-мишенью или модифицированной нуклеиновой кислотой-мишенью. В некоторых вариантах осуществления изобретения, NATNA способна взаимодействовать с эндонуклеазой. В некоторых вариантах осуществления изобретения, NATNA содержит нуклеотиды ДНК и РНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза выбрана из группы, состоящей из нуклеазы «цинковые пальцы» (ZFN), ZFN, конъюгированной с Fok I, эффекторной нуклеазы, подобной активатору транскрипции (TALEN), одноцепочечной эндонуклеазы Endo ТТ, эндонуклеазы Argonaute, эндонуклеазы Arcus, эндорибонуклеазы, выбранной из РНКазы III, РНКазы А, РНКазы Т1, РНКазы А, РНКазы Н, РНКазы Z и РНКазы Р, Cas3 и Cas7-11, и рестриктирующей эндонуклеазы. В некоторых вариантах осуществления изобретения, структура, ингибирующая расщепление экзонуклеазой, выбрана из шпильки, выступающей цепи и модификации нуклеиновой кислоты, например, одной или более (5 или более) фосфоротиоатных связей. В некоторых вариантах осуществления изобретения, образец содержит неочищенный препарат нуклеиновых кислот.

[0016] В одном своем варианте, настоящее изобретение относится к набору для проведения диагностической процедуры согласно способу по п. 116, где указанный набор включает: эндонуклеазу и зонд нуклеиновой кислоты, способный гибридизоваться с нуклеиновой кислотой-мишенью, где зонд содержит: донорный флуорофор и акцепторный флуорофор, причем указанные флуорофоры образуют пару для переноса резонансной энергии флуоресценции (FRET); по меньшей мере одну структуру, ингибирующую расщепление зонда экзонуклеазой; и последовательность распознавания эндонуклеазы; и оценки флуоресценции, испускаемой реакционной смесью, где изменение флуоресценции указывает на присутствие нуклеиновой кислоты-мишени в образце, где нуклеиновая кислота-мишень выбрана из последовательности, характерной для бактерии, последовательносиь, характерной для вируса, последовательности, характерной для паразита, и последовательности, характерной для заболевания или состояния пациента. В некоторых вариантах осуществления изобретения, по меньшей мере одна структура, ингибирующая расщепление зонда экзонуклеазой, выбрана из структуры на каждом 3'-конце, ингибирующей расщепление 3'-5'-экзонуклеазой, структуры на каждом 5'-конце, ингибирующей расщепление 5'-3'-экзонуклеазой или обеих этих структур. В некоторых вариантах осуществления изобретения, набор дополнительно содержит экзонуклеазу, выбранную из экзонуклеазы I, экзонуклеазы III, экзонуклеазы V, экзонуклеазы VII, экзонуклеазы VIII, экзонуклеазы Т5, экзонуклеазы Т7, экзонуклеазы лямбда, экзонуклеазы Т, экзонуклеазы BAL-31, экзонуклеазы RecJf, РНКазы R, РНКазы II, РНКазы D, РНКазы Т, РНКазы BN, РНКазы РН, экзорибонуклеазы I и экзорибонуклеазы II. В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза представляет собой эндонуклеазу, регулируемую нуклеиновой кислотой. В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза, регулируемая нуклеиновой кислотой, представляет собой эндонуклеазу CRISPR класса I (CASCADE), а зонд содержит мотив, смежный с протоспейсером (РАМ) и состоящий из последовательности, выбранной из 5'-AAG-3', 5'-AGG-3', 5'-ATG-3', 5'-GAG-3', 5'-CAG-3', 5'-GTG-3', 5'-TAA-3', 5'-TGG-3', 5'-AAA-3', 5'-AAC-3', 5'-AAT-3', 5'-ATA-3', 5'-TAG-3' и 5'-TTG-3'. В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза, регулируемая нуклеиновой кислотой, представляет собой эндонуклеазу CRISPR Cas9 или эндонуклеазу CRISPR Cas12a, а зонд содержит мотив, смежный с протоспейсером (РАМ) и состоящий из последовательности, выбранной из 5'-NGG-3', 5'-NGGNG-3', 5'-NNAAAAW-3', 5'-NNNNGATT-3', 5'-GNNNCNNA-3', 5'-NNNACA-3', 5'-TTN-3', 5'-TTTN-3' и 5'-TTTV-3'. В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза, регулируемая нуклеиновой кислотой, представляет собой эндонуклеазу CRISPR в комплексе с нуклеиновой кислотой, нацеленной на другую нуклеиновую кислоту (NATNA), a NATNA представляет собой руководящую РНК CRISPR, выбранную из одноцепочечной руководящей РНК и двухцепочечной руководящей РНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения, NATNA содержит cr-РНК и tracr-PHK. В некоторых вариантах осуществления изобретения, NATNA способна взаимодействовать с эндонуклеазой. В некоторых вариантах осуществления изобретения, NATNA содержит нуклеотиды ДНК и РНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза выбрана из группы, состоящей из нуклеазы «цинковые пальцы» (ZFN), ZFN, конъюгированной с Fok I, эффекторной нуклеазы, подобной активатору транскрипции (TALEN), одноцепочечной эндонуклеазы Endo ТТ, эндонуклеазы Argonaute, эндонуклеазы Arcus, эндорибонуклеазы, выбранной из РНКазы III, РНКазы А, РНКазы Т1, РНКазы А, РНКазы Н, РНКазы Z и РНКазы Р, Саз3 и Cas7-11, и рестриктирующей эндонуклеазы. В некоторых вариантах осуществления изобретения, структура, ингибирующая расщепление экзонуклеазой, выбрана из шпильки, выступающей цепи и модификации нуклеиновой кислоты, например, одной или более (5 или более) фосфоротиоатных связей.

[0017] В одном своем варианте, настоящее изобретение относится к набору для обнаружения присутствия нуклеиновой кислоты-мишени в образце, где указанный способ включает один или более олигонуклеотидов, способных присоединяться к нуклеиновой кислоте-мишени с образованием модифицированной нуклеиновой кислоты, где олигонуклеотиды содержат: донорный флуорофор и акцепторный флуорофор, причем, указанные флуорофоры образуют пару для переноса резонансной энергии флуоресценции (FRET); по меньшей мере одну структуру, ингибирующую расщепление экзонуклеазой; где модифицированная нуклеиновая кислота содержит последовательность распознавания эндонуклеазы, и эндонуклеазу, и где нуклеиновая кислота-мишень выбрана из последовательности, характерной для бактерии, последовательности, характерной для вируса, последовательности, характерной для паразита, и последовательности, характерной для заболевания или состояния пациента. В некоторых вариантах осуществления изобретения, по меньшей мере одна структура, ингибирующая расщепление экзонуклеазой, выбрана из структуры на каждом 3'-конце, ингибирующей расщепление 3'-5'-экзонуклеазой, структуры на каждом 5'-конце, ингибирующей расщепление 5'-3'-экзонуклеазой или обеих этих структур. В некоторых вариантах осуществления изобретения, экзонуклеаза выбрана из экзонуклеазы I, экзонуклеазы III, экзонуклеазы V, экзонуклеазы VII, экзонуклеазы VIII, экзонуклеазы Т5, экзонуклеазы Т7, лямбда-экзонуклеазы, экзонуклеазы Т, экзонуклеазы BAL-31, экзонуклеазы RecJf, РНКазы R, РНКазы II, РНКазы D, РНКазы Т, РНКазы BN, РНКазы РН, экзорибонуклеазы I и экзорибонуклеазы II. В некоторых вариантах осуществления изобретения, присоединение осуществляется посредством лигирования олигонуклеотидов с нуклеиновой кислотой-мишенью, и набор необязательно включает лигазу. В некоторых вариантах осуществления изобретения, присоединение осуществляется посредством одного или более циклов удлинения, при этом, олигонуклеотиды действуют как праймеры для амплификации, а набор необязательно включает реагенты для проведения амплификации. В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза представляет собой эндонуклеазу, регулируемую нуклеиновой кислотой. В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза представляет собой эндонуклеазу CRISPR класса I (CASCADE), а нуклеиновая кислота-мишень или модифицированная нуклеиновая кислота-мишень содержит мотив, смежный с протоспейсером (РАМ) и состоящий из последовательности, выбранной из 5'-AAG-3', 5'-AGG-3', 5'-ATG-3', 5'-GAG-3', 5'-CAG-3', 5'-GTG-3', 5'-TAA-3', 5'-TGG-3', 5'-AAA-3', 5'-AAC-3', 5'-AAT-3', 5'-ATA-3', 5'-TAG-3' и 5'-TTG-3'. В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза представляет собой эндонуклеазу CRISPR Cas9 или эндонуклеазу CRISPR Cas12a, а нуклеиновая кислота-мишень или модифицированная нуклеиновая кислота-мишень содержит мотив, смежный с протоспейсером (РАМ) и состоящий из последовательности, выбранной из 5'-NGG-3', 5'-NGGNG-3', 5'-NNAAAAW-3', 5'-NNNNGATT-3', 5'-GNNNCNNA-3', 5'-NNNACA-3', 5'-TTN-3', 5'-TTTN-3' и 5'-TTTV-3'. В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза, регулируемая нуклеиновой кислотой, включает эндонуклеазу и нуклеиновую кислоту, нацеленную на другую нуклеиновую кислоту (NATNA), например, руководящую РНК CRISPR, выбранную из одноцепочечной руководящей РНК и двухцепочечной руководящей РНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения, NATNA содержит cr-РНК и tracr-PHK. В некоторых вариантах осуществления изобретения, NATNA содержит область нацеливания, способную гибридизоваться с нуклеиновой кислотой-мишенью или с модифицированной нуклеиновой кислотой-мишенью. В некоторых вариантах осуществления изобретения, NATNA способна взаимодействовать с эндонуклеазой. В некоторых вариантах осуществления изобретения, NATNA содержит нуклеотиды ДНК и РНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза выбрана из группы, состоящей из нуклеазы «цинковые пальцы» (ZFN), ZFN, конъюгированной с Fok I, эффекторной нуклеазы, подобной активатору транскрипции (TALEN), одноцепочечной эндонуклеазы Endo ТТ, эндонуклеазы Argonaute, эндонуклеазы Arcus, эндорибонуклеазы, выбранной из РНКазы III, РНКазы А, РНКазы Т1, РНКазы А, РНКазы Н, РНКазы Z и РНКазы Р, СазЗ и Cas7-11, и рестриктирующей эндонуклеазы. В некоторых вариантах осуществления изобретения, структура, ингибирующая расщепление экзонуклеазой, выбрана из шпильки, выступающей цепи и модификации нуклеиновой кислоты, например, одной или более (5 или более) фосфоротиоатных связей.

[0018] В одном своем варианте, настоящее изобретение относится к способу оптимизации реакций эндонуклеазного расщепления, где указанный способ включает: приготовление серии реакционных смесей с экзонуклеазой и субстратом нуклеиновой кислоты, содержащим: донорный флуорофор и акцепторный флуорофор, где указанные флуорофоры образуют пару для переноса резонансной энергии флуоресценции (FRET); по меньшей мере одну структуру по меньшей мере на одной цепи, ингибирующую расщепление субстрата экзонуклеазой; и последовательность распознавания эндонуклеазы; контактирование каждой из серий реакционных смесей с различными количествами эндонуклеазы; оценку флуоресценции, излучаемой реакционной смесью, где изменение флуоресценции указывает на активность эндонуклеазы; выбор количества эндонуклеазы, дающего наибольшую флуоресценцию реакционной смеси, или наибольшую скорость увеличения флуоресценции реакционной смеси, в качестве оптимальной концентрации эндонуклеазы. В некоторых вариантах осуществления изобретения, структура, ингибирующая расщепление субстрата экзонуклеазой, выбрана из структуры на каждом 3'-конце, ингибирующей расщепление 3'-5'-экзонуклеазой, структуры на каждом 5'-конце, ингибирующей расщепление 5'-3'-экзонуклеазой или обеих этих структур. В некоторых вариантах осуществления изобретения, экзонуклеаза выбрана из экзонуклеазы I, экзонуклеазы III, экзонуклеазы V, экзонуклеазы VII, экзонуклеазы VIII, экзонуклеазы Т5, экзонуклеазы Т7, лямбда-экзонуклеазы, экзонуклеазы Т, экзонуклеазы BAL-31, экзонуклеазы RecJf, РНКазы R, РНКазы II, РНКазы D, РНКазы Т, РНКазы BN, РНКазы РН, экзорибонуклеазы I и экзорибонуклеазы II. В некоторых вариантах осуществления изобретения, реакционную смесь одновременно подвергают контактированию с эндонуклеазой и экзонуклеазой. В некоторых вариантах осуществления изобретения, реакционную смесь сначала подвергают контактированию с эндонуклеазой, а затем с экзонуклеазой. В некоторых вариантах осуществления изобретения, между контактированием реакционной смеси с эндонуклеазой и контактированием реакционной смеси с экзонуклеазой, стадии очистки не проводят.

[0019] В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза представляет собой эндонуклеазу, регулируемую нуклеиновой кислотой, такую как эндонуклеаза CRISPR класса I (CASCADE), а субстрат содержит мотив, смежный с протоспейсером (РАМ) и состоящий из последовательности, выбранной из 5'-AAG-3', 5'-AGG-3', 5'-ATG-3', 5'-GAG-3', 5'-CAG-3', 5'-GTG-3', 5'-TAA-3', 5'-TGG-3', 5'-AAA-3', 5'-AAC-3', 5'-AAT-3', 5'-ATA-3', 5'-TAG-3' и 5'-TTG-3', или эндонуклеазу CRISPR Cas9, или эндонуклеазу CRISPR Cas12a, а субстрат содержит мотив, смежный с протоспейсером (РАМ) и состоящий из последовательности, выбранной из 5'-NGG-3', 5'-NGGNG-3', 5'-NNAAAAW-3', 5'-NNNNGATT-3', 5'-GNNNCNNA-3', 5'-NNNACA-3', 5'-TTN-3', 5 '-TTTN-3' и 5'-TTTV-3'.

[0020] В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза, регулируемая нуклеиновой кислотой, включает эндонуклеазу и нуклеиновую кислоту, нацеленную на другую нуклеиновую кислоту (NATNA), например, руководящую РНК CRISPR, выбранную из одноцепочечной руководящей РНК и двухцепочечной руководящей РНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения, NATNA содержит cr-РНК и tracr-PHK. В некоторых вариантах осуществления изобретения, NATNA содержит область нацеливания, способную гибридизоваться с областью субстрата. В некоторых вариантах осуществления изобретения, NATNA способна взаимодействовать с эндонуклеазой. В некоторых вариантах осуществления изобретения, NATNA содержит нуклеотиды ДНК и РНК.

[0021] В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза выбрана из группы, состоящей из нуклеазы «цинковые пальцы» (ZFN), ZFN, конъюгированной с Fok I, эффекторной нуклеазы, подобной активатору транскрипции (TALEN), одноцепочечной эндонуклеазы Endo ТТ, эндонуклеазы Argonaute, эндонуклеазы Arcus, эндорибонуклеазы, выбранной из РНКазы III, РНКазы А, РНКазы Т1, РНКазы А, РНКазы Н, РНКазы Z и РНКазы Р, Cas3 и Cas7-11, и рестриктирующей эндонуклеазы. В некоторых вариантах осуществления изобретения, структура, ингибирующая расщепление субстрата экзонуклеазой, выбрана из шпильки, выступающей цепи и модификации нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления изобретения, модификация нуклеиновой кислоты включает одну или более фосфортиоатных связей. В некоторых вариантах осуществления изобретения, модификация нуклеиновой кислоты включает 5 или более фосфортиоатных связей.

[0022] В одном своем варианте, настоящее изобретение относится к способу оптимизации реакций расщепления эндонуклеазой CRISPR, где указанный способ включает: приготовление серии реакционных смесей с эндонуклеазой CRISPR, экзонуклеазой и субстратом нуклеиновой кислоты, содержащим: донорный флуорофор и акцепторный флуорофор, где указанные флуорофоры образуют пару для переноса резонансной энергии флуоресценции (FRET); по меньшей мере одну структуру по меньшей мере на одной цепи, ингибирующую расщепление субстрата экзонуклеазой; и последовательность распознавания эндонуклеазы; контактирование каждой из серий нуклеиновых кислот, нацеленных на другую нуклеиновую кислоту (NATNA); оценку флуоресценции, излучаемой реакционной смесью, где изменение флуоресценции указывает на активность эндонуклеазы; и отбор NATNA, дающей наибольшую флуоресценцию реакционной смеси или наибольшую скорость увеличения флуоресценции реакционной смеси, в качестве оптимальной NATNA. В некоторых вариантах осуществления изобретения, по меньшей мере одна структура, ингибирующая расщепление субстрата экзонуклеазой, выбрана из структуры на каждом 3'-конце, ингибирующей расщепление 3'-5'-экзонуклеазой, структуры на каждом 5'-конце, ингибирующей расщепление 5'-3'-экзонуклеазой или обеих этих структур. В некоторых вариантах осуществления изобретения, экзонуклеаза выбрана из экзонуклеазы I, экзонуклеазы III, экзонуклеазы V, экзонуклеазы VII, экзонуклеазы VIII, экзонуклеазы Т5, экзонуклеазы Т7, лямбда-экзонуклеазы, экзонуклеазы Т, экзонуклеазы BAL-31, экзонуклеазы RecJf, РНКазы R, РНКазы II, РНКазы D, РНКазы Т, РНКазы BN, РНКазы РН, экзорибонуклеазы I и экзорибонуклеазы II. В некоторых вариантах осуществления изобретения, реакционную смесь одновременно подвергают контактированию с эндонуклеазой и экзонуклеазой. В некоторых вариантах осуществления изобретения, реакционную смесь сначала подвергают контактированию с эндонуклеазой, а затем с экзонуклеазой.

[0023] В некоторых вариантах осуществления изобретения, никаких стадий очистки между контактированием реакционной смеси с эндонуклеазой и контактированием реакционной смеси с экзонуклеазой не проводят.

[0024] В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза CRISPR представляет собой эндонуклеазу класса I (CASCADE), а субстрат содержит мотив, смежный с протоспейсером (РАМ), и состоящий из последовательности, выбранной из 5'-AAG-3', 5'-AGG-3', 5'-ATG-3', 5'-GAG-3', 5'-CAG-3', 5'-GTG-3', 5'-TAA-3', 5'-TGG-3', 5'-AAA-3', 5'-AAC-3', 5'-AAT-3', 5'-ATA-3', 5'-TAG-3' и 5'-TTG-3'. В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза CRISPR представляет собой эндонуклеазу Cas9 или эндонуклеазу Cas12a, а субстрат содержит мотив, смежный с протоспейсером (РАМ) и состоящий из последовательности, выбранной из 5'-NGG-3', 5'-NGGNG-3', 5' -NNAAAAW-3', 5'-NNNNGATT-3', 5'-GNNNCNNA-3', 5'-NNNACA-3', 5'-TTN-3', 5'-TTTN-3' и 5'-TTTV-3'. В некоторых вариантах осуществления изобретения, NATNA представляет собой руководящую РНК CRISPR, выбранную из одноцепочечной руководящей РНК и двухцепочечной руководящей РНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения, NATNA содержит ск-РНК и tracr-PHK. В некоторых вариантах осуществления изобретения, NATNA содержит область нацеливания, способную гибридизоваться с областью субстрата. В некоторых вариантах осуществления изобретения, NATNA содержит нуклеотиды ДНК и РНК.

[0025] В некоторых вариантах осуществления изобретения, структура, ингибирующая расщепление субстрата экзонуклеазой, выбрана из шпильки, выступающей цепи и модификации нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления изобретения, модификация нуклеиновой кислоты включает одну или более фосфортиоатных связей. В некоторых вариантах осуществления изобретения, модификация нуклеиновой кислоты включает 5 или более фосфортиоатных связей.

Краткое описание чертежей

[0026] На фигуре 1 представлена диаграмма для субстрата и способа согласно изобретению.

[0027] На фигуре 2 проиллюстрировано экспериментальное подтверждение ценности флуоресцентного детектирования, ассоциированного с экзонуклеазой (Пример 2).

[0028] На фигуре 3 показано расщепление субстрата (фигура 1) эндонуклеазой Cas12a (Пример 3).

[0029] На фигуре 4 показано экспериментальное определение линейного диапазона анализа в зависимости от концентрации RNP Cas12a (Пример 4).

[0030] На фигуре 5 проиллюстрировано экспериментальное подтверждение того, что экзонуклеаза, но не Cas12a, гидролизует ДНК (Пример 5).

[0031] На фигуре 6 показано экспериментальное определение линейного диапазона анализа в зависимости от концентрации субстрата ДНК (Пример 6).

[0032] На фигуре 7 представлена подробная схема меченного FAM субстрата для эндонуклеаз CRISPR.

[0033] На фигуре 8 показано применение экзонуклеазного анализа для расщепления меченного FAM субстрата (фигура 7) эндонуклеазой Cas12a (Пример 9).

[0034] На фигуре 9 показано применение экзонуклеазного анализа для расщепления меченного TAMRA субстрата эндонуклеазой Cas12a (Пример 10).

[0035] На фигуре 10 представлена схема субстратов, меченных FAM, с различным расположением флуорофора FAM.

[0036] На фигуре 11 показано применение экзонуклеазного анализа для расщепления различных меченных FAM субстратов (фигура 10) эндонуклеазой Cas12a (Пример 11).

[0037] На фигуре 12 представлены систематизированные данные, показанные на фигуре 11.

[0038] На фигуре 13 показана скорость изменения флуоресценции реакционных смесей (Пример 11).

[0039] На фигуре 14 показано титрование экзонуклеазы в анализе, применяемом для расщепления нецелевого субстрата FAM эндонуклеазой Cas12a (пример 12).

[004 0] На фигуре 15 показано применение экзонуклеазного анализа для расщепления FAM-меченного субстрата эндонуклеазой Cas9 (Пример 13).

[0041] На фигуре 16 показано применение экзонуклеазного анализа для расщепления FAM-меченного субстрата рестриктирующими эндонуклеазами (Пример 14).

Подробное описание изобретения

[0042] Определения

[0043] Нижеследующие определения представлены для лучшего понимания сущности изобретения.

[0044] Термин «эндонуклеаза» относится к ферменту, катализирующему гидролиз фосфодиэфирной связи между двумя нуклеозидными остатками внутри полинуклеотида (ДНК или РНК), в котором ни один нуклеозидный остаток не является концевым.

[0045] Термин «экзонуклеаза» относится к ферменту, катализирующему гидролиз фосфодиэфирной связи между концевым нуклеозидным остатком и предпоследним нуклеозидным остатком внутри полинуклеотида (ДНК или РНК). Экзонуклеазы могут быть процессивными или способными постадийно удалять множество нуклеозидных остатков с конца цепи нуклеиновой кислоты.

[0046] Термин «повтор CRISPR» или «последовательность повтора CRISPR» относится к минимальной последовательности повтора CRISPR.

[0047] Термин «эндорибонуклеаза» относится к ферменту, катализирующему гидролиз фосфодиэфирной связи в РНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндорибонуклеаза может представлять собой сайт-направленный полипептид. Эндорибонуклеаза может быть членом системы CRISPR (например, Типа I, Типа II, Типа III). Эндорибонуклеаза может относиться к суперсемейству белков, принадлежащих к прогностическому белку, ассоциированному с повторами (RAMP) (например, семейства Cas6, Cas6, Cas5). Эндорибонуклеазы также могут включать РНКазу А, РНКазу Н, РНКазу I, члены семейства РНКаз III (например, Drosha, Dicer, РНКазу N), РНКазу L, РНКазу Р, РНКазу PhyM, РНКазу Т1, РНКазу Т2, РНКазу U2, РНКазу VI, РНКазу V.

[0048] Термин «ингибирование» относится к способности химической структуры частично или полностью ингибировать химическую реакцию. Специалисту в данной области известно, что частичное или полное ингибирование зависит от чувствительности методов детектирования. Термин «ингибирование расщепления» в отношении нуклеазы относится к способности заметно уменьшать количество продукта расщепления. Термин «предотвращение расщепления» в отношении нуклеазы относится к способности уменьшать количество продукта расщепления ниже уровня детектирования.

[0049] Термин «NATNA» относится к нуклеиновой кислоте, нацеленной на другую нуклеиновую кислоту. NATNA может быть частью программируемой эндонуклеазной системы, такой как система CRISPR. NATNA может состоять из двух полинуклеотидов, нацеленных на нуклеиновую кислоту («двухчепочечной руководящей молекулы»), включая РНК CRISPR (cr-РНК) и трансактивирующую РНК CRISPR (tracr-PHK). NATNA может состоять из сконструированного полинуклеотида, нацеленного на одну нуклеиновую кислоту («одноцепочечной руководящей молекулы»), и содержащего cr-РНК и tracr-PHK, соединенные областью слияния (линкером). NATNA также может состоять из встречающейся в природе одноцепочечной руководящей РНК (например, руководящей РНК Cas12a). Cr-РНК может содержать нацеливающую область и активирующую область. Tracr-PHK может содержать область, способную гибридизоваться с активирующей областью cr-РНК. Термин «нецеливающая область» относится к области, которая способна гибридизоваться с последовательностью нуклеиновой кислоты-мишени. Термин «активирующая область» относится к области, которая взаимодействует с полипептидом, например, с нуклеазой CRISPR.

[0050] Нуклеиновые кислоты, меченные донорным флуорофором и акцепторным флуорофором (или репортерным флуорофором и гасителем), представляют собой популярный тип зонда или ферментативного субстрата. Нуклеиновые кислоты, меченные флуорофором, являются популярным типом зонда или ферментативного субстрата. Особой популярностью пользуются зонды и субстраты, меченные двумя флуорофорами, образующими FRET-napy. Популярные типы зондов с двойной меткой включают зонды Taqman и Molecular Beacon.

[0051] В анализе Такмана (патент США №5210015), олигонуклеотидный зонд с двойной меткой гибридизуется с образующимся продуктом амплификации во время ПЦР. Флуоресценция обнаруживается в том случае, когда 5'-3'-экзонуклеазная активность ДНК-полимеразы гидролизует зонд между двумя флуорофорами.

[0052] Молекулярные маяки представляют собой зонды с двойной меткой в форме шпильки, в которых связывание зонда с мишенью приводит к раскручиванию шпильки. Такое раскручивание разделяет пару FRET, что позволяет обнаружить флуоресценцию донорного флуорофора. Tyagi S, et al., (1996) Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization. Nat Biotechnol. 14(3):303.

[0 053] Субстраты нуклеиновых кислот, меченные двумя флуорофорами, образующими пару FRET и способными к передаче условной флуоресценции, могут быть использованы для обнаружения ферментативной активности in vitro. Ферментативная активность может указывать, например, на присутствие инфекционного агента в образце. Использование зондов, меченных флуорофором и флуорофором-гасителем, для обнаружения микробного загрязнения, описано в патенте США №10663459. Согласно этому методу, присутствие микроорганизма в образце приводит к расщеплению зонда одной или более нуклеазами (например, эндонуклеазами или экзонуклеазами). Все возможные расщепления приводят к физическому разделению флуорофора и гасителя и к испусканию детектируемой флуоресценции, которая указывает на присутствие микроорганизма в образце.

[0054] Похожий принцип был использован в патенте США №10653800, где РНК-субстрат включает 2'-О-метилмодифицированные пиримидины и обладает уникальной чувствительностью к микоплазменной РНКазе. Субстрат метят флуорофором и гасителем. Присутствие микоплазмы в образце приводит к расщеплению зонда микоплазменной РНКазой и к испусканию детектируемой флуоресценции, что указывает на присутствие микоплазмы в образце.

[0055] Субстраты двухцепочечных нуклеиновых кислот, меченные флуорофором и гасителем, также были использованы для обнаружения специфической редактирующей активности эндонуклеаз CRISPR. Например, в публикации Smith et al., (202 0) Probing CRISPR-Cas12a Nuclease Activity Using Double-Stranded DNA-Templated Fluorescent Substrates, Biochemistry 59:1474, описано расщепление такого субстрата посредством транс-расщепляющей («транс-измельчающей») активности нуклеазы CRISPR Cas12a. Транс-измельчающая активность запускается связыванием комплекса Cas12a-cr-PHK с двухцепочечной ДНК-мишенью. Транс-расщепляющая нуклеазная активность направлена на любую двухцепочечную ДНК вблизи комплекса Cas12a-crHK-мишень. Измельчение субстрата, меченного флуорофором и гасителем, приводит к испусканию детектируемой флуоресценции, что свидетельствует об образовании комплекса Cas12a-crPHK-мишень в образце.

[0056] Активность нуклеаз CRISPR-Cas обычно оценивают путем инкубирования рибонуклеопротеинового комплекса (RNP) с моделированным субстратом с последующим электрофорезом в агарозном геле для отделения отщепленных фрагментов от интактного субстрата. Этот подход имеет низкую производительность и обычно ограничивается анализом конечной точки и, таким образом, дает мало или вообще не дает информации о кинетике реакций.

[0057] Для Cas12a также был описан флуоресцентный анализ, однако, этот анализ позволяет определять только неспецифическую транс-активность фермента Cas12a (см. Smith CW, Biochemistry. 2020, см. выше). Если RNP Cas12a взаимодействует с последовательностью-мишенью и расщепляет эту последовательность (цис-активность), то Cas12a активируется и осуществляет неспецифическое расщепление коротких фрагментов ДНК (транс-активность или активность «транс-измельчения»). Существует несколько ограничений по оценке гране-активности как индикатора цис-активности. Во-первых, точная корреляция между цис- и трансактивностью неизвестна. Во-вторых, суррогатный анализ дает ограниченную кинетическую информацию о цис-активности, поскольку две реакции выполняются одним и тем же ферментом и не могут быть разделены. И наконец, этот анализ не имеет общей применимости, поскольку многие эндонуклеазы не обладают транс-активностью.

[0058] Флуоресцентный анализ для оценки активности Cas9 был разработан в 2018 году (см. Seamon et al., (2018), Versatile High-Throughput Fluorescence Assay for Monitoring Cas9 Activity, Anal. Chem., 2018, 90, 11, 6913-6921). Однако, этот анализ обеспечивает только определение конечной точки, но не дает данных в реальном времени, поскольку он основан на денатурации субстрата ДНК после расщепления эндонуклеазой.

[0059] Настоящее изобретение позволяет устранить эти недостатки, что обеспечивает удобный анализ активности эндонуклеазы в реальном времени. Настоящее изобретение включает простой, высокопроизводительный флуоресцентный анализ в качестве инструмента оценки и контроля качества.

[0060] Настоящее изобретение дополнительно включает диагностический анализ специфической активности эндонуклеазы, который указывает на наличие диагностической мишени в образце.

[0061] В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к молекуле-субстрату для обнаружения и оценки активности эндонуклеазы. Как показано на Фигуре 1, панель А, в некоторых вариантах осуществления изобретения, субстрат представляет собой нуклеиновую кислоту, имеющую по меньшей мере одну двухцепочечную область. В некоторых вариантах осуществления изобретения, субстрат является одноцепочечным. В некоторых вариантах осуществления изобретения, субстрат представляет собой двухцепочечную нуклеиновую кислоту, содержащую две цепи нуклеиновой кислоты, образующие дуплекс посредством гибридизации. В других вариантах осуществления изобретения, субстрат представляет собой одну цепь нуклеиновой кислоты, образующую вторичную структуру, содержащую двухцепочечную область, например, шпильку, посредством гибридизации.

Специалисту в данной области будет очевидно, что гибридизация и образование двухцепочечной области не требуют 100% комплементарности по длине цепей нуклеиновой кислоты. В подходящих условиях, определяемых ионной силой буфера и температурой, может образовываться стабильный гибрид (двухцепочечная область) с комплементарностью между двумя цепями нуклеиновой кислоты, составляющей менее 100%, например, 90%, 80%, 75% или менее.

[0062] Как далее видно на фигуре 1, субстрат нуклеиновой кислоты содержит донорный флуорофор и акцепторный флуорофор (или репортерный флуорофор и флуорофор-гаситель), причем указанные флуорофоры образуют пару для переноса резонансной энергии флуоресценции (FRET).

[0063] Флуорофор и гаситель могут находиться в различных участках на субстрате двухцепочечной нуклеиновой кислоты. Кроме того, можно использовать более, чем один флуорофор. Как показано на фигуре 10, флуорофор и гаситель могут быть расположены на цепи-мишени, на нецелевой цепи, а также на цепи-мишени и на нецелевой цепи.

[0064] Перенос резонансный энергии флуоресценции (FRET), также известный как перенос резонансный энергии Foerster (или Форстера), представляет собой передачу энергии возбуждения от одной молекулы к другой без флуоресценции и повторного поглощения. Донорный хромофор переходит в электронно-возбужденное состояние после поглощения света на определенной длине волны. Донор передает энергию акцептору, и акцептор переходит в электронно-возбужденное состояние. Впоследствии, электронно-возбужденное состояние акцептора затухает, в результате чего испускается детектируемый свет. оскольку акцептор уменьшает или гасит флуоресценцию донора, то его иногда называют гасителем. Донор иногда называют репортером. В традиционной технологии FRET, донор и акцептор являются флуорофорами. Донорный флуорофор поглощает свет на определенной длине волны поглощения, а акцептор излучает свет на определенной длине волны излучения, которая длиннее длины волны поглощения. FRET возникает в том случае, когда донор и акцептор находятся в непосредственной близости друг от друга (например, на рссстоянии 1-10 нм). В некоторых вариантах осуществления изобретения, донорный флуорофор и акцепторный флуорофор расположены на расстоянии от 0 до 12 нуклеотидов друг от друга. Донорный флуорофор и акцепторный флуорофор размещаются на одной цепи субстрата или на разных (противоположных) цепях субстрата. Либо донор, либо акцептор, либо и донор и акцептор могут находиться вблизи от конца цепи нуклеиновой кислоты, например, 5'-конца или 3'-конца. Донорный и акцепторный флуорофоры могут находиться на одной цепи или на противоположных нитях. Специалист в данной области может легко определить различные варианты размещения донорного флуорофора и акцепторного флуорофора (или репортерного флуорофора и гасителя) внутри двухцепочечного субстрата так, чтобы достичь желаемой близости флуорофоров (например, 1-10 нм).

[0065] В существующей литературе имеется достаточно рекомендаций по выбору соответствующих пар репортер-гаситель, способных к FRET, см., например, патенты США №5538848; 8350038; и 8137616. Обычно, как рекомендовано в публикации заявки на патент США US20060088855, донорные флуорофоры поглощают энергию в диапазоне 350-800 нм, предпочтительно 350-600 нм или 500-750 нм, а расстояние между донором и акцептором составляет от 10 до 100 ангстрем. См. также Pesce et al., eds., Fluorescence Spectroscopy (Marcel Dekker, New York, 1971); White et al., Fluorescence Analysis: A Practical Approach (Marcel Dekker, New York, 1970); Berlman, Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules, 2nd Edition (Academic Press, New York, 1971); Griffiths, Color and Constitution of Organic Molecules (Academic Press, New York, 1976); Bishop, editor, Indicators (Pergamon Press, Oxford, 1972); Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (Molecular Probes, Eugene, 1992); Pringsheim, Fluorescence and Phosphorescence (Interscience Publishers, New York, 1949); и т.п.

[0066] Многие доноры, акцепторы и пары донор/акцептор, демонстрирующие феномен FRET, являются коммерчески доступными. Хорошо известные доноры включают флуоресцеиновые красители, такие как 5-карбоксифлуоресцеин (5-FAM), 6-карбоксифлуоресцеин (6-FAM), 2',4',1,4,-тетрахлорфлуоресцеин (ТЕТ), 2',4',5', 7',1,4-гексахлорфлуоресцеин (HEX) и 2',7'-диметокси-4',5'-дихлор-6-карбоксифлуоресцеин (JOE). Другие доноры включают кумариновые красители, семейство красителей Alexa Fluor, IRDye 800CW, каскадный синий, краситель Pacific Blue, оранжевый краситель Pacific Orange и техасский красный. Хорошо известные акцепторы включают родаминовые красители, такие как тетраметил-6-карбоксирродамин (TAMRA) и тетрапропано-6-карбоксирродамин (ROX), DABSYL, DABCYL, цианиновые красители, включая Су5 и Су5.5, антрахинон, нитротиазол и соединения нитроимидазола. Дополнительными акцепторами являются LC-Red 610, LC-Red 64 0, LC-Red 705, JA286, DDQ-I, DDQ-II, QSY-7, QSY-21, IRDye QC1, Iowa Black FQ и Iowa Black RQ, и сульфированные цианиновые красители, описанные в патенте США №6027709. Хорошо известные донорно-акцепторные комбинации включают флуоресцеин/родамин, а в частности, карбоксифлуоресцеин/тетраметилродамин (FAM/TAMRA). TAMRA в качестве гасителя также может сочетаться с такими донорами, как HEX (гексахлорфлуоресцеин), ТЕТ (тетрахлорфлуоресцеин), JOE (5'-дихлордиметоксифлуоресцеин) и цианиновыми красителями. Другая пара донор/акцептор раскрыта в патенте США №97967 6 и состоит из окисленной формы первого флуорофора на основе карба-NADH и второго флуорофора, который возбуждается под действием света на длине волны 445-540 нм и имеет максимальную энергию излучения более, чем 560 нм.

[0067] Другой группой флуоресцентных соединений являются нафтиламины, имеющие аминогруппу в альфа- или бета-положении. К таким нафтиламино-соединениям относятся 1-диметиламинонафтил-5-сульфонат, 1-анилино-8-нафталинсульфонат и 2-п-толуидинил-6-нафталинсульфонат.Другие красители включают 3-фенил-7-изоцианатокумарин, акридины, такие как 9-изотиоцианатоакридин и акридиновый оранжевый; N-(п-(2-бензоксазолил)фенил)малеимид; бензоксадиазолы, стильбены и пирены.

[0068] К другой категории флуорофоров относятся красители BODIPY®, описанные в патенте США №5994063. «BODIPY®» относится к классу модифицированных спектрально различающихся флуорофоров, в которых исходная гетероциклическая молекула представляет собой соединение дифторида дипиррометенбора. Большинство флуорофоров BODIPY® имеют максимальное поглощение приблизительно от 450 до 700 и максимальное излучение приблизительно от 450 до 700. Примерами являются BODIPY® 503/512-SE (4, 4-дифтор-5,7-диметил-4 -бора-За,4а-диаза-з-индацен-3-пропионовая кислота), BODIPY®523/547 (4,4-дифтор-5-фенил-4-бора-3,4а-диаза-з-индацен-3-пропионовая кислота), BODIPY® 530/550 (4, 4-дифтор-5,7-дифенил-4-бора-За,4а-диаза-з-индацен-3-пропионовая кислота), BODIPY® 558/568 (4,4-дифтор-5-(2-тиенил)-4-бора-За,4а-диаза-s-индацен-3-пропионовая кислота), BODIPY® 564/570 (4,4-дифтор-5-стирил-4-бора-За,4а-диаза-з-индацен-3-пропионовая кислота), BODIPY® 576/589 (4,4-дифтор-5-(2-пирролил)-4-бора-3,4а-диаза-s-индацен-3-пропионовая кислота) и BODIPY® 581/591 (4,4-дифтор-5-(4-фенил-1,3-бутадиенил)-4-бора-3,4 а-диаза-s-индацен-3-пропионовая кислота).

[0069] Одним из типов гасителей являются «темновые гасители». Эти нефлуоресцентные акцепторы обеспечивают низкую фоновую флуоресценцию и таким образом повышают чувствительность анализа. При использовании темнового гасителя, донорный флуорофор не излучает свет до тех пор, пока гаситель не будет удален от донора. Например, если донор и гаситель конъюгированы с олигонуклеотидом, то флуоресценция донора может возникнуть только тогда, когда гаситель удаляется путем гидролиза олигонуклеотида нуклеазой. Одним из примеров темнового гасителя является DABCYL (4-[[4-(диметиламино)фенил]азо]бензойная кислота), который гасит донорные красители в диапазоне от 380 до 530 нм. Еще одним темновым гасителем является гаситель Eclipse (4 -[[2-хлор-4-нитрофенил]азо]анилин (поставляется от Epoch Biosciences, Inc.), который имеет максимум поглощения на 530 нм и осуществляет эффективное гашение в спектре от 520 до 670 нм. Еще одна категория темновых гасителей представляет собой гасители черных дыр, такие как BHQ-1([(4-(2-нитро-4-метил-фенил)-азо)-ил-((2-метокси-5-метил-фенил)-азо)]-анилин) и BHQ-2 ([(4-(1-нитрофенил)-азо)-ил-((2,5-диметокси-фенил)-азо)]-анилин) (все они поставляются Biosearch Technologies, Inc.).

[0070] Другой тип гасителя включает производные пиридинилизохинолиндиона, раскрытые в патенте США №8350038. Эти соединения характеризуются низким фоновым сигналом и высокой эффективностью гашения. Еще одной категорией гасителей являются нефлуоресцентные цианиновые соединения-гасители, присоединенные к основанию нуклеотида посредством линкерного соединения, как описано в патенте США №6348596. Еще одной категорией гасителей являются слаболюминесцентные цианины, которые замещены одним или более гетероароматическими гасящими фрагментами, раскрытыми в патенте США №8093411. Эти гасители проявляют слабую люминесценцию, или практически не проявляют заметной люминесценции и эффективно гасят люминесцентные соединения широкого спектра.

[0071] Специалистам в данной области известны способы синтеза олигонуклеотидов и ковалентного присоединения флуорофоров к нуклеиновым кислотам. См., например, патенты США №3996345; 4351760; 4757141; 4739044; 4997928; 5538848; 5188934; 5231191; и 7759469; и публикации Eckstein, ed., Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 1991); Zuckerman et al., Nucleic Acids Research, 15: 5305-5321 (1987) (З'-тиоловая группа на олигонуклеотиде); Sharma et al., Nucleic Acids Research, 19:3019 (1991) (3'-сульфгидрил); Giusti et al., PCR Methods and Applications, 2:223-227 (1993); Agrawal et al., Tetrahedron Letters, 31:1543-1546 (1990) (присоединение посредством фосфорамидатных связей); Sproat et al., Nucleic Acids Research, 15:4837 (1987) (5'-меркаптогруппа); Nelson et al., Nucleic Acids Research, 17:7187-7194 (1989) (3'-аминогруппа). Для синтеза меченых зондов нуклеиновой кислоты могут быть использованы функциональные группы и связывающие фрагменты. Обычно, предварительно синтезированные нуклеотиды, меченные флуорофором, вводят в олигонуклеотид с применением стандартного химического метода на основе фосфорамидита. Путем включения таких нуклеотидов в нужное положение олигонуклеотида, донорные и акцепторные флуорофоры могут быть включены в любое внутреннее или концевое положение олигонуклеотида. В предварительно синтезированных нуклеотидах, меченных флуорофором, метка может быть связана с функциональной группой, присоединенной, например, к аминогруппе основания нуклеотида. В других вариантах осуществления изобретения, метку присоединяют к части нуклеотида посредством связывающего фрагмента. Например, в некоторых вариантах осуществления изобретения, нуклеотидное основание модифицируют для обеспечения возможности конъюгирования с меткой. Например, в патенте США №7759469 раскрываются замещенные нитроиндольные нуклеотиды, которые могут быть конъюгированы с флуорофором.

[0072] В некоторых вариантах осуществления изобретения, субстрат двухцепочечной нуклеиновой кислоты имеет длину приблизительно от 10 до приблизительно 90 пар оснований. Например, для эндонуклеазы Cas12a, субстрат имеет длину от 35 до 90 пар оснований и может содержать РАМ (5 нуклеотидов), спейсер (20 нуклеотидов), защиту концов (5 нуклеотидов на каждом конце), с добавлением до 35 пар оснований. В целом, эндонуклеазы имеют разные размеры и структуры последовательностей распознавания.

Следовательно, для каждой тестируемой эндонуклеазы, оптимальную длину субстрата можно определить путем вычисления, показанного выше. Оптимальную длину и последовательность можно определить in silico или вычислить эмпирически. Такая оптимальная длина обеспечивает наиболее эффективное расщепление эндонуклеазой без стерических затруднений и при этом не является избыточной. Чрезмерная длина связана с высокой стоимостью производства и требует введения дополнительных единиц экзонуклеазы и дополнительного времени для выполнения описанного здесь способа. При выборе оптимальной длины субстрата двухцепочечной нуклеиновой кислоты для каждой тестируемой эндонуклеазы можно учитывать одно или более таких соображений.

[0073] В некоторых вариантах осуществления изобретения, субстрат нуклеиновой кислоты согласно изобретению включает химические модификации. В некоторых вариантах осуществления изобретения, модификация повышает стабильность дуплекса нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления изобретения, модификация придает резистентность к расщеплению нуклеазой или к ингибированию нуклеаз. В некоторых вариантах осуществления изобретения, модификация придает резистентность к расщеплению экзонуклеазами или ингибированию экзонуклеаз.

[0074] В некоторых вариантах осуществления изобретения, модификация представляет собой модификацию остова. Одним из типов модификации остова является модифицированная межнуклеозидная связь. Например, модификация включает фосфортиоатные связи и межнуклеозидные связи гетероатомов.

[0075] Другим типом модификации остова является модификация сахарного фрагмента. В некоторых вариантах осуществления изобретения, модификация включает включение 6-членного морфолинового кольца вместо рибозного или дезоксирибозного кольца. Другая модификация остова включает введение циклогексенильного кольца вместо рибозы или дезоксирибозы (ceNA). Еще одна модификация остова включает введение блокированных нуклеиновых кислот (LNA), в которых 2'-гидроксильная группа связана с 4'-атомом углерода рибозы с образованием бициклической структуры, имеющей 2'-С,4'-С-оксиметиленовую связь. LNA характеризуются дуплексной стабильностью и резистентностью к расщеплению 3'-5' экзонуклеазой.

[0076] В некоторых вариантах осуществления изобретения, модификация представляет собой модификацию азотистого основания. Например, субстрат двухцепочечной нуклеиновой кислоты может включать один или более из 5-метилцитозина (5-те-С), 5-гидроксиметилцитозина, ксантина, гипоксантина, 2-аминоаденина, 6-метила и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-пропил и другие алкилпроизводные аденина и гуанина, 2-тиоурацил, 2-тиотимин и 2-тиоцитозин, 5-галурацил и цитозин, 5-пропинил(-С=С-СНЗ)урацил и цитозин и другие алкинильные производные пиримидиновых оснований, 6-азоурацил, цитозин и тимин, 5-урацил (псевдоурацил), 4-тиоурацил, 8-галоген, 8-амино, 8-тиол, 8-тиоалкил, 8-гидроксил и другие 8-замещенные аденины и гуанины, 5-галоген, в частности 5-бром, 5-трифторметил и другие 5-замещенные урацилы и цитозины, 7-метилгуанин и 7-метиладенин, 2-F-аденин, 2-аминоаденин, 8-азагуанин и 8-азааденин, 7-деазагуанин и 7-деазааденин, 3-деазааденин и 3-деазааденин. Модифицированные азотистые основания могут включать трициклические пиримидины, такие как феноксазинцитидин(1Н-пиримидо(5,4-b,4)бензоксазин-2(3)-он), фенотиазинцитидин (1Н-пиримидо(5,4-b(1,4)бензотиазин-2(3)-он), G-комплексы, такие как замещенный феноксазин-цитидин (например, 9-(2-аминоэтокси)-Н-пиримидо(5,4-(b)(1,4)бензоксазин)-2(3)-он), карбазолцитидин (2Н-пиримидо(4,5-b)индол-2-он), пиридоиндолцитидин (Н-пиридо(3',2':4,5)пирроло(2,3-)г)римидин-2-он), 7-деазааденин, 7-деазагуанозин, 2-аминопиридин и 2-пиридон. Азотистые основания могут оказаться полезными для повышения аффинности связывания полинуклеотидного соединения. Они могут включать 5-замещенные пиримидины, 6-азапиримидины и N-2-, N-6- и 0-6-замещенные пурины, включая 2-аминопропиладенин, 5-пропинилурацил и 5-пропинилцитозин. Замены 5-метилцитозина могут повышать стабильность дуплекса нуклеиновой кислоты на 0,6-1,2° и могут оказаться подходящими заменами оснований (например, в сочетании с модификациями 2'-0-метоксиэтилсахара).

[0077] Специалисту в данной области будет очевидно, что модификации нуклеиновой кислоты не следует включать в сайт распознавания тестируемой эндонуклеазы, если такая модификация может препятствовать активности эндонуклеазы, если только не было установлено, что эндонуклеаза не ингибируется такой модификацией. Аналогичным образом, специалисту в данной области будет очевидно, что модификации нуклеиновых кислот, которые, как известно, ингибируют расщепление экзонуклеазой, не должны быть включены в часть субстрата, расположенного между сайтом распознавания эндонуклеазы и флуорофором, чтобы не блокировать или не ингибировать эффективность описанного здесь способа.

[0078] В способах и в композициях, описанных в настоящей заявке, используется экзонуклеаза. Экзонуклеазы известны специалистам в данной области, и многие из них являются коммерчески доступными, см., например, Lovett S. Т. (2011). The DNA Exonucleases of Escherichia coli. EcoSal Plus, 4(2) and Shevelev, I., Hiibscher, U. (2002) The 3'-5' exonucleases. Nat Rev Mol Cell Biol 3, 364-376. Многие экзонуклеазы поставляются от New England Biolabs (Ipswich, Mass.). Например, экзонуклеаза I, экзонуклеаза T и экзонуклеаза VII представляют собой 3'-5' экзонуклеазы, активные в отношении одноцепочечной ДНК. RecJf представляет собой 5'-3'-экзонуклеазу, активную в отношении одноцепочечной ДНК. Экзонуклеаза III представляет собой 3'-5' экзонуклеазу, активную в отношении одноцепочечной ДНК и двухцепочечной ДНК. Экзонуклеаза Т7, экзонуклеаза V, экзонуклеаза VIII, экзонуклеаза лямбда и экзонуклеаза Т5 представляют собой 5'-3'-экзонуклеазы, активные в отношении одноцепочечной и двухцепочечной ДНК. Экзонуклеаза V (RecBCD) и BAL-31 одновременно являются 5'-3'- и 3'-5'-экзонуклеазами, активными в отношении одноцепочечной ДНК и двухцепочечной ДНК. В зависимости от типа концов нуклеиновой кислоты, образующихся под действием тестируемой эндонуклеазы, квалифицированный специалист может выбрать подходящую экзонуклеазу. Соответствующая экзонуклеаза будет использовать конец или концы, генерируемые эндонуклеазой, и гидролизовать субстрат нуклеиновой кислоты, описанный в настоящей заявке. Гидролиз экзонуклеазой будет разделять пару флуорофоров FRET (например, донор и акцептор или репортер и гаситель), так, что можно будет обнаружить флуоресценцию или изменение флуоресценции.

[0079] Как показано на фигуре 1, субстрат содержит структуру по меньшей мере на одном из концов, которая ингибирует или предотвращает расщепление экзонуклеазой. Выбор экзонуклеазы для включения в способы, композиции и наборы, описанные в настоящей заявке, определяет выбор структуры, ингибирующей экзонуклеазу и обеспечивающей концевую защиту в субстрате нуклеиновой кислоты. Например, если предпочтительным субстратом экзонуклеазы является 3'-конец, то субстрат нуклеиновой кислоты имеет структуру, ингибирующую экзонуклеазу, на каждом из 3'-концов. Если предпочтительным субстратом экзонуклеазы является 5'-конец, то субстрат нуклеиновой кислоты имеет структуру, ингибирующую экзонуклеазу, на каждом из 5'-концов. Если экзонуклеаза является активной как на 3'-концах, так и на 5'-концах, то субстрат нуклеиновой кислоты имеет структуру, ингибирующую экзонуклеазу, на каждом из 3'-концов и 5'-концов.

[0080] Выбор экзонуклеазы также должен согласовываться с типами разрывов и доступных концов, генерируемых тестируемой эндонуклеазой. Экзонуклеаза (или смесь экзонуклеаз) должна быть активна в отношении типов концов (выступающих, тупых или утопленных, гидроксильных или фосфорильных), генерируемых тестируемой эндонуклеазой, и в то же время она должна ингибироваться ингибирующими структурами, присутствующими на концах субстрата нуклеиновой кислоты, описанного в настоящей заявке.

[0081] В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза представляет собой никазу, то есть, эндонуклеазу, расщепляющую только одну цепь дуплекса и образующую разрыв. В этом варианте осуществления изобретения, экзонуклеазой может быть, например, экзонуклеаза III, экзонуклеаза Т5, экзонуклеаза Т7, лямбда-экзонуклеаза и экзонуклеаза BAL31.

[0082] В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза расщепляет обе цепи дуплекса и образует двухцепочечный разрыв. В некоторых вариантах осуществления изобретения, двухцепочечный разрыв имеет тупые концы. В некоторых вариантах осуществления изобретения, двухцепочечный разрыв имеет концы, расположенные в шахматном порядке. В некоторых вариантах осуществления изобретения, концы, расположенные в шахматном порядке, могут иметь выступающий 3'-конец. В некоторых вариантах осуществления изобретения, концы, расположенные в шахматном порядке, могут иметь выступающий 5'-конец. Специалист в данной области может выбрать экзонуклеазу (или смесь двух или более экзонуклеаз), способную инициировать гидролиз в нужном направлении с концов конкретного типа, генерируемых тестируемой эндонуклеазой. Например, в публикации New England Biolabs (Ipswich, Mass.) приводится список доступных экзонуклеаз, сгруппированных по биохимическим свойствам (например, по типу требуемых концов и направленности гидролиза).

[0083] Как далее видно на фигуре 1, панель В, субстрат содержит последовательность распознавания (или сайт распознавания) эндонуклеазы. В зависимости от тестируемой эндонуклеазы, сайт распознавания может содержать сайт расщепления и иметь один или более дополнительных элементов. В некоторых вариантах осуществления изобретения, тестируемая эндонуклеаза представляет собой эндонуклеазу, регулируемую нуклеиновой кислотой. В некоторых вариантах осуществления изобретения, тестируемая эндонуклеаза представляет собой эндонуклеазу CRISPR класса I (CASCADE) или эндонуклеазу CRISPR класса II. В некоторых вариантах осуществления изобретения, тестируемая эндонуклеаза представляет собой эндонуклеазу CRISPR Cas9 или CRISPR Cas12a (Cpf1.

[0084] В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза представляет собой дезоксирибонуклеазу, а субстрат представляет собой одноцепочечную или двухцепочечную ДНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза представляет собой рибонуклеазу, а субстрат представляет собой одноцепочечную или двухцепочечную РНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза представляет собой рибонуклеазу, такую как рибозим, рибозим типа «головка молотка», ДНКзим, РЫАзим или сконструированную эндорибонуклеазу, например, типа, описанного в публикации Choudhury, R. et al., (2012) Engineering RNA endonucleases with customized sequence specificities. Nature Comm., 3:1147.

[0085] В некоторых вариантах осуществления изобретения, тестируемая эндонуклеаза представляет собой эндонуклеазу, кодируемую локусом CRISPR, или эндонуклеазу, родственную ей. Геномный локус CRISPR (кластеризованных регулярно повторяющихся коротких палиндромных повторов) встречается во многих геномах прокариот и обеспечивает резистентность к включению чужеродных нуклеиновых кислот.Структура, номенклатура и классификация локусов CRISPR рассматриваются в публикации Makarova et al., Evolution and classification of the CRISPR-Cas systems. Nature Reviews Microbiology. 2011 June; 9(6): 467-477.

[0086] Вкратце, типичный локус CRISPR включает ряд коротких повторов, регулярно перемежающихся спейсерами. Локус CRISPR также включает последовательности, кодирующие CRISPR-ассоциированные (Cas) гены. Звено последовательности спейсер-повтор кодирует crispr-PHK (cr-РНК). In vivo, зрелые cr-РНК процессируются из полицистронного транскрипта, называемого пре-cr-РНК или массивом пре-cr-PHK. Повторы в массиве пре-сг-РНК распознаются белками, кодируемыми Саз, которые связываются с повторами и расщепляют их, высвобождая зрелые cr-РНК. Системы CRISPR выполняют расщепление нуклеиновой кислоты-мишени, при этом, белки Cas и cr-РНК образуют рибонуклеопротеины CRISPR (crRNP). Молекула cr-РНК направляет crRNP к нуклеиновой кислоте-мишени (например, чужеродной нуклеиновой кислоте, проникающей в бактериальную клетку), а белки-нуклеазы Саз расщепляют нуклеиновую кислоту-мишень.

[0087] Системы CRISPR класса 1, типа I включают средства для процессинга массива пре-cr-PHK, который включает мультибелковый комплекс, называемый Cascade (CRISPR-ассоциированный комплекс для противовирусной защиты) и состоящий из субъединиц CasA, В, С, D и Е. Комплекс Cascade-cr-PHK распознает нуклеиновую кислоту-мишень посредством гибридизации нуклеиновой кислоты-мишени с cr-РНК. Связанный нуклеопротеиновый комплекс осуществляет рекрутинг геликазы/нуклеазы Cas3 для облегчения расщепления нуклеиновой кислоты-мишени.

[0088] Системы CRISPR класса 2, типа II включают трансактивирующую РНК CRISPR (tracr-PHK). Tracr-PHK гибридизуется с повтором cr-РНК в массиве пре-cr-PHK и осуществляет рекрутинг эндогенной РНКазы III для расщепления массива пре-cr-PHK. Комплекс tracr-PHK/cr-РНК может ассоциироваться с нуклеазой, например, Cas9. Комплекс сг-РНК-tracr-PHK-Cas9 распознает нуклеиновую кислоту-мишень посредством гибридизации нуклеиновой кислоты-мишени с cr-РНК. Гибридизация cr-РНК с нуклеиновой кислотой-мишенью активирует нуклеазу Cas 9. для расщепления нуклеиновой кислоты-мишени.

[0089] Системы CRISPR класса 1, типа III включают суперсемейство эндорибонуклеаз RAMP (например, Cas6), которые расщепляют массив пре-cr-PHK посредством одного или более белков, подобных полимеразе CRISPR.

[0090] Системы CRISPR класса 2, типа V содержат другой набор Cas-подобных генов, включая Csf1, Csf2, Csf3 и Csf4, которые являются отдаленными гомологами генов Cas в системах CRISPR типов I-III.

[0091] Как показано на фигуре 1, панель В, субстрат содержит последовательность распознавания (или сайт распознавания) эндонуклеазы. В некоторых вариантах осуществления изобретения, последовательность распознавания и сайт расщепления являются одинаковыми. В некоторых вариантах осуществления изобретения, сайт распознавания представляет собой палиндромную последовательность, характерную для рестриктирующих эндонуклеаз типа II, и расщепление происходит внутри палиндромной последовательности. В некоторых вариантах осуществления изобретения, последовательность распознавания отличается от сайта расщепления. В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза представляет собой эндонуклеазу CRSIPR Cas9, а последовательность распознавания представляет собой мотив, смежный с протоспейсером (РАМ), тогда как сайт расщепления примыкает к РАМ. В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза представляет собой эндонуклеазу CRSIPR Cas12a, а последовательность распознавания представляет собой мотив, смежный с протоспейсером (РАМ), тогда как сайт расщепления находится на расстоянии 16-18 оснований от РАМ на нецелевой цепи и на расстоянии 23-25 оснований от РАМ на цепи-мишени, см. Strohkendl, I., et al., (2018) Kinetic Basis for DNA Target Specificity of CRISPR-Cas12a, Mol. Cell, 71(5):816-824.e3.

[0092] В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза представляет собой никазу, то есть, эндонуклеазу, расщепляющую только одну цепь дуплекса и образующую разрыв. В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза расщепляет обе цепи дуплекса и образует двухцепочечный разрыв. Двухцепочечный разрыв может иметь тупые концы или концы, расположенные в шахматном порядке. Концы, расположенные в шахматном порядке, могут иметь выступающий 3'-конец или выступающий 5'-конец. 5'-конец может иметь 5'-фосфорильную или 5'-гидроксильную группу, тогда как 3'-конец может содержать 3'-фосфорильную или 3'-гидроксильную группу.

[0093] Нуклеазы CRISPR не расщепляют фиксированную последовательность, а вместо этого регулируются руководящей нуклеиновой кислотой, как описано выше. Помимо руководящей РНК, нуклеазы CRISPR распознают дополнительную последовательность, называемую мотивом, смежным с протоспейсером (РАМ). В некоторых вариантах осуществления изобретения, субстрат согласно изобретению содержит мотив, смежный с протоспейсером (РАМ). В вариантах осуществления изобретения, если тестируемая эндонуклеаза представляет собой эндонуклеазу CRISPR класса I (CASCADE), то субстрат включает мотив, смежный с протоспейсером (РАМ) и состоящий из последовательности, выбранной из 5'-AAG-3', 5'-AGG-3', 5'-ATG-3', 5'-GAG-3', 5'-CAG-3', 5'-GTG-3', 5'-TAA-3', 5'-TGG-3', 5'-AAA-3', 5'-AAC-3', 5'-AAT-3', 5'-ATA-3', 5'-TAG-3' и 5'-TTG-3'. В тех вариантах осуществления изобретения, где тестируемая эндонуклеаза представляет собой эндонуклеазу CRISPR класса II, субстрат включает мотив, смежный с протоспейсером (РАМ) и состоящий из последовательности, выбранной из 5'-NGG-3', 5'-NGGNG-3', 5' -NNAAAAW-3', 5'-NNNNGATT-3', 5'-GNNNCNNA-3' и 5'-NNNACA-3', 5 '-TTN-3', 5 '-TTTN-3' и 5'-TTTV-3'.

[0094] Нуклеазы CRISPR не расщепляют фиксированную последовательность распознавания, а вместо этого регулируются руководящей нуклеиновой кислотой, называемой «руководящей РНК», а также называемой здесь «нуклеиновой кислотой, нацеленной на другую нуклеиновую кислоту (NATNA)». Руководящая РНК (NATNA) содержит «спейсерную» последовательность, комплементарную сайту расщепления эндонуклеазой. В тех вариантах осуществления изобретения, где тестируемая эндонуклеаза представляет собой эндонуклеазу CRISPR, субстрат включает последовательность-мишень, способную гибридизоваться с частью («спейсером») в NATNA.

[0095] В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза представляет собой эндонуклеазу, регулируемую нуклеиновой кислотой. Реакционная смесь с такой эндонуклеазой дополнительно требует нуклеиновой кислоты, нацеленной на другую нуклеиновую кислоту (NATNA). В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза представляет собой эндонуклеазу CRISPR, a NATNA представляет собой руководящую РНК. Эндонуклеаза способна образовывать рибонуклеопротеиновый комплекс (RNP) с одной или более руководящими РНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза представляет собой эндонуклеазу CRISPR класса 2, типа II, a NATNA содержит tracr-PHK и cr-РНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза представляет собой эндонуклеазу CRISPR класса 2, типа V, a NATNA содержит cr-РНК.

[0096] В некоторых вариантах осуществления изобретения, NATNA выбрана из вариантов осуществления изобретения, описанных в патенте США №9260752. Вкратце, NATNA может содержать, в направлении от 5' до 3', удлинение спейсера, спейсер, минимальный повтор CRISPR, один руководящий соединитель, минимальную tracr-PHK, 3 '-последовательность tracr-PHK и удлинение tracr-PHK. В некоторых случаях, нуклеиновая кислота, нацеленная на другую нуклеиновую кислоту, может содержать удлинение tracr-PHK, 3 '-последовательность tracr-PHK, минимальную tracr-PHK, одноцепочечный руководящий соединитель, минимальный повтор CRISPR, спейсер и удлинение спейсера в любом порядке.

[0097] В некоторых вариантах осуществления изобретения, нуклеиновая кислота, нацеленная на руководящую нуклеиновую кислоту, может содержать одну руководящую NATNA. NATNA содержит спейсерную последовательность, которую можно сконструировать для гибридизации с последовательностью нуклеиновой кислоты-мишеи. NATNA дополнительно содержит повтор CRISPR, содержащий последовательность, которая может гибридизоваться с последовательностью tracr-PHK. Необязательно, NATNA может иметь удлинение спейсера и удлинение tracr-PHK. Эти элементы могут включать элементы, которые могут повышать стабильность NATNA. Повтор CRISPR и последовательность tracr-PHK могут взаимодействовать друг с другом с образованием двухцепочечной структуры из спаренных оснований. Такая структура может облегчать связывание эндонуклеазы с NATNA.

[0098] В некоторых вариантах осуществления изобретения, одноцепочечная руководящая NATNA содержит спейсерную последовательность, расположенную у 5' от первого дуплекса, который содержит область гибридизации между минимальным повтором CRISPR и минимальной последовательностью tracr-PHK. Первый дуплекс может прерываться «узлом». Такой «узел» облегчает рекрутинг эндонуклеазы к NATNA. За узлом может следовать первый стебель, содержащий линкер, соединяющий минимальный повтор CRISPR и минимальную последовательность tracr-PHK. Последний парный нуклеотид на 3'-конце первого дуплекса может быть связан со вторым линкером, соединяющим первый дуплекс со средней tracr-PHK. Средняя tracr-PHK может содержать одну или более дополнительных шпилек.

[0099] В некоторых вариантах осуществления изобретения, NATNA может содержать структуру двухцепочечной руководящей нуклеиновой кислоты. Двухцепочечная руководящая NATNA включает удлинение спейсера, спейсер, минимальный повтор CRISPR, минимальную последовательность tracr-PHK, 3'-последовательность tracr-PHK и удлинение tracr-PHK. Двухцепочечная руководящая NATNA не включает одноцепочечный руководящий соединитель. Вместо этого, минимальная последовательность повтора CRISPR содержит 3'-последовательность повтора CRISPR, минимальная последовательность tracr-PHK содержит 5'-последовательность tracr-PHK, а двухцепочечные руководящие NATNA могут гибридизоваться посредством минимального повтора CRISPR и минимальной последовательности tracr-PHK.

[00100] В некоторых вариантах осуществления изобретения, NATNA представляет собой сконструированную руководящую РНК, содержащую один или более остатков ДНК (гибридной RDNA CRISPR или chRDNA). В некоторых вариантах осуществления изобретения, NATNA выбрана из вариантов осуществления изобретения, описанных в патенте США №9650617. Вкратце, некоторые chRDNA для использования с системой CRISPR класса 2 могут состоять из двух цепей, образующих вторичную структуру, которая включает активирующую область, состоящую из верхней дуплексной области, нижней дуплексной области, узла, нацеливающей области, цепи и одной или более шпилек. Нуклеотидная последовательность, расположенная непосредственно за областью нацеливания, может содержать ДНК и РНК в различных соотношениях. Другая chRDNA может представлять собой одноцепочечную руководящую D(R)NA для использования с системой CRISPR типа II, содержащей область нацеливания и активирующую область, состоящую из нижней дуплексной области, верхней дуплексной области, области слияния, узла, цепи и одной или более шпилек. Нуклеотидная последовательность, расположенная непосредственно за областью нацеливания, может содержать ДНК и РНК в различных соотношениях. Например, область нацеливания может содержать ДНК или смесь ДНК и РНК, а активирующая область может содержать РНК или смесь ДНК и РНК.

[00101] В некоторых вариантах осуществления изобретения, руководящая РНК включает модификации нуклеиновой кислоты, например, модификации, сообщающие резистентность к рибонуклеазам. Эта особенность является особенно полезной при анализах сырого лизата, описанных ниже.

[00102] В некоторых вариантах осуществления изобретения, тестируемая эндонуклеаза представляет собой рестриктирующую эндонуклеазу. В некоторых вариантах осуществления изобретения, тестируемая эндонуклеаза представляет собой рестриктирующую эндонуклеазу типа II, III или IV. Для каждой эндонуклеазы, субстрат согласно изобретению содержит соответствующую последовательность распознавания. Для рестриктирующей эндонуклеазы типа IV, субстрат согласно изобретению также содержит один или более метилированных остатков, необходимых для расщепления эндонуклеазой.

[00103] В тех вариантах осуществления изобретения, где тестируемая эндонуклеаза представляет собой нуклеазу «цинковые пальцы» (ZFN) или ZFN, конъюгированную с доменом неспецифического расщепления рестриктирующей эндонуклеазы Fok I, последовательность-мишень имеет длину приблизительно 22-52 оснований и содержит пару последовательностей распознавания ZFN длиной 9-18 нуклеотидов каждая, разделенные спейсером длиной 4-18 нуклеотидов (см., например, Kim Y.G., et al., (1996). Hybrid resticrion enzymes: zinc finger fusions to Fok I cleavage domain, Proc Natl Acad Sci USA. 93(3): 1156-1160.

[00104] В тех вариантах осуществления изобретения, в которых тестируемая эндонуклеаза представляет собой эффекторную нуклеазу, подобную активатору транскрипции (TALEN), или гибрид TALEN-Fok I, последовательность-мишень имеет длину приблизительно 4 8-85 нуклеотидов и содержит пару последовательностей распознавания TALEN, каждая из которых состоит из 18-30 оснований, разделенных спейсером длиной 12-25 оснований [см., например. Christian М. et al., (2010) Targeting DNA double-strand breaks with TAL effector nucleases, Genetics. 186 (2): 757-61).

[00105] В некоторых вариантах осуществления изобретения, тестируемая эндонуклеаза представляет собой эндонуклеазу Argonaute (Ago). Эндонуклеазы Ago не имеют последовательности распознавания, но регулируются небольшими интерферирующими руководящими ДНК (киДНК) для расщепления комплементарной ДНК. Hegge, et al., (2019) DNA-guided DNA cleavage at moderate temperatures by Clostridium butyricum Argonaute, N.A. R. 47 (11):5809.

[00106] В некоторых вариантах осуществления изобретения, тестируемая эндонуклеаза представляет собой эндонуклеазу Arcus. Arcus представляет собой эндонуклеазу I-Crel с последовательностью-мишенью длиной 22 основания (см., например, Durrenberger et al., (1991) Double-strand break induced recombination in Chlamydomonas reinhardtii chloroplasts, N.A.R. 24 (17):3323.

[00107] В некоторых вариантах осуществления изобретения, тестируемая эндонуклеаза представляет собой эндорибонуклеазу, а субстрат содержит РНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения, субстрат представляет собой одноцепочечную РНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения, субстрат представляет собой двухцепочечную РНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения, субстрат представляет собой гибрид РНК-ДНК. Экзонуклеаза, используемая в таком анализе, представляет собой экзодезоксирибонуклеазу или экзорибонуклеазу для размещения выбранного субстрата. Примеры эндорибонуклеаз, расщепляющих один или более таких субстратов, включают РНКазу III, РНКазу А, РНКазу Т1, РНКазу А, РНКазу Н, РНКазу Z и РНКазу Р. Другими примерами эндорибонуклеаз являются эндорибонуклеазы CRISPR, выбранные из Casl3 и Cas7-11.

[00108] Примеры экзорибонуклеаз включают экзорибонуклезы, которые расщепляются в направлении 3'-5', такие как РНКаза R, РНКаза II, РНКаза D, РНКаза Т, РНКаза BN, РНКаза РН, и которые расщепляются в направлении 5'-3', такие как экзорибонуклеаза I, и экзорибонуклеаза II.

[00109] В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к способу обнаружения активности эндонуклеазы с использованием описанного здесь субстрата. Как показано на Фигуре 1, панель В, этот способ включает контактирование тестируемой эндонуклеазы с реакционной смесью, включающей субстрат двухцепочечной нуклеиновой кислоты, содержащий: донорный флуорофор и акцепторный флуорофор (или репортерный флуорофор и гасящий флуорофор), где флуорофоры образуют пару для переноса резонансной энергии флуоресценции (FRET), и последовательность распознавания тестируемой эндонуклеазы. Реакционную смесь инкубируют в условиях, подходящих для эндонуклеазного расщепления ее последовательности распознавания.

[00110] Этот способ дополнительно включает контактирование реакционной смеси с экзонуклеазой. Экзонуклеаза, субстрат и эндонуклеаза могут быть добавлены одновременно или последовательно в любом порядке.

[00111] Как показано на фигуре 1, панели В-С, структура субстрата двухцепочечной нуклеиновой кислоты такова, что экзонуклеаза не гидролизует субстрат двухцепочечной нуклеиновой кислоты до тех пор, пока не произойдет расщепление эндонуклеазой. Соответствующие концы субстрата двухцепочечной нуклеиновой кислоты содержат структуры, ингибирующие расщепление субстрата экзонуклеазой. Как описано в настоящей заявке, в зависимости от концов, генерируемых эндонуклеазой, экзонуклеаза представляет собой 3'-5'-экзонуклеазу, а 3'-конец субстрата защищен структурой, ингибирующей экзонуклеазу. В других вариантах осуществления изобретения, экзонуклеаза представляет собой 5'-3'-экзонуклеазу, а 5'-конец субстрата защищен структурой, ингибирующей экзонуклеазу. В некоторых вариантах осуществления изобретения используется смесь 3'-5'-экзонуклеазы и 5'-3'-экзонуклеазы. В таких вариантах осуществления изобретения, 3'-конец и 5'-конец субстрата защищены структурой, ингибирующей экзонуклеазу.

[00112] Как показано на фигуре 1, панель С, реакционную смесь затем инкубируют в условиях, подходящих для экзонуклеазного расщепления субстрата двухцепочечной нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления изобретения, условия эндонуклеазного расщепления и последующего экзонуклеазного расщепления являются одинаковыми. В таких вариантах осуществления изобретения не требуется каких-либо изменений в буферах или условиях инкубирования. В некоторых вариантах осуществления изобретения, между контактированием реакционной смеси с эндонуклеазой и контактированием реакционной смеси с экзонуклеазой, стадии очистки не проводят.

[00113] Одним из преимуществ этого метода является то, что он минимизирует фоновый сигнал, поскольку флуорофор и гаситель можно разместить очень близко друг от друга. Это также позволяет избежать любых стерических эффектов, которые могли бы возникнуть, если бы пара флуорофорных гасителей была встроена рядом с сайтом разрезания, например, когда флуорофор находился на одной стороне сайта разрезания, а гаситель - на другой.

[00114] В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза, тестируемая указанным способом, представляет собой эндонуклеазу, регулируемую нуклеиновой кислотой. В таких вариантах осуществления изобретения, в этом способе также используется NATNA. В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза представляет собой эндонуклеазу CRISPR, a NATNA представляет собой руководящую РНК.

[00115] В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза, тестируемая с помощью этого способа, представляет собой эндонуклеазу CRISPR класса I (CASCADE), причем, субстрат двухцепочечной нуклеиновой кислоты, используемый в этом способе, включает мотив, смежный с протоспейсером (РАМ) и состоящий из последовательности, выбранной из 5'-AAG-3', 5'-AGG-3', 5'-ATG-3', 5'-GAG-3', 5'-CAG-3', 5'-GTG-3', 5'-TAA-3', 5'-TGG-3', 5'-AAA-3', 5'-AAC-3', 5'-AAT-3', 5'-ATA-3', 5'-TAG-3' и 5'-TTG-3'. В тех вариантах осуществления изобретения, где эндонуклеаза, тестируемая данным способом, представляет собой эндонуклеазу CRISPR класса II, субстрат двухцепочечной нуклеиновой кислоты, используемый в этом способе, включает мотив, смежный с протоспейсером (РАМ) и состоящий из последовательности, выбранной из 5'-NGG-3', 5'-NGGNG-3', 5'-NNAAAAW-3', 5'-NNNNGATT-3', 5'-GNNNCNNA-3' и 5'-NNNACA-3', 5'-TTN-3', 5'-TTTN-3' и 5'-TTTV-3'.

[00116] В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза, тестируемая указанным способом, представляет собой одну из нуклеаз «цинковые пальцы» (ZFN), ZFN, конъюгированной с Fok I, эффекторной нуклеазы, подобной активатору транскрипции (TALEN), одноцепочечной эндонуклеазы Endo ТТ, эндонуклеазы Argonaute, эндонуклеазы Arcus, эндорибонуклеазы, выбранной из РНКазы III, РНКазы А, РНКазы Т1, РНКазы А, РНКазы Н, РНКазы Z и РНКазы Р, Cas3 и Cas7-11, и рестриктирующей эндонуклеазы. В этих вариантах осуществления изобретения, субстрат двухцепочечной нуклеиновой кислоты, используемый в этом способе, включает подходящий сайт распознавания.

[00117] В некоторых вариантах осуществления изобретения, способ включает скрининг, тестирование или сравнение нескольких эндонуклеаз. В этих вариантах осуществления изобретения, способ включает контактирование серии реакционных смесей, содержащих одни и те же ингредиенты, с серией различных эндонуклеаз. В некоторых вариантах осуществления изобретения, серия эндонуклеаз представляет собой серию эндонуклеаз, регулируемых нуклеиновыми кислотами, и реакционные смеси в серии реакционных смесей, содержащих одни и те же ингредиенты, также содержат одну и ту же NATNA. В некоторых вариантах осуществления изобретения, серия эндонуклеаз представляет собой серию эндонуклеаз CRISPR, и реакционные смеси в серии реакционных смесей, содержащих одни и те же ингредиенты, также содержат одну и ту же руководящую РНК.

[00118] В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза представляет собой эндонуклеазу, регулируемую нуклеиновой кислотой, а способ включает скрининг, тестирование или сравнение нескольких NATNA. В этих вариантах осуществления изобретения, способ включает контактирование серии реакционных смесей, содержащих одни и те же ингредиенты, включая одну и ту же эндонуклеазу, с серией различных NATNA. В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза представляет собой эндонуклеазу CRISPR, a NATNA представляет собой руководящую РНК. В этих вариантах осуществления изобретения, способ включает контактирование серии реакционных смесей, содержащих одни и те же ингредиенты, включая одну и ту же эндонуклеазу CRISPR, с серией различных руководящих РНК.

[00119] В некоторых вариантах осуществления изобретения, способ включает скрининг, тестирование или сравнение нескольких препаратов одной и той же эндонуклеазы. В этих вариантах осуществления изобретения, способ включает контактирование серии реакционных смесей, содержащих одни и те же ингредиенты, с серией различных препаратов одной и той же эндонуклеазы. Различные препараты могут представлять собой различные изоляты одной и той же эндонуклеазы. Различные препараты могут представлять собой элюированные аликвоты, полученные в результате проведения хроматографии, направленной на выделение эндонуклеазы. Настоящее изобретение включает способ мониторинга элюирования эндонуклеазы путем проведения анализа на активность эндонуклеазы, описанного в настоящей заявке, на фракциях элюирования, полученных в результате процедуры хроматографии, и сохранения фракций элюирования с наиболее высокой активностью эндонуклеазы.

[00120] В некоторых вариантах осуществления изобретения, способ включает скрининг, тестирование или сравнение нескольких последовательностей нуклеиновых кислот в целях идентификации предпочтительной или оптимальной последовательности-мишени для эндонуклеазы. В этих вариантах осуществления изобретения, способ включает контактирование серии реакционных смесей, содержащих одни и те же ингредиенты, включая одну и ту же эндонуклеазу, с серией субстратов двухцепочечной нуклеиновой кислоты, имеющих разные последовательности. В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза представляет собой эндонуклеазу CRISPR, и реакционные смеси в серии реакционных смесей, содержащих одни и те же ингредиенты, также содержат одну и ту же руководящую РНК.

[00121] В некоторых вариантах осуществления изобретения, способ включает скрининг, тестирование или сравнение нескольких условий реакции в целях определения предпочтительных или оптимальных условий реакции для эндонуклеазы. В некоторых вариантах осуществления изобретения, способ включает контактирование серии реакционных смесей, содержащих различные конфигурации буферов, с одной и той же эндонуклеазой. В некоторых вариантах осуществления изобретения, серию реакционных смесей также подвергают воздействию различных температурных профилей во время стадии расщепления эндонуклеазой.

[00122] В некоторых вариантах осуществления изобретения, способ включает скрининг, тестирование или сравнение нескольких условий реакции в целях идентификации предпочтительных или оптимальных концентраций эндонуклеазы в реакциях расщепления нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления изобретения, способ включает контактирование серии реакционных смесей, которые являются идентичными, но имеют разные концентрации одной и той же тестируемой эндонуклеазы.

[00123] В некоторых вариантах осуществления изобретения, способ включает скрининг, тестирование или сравнение нескольких полинуклеотидных руководящих CRISPR (руководящих РНК или рРНК) в целях идентификации предпочтительной или оптимальной рРНК для эндонуклеазы CRISPR. В этих вариантах осуществления изобретения, способ включает контактирование серии реакционных смесей, которые являются идентичными, но имеют разные руководящие РНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения, полинуклеотидная руководящая CRISPR содержит один или более остатков ДНК (гибридная RDNA CRISPR или chRDNA). В этих вариантах осуществления изобретения, способ включает контактирование серии реакционных смесей, которые являются идентичными, но имеют различные chRDNA.

[00124] Как показано на фигуре 1, панель D, этот способ также включает оценку флуоресценции, испускаемой реакционной смесью, где изменение флуоресценции указывает на активность эндонуклеазы. Изменение флуоресценции включает изменение цвета (длины волны) флуоресцентного сигнала, а также появление флуоресценции там, где флуоресценция ранее не обнаруживалась. В некоторых вариантах осуществления изобретения, оценка является качественной и указывает на наличие или отсутствие эндонуклеазной активности. В других вариантах осуществления изобретения, оценка является количественной и указывает на относительное количество эндонуклеазной активности. В некоторых вариантах осуществления изобретения, изменение флуоресценции дополнительно включает изменение интенсивности флуоресценции и различия в интенсивности флуоресценции между тестируемыми образцами.

[00125] В некоторых вариантах осуществления изобретения, описанный здесь способ осуществляют с использованием выделенных субстратов нуклеиновых кислот и выделенных полипептидов (например, эндонуклеазы и экзонуклеазы). В других вариантах осуществления изобретения, анализ осуществляют с неочищенными смесями без проведения стадий очистки. В некоторых вариантах осуществления изобретения, выделенный или очищенный субстрат нуклеиновой кислоты добавляют к неочищенным изолятам или к образовавшимся фракциям эндонуклеазы, например, для быстрой оценки процесса продуцирования или очистки эндонуклеазы. В некоторых вариантах осуществления изобретения, выделенные или очищенные полипептиды (например, эндонуклеазу и экзонуклеазу) добавляют к неочищенным изолятам нуклеиновых кислот, например, к минимально обработанным образцам, взятым у пациентов, в целях быстрого обнаружения присутствия инфекционного агента у пациента.

[00126] В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к субстрату двухцепочечной нуклеиновой кислоты и к способу получения субстрата. Субстрат имеет экзонуклеазную защиту на конце, такую как, например, фосфоротиоатные связи. 1, 2, 3, 4 или приблизительно 5 фосфодиэфирных связей могут быть заменены фосфортиоатными связями. Например, если используется экзонуклеаза III, то фосфодиэфирные связи могут быть заменены фосфортиоатными связями на 3'-концах обеих цепей. Необязательно, концевой фосфатный фрагмент (если он присутствует) на 3'-конце каждой цепи можно заменить фосфортиоатом.

[00127] Субстрат также имеет флуорофор (репортер) и гаситель. Репортер и гаситель могут быть расположены возле одного конца одной цепи субстрата двухцепочечной нуклеиновой кислоты. Один из флуорофоров и гасителей могут быть присоединены к концу одной цепи. Например, если используется экзонуклеаза III, то один член пары флуорофор-гаситель может быть присоединен к 5'-концу цепи-мишени, в то время как этот член может быть присоединен к нуклеотиду длиной 1, 2, 3, 4 или приблизительно 5 нуклеотидов далеко от этого конца. Например, одна цепь может содержать связанный с тимином флуоресцеин в положении 3-го нуклеотида от 5'-конца и гаситель Iowa Black® на 5'-конце.

[00128] В некоторых вариантах осуществления изобретения, тестируемая эндонуклеаза распознает последовательность на обеих цепях (например, палиндромную последовательность, распознаваемую рестриктирующими эндонуклеазами типа II). В некоторых вариантах осуществления изобретения, тестируемая эндонуклеаза распознает последовательность на одной цепи (например, последовательность-мишень для эндонуклеазы CRISPR Cas). В таких вариантах осуществления изобретения, нуклеиновая кислота-мишень имеет цепь-мишень и нецелевую цепь. Типичный субстрат для CRISPR Cas12a показан на фигуре 7. Цепь-мишень субстрата включает последовательность, нацеливаемую на тестируемую эндонуклеазу. Например, расщепляемый сайт Cas12a (Cpfl) описан в публикации Zetsche, В., et al., (2015) Cpfl is a single-RNA guided endonuclease of a Class II CRISPR-Cas system, Cell, 163:P759. Как показано на фигуре 7, субстрат дополнительно включает спейсерную последовательность, распознаваемую руководящими нуклеиновыми кислотами CRISPR, флуорофор, гаситель и защиту конца экзонуклеазы, такую как фосфоротиоатные нуклеотиды на концах каждой цепи или поблизости от них.

[00129] В некоторых вариантах осуществления изобретения, флуорофор помещают на цепь-мишень. В некоторых вариантах осуществления изобретения, флуорофор помещают на нецелевую цепь. В некоторых вариантах осуществления изобретения, флуорофор помещают как на цепь-мишень, так и на нецелевую цепь. На фигуре 10 проиллюстрирован субстрат, показанный на фигуре 7, с альтернативным размещением флуорофора. На фигуре 10, светлые и темные блоки на верхней цепи представляют собой последовательность распознавания (мишень) для эндонуклеаз CRISPR (светлый блок - РАМ, темный блок - спейсер). Флуорофоры представлены в виде звездочек, а гасители - в виде темных полумесяцев. Темные восьмиугольники представляют модификации, ингибирующие экзонуклеазу, такие как фосфортиоатные нуклеотиды.

[00130] В некоторых вариантах осуществления изобретения, размещение флуорофора влияет на эффективность анализа (см. Пример 11 и фигуры 11, 12 и 13).

[00131] Субстрат двухцепочечной нуклеиновой кислоты может быть получен путем объединения двух цепей (цепи-мишени и комплементарной нецелевой цепи) в реакционной смеси, содержащей подходящий буфер (например, ТЕ). Для оптимального отжига, смесь можно нагреть до >90°С и дать ей остыть до комнатной температуры.

[00132] В некоторых вариантах осуществления изобретения, эффективность экзонуклеазной защиты тестируют для каждой экзонуклеазы, предназначенной для использования в эндонуклеазной анализе, раскрытом в настоящей заявке. Для каждого субстрата двухцепочечной нуклеиновой кислоты, описанного ы нвстоящей заявке, получают контрольный субстрат двухцепочечной нуклеиновой кислоты, лишенный экзонуклеазной защиты. Оба субстрата подвергают воздействию экзонуклеазы в подходящем буфере и в подходящих условиях реакции как для активности экзонуклеазы, так и для флуоресценции (например, в NE-буфере 1, рН 7,0 для экзонуклеазы III и флуоресцеина) и флуоресценцию оценивают, например, с помощью флуоресцентного ридера. Если экзонуклеазная защита является подходящей для экзонуклеазы, то флуоресцентный сигнал будет генерироваться для незащищенного субстрата, но не для защищенного субстрата.

[00133] В некоторых вариантах осуществления изобретения, субстрат двухцепочечной нуклеиновой кислоты, описанный в нвстоящей заявке, используют для обнаружения эндонуклеазной активности. Субстрат имеет экзонуклеазную защиту, флуорофор и гаситель (например, 1, 2, 3, 4 или приблизительно 5 фосфортиоатных связей на 3'-концах обеих цепей и связанный с тимином флуоресцеин в 3-м положении нуклеотида от 5-го конца и гаситель Iowa Black® на 5'-конце цепи-мишени). Субстрат подвергают контактированию с экзонуклеазой и эндонуклеазой в подходящем буфере и в подходящих условиях реакции для экзонуклеазной активности, эндонуклеазной активности и флуоресценции (например, в NE-буфере 1, рН 7,0 для экзонуклеазы III, AsCas12a и флуоресцеина. Рекомендации по выбору подходящего буфера можно найти в описании руководства, имеющегося у дистрибьюторов эндонуклеаз (например, в публикации New England Biolabs для рестриктирующих эндонуклеаз) или в опубликованных исследованиях, например, в публикации Gasiunas, G., et al., (2020) A catalogue of biochemically diverse CRISPR-Cas9 orthologSf Nature Comm. 11, Article number: 5512 doi:10.103 8/s41467-020-193 44-1.

[00134] Если эндонуклеаза представляет собой эндонуклеазу, регулируемую нуклеиновой кислотой, то собирают нуклеопротеиновый комплекс (например, рибонуклеопротеиновый комплекс, RNP), и эндонуклеазу добавляют к реакционной смеси в форме нуклеопротеинового комплекса. Нуклеопротеиновый комплекс включает эндонуклеазу и нуклеиновую кислоту, нацеленную на другую нуклеиновую кислоту (NATNA), например, руководящую РНК CRISPR (cr-РНК), такую как cr-РНК для Cas12a (Cpfl), подходящие последовательности которых можно найти, например, в публикации Yamano Т., et al., (2016) Crystal structure of Cpf1 In complex with guide RNA and target DNA., Cell 165:P94 9. Для сборки нуклеопротеинового комплекса, NATNTA инкубируют с эндонуклеазой при подходящих условиях, например, при 37°С, в течение 10 минут.NATNTA можно предварительно обработать, чтобы обеспечить правильное формирование вторичной структуры, путем нагревания (например, до 95°С в течение 2 минут), а затем оставить его для медленного охлаждения до комнатной температуры.

[00135] Затем оценивают флуоресценцию реакционной смеси. Для субстратов, защищенных экзонуклеазой, флуоресцентный сигнал генерируется только тогда, когда присутствуют как экзонуклеаза, так и эндонуклеаза.

[00136] В некоторых вариантах осуществления изобретения, линейный диапазон анализа в отношении концентрации эндонуклеазы и концентрации субстрата нуклеиновой кислоты тестируют для определения оптимального диапазона концентрации субстрата и чувствительности в отношении концентрации эндонуклеазы.

[00137] В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к композиции для обнаружения активности эндонуклеазы. Композиция включает субстрат нуклеиновой кислоты, описанный ы нвстоящей заявке и дополнительно содержащий 3'-5'-экзонуклеазу (или 5'-3-экзонуклеазу, или обе эти экзонуклеазы), ингибируемую структурами на 3'-концах (или 5'-концах, или обоих концах) субстрата. Композиция содержит субстрат двухцепочечной нуклеиновой кислоты, содержащий: донорный флуорофор и акцепторный флуорофор (или репортерный флуорофор и флуорофор-гаситель), где указанные флуорофоры образуют пару для переноса резонансноой энергии флуоресценции (FRET); структуру на каждом конце, ингибирующую расщепление субстрата экзонуклеазой; и последовательность распознавания тестируемой эндонуклеазы.

[00138] Композиция также может содержать экзонуклеазу. В зависимости от концов, генерируемых эндонуклеазой, композиция содержит 3'-5'-экзонуклеазу или 5'-3'-экзонуклеазу или смесь обеих этих экзонуклеаз. В некоторых вариантах осуществления изобретения, сигнал усиливается за счет наличия более, чем одного флуорофора на субстрат.В некоторых вариантах осуществления изобретения, конкретные свойства тестируемой эндонуклеазы неизвестны. В таких вариантах осуществления изобретения, оба конца обеих цепей помечены с учетом всех возможных ориентаций и химических процессов расщепления нуклеиновой кислоты. В некоторых таких вариантах осуществления изобретения, концы помечены разными флуорофорами, излучающими на разных длинах волн. Длина волны излучения указывает на идентичность расщепленной цепи и химический процесс расщепления. Для 3'-5'-экзонуклеазы, субстрат двухцепочечной нуклеиновой кислоты имеет структуру на каждом 3'-конце, ингибирующую расщепление субстрата экзонуклеазой. Для 5'-3'-экзонуклеазы, субстрат двухцепочечной нуклеиновой кислоты имеет структуру на каждом 5'-конце, ингибирующую расщепление субстрата экзонуклеазой. В некоторых вариантах осуществления изобретения используется смесь 3'-5'-экзонуклеазы и 5'-3'-экзонуклеазы. В таких вариантах осуществления изобретения, как 3'-конец, так и 5'-конец субстрата защищены структурой, ингибирующей экзонуклеазу.

[00139] В некоторых вариантах осуществления изобретения, субстрат предназначен для размещения нескольких типов эндонуклеаз, включая эндонуклеазы, биохимические свойства которых не полностью известны на момент тестирования. Такой субстрат будет иметь пару флуорофора и гасителя, расположенную на обоих концах обеих цепей или рядом с ними. Такой дважды меченный субстрат может быть использован в реакционной смеси, содержащей экзонуклеазу, способную гидролизоваться в обоих направлениях (например, экзонуклеазу V или экзонуклеазу VII).

[00140] В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза, тестируемая с помощью композиции, представляет собой эндонуклеазу, регулируемую нуклеиновой кислотой. В таких вариантах осуществления изобретения, в композиции также присутствует NATNA. В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза представляет собой эндонуклеазу CRISPR, a NATNA представляет собой руководящую РНК.

[00141] В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза, тестируемая с помощью композиции, представляет собой эндонуклеазу CRISPR класса I (CASCADE), где субстрат двухцепочечной нуклеиновой кислоты в композиции включает мотив, смежный с протоспейсером (РАМ) и состоящий из последовательности, выбранной из 5'-AAG-3', 5'-AGG-3', 5'-ATG-3', 5'-GAG-3', 5'-CAG-3', 5'-GTG-3', 5'-TAA-3', 5'-TGG-3', 5'-AAA-3', 5'-AAC-3', 5'-AAT-3', 5'-ATA-3', 5'-TAG-3', и 5'-TTG-3'. В тех вариантах осуществления изобретения, где эндонуклеаза, тестируемая с помощью композиции, представляет собой эндонуклеазу CRISPR класса II, субстрат двухцепочечной нуклеиновой кислоты в композиции включает мотив, смежный с протоспейсером (РАМ) и состоящий из последовательности, выбранной из 5'-NGG-3', 5'-NGGNG-3', 5'-NNAAAAW-3', 5'-NNNNGATT-3', 5'-GNNNCNNA-3' и 5'-NNNACA-3', 5'-TTN-3', 5'-TTTN-3' и 5'-TTTV-3'.

[00142] В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза, тестируемая с помощью композиции, представляет собой одну из нуклеазы «цинковые пальцы» (ZFN), ZFN, конъюгированной с Fok I, эффекторной нуклеазы, подобной активатору транскрипции (TALEN), одноцепочечной эндонуклеазы Endo ТТ, эндонуклеазы Argonaute, эндонуклеазы Arcus, эндорибонуклеазы, выбранной из РНКазы III, РНКазы А, РНКазы Т1, РНКазы А, РНКазы Н, РНКазы Z и РНКазы Р, Cas3 и Cas7-11, и рестриктирующей эндонуклеазы. В этих вариантах осуществления изобретения, субстрат двухцепочечной нуклеиновой кислоты в композиции включает подходящий сайт распознавания.

[00143] В некоторых вариантах осуществления изобретения, композиция содержит экзонуклеазу III, субстрат двухцепочечной нуклеиновой кислоты, включающий (i) оба 3'-конца, содержащие одну или более дцДНК, защищенных фосфоротиоатом; (ii) репортерный флуорофор и (iii) совместимый гаситель флуоресценции, расположенный так, чтобы гасить донорскую флуоресценцию, если субстрат двухцепочечной нуклеиновой кислоты является интактным, и представляющую интерес эндонуклеазу.

[00144] В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к способу, подходящему для его применения в качестве удобного инструмента для оценки, скрининга, тестирования или сравнения нескольких эндонуклеаз. Этот инструмент дополнительно позволяет оценить набор условий эндонуклеазного расщепления, что позволяет определить, какое из условий обеспечивает самый высокий уровень или скорость эндонуклеазной активности. Такой инструмент также позволяет оценить методы выделения и очистки эндонуклеазы. В частности, этот инструмент можно применять для сравнения фракций выделения белка, чтобы идентифицировать фракцию, содержащую выделенный белок. В таких вариантах осуществления изобретения, модификацию вводят для того, чтобы гарантировать, что все компоненты, например, эндонуклеаза, экзонуклеаза, NATNA (если она используется) будут обладать активностью и будут по меньшей мере частично защищены от ферментативного расщепления в неочищенном препарате. Такой инструмент можно быстро применять к вновь образованным фракциям, например, для мониторинга процесса очистки белка. Более того, этот инструмент может быть применен для скрининга множества субстратов эндонуклеазы, имеющих разные последовательности, чтобы быстро идентифицировать последовательность-мишень эндонуклеазы.

[00145] Способы и композиции, раскрытые в настоящей заявке, могут быть применены в диагностическом анализе. В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к способу обнаружения присутствия конкретной нуклеиновой кислоты в образце, где нуклеиновая кислота содержит последовательность распознавания эндонуклеазы. В некоторых вариантах осуществления изобретения, образец представляет собой образец, взятый у пациента. Нуклеиновая кислота может быть характерна для микроорганизма, включая вирус или бактерию. Нуклеиновая кислота также может содержать полиморфизм или последовательность, наличие которой связано с заболеванием или состоянием, которое может быть обнаружено у пациента.

[00146] Этот способ включает манипуляцию с нуклеиновыми кислотами, выделенными из образца. В некоторых вариантах осуществления изобретения, образец получают у индивидуума или пациента. В некоторых вариантах осуществления изобретения, образец может содержать фрагмент твердой ткани или солидной опухоли, полученный от индивидуума или пациента, например, путем биопсии. Образец может также включать физиологические жидкости, которые могут содержать нуклеиновые кислоты (например, мочу, мокроту, сыворотку, кровь или фракции крови, то есть, плазму, лимфу, слюну, мокроту, пот, слезу, спинномозговую жидкость, амниотическую жидкость, синовиальную жидкость, перикардиальную жидкость, перитонеальную жидкость, плевральную жидкость, кистозную жидкость, желчь, желудочный сок, кишечную жидкость или образцы кала). В других вариантах осуществления изобретения, образец представляет собой культивированный образец, например, культуру ткани, содержащую клетки и жидкости, из которых можно выделить нуклеиновые кислоты. В некоторых вариантах осуществления изобретения, представляющие интерес нуклеиновые кислоты, присутствующие или предположительно присутствующие в образце, происходят от инфекционных агентов, таких как вирусы, бактерии, простейшие или грибы.

[00147] В некоторых вариантах осуществления изобретения, способ включает процедуру предварительной амплификации, при которой нуклеиновую кислоту в образце амплифицируют посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР), в результате которой из каждой нуклеиновой кислоты-мишени генерируется специфический ампликон. В некоторых вариантах осуществления изобретения, флуорофор, гаситель и концевая защита встраиваются в ампликон путем лигирования адаптеров. Формирование тупых концов, А-хвоста и лигирование адаптера можно осуществлять с помощью разработанных методов, например, в сочетании с формированием библиотеки последовательностей для массового параллельного секвенирования. В некоторых вариантах осуществления изобретения, флуорофор, гаситель и концевая защита включены непосредственно в праймеры для амплификации. Избыточные праймеры или адаптеры, содержащие флуорофор, гаситель и концевую защиту, можно удалить с помощью процедуры очистки перед проведением эндонуклеазного анализа. Ампликон, включающий флуорофор, гаситель и концевую защиту, представляет собой субстрат двухцепочечной нуклеиновой кислоты, используемый непосредственно в способе, раскрытом в нвстоящей заявке.

[00148] В некоторых вариантах осуществления изобретения, субстрат эндонуклеазы, который представляет собой зонд, содержащий флуорофор, гаситель и концевую защиту, гибридизуют с нуклеиновой кислотой-мишенью или ампликоном нуклеиновой кислоты-мишени в образце. В некоторых вариантах осуществления изобретения, зонд, нуклеиновая кислота-мишень или ампликон являются одноцепочечными. В некоторых вариантах осуществления изобретения, зонд, нуклеиновая кислота-мишень или ампликон являются двухцепочечными, но перед гибридизацией с зондом становятся одноцепочечными. Дуплекс, образованный нуклеиновой кислотой=мишенью, гибридизованной с зондом, включающим флуорофор, гаситель и концевую защиту, становится субстратом двухцепочечной нуклеиновой кислоты, используемым непосредственно в способе, раскрытом в настоящей заявке.

[00149] Субстрат нуклеиновой кислоты, полученный любым из альтернативных способов, описанных выше, содержит диагностически значимую последовательность нуклеиновой кислоты, подлежащую анализу. В некоторых вариантах осуществления изобретения, субстрат нуклеиновой кислоты подвергают контактированию с эндонуклеазой, нацеленной на представляющую интерес последовательность, например, последовательность, характерную для микроорганизма, или последовательность, содержащую полиморфизм, или последовательность, присутствие которой связано с заболеванием или состоянием, которое может быть обнаружено у пациента. Эндонуклеаза осуществляет расщепление только в том случае, если представляющая интерес последовательность, содержащая сайт расщепления эндонуклеазой, присутствует в субстрате нуклеиновой кислоты.

[00150] В описанном здесь диагностическом анализе, особенно выгодными являются эндонуклеазы CRISPR. Руководящая РНК для эндонуклеазы CRISPR (например, cr-РНК) может быть создана для гибридизации с любой представляющей интерес диагностической последовательностью. Образец подвергают контактированию с зондом, содержащим флуорофор, гаситель и концевую защиту и способным гибридизоваться с нуклеиновой кислотой-мишенью, представляющей диагностический интерес. Затем, образец подвергают контактированию с руководящей РНК, способной гибридизоваться с нуклеиновой кислотой-мишенью. Эндонуклеаза CRSIPR осуществляет расщепление, а флуоресценция становится обнаруживаемой только в том случае, если в образце присутствует последовательность, способная гибридизоваться с зондом, и сконструированная руководящая РНК.

[00151] В некоторых вариантах осуществления изобретения, диагностический метод является мультиплексным, то есть, в одной и той же реакционной смеси обнаруживают несколько последовательностей-мишеней. В таких вариантах осуществления изобретения, к образцу добавляют несколько зондов нуклеиновой кислоты. В тех вариантах осуществления изобретения, где эндонуклеаза представляет собой эндонуклеазу CRISPR, к образцу также добавляют несколько руководящих РНК, и одна и та же эндонуклеаза CRISPR выполняет расщепление, приводящее к продуцированию детектируемого сигнала. В некоторых вариантах осуществления изобретения, каждый из различных зондов помечен различными флуорофорами. В некоторых вариантах осуществления изобретения, все или некоторые из различных зондов помечены одной и той же меткой, например, одной меткой для набора зондов, гибридизующихся с бактериальными последовательностями, и другой меткой для набора зондов, гибридизующихся с вирусными последовательностями, или одной меткой для набора зондов, гибридизующихся с последовательностями грамположительных бактерий, и еще одной меткой для набора зондов, гибридизующихся с последовательностями грамотрицательных бактерий.

[00152] Эндонуклеаза и экзонуклеаза могут быть добавлены в образец последовательно или одновременно. Эндонуклеаза и экзонуклеаза могут быть добавлены к образцу до добавления субстрата двухцепочечной нуклеиновой кислоты. Экзонуклеаза выполняет расщепление цепи (гидролиз) только в том случае, если эндонуклеаза ранее выполнила расщепление, создавая, таким образом, конец, доступный для экзонуклеазы. бидролиз субстрата двухцепочечной нуклеиновой кислоты экзонуклеазой разделяет флуорофор и гаситель, что приводит к обнаружению флуоресцентного сигнала. Наличие флуоресцентного сигнала указывало на наличие представляющей интерес последовательности в образце. В некоторых вариантах осуществления изобретения, анализ включает стадию сообщения о том, что представляющая интерес последовательность (например, последовательность, характерная для микроорганизма или полиморфизма, или последовательность, присутствие которой связано с заболеванием или состоянием, которое может быть обнаружено у пациента) присутствует в образце.

[00153] В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к набору для обнаружения активности эндонуклеазы. Этот набор включает аликвоту субстрата нуклеиновой кислоты, описанного в настоящей заявке. Композиция содержит субстрат двухцепочечной нуклеиновой кислоты, содержащий: донорный флуорофор и акцепторный флуорофор (или репортерный флуорофор и флуорофор-гаситель), где указанные флуорофоры образуют пару для переноса резонансной энергии флуоресценции (FRET); структуру на каждом конце, ингибирующую расщепление субстрата экзонуклеазой; и последовательность распознавания тестируемой эндонуклеазы.

[00154] Набор может дополнительно содержать аликвоту экзонуклеазы. В зависимости от концов, генерируемых эндонуклеазой, набор включает 3'-5'-экзонуклеазу или 5'-3'-экзонуклеазу. Для 3'-5'-экзонуклеазы, субстрат двухцепочечной нуклеиновой кислоты имеет структуру на каждом 3'-конце, ингибирующую расщепление субстрата экзонуклеазой. Для 5'-3'-экзонуклеазы, субстрат двухцепочечной нуклеиновой кислоты имеет структуру на каждом 5'-конце, ингибирующую расщепление субстрата экзонуклеазой. Набор может содержать как 3'-5'-экзонуклеазу, так и 5'-3'-экзонуклеазу. Набор может содержать субстрат двухцепочечной нуклеиновой кислоты, который имеет структуры как на 3'-концах, так и на 5'-концах, ингибирующие расщепление субстрата экзонуклеазой.

[00155] В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза, тестируемая с помощью набора, представляет собой эндонуклеазу, регулируемую нуклеиновой кислотой. В таких вариантах осуществления изобретения, набор может также включать аликвоту NATNA. В некоторых вариантах осуществления изобретения, тестируемая эндонуклеаза представляет собой эндонуклеазу CRISPR, a NATNA, присутствующая в наборе, представляет собой руководящую РНК.

[00156] В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза, подлежащая тестированию с помощью набора, представляет собой эндонуклеазу CRISPR класса I (CASCADE), а субстрат двухцепочечной нуклеиновой кислоты, включенный в набор, включает мотив, смежный с протоспейсером (РАМ) и состоящий из последовательности, выбранной из 5'-AAG-3', 5'-AGG-3', 5'-ATG-3', 5'-GAG-3', 5'-CAG-3', 5'-GTG-3', 5'-TAA-3', 5'-TGG-3', 5'-AAA-3', 5'-AAC-3', 5'-AAT-3', 5'-ATA-3', 5'-TAG-3' и 5'-TTG-3'. В тех вариантах осуществления изобретения, где эндонуклеаза, подлежащая тестированию с помощью набора, представляет собой эндонуклеазу CRISPR класса II, субстрат двухцепочечной нуклеиновой кислоты, включенный в набор, содержит мотив, смежный с протоспейсером (РАМ) и состоящий из последовательности, выбранной из 5'-NGG-3', 5'-NGGNG-3', 5'-NNAAAAW-3', 5'-NNNNGATT-3', 5'-GNNNCNNA-3' и 5'-NNNACA-3', 5'-TTN-3', 5'-TTTN-3' и 5'-TTTV-3'.

[00157] В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза, подлежащая тестированию с помощью набора, представляет собой одну из нуклеазы «цинковые пальцы» (ZFN), ZFN, конъюгированной с Fok I, эффекторной нуклеазы, подобной активатору транскрипции (TALEN), одноцепочечной эндонуклеазы Endo ТТ, эндонуклеазы Argonaute, эндонуклеазы Arcus, эндорибонуклеазы, выбранной из РНКазы III, РНКазы А, РНКазы Т1, РНКазы А, РНКазы Н, РНКазы Z и РНКазы Р, Cas3 и Cas7-11, и рестриктирующей эндонуклеазы. В этих вариантах осуществления изобретения, субстрат нуклеиновой кислоты, включенный в набор, содержит подходящий сайт распознавания.

[00158] В некоторых вариантах осуществления изобретения, набор дополнительно содержит инструкции по выполнению метода тестирования активности эндонуклеазы способом, описанным в настоящей заявке.

[00159] В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к набору для проведения диагностической процедуры. Этот набор включает аликвоту зонда, способного гибридизоваться с нуклеиновой кислотой-мишенью, представляющей диагностический интерес, и содержащего донорный флуорофор и акцепторный флуорофор (или репортерный флуорофор и флуорофор-гаситель), где указанные флуорофоры образуют пару для переноса резонансной энергии флуоресценции (FRET); структуру на каждом конце, ингибирующую расщепление субстрата экзонуклеазой; и последовательность распознавания тестируемой эндонуклеазы. Набор может дополнительно содержать аликвоту экзонуклеазы и эндонуклеазы. Экзонуклеаза способна ингибироваться ингибирующими структурами, присутствующими на зонде. Эндонуклеаза способна связывать и расщеплять дуплекс, образованный зондом и последовательностью-мишенью. В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндонуклеаза представляет собой эндонуклеазу, регулируемую нуклеиновой кислотой. В таких вариантах осуществления изобретения, набор может также включать аликвоту NATNA, способную гибридизоваться с нуклеиновой кислотой-мишенью. В некоторых вариантах осуществления изобретения, тестируемая эндонуклеаза представляет собой эндонуклеазу CRISPR, a NATNA, присутствующая в наборе, представляет собой руководящую РНК.

[00160] В некоторых вариантах осуществления изобретения, набор дополнительно содержит инструкции по проведению диагностического анализа, описанного в нвстоящей заявке.

[00161] Раскрытый здесь способ может быть реализован с помощью специализированного устройства. В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к устройству для обнаружения активности эндонуклеазы, содержащему одну или более реакционных камер для проведения ферментативных реакций, и детектор флуоресценции. Это устройство может дополнительно содержать средства для доставки и дозирования компонентов описанных здесь реакционных смесей. Это устройство может быть адаптировано для высокопроизводительного скрининга, например, в многолуночных планшетах (в микролуночных планшетах).

[00162] Устройство может включать флуоресцентный считыватель многолуночных планшетов или пробирочный флуориметр, такой как устрайства, которые поставляются от Тесап, ThermoFisher Scientific (инструменты BioTek) и Molecular Devices.

Примеры

[00163] Пример 1. Получение субстрата двухцепочечной эндонуклеазы

[00164] В этом примере была получена конструкция двухцепочечной нуклеиновой кислоты из 60 пар оснований, в которой 3'-концы обеих цепей были защищены серией фосфортиоатных связей, а одна цепь была помечена флуорофором и гасителем. Последние четыре фосфодиэфирные связи на 3'-концах обеих цепей были заменены фосфортиоатной связью. Концевой фосфатный фрагмент на 3'-конце каждой цепи также был заменен фосфортиоатом. Кроме того, цепь-мишень содержала связанный с тимином фрагмент флуоресцеина, включенный в 3-е нуклеотидное положение от 5'-конца, а гаситель Iowa Black® был присоединен к 5'-концу той же цепи. дцДНК-мишень включала хорошо охарактеризованную моделированную нацеливаемую последовательность AsCas12a, которая включает сайт расщепления фермента Cas12a (AsCas12a) Acidaminococcus sp.Расщепление происходит на расстоянии 19-28 п. о. от первого тимина мотива, смежного с протоспейсерном ТТТС (РАМ), который, в свою очередь, расположен в положении 16 от 5'-конца субстрата, а конечный нуклеотид спейсерной последовательности расположен в положении 39 с 5'-конца субстрата. Была получена вторая мишень дцДНК, которая была идентична первой, за исключением того, что у нее отсутствовала какая-либо концевая защита. Олигонуклеотиды с модификациями были заказаны у компании Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa).

[00165] Двухцепочечный субстрат собирали из одноцепочечных SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2. Двухцепочечную ДНК-мишень получали путем объединения цепи-мишени и комплементарных олигонуклеотидов нецелевых цепей в конечной концентрации 50 мкМ каждой в IX буфере ТЕ (10 мМ Трис-HCl (рН 8,0), 0,1 мМ EDTA), и для обеспечения правильного отжига дцДНК, смесь нагревали до 95°С в течение 2 минут, а затем медленно охлаждали до комнатной температуры.

Верхняя цепь (SEQ ID N0: 1):

5 ' -

Нижняя цепь (SEQ ID N0: 2): 5 ' -

gcatacttagaggtctcgagcaaggagagagatggctccaggaaatgggtcgaca* с* c* a*t* g-3 '

п^Л означает гаситель Iowa Black®

nt означает репортерный флуорофор флуоресцеин

* означает фосфоротиоатную связь

Подчеркивание - мотив, смежный с протоспейсером (РАМ) для Cas12a.

Двойное подчеркивание - спейсерная область, гибридизующаяся с областью сг-РНК.

[00166] Контрольный двухцепочечный субстрат, лишенный фосфортиоатной защиты, собирали из одноцепочечных SEQ ID N0: 3 и SEQ ID N0: 4.

Верхняя цепь (без защиты от экзонуклеазы) (SEQ ID N0: 3): 5 ' -

Нижняя цепь (без защиты от экзонуклеазы) (SEQ ID NO: 4): 5 ' -

gcatacttagaggtctcgagcaaggagagagatggctccaggaaatgggtcgacaccatg-3' n" означает гаситель пф означает флуорофор

Подчеркивание - мотив, смежный с протоспейсером (РАМ) для Cas12a.

Двойное подчеркивание - спейсерная область, гибридизующаяся с областью сг-РНК.

[00167] Пример 2. Применение флуоресцентного детектирования, связанного с экзонуклеазой

[00168] В этом примере, субстраты, описанные в Примере 1, были инкубировали при 100 нМ с 0,5 ед./мкл экзонуклеазы III в IX NEBuffer™ 1, рН 7,0 при 37°С (оба от New England Biolabs, Ipswich, Mass.). Флуоресценцию контролировали в течение определенного периода времени на длине волны возбуждения 4 85 нм и длине волны излучения 520 нм. Флуоресцентный сигнал генерировался для незащищенного субстрата, но не для защищенного субстрата. Сигнал считывали с использованием планшета Spectramax i3x (Molecular Devices, San Jose, Cal.). Результаты представлены на фигуре 2. Усиление флуоресценции наблюдалось только на незащищенных субстратах в присутствии экзонуклеазы III.

[00169] Пример 3. Расщепление субстрата эндонуклеазой Cas12a

[00170] В этом примере, авторы продемонстрировали, что расщепление фосфоротиоат-защищенного субстрата дцДНК под действием AsCas12a делает фосфоротиоат-защищенный субстрат восприимчивым к расщеплению экзонуклеазой III, что приводит к продуцированию флуоресцентного сигнала, который можно отслеживать в реальном времени.

[00171]

[00172] Была использована двухцепочечная ДНК-мишень длиной 60 п. о. (дцДНК), которая была защищена фосфортиоатом, как описано в Примере 1. Рибонуклеопротеин Cas12a (RNP), состоящий из Cas12a и руководящей РНК (cr-РНК), получали путем инкубирования очищенного рекомбинантного белка Cas12a при 37°С в течение 10 минут с синтетической cr-РНК. Перед образованием RNP, cr=РНК нагревали до 95°С в течение 2 минут и медленно охлаждали до комнатной температуры, чтобы обеспечить правильное формирование вторичной структуры. Компонент cr-РНК RNP обеспечивал специфичность к моделированной нацеливаемой последовательности AsCas12a, присутствующей в верхней цепи двухцепочечного субстрата. Защищенную дцДНК-мишень при 100 нМ инкубировали либо с 2,5 ед./мкл экзонуклеазы III отдельно, либо с 2,5 ед./мкл экзонуклеазы III и 112,5 нМ AsCas12a RNP. Инкубирование проводили в IX NEBuffer™ 1, рН 7,0. Контрольная реакционная смесь включала незащищенную дцДНК-мишень и экзонуклеазу III, но не RNP. Реакционные смеси инкубировали при 37°С и показания флуоресценции (возбуждение: 485 нм, излучение: 520 нм) регистрировали каждые 30 секунд в течение 600 минут с использованием планшета Spectramax i3x (Molecular Devices, San Jose, Cal.). Результаты показаны на фигуре 3. Быстрое увеличение флуоресценции наблюдалось только в присутствии Cas12a RNP, а не в контроле без RNP, что указывает на то, что дцДНК-мишень с защищенным концом разрушалась после расщепления Cas12a. Незащищенная дцДНК-мишень была расщеплена только экзонуклеазой III. Во время непрерывного считывания флуоресценции приблизительно через 200 минут после начала эксперимента произошло отключение электроэнергии. Показания были быстро возобновлены, но прерывание привело к резкому всплеску флуоресцентного сигнала для всех образцов, которые стабилизировались приблизительно через 10 минут, и показания были восстановлены.

[00173] Пример 4. Линейный диапазон анализа в зависимости от концентрации RNP Cas12a.

[00174] В этом примере, реакцию между двухцепочечный субстратом, RNP Cas12a и экзонуклеазой проводили, в основном, так же, как в Примере 3, но с использованием буфера IX Outsmart®, рН 7,9 (New England Biolabs, Ipswich, Mass.). Концентрации RNP варьировались от 0,11 нМ до 112,5 нМ. Негативный контроль не включал cr-РНК или RNP Cas12a. Позитивный контроль включал экзонуклеазу III только с незащищенным субстратом (см. Пример 1). Результаты показаны на фигуре 4. Существует прямая корреляция между концентрацией RNP и скоростью реакции. Реакции с более низкими концентрациями RNP показали плато при более низкой интенсивности флуоресценции. Заметное увеличение флуоресценции можно обнаружить даже для образца с концентрацией 0,11 нМ по сравнению с наблюдаемой флуоресценцией для реакции без Cas12a. Результаты указывают на линейную реакцию доза-ответ на концентрацию Cas12a от 0,11 до 7 нМ. Чувствительность анализа в широком диапазоне концентраций Cas12a подтверждает надежность этого анализа контроля качества (КК).

[00175] Пример 5. Подтверждение того, что экзонуклеаза, а не Cas12a, гидролизует ДНК.

[00176] Cas12a является уникальной среди эндонуклеаз тем, что она обладает неспецифической экзонуклеазной активностью («транс-расщеплением»). В этом Примере, авторы продемонстрировали, что экзонуклеаза III отвечает за расщепление дцДНК-мишени после первоначального расщепления Cas12a-RNP, а не за транс-активность самого Cas12a.

[00177] В этом Примере, реакцию между двухцепочечный субстратом, RNP Cas12a и экзонуклеазой проводили, в основном, так же, как в Примере 3, но с использованием NEBuffer™ 1, рН 7,0. Концентрация дцДНК варьировалась. Кроме того, контрольная реакционная смесь не содержала экзонуклеазы. Этот контроль был включен для того, чтобы определить, разрушает ли Cas12a субстрат самостоятельно (без экзонуклеазы) посредством вторичной неспецифической нуклеазной активности, известной как транс-активность. Результаты показаны на фигуре 5. Авторами наблюдалось некоторое увеличение флуоресценции в отсутствие экзонуклеазы III, что указывает на возможный ограниченный вклад гране-активности Cas12a в общий сигнал. Однако, максимальная скорость флуоресценции была приблизительно в 3,3 раза выше в присутствии экзонуклеазы III, что позволяет предположить, что экзонуклеаза III присутствует в достаточной концентрации, чтобы гарантировать, что скорость реакции не ограничивается трансактивностью Cas12a. Максимальная скорость наблюдалась для незащищенного субстрата дцДНК только с экзонуклеазой III, что указывает на то, что активность экзонуклеазы III не является ограничивающей по скорости.

[00178] Пример 6. Линейный диапазон анализа в зависимости от концентрации ДНК-субстрата

[00179] В этом Примере, реакцию между двухцепочечным субстратом, RNP Cas12a и экзонуклеазой проводили как описано в Примере 5. При сохранении всех остальных реагентов постоянными, концентрация ДНК-субстрата варьировалась от 2,06 нМ до 500 нМ. Результаты показаны на фигуре 6. Авторы настоящего изобретения заметили, что анализ является достаточно чувствительным для обнаружения последовательности дцДНК-мишени с концентарцией по меньшей мере 4,1 нМ и дает линейную реакцию доза-ответ в широком диапазоне концентраций дцДНК-мишени.

[00180] Пример 7 (прогностический). Расщепление субстрата эндонуклеазой Cas9

[00181] В этом Примере, эксперимент, описанный в Примере 3, проводили с эндонуклеазой Cas9 вместо эндонуклеазы Cas12a. Двухцепочечная ДНК-мишень (дцДНК), защищенная фосфортиоатом, была аналогична SEQ ID NO: 1/SEQ ID NO: 2, за исключением того, что она содержала последовательность РАМ, распознаваемую Cas9. Кроме того, дцДНК-мишень содержит пару флуорофор-гаситель на 5'-конце нецелевой цепи, а также цепи-мишени. Инкубирование проводили в буфере IX Outsmart®. Рибонуклеопротеин Cas9 (RNP), состоящий из SpyCas9 (Streptococcus pyogenes Cas9) и руководящей РНК (cr-РНК), получали путем инкубирования очищенного рекомбинантного белка Cas9 при 3°С в течение 10 минут с синтетической cr-РНК. Компонент cr-РНК RNP обеспечивает специфичность к SpyCas9 и к двухцепочечному субстрату. Защищенную дцДНК-мишень инкубировали либо с экзонуклеазой III, либо с RNP Cas9. Были включены одна или более контрольных реакционных смесей, например, без RNP, без экзонуклеазы или без экзонуклеазной защиты. Реакцинные смеси инкубировали при 37°С, и показания флуоресценции, соответствующие длине волны излучения репортерного флуорофора, регистрировали каждые 30 секунд в течение 600 минут с использованием планшета Spectramax i3x (Molecular Devices, San Jose, Cal.).

[00182] Пример 8 (прогностический). Расщепление субстрата рестриктирующей эндонуклеазой

[00183] В этом Примере, эксперимент, описанный в Примере 3, проводили с рестриктирующей эндонуклеазой, например, рестриктирующей эндонуклеазой типа II, вместо эндонуклеазы Cas12a. Двухцепочечная ДНК-мишень (дцДНК), защищенная фосфортиоатом, аналогична SEQ ID NO: 1/SEQ ID NO: 2, за исключением того, что она содержит последовательность распознавания тестируемой рестриктирующей эндонуклеазы.

Защищенную дцДНК-мишень инкубировали с экзонуклеазой III и рестриктирующей эндонуклеазой в соответствующем буфере, подходящем как для активности рестриктирующей эндонуклеазы, так и для активности экзонуклеазы III. Были включены одна или более контрольных реакционных смесей, например, без рестриктирующей эндонуклеазы, без экзонуклеазы или без экзонуклеазной защиты. Реакционные смеси инкубировали при 37°С, и показания флуоресценции, соответствующие длине волны излучения репортерного флуорофора, регистрировали каждые 30 секунд в течение 600 минут с использованием планшета Spectramax i3x (Molecular Devices, San Jose, Cal.).

[00184] Пример 9. Расщепление субстрата FAM с помощью CRISPR Cas12a.

[00185] В этом Примере, авторами был сконструирован субстрат («субстрат БАМ»), показанный на фигуре 7. Мишень длиной 60 п. о. содержала мотив, смежный с протоспейсером (РАМ) для Cas12a, и хорошо охарактеризованную спейсерную последовательность AAVS1. На 5'-конце выше РАМ, субстрат содержит конъюгированный с дезокситимидином (с!Т) флуоресцеин (БАМ) в паре с темновым гасителем Iowa Black. Оба 3'-конца были защищены фосфоротиоатными связями (Pt). Контрольный субстрат не имел Pt-защиты на 3'-концах («незащищенный субстрат БАМ»).

[00186] Субстрат (фиг. 7) расщеплялся в реакционной смеси, содержащей субстрат БАМ, Exo III и рибонуклеопротеиновый комплекс AsCas12a (RNP) при 0,42-18 нМ RNP, 2,5 кЕд./мл Exo III и дцДНК-мишени 100 нМ в NEBuffer 1. Реакция была продолжена при 37°С и были собраны данные флуоресценци, как показано на фигуре 8. Скорость увеличения флуоресценции в период времени 50-150 минут была отложена на графике в зависимости от концентрации Cas12a.

[00187] Пример 10. Расщепление субстрата TAMRA с помощью CRTSPR Cas12a.

[00188] В этом Примере, авторами был сконструирован субстрат («субстрат TAMRA»), идентичный субстрату FAM, как показано на фигуре 7, за исключением того, что вместо дезокситимидин (dT)-конъюгированного флуоресцеина (FAM) использовали сложный эфир TAMRA-NHS. Как и в случае с субстратом FAM (фмгура 7), оба 3'-конца были защищены фосфоротиоатными связями (Pt). Контрольный субстрат не имел Pt-защиты на 3'-концах («незащищенный субстрат IAMRA»).

[00189] Субстрат расщепляли в реакционной смеси, содержащей субстрат TAMRA, Exo III и рибонуклеопротеиновый комплекс (RNP) AsCas12a. Реакционная смесь содержала 18 нМ RNP (или контрольный 1х буфер NCA), 2,5 кЕд/мл Exo III и 100 нМ субстрата дцДНК в NEBuffer 1. Реакции продолжалли при 37°С и собирали данные флуоресценции, как показано на Фигуре 9.

[00190] Пример 11. Альтернативное размещение флуорофора

[00191] В этом Примере, авторами была разработана серия субстратов CRISPR Cas12a (похожих на те, которые были показаны на фигуре 7), но с альтернативным размещением флуорофоров. На фигуре 10 показан субстрат «нецелевой FAM» (тот же, что показан на фигуре 7, имеющий FAM на той же цепи и выше РАМ), субстрат «FAM-мишени» (FAM на цепи, противоположной РАМ), и субстрат «двойной FAM» (FAM как на той же цепи, так и на противоположной цепи от РАМ).

[00192] Три субстрата были расщеплены в реакционных смесях, содержащих один из трех субстратов FAM, Exo III и рибонуклеопротеиновый комплекс (RNP) AsCas12a. Реакционные смеси содержали 18 нМ RNP (или контрольный 1х NCA-буфер), 2,5 кЕд/мл Exo III, 100 нМ субстрата дцДНК в NEBuffer 1. Реакции продолжали при 37°С и собирали данные флуоресценции (показано на Фигуре 11). Данные также представлены в виде сравнения всех защищенных субстратов (Фигура 12) и скорости изменения флуоресценции в различных реакционных смесях (Фигура 13).

[00193] Пример 12. Оптимизация концентрации экзонуклеазы [00194] В этом Примере, авторы провели титрование экзонуклеазы и оптимизировали концентрацию экзонуклеазы. Реакции расщепления проводили в буфере NEBuffer 1, и эти реакционные смеси содержали субстрат FAM «цепи-мишени» (фигура 10), RNP AsCas12a в концентрации 20,25 нМ RNP (2:1 casl2a:cr-РНК), различные количества ЕхоШ (156, 25-2500 Ед./мл) и субстрат, меченный FAM. Контрольные реакционные смеси содержали незащищенный субстрат, или не содержали RNP, или не содержали ЕхоШ. Реакции продолжали при 37°С. Результаты показаны на фигуре 14.

[00195] Пример 13. Расщепление эндонуклеазой Cas9

[00196] В этом Примере, авторы продемонстрировали применимость анализа к Cas9. Этот пример представляет собой подтверждение прогностического Примера 7. Как описано в Примере 7, двухцепочечная ДНК (дцДНК) была сконструирована как показано на Фигуре 1 и Фигуре 7. Субстрат был защищен фосфортиоатом и содержал последовательность РАМ, распознаваемую Cas9, спейсерную последовательность, флуорофор и гаситель на той же цепи, что и РАМ (нецелевая цепь). В этом эксперименте, руководящая Cas9 нацеливалась на цепь, противоположную руководящей Cas12a.

[00197] Авторами была разработана одноцепочечная руководящая РНК (оцрРНК) для эндонуклеазы Cas9, которая объединяла cr-РНК и tracr-PHK. Как описано в Примере 7, инкубирование проводили в буфере IX Cutsmartr®. Рибонуклеопротеин Cas9 (RNP), состоящий из SpyCas9 [Streptococcus pyogenes Cas9) и руководящей РНК (одноцепочечной руководящей РНК (оцрРНК)), получали путем инкубирования очищенного рекомбинантного Cas 9 с оцрРНК при 37°С в течение 10 минут.Реакционные смеси включали 50 нМ SpyCas9, 1 кЕд/мл ЕхоШ (New England Biolabs, Ipswich, Mass.) и субстрат дцДНК при 110 нМ в реакционном объеме 200 мкл. Как описано в Примере 7, была включена только контрольная реакционная смесь без RNP (реакционная смесь, содержащая только ЕхоШ). Реакционные смеси инкубировали при 37°С, и показания флуоресценции, соответствующие длине волны излучения репортерного флуорофора, регистрировали каждые 30 минут в течение 1000 минут с использованием планшета Spectramax i3x (Molecular Devices, San Jose, Cal. Все реакции проводили с тремя повторами, и усредненные результаты для каждой серии данных показаны на фигуре 15.

[00198] Пример 14. Расцепление рестриктирующими эндонуклеазами

[00199] В этом примере, авторы продемонстрировали применимость анализа к рестриктирующим эндонуклеазам типа II. Этот Пример представляет собой подтверждение прогностического Примера 8.

[00200] Как описано в Примере 8, двухцепочечные ДНК (ДЦДНК)-субстраты, защищенные фосфоротиоатом, были сконструированы как показано на фигуре 1. Субстраты содержали последовательности распознавания одной из рестриктирующих эндонуклеаз Bsal, BcoDI и Sail. Как описано в Примере 7, каждый субстрат инкубировали с экзонуклеазой III и рестриктирующей эндонуклеазой в IX буфере Cutsmart®. Каждая реакционная смесь содержала 300 единиц одного из Bsal HF v2, BcoDI и Sail (New England Biolabs) и 1,25 кЕд. ЕхоШ. Реакционные смеси инкубировали при 37°С, и показания флуоресценции, соответствующие длине волны излучения репортерного флуорофора, регистрировали каждую минуту в течение 300 минут с использованием планшета Spectramax i3x (Molecular Devices, San Jose, Cal.). Результаты показаны на фигуре 16.

[00201] Хотя настоящее изобретение подробно описано со ссылкой на конкретные примеры, однако, специалисту в данной области будет очевидно, что в настоящее описание могут быть внесены различные модификации, не выходящие за рамки объема изобретения. Таким образом, объем изобретения не должен ограничиваться описанными здесь примерами, а должен ограничиваться только формулой изобретения, представленной ниже.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="CBI042.30.xml"

softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.2.0"

productionDate="2022-10-24">

<ApplicantFileReference>CBI042.30</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>US</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>US 63/272,091</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2021-10-26</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="en">CARIBOU BIOSCIENCES,

INC.</ApplicantName>

<InventorName languageCode="en">SMITH, Stephen</InventorName>

<InventionTitle languageCode="en">EXONUCLEASE-COUPLED REAL-TIME

ENDONUCLEASE ACTIVITY ASSAY</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>4</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>59</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..59</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q1">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Synthetic: Top

strand</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>modified_base</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mod_base</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>OTHER</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>quencher Iowa Black</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>modified_base</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>3</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mod_base</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>OTHER</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q3">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>reporter fluorophore

Fluorescein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>modified_base</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>16..19</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mod_base</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>OTHER</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protospacer adjacent motif (PAM) for

Cas12a</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>modified_base</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>20..39</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mod_base</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>OTHER</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q5">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>spacer region hybridizing to a region of

crRNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>modified_base</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>56..59</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mod_base</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>OTHER</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q6">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Phosphorothioate

linkage</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..59</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q7">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>catggtgtcgacccatttcctggagccatctctctccttgctcgagacc

tctaagtatg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>60</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..60</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q8">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Synthetic: Bottom

strand</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>modified_base</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>55..60</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mod_base</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>OTHER</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q9">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Phosphorothioate

linkage</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..60</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q10">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gcatacttagaggtctcgagcaaggagagagatggctccaggaaatggg

tcgacaccatg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>55</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..55</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q11">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Synthetic: Top strand (no exonuclease

protection)</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>modified_base</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mod_base</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>OTHER</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q12">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>quencher</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>modified_base</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>3</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mod_base</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>OTHER</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q13">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>fluorophore</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>modified_base</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>16..19</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mod_base</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>OTHER</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q14">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protospacer adjacent motif (PAM) for

Cas12a</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>modified_base</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>20..39</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mod_base</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>OTHER</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q15">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protospacer adjacent motif (PAM) for

Cas12a</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..55</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q16">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>catggtgtcgacccatttcctggagccatctctctccttgctcgagacc

tctaag</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>60</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..60</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q17">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Synthetic: Bottom strand (no exonuclease

protection)</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..60</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q18">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gcatacttagaggtctcgagcaaggagagagatggctccaggaaatggg

tcgacaccatg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Claims (41)

1. Субстрат нуклеиновой кислоты для обнаружения активности эндонуклеазы, содержащий:

(а) донорный флуорофор и акцепторный флуорофор, где указанные флуорофоры образуют пару для переноса резонансной энергии флуоресценции (FRET);

(b) по меньшей мере одну структуру по меньшей мере на одной цепи нуклеиновой кислоты, ингибирующую расщепление субстрата экзонуклеазой, используемой для обнаружения активности эндонуклеазы, где структура, ингибирующая расщепление субстрата экзонуклеазой, выбрана из шпильки, выступающей цепи и модификации нуклеиновой кислоты, и где указанная структура способна ингибировать активность указанной экзонуклеазы; и

(c) последовательность распознавания эндонуклеазы.

2. Субстрат по п. 1, где экзонуклеаза выбрана из экзонуклеазы I, экзонуклеазы III, экзонуклеазы V, экзонуклеазы VII, экзонуклеазы VIII, экзонуклеазы Т5, экзонуклеазы Т7, экзонуклеазы лямбда, экзонуклеазы Т, экзонуклеазы BAL-31, экзонуклеазы RecJf, РНКазы R, РНКазы II, РНКазы D, РНКазы Т, РНКазы BN, РНКазы PH, экзорибонуклеазы I и экзорибонуклеазы II.

3. Субстрат по п. 1 или 2, где донорный флуорофор выбран из группы, состоящей из 5-карбоксифлуоресцеина (5-FAM), 6-карбоксифлуоресцеина (6-FAM), 2',4',1,4-тетрахлорфлуоресцеина (TET), 2',4',5',7',1,4-гексахлорфлуоресцеина (HEX), 2',7'-диметокси-4',5'-дихлор-6-карбоксифлуоресцеина (JOE), кумариновых красителей, красителей Alexa Fluor, IRDye 800CW, каскадного синего, синего красителя Pacific, оранжевого красителя Pacific, техасского красного и BODIPY®.

4. Субстрат по любому из пп. 1-3, где акцепторный флуорофор выбран из группы, состоящей из тетраметил-6-карбоксиродамина (TAMRA), тетрапропано-6-карбоксиродамина (ROX), DABSYL, DABCYL (4-[[4-(диметиламино)-фенил]-азо]-бензойной кислоты), Cy5 и Cy5.5, антрахиноновых красителей, нитротиазольных красителей, нитроимидазольных красителей, LC-Red 610, LC-Red 640, LC-Red 705, JA286, DDQ-I, DDQ-II, QSY-7, QSY-21, IRDye QC1, Iowa Black FQ, Iowa Black RQ, HEX (гексахлорфлуоресцеина), TET (тетрахлорфлуоресцеина), JOE (5'-дихлордиметоксифлуоресцеина), красителей BODIPY®, гасителя Eclipse (4-[[2-хлор-4-нитро-фенил]-азо]анилина, BHQ-1 ([(4-(2-нитро-4-метил-фенил)-азо)-ил-((2-метокси-5-метил-фенил)-азо)]анилина), BHQ-2 ([(4-(1-нитрофенил)-азо)-ил-((2,5-диметокси-фенил)-азо)]анилина) и пиридинилизохинолиндионовых красителей.

5. Субстрат по любому из пп. 1-4, где экзонуклеаза выбрана из экзонуклеазы III, экзонуклеазы Т5, экзонуклеазы Т7, экзонуклеазы лямбда, экзонуклеазы BAL-31, РНКазы R, РНКазы II, РНКазы D, РНКазы Т, РНКазы BN, РНКазы PH, экзорибонуклеазы I и экзорибонуклеазы II.

6. Субстрат по любому из пп. 1-5, где эндонуклеаза представляет собой эндонуклеазу, регулируемую нуклеиновой кислотой.

7. Субстрат по п. 6, где эндонуклеаза, регулируемая нуклеиновой кислотой, представляет собой эндонуклеазу CRISPR класса I (CASCADE), и субстрат содержит мотив, смежный с протоспейсером (PAM), состоящий из последовательности, выбранной из 5'-AAG-3', 5'-AGG-3', 5'-ATG-3', 5'-GAG-3', 5'-CAG-3', 5'-GTG-3', 5'-ТАА-3', 5'-TGG-3', 5'-ААА-3', 5'-ААС-3', 5'-ААТ-3', 5'-АТА-3', 5'-ТАG-3' и 5'-ТТG-3'.

8. Субстрат по п. 6, где эндонуклеаза, регулируемая нуклеиновой кислотой, представляет собой эндонуклеазу CRISPR Cas9 или эндонуклеазу CRISPR Cas12a, и субстрат содержит мотив, смежный с протоспейсером (PAM), состоящий из последовательности, выбранной из 5'-NGG-3', 5'-NGGNG-3', 5'-NNAAAAW-3', 5'-NNNNGATT-3', 5'-GNNNCNNA-3', 5'-NNNACA-3', 5'-TTN-3', 5'-TTTN-3' и 5'-TTTV-3'.

9. Субстрат по п. 6, где эндонуклеаза, регулируемая нуклеиновой кислотой, включает эндонуклеазу и нуклеиновую кислоту, нацеленную на другую нуклеиновую кислоту (NATNA), и NATNA содержит нуклеотиды ДНК и РНК.

10. Субстрат по любому из пп. 1-5, где эндонуклеаза выбрана из группы, состоящей из нуклеазы «цинковые пальцы» (ZFN), ZFN, конъюгированной с Fok I, эффекторной нуклеазы, подобной активатору транскрипции (TALEN), эндонуклеазы Endo TT, эндонуклеазы Argonaute, зндонуклеазы Arcus, эндорибонуклеазы, выбранной из РНКазы III, РНКазы А, РНКазы Т1, РНКазы А, РНКазы H, РНКазы Z и РНКазы P, рибозима, рибозима «головка молотка», ДНКзима, ПНАзима или сконструированной эндорибонуклеазы; Cas3 и Cas7-11, и рестриктирующей эндонуклеазы.

11. Композиция для обнаружения активности эндонуклеазы, содержащая субстрат нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-10 и экзонуклеазу.

12. Способ обнаружения активности эндонуклеазы, включающий:

(a) приведение эндонуклеазы в контакт с реакционной смесью, включающей композицию по п. 11; и

(b) измерение флуоресценции, испускаемой реакционной смесью, где изменение флуоресценции указывает на активность эндонуклеазы.

13. Способ по п. 12, где субстрат нуклеиновой кислоты или эндонуклеаза находятся в неочищенной форме.

14. Набор для обнаружения активности эндонуклеазы, содержащий:

(a) субстрат по любому из пп. 1-10; и

(b) экзонуклеазу.

15. Способ обнаружения присутствия нуклеиновой кислоты-мишени в образце, включающий:

(а) приведение образца в контакт с субстратом по любому из пп. 1-10; и

(b) измерение флуоресценции, испускаемой реакционной смесью, где изменение флуоресценции указывает на присутствие нуклеиновой кислоты-мишени в образце.

16. Способ по п. 15, где образец содержит неочищенный препарат нуклеиновых кислот.

17. Набор для проведения диагностической процедуры, состоящей в обнаружении нуклеиновой кислоты-мишени в соответствии со способом по п. 15, содержащий

композицию по п. 11, где нуклеиновая кислота-мишень выбрана из последовательности, характерной для бактерии; последовательности, характерной для вируса; последовательности, характерной для паразита; и последовательности пациента, характерной для заболевания или состояния пациента; и

инструкции по проведению диагностического анализа.

18. Способ оптимизации реакций эндонуклеазного расщепления, где указанный способ включает:

(а) приготовление серии реакционных смесей с экзонуклеазой и субстратом нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-10;

(b) приведение каждой из серий реакционных смесей в контакт с различными количествами эндонуклеазы;

(c) измерение флуоресценции, излучаемой реакционной смесью, где изменение флуоресценции указывает на активность эндонуклеазы;

(d) выбор количества эндонуклеазы, дающего наибольшую флуоресценцию реакционной смеси или наибольшую скорость увеличения флуоресценции реакционной смеси, в качестве оптимальной концентрации эндонуклеазы.

19. Способ оптимизации реакций расщепления эндонуклеазой CRISPR, включающий:

(а) приготовление серии реакционных смесей с эндонуклеазой CRISPR, экзонуклеазой и субстратом нуклеиновой кислоты, включающим:

i. донорный флуорофор и акцепторный флуорофор, где указанные флуорофоры образуют пару для переноса резонансной энергии флуоресценции (FRET);

ii. по меньшей мере одну структуру по меньшей мере на одной цепи, ингибирующую расщепление субстрата экзонуклеазой, где структура, ингибирующая расщепление субстрата экзонуклеазой, выбрана из шпильки, выступающей цепи и модификации нуклеиновой кислоты; и

iii. последовательность распознавания эндонуклеазы;

(b) добавление каждой из серии нуклеиновых кислот, нацеленных на другую нуклеиновую кислоту (NATNA);

(с) оценку флуоресценции, излучаемой реакционной смесью, где изменение флуоресценции указывает на активность эндонуклеазы;

(d) выбор NАТNА, дающей наибольшую флуоресценцию реакционной смеси, в качестве оптимальной NАТNА.