RU2847808C9 - Нейтрализующее респираторно-синцитиальный вирус антитело и его применение - Google Patents
Нейтрализующее респираторно-синцитиальный вирус антитело и его применениеInfo
- Publication number
- RU2847808C9 RU2847808C9 RU2024129759A RU2024129759A RU2847808C9 RU 2847808 C9 RU2847808 C9 RU 2847808C9 RU 2024129759 A RU2024129759 A RU 2024129759A RU 2024129759 A RU2024129759 A RU 2024129759A RU 2847808 C9 RU2847808 C9 RU 2847808C9
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- insdqualifier
- insdseq
- antibody
- insdfeature
- seq
- Prior art date
Links
Abstract
Группа изобретений относится к биотехнологии и лекарственным средствам на основе антител. Предложены антитело, специфически связывающееся с респираторно-синцитиальным вирусом (РСВ), молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело, применение антитела в производстве лекарственного средства для профилактики или лечения вызванного РСВ заболевания и способ профилактики или лечения вызванного РСВ заболевания. Изобретения обеспечивают антитело, связывающееся с F-белком РСВ человека, обладающее высокой активностью и способное успешно нейтрализовать клинические штаммы РСВ. 4 н. и 12 з.п. ф-лы, 7 ил., 4 табл., 4 пр.
Description
ОТСЫЛКА К РОДСТВЕННОЙ ЗАЯВКЕ
В настоящей заявке испрашивается приоритет Заявки на патент Китая № 202210871810.9, поданной 22 июля 2022 года и во всей полноте включенной в настоящую заявку посредством отсылки.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящая заявка в широком смысле относится к генной инженерии и лекарственным средствам на основе антител. В частности, настоящая заявка относится к антителу к респираторно-синцитиальному вирусу (РСВ) и к применению данного антитела в профилактике или лечении вызванного респираторно-синцитиальным вирусом (РСВ) заболевания.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Библиотеки антител большого размера и высокого качества являются важным источником молекул для скрининга высокоаффинных антител к любому антигену и обладают высокой коммерческой и практической ценностью. На сегодняшний день, большинство высококачественных библиотек антител, о которых сообщают отечественные и зарубежные источники, создаются по технологии электротрансформации. Однако размер библиотек антител, создаваемых по технологии электротрансформации, ограничен из-за недостаточной эффективности трансформации. Процесс получения библиотек антител происходит периодически с использованием множества партий, что обуславливает его длительность и требует значительных человеческих и материальных ресурсов.
Респираторно-синцитиальный вирус (РСВ) является самым опасным вирусным патогеном, вызывающим острые инфекции нижних дыхательных путей (ОИНДП) у детей младше 5 лет по всему миру1. РСВ-инфекция является основной причиной госпитализации детей раннего и младшего возраста с респираторными вирусными инфекция и представляет серьезную опасность для здоровья детей, в особенности – недоношенных, с врожденным пороком сердца или первичными иммунодефицитами. В первую пятерку стран с наибольшей частотой возникновения РСВ-инфекции входят Пакистан, Индия, Нигерия, Китай и Индонезия, на долю которых приходится почти половина случаев вызванных РСВ ОИНДП в мире2.
Респираторно-синцитиальный вирус (РСВ) относится к семейству Pneumoviridae, роду Orthopneumovirus и представляет собой вирус с несегментированным геномом, содержащий одноцепочечную РНК отрицательной полярности3. Он может быть классифицирован на два подтипа – A и B – в зависимости от различий в поверхностных антигенах4. Геном РСВ содержит 10 генов, кодирующих 11 белков. Адгезивный G-белок и фузогенный F-белок являются основными протективными антигенами на поверхности вируса, могущими вызывать продукцию нейтрализующего антитела организмом5. G-белок характеризуется высокой степенью дифференцировки подтипов, поэтому большинство антител к G-белку являются подтип-специфическими антителами6. F-белок характеризуется высокой степенью консервативности подтипов, поэтому индуцированные F-белком антитела способны одновременно ингибировать РСВ типов A и B.
F-белок представляет собой трансмембранный белок 1-го типа, при этом его неактивный предшественник (F0) состоит из 574 аминокислот7. Три F0 образуют тример. Фурин хозяина расщепляет F0 между аминокислотами в положениях 109 и 110 и между аминокислотами в положениях 136 и 137 в F0 при его прохождении через Гольджи. После расщепления высвобождается короткий пептид из 27 аминокислот в середине (P27), при этом остальные два сегмента F2 и F1 образуют активный F-белок за счет дисульфидных связей (Cys69–Cys212 и Cys37–Cys439)8. Высокогидрофобный пептид слияния (FP) презентирует на N-конце белка F1 и расположен в гидрофобной полости белка, тем самым будучи защищен от воздействия внешней гидрофильной среды. Когда F-белок презентирует на поверхности вириона или клетки, он находится не в структурно стабильной, а в высокоуровневой метастабильной предшествующей слиянию форме глипротеина (Pre-F)9. В дальнейшем происходит ряд значительных структурных изменений N-конца белка F1, индуцирующих слияние мембран и, как следствие, заражение клетки вирусом. При этом данный процесс также приводит к превращению F-белка из высокоуровневой метастабильной структуры Pre-F в форму стабильного глипротеина после слияния (Post-F).
На сегодняшний день, не существует вакцины для профилактики РСВ. Паливизумаб (торговое наименование: «Синагис») разрешен Управлением по контролю за качеством пищевых продуктов и медикаментов США к применению для профилактики РСВ-инфекции у детей раннего и младшего возраста в группе высокого риска. Как правило, на сезон РСВ требуется до 5 инъекций, что связано с большими финансовыми затратами и делает невозможным широкий охват популяции детей раннего и младшего возраста.
С учетом клинических потребностей, разработка антител к респираторно-синцитиальному вирусу важна с медицинской точки зрения для профилактики вызываемых РСВ-инфекцией заболеваний.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Согласно первому аспекту, в настоящей заявке предложено антитело к респираторно-синцитиальному вирусу (РСВ), содержащее вариабельную область тяжёлой цепи, содержащую определяющие комплементарность участки тяжелой цепи (HCDR, от англ. Heavy Complementarity Determining Regions) HCDR1, HCDR2 и HCDR3, и вариабельную область легкой цепи, содержащую определяющие комплементарность участки легкой цепи (LCDR, от англ. Light Complementarity Determining Regions) LCDR1, LCDR2 и LCDR3, причем
аминокислотная последовательность HCDR1 представлена в SEQ ID NO:32, аминокислотная последовательность HCDR2 представлена в SEQ ID NO:33, аминокислотная последовательность HCDR3 представлена в SEQ ID NO:34, аминокислотная последовательность LCDR1 представлена в SEQ ID NO:35, аминокислотная последовательность LCDR2 представлена в SEQ ID NO:36, и аминокислотная последовательность LCDR3 представлена в SEQ ID NO:37; или
аминокислотная последовательность HCDR1 представлена в SEQ ID NO:38, аминокислотная последовательность HCDR2 представлена в SEQ ID NO:39, аминокислотная последовательность HCDR3 представлена в SEQ ID NO:40, аминокислотная последовательность LCDR1 представлена в SEQ ID NO:35, аминокислотная последовательность LCDR2 представлена в SEQ ID NO:36, и аминокислотная последовательность LCDR3 представлена в SEQ ID NO:43;
причем аминокислотные последовательности определяющих комплементарность участков тяжелой цепи и определяющих комплементарность участков легкой цепи определены по номенклатуре Кэбота.
В некоторых вариантах осуществления первого аспекта аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела представлена в SEQ ID NO: 28 или 30.
В некоторых вариантах осуществления первого аспекта аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела представлена в SEQ ID NO: 29 или 31.
В некоторых вариантах осуществления первого аспекта аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела представлена в SEQ ID NO: 28, при этом аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела представлена в SEQ ID NO: 29; или
аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела представлена в SEQ ID NO: 30, при этом аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела представлена в SEQ ID NO: 31.
Согласно второму аспекту, в настоящей заявке предложено антитело к респираторно-синцитиальному вирусу (РСВ), в котором аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности, определенной в SEQ ID NO: 28 или 30, при этом аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности, определенной в SEQ ID NO: 29 или 31.
В некоторых вариантах осуществления первого или второго аспектов антитело является нейтрализующим антителом.
В некоторых вариантах осуществления первого или второго аспектов антитело может быть способно к связыванию с F-белком респираторно-синцитиального вируса (РСВ) человека.
В некоторых вариантах осуществления первого или второго аспектов антитело представляет собой Fab-фрагмент, полное антитело, F(ab’)2-фрагмент или одноцепочечный Fv-фрагмент (scFv-фрагмент).
В некоторых вариантах осуществления первого или второго аспектов антитело является моноклональным антителом.
В некоторых вариантах осуществления первого или второго аспектов антитело содержит константную область тяжёлой цепи подтипа IgG1, подтипа IgG2 или подтипа IgG4.
В некоторых вариантах осуществления первого или второго аспектов константная область тяжёлой цепи содержит Fc-фрагмент константной области тяжёлой цепи подтипа IgG1, при этом аминокислоты в положениях 252, 254, 256 последовательности Fc-фрагмента представляют собой соответственно Y, T и E, причем положения аминокислот константной области антитела определены согласно EU-нумерации.
В некоторых вариантах осуществления первого или второго аспектов антитело содержит константную область легкой цепи подтипа каппа или подтипа лямбда.
Согласно третьему аспекту, в настоящей заявке предложена молекула нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело по первому или второму аспекту.
Согласно четвертому аспекту, в настоящей заявке предложена фармацевтическая композиция, содержащая антитело по первому или второму аспекту и фармацевтически приемлемые вспомогательное вещество, разбавитель или носитель.
Согласно пятому аспекту, в настоящей заявке предложено применение антитела по первому или второму аспекту, молекулы нуклеиновой кислоты по третьему аспекту или фармацевтической композиции по четвертому аспекту в производстве медикамента для профилактики или лечения вызванного РСВ заболевания.
Согласно шестому аспекту, в настоящей заявке предложен способ профилактики или лечения вызванного РСВ заболевания, включающий этап, на котором вводят нуждающемуся в этом субъекту антитело по первому или второму аспекту или фармацевтическую композицию по четвертому аспекту.
Согласно седьмому аспекту, в настоящей заявке предложена комбинация плазмид для экспрессии библиотеки Fab-фрагментов антител, содержащая первую плазмиду и вторую плазмиду, причем
первая плазмида содержит элемент экспрессии VH-CH1 тяжелой цепи антитела и первый сайт рекомбинации;
вторая плазмида содержит элемент экспрессии VH-CH1 легкой цепи антитела и второй сайт рекомбинации; при этом
первый сайт рекомбинации отличен от второго сайта рекомбинации.
В некоторых вариантах осуществления седьмого аспекта комбинация плазмид содержит множество первых плазмид, при этом множество первых плазмид несут разные элементы экспрессии VH-CH1 тяжелой цепи антитела и имеют идентичный первый сайт рекомбинации.
В некоторых вариантах осуществления седьмого аспекта комбинация плазмид содержит множество вторых плазмид, при этом множество вторых плазмид несут разные элементы экспрессии VH-CH1 легкой цепи антитела и имеют идентичный второй сайт рекомбинации.
В некоторых вариантах осуществления седьмого аспекта первая плазмида и/или вторая плазмида является фагмидой.
В некоторых вариантах осуществления седьмого аспекта первая плазмида и вторая плазмида имеют разные ориджины репликации.
В некоторых вариантах осуществления седьмого аспекта ориджин репликации выбран из группы, состоящей из одного или нескольких из ориджина репликации плазмиды pBR (ориджина репликации pBR), ориджина репликации CDF, ориджина репликации нитчатого фага M13 (ориджина репликации f1) и ориджина репликации p15A.
В некоторых вариантах осуществления седьмого аспекта первый сайт рекомбинации и второй сайт рекомбинации являются сайтами для интеграции фага в геноме фага и бактерии-хозяина соответственно.
В некоторых вариантах осуществления седьмого аспекта первый сайт рекомбинации является attP-сайтом, при этом второй сайт рекомбинации является attB-сайтом.
В некоторых вариантах осуществления седьмого аспекта первый сайт рекомбинации и второй сайт рекомбинации расположены на поликлональных сайтах ферментного расщепления первой плазмиды и второй плазмиды соответственно.
В некоторых вариантах осуществления седьмого аспекта константная область лёгкой цепи (CL-область) антитела представляет собой константную область легкой цепи каппа человека или константную область легкой цепи лямбда человека.
В некоторых вариантах осуществления седьмого аспекта CH1-домен константной области тяжёлой цепи антитела относится к подтипу IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4.
В некоторых вариантах осуществления седьмого аспекта первая плазмида и/или вторая плазмида содержит кодирующую ген устойчивости область.
В некоторых вариантах осуществления седьмого аспекта молекула нуклеиновой кислоты, включающая молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую CH1-домен константной области тяжёлой цепи антитела, слита своим 3’-концом с 5’-концом молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей белок gIII нитчатого фага M13.
В некоторых вариантах осуществления седьмого аспекта геном устойчивости является ген устойчивости к антибиотику.
В некоторых вариантах осуществления седьмого аспекта ген устойчивости выбран из группы, состоящей из: гена устойчивости к хлорамфениколу (гена CmR), гена устойчивости к ампициллину (гена Ampr), гена устойчивости к канамицину (гена KaR) и гена устойчивости к тетрациклину (гена TetR).
Согласно восьмому аспекту, в настоящей заявке предложена рекомбинантная система для экспрессии библиотеки Fab-фрагментов антител, содержащая первую плазмиду, вторую плазмиду и экспрессирующую фаговую интегразу клетку; причем
первая плазмида содержит элемент экспрессии VH-CH1 тяжелой цепи антитела и первый сайт рекомбинации;
вторая плазмида содержит элемент экспрессии VH-CH1 легкой цепи антитела и второй сайт рекомбинации; при этом
первый сайт рекомбинации отличен от второго сайта рекомбинации.
В некоторых вариантах осуществления восьмого аспекта рекомбинантная система содержит множество первых плазмид, при этом множество первых плазмид несут разные элементы экспрессии VH-CH1 тяжелой цепи антитела и имеют идентичный первый сайт рекомбинации.
В некоторых вариантах осуществления восьмого аспекта рекомбинантная система содержит множество вторых плазмид, при этом множество вторых плазмид несут разные элементы экспрессии VH-CH1 легкой цепи антитела и имеют идентичный второй сайт рекомбинации.
В некоторых вариантах осуществления восьмого аспекта первая плазмида и/или вторая плазмида является фагмидой.
В некоторых вариантах осуществления восьмого аспекта первая плазмида и вторая плазмида имеют разные ориджины репликации.
В некоторых вариантах осуществления восьмого аспекта ориджин репликации выбран из группы, состоящей из одного или нескольких из ориджина репликации pBR, ориджина репликации CDF, ориджина репликации нитчатого фага M13 (ориджина репликации f1) и ориджина репликации p15A.
В некоторых вариантах осуществления восьмого аспекта первый сайт рекомбинации и второй сайт рекомбинации являются сайтами для интеграции фага в геноме фага и бактерии-хозяина соответственно.
В некоторых вариантах осуществления восьмого аспекта первый сайт рекомбинации является attP-сайтом, при этом второй сайт рекомбинации является attB-сайтом.
В некоторых вариантах осуществления восьмого аспекта первый сайт рекомбинации и второй сайт рекомбинации расположены на поликлональных сайтах ферментного расщепления первой плазмиды и второй плазмиды соответственно.
В некоторых вариантах осуществления восьмого аспекта константная область лёгкой цепи (CL-область) антитела представляет собой константную область легкой цепи каппа человека или константную область легкой цепи лямбда человека.
В некоторых вариантах осуществления восьмого аспекта CH1-домен константной области тяжёлой цепи антитела относится к подтипу IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4.
В некоторых вариантах осуществления восьмого аспекта первая плазмида и/или вторая плазмида содержит кодирующую ген устойчивости область.
В некоторых вариантах осуществления восьмого аспекта молекула нуклеиновой кислоты, включающая молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую CH1-домен константной области тяжёлой цепи антитела, слита своим 3’-концом с 5’-концом молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей белок gIII нитчатого фага M13.
В некоторых вариантах осуществления восьмого аспекта геном устойчивости является ген устойчивости к антибиотику.
В некоторых вариантах осуществления восьмого аспекта ген устойчивости выбран из группы, состоящей из: гена устойчивости к хлорамфениколу (гена CmR), гена устойчивости к ампициллину (гена Ampr), гена устойчивости к канамицину (гена KaR) и гена устойчивости к тетрациклину (гена TetR).
В некоторых вариантах осуществления восьмого аспекта фаговой интегразой является тирозининтеграза.
В некоторых вариантах осуществления восьмого аспекта фаговой интегразой является интеграза фага лямбда.
В некоторых вариантах осуществления восьмого аспекта фаговой интегразой является индуцибельно экспрессируемая или конститутивно экспрессируемая интеграза.
В некоторых вариантах осуществления восьмого аспекта фаговой интегразой является индуцибельно экспрессируемая интеграза.
В некоторых вариантах осуществления восьмого аспекта экспрессирующей фаговую интегразу клеткой является прокариотическая клетка.
В некоторых вариантах осуществления восьмого аспекта экспрессирующей фаговую интегразу клеткой является E. coli.
В некоторых вариантах осуществления восьмого аспекта экспрессирующей фаговую интегразу клеткой является генно-инженерная бактерия.
В некоторых вариантах осуществления восьмого аспекта первая плазмида, вторая плазмида и экспрессирующая фаговую интегразу клетка существуют независимо друг от друга, или по меньшей мере одна из первой плазмиды и второй плазмиды была введена в экспрессирующую фаговую интегразу клетку.
Согласно девятому аспекту, в настоящей заявке предложена рекомбинантная клетка для экспрессии библиотеки Fab-фрагментов антител, содержащая первую плазмиду, вторую плазмиду и экспрессирующая фаговую интегразу; причем
первая плазмида содержит элемент экспрессии VH-CH1 тяжелой цепи антитела и первый сайт рекомбинации;
вторая плазмида содержит элемент экспрессии VH-CH1 легкой цепи антитела и второй сайт рекомбинации; при этом
первый сайт рекомбинации отличен от второго сайта рекомбинации.
В некоторых вариантах осуществления девятого аспекта рекомбинантная клетка содержит множество первых плазмид, при этом множество первых плазмид несут разные элементы экспрессии VH-CH1 тяжелой цепи антитела и имеют идентичный первый сайт рекомбинации.
В некоторых вариантах осуществления девятого аспекта рекомбинантная клетка содержит множество вторых плазмид, при этом множество вторых плазмид несут разные элементы экспрессии VH-CH1 легкой цепи антитела и имеют идентичный второй сайт рекомбинации.
В некоторых вариантах осуществления девятого аспекта первая плазмида и/или вторая плазмида является фагмидой.
В некоторых вариантах осуществления девятого аспекта первая плазмида и вторая плазмида имеют разные ориджины репликации.
В некоторых вариантах осуществления девятого аспекта ориджин репликации выбран из группы, состоящей из одного или нескольких из ориджина репликации pBR, ориджина репликации CDF, ориджина репликации нитчатого фага M13 (ориджина репликации f1) и ориджина репликации p15A.
В некоторых вариантах осуществления девятого аспекта первый сайт рекомбинации и второй сайт рекомбинации являются сайтами для интеграции фага в геноме фага и бактерии-хозяина соответственно.
В некоторых вариантах осуществления девятого аспекта первый сайт рекомбинации является attP-сайтом, при этом второй сайт рекомбинации является attB-сайтом.
В некоторых вариантах осуществления девятого аспекта первый сайт рекомбинации и второй сайт рекомбинации расположены на поликлональных сайтах ферментного расщепления первой плазмиды и второй плазмиды соответственно.
В некоторых вариантах осуществления девятого аспекта константная область лёгкой цепи (CL-область) антитела представляет собой константную область легкой цепи каппа человека или константную область легкой цепи лямбда человека.
В некоторых вариантах осуществления девятого аспекта CH1-домен константной области тяжёлой цепи антитела относится к подтипу IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4.
В некоторых вариантах осуществления девятого аспекта первая плазмида и/или вторая плазмида содержит кодирующую ген устойчивости область.
В некоторых вариантах осуществления девятого аспекта молекула нуклеиновой кислоты, включающая молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую CH1-домен константной области тяжёлой цепи антитела, слита своим 3’-концом с 5’-концом молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей белок gIII нитчатого фага M13.
В некоторых вариантах осуществления девятого аспекта геном устойчивости является ген устойчивости к антибиотику.
В некоторых вариантах осуществления девятого аспекта ген устойчивости выбран из группы, состоящей из: гена устойчивости к хлорамфениколу (гена CmR), гена устойчивости к ампициллину (гена Ampr), гена устойчивости к канамицину (гена KaR) и гена устойчивости к тетрациклину (гена TetR).
В некоторых вариантах осуществления девятого аспекта фаговой интегразой является тирозининтеграза.
В некоторых вариантах осуществления девятого аспекта фаговой интегразой является интеграза фага лямбда.
В некоторых вариантах осуществления девятого аспекта фаговой интегразой является индуцибельно экспрессируемая или конститутивно экспрессируемая интеграза.
В некоторых вариантах осуществления девятого аспекта фаговой интегразой является индуцибельно экспрессируемая интеграза.
В некоторых вариантах осуществления девятого аспекта рекомбинантной клеткой является прокариотическая клетка.
В некоторых вариантах осуществления девятого аспекта рекомбинантной клеткой является E. coli.
В некоторых вариантах осуществления девятого аспекта рекомбинантной клеткой является генно-инженерная бактерия.
Согласно десятому аспекту, в настоящей заявке предложен способ получения библиотеки Fab-фрагментов антител, при котором осуществляют перенос первой плазмиды и второй плазмиды в экспрессирующую фаговую интегразу клетку; причем
первая плазмида содержит элемент экспрессии VH-CH1 тяжелой цепи антитела и первый сайт рекомбинации;
вторая плазмида содержит элемент экспрессии VH-CH1 легкой цепи антитела и второй сайт рекомбинации; при этом
первый сайт рекомбинации отличен от второго сайта рекомбинации.
В некоторых вариантах осуществления десятого аспекта осуществляют перенос множества первых плазмид в экспрессирующую фаговую интегразу клетку, причем множество первых плазмид несут разные элементы экспрессии VH-CH1 тяжелой цепи антитела и имеют идентичный первый сайт рекомбинации.
В некоторых вариантах осуществления десятого аспекта осуществляют перенос множества вторых плазмид в экспрессирующую фаговую интегразу клетку, причем множество вторых плазмид несут разные элементы экспрессии VH-CH1 легкой цепи антитела и имеют идентичный второй сайт рекомбинации.
В некоторых вариантах осуществления десятого аспекта перенос первой плазмиды и/или второй плазмиды в экспрессирующую фаговую интегразу клетку включает этапы, на которых:
(1) осуществляют перенос первой плазмиды и/или второй плазмиды в компетентную клетку;
(2) инфицируют полученную на этапе (1) компетентную клетку хелперным фагом для конструирования фаговой библиотеки; и
(3) Осуществляют перенос полученной на этапе (2) фаговой библиотеки в экспрессирующую фаговую интегразу клетку.
В некоторых вариантах осуществления десятого аспекта компетентной клеткой является прокариотическая клетка.
В некоторых вариантах осуществления десятого аспекта компетентная клетка не экспрессирует фаговую интегразу.
В некоторых вариантах осуществления десятого аспекта хелперным фагом является хелперный фаг M13.
В некоторых вариантах осуществления десятого аспекта первая плазмида и/или вторая плазмида является фагмидой.
В некоторых вариантах осуществления десятого аспекта первая плазмида и вторая плазмида имеют разные ориджины репликации.
В некоторых вариантах осуществления десятого аспекта ориджин репликации выбран из группы, состоящей из одного или нескольких из ориджина репликации pBR, ориджина репликации CDF, ориджина репликации нитчатого фага M13 (ориджина репликации f1) и ориджина репликации p15A.
В некоторых вариантах осуществления десятого аспекта первый сайт рекомбинации и второй сайт рекомбинации являются сайтами для интеграции фага в геноме фага и бактерии-хозяина соответственно.
В некоторых вариантах осуществления десятого аспекта первый сайт рекомбинации является attP-сайтом, при этом второй сайт рекомбинации является attB-сайтом.
В некоторых вариантах осуществления десятого аспекта первый сайт рекомбинации и второй сайт рекомбинации расположены на поликлональных сайтах ферментного расщепления первой плазмиды и второй плазмиды соответственно.
В некоторых вариантах осуществления десятого аспекта константная область лёгкой цепи (CL-область) антитела представляет собой константную область легкой цепи каппа человека или константную область легкой цепи лямбда человека.
В некоторых вариантах осуществления десятого аспекта CH1-домен константной области тяжёлой цепи антитела относится к подтипу IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4.
В некоторых вариантах осуществления десятого аспекта первая плазмида и/или вторая плазмида содержит кодирующую ген устойчивости область.
В некоторых вариантах осуществления десятого аспекта ген устойчивости выбран из группы, состоящей из: гена устойчивости к хлорамфениколу (гена CmR), гена устойчивости к ампициллину (гена Ampr), гена устойчивости к канамицину (гена KaR) и гена устойчивости к тетрациклину (гена TetR).
В некоторых вариантах осуществления десятого аспекта фаговой интегразой является тирозининтеграза.
В некоторых вариантах осуществления десятого аспекта фаговой интегразой является интеграза фага лямбда.
В некоторых вариантах осуществления десятого аспекта фаговой интегразой является индуцибельно экспрессируемая или конститутивно экспрессируемая интеграза.
В некоторых вариантах осуществления десятого аспекта фаговой интегразой является индуцибельно экспрессируемая интеграза.
В некоторых вариантах осуществления десятого аспекта экспрессирующей фаговую интегразу клеткой является прокариотическая клетка.
В некоторых вариантах осуществления десятого аспекта экспрессирующей фаговую интегразу клеткой является E. coli.
В некоторых вариантах осуществления десятого аспекта экспрессирующей фаговую интегразу клеткой является генно-инженерная бактерия.
Согласно одиннадцатому аспекту, в настоящей заявке предложено применение комбинации плазмид по седьмому аспекту, рекомбинантной системы по восьмому аспекту или рекомбинантной клетки по девятому аспекту в производстве библиотеки Fab-фрагментов антител.
ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фиг. 1 схематически изображает структуру фагмидного вектора pHGDisn-attP-site-new.
Фиг. 2 схематически изображает структуру прокариотического экспрессионного вектора pHKb-attB-site-new.
На Фиг. 3 представлены результаты оценки по методу ELISA (от англ. enzyme-linked immunosorbent assay – фермент-связанное иммуносорбентное исследование) активности связывания рекомбинантных моноклональных антител к F-белку РСВ (R3B1h1, R22B1 и антитела положительного контроля) с RSV-DS-Cav1-A (Вставка A) и RSV-DS-Cav1-B (Вставка B).
Фиг. 4 представлены результаты оценки по методу ELISA способности моноклональных антител к F-белку РСВ (R3B1h1, R22B1 и клесровимаба) блокировать связывание фагов к F-белку РСВ с RSV-DS-Cav1-B; где на Вставках A-C представлены результаты оценки способности R3B1h1, R22B1 и клесровимаба блокировать связывание очищенного фага к F-белку РСВ с RSV-DS-Cav1-B соответственно.
На Фиг. 5 представлены результаты быстрого теста на ингибирование флуоресцентного свечения (RFFIT-теста, от англ. Rapid Fluorescent Focus Inhibition Test), выявляющего способность моноклональных антител к F-белку РСВ ингибировать заражение клеток Hep-2 штаммом A2 РСВ.
Фиг. 6 представлены результаты RFFIT-теста, выявляющего способность моноклональных антител к F-белку РСВ ингибировать заражение клеток Hep-2 штаммом 18537 РСВ.
Фиг. 7 представлены результаты ингибирования моноклональными антителами к F-белку РСВ заражения клеток Hep-2 РСВ, выделенным из клинических образцов.
ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
SEQ ID NO:1 представляет нуклеотидную последовательность, полученную на основе Escherichia coli, кодирующую промотор гена устойчивости к хлорамфениколу (Cat-промотор).
SEQ ID NO:2 представляет нуклеотидную последовательность, полученную на основе фага лямбда, нацеленного на Escherichia, кодирующую attP-сайт интеграции.
SEQ ID NO:3 представляет нуклеотидную последовательность, полученную на основе E. coli, кодирующую ориджин репликации CDF.
SEQ ID NO:4 представляет нуклеотидную последовательность, полученную на основе E. coli, кодирующую attB-сайт интеграции.
SEQ ID NO:5 представляет нуклеотидную последовательность, полученную на основе E. coli, кодирующую ген устойчивости к хлорамфениколу.
SEQ ID NO:6 представляет нуклеотидную последовательность, полученную на основе E. coli, кодирующую экспрессирующий ген полной устойчивости к ампициллину элемент.
SEQ ID NO:7 представляет нуклеотидную последовательность, полученную на основе фага лямбда, нацеленного на Escherichia, кодирующую элемент, экспрессирующий индуцибельную интегразу фага лямбда лактозного оперона.
SEQ ID NO:8 представляет нуклеотидную последовательность, кодирующую attL-сайт рекомбинации.
SEQ ID NO:9 представляет нуклеотидную последовательность, кодирующую attR-сайт рекомбинации.
SEQ ID NO:10 представляет аминокислотную последовательность F-белка штамма A2 подтипа A РСВ.
SEQ ID NO:11 представляет аминокислотную последовательность F-белка штамма 18537 подтипа B РСВ.
SEQ ID NO:12 представляет аминокислотную последовательность F-белка мутантной структуры RSV-DS-Cav1-A с DS-Cav1 до слияния.
SEQ ID NO:13 представляет аминокислотную последовательность F-белка мутантной структуры RSV-DS-Cav1-B с DS-Cav1 до слияния.
SEQ ID NO:14 представляет аминокислотную последовательность гистидиновой метки.
SEQ ID NO:15 представляет аминокислотную последовательность константной области тяжёлой цепи человека (homo sapiens) подтипа IgG1.
SEQ ID NO:16 представляет аминокислотную последовательность константной области тяжёлой цепи мутантного IgG1-YTE человека (Homo sapiens) подтипа IgG1.
SEQ ID NO:17 представляет аминокислотную последовательность константной области тяжёлой цепи мыши (Mus musculus) подтипа IgG2a.
SEQ ID NO:18 представляет аминокислотную последовательность константной области лёгкой цепи подтипа каппа человека (Homo sapiens).
SEQ ID NO:19 представляет аминокислотную последовательность константной области лёгкой цепи подтипа лямбда человека (Homo sapiens).
SEQ ID NO:20 представляет аминокислотную последовательность константной области лёгкой цепи подтипа каппа мыши (Mus musculus).
SEQ ID NO:21 представляет аминокислотную последовательность константной области лёгкой цепи подтипа лямбда мыши (Mus musculus).
SEQ ID NO:22 представляет аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного моноклонального антитела к РСВ паливизумаб (Hu1129).
SEQ ID NO:23 представляет аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи гуманизированного моноклонального антитела к РСВ паливизумаб (Hu1129).
SEQ ID NO:24 представляет аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи полностью человеческого моноклонального антитела к РСВ нирсевимаб (MEDI8897).
SEQ ID NO:25 представляет аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи полностью человеческого моноклонального антитела к РСВ нирсевимаб (MEDI8897).
SEQ ID NO:26 представляет аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи полностью человеческого моноклонального антитела к РСВ клесровимаб (RB1).
SEQ ID NO:27 представляет аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи полностью человеческого моноклонального антитела к РСВ клесровимаб (RB1).
SEQ ID NO:28 представляет аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи Fab-антитела R3B1h1 к F-белку РСВ.
SEQ ID NO:29 представляет аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи Fab-антитела R3B1h1 к F-белку РСВ.
SEQ ID NO:30 представляет аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи Fab-антитела R22B1 к F-белку РСВ.
SEQ ID NO:31 представляет аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи Fab-антитела R22B1 к F-белку РСВ.
SEQ ID NO:32-34 представляет аминокислотные последовательности HCDR1, HCDR2 и HCDR3 вариабельной области тяжелой цепи Fab-антитела R3B1h1 к F-белку РСВ соответственно.
SEQ ID NO:35-37 представляет аминокислотные последовательности LCDR1, LCDR2 и LCDR3 вариабельной области легкой цепи Fab-антитела R3B1h1 к F-белку РСВ соответственно.
SEQ ID NO:38-40 представляет аминокислотные последовательности HCDR1, HCDR2 и HCDR3 вариабельных областей тяжелой цепи Fab-антитела R22B1 к F-белку РСВ соответственно.
SEQ ID NO:35, 36,43 представляет аминокислотные последовательности LCDR1, LCDR2 и LCDR3 вариабельных областей легкой цепи Fab-антитела R22B1 к F-белку РСВ соответственно.
SEQ ID NO:44 представляет нуклеотидную последовательность, полученную на основе E. coli, кодирующую ориджин репликации pBR.
SEQ ID NO:45 представляет нуклеотидную последовательность, полученную на основе фага f1, кодирующую ориджин репликации f1.
SEQ ID NO:46 представляет нуклеотидную последовательность, полученную на основе фага M13, кодирующую белок gIII нитчатого фага M13.
ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Интеграция специфических рекомбинантов и расщепление целевой нуклеотидной последовательности in vivo и in vitro могут быть достигнуты генно-инженерными средствами с использованием специфической рекомбинантной системы или рекомбинантной клетки с интегразой фага лямбда (лямбда-интегразой). По данным литературы, специфическая рекомбинация плазмид для экспрессии легкой цепи антитела и плазмид для экспрессии тяжелой цепи антитела в клетках может быть достигнута с помощью генно-инженерных бактерий, экспрессирующих лямбда-интегразу, путем тепловой индукции с получением полной плазмиды, экспрессирующей функциональный Fab-фрагмент10. При применении технологии гомологической рекомбинации «Гейтвэй» (Gateway) компании «Термо Фишер» (Thermo Fisher) на основе принципа специфической рекомбинация интегразы фага лямбда, эффективность рекомбинации in vitro может достигать 95% без необходимости выполнения таких этапов традиционного клонирования генов, как расщепление и лигирование. Данная технология используется для создания набора «Гейтвэй» для конструирования библиотеки кДНК с разнообразием 1.0E+7.
Изобретение по настоящей заявке позволяет преодолеть недостаток, состоящий в недостаточной эффективности трансформации ДНК, при конструировании библиотеки антител за счет эффективного внедрения фага с помощью рекомбинантной системы или рекомбинантной клетки с интегразой фага лямбда. Внедрение, в частности, элемента экспрессии VH-CH1 тяжелой цепи, позволяет индуцировать E.coli с плазмидами, экспрессирующими лямбда-интегразу и содержащими элемент экспрессии легкой цепи антитела, и получить библиотеку Fab-антител большого размера (более 1.0E+12) путем специфической рекомбинации элемента экспрессии тяжелой цепи (например, элемента экспрессии VH-CH1 тяжелой цепи) антитела и элемента экспрессии легкой цепи антитела с использованием лямбда-интегразы in vivo и выполнить скрининг на устойчивость к антибиотикам с использованием фага с упакованным в нем элементом экспрессии тяжелой цепи (например, элементом экспрессии VH-CH1 тяжелой цепи) антитела для внедрения E.coli, могущей индуцировать экспрессию лямбда-интегразы и содержащей плазмиду, содержащую элемент экспрессии легкой цепи антитела.
Авторы предлагаемого изобретения использовали сконструированную библиотеку Fab-антител, речь о которой шла выше, для скрининга на новые Fab-антитела к РСВ. Согласно различным аспектам изобретения по настоящей заявке, предложены новое антитело к РСВ, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело, вектор, содержащий такую молекулу нуклеиновой кислоты, клетка-хозяин, содержащая такую молекулу нуклеиновой кислоты или такой вектор, композиция, содержащая антитело, способ получения препарата и очистки антитела, а также варианты медицинского и биологического применения такого антитела. В соответствии с аминокислотными последовательностями вариабельных областей антитела, предложенного в настоящей заявке, может быть получена молекула полноразмерного антитела в качестве лекарственного средства для профилактики или лечения вызванных РСВ заболеваний.
За исключением особо оговоренных случаев, изобретения по настоящей заявке могут быть реализованы с помощью методик, известных в областях молекулярной биологии, микробиологии, цитологии, биохимии и иммунологии.
За исключением особо оговоренных случаев, термины в настоящей заявке используются в их общепринятых значениях, понятных специалистам в данной области техники.
ОПРЕДЕЛЕНИЯ
В настоящем документе понятие «сайт рекомбинации» означает сайт для интеграции фага в геноме фага и геноме бактерии. В некоторых вариантах осуществления предлагаемого изобретения первый сайт рекомбинации и второй сайт рекомбинации может представлять собой сайт для интеграции фага в геноме фага и бактерии-хозяина соответственно, в том числе – когда первый сайт рекомбинации является сайтом для интеграции фага в геноме фага, при этом второй сайт рекомбинации является сайтом для интеграции фага в геноме бактерий-хозяев фага; или когда второй сайт рекомбинации является сайтом для интеграции фага в геноме фага, а первый сайт рекомбинации является сайтом для интеграции фага в геноме бактерии-хозяина фага.
В настоящем документе понятие «плазмида» означает молекулу ДНК, кроме хромосомы (или нуклеоида), в организме, например – бактерий, дрожжей, актиномицетов и т.п. Это кольцевая двухнитевая молекула ДНК, находящаяся в цитоплазме (за исключением дрожжей, где 2-микрометровая плазмида дрожжей находится в ядре), способная к автономной репликации так, что постоянное число копий также сохраняется в потомство, и экспрессирующая генетическую информацию, которую она несет. В настоящем документе понятие «плазмида» включает в себя значения «бактериальная плазмида», «фагмида» и т.п. «Бактериальная плазмида» - это вектор, широко используемый в методах рекомбинации ДНК, а также в качестве средства доставки полезного экзогенного гена в клетку-реципиент для пролиферации и экспрессии генно-инженерными средствами. «Фагмида» - это вектор, сформированный путем создания комбинации плазмидного вектора с однонитевым фаговым вектором, содержащий последовательность упаковки однонитевого фага, репликон, плазмидный репликон, сайт клонирования, маркёрный ген и т.п. В клетках-хозяевах, в частности, E. coli, она способна к репликации так же, как и обычные двухцепочечные плазмидные молекулы ДНК, при этом, в присутствии хелперных фагов, она способна к репликации по модели «катящегося кольца» с образованием одноцепочечной ДНК, которая может быть упакована в фаговую частицу.
В настоящем документе понятие «attP-сайт интеграции» означает определенную последовательность в фаговой ДНК с коровой областью из 15 пар нуклеотидных оснований (п.н.) с последовательностью, идентичной последовательности хозяйской хромосомы.
В настоящем документе понятие «attB-сайт интеграции» означает сайт интеграции в геноме бактерии с коровой областью из 15 п.н. с последовательностью, идентичной соответствующей последовательности гена фага.
В настоящем документе понятие «интеграза фага» означает белок с активностью топоизомеразы 1-го типа, специфически связывающийся с attP-сайтом и attB-сайтом интеграции и являющийся обязательным для интеграции фага в геном хозяина путем сайт-специфической рекомбинации.
В настоящем документе понятие «ориджин репликации» означает сайт начала репликации плазмиды, состоящий из репликона ориджина (ORI) и соответствующего регуляторного элемента.
В настоящем документе понятие «антитело» означает иммуноглобулиновую молекулу, способную к специфическому связыванию с мишенью через по меньшей мере один сайт распознавания антигена в вариабельной области иммуноглобулиновой молекулы. В число мишеней входят, помимо прочих, углеводы, полинуклеотиды, липиды, полипептиды и т.п. В контексте настоящего документа, понятие «антитело» включает в себя не только значение «интактное (т.е. полноразмерное) антитело», но и его антигенсвязывающий фрагмент (например, Fab-фрагмент, Fab’-фрагмент, F(ab’)2-фрагмент или Fv-фрагмент), его вариант, белок слияния, содержащий части антитела, гуманизированное антитело, химерное антитело, диатело, линейное антитело, одноцепочечный вариабельный фрагмент, мультиспецифическое антитело (например, биспецифическое антитело), а также любые модифицированные конфигурации иммуноглобулиновой молекулы, содержащие желаемый сайт распознавания специфического антигена, в том числе – гликолизированный вариант антитела, вариант аминокислотной последовательности антитела и ковалентно-модифицированное антитело.
Интактное или полноразмерное антитело обычно содержит две тяжелые цепи и две легкие цепи. Каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH-область), а также первую, вторую и третью константные области (CH1, CH2 и CH3). Каждая легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи (VL-область) и константную область (CL-область). Полноразмерное антитело может быть антителом любого типа, в частности – антителом типа IgD, IgE, IgG, IgA или IgM (или их подтипа), но может не относится к какому-либо определенному типу. Иммуноглобулины относят к тому или иному типу в зависимости от аминокислотных последовательностей константных доменов их тяжелых цепей. Как правило, иммуноглобулины относятся к пяти основным типам, т.е. IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, некоторые из которых можно, в свою очередь, подразделить на подтипы (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2. Константные домены тяжелых цепей, относящиеся к отдельным типам иммуноглобулинов, обозначаются α, δ, ε, γ и μ соответственно. Субчастицы и трехмерные структуры иммуноглобулинов различных типов хорошо известны.
В настоящем документе понятие «антигенсвязывающий фрагмент» или «антигенсвязывающая часть» означает часть или область интактной молекулы антитела, отвечающую за связывание антигена. Антигенсвязывающий домен может включать в себя вариабельную область тяжелой цепи (VH-область), вариабельную область легкой цепи (VL-область) или и ту, и другую. И VH-область, и VL-область обычно содержит три определяющих комплементарность участка, т.е. CDR1, CDR2 и CDR3.
Специалистам в данной области техники хорошо известно, что определяющие комплементарность участки (CDR-участки, обычно – CDR1, CDR2 и CDR3) являются участками вариабельной области, в наибольшей степени влияющими на аффинность и специфичность антитела. Аминокислотные последовательности CDR-участков VH-области или VL-области определяют по двум общепринятым номенклатурам: номенклатуре Чотиа и номенклатуре Кэбота11-13. В случае аминокислотных последовательностей вариабельных областей того или иного антитела, аминокислотные последовательности CDR-участков в VH-области и аминокислотные последовательности VL-области могут быть определены по номенклатуре Чотиа или по номенклатуре Кэбота. В одном из вариантов осуществления предлагаемого изобретения аминокислотные последовательности CDR-участков определены по номенклатуре Кэбота.
В случае аминокислотных последовательностей вариабельных областей того или иного антитела, аминокислотные последовательности CDR-участков в аминокислотных последовательностях вариабельных областей могут быть определены различными методами, например, с помощью сетевой программы «Abysis» (http://www.abysis.org/).
В число примеров антигенсвязывающих фрагментов входят, помимо прочих: (1) Fab-фрагмент, которым может быть моновалентный фрагмент антитела с цепью типа VL-CL и цепью типа VH-CH1; (2) F(ab’)2-фрагмент, который может представлять собой бивалентный фрагмент с двумя Fab’-фрагментами, связанными дисульфидным мостиком шарнирной области (т.е. димер Fab’); (3) Fv-фрагмент с VL- и VH-доменами в одном плече антитела; (4) одноцепочечный Fv-фрагмент (scFv-фрагмент), могущий представлять собой единственную полипептидную цепь, состоящую из VH-домена и VL-домена, связанных полипептидным линкером; и (5) (scFv-фрагмент)2, могущий содержать два VH-домена, связанных пептидным линкером и два VL-домена, соединенных с двумя VH-доменами дисульфидным мостиком.
В некоторых частных вариантах осуществления предлагаемого изобретения антитело представляет собой Fab-фрагмент, т.е. моновалентный фрагмент с цепью типа VL-CL и цепью типа VH-CH1.
В настоящем документе понятие «Fd-фрагмент» означает фрагмент, состоящий из вариабельной области тяжелой цепи (VH-области) антитела и первой константной области (CH1) тяжелой цепи антитела.
В настоящем документе понятие «специфическое связывание» означает реакцию неслучайного связывания между двумя молекулами, например, связывание антитела с антигенным эпитопом.
В настоящем документе понятие «нейтрализующее антитело» означает антитело, способное к связыванию с антигеном на поверхности патогенного микроорганизма, тем самым препятствуя инвазии клетки путем предотвращения прикрепления патогенного микроорганизма к рецептору клетки-мишени или предотвращения слияния вирусной оболочки с клеточной мембраной.
В настоящем документе понятие «моноклональное антитело» означает антитело, полученное из по существу однородной популяции антител, т.е. из популяции, в которой образующие ее антитела являются одинаковыми, за исключением естественных мутаций, которые могут присутствовать у небольшого числа индивидуумов.
Согласно первому аспекту, в настоящей заявке предложено антитело к респираторно-синцитиальному вирусу (РСВ), содержащее вариабельную область тяжёлой цепи, содержащую HCDR1, HCDR2 и HCDR3, и вариабельную область легкой цепи, содержащую LCDR1, LCDR2 и LCDR3, причем
аминокислотная последовательность HCDR1 представлена в SEQ ID NO:32, аминокислотная последовательность HCDR2 представлена в SEQ ID NO:33, аминокислотная последовательность HCDR3 представлена в SEQ ID NO:34, аминокислотная последовательность LCDR1 представлена в SEQ ID NO:35, аминокислотная последовательность LCDR2 представлена в SEQ ID NO:36, и аминокислотная последовательность LCDR3 представлена в SEQ ID NO:37; или
аминокислотная последовательность HCDR1 представлена в SEQ ID NO:38, аминокислотная последовательность HCDR2 представлена в SEQ ID NO:39, аминокислотная последовательность HCDR3 представлена в SEQ ID NO:40, аминокислотная последовательность LCDR1 представлена в SEQ ID NO:35, аминокислотная последовательность LCDR2 представлена в SEQ ID NO:36, и аминокислотная последовательность LCDR3 представлена в SEQ ID NO:43;
причем аминокислотные последовательности определяющих комплементарность участков тяжелой цепи и определяющих комплементарность участков легкой цепи определены по номенклатуре Кэбота.
В некоторых вариантах осуществления первого аспекта аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела представлена в SEQ ID NO: 28 или 30.
В некоторых вариантах осуществления первого аспекта аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела представлена в SEQ ID NO: 29 или 31.
В некоторых вариантах осуществления первого аспекта аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела представлена в SEQ ID NO: 28, при этом аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела представлена в SEQ ID NO: 29; или
аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела представлена в SEQ ID NO: 30, при этом аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела представлена в SEQ ID NO: 31.
Согласно второму аспекту, в настоящей заявке предложено антитело к респираторно-синцитиальному вирусу (РСВ), причем аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности, определенной в SEQ ID NO: 28 или 30, при этом аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности, определенной в SEQ ID NO: 29 или 31.
В некоторых вариантах осуществления второго аспекта аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентична аминокислотной последовательности, определенной в SEQ ID NO: 28 или 30.
В некоторых вариантах осуществления второго аспекта аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентична аминокислотной последовательности, определенной в SEQ ID NO: 29 или 31.
В некоторых вариантах осуществления второго аспекта аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела отлична от аминокислотной последовательности, определенной в любой из SEQ ID NO: 28 и 30, примерно на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот, замененных, удаленных и/или добавленных.
В некоторых вариантах осуществления второго аспекта аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела отлична от аминокислотной последовательности, определенной в любой из SEQ ID NO: 29 и 31, примерно на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот, замененных, удаленных и/или добавленных.
В некоторых вариантах осуществления второго аспекта C-концевая или N-концевая область аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 28 и 30, также может быть укорочена примерно на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25 или более аминокислот, при этом полученные в результате аминокислотные последовательности сохраняют функцию, аналогичную функции вариабельной области тяжелой цепи антитела.
В некоторых вариантах осуществления второго аспекта 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25 или более аминокислот также могут быть добавлены к C-концевой или N-концевой области аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 28 и 30, при этом полученные в результате аминокислотные последовательности сохраняют функцию, аналогичную функции вариабельной области тяжелой цепи антитела.
В некоторых вариантах осуществления второго аспекта 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25 или более аминокислот также могут быть добавлены или удалены в области, не являющейся C-концом или N-концом аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 28 и 30, при условии, что измененные аминокислотные последовательности по существу сохранят функцию, аналогичную функции вариабельной области тяжелой цепи антитела.
В некоторых вариантах осуществления второго аспекта C-концевая или N-концевая область аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 29 и 31, также может быть укорочена примерно на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25 или более аминокислот, при этом полученные в результате аминокислотные последовательности сохраняют функцию, аналогичную функции вариабельной области легкой цепи антитела.
В некоторых вариантах осуществления второго аспекта 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25 или более аминокислот также могут быть добавлены к C-концевой или N-концевой области аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 29 и 31, при этом полученные в результате аминокислотные последовательности сохраняют функцию, аналогичную функции вариабельной области легкой цепи антитела.
В некоторых вариантах осуществления второго аспекта 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25 или более аминокислот также могут быть добавлены или удалены в области, не являющейся C-концом или N-концом аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 29 и 31, при условии, что измененные аминокислотные последовательности по существу сохранят функцию, аналогичную функции вариабельной области легкой цепи антитела.
В некоторых вариантах осуществления первого или второго аспектов антитело является нейтрализующим антителом.
В некоторых вариантах осуществления первого или второго аспектов антитело может быть способно к связыванию с F-белком респираторно-синцитиального вируса (РСВ) человека.
В некоторых частных вариантах осуществления первого или второго аспектов F-белок респираторно-синцитиального вируса (РСВ) человека является рекомбинантным F-белком РСВ человека, в частности, рекомбинантным F-белком РСВ человека, определенным в SEQ ID NO: 12 или 13.
В некоторых вариантах осуществления первого или второго аспектов антитело представляет собой Fab-фрагмент, полное антитело, F(ab’)2-фрагмент или одноцепочечный Fv-фрагмент (scFv-фрагмент).
В некоторых частных вариантах осуществления первого или второго аспектов антитело представляет собой Fab-фрагмент.
В некоторых вариантах осуществления первого или второго аспектов антитело является моноклональным антителом.
В некоторых вариантах осуществления первого или второго аспектов антитело содержит константную область тяжёлой цепи подтипа IgG1, подтипа IgG2 или подтипа IgG4.
В некоторых вариантах осуществления первого или второго аспектов константная область тяжёлой цепи содержит Fc-фрагмент константной области тяжёлой цепи подтипа IgG1, при этом аминокислоты в положениях 252, 254, 256 последовательности Fc-фрагмента представляют собой соответственно Y, T и E, причем положения аминокислот константной области антитела определены согласно EU-нумерации.
В некоторых вариантах осуществления первого или второго аспектов антитело содержит константную область легкой цепи подтипа каппа или подтипа лямбда.
Согласно третьему аспекту, в настоящей заявке предложена молекула нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело по первому или второму аспекту.
В некоторых вариантах осуществления по третьему аспекту, молекула нуклеиновой кислоты функционально связана с регуляторной последовательностью нуклеиновой кислоты, которая может быть распознана клеткой-хозяином, трансформированной вектором.
Согласно четвертому аспекту, в настоящей заявке предложена фармацевтическая композиция, содержащая антитело по первому или второму аспекту и фармацевтически приемлемые вспомогательное вещество, разбавитель или носитель.
В некоторых вариантах осуществления четвертого аспекта фармацевтическая композиция предназначена для профилактики или лечения вызванного РСВ заболевания.
В некоторых вариантах осуществления четвертого аспекта вызванным РСВ заболеванием является инфекционное заболевание дыхательных путей, в частности, бронхиолит и пневмония.
В некоторых вариантах осуществления четвертого аспекта фармацевтическая композиция может дополнительно содержать что-либо одно или более из следующего: скользящее вещество, в частности, тальк, стеарат магния и минеральное масло; смачивающее вещество; эмульгатор; суспендирующее средство; консервант, в частности, бензойную кислоту, сорбиновую кислоту и пропионат кальция; подсластитель и/или вкусовой агент и т.п.
В некоторых вариантах осуществления четвертого аспекта фармацевтические композиции по настоящей заявке могут быть изготовлены в лекарственной форме таблетки, драже, порошка, пастилки для рассасывания, эликсира, суспензии, эмульсии, раствора, сиропа, суппозитория или капсулы и т.п.
В некоторых вариантах осуществления четвертого аспекта фармацевтические композиции по настоящей заявке могут вводиться любым физиологически приемлемым путем, в том числе, помимо прочего, перорально, парентерально, интраназально, ректально, интраперитонеально, путем интраваскулярной инъекции, подкожно, трансдермально, ингаляционно и т.п.
В некоторых вариантах осуществления четвертого аспекта фармацевтическая композиция для терапевтического применения может быть изготовлена в лекарственной форме с возможностью хранения в виде лиофилизированного состава или водного раствора путем смешивания реагента желаемой чистоты с соответствующим фармацевтически приемлемым носителем, вспомогательным веществом и т.п.
Согласно пятому аспекту, в настоящей заявке предложено применение антитела по первому или второму аспекту, молекулы нуклеиновой кислоты по третьему аспекту или фармацевтической композиции по четвертому аспекту в производстве медикамента для профилактики или лечения вызванных РСВ заболеваний.
В некоторых вариантах осуществления пятого аспекта вызванным РСВ заболеванием является инфекционное заболевание дыхательных путей, в частности, бронхиолит и пневмония.
Согласно шестому аспекту, в настоящей заявке предложен способ профилактики или лечения вызванного РСВ заболевания, включающий этап, на котором вводят нуждающемуся в этом субъекту антитело по первому или второму аспекту или фармацевтическую композицию по четвертому аспекту.
В некоторых вариантах осуществления шестого аспекта вызванным РСВ заболеванием является инфекционное заболевание дыхательных путей, в частности, бронхиолит и пневмония.
Согласно седьмому аспекту, в настоящей заявке предложена комбинация плазмид для экспрессии библиотеки Fab-фрагментов антител, содержащая первую плазмиду и вторую плазмиду, причем
первая плазмида содержит элемент экспрессии VH-CH1 тяжелой цепи антитела и первый сайт рекомбинации;
вторая плазмида содержит элемент экспрессии VH-CH1 легкой цепи антитела и второй сайт рекомбинации; при этом
первый сайт рекомбинации отличен от второго сайта рекомбинации.
В некоторых вариантах осуществления седьмого аспекта комбинация плазмид содержит множество первых плазмид, при этом множество первых плазмид несут разные элементы экспрессии VH-CH1 тяжелой цепи антитела и имеют идентичный первый сайт рекомбинации.
В некоторых вариантах осуществления седьмого аспекта комбинация плазмид содержит множество вторых плазмид, при этом множество вторых плазмид несут разные элементы экспрессии VH-CH1 легкой цепи антитела и имеют идентичный второй сайт рекомбинации.
Согласно восьмому аспекту, в настоящей заявке предложена рекомбинантная система для экспрессии библиотеки Fab-фрагментов антител, содержащая первую плазмиду, вторую плазмиду и экспрессирующую фаговую интегразу клетку; причем
первая плазмида содержит элемент экспрессии VH-CH1 тяжелой цепи антитела и первый сайт рекомбинации;
вторая плазмида содержит элемент экспрессии VH-CH1 легкой цепи антитела и второй сайт рекомбинации; при этом
первый сайт рекомбинации отличен от второго сайта рекомбинации.
В некоторых вариантах осуществления восьмого аспекта рекомбинантная система содержит множество первых плазмид, при этом множество первых плазмид несут разные элементы экспрессии VH-CH1 тяжелой цепи антитела и имеют идентичный первый сайт рекомбинации.
В некоторых вариантах осуществления восьмого аспекта рекомбинантная система содержит множество вторых плазмид, при этом множество вторых плазмид несут разные элементы экспрессии VH-CH1 легкой цепи антитела и имеют идентичный второй сайт рекомбинации.
В некоторых вариантах осуществления восьмого аспекта первая плазмида, вторая плазмида и экспрессирующая фаговую интегразу клетка существуют независимо друг от друга, или по меньшей мере одна из первой плазмиды и второй плазмиды была введена в экспрессирующую фаговую интегразу клетку.
В некоторых частных вариантах осуществления восьмого аспекта вторая плазмида была введена в экспрессирующую фаговую интегразу клетку.
Согласно девятому аспекту, в настоящей заявке предложена рекомбинантная клетка для экспрессии библиотеки Fab-фрагментов антител, содержащая первую плазмиду, вторую плазмиду и экспрессирующая фаговую интегразу; причем
первая плазмида содержит элемент экспрессии VH-CH1 тяжелой цепи антитела и первый сайт рекомбинации;
вторая плазмида содержит элемент экспрессии VH-CH1 легкой цепи антитела и второй сайт рекомбинации; при этом
первый сайт рекомбинации отличен от второго сайта рекомбинации.
В некоторых вариантах осуществления девятого аспекта рекомбинантная клетка содержит множество первых плазмид, при этом множество первых плазмид несут разные элементы экспрессии VH-CH1 тяжелой цепи антитела и имеют идентичный первый сайт рекомбинации.
В некоторых вариантах осуществления девятого аспекта рекомбинантная клетка содержит множество вторых плазмид, при этом множество вторых плазмид несут разные элементы экспрессии VH-CH1 легкой цепи антитела и имеют идентичный второй сайт рекомбинации.
В некоторых вариантах осуществления девятого аспекта рекомбинантной клеткой является прокариотическая клетка.
В некоторых вариантах осуществления девятого аспекта рекомбинантной клеткой является E. coli.
В некоторых вариантах осуществления девятого аспекта рекомбинантной клеткой является генно-инженерная бактерия.
В некоторых частных вариантах осуществления девятого аспекта рекомбинантной клеткой является мужской штамм E. coli с половым фактором (F-фактором), в частности, штамм TG1.
Согласно десятому аспекту, в настоящей заявке предложен способ получения библиотеки Fab-фрагментов антител, при котором осуществляют перенос первой плазмиды и второй плазмиды в экспрессирующую фаговую интегразу клетку; причем
первая плазмида содержит элемент экспрессии VH-CH1 тяжелой цепи антитела и первый сайт рекомбинации;
вторая плазмида содержит элемент экспрессии VH-CH1 легкой цепи антитела и второй сайт рекомбинации; при этом
первый сайт рекомбинации отличен от второго сайта рекомбинации.
В некоторых вариантах осуществления десятого аспекта осуществляют перенос множества первых плазмид в экспрессирующую фаговую интегразу клетку, причем множество первых плазмид несут разные элементы экспрессии VH-CH1 тяжелой цепи антитела и имеют идентичный первый сайт рекомбинации.
В некоторых вариантах осуществления десятого аспекта осуществляют перенос множества вторых плазмид в экспрессирующую фаговую интегразу клетку, причем множество вторых плазмид несут разные элементы экспрессии VH-CH1 легкой цепи антитела и имеют идентичный второй сайт рекомбинации.
В некоторых вариантах осуществления десятого аспекта перенос первой плазмиды и/или второй плазмиды в экспрессирующую фаговую интегразу клетку включает этапы, на которых:
(1) осуществляют перенос первой плазмиды и/или второй плазмиды в компетентную клетку;
(2) инфицируют полученную на этапе (1) компетентную клетку хелперным фагом для конструирования фаговой библиотеки; и
(3) осуществляют перенос полученной на этапе (2) фаговой библиотеки в экспрессирующую фаговую интегразу клетку.
В некоторых вариантах осуществления десятого аспекта компетентной клеткой является прокариотическая клетка.
В некоторых вариантах осуществления десятого аспекта компетентной клеткой является E. coli.
В некоторых вариантах осуществления десятого аспекта компетентной клеткой является генно-инженерная бактерия.
В некоторых частных вариантах осуществления десятого аспекта компетентной клеткой является мужской штамм E. coli с F-фактором, в частности, штамм TG1.
В некоторых вариантах осуществления десятого аспекта компетентная клетка не экспрессирует фаговую интегразу.
В некоторых вариантах осуществления десятого аспекта хелперным фагом является хелперный фаг M13.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов с седьмого по десятый первая плазмида является фагмидой.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов с седьмого по десятый вторая плазмида является фагмидой.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов с седьмого по десятый первая плазмида и вторая плазмида имеют разные ориджины репликации.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов с седьмого по десятый ориджин репликации выбран из группы, состоящей из одного или нескольких из ориджина репликации pBR, ориджина репликации CDF, ориджина репликации нитчатого фага M13 (ориджина репликации f1) и ориджина репликации p15A.
В некоторых частных вариантах осуществления любого из аспектов с седьмого по десятый первая плазмида содержит ориджин репликации pBR и ориджин репликации f1.
В некоторых частных вариантах осуществления любого из аспектов с седьмого по десятый вторая плазмида содержит ориджин репликации CDF.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов с седьмого по десятый первый сайт рекомбинации и второй сайт рекомбинации являются сайтами для интеграции фага в геноме фага и бактерии-хозяина соответственно.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов с седьмого по десятый первый сайт рекомбинации является attP-сайтом.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов с седьмого по десятый второй сайт рекомбинации является attB-сайтом.
В некоторых частных вариантах осуществления любого из аспектов с седьмого по десятый первый сайт рекомбинации содержит нуклеотидную последовательность, определенную в SEQ ID NO:2, или нуклеотидную последовательность, полученную на основе нуклеотидной последовательности, определенной в SEQ ID NO:2, путем одной или нескольких замен, удалений или добавлений, не изменяющих по существу функцию первого сайта рекомбинации.
В некоторых частных вариантах осуществления любого из аспектов с седьмого по десятый второй сайт рекомбинации содержит нуклеотидную последовательность, определенную в SEQ ID NO:4, или нуклеотидную последовательность, полученную на основе нуклеотидной последовательности, определенной в SEQ ID NO:4, путем одной или нескольких замен, удалений или добавлений, не изменяющих по существу функцию второго сайта рекомбинации.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов с седьмого по десятый число одной или нескольких замен, удалений или добавлений, не изменяющих по существу функцию первого сайта рекомбинации или второго сайта рекомбинации, составляет от 1 до 30, предпочтительно от 1 до 20, более предпочтительно от 1 до 10, причем функция полученной в результате нуклеотидной последовательности по существу остается без изменений по сравнению с функцией первого сайта рекомбинации или второго сайта рекомбинации.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов с седьмого по десятый первая плазмида и вторая плазмида отличны друг от друга.
В некоторых частных вариантах осуществления любого из аспектов с седьмого по десятый первая плазмида является фагмидой, при этом вторая плазмида представляет собой прокариотический экспрессионный вектор (например, бактериальную плазмиду).
В некоторых частных вариантах осуществления любого из аспектов с седьмого по десятый первая плазмида представлена в виде pHGDisn-attP-site-new.
В некоторых частных вариантах осуществления любого из аспектов с седьмого по десятый вторая плазмида представлена в виде pHKb-attB-site-new.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов с седьмого по десятый первый сайт рекомбинации расположен на поликлональном сайте ферментного расщепления первой плазмиды.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов с седьмого по десятый второй сайт рекомбинации расположен на поликлональном сайте ферментного расщепления второй плазмиды.
В некоторых частных вариантах осуществления любого из аспектов с седьмого по десятый первый сайт рекомбинации расположен между сайтами XbaI и KpnI ферментного расщепления плазмиды pHGDisn-attP-site-new.
В некоторых частных вариантах осуществления любого из аспектов с седьмого по десятый второй сайт рекомбинации расположен между сайтами HindIII и BamHI ферментного расщепления плазмиды pHKb-attB-site-new.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов с седьмого по десятый константная область лёгкой цепи (CL-область) антитела представляет собой константную область легкой цепи каппа человека или константную область легкой цепи лямбда человека.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов с седьмого по десятый CH1-домен константной области тяжёлой цепи антитела относится к подтипу IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов с седьмого по десятый первая плазмида и/или вторая плазмида содержит кодирующую ген устойчивости область.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов с седьмого по десятый молекула нуклеиновой кислоты, включающая молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую CH1-домен константной области тяжёлой цепи антитела, слита своим 3’-концом с 5’-концом молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей белок gIII нитчатого фага M13.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов с седьмого по десятый присутствие гена устойчивости облегчает скрининг рекомбинантной системы или рекомбинантной клетки.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов с седьмого по десятый геном устойчивости является ген устойчивости к антибиотику.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов с седьмого по десятый ген устойчивости выбран из группы, состоящей из: гена устойчивости к хлорамфениколу (гена CmR), гена устойчивости к ампициллину (гена Ampr), гена устойчивости к канамицину (гена KaR) и гена устойчивости к тетрациклину (гена TetR).
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов с восьмого по десятый фаговой интегразой является тирозининтеграза.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов с восьмого по десятый тирозининтегразой является интеграза фага лямбда.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов с восьмого по десятый фаговой интегразой является индуцибельно экспрессируемая или конститутивно экспрессируемая интеграза.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов с восьмого по десятый фаговой интегразой является индуцибельно экспрессируемая интеграза.
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов с восьмого по десятый индуцибельная экспрессия осуществляется с применением индуцибельного промотора, в частности, лактозного промотора (Plac) или арабинозного промотора (Para).
В некоторых вариантах осуществления восьмого или десятого аспекта экспрессирующей фаговую интегразу клеткой является прокариотическая клетка.
В некоторых вариантах осуществления восьмого или десятого аспекта экспрессирующей фаговую интегразу клеткой является E. coli.
В некоторых вариантах осуществления восьмого или десятого аспекта экспрессирующей фаговую интегразу клеткой является генно-инженерная бактерия.
В некоторых вариантах осуществления восьмого или десятого аспекта экспрессирующей фаговую интегразу клеткой является мужской штамм E. coli с F-фактором.
В некоторых частных вариантах осуществления восьмого или десятого аспекта экспрессирующей фаговую интегразу клеткой является штамм TG1.
В некоторых частных вариантах осуществления любого из аспектов с седьмого по десятый первая плазмида содержит элемент экспрессии VH-CH1 тяжелой цепи антитела и attP-сайт интеграции; при этом вторая плазмида содержит элемент экспрессии VH-CH1 легкой цепи антитела и attB-сайт интеграции.
В некоторых вариантах осуществления седьмого аспекта первый сайт рекомбинации и второй сайт рекомбинации соответствуют друг другу. Например, если нуклеотидная последовательность первого сайта рекомбинации представлена в SEQ ID NO:2, то нуклеотидная последовательность второго сайта рекомбинации представлена в SEQ ID NO:4.
В некоторых вариантах осуществления восьмого или десятого аспекта существует соответствие между первым сайтом рекомбинации, вторым сайтом рекомбинации, типом интегразы фага и типом клетки, экспрессирующей интегразу фага.
В некоторых вариантах осуществления восьмого или десятого аспекта второй сайт рекомбинации, тип интегразы фага и тип клетки, экспрессирующей интегразу фага, применимые в изобретении по настоящей заявке, могут быть определены, как только будет определен первый сайт рекомбинации.
В некоторых вариантах осуществления восьмого или десятого аспекта первый сайт рекомбинации, тип интегразы фага и тип клетки, экспрессирующей интегразу фага, применимые в изобретении по настоящей заявке, могут быть определены, как только будет определен второй сайт рекомбинации.
В некоторых вариантах осуществления восьмого или десятого аспекта, в случае определения типа интегразы фага, тип клетки, экспрессирующей интегразу фага, применимый в изобретении по настоящей заявке, может быть определен, как только будет определен тип интегразы фага.
В некоторых вариантах осуществления восьмого или десятого аспекта, если нуклеотидная последовательность первого сайта рекомбинации представлена в SEQ ID NO:2, а нуклеотидная последовательность второго сайта рекомбинации представлена в SEQ ID NO:4, то фаговой интегразой является интеграза фага лямбда, при этом экспрессирующей фаговую интегразу клеткой является штамм TG1 E. coli.
В некоторых вариантах осуществления девятого аспекта существует соответствие между первым сайтом рекомбинации, вторым сайтом рекомбинации, типом интегразы фага и типом рекомбинантной клетки.
В некоторых вариантах осуществления девятого аспекта второй сайт рекомбинации, тип интегразы фага и тип рекомбинантной клетки, применимые в изобретении по настоящей заявке, могут быть определены, как только будет определен первый сайт рекомбинации.
В некоторых вариантах осуществления девятого аспекта первый сайт рекомбинации, тип интегразы фага и тип рекомбинантной клетки, применимые в изобретении по настоящей заявке, могут быть определены, как только будет определен второй сайт рекомбинации.
В некоторых вариантах осуществления девятого аспекта тип рекомбинантной клетки, применимый в изобретении по настоящей заявке, может быть определен, как только будет определен тип интегразы фага.
В некоторых вариантах осуществления девятого аспекта, если нуклеотидная последовательность первого сайта рекомбинации представлена в SEQ ID NO:2, а нуклеотидная последовательность второго сайта рекомбинации представлена в SEQ ID NO:4, то фаговой интегразой является интеграза фага лямбда, при этом рекомбинантной клеткой является штамм TG1 E. coli.
В некоторых частных вариантах осуществления десятого аспекта способ получения библиотеки Fab-фрагментов антител может включать этапы, на которых:
(1) осуществляют перенос первой плазмиды (например, множества первых плазмид, в частности, множества фагмид, несущих разные элементы экспрессии VH-CH1 тяжелой цепи антител и идентичный attP-сайт интеграции), в компетентные клетки (например, компетентные клетки штамма TG1);
(2) инфицируют компетентные клетки, полученные на этапе (1), хелперным фагом (например, хелперным фагом M13) для конструирования фаговой библиотеки (например, фаговой библиотеки, включающей множество фагов, несущих разные элементы экспрессии VH-CH1 тяжелой цепи антител и идентичный attP-сайт интеграции);
(3) осуществляют перенос второй плазмиды (например, множества вторых плазмид, несущих разные элементы экспрессии VH-CH1 легкой цепи антител и идентичный attB-сайт интеграции) в клетки, экспрессирующие интегразу фага (например, компетентные клетки штамма TG1, экспрессирующие интегразу фага лямбда);
(4) индуцируют экспрессию клетками, полученными на этапе (3), фаговой интегразы (например, интегразы фага лямбда);
(5) инфицируют клетки, экспрессирующие интегразу фага, полученные на этапе (4), фаговой библиотекой (например, фаговой библиотекой, включающей множество фагов, несущих разные элементы экспрессии VH-CH1 тяжелой цепи антител и идентичный attP-сайт интеграции); и
(6) инфицируют клетки, полученные на этапе (5), хелперным фагом (например, хелперным фагом M13) для конструирования библиотеки Fab-фрагментов антител.
Согласно одиннадцатому аспекту, в настоящей заявке предложено применение комбинации плазмид по седьмому аспекту, рекомбинантной системы по восьмому аспекту или рекомбинантной клетки по девятому аспекту в производстве библиотеки Fab-фрагментов антител.
Согласно прочим аспектам, в настоящей заявке предложен вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело по настоящей заявке, либо его легкую или тяжелую цепь, клетка-хозяин, содержащая такой вектор, и способ получения такого антитела. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты функционально связана с регуляторной последовательностью, которая может быть распознана клетками-хозяевами, трансформированными вектором. В некоторых вариантах осуществления способ получения антитела включает этап, на котором культивируют клетки-хозяева. В некоторых вариантах осуществления способ получения антитела дополнительно включает этап, на котором выделяют антитело из культуральной среды клеток-хозяев.
Кроме того, раскрытое в настоящей заявке специфическое антитело к РСВ может найти применение для обнаружения РСВ в биологической пробе. Методы обнаружения на основе антител хорошо известны в данной области техники, при этом в их число входят, например, методы ELISA, иммуноблотирования, радиоиммунотестирования, иммунофлуоресценции, иммунной преципитации и иные соответствующие методики.
Следует понимать, что приведенное выше детальное описание предназначено исключительно для того, чтобы специалисты в данной области техники могли получить более ясное представление об изобретении по настоящей заявке, но не для того, чтобы ограничить его в каком-либо аспекте. Специалисты в данной области техники смогут внести в раскрытые выше варианты осуществления разнообразные доработки и измененияt.
Примеры
Нижеследующие примеры носят исключительно иллюстративный характер и не предназначены для ограничения объема изобретения по настоящей заявке.
Пример 1: Получение библиотеки полностью человеческих рекомбинантных Fab-фрагментов
Данный пример был реализован на основе патента Китая на изобретение № CN 108251431B, содержание которого включено в настоящую заявку посредством отсылки.
1.1 Конструирование рекомбинантных экспрессионных плазмид, содержащих attB-сайт и attP-сайт интеграции
На основе плазмиды pADG-S сконструировали фагмидный вектор pHGDisn-attP-site-new, содержащий attP-сайт интеграции и экспрессирующий Fd-домен тяжелой цепи (VH-CH1) антитела, путем клонирования фрагмента синтетического рекомбинантного гена, содержащего промотор гена устойчивости к хлорамфениколу (Cat-промотор, с кодирующей последовательностью, определенной в SEQ ID NO: 1) и attP-сайт интеграции (attP1, с кодирующей последовательностью, определенной в SEQ ID NO: 2), в вектор pADG-S с применением расщепления двумя ферментами XbaI и KpnI (Фиг. 1).
На основе плазмиды pADK-S сконструировали прокариотический экспрессионный вектор pHKb-attB-site-new, содержащий attB-сайт интеграции и экспрессирующий легкую цепь антитела, путем клонирования фрагмента синтетического рекомбинантного гена, содержащего ориджин репликации CDF (CDF ori, с кодирующей последовательностью, определенной в SEQ ID NO: 3), attB-сайт интеграции (attB1, с кодирующей последовательностью, определенной в SEQ ID NO: 4), ген устойчивости к хлорамфениколу (CmR-ген, с кодирующей последовательностью, определенной в SEQ ID NO: 5) и экспрессирующий ген полной устройчивости к ампициллину элемент (AmpR-ген, с кодирующей последовательностью, определенной в SEQ ID NO: 6), в вектор pADK-S с применением расщепления двумя ферментами HindIII и BamHI (Фиг. 2).
PHGDisn-attP-site-new и pHKb-attB-site-new имеют разные ориджины репликации и способны к репликации и сосуществованию в пределах одной и той же клетки E. coli. После индукции интегразой фага лямбда (λInt) специфической рекомбинации attP-сайта и attB-сайт интеграции, новообразованная плазмида может экспрессировать хлорамфеникол-ацетил-трансферазу и проявлять устойчивость к хлорамфениколу, так как она содержит промотор гена полной устойчивости к хлорамфениколу и кодирующий ген, тем самым облегчая скрининг рекомбинантных плазмид.
1.2 Получение штамма TG1 E. coli с отредактированным λInt геномом
attL-сайт и attR-сайт создавали путем специфической рекомбинации attB-сайта и attP-сайт интеграции в клетках E. coli, причем реакцию необходимо проводить в условиях катализа интегразы фага лямбда14. Ген, кодирующий элемент, экспрессирующий индуцибельную интегразу фага лямбда лактозного оперона (с нуклеотидной последовательностью, определенной в SEQ ID NO: 7), вводили в геном штамма TG1 E. coli средствами редактирования генома. Рекомбинантные генно-инженерные бактерии штамма TG1-λInt были получены компанией «Дженскрипт Байотек Корпорейшн» (GenScript Biotech Corporation).
1.3 Конструирование библиотеки антител, содержащей полностью человеческие тяжелые цепи
Библиотека антител, содержащая полностью человеческое тяжелые цепи, с разнообразием 1.73E+9 была сконструирована на основе китайского патента на изобретение № CN 108251431B путем применения замороженных кДНК природной человеческой вариабельной области тяжелой цепи и продуктов ПЦР VH1, VH3 и VH5 с мутациями в качестве матриц, конструирования ПЦР-праймеров для амплификации представляющих интерес фрагментов, клонирования представляющих интерес фрагментов в вектор pHGDisn-attP-site-new путем применения расщепления двумя ферментами NcoI и PmlI и электротрансформации для ввода продуктов лигирования в компетентные клетки штамма TG1. Сконструированную библиотеку антител секвенировали и анализировали с точностью в среднем выше 85%.
1.4 Конструирование библиотеки антител, содержащей полностью человеческие легкие цепи
Библиотека антител, содержащая полностью человеческие легкие цепи, с разнообразием 1.95E+8 была сконструирована на основе китайского патента на изобретение № CN 108251431B путем применения замороженных кДНК природной человеческой вариабельной области легкой цепи и продуктов ПЦР VK1 и VK3 с мутациями в качестве матриц, конструирования ПЦР-праймеров для амплификации представляющих интерес фрагментов, клонирования представляющих интерес фрагментов в вектор pHKb-attB-site-new путем применения расщепления двумя ферментами NcoI и PmlI и электротрансформации для ввода продуктов лигирования в компетентные клетки штамма TG1-λInt. Сконструированную библиотеку антител секвенировали и анализировали с точностью в среднем выше 90%.
1.5 Получение библиотеки полностью человеческих рекомбинантных Fab-фрагментов
Бактериальный раствор, содержащий сконструированную, как описано выше, библиотеку тяжелых цепей, инокулировали в 200 мл жидкой среды, культивировали до наступления логарифмической фазы роста при 37°C и 220 об/мин, инфицировали хелперным фагом M13 и культивировали в течение ночи при 28°C и 220 об/мин для амплификации фага. Затем получали очищенную фаговую библиотеку тяжелых цепей методом ПЭГ/NaCl-преципитации. Очищенную фаговую библиотеку тяжелых цепей после титрирования хранили в холодильнике при -80°C в качестве запаса.
Полученную как описано выше библиотеку антител, содержащую полностью человеческие легкие цепи, инокулировали в 50 мл жидкой среды с ИПТГ с конечной концентрацией 0.1 ммоль, культивировали до наступления логарифмической фазы роста при 37°C и 220 об/мин, а затем инфицировали фаговой библиотекой тяжелых цепей. После инфицирования, бактериальную жидкость равномерно распределяли по чашке для культивирования бактерий и инкубировали в течение ночи в термостате при 32°C.
Бактерии, выращенные на чашке, пересчитывали и отправляли на секвенирование для выявления рекомбинантных сайтов моноклонов, а также последовательностей легкой и тяжелой цепей. Размер библиотеки после рекомбинации подсчитывали методом разведения. По результатам подсчета, общее число рекомбинантных колоний составило 3.80E+12. Результаты секвенирования моноклональных антител показали, что все клоны, выращенные на чашке, представляли собой рекомбинантные плазмиды, содержавшие новообразованные attL-сайт (attL1, с кодирующей последовательностью, определенной в SEQ ID NO: 8) и attR-сайт (attR1, с кодирующей последовательностью, определенной в SEQ ID NO: 9) рекомбинации, полные гены легкой цепи и Fd-фрагмент тяжелой цепи с содержанием корректных генов антител более 76.5%.
Колонии на вышеупомянутой чашке для культивирования бактерий собирали, инокулировали в жидкую среду и культивировали при 37°C и 220 об/мин до наступления логарифмической фазы роста, после чего инфицировали хелперным фагом M13 с получением очищенной фаговой библиотеки человеческих Fab-фрагментов.
Пример 2: Получение F-белка РСВ и рекомбинантных антител
2.1 Получение F-белка РСВ
Рекомбинантный F-белок разных подтипов вирусов, в том числе – F-белок штамма A2 РСВ подтипа A (F-A2, с аминокислотной последовательностью, определенной в SEQ ID NO: 10) и F-белок штамма 18537 РСВ подтипа B (F-18537, с аминокислотной последовательностью, определенной в SEQ ID NO: 11), был необходим при получении моноклональных антител к F-белку РСВ. На основе двух разных подтипов F-белка РСВ, авторы настоящего изобретения сконструировали мутантные F-белки структуры DS-Cav115 до слияния, обозначенные «RSV-DS-Cav1-A» (с аминокислотной последовательностью, определенной в SEQ ID NO: 12) и «RSV-DS-Cav1-B» (с аминокислотной последовательностью, определенной в SEQ ID NO: 13) соответственно. Имеют место посттрансляционные модификации (например, гликозилирование или дисульфидные связи и т.п.) в F-белке. Поэтому применение системы экспрессии клеток млекопитающих было бы более предпочтительно для сохранения структуры и функции рекомбинантного белка. При этом, добавление гистидиновой метки (His-метки, с аминокислотной последовательностью, определенной в SEQ ID NO:14) к С-концу рекомбинантного белка более предпочтительно для очистки рекомбинантного белка и определения функции моноклональных антител.
Были синтезированы гены RSV-DS-Cav1-A и RSV-DS-Cav1-B. Синтезированные гены клонировали в подходящий эукариотический вектор экспрессии (например, pкДНК3.1 от компании «Инвитроджен Инк.» и т.п.) методами, известными в области молекулярной биологии. Клетки HEK293 (например, HEK293F от компании «Инвитроджен Инк.» и т.п.) трансфицировали полученными плазмидами, экспрессирующими рекомбинантный белок, с помощью липосом (например, 293fectin от компании «Инвитроджен Инк.» и т.п.) или иного катионного трансфекционного реагента (например, ПЭИ и т.п.). Клетки культивировали во взвешенном состоянии в бессывороточной среде в течение 3-4 суток. Затем супернатант клеточной культуры собирали путем центрифугирования и иными средствами. Рекомбинантный белок в супернатанте подвергали одноэтапной очистке на колонке для металл-хелатной аффинной хроматографии (например, «HisTrap FF» производства «Джи-И Инк.» и т.п.). Раствор хранения рекомбинантного белка заменяли на фосфатно-солевой буферный раствор (раствор PBS) (pH 7.0) или иные подходящие буферы с помощью колонки обессоливания (например, «Hitrap desaulting» производства «Джи-И Инк.» и т.п.). При необходимости, образец может быть стерилизован путем фильтрации с последующим хранением в виде аликвот при -20°C.
2.2 Получение рекомбинантных антител
Нуклеотидные последовательности, кодирующие вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи антител, клонировали в эукариотические векторы экспрессии (например, pкДНК3.1 от компании «Инвитроджен Инк.» и т.п.), сливали с нуклеотидными последовательностями, кодирующими константную область тяжёлой цепи и константную область лёгкой цепи соответственно, известными в области молекулярной биологии средствами. Полные антитела экспрессировались в комбинации. Константная область тяжёлой цепи антител может быть человеческого подтипа IgG1 (с аминокислотной последовательностью, определенной в SEQ ID NO: 15), мутантом IgG1-YTE человеческого подтипа IgG1 (с аминокислотной последовательностью, определенной в SEQ ID NO: 16), мышиного подтипа IgG2a (с аминокислотной последовательностью, определенной в SEQ ID NO: 17), при этом константная область лёгкой цепи антител может быть человеческого подтипа каппа (с аминокислотной последовательностью, определенной в SEQ ID NO: 18), человеческого подтипа лямбда (с аминокислотной последовательностью, определенной в SEQ ID NO: 19), мышиного подтипа каппа (с аминокислотной последовательностью, определенной в SEQ ID NO: 20) или мышиного подтипа лямбда (с аминокислотной последовательностью, определенной в SEQ ID NO: 21).
Клетки HEK293 (например, HEK293F от компании «Инвитроджен Инк.») трансфицировали экспрессирующими полученное рекомбинантное антитело плазмидами с помощью липосом (например, 293fectin от компании «Инвитроджен Инк.» и т.п.) или иных трансфекционных реагентов (например, ПЭИ и т.п.). Клетки культивировали во взвешенном состоянии в бессывороточной среде в течение 3-5 суток. Затем супернатант клеточной культуры собирали путем центрифугирования и иными средствами. Рекомбинантные антитела в супернатанте подвергали одноэтапной очистке с помощью колонки для хроматографии по сродству к A/G-белку (например, «Mabselect SURE» производства «Джи-И Инк.» и т.п.). Раствор хранения рекомбинантного белка заменяли на раствор PBS (pH 7.0) или иные подходящие буферы с помощью колонки обессоливания (например, «Hitrap desaulting» производства «Джи-И Инк.» и т.п.). При необходимости, образец может быть стерилизован путем фильтрации с последующим хранением в виде аликвот при -20°C.
Пример 3: Скрининг библиотеки полностью человеческих рекомбинантных Fab-фрагментов с F-белком РСВ
В соответствии со справочным документом (детальные протоколы экспериментов, во всей полноте включенные в настоящую заявку посредством отсылки, см. в заявке на патент Китая № 201510097117.0), библиотеку полностью человеческих рекомбинантных Fab-фрагментов, сконструированную в Примере 1, подвергали скринингу по твердофазному методу (протокол эксперимента см. в документе «Phage Display: A Practical Approach, Clackson, T. (USA) and Lowman, H. B. (USA) (ed.)» [«Фаговый дисплей: практический подход», Клаксон, Т. (США) и Лоумэн, Х.Б. (США) (ред.)»] в переводе Лань Ма и др., «Кемикал Индастри Пресс», май 2008г.) с применением рекомбинантного F-белка РСВ, полученного в Примере 2. Проводили четыре – шесть циклов скрининга путем связывания, элюирования, нейтрализации, инфицирования и амплификации. В итоге были получены два Fab-антитела R3B1h1 и R22B1, специфически связывающиеся с F-белком РСВ.
Пример 4: Выявление рекомбинантных моноклональных антител к F-белку РСВ
Нуклеотидные последовательности, кодирующие легкую и тяжелые цепи двух молекул R3B1h1 и R22B1, клонировали в эукариотические векторы экспрессии известными в области молекулярной биологии методами для получения моноклональных антител с рекомбинантной версией человеческого IgG1-κ. При этом, получали человеческое моноклональное антитело к РСВ паливизумаб (Hu1129) (с аминокислотной последовательностью вариабельной области тяжелой цепи, определенной в SEQ ID NO: 22, и аминокислотной последовательностью вариабельной области легкой цепи, определенной в SEQ ID NO: 23) в соответствии с патентом № US 7704505 B2, человеческое моноклональное антитело к РСВ нирсевимаб (MEDI8897) (с аминокислотной последовательностью вариабельной области тяжелой цепи, определенной в SEQ ID NO: 24, и аминокислотной последовательностью вариабельной области легкой цепи, определенной в SEQ ID NO: 25) в соответствии с патентом № US 11186628 B2, и человеческое моноклональное антитело к РСВ клесровимаб (RB1) (с аминокислотной последовательностью вариабельной области тяжелой цепи, определенной в SEQ ID NO: 26, и аминокислотной последовательностью вариабельной области легкой цепи, определенной в SEQ ID NO: 27) в соответствии с патентом № US 9963500 B2, при этом данные три антитела применяли в качестве антител положительного контроля.
4.1 Подтверждение активности связывания рекомбинантных моноклональных антител к F-белку РСВ
96-луночные планшеты для ELISA покрывали полученными RSV-DS-Cav1-A и RSV-DS-Cav1-Bat в концентрации 3мкг/мл, 100 мкл на лунку и выдерживали при 4°C в течение ночи соответственно. После блокирования планшетов блокирующим раствором (молоком на основе раствора PBS-0.1% и твина 20-3% (молоком PBST-3%)) при 37°C в течение 1 часа, каждое рекомбинантное моноклональное антитело к F-белку РСВ вводили в соответствующий планшет и подвергали связыванию при 37°C в течение 1 часа. Планшеты для ELISA промывали буферным раствором на основе PBS-0.1% и твина 20 (раствором PBST), вводили антитело мыши с пероксидазой хрена (HRP) к человеческому IgG (производства «Биосс» (Bioss), bsm-0297M-HRP) и подвергали связыванию при 37°C в течение 1 часа. Планшеты для ELISA промывали буферным раствором PBST. Вводили цветопроявляющий раствор субстрата OPD (орто-фенилендиамина). После инкубации в течение 5-10 минут, цветопроявление останавливали 1M раствором H2SO4. Измеряли значения оптической плотности на двух длинах волн 492 нм/630 нм с помощью микропланшетного фотометра. Результаты анализа по методу ELISA (Фиг. 3) свидетельствовали о том, что рекомбинантные моноклональные антитела R3B1h1 и R22B1 к F-белку РСВ проявляют примерно равную активность в части связывания двух рекомбинантных белков RSV-DS-Cav1-A и RSV-DS-Cav1-B.
4.2 Анализ эпитопа рекомбинантных моноклональных антител к F-белку РСВ
96-луночные планшеты для ELISA покрывали рекомбинантным белком RSV-DS-Cav1-B (1мкг/мл, 100 мкл на лунку) и выдерживали в течение ночи в холодильнике при 4°C. Планшеты блокировали блокирующим раствором (молоком PBST-3%) при 37°C в течение 1 часа. Проводили градиентное разбавление рекомбинантных моноклональных антител к F-белку РСВ (R3B1h1/R22B1/клесровимаб) с каждым из очищенных фагов к F-белку РСВ (R3B1h1/R22B1/клесровимаб/нирсевимаб) с фиксированной концентрацией (1×1011 КОЭ/мл) соответственно. Начальная концентрация антител составляла 200 мкг/мл, разбавление проводили в 3 раза, при этом общее число градиентов концентрации составило 10. Разбавленные антитела вводили в блокированные 96-луночные планшеты для ELISA в концентрации 100 мкл на лунку и инкубировали планшеты при 37°C в течение 1 часа. Планшеты для ELISA промывали буферным раствором PBST, после чего вводили вторичное антитело с HRP к M13 (производства «Сино Байолоджикал Инк.» (Sino Biological Inc.), 11973-MM05T-H) и инкубировали планшеты при 37°C в течение 1 часа. Планшеты для ELISA промывали раствором PBST, вводили цветопроявляющий раствор субстрата OPD. После инкубации в течение 5-10 минут, цветопроявление останавливали 1M раствором H2SO4. Измеряли значения оптической плотности на двух длинах волн 492нм/630нм с помощью микропланшетного фотометра. Результаты анализа по методу ELISA представлены на Фиг. 4. Моноклональное антитело R3B1h1 может блокировать связывание фагов R22B1/нирсевимаб с рекомбинантным белком RSV-DS-Cav1-B, но не влияет на связывание фага клесровимаб с рекомбинантным белком RSV-DS-Cav1-B (Фиг. 4A). Моноклональное антитело R22B1 может блокировать связывание фагов R3B1h1/нирсевимаб с рекомбинантным белком RSV-DS-Cav1-B, но не влияет на связывание фага клесровимаб с рекомбинантным белком RSV-DS-Cav1-B (Фиг. 4B). Моноклональное антитело Клесровимаб не может блокировать связывание фагов R3B1h1/R22B1/нирсевимаб с рекомбинантным белком RSV-DS-Cav1-B (Фиг. 4C).
4.3 Анализ аффинности рекомбинантных моноклональных антител к F-белку РСВ
Аффинность моноклональных антител к F-белку РСВ определяли методом поверхностного плазмонного резонанса с помощью прибора «Biacore T200». Соответствующие реагенты и расходные материалы, в частности, набор для аминного связывания (BR-1000-50), набор для захвата человеческих антител (BR-1008-39), чип CM5 (BR100012) и буферный раствор 10×HBS-EP (pH 7.4, BR100669) были приобретены у компании «Джи-И Хелскер» (GE healthcare). Поверхность карбоксилированного чипа CM5 активировали 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)-карбодиимид-гидрохлоридом (EDC) и N- гидроксисукцинимидом (NHS) согласно инструкциям к набору. Антитело к человеческому IgG (Fc-фрагменту) (иммобилизованное антитело) разбавляли до концентрации 25мкг/мл раствором ацетата натрия в концентрации 10 ммоль (pH 5.0), а затем вводили с расходом 10 мкл/мин до достижения количества присоединений, составляющего около 10000 единиц ответа (ЕО). После введения иммобилизованного антитела, вводили 1M раствор этаноламина для блокирования непрореагировавших групп. Для кинетических измерений моноклональные антитела к F-белку РСВ разбавляли до концентрации 0.5-1 мкг/мл и вводили с расходом 10 мкл/мин для обеспечения захвата антител в количестве около 80 ЕО антителом к человеческому Fc-фрагменту. Проводили разбавление RSV-DS-Cav1-A или RSV-DS-Cav1-B с серией градиентов концентрации (например, 6.17 нмоль, 18.5 нмоль, 55.6 нмоль, 166.7 нмоль, 500 нмоль) и вводили при 25°C в концентрациях от низкой до высокой с расходом 30 мкл/мин, при этом продолжительность ассоциации составляла 90 секунд, а продолжительность диссоциации составляла 3600 секунд. 3M раствор MgCl2 вводили с расходом 10 мкл/мин в течение 30 секунд для регенерации поверхности чипа. Скорость ассоциации (Kon) и скорость диссоциации (Koff) вычисляли путем сопоставления полученных с помощью датчиков диаграмм ассоциации и диссоциации с моделью ассоциации 1:1, используя программу оценки «Biacore T200» версии 3.0. Константу равновесия при диссоциации (KD) вычисляли как соотношение Koff/Kon. Результаты сопоставления приведены в Таблицах 1 и 2.
Таблица 1. Константы аффинности для связывания рекомбинантных моноклональных антител к F-белку РСВ с RSV-DS-Cav1-A
| Kon (1/MS) | Koff (1/S) | KD (M) | |
| Паливизумаб | 3.158E+4 | 8.197E-5 | 2.595E-9 |
| Клесровимаб | 2.001E+4 | 3.515E-4 | 1.756E-8 |
| Нирсевимаб | 3.149E+4 | 1.502E-5 | 4.770E-10 |
| R3B1h1 | 3.184E+4 | 2.370E-5 | 6.213E-10 |
| R22B1 | 3.991E+4 | 1.411E-5 | 6.213E-10 |
Таблица 2. Константы аффинности для связывания рекомбинантных моноклональных антител к F-белку РСВ с RSV-DS-Cav1-B
| Kon (1/MS) | Koff (1/S) | KD (M) | |
| Паливизумаб | 1.360E+5 | 2.001E-4 | 1.471E-9 |
| Клесровимаб | 9.171E+6 | 8.208E-5 | 8.951E-12 |
| Нирсевимаб | 1.082E+5 | 3.327E-4 | 3.075E-9 |
| R3B1h1 | 2.286E+5 | 8.093E-5 | 3.541E-10 |
| R22B1 | 3.577E+5 | 1.010E-4 | 2.824E-10 |
4.4 Ингибирование заражения клеток Hep-2 РСВ рекомбинантными моноклональными антителами к F-белку РСВ
4.4.1 Ингибирование заражения клеток Hep-2 штаммом A2 РСВ рекомбинантными моноклональными антителами к F-белку РСВ
Моноклональные антитела к F-белку РСВ (R3B1h1, R22B1, нирсевимаб, клесровимаб и паливизумаб) и антитело отрицательного изотипического контроля разбавляли поддерживающей средой для клеток Hep-2 (модифицированная по способу Дульбекко среда Игла (DMEM) + фетальная бычья сыворотка (ФБС) 2% + пенициллин / синтомицин (P/S) 1% + глутамат 2ммоль) в начальной концентрации 66.7 нмоль, с 5-кратным градиентом, с общим числом градиентов концентрации, равным 10. Разбавленные антитела вводили в 96-луночные стерильные полностью проницаемые планшеты для культуры клеток. 1 замороженный раствор РСВ типа A2 помещали в лабораторный бокс микробиологической безопасности типа P2 и медленно размораживали, после чего разбавляли до концентрации 1.5×103 БОЕ/мл поддерживающей средой для клеток Hep-2. Разбавленный раствор вируса вводили в разбавленное антитело в количестве 70 мкл на лунку для тщательного перемешивания. Одновременно готовили отдельные лунки для клеток контроля (поддерживающая среда для клеток Hep-2 в количестве 140 мкл на лунку) и лунки «клетка + штамм A2 РСВ» (поддерживающая среда для клеток Hep-2 в количестве 70 мкл на лунку + разбавленный штамм A2 РСВ в количестве 70 мкл на лунку). После ввода всех образцов, планшеты закрывали, помещали в камеру культивирования клеток (при 37±1°C, 5±1% CO2) и нейтрализовали в течение 1 часа. Клетки Hep-2 в логарифмической фазе роста собирали, подвергали расщеплению и центрифугированию и разбавляли, после чего суспензию подсчитанных клеток разбавляли поддерживающей средой для клеток Hep-2 с получением одной суспензии клеток в концентрации 4.3×105 клеток на мл. Клетки высевали в 96-луночные планшеты для культуры клеток, которые нейтрализовали в количестве 70 мкл на лунку и инкубировали в инкубаторе для культур клеток (при 37±1°C, 5±1%CO2) в течение 60-72 часов. После вирусной инфильтрации, клетки промывали дважды раствором PBS и выдерживали в течение 30 минут в холодильнике при 2~8°C с 80%-ным ацетоном. Затем 80%-ный ацетон удаляли. Клетки промывали дважды раствором PBS, после чего вводили детекторное антитело паливизумаб (100 мкл на лунку), разбавленное до концентрации 10мкг/мл раствором PBS, и инкубировали при 37°C в темноте в течение 60 минут. После удаления первичного антитела, клетки промывали дважды раствором PBS. Далее вводили ФИТЦ-меченые антитела козы к человеческому IgG (ZSGB-BIO, ZF-0308), разбавленные раствором PBS (1: 400), в концентрации 100 мкл на лунку и инкубировали при 37°C в темноте в течение 40 минут. После удаления вторичного антитела, клетки промывали дважды раствором PBS. Определяли значения хемилюминесценции путем быстрого теста на ингибирование флуоресцентного свечения (RFFIT-теста) с помощью многофункционального микропланшетного фотометра (SpectraMax I3). Результаты (Фиг. 5) свидетельствовали о том, что R3B1h1 обладает наилучшей активностью, превышающей приблизительно в 5 раз активность нирсевимаба, приблизительно в 12 раз активность клесровимаба и приблизительно в 410 раз активность паливизумаба по итогам сравнения значений IC50 (Таблица 3).
Таблица 3. Полуподавляющие концентрации моноклональных антител к F-белку РСВ, ингибирующих заражение клеток Hep-2 штаммом A2 РСВ
| Наименование антитела | IC50( нмоль) |
| R3B1h1 | 0.005162 |
| R22B1 | 0.07067 |
| Нирсевимаб | 0.02306 |
| Клесровимаб | 0.06219 |
| Паливизумаб | 2.12 |
| Антитело изотипического контроля | / |
4.4.2 Ингибирование заражения клеток Hep-2 штаммом 18537 РСВ рекомбинантными моноклональными антителами к F-белку РСВ
Нейтрализующую активность рекомбинантных моноклональных антител к F-белку РСВ (R3B1h1, R22B1, нирсевимаба, клесровимаба и паливизумаба) в отношении штамма 18537 РСВ определяли согласно протоколу, описанному в Разделе 4.4.1. Результаты (Фиг. 6) свидетельствовали о том, что R3B1h1 обладает наилучшей активностью, превышающей приблизительно в 18 раз активность нирсевимаба, приблизительно в 12 раз активность клесровимаба и приблизительно в 545 раз активность паливизумаба по итогам сравнения значений IC50 (Таблица 4).
Таблица 4. Полуподавляющие концентрации моноклональных антител к F-белку РСВ, ингибирующих заражение клеток Hep-2 штаммом 18537 РСВ
| Наименование антитела | IC50(нмоль) |
| R3B1h1 | 0,007595 |
| R22B1 | 0,1111 |
| Нирсевимаб | 0,1392 |
| Клесровимаб | 0,08802 |
| Паливизумаб | 4,146 |
| Антитело изотипического контроля | / |
4.4.3 Ингибирование заражения клеток Hep-2 выделенным из клинических образцов РСВ рекомбинантными моноклональными антителами к F-белку РСВ
Нейтрализующую активность рекомбинантных моноклональных антител к F-белку РСВ (R3B1h1, R22B1, нирсевимаба, клесровимаба и паливизумаба) в отношении выделенного из клинических образцов РСВ определяли согласно протоколу, описанному в Разделе 4.4.1.
Штаммы общим числом 11, выделенные из клинических образцов, отобранных в сезон эпидемии РСВ в 2021 году, были получены из Центра женского и детского здоровья г. Гуанчжоу. Из них, 9 штаммов относятся к подтипу A (под номерами 2033, 2064, 2066, 2406, 2410, 2416, 2425, 2430 и 2438 соответственно), а 2 штамма относятся к подтипу B (под номерами 2063 и 2427 соответственно). Результаты (Фиг. 7) свидетельствуют о том, что и R3B1h1, и R22B1 способны успешно нейтрализовать клинические штаммы РСВ.
Информация о последовательностях
SEQ ID NO:1
CGAATAAATACCTGTGACGGAAGATCACTTCGCAGAATAAATAAATCCTGGTGTCCCTGTTGATACCGGGAAGCCCTGGGCCAACTTTTGGCGAAAATGAGACGTTGATCGGCACGTAAGAGGTTCCAACTTTCACCATAATGAAATAAGATCACTACCGGGCGTATTTTTTGAGTTATCGAGATTTTCA
SEQ ID NO:2
AAATAATGATTTTATTTTGACTGATAGTGACCTGTTCGTTGCAACACATTGATGAGCAATGCTTTTTTATAATGCCAACTTTGTACAAAAAAGCTGAACGAGAAACGTAAAATGATATAAATATCAATATATTAAATTAGATTTTGCATAAAAAACAGACTACATAATACTGTAAAACACAACATATCCAGTCACTATGAATCAACTACTTAGATGGTATTAGTGACCTGTA
SEQ ID NO:3
GATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTTTTGCCCTGTAAACGAAAAAACCACCTGGGGAGGTGGTTTGATCGAAGGTTAAGTCAGTTGGGGAACTGCTTAACCGTGGTAACTGGTTTTCGCAGAGCACAGCAACCAAATCTGTCCTTCCAGTGTAGCCGGACTTTGGCGCACACTTCAAGAGCAACCGCGTGTTTAGCTAAACAAATCCTCTGCGAACTCCCAGTTACCAATGGCTGCTGCCAGTGGCGTTTTACCGTGCTTTTCCGGGTTGGACTCAAGTGAACAGTTACCGGATAAGGCGCAGCAGTCGGGCTGAACGGGGAGTTCTTGCTTACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAGCCGAGATACCAGTGTGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACACTTCCCGTAAGGGAGAAAGGCGGAACAGGTATCCGGTAAACGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCAAGAGGGAGCGACCCGCCGGAAACGGTGGGGATCTTTAAGTCCTGTCGGGTTTCGCCCGTACTGTCAGATTCATGGTTGAGCCTCACGGCTCCCACAGATGCACCGGAAAAGCGTCTGTTTATGTGAACTCTGGCAGGAGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCACCGGCGCGGCCCTGCTGTTTTGCCTCACATGTTAGTCCCCTGCTTATCCACGGAATCTGTGGGTAACTTTGTATGTGTCCGCAGCGC
SEQ ID NO:4
ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT
SEQ ID NO:5
ATGGAGAAAAAAATCACTGGATATACCACCGTTGATATATCCCAATGGCATCGTAAAGAACATTTTGAGGCATTTCAGTCAGTTGCTCAATGTACCTATAACCAGACCGTTCAGCTGGATATTACGGCCTTTTTAAAGACCGTAAAGAAAAATAAGCACAAGTTTTATCCGGCCTTTATTCACATTCTTGCCCGCCTGATGAATGCTCATCCGGAATTCCGTATGGCAATGAAAGACGGTGAGCTGGTGATATGGGATAGTGTTCACCCTTGTTACACCGTTTTCCATGAGCAAACTGAAACGTTTTCATCGCTCTGGAGTGAATACCACGACGATTTCCGGCAGTTTCTACACATATATTCGCAAGATGTGGCGTGTTACGGTGAAAACCTGGCCTATTTCCCTAAAGGGTTTATTGAGAATATGTTTTTCGTCTCAGCCAATCCCTGGGTGAGTTTCACCAGTTTTGATTTAAACGTGGCCAATATGGACAACTTCTTCGCCCCCGTTTTCACTATGGGCAAATATTATACGCAAGGCGACAAGGTGCTGATGCCGCTGGCGATTCAGGTTCATCATGCCGTCTTTGATGGCTTCCATGTCGGCAGAATGCTTAATGAATTACAACAGTACTGCGATGAGTGGCAGGGCGGGGCGTAA
SEQ ID NO:6
TCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTC
SEQ ID NO:7
CTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTAAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGGATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCTTTGCCTGGTTTCCGGCACCAGAAGCGGTGCCGGAAAGCTGGCTGGAGTGCGATCTTCCTGAGGCCGATACTGTCGTCGTCCCCTCAAACTGGCAGATGCACGGTTACGATGCGCCCATCTACACCAACGTGACCTATCCCATTACGGTCAATCCGCCGTTTGTTCCCACGGAGAATCCGACGGGTTGTTACTCGCTCACATTTAATGTTGATGAAAGCTGGCTACAGGAAGGCCAGACGCGAATTATTTTTGATGGCGTCGGGATCTGATCCGGATTTACTAACTGGAAGAGGCACTAAATGGGAAGAAGGCGAAGTCATGAGCGCCGGGATTTACCCCCTAACCTTTATATAAGAAACAATGGATATTACTGCTACAGGGACCCAAGGACGGGTAAAGAGTTTGGATTAGGCAGAGACAGGCGAATCGCAATCACTGAAGCTATACAGGCCAACATTGAGTTATTTTCAGGACACAAACACAAGCCTCTGACAGCGAGAATCAACAGTGATAATTCCGTTACGTTACATTCATGGCTTGATCGCTACGAAAAAATCCTGGCCAGCAGAGGAATCAAGCAGAAGACACTCATAAATTACATGAGCAAAATTAAAGCAATAAGGAGGGGTCTGCCTGATGCTCCACTTGAAGACATCACCACAAAAGAAATTGCGGCAATGCTCAATGGATACATAGACGAGGGCAAGGCGGCGTCAGCCAAGTTAATCAGATCAACACTGAGCGATGCATTCCGAGAGGCAATAGCTGAAGGCCATATAACAACAAACCATGTCGCTGCCACTCGCGCAGCAAAATCAGAGGTAAGGAGATCAAGACTTACGGCTGACGAATACCTGAAAATTTATCAAGCAGCAGAATCATCACCATGTTGGCTCAGACTTGCAATGGAACTGGCTGTTGTTACCGGGCAACGAGTTGGTGATTTATGCGAAATGAAGTGGTCTGATATCGTAGATGGATATCTTTATGTCGAGCAAAGCAAAACAGGCGTAAAAATTGCCATCCCAACAGCATTGCATATTGATGCTCTCGGAATATCAATGAAGGAAACACTTGATAAATGCAAAGAGATTCTTGGCGGAGAAACCATAATTGCATCTACTCGTCGCGAACCGCTTTCATCCGGCACAGTATCAAGGTATTTTATGCGCGCACGAAAAGCATCAGGTCTTTCCTTCGAAGGGGATCCGCCTACCTTTCACGAGTTGCGCAGTTTGTCTGCAAGACTCTATGAGAAGCAGATAAGCGATAAGTTTGCTCAACATCTTCTCGGGCATAAGTCGGACACCATGGCATCACAGTATCGTGATGACAGAGGCAGGGAGTGGGACAAAATTGAAATCAAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTG
SEQ ID NO:8
AAATAATGATTTTATTTTGACTGATAGTGACCTGTTCGTTGCAACACATTGATGAGCAATGCTTTTTTATAATGCCAACTTTGTACAAAAAAGCAGGCT
SEQ ID NO:9
ACAAGTTTGTACAAAAAAGCTGAACGAGAAACGTAAAATGATATAAATATCAATATATTAAATTAGATTTTGCATAAAAAACAGACTACATAATACTGTAAAACACAACATATCCAGTCACTATGAATCAACTACTTAGATGGTATTAGTGACCTGTA
SEQ ID NO:10
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPPTNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEINLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGMDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN
SEQ ID NO:11
MELLIHRSSAIFLTLAVNALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITIELSNIKETKCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNRARREAPQYMNYTINTTKNLNVSISKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYINNRLLPIVNQQSCRISNIETVIEFQQMNSRLLEITREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKTDISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGKNLYVKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRRSDELLHNVNTGKSTTNIMITTIIIVIIVVLLSLIAIGLLLYCKAKNTPVTLSKDQLSGINNIAFSK
SEQ ID NO:12
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPPTNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEINLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGMDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL
SEQ ID NO:13
MELLIHRSSAIFLTLAVNALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITIELSNIKETKCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNRARREAPQYMNYTINTTKNLNVSISKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVCKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYINNRLLPILNQQSCRISNIETVIEFQQMNSRLLEITREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSSNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKTDISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGKNLYVKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRRSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL
SEQ ID NO:14
HHHHHH
SEQ ID NO:15
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:16
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:17
AKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
SEQ ID NO:18
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:19
GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
SEQ ID NO:20
RADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
SEQ ID NO:21
GQPKSSPSVTLFPPSSEELETNKATLVCTITDFYPGVVTVDWKVDGTPVTQGMETTQPSKQSNNKYMASSYLTLTARAWERHSSYSCQVTHEGHTVEKSLSRADCS
SEQ ID NO:22
QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMSVGWIRQPPGKALEWLADIWWDDKKDYNPSLKSRLTISKDTSKNQVVLKVT NMDPADTATYYCARSMITNWYFDVWGAGTTVTVSS
SEQ ID NO:23
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCKCQLSVGYMHWYQQKPGKAPKLWIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCFQGSGYPFTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO:24
QVQLVQSGAEVKKPGSSVMVSCQASGGLLEDYIINWVRQAPGQGPEWMGGIIPVLGTVHYGPKFQGRVTITADESTDTAYMELSSLRSEDTAMYYCATETALVVSETYLPHYFDNWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:25
DIQMTQSPSSLSAAVGDRVTITCQASQDIVNYLNWYQQKPGKAPKLLIYVASNLETGVPSRFSGSGSGTDFSLTISSLQPEDVATYYCQQYDNLPLTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO:26
EVQLVESGGGLVRPGRSLRLSCTVSGFSFDDSAMSWVRQAPGKGLEWISFIKSKTYGGTKEYAASVKGRFTISRDDSKNIAYLQMNSLKTEDTAVYYCTRGAPYGGNSDYYYGLDVWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO:27
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSQDVRGALAWYQQKPGKAPKLLIFDASSLETGVPSRFSGSGSGTVFTLTISSLQPEDFAAYYCQQFLDFPFTFGQGTRLEIK
SEQ ID NO:28
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGLLEDYIINWVRQAPGQGLEWMGGIIPVLGTVHYGPKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCATETAIVVTESYRPHFFDNWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:29
DIQMTQSPSSLSAsVGDRVTITCQASQDIVNYLNWYQQKPGKAPKLLIYVASNLETGVPSRFSGSGSGTDFtfTISSLQPEDiATYYCQEFAGLALNFGGGTKVEIK
SEQ ID NO:30
QVQLVQSGAEVKKPGSSVMVSCQASGDPLQNYIINWVRQAPGQGPEWMGAIIPALGSAHYGPKFQGRVTITADESTDTAYMELSSLRSEDTAMYYCATETAVIISESYLPHFFDNWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:31
DIQMTQSPSSLSAAVGDRVTITCQASQDIVNYLNWYQQKPGKAPKLLIYVASNLETGVPSRFSGSGSGTDFSLTISSLQPEDVATYYCQEYDSLALAFGGGTKVEIK
SEQ ID NO:32
DYIIN
SEQ ID NO:33
GIIPVLGTVHYGPKFQG
SEQ ID NO:34
ETAIVVTESYRPHFFDN
SEQ ID NO:35
QASQDIVNYLN
SEQ ID NO:36
VASNLET
SEQ ID NO:37
QEFAGLALN
SEQ ID NO:38
NYIIN
SEQ ID NO:39
AIIPALGSAHYGPKFQG
SEQ ID NO:40
ETAVIISESYLPHFFDN
SEQ ID NO:43
QEYDSLALA
SEQ ID NO:44
TTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAA
SEQ ID NO:45
CGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGCTTACAATTT
SEQ ID NO:46
GGTGGCGGCTCCGGTTCCGGTGATTTTGATTATGAAAAAATGGCAAACGCTAATAAGGGGGCTATGACCGAAAATGCCGATGAAAACGCGCTACAGTCTGACGCTAAAGGCAAACTTGATTCTGTCGCTACTGATTACGGTGCTGCTATCGATGGTTTCATTGGTGACGTTTCCGGCCTTGCTAATGGTAATGGTGCTACTGGTGATTTTGCTGGCTCTAATTCCCAAATGGCTCAAGTCGGTGACGGTGATAATTCACCTTTAATGAATAATTTCCGTCAATATTTACCTTCCCTCCCTCAATCGGTTGAATGTCGCCCTTTTGTCTTTGGCGCTGGTAAACCATATGAATTTTCTATTGATTGTGACAAAATAAACTTATTCCGTGGTGTCTTTGCGTTTCTTTTATATGTTGCCACCTTTATGTATGTATTTTCTACGTTTGCTAACATACTGCGTAATAAGGAGTCTTGATAA
Источники:
1. JAMA Pediatr. 2016 Mar;170(3):267-87.
2. Lancet Glob Health. 2017 Oct;5(10): e984-e991.
3. J Gen Virol. 2017 Dec;98(12):2912-2913.
4. J Gen Virol. 1985 Oct;66 (Pt 10):2111-24.
5. J Virol. 2008 Mar;82(5):2040-55.
6. J Virol. 1987 Oct;61(10):3163-6.
7. Proc Natl Acad Sci U S A. 1984 Dec;81(24):7683-7.
8. Virus Res. 2000 Jun;68(1):25-33.
9. Virology. 1993 Nov;197(1):1-11.
10. Gene. 1994 Dec 30;151(1-2):109-13.
11. Kabat, «Sequences of Proteins of Immunological Interest», National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991).
12. A1-Lazikani, et al., J. Mol. Biol. 273:927-948 (1997).
13. Martin, et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA86:9268-9272 (1989).
14. Annu Rev Biochem. 1989; 58:913-49.
15. Science. 2013 Nov 1; 342(6158):592-8.
--->
<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>
<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing
1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">
<ST26SequenceListing originalFreeTextLanguageCode="en"
dtdVersion="V1_3" fileName="23C83147RU-Sequence listing.xml"
softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.3.0"
productionDate="2024-08-21">
<ApplicantFileReference>23C83147RU</ApplicantFileReference>
<EarliestPriorityApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>CN</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText>202210871810.9</ApplicationNumberText>
<FilingDate>2022-07-22</FilingDate>
</EarliestPriorityApplicationIdentification>
<ApplicantName languageCode="en">Beijing Wisdomab Biotechnology Co.,
Ltd.</ApplicantName>
<InventionTitle languageCode="en">ANTI-RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUS
NEUTRALIZING ANTIBODY AND USE THEREOF</InventionTitle>
<SequenceTotalQuantity>46</SequenceTotalQuantity>
<SequenceData sequenceIDNumber="1">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>190</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..190</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q47">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Escherichia coli</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>cgaataaatacctgtgacggaagatcacttcgcagaataaataaatcct
ggtgtccctgttgataccgggaagccctgggccaacttttggcgaaaatgagacgttgatcggcacgtaa
gaggttccaactttcaccataatgaaataagatcactaccgggcgtattttttgagttatcgagattttc
a</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="2">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>232</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..232</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q48">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Lambda phage targeting
Escherichia</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>aaataatgattttattttgactgatagtgacctgttcgttgcaacacat
tgatgagcaatgcttttttataatgccaactttgtacaaaaaagctgaacgagaaacgtaaaatgatata
aatatcaatatattaaattagattttgcataaaaaacagactacataatactgtaaaacacaacatatcc
agtcactatgaatcaactacttagatggtattagtgacctgta</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="3">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>739</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..739</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q49">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Escherichia coli</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatcttttgc
cctgtaaacgaaaaaaccacctggggaggtggtttgatcgaaggttaagtcagttggggaactgcttaac
cgtggtaactggttttcgcagagcacagcaaccaaatctgtccttccagtgtagccggactttggcgcac
acttcaagagcaaccgcgtgtttagctaaacaaatcctctgcgaactcccagttaccaatggctgctgcc
agtggcgttttaccgtgcttttccgggttggactcaagtgaacagttaccggataaggcgcagcagtcgg
gctgaacggggagttcttgcttacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgagccgagataccagtg
tgtgagctatgagaaagcgccacacttcccgtaagggagaaaggcggaacaggtatccggtaaacggcag
ggtcggaacaggagagcgcaagagggagcgacccgccggaaacggtggggatctttaagtcctgtcgggt
ttcgcccgtactgtcagattcatggttgagcctcacggctcccacagatgcaccggaaaagcgtctgttt
atgtgaactctggcaggagggcggagcctatggaaaaacgccaccggcgcggccctgctgttttgcctca
catgttagtcccctgcttatccacggaatctgtgggtaactttgtatgtgtccgcagcgc</INSDSeq_
sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="4">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>25</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..25</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q50">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Escherichia coli</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>acaagtttgtacaaaaaagcaggct</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="5">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>660</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..660</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q51">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Escherichia coli</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>atggagaaaaaaatcactggatataccaccgttgatatatcccaatggc
atcgtaaagaacattttgaggcatttcagtcagttgctcaatgtacctataaccagaccgttcagctgga
tattacggcctttttaaagaccgtaaagaaaaataagcacaagttttatccggcctttattcacattctt
gcccgcctgatgaatgctcatccggaattccgtatggcaatgaaagacggtgagctggtgatatgggata
gtgttcacccttgttacaccgttttccatgagcaaactgaaacgttttcatcgctctggagtgaatacca
cgacgatttccggcagtttctacacatatattcgcaagatgtggcgtgttacggtgaaaacctggcctat
ttccctaaagggtttattgagaatatgtttttcgtctcagccaatccctgggtgagtttcaccagttttg
atttaaacgtggccaatatggacaacttcttcgcccccgttttcactatgggcaaatattatacgcaagg
cgacaaggtgctgatgccgctggcgattcaggttcatcatgccgtctttgatggcttccatgtcggcaga
atgcttaatgaattacaacagtactgcgatgagtggcagggcggggcgtaa</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="6">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>1163</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..1163</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q52">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Escherichia coli</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttat
ttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattg
aaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgcctt
cctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgg
gttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaat
gatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactc
ggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacgg
atggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttact
tctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgc
cttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtag
caatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaat
agactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttatt
gctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagc
cctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgc
tgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagatt
gatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaa
tcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttc</INSD
Seq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="7">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>1760</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..1760</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q53">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Lambda phage targeting
Escherichia</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgca
attaatgtaagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtataatgt
gtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacggattcactggccg
tcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccc
tttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaat
ggcgaatggcgctttgcctggtttccggcaccagaagcggtgccggaaagctggctggagtgcgatcttc
ctgaggccgatactgtcgtcgtcccctcaaactggcagatgcacggttacgatgcgcccatctacaccaa
cgtgacctatcccattacggtcaatccgccgtttgttcccacggagaatccgacgggttgttactcgctc
acatttaatgttgatgaaagctggctacaggaaggccagacgcgaattatttttgatggcgtcgggatct
gatccggatttactaactggaagaggcactaaatgggaagaaggcgaagtcatgagcgccgggatttacc
ccctaacctttatataagaaacaatggatattactgctacagggacccaaggacgggtaaagagtttgga
ttaggcagagacaggcgaatcgcaatcactgaagctatacaggccaacattgagttattttcaggacaca
aacacaagcctctgacagcgagaatcaacagtgataattccgttacgttacattcatggcttgatcgcta
cgaaaaaatcctggccagcagaggaatcaagcagaagacactcataaattacatgagcaaaattaaagca
ataaggaggggtctgcctgatgctccacttgaagacatcaccacaaaagaaattgcggcaatgctcaatg
gatacatagacgagggcaaggcggcgtcagccaagttaatcagatcaacactgagcgatgcattccgaga
ggcaatagctgaaggccatataacaacaaaccatgtcgctgccactcgcgcagcaaaatcagaggtaagg
agatcaagacttacggctgacgaatacctgaaaatttatcaagcagcagaatcatcaccatgttggctca
gacttgcaatggaactggctgttgttaccgggcaacgagttggtgatttatgcgaaatgaagtggtctga
tatcgtagatggatatctttatgtcgagcaaagcaaaacaggcgtaaaaattgccatcccaacagcattg
catattgatgctctcggaatatcaatgaaggaaacacttgataaatgcaaagagattcttggcggagaaa
ccataattgcatctactcgtcgcgaaccgctttcatccggcacagtatcaaggtattttatgcgcgcacg
aaaagcatcaggtctttccttcgaaggggatccgcctacctttcacgagttgcgcagtttgtctgcaaga
ctctatgagaagcagataagcgataagtttgctcaacatcttctcgggcataagtcggacaccatggcat
cacagtatcgtgatgacagaggcagggagtgggacaaaattgaaatcaaataactagcataaccccttgg
ggcctctaaacgggtcttgaggggttttttg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="8">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>99</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..99</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q54">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>aaataatgattttattttgactgatagtgacctgttcgttgcaacacat
tgatgagcaatgcttttttataatgccaactttgtacaaaaaagcaggct</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="9">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>158</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..158</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q55">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>acaagtttgtacaaaaaagctgaacgagaaacgtaaaatgatataaata
tcaatatattaaattagattttgcataaaaaacagactacataatactgtaaaacacaacatatccagtc
actatgaatcaactacttagatggtattagtgacctgta</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="10">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>574</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..574</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q56">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>strain A2 of subtype A
RSV</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALR
TGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPPTNNRARRELPRFMNYTL
NNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLT
SKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLS
LINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEG
SNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEINLCNVDIFNPKYDCKIMTSK
TDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGMDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYV
KGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTIIIVIIVILL
SLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="11">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>574</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..574</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q57">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>strain 18537 of subtype B
RSV</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>MELLIHRSSAIFLTLAVNALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALR
TGWYTSVITIELSNIKETKCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNRARREAPQYMNYTI
NTTKNLNVSISKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAVVSLSNGVSVLT
SKVLDLKNYINNRLLPIVNQQSCRISNIETVIEFQQMNSRLLEITREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLS
LINDMPITNDQKKLMSSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEG
SNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIMTSK
TDISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGKNLYV
KGEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRRSDELLHNVNTGKSTTNIMITTIIIVIIVVLL
SLIAIGLLLYCKAKNTPVTLSKDQLSGINNIAFSK</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="12">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>544</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..544</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q58">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALR
TGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPPTNNRARRELPRFMNYTL
NNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLT
FKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLS
LINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEG
SNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEINLCNVDIFNPKYDCKIMTSK
TDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGMDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYV
KGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVL
LSTFL</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="13">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>544</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..544</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q59">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>MELLIHRSSAIFLTLAVNALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALR
TGWYTSVITIELSNIKETKCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNRARREAPQYMNYTI
NTTKNLNVSISKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVCKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAVVSLSNGVSVLT
FKVLDLKNYINNRLLPILNQQSCRISNIETVIEFQQMNSRLLEITREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLS
LINDMPITNDQKKLMSSNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEG
SNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIMTSK
TDISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGKNLYV
KGEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRRSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVL
LSTFL</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="14">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>6</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..6</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q60">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>HHHHHH</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="15">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>330</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..330</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q61">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLG
GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVL
TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSD
IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
K</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="16">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>330</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..330</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q62">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLG
GPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVL
TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSD
IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
K</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="17">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>330</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..330</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q63">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Mus musculus</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>AKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSG
VHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLG
GPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSAL
PIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPED
IYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPG
K</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="18">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>107</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..107</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q64">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS
GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC</INSDSeq_se
quence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="19">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>106</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..106</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q65">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPV
KAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS</INSDSeq_seq
uence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="20">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>107</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..107</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q66">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Mus musculus</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>RADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQ
NGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC</INSDSeq_se
quence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="21">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>106</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..106</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q67">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Mus musculus</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>GQPKSSPSVTLFPPSSEELETNKATLVCTITDFYPGVVTVDWKVDGTPV
TQGMETTQPSKQSNNKYMASSYLTLTARAWERHSSYSCQVTHEGHTVEKSLSRADCS</INSDSeq_seq
uence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="22">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>120</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..120</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q68">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMSVGWIRQPPGKALEW
LADIWWDDKKDYNPSLKSRLTISKDTSKNQVVLKVTNMDPADTATYYCARSMITNWYFDVWGAGTTVTVS
S</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="23">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>106</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..106</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q69">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCKCQLSVGYMHWYQQKPGKAPKLWIYD
TSKLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCFQGSGYPFTFGGGTKLEIK</INSDSeq_seq
uence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="24">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>126</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..126</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q70">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>QVQLVQSGAEVKKPGSSVMVSCQASGGLLEDYIINWVRQAPGQGPEWMG
GIIPVLGTVHYGPKFQGRVTITADESTDTAYMELSSLRSEDTAMYYCATETALVVSETYLPHYFDNWGQG
TLVTVSS</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="25">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>107</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..107</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q71">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>DIQMTQSPSSLSAAVGDRVTITCQASQDIVNYLNWYQQKPGKAPKLLIY
VASNLETGVPSRFSGSGSGTDFSLTISSLQPEDVATYYCQQYDNLPLTFGGGTKVEIK</INSDSeq_se
quence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="26">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>127</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..127</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q72">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>EVQLVESGGGLVRPGRSLRLSCTVSGFSFDDSAMSWVRQAPGKGLEWIS
FIKSKTYGGTKEYAASVKGRFTISRDDSKNIAYLQMNSLKTEDTAVYYCTRGAPYGGNSDYYYGLDVWGQ
GTTVTVSS</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="27">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>107</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..107</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q73">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSQDVRGALAWYQQKPGKAPKLLIF
DASSLETGVPSRFSGSGSGTVFTLTISSLQPEDFAAYYCQQFLDFPFTFGQGTRLEIK</INSDSeq_se
quence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="28">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>126</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..126</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q74">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGLLEDYIINWVRQAPGQGLEWMG
GIIPVLGTVHYGPKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCATETAIVVTESYRPHFFDNWGQG
TLVTVSS</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="29">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>107</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..107</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q75">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDIVNYLNWYQQKPGKAPKLLIY
VASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQEFAGLALNFGGGTKVEIK</INSDSeq_se
quence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="30">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>126</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..126</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q76">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>QVQLVQSGAEVKKPGSSVMVSCQASGDPLQNYIINWVRQAPGQGPEWMG
AIIPALGSAHYGPKFQGRVTITADESTDTAYMELSSLRSEDTAMYYCATETAVIISESYLPHFFDNWGQG
TLVTVSS</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="31">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>107</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..107</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q77">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>DIQMTQSPSSLSAAVGDRVTITCQASQDIVNYLNWYQQKPGKAPKLLIY
VASNLETGVPSRFSGSGSGTDFSLTISSLQPEDVATYYCQEYDSLALAFGGGTKVEIK</INSDSeq_se
quence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="32">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>5</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..5</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q78">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>DYIIN</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="33">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>17</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..17</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q79">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>GIIPVLGTVHYGPKFQG</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="34">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>17</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..17</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q80">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ETAIVVTESYRPHFFDN</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="35">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>11</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..11</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q81">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>QASQDIVNYLN</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="36">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>7</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..7</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q82">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>VASNLET</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="37">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>9</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..9</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q83">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>QEFAGLALN</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="38">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>5</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..5</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q84">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>NYIIN</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="39">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>17</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..17</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q85">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>AIIPALGSAHYGPKFQG</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="40">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>17</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..17</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q86">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ETAVIISESYLPHFFDN</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="41">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>11</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..11</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q87">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>QASQDIVNYLN</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="42">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>7</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..7</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q88">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>VASNLET</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="43">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>9</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..9</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q89">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>QEYDSLALA</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="44">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>589</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..589</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q90">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Escherichia coli</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaa
ccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggct
tcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactc
tgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcg
tgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggtt
cgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgaga
aagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagag
cgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgac
ttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaa</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="45">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>455</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..455</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q91">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>f1 phage</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>cgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgc
agcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgcca
cgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacg
gcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtt
tttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactca
accctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatga
gctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgcttacaattt</INSDSeq_sequ
ence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="46">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>477</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..477</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q92">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>M13 phage</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ggtggcggctccggttccggtgattttgattatgaaaaaatggcaaacg
ctaataagggggctatgaccgaaaatgccgatgaaaacgcgctacagtctgacgctaaaggcaaacttga
ttctgtcgctactgattacggtgctgctatcgatggtttcattggtgacgtttccggccttgctaatggt
aatggtgctactggtgattttgctggctctaattcccaaatggctcaagtcggtgacggtgataattcac
ctttaatgaataatttccgtcaatatttaccttccctccctcaatcggttgaatgtcgcccttttgtctt
tggcgctggtaaaccatatgaattttctattgattgtgacaaaataaacttattccgtggtgtctttgcg
tttcttttatatgttgccacctttatgtatgtattttctacgtttgctaacatactgcgtaataaggagt
cttgataa</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
</ST26SequenceListing>
<---
Claims (20)
1. Антитело к респираторно-синцитиальному вирусу (РСВ), содержащее вариабельную область тяжёлой цепи, содержащую определяющие комплементарность участки тяжелой цепи HCDR1, HCDR2 и HCDR3, и вариабельную область легкой цепи, содержащую определяющие комплементарность участки легкой цепи LCDR1, LCDR2 и LCDR3, где антитело специфически связывается с респираторно-синцитиальным вирусом, и в котором
аминокислотная последовательность HCDR1 представлена в SEQ ID NO: 32, аминокислотная последовательность HCDR2 представлена в SEQ ID NO: 33, аминокислотная последовательность HCDR3 представлена в SEQ ID NO: 34, аминокислотная последовательность LCDR1 представлена в SEQ ID NO: 35, аминокислотная последовательность LCDR2 представлена в SEQ ID NO: 36 и аминокислотная последовательность LCDR3 представлена в SEQ ID NO: 37; или
аминокислотная последовательность HCDR1 представлена в SEQ ID NO: 38, аминокислотная последовательность HCDR2 представлена в SEQ ID NO: 39, аминокислотная последовательность HCDR3 представлена в SEQ ID NO: 40, аминокислотная последовательность LCDR1 представлена в SEQ ID NO: 35, аминокислотная последовательность LCDR2 представлена в SEQ ID NO: 36 и аминокислотная последовательность LCDR3 представлена в SEQ ID NO: 43;
при этом аминокислотные последовательности определяющих комплементарность участков тяжелой цепи и определяющих комплементарность участков легкой цепи определены по номенклатуре Кэбота.
2. Антитело по п. 1, в котором аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела представлена в SEQ ID NO: 28 или 30.
3. Антитело по п. 1, в котором аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела представлена в SEQ ID NO: 29 или 31.
4. Антитело по пп. 1-3, в котором аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности, определенной в SEQ ID NO: 28 или 30, при этом аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности, определенной в SEQ ID NO: 29 или 31.
5. Антитело по любому из пп. 1-4, в котором аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела представлена в SEQ ID NO: 28, при этом аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела представлена в SEQ ID NO: 29; или
аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела представлена в SEQ ID NO: 30, при этом аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела представлена в SEQ ID NO: 31.
6. Антитело по любому из пп. 1-5, в котором антитело является нейтрализующим антителом.
7. Антитело по любому из пп. 1-5, в котором антитело способно к связыванию с F-белком респираторно-синцитиального вируса (РСВ) человека; при этом антитело предпочтительно способно к связыванию рекомбинантного F-белка РСВ человека, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 12 или 13.
8. Антитело по любому из пп. 1-5, в котором антитело представляет собой Fab-фрагмент, полное антитело, F(ab’)2-фрагмент или одноцепочечный Fv-фрагмент (scFv-фрагмент); при этом антитело предпочтительно представляет собой Fab-фрагмент.
9. Антитело по любому из пп. 1-5, в котором антитело является моноклональным антителом.
10. Антитело по любому из пп. 1-9, в котором антитело содержит константную область тяжёлой цепи подтипа IgG1, подтипа IgG2 или подтипа IgG4; при этом константная область тяжёлой цепи предпочтительно содержит Fc-фрагмент константной области тяжёлой цепи подтипа IgG1, при этом аминокислоты в положениях 252, 254 и 256 последовательности Fc-фрагмента представляют собой соответственно Y, T и E, при этом положения аминокислот константной области антитела определены согласно EU-нумерации.
11. Антитело по любому из пп. 1-9, в котором антитело содержит константную область легкой цепи подтипа каппа или подтипа лямбда.
12. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело по любому из пп. 1-11.
13. Применение антитела по любому из пп. 1-11 в производстве лекарственного средства для профилактики или лечения вызванного РСВ заболевания.
14. Применение по п. 13, где заболевание, вызванное РСВ, представляет собой бронхиолит или пневмонию.
15. Способ профилактики или лечения вызванного РСВ заболевания, включающий этап, на котором вводят нуждающемуся в этом субъекту антитело по любому из пп. 1-11.
16. Способ по п. 15, где заболевание, вызванное РСВ, представляет собой бронхиолит или пневмонию.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210871810.9 | 2022-07-22 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2024129759A RU2024129759A (ru) | 2024-12-02 |
| RU2847808C2 RU2847808C2 (ru) | 2025-10-15 |
| RU2847808C9 true RU2847808C9 (ru) | 2025-11-26 |
Family
ID=
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015010792A1 (en) * | 2013-07-24 | 2015-01-29 | Humabs Biomed Sa | Antibodies that potently neutralize rsv and uses thereof |
| RU2016133247A (ru) * | 2014-01-15 | 2018-02-20 | МЕДИММЬЮН, ЭлЭлСи | Rsv-специфичные антитела и их функциональные части |
| US10149903B2 (en) * | 2015-11-30 | 2018-12-11 | Eliteimmune Inc. | Fully human antibody against respiratory syncytical virus |
| CN110418803A (zh) * | 2017-03-01 | 2019-11-05 | 免疫医疗有限公司 | 抗rsv单克隆抗体配制品 |
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015010792A1 (en) * | 2013-07-24 | 2015-01-29 | Humabs Biomed Sa | Antibodies that potently neutralize rsv and uses thereof |
| RU2016133247A (ru) * | 2014-01-15 | 2018-02-20 | МЕДИММЬЮН, ЭлЭлСи | Rsv-специфичные антитела и их функциональные части |
| US10149903B2 (en) * | 2015-11-30 | 2018-12-11 | Eliteimmune Inc. | Fully human antibody against respiratory syncytical virus |
| CN110418803A (zh) * | 2017-03-01 | 2019-11-05 | 免疫医疗有限公司 | 抗rsv单克隆抗体配制品 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111620945B (zh) | 一种抗新型冠状病毒的单克隆抗体或其衍生体 | |
| US9605053B2 (en) | Influenza virus-neutralizing antibody and screening method therefor | |
| CN104892753B (zh) | 一种中和人感染h7n9甲型流感病毒的抗体及其用途 | |
| CN111333723B (zh) | 针对狂犬病病毒g蛋白的单克隆抗体及其用途 | |
| US20100080813A1 (en) | Neutralizing anti-influenza a virus antibodies and uses thereof | |
| JP6050747B2 (ja) | インフルエンザ受動免疫化に有用な抗体 | |
| NZ585589A (en) | Anti-rsv g protein antibodies | |
| US20240207401A1 (en) | Coronavirus antibody | |
| JP2024522670A (ja) | 呼吸器合胞体ウイルスに対する抗体及びその使用 | |
| US20100074906A1 (en) | Antibodies Specific for Varicella Zoster Virus | |
| RU2847808C9 (ru) | Нейтрализующее респираторно-синцитиальный вирус антитело и его применение | |
| RU2847808C2 (ru) | Нейтрализующее респираторно-синцитиальный вирус антитело и его применение | |
| WO2024016843A1 (zh) | 用于表达Fab片段库的重组系统 | |
| Zhang et al. | A recombinant avian antibody against VP2 of infectious bursal disease virus protects chicken from viral infection | |
| EP4063384A1 (en) | Human neutralizing antigen specific proteins for spike-rbd of sars-cov-2 | |
| US20250388652A1 (en) | Anti-respiratory syncytial virus neutralizing antibody and use thereof | |
| EP4559931A1 (en) | Anti-respiratory syncytial virus neutralizing antibody and use thereof | |
| Xiao et al. | Development of a potent neutralizing nanobody against canine distemper virus hemagglutinin protein | |
| CN116284353B (zh) | 一种单克隆抗体及其用途 | |
| Coelho | Isolation of human recombinant antibodies anti-SARS-CoV-2 by synthetic methods | |
| KR20210067552A (ko) | 중동호흡기증후군 코로나바이러스에 대한 결합 분자 및 이를 포함하는 중화용 약학 조성물 | |
| HK1191974A (en) | Influenza virus neutralizing antibody and method for screening same | |
| HK1184188A (en) | Influenza virus neutralizing antibody and method for screening same |