RU2847624C2

RU2847624C2 - Композиция молекул малых интерферирующих РНК и пептида против риновирусной инфекции

Info

Publication number: RU2847624C2
Application number: RU2024108225A
Authority: RU
Inventors: Муса Рахимович Хаитов; Игорь Петрович Шиловский; Валерий Валерьевич Смирнов; Сергей Михайлович Андреев; Илья Андреевич Кофиади; Артем Андреевич Шатилов; Анастасия Витальевна Шатилова; Екатерина Драгановна Тимотиевич; Валерия Ивановна Ковчина
Filing date: 2024-03-28
Publication date: 2025-10-10

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии. Описана композиция, в состав которой входят один из двух вариантов молекул малых интерферирующих РНК (миРНК), нацеленных против генома риновируса, и носителя - катионного дендримерного пептида КК-46. Обе молекулы миРНК (siRV-5UTR-4-3 и siRV-5UTR-5-3) представлены в виде двух комплементарных цепей. Молекула siRV-5UTR-4-3 состоит из мысловой цепи с составом GCUUAUGGUGACAAUAUAUTT и антисмысловой AUAUAUUGUCACCAUAAGCTT. Молекула способна подавлять репликацию HRV-A путем подавления транскриптов консервативных участков 5’UTR последовательности генома вируса. Молекула siRV-5UTR-5-3 состоит из смысловой цепи ACUUUGGGUGUCCGUGUUUTT и антисмысловой AAACACGGACACCCAAAGUTT. миРНК способна связываться с различными участками молекулы РНК HRV всех трех видов и подавлять их репликацию. Также siRV-5UTR-5-3 отличается от транскриптов генома человека на 3 нуклеотида, что достаточно для минимизации «off-target-эффектов». Дендримерный катионный пептид КК-46 обладает доказанной трансфекционной активностью, способен доставлять миРНК в клетки млекопитающих и характеризуется структурой R₈K₄W₄T₄P₄E₄V₄K₂H₂KFC. Композиция siRV-5UTR-4-3/КК-46 и/или siRV-5UTR-5-3/КК-46 может быть использована для лечения и профилактики проявлений риновирусной инфекции, связанных с репликацией вируса. 5 ил., 3 табл., 4 пр.

Description

Изобретение относится к медицине, биотехнологии, вирусологии, и заключается в получении комбинированной композиции, обладающего противовирусным эффектом в отношении риновируса человека (HRV). Изобретение представляет собой композицию, в состав которой входят молекулы малых интерферирующих РНК, нацеленные на геном риновируса, и пептид-носитель. Противовирусное действие композиции основано на механизме РНК-интерференции (РНКи) и включает специфическое распознавание геномных мишеней вируса с последующим привлечением собственных белковых комплексов клетки, разрушающих вирусный геном (и его мРНК-транскрипты) и тем самым нарушающих процесс репликации вируса. Композиция может быть использована для лечения и профилактики проявлений риновирусной инфекции, связанных с размножением вируса.

Риновирусы человека (HRV), вызывающие инфекцию верхних дыхательных путей, относятся к роду Enterovirus семейства Picornaviridae. Риновирусы были открыты еще в 1950-х годах прошло столетия, с тех пор их систематика претерпевала значительные изменения [1]. Текущая таксономия и классификация риновирусов и энтеровирусов основана на различиях в белках капсида, в частности VP4/VP2 и VP1 [2]. К настоящему моменту, HRV подразделяются на следующие виды: HRV-A (100 генотипов), HRV-B (30 генотипов) и HRV-C (50 генотипов) [3, 4].

Риновирусы - это безоболочечные вирусы, а их геном представлен одноцепочечной РНК положительной полярности длиной около 7200 нуклеотидов. Адгезия вируса на поверхности клетки происходит путем связывания белка капсида VP1 с рецептором поверхности клетки-хозяина. В зависимости от вида рецепторами могут быть молекулы внутриклеточной адгезии 1 (ICAM-1), рецепторы липопротеинов низкой плотности (LDLR) или гепарансульфаты [3]. Эти рецепторы обычно экспрессируются в эпителиальных клетках дыхательных путей. В зависимости от типа рецептора захват вируса происходит посредством эндоцитоза или макропиноцитоза. Затем происходит высвобождение вирусного генома засчет понижения рН в эндосомах. В цитозоле вирусная РНК транслируется в полипротеин, который расщепляется вирусными протеазами на более мелкие белки. Репликация вирусной РНК проходит через стадию РНК отрицательной полярности, с которой затем синтезируются РНК положительной полярности. На завершающем этапе происходит сборка новых вирионов. Выход вируса из клеток происходит путем их лизиса [2].

Риновирусы способны вызывать патологии респираторного тракта, включающие ринит, боль в горле, кашель, бронхит и пневмонию. Инфекция HRV, также, может быть связана с различными осложнениями дыхательных путей, такими как бронхиолит, пневмония, синусит и острый средний отит. HRV также способствует обострению хронических респираторных заболеваний, таких как астма, муковисцидоз и хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) [5, 6]. К настоящему моменту четко установлена связь между сезонными обострениями астмы и HRV. Респираторные вирусы (среди которых часто преобладает HRV) являются триггерами обострений астмы в более чем 50% случаев [6]. По прогнозам Всемирной организации здравоохранения в ближайшие несколько десятилетий, подобные обострения станут одной из основных причин смертности среди пациентов, страдающих бронхиальной астмой [7].

Показано, что HRV вовлечен в активацию Th2-иммунного ответа, усиливая его [8]. В частности, риновирусы способны активировать фактор транскрипции STAT6, а, следовательно Th2-цитокинов (IL-4, IL-5 и IL-13), а также IL-25 и IL-33 и хемокинов. Показано, что повышение уровня продукции IL-33 эпителием в ответ на инфекцию коррелирует с тяжестью астмы, а продукция IL-5 и IL-13 с вирусной нагрузкой. Клетки ILC2 являются важными источниками Th2-цитокинов (IL-5 и IL-13), что приводит к превлечению в дыхательные пути эозинофилов, активации тучных клеток, а также к гиперпродукции слизи бронхиальным эпителием. У пациентов с астмой инфекция HRV приводит к увеличению эозинофилии в дыхательных путях, а также числа ILC2, причем их количество коррелирует с тяжестью обострения и продолжительностью инфекции HRV [6].

По причине разнообразия серотипов вируса вакцинация против HRV невозможна [9]. Несмотря на достижения в области разработки противовирусных средств, к настоящему времени не были одобрены специфические противовирусные препараты против HRV-инфекции [10]. Можно выделить несколько групп антивирусных препаратов против риновируса: ингибиторы связывания вируса с клеткой (самыми распространенными среди них являются пиродавир и плеконарил), ингибиторы репликации (рибавирин, кверцитин), блокаторы вирусных протеаз (рупинтривир), ингибиторы провоспалительных цитокинов (будесонид), экзогенные «усилители» врожденного иммунного ответа хозяина (дефензины, IFN-β, азитромицин) [11]. Имеются данные об исследовании приема витамина С, цинка и антигистаминных препаратов при риновирусной инфекции. Прием этих препаратов улучшал состояние пациентов, однако значительного снижения вирусной нагрузки не происходило [3]. На сегодняшний день активно продолжается поиск средств противовирусной терапии в отношении HRV-инфекции.

В последнее время активно развивается стратегия создания противовирусных препаратов, основанная на применении явления РНК-интерференции [12, 13]. Под РНК-интерференцией понимают естественный механизм регуляции экспрессии генов в клетке с участием фермента Dicer и молекул малых интерферирующих РНК (миРНК) [14]. С началом пандемии COVID-19 внимание разработчиков лекарственных средств было сосредоточено на создании стратегий противовирусной терапии. Так, в России был разработан и зарегистрирован препарат МИР 19 (siR-7-EM/KK-46) для лечения COVID-19 [15], активно применяется в клинической практике [16, 21].

Открытие РНК интерференции дало новые возможности для регуляции экспрессии патогенетически-значимых генов, в том числе и генов, вовлеченных в развитие риновирусной инфекции. РНКи активируется молекулами малых интерферирующих РНК (миРНК), которые имеют нуклеотидную последовательность комплементарную гену-мишени. Главными преимуществами использования препаратов на основе РНКи являются высокая специфичность и эффективность подавления гена-мишени (более чем на 90%), а также то, что вводимые миРНК способны действовать в крайне низких концентрациях. Кроме того, привлекательной является сравнительная дешевизна методики.

Известны патентные документы, в которых описаны молекулы миРНК против респираторных заболеваний человека.

В патенте CN 108271387 B описано изобретение, представляющее собой смысловые цепи миРНК длиной от 15 нуклеотидов против генов Р, N или L респираторно-синцитиального вируса (РСВ). Молекулы демонстрируют снижение титров РСВ при введении препарата интраназально.

В патенте KR 102272800 B1 описано изобретение, включающее олигомерные соединения, содержащие от 8 до 80 нуклеиновых оснований, нацеленных на молекулу генома вируса SARS. Молекулы миРНК гибридизуются с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей геном вируса, и снижают репликацию вируса более чем на 50%. Отличие представленных изобретений от патентуемого является отсутствие эффективного носителя для молекул терапевтических миРНК.

Одной из главных проблем при использовании лекарственных средств, работающих на основе РНКи, является внутриклеточная доставка молекул миРНК в клетки-мишени.

Поэтому нами был оценен технический уровень и тенденции развития способов невирусной доставки молекул миРНК на основе катионных пептидов.

В патенте US 20090093026 A1 описано изобретение - гибридные полипептиды и структуры, способные к транспорту отрицательно заряженных молекул нуклеиновой кислоты в клетки. Они могут состоят из сшитых между собой домена трансдукции белка (проникающие пептиды) и домена связывания с нуклеиновой кислотой, либо самой нуклеиновой кислоты.

Из US 20130164219 A1 известны пептидные соединения, способные проникать в клетки млекопитающих. Описанные пептиды имеет длину от 10 до 15 аминокислотных остатков и содержат в своей первичной аминокислотной последовательности по меньшей мере 25-30% положительно заряженных аминокислотных остатков. Эффективность проникновения таких пептидов в клетки сопоставима с эффективностью проникновения известного пептида ТАТ. Заявленные пептиды образуют альфа-спиральную вторичную структуру. Разрабатываемый носитель (КК-46) в заявленной композиции, хотя и имеет в своем составе аргинин и лизин, но не формирует альфа-спиральную вторичную структуру, а также содержит иные аминокислоты.

В US 20130281658 A1 описана композиция, разработанная для адресной доставки молекул миРНК в гепатоциты in vivo. Для этой цели молекулы миРНК либо химически, либо электростатически объединяют с пептидами, являющимися производными мелиттина. Такой подход обеспечивает эффективную передачу миРНК через клеточные мембраны. Важным является использование пептидов - производных мелиттина, как природного соединения. Также, авторами изобретения предлагается формирование комплекса пептидов с галактозой, что позволяет композиции специфически взаимодействовать с асиалогликопротеиновыми рецепторами, которые обширно присутствуют на поверхности гепатоцитов. Механизм взаимодействия между носителем в нашем изобретении и транспортируемой молекулой основан на электростатическом взаимодействии, как и в предлагаемом патенте. Однако пептид-носитель (КК-46) в заявленной композиции представляет собой полностью синтетическое соединение и не имеет структурных аналогий с природными пептидами, включая мелиттин.

В документе US 20130137644 A1 описано изобретение, которое представляет собой композицию пептида и нуклеиновой кислоты, а также гидрофильный полимер, предпочтительно полиэтиленгликоль, который объединяет пептид и нуклеиновую кислоту. Патент также раскрывает методы создания и возможные способы использования таких конструкций. Согласно информации заявителя, это изобретение обеспечивает эффективную доставку молекул миРНК в клетки как in vitro, так и in vivo. Патентуемая нами композиция отличается по химической структуре и использует другой механизм взаимодействия с нуклеиновой кислотой.

В патентах RU 2771605 C2 и RU 2572575 C1 представлены изобретения относящиеся к внутриклеточным способам доставки нуклеиновых кислот. Описанные в данных изобретениях катионные дендримерные пептиды, представляющие собой разветвленные трехмерные структуры с плотным ядром и внешним слоем, состоящим из одних и тех же заряженных группировок. Пептиды эффективно доставляют молекулы нуклеиновых кислот в клетки.

В патенте RU 2746362 C1 описано комбинированное лекарственное средство, обладающее противовирусным эффектом в отношении коронавируса SARS-CoV-2. Изобретение содержит эффективное количество молекул миРНК, направленных против генома вируса SARS-CoV-2, представленных в виде двух комплементарных цепей, и дендримерный катионный пептид, обладающий трансфекционной активностью - КК-46. В данном изобретении молекулы миРНК направлены против вируса SARS-CoV-2, что отличает его от заявленной композиции, в которой миРНК направлены против генома риновируса.

Целью исследования является создание противовирусного средства, действие которого основано на механизме РНК-интерференции.

Изобретение представляет собой композицию одного из двух вариантов молекул миРНК, направленных против генома риновируса, и дендримерного катионного пептида. Дендримерный катионный пептид (КК-46) обладает доказанной трансфекционной активностью [15, 21]. В данном изобретении предлагается применение данной композиции для профилактики или лечения риновирусной инфекции.

Композиция для профилактики или лечения риновирусной инфекции, вызываемой HRV, содержит: (i) эффективное количество молекул миРНК, направленные против генома HRV, представленных в виде двух вариантов комплементарных цепей с нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO 1 и SEQ ID NO 2 или SEQ ID NO 3 и SEQ ID NO 4, (ii) дендримерный катионный пептид, обладающий трансфекционной активностью и характеризующийся структурной формулой R₈K₄W₄T₄P₄E₄V₄K₂H₂KFC, где аминокислоты представляют собой: R - аргинин, K - лизин, W - триптофан, Т - треонин, V - валин, Р -пролин, Е - глутаминовую кислоту, Н - гистидин, F - гидрофобный аминокислотный остаток, содержащий фенилаланин, С - цистеин.

В данном контексте эффективное количество означает количество агента, подлежащего доставке (в частности, миРНК), которое является достаточным при введении субъекту, страдающему от риновирусной инфекции, с целью лечения, улучшения симптомов, предупреждения и/или отсрочки возникновения инфекции, заболевания.

Эффективное количество миРНК может варьироваться в зависимости от таких факторов, как состояние болезни, возраст, пол и вес индивидуума. Эффективное количество молекул малых интерферирующих РНК представляет собой количество, необходимое для осуществления по меньшей мере 25% снижения параметра, например, ингибирования репликации HRV.

Дендримерный катионный пептид КК-46 обладает трансфекционной активностью и характеризуется структурой R₈K₄W₄T₄P₄E₄V₄K₂H₂KFC (фиг. 1). Таким образом, полученное средство обеспечивает эффективную и безопасную доставку синтетических миРНК, что позволяет проводить противовирусную терапию на основе РНК-интерференции.

Диапазон эффективного количества ДКП составляет 0,01-5,0 мг/мл.

Массовое соотношение молекул малых интерферирующих РНК и ДКП в целом может составлять от 2:1 до 1:2000, например от 1:1 до 1:1000, от 1:2 до 1:100 или от 1:5 до 1:50. Более предпочтительно это соотношение составляет от 1:10 до 1:50, например от 1:15 до 1:25.

Последовательности, характеристики и мишени молекул миРНК, входящих в изобретение, указаны в таблице 1 (SEQ ID NO 1-21).

Технический результат заключается в создании эффективного противовирусного средства, обеспечивающего подавление репликации риновируса и безопасную его доставку в клетки-мишени.

Указанный технический результат достигается тем, что синтетические миРНК представляющие собой дуплексы комплементарных одноцепочечных РНК с нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:3 и SEQ ID NO:4 в составе композиции целенаправленно воздействуют на специфические участки одного или нескольких участков гена риновируса. Молекула siRV-5UTR-4-3 (SEQ ID NO 1 и SEQ ID NO 2) способна подавлять репликацию HRV-A путем подавления транскриптов консервативных участков 5’UTR последовательности генома вируса. Молекула siRV-5UTR-5-3 (SEQ ID NO 3 и SEQ ID NO 4) способна связываться с различными участками молекулы РНК HRV всех трех видов вируса (HRV-A, HRV-B и HRV-C) и подавлять их репликацию. Также, siRV-5UTR-5-3 отличается от транскриптов генома человека на 3 нуклеотида, что также достаточно для минимизации «off-target-эффектов».

Средство предназначено для ингаляционного или интраназального введения.

Сущность заявляемого изобретения поясняется изображениями.

Краткое описание графических материалов.

Фигура 1. Химическая структура дендримерного катионного пептида КК-46.

Фигура 2. Выравнивание девяти последовательностей геномов вируса HRV-A (А) и последовательностей 5’UTR-региона референтных последовательностей геномов HRV-A, HRV-B и HRV-C (Б).

Фигура 3. Противовирусный эффект миРНК in vitro. Титры вируса в супернатантах клеток методом титрования (А), количество копий вирусной РНК (vRNA) методом количественной ПЦР (Б). * - статистически значимо отличается от групп HRV, siHCV и siGFP по методу Краскела-Уоллиса, (р≤0,05). N=10.

Фигура 4. Противовирусный эффект композиций миРНК и пептида-носителя КК-46 in vitro. Титры вируса в супернатантах клеток методом титрования (А), количество копий вирусной РНК (vRNA) методом количественной ПЦР (Б). * - статистически значимо отличается от HRV, × - от siHCV/KK-46 по методу Краскела-Уоллиса, (р≤0,05). N=6.

Фигура 5. Оценка количества копий вирусной РНК в смывах с носовой полости. * -статистически значимо отличается от группы «HRV», р≤0,05; ^× - статистически значимо отличается от группы «siHCV/KK-46», р≤0,05.

Пример 1. Биоинформационный анализ генома риновинуса и проектирование молекул миРНК.

Биоинформационный анализ геномов риновируса проводился в программе Vector NTI (ThermoFisher, США). Последовательности расшифрованных референтных геномов риновируса получены из базы данных Gene Bank (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=Web&PAGETYPE=BLASTHome). Проведено выравнивание последовательностей 9 геномов вируса HRV-A (вид А). Номера последовательностей в GeneBank: JN815255.1, JN837694.1, JQ837724.1, KC894166.1, KC894167.1, KC894169.1, MF973193.1, MF973194.1 и MK989733.1. Выявлено, что внутри вида HRV-A наиболее консервативным участком является 5’UTR (нетранслируемый регион 5’-конца), сходство среди геномов риновируса составляет 75% (фиг. 2А). С целью создать миРНК, активную против всех трех видов риновируса (А, В и С), мы провели дополнительный анализ наиболее консервативного региона 5’UTR с использованием референтных последовательностей геномов HRV-A, HRV-B и HRV-C. Номера референтных последовательностей в GeneBank: NC_038311.1, NC_038312.1 и NC_038878.1 Показано наличие 2 участков (размером 20 и 22 нуклеотидов) с 100% идентичностью среди трех видов риновируса и протяженностью достаточной для отжига молекул миРНК (фиг. 2Б).

Проектирование молекул миРНК и расчет их возможной эффективности проведено с использованием программы OligoWalk (https://rna.urmc.rochester.edu/cgi-bin/server_exe/oligowalk/oligowalk_form.cgi), которая рассчитывает термодинамические параметры гибридизации РНК-олигонуклеотидов, предсказывает их свободную энергию связывания с мРНК-мишенью. Было спрогнозировано 125 различных вариантов молекул миРНК. Выбор осуществлялся в соответствии с рядом критериев, описанных в [17-20]. Синтезированы 7 наиболее оптимальных вариантов миРНК. Последовательности и характеристики молекул миРНК указаны в таблице 1. Из 7 вариантов 4 молекулы миРНК (siRV-5UTR-l-3, siRV-5UTR-2-2, siRV-5UTR-3-19 и siRV-5UTR-4-3) были направленны против консервативных участков 5’UTR-региона HRV-A, в то время как в геномах HRV-B и HRV-C мишень для этих миРНК отсутствует ввиду изменчивости патогена. Один вариант миРНК (siRV-5UTR-5-3) направлен к самому консервативному участку 5’UTR-региона, в связи с этим мишень для этого варианта присутствует в геномах всех 3 видов риновируса (HRV-A, HRV-B и HRV-C). Еще 2 варианта миРНК были направлены к наименее консервативному участку 5’UTR-региона, соответственно мишень для них присутствует лишь у отдельных изоляторов HRV-A.

Синтез и очистка смысловых и антисмысловых цепей миРНК осуществлялись компанией «Синтол» (Россия) методами стандартного твердофазного амидофосфатного синтеза на автоматическом ДНК/РНК синтезаторе (Polygen, Германия).

Для сборки двухцепочечных молекул миРНК из индивидуальных цепей проводили путем их отжига. Для этого смешивали водные растворы эквимолярных количеств смысловой и антисмысловой цепей РНК с последующим образованием между ними водородных связей по принципу комплементарности. В результате отжига две цепи РНК образуют прочный дуплекс - двухцепочечную молекулу миРНК. Для этого каждый олигонуклеотид индивидуально растворяли в объеме деионизованной воды, необходимом для достижения во всех образцах концентрации 100 мкг/мкл миРНК. Растворитель для молекул РНК имел следующий состав: 100 mM CH₃COOK, 30 mM HEPES, рН=7,5 в воде. Далее смесь помещали в программируемый термостат ТП4-ПЦР-01-«Терцик» (ДНК-технология, Россия) и запускали следующую температурную программу: 92°С - 2 минуты, 37°С - 1 час, 10°С - 10 минут. Хранение полученного раствора двуцепочечных молекул миРНК осуществляли при -20°С.

Пример 2. Скрининг биологической активности библиотеки молекул миРНК in vitro.

Скрининг биологической активности синтезированных молекул миРНК проводили оценивая эффективность сайленсингового эффекта миРНК на клеточной модели репликации HRV.

Для проведения эксперимента клетки HeLa Ohio (рак шейки матки человека, производное родительской линии HeLa) высаживали в 24-луночный планшет в количестве 70 тыс. клеток на лунку в 600 мкл полной питательной среды DMEM (10% фетальной бычьей сыворотки, 2% буферного раствора HEPES, 0,1% антибиотика гентамицина, 0,6% L-глутамина) накануне эксперимента и инкубировали сутки при 37°С в СО₂ инкубаторе до достижения 75% конфлюентности. Перед внесением миРНК в лунках с клетками заменяли полную питательную среду DMEM на бессыворточную среду DMEM в количестве 500 мкл (2% буферного раствора HEPES, 0,1% антибиотика гентамицина, 0,6% L-глутамина). Дисперсию исследуемой композиции общим объемом 100 мкл, состоящего из 0,5 мкг миРНК и 1 мкл коммерческого трансфекционного реагента Lipofectamine 3000, готовили в бессывороточной среде optiMEM. Приготовленные смеси выдерживали 15 мин при комнатной температуре и вносили в лунки с монослоем клеток. В качестве отрицательного контроля клетки обрабатывали 100 мкл бессывороточной среды optiMEM, не содержащей молекул миРНК. Клетки инкубировали при 37°С в СО₂ инкубаторе в течение 4 часов. После чего удаляли смеси миРНК/Lipofectamine3000/optiMEM и заражали клетки HRV штамм В1 (относится к виду А риновируса) при MOI=0,01 в бессывороточной среде объемом 500 мкл, инкубировали 1 час при 37°С в СО₂ инкубаторе. Затем производили замену культуральной среды на полную питательную среду DMEM в количестве 400 мкл для создания оптимальных условий культивирования клеток. На протяжении 3 суток после инфекции отбирали аликвоты культуральной среды для последующего титрования методом Рида-Менча на монослое клеток HeLa Ohio. Титр вируса рассчитывали методом Спирмена-Кербера. Противовирусную активность миРНК оценивали относительно контрольного вещества - физиологической раствор. Для чего титр вируса, обработанного физиологически раствором, принимали за 100% и относительного этого значения в % рассчитывали титр вируса после обработки исследуемыми пептидами.

На 3 день собирали клеточные лизаты, из которых затем выделяли РНК для последующей постановки реакции РТ-ПЦР с целью определения количества копий вирусной РНК. Клетки лизировали непосредственно в лунке без использования механических и ферментативных методов отделения. Каждый вариант миРНК был изучен в 1 концентрации в дублях в 12-х независимых повторах. Общую РНК из клеток выделяли с помощью набора RNeasy Mini Kit (Qiagen, Германия) в соответствии с рекомендацией производителя. Общую РНК использовали в реакции обратной транскрипции для получения библиотеки кДНК с применением набора RevertAid Н Minus Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, США) в соответствии с рекомендациями производителя. Количественную ПЦР проводили с использованием набора реактивов “Синтол” (Синтол, РФ).

В качестве положительного контроля использовали клетки, зараженные HRV. В качестве отрицательных контролей в эксперименте использовались неспецифические молекулы миРНК, направленные против мРНК-gƒp (siGFP), которые подавляют экспрессию гена gƒp, продуктом которого является зеленый флуоресцентный белок медузы, и миРНК против мРНК-5’UTR вируса гепатита С (siUTR). Также, в эксперименте присутствовали интактные клетки.

В результате титрования супернатантов было показано, что на второй день инкубации все варианты молекул миРНК статистически значимо снижали титр HRV, а на третий день инкубации 5 из 7 вариантов исследуемых миРНК (siRV-5UTR-2-2, siRV-5UTR-3-19, siRV-5UTR-4-3, siRV-5UTR-l10, siRV-5UTR-5-3) статистически значимо снижали титр вируса; в среднем в 5 раз относительно отрицательных контролей. В группе с интактными клетками гибели не наблюдалось. Наилучшими вариантами миРНК по результатам титрования отказались молекулы siRV-5UTR-4-3 и siRV-5UTR-5-3, снижающие титр риновируса на 85% и 87%, соответственно (фиг. 3, табл. 2).

В результате количественной оценки числа копий вирусных РНК в лизатах клеток, полученных на 3 день инкубации молекул миРНК с HRV выявлено, что 6 из 7 синтезированных вариантов молекул миРНК статистически значимо снижали титр вируса по сравнению с отрицательными контролями. Наилучшими вариантами миРНК по результатам количественной ПЦР-анализа оказались молекулы siRV-5UTR-4-3 и siRV-5UTR-110, снижающие титр риновируса на 95% и 98%, соответственно. Также, высокий процент подавления репликации HRV показан для следующих вариантов: siRV-5UTR-3-19, siRV-5UTR-5-3, siRV-5UTR-2-2 (фиг. 3, табл. 2).

По совокупности полученных данных выявлено, что максимальной противовирусный эффект обеспечивали варианты молекул миРНК siRV-5UTR-4-3 и siRV-5UTR-5-3. Данные варианты миРНК эффективно подавляли репликацию HRV в сравнении с использованием контрольных миРНК (siGFP и siUTR), что свидетельствует о сиквенс-специфическом подавлении репликации HRV в клетках.

Пример 3. Противовирусная активность композиции миРНК и пептида-носителя КК-46

В данном изобретении в качестве носителя миРНК использован катионный дендримерный пептид КК-46. Мы провели дополнительную серию экспериментов, в которых изучили противовирусные эффекты 2-х вариантов миРНК, доставляемых в клетки при помощи пептида-носителя КК-46, созданного ранее [16, 21]. При формировании композиции миРНК/КК-46 использовали соотношение компонентов 1:20 по массе [21].

Учитывая результаты скрининга биологической активности миРНК, в данной серии экспериментов мы испытали противовирусные свойства 2-х вариантов миРНК (siRV-5UTR-4-3 (SEQ ID NO 1 и SEQ ID NO 2) и siRV-5UTR-5-3 (SEQ ID NO 3 и SEQ ID NO 4)) в сочетании с пептидом-носителем KK-46 (композиции siRV-5UTR-4-3/КК-46 и siRV-5UTR-5-3/КК-46, соответственно). Противовирусную активность композиций in vitro оценивали по уменьшению вирусной нагрузки на модели репликации HRV. Для этого культуру клеток HeLa Ohio в количестве 70000 кл/лунку засевали в 24-луночный плейт в полной питательной среде DMEM и инкубировали до образования монослоя конфлюентностью 75%. Далее заменяли среду на бессывороточную и вносили раствор композиций, содержащего миРНК против HRV-1B и пептид-носитель КК-46 в конечной концентрации 125 мкг/мл (6,25 мкг миРНК и 118,75 мкг пептида). Композицию неспецифической миРНК против генома вируса гепатита С (siHCV) и КК-46, использовали в качестве отрицательного контроля. Дополнительным отрицательным контролем выступали клетки, обработанные пептидом КК-46 без миРНК.

Оба варианта миРНК в сочетании с КК-46 статистически значимо снижали титр вируса по сравнению с отрицательным контролем; титр вируса в супернатантах клеток, обработанных композициями «siRV-UTR-4-3/KK-46» и «siRV-UTR-5-3/KK-46» снижался в 61 раз по сравнению отрицательным контролем (фиг. 4А). Данные титрования были подтверждены количественной оценкой копий вирусной РНК. Исследуемые композиции статистически значимо снижали вирусную нагрузку по сравнению с отрицательным контролем. Количество копий вирусной РНК в лизатах клеток, обработанных композициями siRV-UTR-4-3/KK-46 и siRV-UTR-5-3/KK-46 снижалось в 42 и 14 раз по сравнению с отрицательным контролем (фиг. 4Б). Примечательно, что обработка пептидом КК-46 без миРНК не приводило к уменьшению вирусной нагрузки, это свидетельствует о том, что противовирусный эффект композиций обеспечивается специфическим действием молекул миРНК.

Пример 4. Противовирусная активность композиции миРНК/КК-46 in vivo.

Для изучения биологической активности (способности подавлять репликацию риновируса) композиции миРНК с выбранным пептидным носителем in vivo использовали модель риновирусной инфекции у мышей. Мыши были разделены на 5 групп (табл. 3) так, чтобы среднее значение веса в группе отличалось не более чем на 0,2 г. Группа 1 «HRV» включала мышей, не получавших терапии; в группу 2 «siHCV/КК-46» входили животные, получавшие терапию композицией, состоящий из неспецифических молекул миРНК, направленных против генома вируса гепатита С и пептида-носителя; группе 3 «siRV-5UTR-5-3/КК-46» и группе 4 «siRV-5UTR-5-3/КК-46» вводили композиции, содержащие специфические миРНК (siRV-5UTR-4-3 (SEQ ID NO 1 и SEQ ID NO 2) и siRV-5UTR-5-3 (SEQ ID NO 3 и SEQ ID NO 4)) и пептид-носитель; группа 5 «Интактные» не подвергалась никаким манипуляциям. Животным экспериментальных групп интраназально вводили композиции в дозе 10 мкг/мышь за 1 час до и после инфицирования риновирусом. HRV-1 В вводили мышам интраназально в дозе 1*10⁶ ТЦД₅₀/мышь в 50 мкл PBS («ПанЭко», Россия). В качестве отрицательного контроля мышам вводили композицию (siHCV/KK-46), состоящий из неспецифических молекул миРНК, направленных против генома вируса гепатита С (siHCV) и пептида-носителя. Через 24 часа после инфицирования проводили некропсию и отбирали смывы с носовой полости для последующего определения вирусной нагрузки методом количественной ПЦР.

После инфицирования мышей вирусом в смывах носовых хоан в среднем детектировалось 1,8*10⁶ копий на 1 мкг общей РНК (фиг. 5). После интраназального введения композиции с молекулой неспецифической миРНК в смывах обнаруживалось в 2,6 раза меньше вирусной РНК чем в группе положительного контроля. У мышей группы «Интактные» РНК риновируса не определялась. Оба варианта молекул миРНК в сочетании с КК-46 статистически значимо снижали вирусную нагрузку в слизистой оболочке носовой полости. Вариант миРНК siRV-UTR-5-3 снижал вирусную нагрузку в 8 раз, а вариант siRV-UTR-4-3 в 10 раз по сравнению с мышами, получавшими неспецифические миРНК (фиг. 5). Эти данные свидетельствуют, о сиквенс-специфическом подавлении репликации риновируса.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

AGO - белок «Argonaute»

EGS - внешняя направляющая последовательность

HRV-A - человеческий риновирус типа А

HRV-B - человеческий риновирус типа В

HRV-C - человеческий риновирус типа С

HRVs - человеческие риновирусы

ICAM-I - межклеточные адгезивные молекулы класса I

IL-10 - интерлейкин 10

IP-10 - ИФНу-индуцируемый белок 10

IRES - участок внутренней посадки рибосомы

LDLR - рецептор к липопротеинам низкой плотности

RISK - РНК-индуцируемый комплекс сайленсинга генов

TLR-2 - Толл-подобный рецептор 2

UTR - untranslated region

AT - антитела

АТФ - аденозинтрифосфат

БА - бронхиальная астма

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

миРНК - малая интерферирующая рибонуклеиновая кислота

мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота

ОРВИ - острая респираторно-вирусная инфекция

РВ - риновирус

РНК - рибонуклеиновая кисота

ХОБЛ - хроническая обструктивная болезнь легких

ТЦД₅₀ - тканевая цитопатическая доза с цитопатическим действием в 50% клеток монослоя

СПИСОК ЛИТЕРАТУРНЫХ источников

1. Jacobs S.E. et al. Human rhinoviruses // Clin Microbiol Rev. - 2013. - T. 26. - №1. - C. 135 - 162.

2. To K.K.W., Yip C.C.Y., Yuen K.Y. Rhinovirus - From bench to bedside // J Formos Med Assoc. - 2017. - Т. 116. - №7. - C. 496-504.

3. Rollinger J.M., Schmidtke M. The human rhinovirus: human-pathological impact, mechanisms of antirhinoviral agents, and strategies for their discovery // Med Res Rev. Wiley-Blackwell. - 2011. - T. 31. - №1. - C. 42.

4. Hayashi Y. et al. Rhinovirus Infection and Virus-Induced Asthma // Viruses. - 2022. - T. 14. - №12.

5. Lee J.S. et al. Anti-Human Rhinovirus 1B Activity of Dexamethasone viaGCR-Dependent Autophagy Activation // Osong Public Health Res Perspect. Korea Centers for Disease Control and Prevention. - 2018. - T. 9. - №6. - C. 334.

6. Jackson D.J., Gern J.E. Rhinovirus Infections and Their Roles in Asthma: Etiology and Exacerbations // J Allergy Clin Immunol Pract. NIH Public Access. - 2022. - T. 10. - №3. - C. 673.

7. Gunawardana N. et al. Experimental rhinovirus infection in COPD: implications for antiviral therapies // Antiviral Res. - 2014. - T. 102. - C. 95-105.

8. Price A.S., Kennedy J.L. T-helper 2 mechanisms involved in human rhinovirus infections and asthma // Ann Allergy Asthma Immunol. - 2022. - T. 129. - №6. - C. 681-691.

9. Casanova V. et al. Antiviral therapeutic approaches for human rhinovirus infections // Future Virol. - 2018. - T. 13. - №7. - C. 505-518.

10. Ruuskanen O., Waris M., Ramilo O. New aspects on human rhinovirus infections // Pediatr Infect Dis J.. - 2013. - T. 32. - №5. - C. 553-555.

11. Coultas J.A. et al. Experimental Antiviral Therapeutic Studies for Human Rhinovirus Infections // J Exp Pharmacol. - 2021. - T. 13. - C. 645-659.

12. Shilovskiy I.P. et al. Molecular and Cellular Mechanisms of Respiratory Syncytial Viral Infection: Using Murine Models to Understand Human Pathology // Biochemistry (Moscow). - 2021. - T. 86. - №3. - C. 290-306.

13. Khaitov M.R. et al. RNA interference. New approaches to the development of antiviral agents. // Immunologiya. 2010 - Т. 31. - C. 69-76.

14. Whangbo J.S., Hunter CP. Environmental RNA interference // Trends Genet.. - 2008. - T. 24. - №6. - C. 297-305.

15. Khaitov M. et al. Silencing of SARS-CoV-2 with modified siRNA-peptide dendrimer formulation // Allergy.. - 2021. - T. 76. - №9. - C. 2840-2854.

16. Khaitov M.R. et al. Results of clinical trials phases I and II of MIR 19® // Immunologiya. Geotar Media Publishing Group. - 2023. - T. 44. - №3. - C. 291-316.

17. Harborth J. et al. Identification of essential genes in cultured mammalian cells using small interfering RNAs // J Cell Sci. - 2001. - Т. 114. - №24. - C. 4557-4565.

18. Ui-Tei K. et al. Guidelines for the selection of highly effective siRNA sequences for mammalian and chick RNA interference // Nucleic Acids Res. - 2004. - T. 32. - №3. - C. 936-948.

19. Reynolds A. et al. Rational siRNA design for RNA interference // Nat Biotechnol. - 2004. - T. 22. - №3. - C. 326-330.

20. Gatta A.K. et al. Strategies for improving the specificity of siRNAs for enhanced therapeutic potential // Expert Opinion on Drug Discovery. - 2018. - T. 13. - №8.

21. Khaitov M.R. et al. MIR 19® - world first specific antiviral drug for COVID-19 treatment: development and preclinical studies // Immunologiya. Geotar Media Publishing Group. - 2023. - T. 44. - №3. - C. 270-290.

--->

<ST26SequenceListing originalFreeTextLanguageCode="ru"

nonEnglishFreeTextLanguageCode="ru" dtdVersion="V1_3"

fileName="Композиция молекул малых интерферирующих РНК и пептида

против риновирусной инфекции.xml" softwareName="WIPO Sequence"

softwareVersion="2.3.0" productionDate="2025-04-01">

</ApplicationIdentification>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">ФГБУ "ГНЦ Институт иммунологии" ФМБА

России</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>NRC Institute of Immunology of FMBA of

Russia</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Хаитов Муса Рахимович</InventorName>

<InventorNameLatin>Khaitov Musa Rakhimovich</InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="en">Composition of small interfering

RNA molecules and peptide against rhinovirus

infection</InventionTitle>

<InventionTitle languageCode="ru">Композиция молекул малых

интерферирующих РНК и пептида против риновирусной

инфекции</InventionTitle>

<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other RNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_key>ncRNA</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>ncRNA_class</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>siRNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gcttatggtgacaatatat</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other RNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_key>ncRNA</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>ncRNA_class</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>siRNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>atatattgtcaccataagc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other RNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_key>ncRNA</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>ncRNA_class</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>siRNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>actttgggtgtccgtgttt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other RNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_key>ncRNA</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>ncRNA_class</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>siRNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>aaacacggacacccaaagt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other RNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_key>ncRNA</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>ncRNA_class</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>siRNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ctgttattccggtaacttt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other RNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_key>ncRNA</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>ncRNA_class</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>siRNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>aaagttaccggaataacag</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>mRNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Rhinovirus A</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gacaataaggccattgaaa</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other RNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_key>ncRNA</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>ncRNA_class</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>siRNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>aggtcaagcacttctgttt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other RNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_key>ncRNA</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>ncRNA_class</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>siRNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>aaacagaagtgcttgacct</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>mRNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Rhinovirus A</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tccagttcgtgaagacaaa</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other RNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_key>ncRNA</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>ncRNA_class</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>siRNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gaatgcggctaaccttaaa</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other RNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_key>ncRNA</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>ncRNA_class</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>siRNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tttaaggttagccgcattc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>mRNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Rhinovirus A</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cttacgccgattggaattt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>mRNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Rhinovirus A</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cgaataccactgttatata</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other RNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_key>ncRNA</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>ncRNA_class</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>siRNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gcttagtaggattctgaaa</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other RNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_key>ncRNA</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>ncRNA_class</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>siRNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tttcagaatcctactaagc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>mRNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Rhinovirus A</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cgaatcatcctaagacttt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other RNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_key>ncRNA</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>ncRNA_class</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>siRNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gtaacttagaagttttaaa</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other RNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_key>ncRNA</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>ncRNA_class</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>siRNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tttaaaacttctaagttac</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>mRNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Rhinovirus A</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cattgaatcttcaaaattt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>mRNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Rhinovirus A</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tgaaacccacaggcacaaa</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>12</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..12</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_key>SITE</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>10</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>The side chain of this lysine residue is linked

via an amide linkage to another seguence</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>Боковая цепь данного остатка лизина

связана амидной связью с другой

последовательностью</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_key>SITE</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>8</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>The side chain of this lysine residue is linked

to another sequence</INSDQualifier_value>

связана амидной связью с другой

последовательностью</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_key>VARIANT</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>2</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>J - means lysine, the proton of the amino group

of which is replaced by an arignine residueJ</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>J - означает лизин, протон Е-аминогруппы

которого заменён на остаток аргинина</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>RJWTPEVKHKFC</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>7</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..7</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_key>SITE</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>7</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>This sequence is one part of a branched amino

acid sequence</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>Эта последовательность является частью

разветвлённой аминокислотной

последовательности</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_key>VARIANT</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>2</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>J - means lysine, the proton of the amino group

of which is replaced by an arignine residue</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>J – обозначает лизин, протон Е-аминогруппы

которого замещён на остаток аргинина</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>RJTWPEV</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>9</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..9</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_key>SITE</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>9</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>This sequence is one part of a branched amino

acid sequence</INSDQualifier_value>

разветвлённой аминокислотной

последовательности</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_key>SITE</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>8</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>The side chain of this lysine residue is linked

to another sequence</INSDQualifier_value>

связана амидной связью с другой

последовательностью</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_key>VARIANT</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>2</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>J - means lysine, the proton of the amino group

of which is replaced by an arignine residue</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>RJWTPEVKH</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>7</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..7</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>This sequence is one part of a branched amino

acid sequence</INSDQualifier_value>

разветвлённой аминокислотной

последовательности</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_key>VARIANT</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>2</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>J - means lysine, the proton of the amino group

of which is replaced by an arignine residue</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>RJTWPEV</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Claims

Композиция для профилактики или лечения риновирусной инфекции, вызываемой HRV, содержащая: (i) эффективное количество молекул миРНК, направленных против генома HRV, представленных в виде комплементарных цепей с нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO 1 и SEQ ID NO 2 или SEQ ID NO 3 и SEQ ID NO 4, (ii) дендримерный катионный пептид, обладающий трансфекционной активностью и характеризующийся структурной формулой R₈K₄W₄T₄P₄E₄V₄K₂H₂KFC.